WO2004033686A1 - 新規タンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

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WO2004033686A1
WO2004033686A1 PCT/JP2003/012894 JP0312894W WO2004033686A1 WO 2004033686 A1 WO2004033686 A1 WO 2004033686A1 JP 0312894 W JP0312894 W JP 0312894W WO 2004033686 A1 WO2004033686 A1 WO 2004033686A1
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PCT/JP2003/012894
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Hiroshi Tanaka
Kohei Honda
Isao Kaieda
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a novel protein, its DNA, a method of screening for a compound that regulates the expression of the protein gene, a compound obtained by the screening method, a medicament containing the compound, and the like. More specifically, the present invention relates to a preventive / therapeutic agent for cancer, a neurodegenerative disease or an autoimmune disease.
  • P53 is a tumor suppressor gene with the highest frequency of abnormalities detected in human cancers, including induction of glarrest and apoptosis, and a checkpoint mechanism when DNA is damaged. It has been shown to have various physiological functions. It is thought that these functions are exerted by the p53 protein acting as a transcription factor and controlling the expression of its target gene. Therefore, if an abnormality occurs in this P53 (mutant p53), the above effects will not be exhibited, and the cells will progress to cancer.
  • mutant P53 when introduced into p53-deficient cancer cells, the cancer cells will form colonies even in soft agar, or will form tumors in a bile cancer nude mouse model.
  • Mutant p53 not only loses the function of normal p53 (wild-type P53), but also mutant P53 It is suggested that they are involved in Mutant p53 is classified into several types depending on the location of mutation, and the cancer with mutant P53 in which arginine (R) at position 175 is replaced with histidine (H) has the worst prognosis.
  • arginine (R) at position 175 is replaced with histidine (H) has the worst prognosis.
  • mutant p53 like wild-type p53, induces downstream genes (Oncogene 1-2, 194, 1952, 1996).
  • genes derived from mutant p53 genes related to cell proliferation, drug resistance, and regulation of apoptosis have been reported (Gene, Vol. 277, pp. 15-30, 2001). It is thought to be closely involved in canceration. P53 mutations have been reported not only in cancer but also in rheumatoid arthritis (Semin Arthritis Rheum April, 31 (5), 299-310, 2002).
  • Apoptotic mechanism which includes morphogenesis during embryonic development, maintenance of tissue homeostasis, removal of harmful and unnecessary cells, Involved in the phenomenon.
  • abnormalities in apoptosis have also led to the development of many diseases, such as cancer and neurodegenerative diseases, so apoptotic research has attracted attention in terms of disease treatment.
  • Apoptosis signals are controlled by the balance between molecules that promote apoptosis and those that suppress it.
  • the survival of cells is determined by the involvement of the cell proliferation signal in this signal.
  • a large number of cell growth or apoptosis control molecules have been reported to date, but unknown control molecules may be present.
  • New genes related to the regulation of cell proliferation and apoptosis are being developed to develop drugs that are useful for the prevention and treatment of various diseases caused by up- and down-regulation of these genes, such as cancer, neurodegenerative diseases, and autoimmune S-immune diseases. enable. Accordingly, it has been desired to find a novel gene related to the control of cell proliferation and apoptosis derived from humans. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, succeeded in cloning a cDNA having a novel nucleotide sequence from a cancer cell line.
  • the encoded protein was found to be involved in cell proliferation and apoptosis.
  • the present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide according to (5) or a part thereof,
  • (22) A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1), which comprises using the polynucleotide according to (5).
  • a compound that inhibits the activity of the protein or partial peptide thereof or a salt thereof or a salt thereof or (b) a compound that inhibits the expression of a gene of the protein, Or a method for preventing or treating cancer, which comprises administering an effective amount of a salt thereof.
  • (31) a compound or a salt thereof that promotes the activity of the protein or its partial peptide or a salt thereof according to (1) above, or (b) a compound that promotes gene expression of the protein, Or a method for preventing or treating a neurodegenerative disease or an autoimmune disease, which comprises administering an effective amount of a salt thereof.
  • (32) (a) a method for preventing or treating cancer characterized by inhibiting the activity of the protein according to (1) or a partial peptide thereof or a salt thereof, or (b) inhibiting the expression of a gene of the protein.
  • (33) (a) a neurodegenerative disease or autoimmunity characterized by promoting the activity of the protein of (1) or a partial peptide thereof or a salt thereof, or (b) promoting the expression of a gene of the protein.
  • Disease prevention and treatment (a) a neurodegenerative disease or autoimmunity characterized by promoting the activity of the protein of (1) or a partial peptide thereof or a salt thereof, or (b) promoting the expression of a gene of the protein.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein or its partial peptide or the salt thereof described in (1) above for producing a prophylactic / therapeutic agent for cancer or (b) (35) use of a compound that inhibits gene expression or a salt thereof, (35) a protein or a partial peptide thereof described in (1) above, or a salt thereof for producing an agent for preventing or treating a neurodegenerative disease or an autoimmune disease. And (b) use of a compound or a salt thereof that promotes the expression of a gene of the protein.
  • a compound or a salt thereof that promotes expression of the protein gene according to (1) which is obtained by using the screening method according to (22) or the screening kit according to (23).
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 29 is a human warm-blooded animal.
  • Cell goblet cell, endothelial cell, smooth muscle cell, fibroblast, fiber cell, muscle cell, fat cell, immune cell (eg, macrophage, T cell, B cell, natural killer cell, mast cell, neutrophil Spheres, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells Cells, stem cells, or cancer cells) or any tissue in which those cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, thalamus Part, cerebral cortex, medulla
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • An amino acid sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more, may be mentioned.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described above. However, a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferable.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 is at least about 50%, preferably at least about 60%, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29.
  • the amino acid sequence S3 has a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 include, for example, an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29.
  • Substantially the same activity includes, for example, a cell growth promoting activity and an apoptosis suppressing effect. Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Therefore, it is preferable that the cell growth promoting activities are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of activity of the protein and the molecular weight of the protein may vary.
  • the activity such as the cell growth promoting activity can be measured according to a known method.For example, the activity is measured according to the method described in the International Journal of Cancer, Vol. 88, pp. 162-171, 2000 or a method analogous thereto. be able to.
  • Activity such as apoptosis inhibitory activity can be measured according to known methods.For example, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 92, pp. 7162-7166, 1995 It can be measured according to the method described or a method analogous thereto.
  • Examples of the protein of the present invention include (1) (1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, about 1 to 200, preferably 1 to 10) An amino acid sequence in which about 0, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about (1 to 5) amino acids have been deleted; (ii) SEQ ID NO: 1 1 or 2 or more (for example, about 1 to 200, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 30, and preferably 1 to 10 Degree, more preferably an amino acid sequence to which a number (1-5) amino acids are added; (iii) 1 or 2 or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 (for example, about 1-200 amino acids) , Preferably about 1 to 100 pieces, preferably about 1 to 30 pieces, preferably about 1 to 10 pieces, and more preferably a number (1 to 5).
  • SEQ ID NO: is represented by 1 1 or 2 or more in the amino acid sequence (e.g., about 1 to 200, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably Is a so-called mutin, such as a protein containing an amino acid sequence in which a number (1-5) amino acids are substituted with another amino acid, or (V) an amino acid sequence combining them;
  • amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 for example, about 1 to 200, preferably about 1 to 100, and preferably 1 to 3 About 0 amino acids, preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably about 1 to 5 amino acids are deleted.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 1 or 2 or more (for example, about 1 to 2 0, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 10 (Iii) 1 or 2 or more amino acids (for example, about 1 to 200, preferably 1 to 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29; About 0, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably number (1 to 5) amino acids (Iv) 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 (for example, about 1 to 200, preferably about 1 to 100, and preferably about 1 to 30)
  • a protein comprising an amino acid sequence in which about 1 to 10 amino acids are substituted, preferably 1 to 10 amino acids, and more preferably 1 to 5 amino acids, or (V) an amino acid sequence obtained by combining them. And so-called mutin.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • the proteins of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, include C. terminal lipoxyl group (-C00H), carboxylate (-C00-), and amide (_CONH 2 ) or ester (-COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, isopropyl, n - C ⁇ _ 6 alkyl group such as butyl, cyclopentyl Le, c 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, C 6 _ 12 ⁇ Li Ichiru group such Hina Fuchiru, for example, benzyl, phenyl, such as phenethyl i (: Bok 2 alkyl groups or flying one naphthylmethyl etc. - Nafuchiru (Bok 2 Al kill groups C 7 such as -.
  • pivaloyl Ruo carboxymethyl force proteins other than the C-terminus, such as methyl group are used present invention
  • Rupokishiru group or Karupokishire
  • the protein of the present invention also includes those in which the carbonyl group is amidated or esterified, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like.
  • the amino group at the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group (eg, an acyl group such as an alkanol such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protecting group eg, an acyl group such as an alkanol such as a formyl group or an acetyl group.
  • N-terminal dalminine residue generated by cleavage in vivo, which is oxidized with lipamine Substituent on the side chain of amino acid in the molecule (for example, -OH, -SH, amino group , which imidazo Ichiru group, I Ndoru group, etc. Guanijino group) is protected with a suitable protecting group (e.g., formyl groups, C such as ⁇ Se butyl group, etc. Ashiru groups such _ 6 Arukanoiru group), Alternatively, it includes a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
  • Examples of the protein of the present invention include, for example, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 29.
  • Specific examples include a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17
  • the partial peptide of the protein of the present invention is the above-mentioned partial peptide of the protein of the present invention, and preferably any peptide having the same properties as the above-mentioned protein of the present invention.
  • a peptide having at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more amino acid sequences among the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention. is used.
  • the partial peptide of the present invention has one or more (preferably about 1 to 10, preferably 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence, Or 1 or 2 or more (preferably, about 1 to 20; more preferably, about 1 to 10; more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence; or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20; more preferably about 1 to 10; and still more preferably about 1 to 5) amino acids are inserted into the amino acid sequence; Alternatively, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence may be substituted with another amino acid. Good.
  • the C-terminus carboxyl group of the present invention (- C00H), Karupoki Shireto (- C00_), amide (- C0NH 2) or ester (- C00R) may be filed in any.
  • the partial peptide of the present invention includes, as in the case of the above-mentioned protein of the present invention, those having a carboxylate group (or carboxylate) other than at the C-terminus, N-terminal amino acid residues (eg, methionine).
  • Residue) whose amino group is protected with a protecting group, N-terminal cleavage in vivo, glutamine residue generated by pyrodal amine oxidation, and substituent on the side chain of amino acid in the molecule is appropriate Examples include those protected with various protecting groups, and complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bonded. — ⁇
  • the partial peptide of the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
  • salts with physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metals
  • Acid addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, And the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid
  • citric acid malic acid
  • oxalic acid oxalic acid
  • benzoic acid methanesulfonic acid
  • the protein of the present invention can be produced from the above-mentioned human or warm-blooded animal cells or tissues by a known method for purifying a protein, or a protein containing a DNA encoding the protein. It can also be produced by culturing the transformant. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, or the like. Purification and isolation can be performed by combining chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be generally used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM Resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'dimethoxyphenyl) Lumoc aminoethyl) phenoxy resin.
  • amino acids whose amino groups and side chain functional groups are appropriately protected are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or peptide. Obtain those amides.
  • various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • disulfide diimides DCC, ⁇ , ⁇ '-diisopropylcarpo- imide, ⁇ -ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like are used.
  • Activation by these requires racemization inhibitor additives (eg HOB t, HO
  • the protected amino acid can be added directly to the resin together with B t) or can be added to the resin after activating the protected amino acid in advance as a symmetric acid anhydride or HOB t ester or HOOB t ester.
  • the solvent used for activation of the protected amino acid or condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, and trifluoroethanol.
  • Alcohols, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acrylate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. Is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 t to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxy-caprolponyl, C11Z, Br-Z, and adaman Tiloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 212-trophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group may be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Alkyl esterification Alkyl esterification
  • aralkyl esterification for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester
  • Benzyl ester, benzhydryl ester phenacyl ester, benzyloxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C 6 ) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydropyrael group, a t-butyl group and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz and C 1 2 - B zl, 2- two Torobenjiru, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • histidine imidazole for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitro Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, esters with H ⁇ Bt), etc. are used.
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitro Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, esters with H ⁇ Bt
  • activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoramide is used.
  • a method for removing (eliminating) a protecting group for example,? -Kuroh? (Catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as 1-carbon, or acid treatment with anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid, or a mixture thereof.
  • a catalyst such as 1-carbon
  • base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. can be used. It is carried out at a temperature of 20 C to 40 C.
  • anisol for example, anisol, phenol, thioanisole, meta-cresol, para-cresol
  • a cation scavenger such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, and 1-2-ethanedithiol.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributophan is substituted with the above-mentioned 2-ethanedithiol, 1, 4
  • the alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • a peptide (protein) chain is added to the amino group side to a desired chain length.
  • a protein or partial peptide from which only the protecting group for the amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain has been removed and a protein or partial peptide from which only the protecting group for the carboxy group at the C-terminal has been removed are produced.
  • proteins or peptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • an ester form of a protein or peptide for example, after condensing the ⁇ -hydroxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, An ester of the protein or peptide can be obtained.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • Peptide synthesis methods include, for example, solid phase synthesis. Method or liquid phase synthesis method. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide of the present invention with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group.
  • Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following (i) to (V).
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by combining crystals and the like.
  • the partial peptide obtained by the above method is an educt, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the partial peptide is obtained by a salt, the known method or It can be converted to a free form or other salts by a method according to it.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cells and tissues.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include (1) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (2) a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions.
  • Examples of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 19, and a sequence DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20; DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21;
  • Examples of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 22; a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 24; : A DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30; a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30; Examples of a DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 28 under high stringent conditions include, for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 28 and a nucleotide sequence of about 50%. % Or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology. A DNA containing the sequence is used. '
  • Hybridization can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it should be performed under high stringent conditions. Can be. .
  • High stringency conditions refer to, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 2 OmM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65. Particularly preferred is a case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and represented by SEQ ID NO: 3.
  • Examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 include DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19, and the like.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.0, which is represented by SEQ ID NO: 18.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 is a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29.
  • DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 and the like encode DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 Is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, and the like, and a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 is represented by SEQ ID NO: 24
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 is used. .
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide of the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cell 'tissue, cDNA library derived from the above-mentioned cell' tissue, and synthetic DNA.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include: Or a DNA having a portion of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28, or a nucleotide sequence hybridizing under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 28
  • DNA containing a part of DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention may be used.
  • the DNA hybridizable with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 28 has the same significance as described above.
  • DNA is amplified by the PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or the DNA incorporated into an appropriate vector is used as one of the proteins of the present invention.
  • Selection can be carried out by hybridization with a DNA fragment coding for part or all of the region or labeled with a synthetic DNA.
  • the method of hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR, a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., by the 0DA-LA PCR method. It can be carried out according to a method known per se, such as the gapped duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA has ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3, end. May be provided. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the protein of the present invention may be prepared, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) promoting the DNA fragment in a suitable expression vector. It can be manufactured by connecting downstream in the evening.
  • vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, , PSH19, pSH15), bacteriophage such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXT1, pRcZCMV, pRc / RS V pc DNAI / Neo is used.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg,
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • examples include SRo; promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRo cytomegalovirus
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter, lac promoter, re cA promoter evening one, .lambda.P L flop Romo - coater, iota [rho [rho promoter -, such as T7 promoter one, etc.
  • the host is a bacterium of the genus Bacillus
  • yeast such as SPOl Promote, SP02 Promote, penP Promote, and the like
  • PHO5 promoter, PGK promoter, GAP Promote, ADH promoter and the like are preferable.
  • the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may include, if desired, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection tool, and an SV40 replication origin (hereinafter, referred to as the SV40 ori) may be used.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and ampicillin resistant gene (hereinafter abbreviated as Amp 1). there), neomycin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G418 resistance), and the like.
  • the target gene can be selected using a medium containing no thymidine.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA signal sequence, a 0A immediate signal sequence, etc.
  • the host is a Bacillus genus, a poramylase * signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc.
  • Signal sequence, SUC2 signal sequence, etc. when the host is a yeast cell, insulin signal sequence, ⁇ -interferin signal sequence, antibody molecule, signal when the host is an animal cell Arrays etc. can be used respectively.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia include, for example, Escherichia coli.
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis (Bacillus).
  • subtilis MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae. cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 2OB-12, Schizosaccharoiyces pombe N CYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris KM 71, etc. .
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night rob moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and High derived from egg of Trichoplusia ni Five TM cells,
  • Sf cells derived from Mamestra brass icae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • viruses When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N cell; BmN cell) is used.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (above, In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Nature, vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dh fr gene-deficient Chinese hamster cells CH ⁇ (hereinafter CHO (dh fr—) cells Abbreviations), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloid cells, mouse ATDC 5 cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Transformation of a bacterium belonging to the genus Escherichia can be performed, for example, according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) or Gene, 17, 107 (1982). it can.
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Teclmology, 6, 47-55 (1988). Transformation of animal cells can be performed, for example, according to the method described in Cell Engineering Annex 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). Can be done.
  • a liquid medium is suitable as a medium to be used for cultivation.
  • a liquid medium is necessary for growing the transformant.
  • It contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances and others.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip lica, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato.
  • inorganic or organic substances and inorganic substances such as an extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium salt and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for culturing the genus Escherichia for example, glucose, M9 medium containing casamino acid (Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) is preferable. . If necessary, a drug such as 3) 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • culturing is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is yeast, the medium may be, for example, Burkholder's minimal medium [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] or 0.5. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 ° C to 35 for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the culture medium is an additive such as 10% serum inactivated in Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)). Are appropriately added.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [; Science, Vol. 122, 501 (1952)], DM EM medium 01 ( ⁇ , volume 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, volume 199, 519 (1967)], 199 medium
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cells of the transformant, in the cell membrane, or outside the cells.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells When extracting the protein of the present invention from the cultured cells or cells, after the culture, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and then sonicated, lysozyme and Z or freeze-thawed. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or an interface ⁇ f viability such as Triton X-100 TM.
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting-out and solvent precipitation, and dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • solubility such as salting-out and solvent precipitation
  • dialysis ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis mainly molecular weight.
  • How to use the difference of ion exchange Methods that use differences in charge such as oral chromatography, methods that use specific affinity, such as affinity chromatography, methods that use differences in hydrophobicity, such as reverse-phase high-performance liquid chromatography, and isoelectric points
  • a method utilizing the difference between isoelectric points such as electrophoresis is used.
  • the protein thus obtained when it is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, a method known per se or analogous thereto Can be converted into a free form or another salt.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, daricosidase and the like are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by enzyme immunoassay or Western blotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof.
  • An antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as the protein of the present invention in the description of the antibody) uses the protein of the present invention as an antigen, and is known per se. It can be manufactured according to the anti- or serum manufacturing method.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or a diluent at a site capable of producing an antibody upon administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times Is Examples of warm-blooded animals to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • monoclonal antibody-producing cells When preparing monoclonal antibody-producing cells, select an individual with an antibody titer from a warm-blooded animal, such as a mouse, immunized with the antigen, and collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the antibody-producing cells contained in the above with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled serum protein described below with the antiserum, and then measuring the activity 0 of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Köhler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-15. P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%.
  • PEG preferably PEG1000 to PEG6000
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) onto which a protein antigen has been adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase eg, microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is a mouse
  • protein A labeled with a radioactive substance, an enzyme, etc. was added, and the mixture was bound to the solid phase.
  • Monoclonal antibody detection method anti-immunoglobin antibody or protein A is adsorbed on a solid phase to which a hybridoma culture supernatant is added, and a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and the monoclonal antibody bound to the solid phase is added. Detection method and the like can be mentioned.
  • Monoclonal antibodies are selected according to a method known per se or a method analogous thereto. You can do it. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or no hybridoma culture medium Serum medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week and 2 weeks. Cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE), adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Solid phase or specific purification method in which only antibodies are collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bonds are dissociated to obtain antibodies.) It can be done according to.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE), adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Solid phase or specific purification method in which only antibodies are collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bonds are dissociated to obtain antibodies.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting the antibody-containing substance for the protein and separating and purifying the antibody.
  • the type of the carrier-protein and the mixing ratio of the carrier-protein and the hapten are different from those of the hapten immunized by cross-linking the carrier protein.
  • Any antibody may be cross-linked at any ratio as long as it can be efficiently produced.
  • serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of haploid.
  • a method of coupling at a ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 with respect to ten is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier protein, but a dartalaldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithiopyridyl group, or the like is used. . '
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal either at the site where antibody production is possible or with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of polyclonal antibody titer in antiserum can be performed in the same manner as the measurement of antibody titer in serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • An antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to a sequence or a part thereof includes a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention, or Any antisense polynucleotide may be used as long as it has a substantially complementary nucleotide sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the enhancement of MDNA. Is preferred.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, the entire nucleotide sequence or a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • a base sequence having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the base sequence is exemplified.
  • (a) translation inhibition In the case of a harm-directed antisense polynucleotide, the protein of the present invention
  • the antisense polynucleotide having a homology of about 95% or more is (mouth) an antisense polynucleotide that directs RNA degradation by RNase H, the entire nucleotide sequence of the DNA of the present invention, including the ditron, Antisense polynucleotides having homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with the complementary .
  • Antisense polynucleotide preferably an antisense polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 28, or a part thereof (more preferably Is a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 28, or an antisense polynucleotide having a part thereof.
  • the antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • each nucleotide constituting the antisense DNA is replaced by chemicals such as phosphorothioate, methyl phosphate and phosphorodithionate. It may be substituted with a modified acid residue.
  • the sugar (dexoxy report) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2, -O-methylation, and the base moiety (pyrimidine, purine) may also be chemically modified. Any one may be used as long as it hybridizes to DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • Antisense polynucleotides can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence information of the cloned or determined DNA encoding the protein.
  • Such a polynucleotide is capable of hybridizing with the RNA of the protein gene of the present invention and inhibiting the synthesis or function of the RNA, or interacting with the protein-related RNA of the present invention.
  • the expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled.
  • Polynucleotides that are complementary to the selected sequence of the protein-related RNA of the present invention and that can specifically hybridize with the protein-related RNA of the present invention can be used in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of the protein gene of the present invention, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) specified by the sequence derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. ing. 5 'end hairpin loop, 5' end 6_ base spare repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3' end untranslated region, The palindrome region at the 3 'end and the hairpin loop at the 3' end can be selected as preferred regions of interest, but any region within the protein gene can be selected as a target.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region is based on the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize.
  • Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-dexoxy-D-reports, polynucleotides containing D-liposes, and other types of N-glycosides of purine or pyrimidine bases. Polynucleotides or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (however, such polymers may be found in DNA or RNA Pairing of bases as found in ⁇ Containing a nucleotide having a configuration that allows attachment).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, as well as unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), Furthermore, those with known modifications, e.g., those with labels known in the art, those with caps, those that are methylated, those in which one or more natural nucleotides have been substituted by analogs Modified with an intramolecular nucleotide, such as those having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, carbamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, phosphoro Those with thioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nucleases / inhibitors, toxins) Those with side groups such as antibodies, signal peptides, poly-L-ly
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with a halogen, an aliphatic group, etc. It may be converted to a functional group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids ⁇ thiophosphoate derivatives, and polynucleoside amides ⁇ oligonucleoside amides that are resistant to degradation. .
  • the antisense nucleic acid of the present invention is favored by the following policy. It can be well designed.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, applied by gene therapy, or added. Can be given in a written form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton
  • lipids which increase the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids (
  • hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • Such a substance can be attached to the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 'end or the 5' end of nucleic acids for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNAse.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol. .
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof may be abbreviated as the protein of the present invention
  • a polynucleotide encoding the protein or partial peptide of the present invention eg, DNA
  • DNA a polynucleotide encoding the protein or partial peptide of the present invention
  • the polynucleotide of the present invention, the DNA of the present invention, etc.), the antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention
  • the application of the DNA antisense polynucleotide of the present invention hereinafter, may be abbreviated as the antisense polynucleotide of the present invention
  • the protein of the present invention has a cell growth promoting activity, an apoptosis-suppressing activity, and the like
  • the protein of the present invention, the polynucleotide of the present invention, the antibody of the present invention, and the like include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer) , Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc., neurodegenerative disease ( Eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus) It is also useful as a marker for such diseases and as a prophylactic
  • an antisense polynucleotide of the present invention a compound that regulates (promotes or inhibits) the activity of the protein of the present invention or a salt thereof, a compound that regulates (promotes or inhibits) the expression of the protein gene of the present invention, or a compound thereof Salts also include cancers (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, 'Skin cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.), neurodegenerative disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis) It is useful as a prophylactic agent for the treatment of Scheddaren syndrome, insulin-resistant diabetes mellitus, rheumatoid
  • the gene of the protein of the present invention since the gene of the protein of the present invention has low expression in normal tissues, screening for a prophylactic / therapeutic agent for cancer with few side effects becomes possible.
  • cancers with mutant P53 have a low grade of malignancy, such as poor efficacy of anticancer drugs in clinical practice and poor prognosis. Is known to be high.
  • the protein gene of the present invention acts downstream of the mutant P53 to thereby provide an antisense polynucleotide of a polynucleotide encoding the protein of the present invention, a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention, or a salt thereof, and a protein of the present invention.
  • a compound or its salt that inhibits the expression of the above-mentioned gene, or an antibody against the protein of the present invention is also effective for highly malignant cancer. '
  • Inhibiting the activity of the protein of the present invention causes cancer cells to undergo apoptosis.
  • compounds or salts thereof that regulate (promote or inhibit) the activity of the protein of the present invention include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, liver cancer, biliary tract cancer, Spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular ⁇ , thyroid cancer, ⁇ renal cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc., neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, , Myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sheddalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.).
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer,
  • the compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention includes, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, It can be used as a preventive agent for the treatment of bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, It can be used as a preventive agent for the treatment of bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.
  • Compounds or salts thereof that promote the activity of the protein of the present invention include, for example, ebony neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis) , Siedaren syndrome, insulin resistant diabetes mellitus, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.).
  • ebony neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis
  • Siedaren syndrome eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis
  • insulin resistant diabetes mellitus rheumatoid arthritis
  • systemic lupus erythematosus etc.
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that regulates the activity of the protein of the present invention.
  • the present invention provides the present invention characterized by using the protein of the present invention. It provides a method for screening a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) the activity of a protein (eg, cell growth promoting activity, apoptosis inhibitory effect, etc.).
  • a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) the activity of a protein (eg, cell growth promoting activity, apoptosis inhibitory effect, etc.).
  • a cell growth-promoting activity or an apoptosis-suppressing activity of a cell capable of producing the protein of the present invention and (ii) a cell capable of producing the protein of the present invention.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that regulates the activity of the protein of the present invention, which is characterized by comparing with a cell growth promoting activity or an apoptosis suppressing activity of a mixture of test compounds, is used.
  • the cell growth promoting activity or the apoptosis inhibitory effect is determined by utilizing an ELISA reaction for detecting colony forming ability or DNA fragmentation. The area of the colony or the amount of DNA fragmentation is used as an index for comparison.
  • the cell growth promoting activity can be measured by a known method, for example, the method described in International Journal of Cancer, Vol. 88, pp. 162-171, 2000 or a method analogous thereto.
  • Cis inhibitory action can be performed by a known method, for example, the method described in Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 92, pp. 7162-7166, 1995, or a method analogous thereto. Can be measured according to
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the activity of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8) and a borate buffer.
  • Cells having the ability to produce the protein of the present invention include, for example, those described above.
  • a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention is also used.
  • the host for example, animal cells such as COS7 cells, CHO cells, and HEK293 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane and in a cell by culturing by the method described above is preferably used.
  • the method for culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the above-described method for culturing the transformant of the present invention.
  • a test compound that promotes the activity in the case of (ii) above by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of (i) above.
  • the activity in the case of the above (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 30% or more of that in the above (i).
  • a test compound that inhibits 50% or more can be selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissues It is a compound selected from extracts, plasma, etc.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.
  • a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) the expression of the protein gene of the present invention may be, for example, a cancer (eg, Colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, diet. Road cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid-adenocarcinoma, victory cancer, brain tumor, melanoma.
  • a cancer eg, Colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, diet. Road cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid-adenocarcinoma, victory cancer, brain tumor, melanoma.
  • Hematologic malignancies Hematologic malignancies
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Scheddaren syndrome, insulin resistant diabetes
  • rheumatoid arthritis systemic lupus erythematosus, etc.
  • the compound or its salt that inhibits the expression of the protein gene of the present invention is, for example, a cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.).
  • a cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer
  • a prophylactic / therapeutic agent for biliary tract cancer eg, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.
  • Compounds or salts thereof that promote the expression of the protein gene of the present invention include, for example, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, polymorphism) It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for sclerosis, Siedalen syndrome, insulin-resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.).
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, polymorphism
  • the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that regulates the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • the screening methods include (iii) culturing cells capable of producing the protein of the present invention, and (iv) culturing cells capable of producing the protein of the present invention in the presence of the test compound. And a screening method characterized by performing a comparison with the above.
  • the expression level of the gene (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) in the cases (iii) and (iv) is measured and compared.
  • test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include the same cells as described above.
  • the amount of the protein is measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like according to a method such as Western analysis, ELISA, or a method analogous thereto. Can be measured.
  • the amount of mRNA can be measured by a known method, for example, Northern hybridization using a nucleic acid containing SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 30 or a part thereof as a probe.
  • PCR using a nucleic acid containing SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 30 or a part thereof as a primer or primer, or a method similar thereto It can be measured.
  • the expression of the gene in the case of the above (iv) is about 20% or more, preferably 30% or more, as compared with the case of the above (iii).
  • a test compound that inhibits about 50% or more can be selected as a compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • the screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof, or a cell having the ability to produce the protein or partial peptide of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and cell extracts.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • the compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention and the compound or its salt that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention are, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer) , Stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.) Useful as a safe medicine.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer
  • Stomach cancer liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.
  • the compound or its salt that promotes the activity of the protein of the present invention, and the compound or its salt that promotes the expression of the gene of the protein of the present invention are, for example, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), Prevention of immune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.) Useful.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated into a preparation according to a conventional method.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, and capsules (including soft capsules). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration include injections, suppositories, and the like.
  • Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections, and joint injections. Includes dosage forms such as injections.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents, etc.
  • a suitable solubilizing agent for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol ( E.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (e.g., Polysorbate 80, HCO-50
  • suppositories used for rectal administration are prepared by mixing the above compound or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to conform to the dose of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories, and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially 5 to 500 mg for injections. It is preferred that 100 mg, and other dosage forms contain 10 to 250 mg of the above compound.
  • compositions may contain other active ingredients as long as the compound and the above-mentioned compound do not cause an undesirable interaction.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • warm-blooded animals eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject of administration, route of administration, and the like.
  • the salt is orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 501 mg, more preferably about 1 to 100 mg of the compound or its salt per day is used.
  • the single dose of the compound or its salt may vary depending on the administration subject, the target disease, and the like.
  • the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating breast cancer may be reduced.
  • an inhibitory compound or a salt thereof When an inhibitory compound or a salt thereof is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) usually in the form of an injection, about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg of the compound or its salt per day is administered. More preferably, about 0.1 to 10 mg is administered to the cancerous lesion by injection. In the case of other animals, it is possible to administer the amount in terms of weight per 60 kg.
  • the compound or salt thereof when orally administering a compound or a salt thereof that promotes the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating Alzheimer's disease, generally in adults (assuming a body weight of 60 kg), the compound or salt thereof is administered daily.
  • the salt is administered in about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.For example, it promotes the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating Alzheimer's disease.
  • the compound or a salt thereof When the compound or a salt thereof is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) usually in the form of an injection, the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 1 mg per day. 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg is administered by injection to the cancerous lesion It is convenient to do so. In the case of other animals, it is possible to administer the amount in terms of weight per 60 kg.
  • an antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention. In particular, it can be used for quantification by sandwich immunoassay.
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the antibody, antigen, or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution is measured. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition The method, the immunometric method and the sandwich method are preferably used, but it is particularly preferable to use the sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [i], c I3L n, and [3 ⁇ 4], [i4 c] used.
  • the enzyme a stable and specific activity ⁇ : kina is preferable.
  • monogalactosidase, ⁇ -darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily required to be one type, and two or more types of antibodies are used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. Mixtures may be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds.
  • the antibody used in the reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably other than the C-terminal. For example, an antibody that recognizes the N-terminal is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry. .
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • BZF separation The amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test wave and the immobilized antigen are allowed to compete with a certain amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is separated. Is allowed to react with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of the label in either phase is measured to determine the amount of the antigen in the test wave.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test wave is small and only a small amount of sediment is obtained, a laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the system for measuring the protein of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and documents.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • cancer eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate
  • Cancer esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pallial cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor etc.
  • testicular cancer thyroid cancer
  • pallial cancer brain tumor, melanoma, blood tumor etc.
  • a decrease in the concentration of the protein of the present invention can be detected, for example, a neurodegenerative disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), an autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, It can be diagnosed as having Siedalen's syndrome, insulin-resistant diabetes mellitus, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.) or as having a high possibility of contracting in the future.
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • an autoimmune disease eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, It can be diagnosed as having Siedalen's syndrome, insulin-resistant diabetes mellitus, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. can be used for (3) Gene diagnostics
  • the DNA of the present invention can be used as a probe, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Abnormalities (genetic abnormalities) of DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof in monkeys, chimpanzees, etc.). It is useful as a diagnostic agent for gene expression such as decreased expression, increased DNA or mRNA, or overexpression.
  • warm-blooded animals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Abnormalities (genetic abnormalities) of DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof in monkeys, chimpanzees, etc.
  • the above-mentioned genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern Eighth hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the Natal Academy). of Science of the USA, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) and the like.
  • cancer eg, colorectal cancer, breast cancer, lung lung, prostate
  • Cancer esophagus, stomach, liver, biliary tract, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, thyroid, kidney, brain, melanoma, blood, etc.
  • cancer eg, colorectal cancer, breast cancer, lung lung, prostate
  • Cancer esophagus, stomach, liver, biliary tract, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, thyroid, kidney, brain, melanoma, blood, etc.
  • a decrease in expression is detected by Northern hybridization or when a DNA mutation is detected by PCR-SSCP, for example, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (Eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.) can be diagnosed as having a high possibility.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases Eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.
  • the antisense polynucleotide of the present invention which binds complementarily to the DNA of the present invention and can suppress the expression of the DNA, has low toxicity, and is characterized by having the protein of the present invention in vivo or the protein of the present invention. Because it can suppress the function of DNA, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain ulcer, melanoma, blood tumor, etc.).
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer
  • It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid
  • the above antisense polynucleotide When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered according to a method known per se.
  • a human or mammal after inserting the above-mentioned antisense polynucleotide alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, a human or mammal (for example, it can be administered orally or parenterally to rats, egrets, sheep, sheep, bush, horses, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, they can be aerosolized and administered topically into the trachea as an inhalant.
  • the antisense polynucleotide is formulated alone or in combination with a carrier such as ribosome (injection), and is intravenously or subcutaneously. Etc. may be administered.
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.For example, when the antisense polynucleotide of the present invention is administered for the purpose of treating breast cancer, it is generally used. In an adult (body weight: 60 kg), about 0.1 to 100 rag of the antisense polynucleotide is administered per day.
  • antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of its expression.
  • double-stranded RNA containing a part of RNA encoding the protein of the present invention double-stranded RNA containing a part of RNA encoding the protein of the present invention, lipozyme containing part of RNA encoding the protein of the present invention, etc.
  • the gene expression can be suppressed and the function of the protein of the present invention or the DNA used in the present invention in the living body can be suppressed, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer) , Esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen ⁇ , kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.).
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer
  • Double-stranded RNA can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the lipozyme can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of the RNA encoding the protein of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the protein of the present invention includes a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme.
  • RNA or ribozyme When the above-described double-stranded RNA or ribozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide.
  • the antibodies (eg, neutralizing antibodies) of the present invention include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent (eg, vaccine, antibody drug, etc.) for uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer
  • prophylactic / therapeutic agent eg, vaccine, antibody drug, etc.
  • Activating antibodies include, for example, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistant diabetes, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent (eg, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.) (eg, vaccine, antibody drug, etc.).
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistant diabetes
  • prophylactic / therapeutic agent eg, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.
  • vaccine eg.g, vaccine, antibody drug, etc.
  • the prophylactic / therapeutic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and is used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, porcupine, sheep, pig, It can be administered orally or parenterally (eg, intravascular, subcutaneous, etc.) to mice, cats, dogs, monkeys, etc.). Preferably, it can be administered as a vaccine according to a standard method.
  • the antibody of the present invention may be administered per se or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, vaccines, etc. are used.
  • Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Dosage forms may be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method. Injection preparations can be prepared, for example, by dissolving, suspending, or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, and the like, suitable dissolution aids such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] and the like.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier usually used in the field of pharmaceutical preparation; a diluent or an excipient.
  • carriers and excipients for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the parenteral or oral pharmaceutical composition ⁇ is suitable for the dosage of the active ingredient. It is convenient to prepare such dosage unit forms. Such dosage unit forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the content of the antibody is usually about 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, preferably about 5 to 100 mg for injection, and about 10 to 250 mg for other dosage forms.
  • the dose of the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route and the like.
  • the dose of the antibody of the present invention is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight per day. It is convenient to administer by intravenous injection about to 5 times, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration contains the above-mentioned i-isomer or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for parenteral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the protein of the present invention has cell proliferation ability, apoptosis suppression ability and the like. Therefore, when the DNA encoding the protein of the present invention is abnormal or deficient, or when the expression level of the protein of the present invention is reduced, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer) , Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.), neurodegenerative disease (Eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple Various diseases such as sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, and systemic lupus erythematosus develop.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer
  • the protein of the present invention and the DNA of the present invention include, for example, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, siedalen) It can be used as a safe medicine such as a preventive or remedy for syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.).
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, siedalen
  • It can be used as a safe medicine such as a preventive or remedy for syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.
  • the DNA of the present invention when there is a patient in whom the activity of the protein of the present invention is not sufficiently or normally exerted because the protein of the present invention is reduced or deleted in a living body, (a) the DNA of the present invention
  • the (mouth) cell By administering to a patient and expressing the protein of the present invention in vivo, the (mouth) cell is inserted with the DNA of the present invention, and after expressing the protein of the present invention, the cells are transplanted into the patient.
  • the role of the protein of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, the DNA is usually used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector. It can be administered to humans or warm-blooded animals according to the usual practice.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary for promoting uptake, and administered by a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • the protein of the present invention when used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, it should be purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. Is preferred.
  • the protein of the present invention can be used, for example, in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., which are sugar-coated as required, orally, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions or suspensions.
  • the protein of the present invention is It can be manufactured by admixing in a generally accepted dosage form with approved carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. . The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • a liquid carrier such as an oil or fat may be further contained in the above-mentioned dinner material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil. .
  • Aqueous liquids for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Ad-sorbitol eg., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • Auxiliaries such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HC0-50) You may.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium phosphate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the DNA-introduced vector of the present invention is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in warm-blooded animals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, sheep, pigeons, horses, cats, cats). , Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the dose of the protein of the present invention may vary depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.For example, when the protein of the present invention is orally administered for the purpose of treating Alzheimer's disease, it is generally used. In an adult (assuming a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the protein is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the protein may vary depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the protein of the present invention may be administered in the form of an injection to an adult (for the purpose of treating Alzheimer's disease).
  • the present invention relates to a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or its mutant DNA (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). And a non-human mammal having the same.
  • the non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof is a germ cell containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and its progenitor cells. And the like, preferably at the stage of embryonic development in the development of non-human mammals (more preferably at the stage of single cells or fertilized egg cells). (Generally before the 8-cell stage) by transferring the desired DNA by the calcium phosphate method, electric pulse method, ribofection method, agglutination method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc. can do.
  • exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing these cells with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se.
  • non-human mammals for example, porcupines, pigs, higgins, goats, magpies, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like are used.
  • rodents with relatively short ontogeny and biological cycle are relatively short in terms of the creation of disease animal model systems, and are easy to breed in rodents, especially mice (for example, hybrids such as C57BLZ6 and DBA2 as pure strains).
  • the strain is preferably a B6C3F strain, a BDFi strain, a BeDSFi strain, a BALBZc strain, an ICR strain, etc.) or a rat (eg, Wistar, SD, etc.).
  • mammal in the recombinant vector that can be expressed in mammals, human and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • Examples of the mutant DNA of the present invention include those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition or deletion of bases, DNA with substitution or the like is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same or different species as the animal of interest.
  • the present invention When DNA of the present invention is transferred, DNAs derived from various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having a high homology to the DNA are expressed.
  • the DNA construct (eg, vector, etc.) to which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be obtained is microinjected into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses DNA can be created.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni monoleukemia virus, a vaccinia virus or a papulovirus. And animal viruses such as Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoter that regulates the DNA expression examples include, for example, (i) a promoter of DNA derived from virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) (Ii) promoters derived from various mammals (human, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, peroplacin II, elastase, erythropoietin, endocerin, muscle Creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor] 8, keratin Kl, K1 and ⁇ 14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase) 3 I Subunit, dystrophy , Tartaric acid-resistant alkaline phosphatase, atrial n
  • the vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the messenger RNA of interest in the DNA-transferred mammal (generally referred to as "Yuichi Mineta").
  • a sequence of each DNA derived from the DNA can be used, and preferably, SV40 terminator of simian virus is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are used to further express the target exogenous DNA at 5, upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region. Alternatively, it can be linked to the 3 'downstream of the translation region depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention includes DNA derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.).
  • Complementary DNA prepared by known methods from RNAs derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts can be obtained as raw materials as all or part of genomic DNACO from various commercially available genomic DNA libraries.
  • the foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the above-described cells or tissues by a point mutation induction method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the aforementioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Products after DNA transfer The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the animal indicates that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. means.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as a DNA-bearing animal in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. Means that. The offspring of such an animal that inherited the exogenous DNA of the present invention have an extraneous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and finally promotes the function of endogenous normal DNA, thereby finally obtaining the protein of the present invention. It may develop quality hyperfunction and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, elucidation of the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and examination of methods for treating these diseases. It is possible.
  • the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred still has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases related to the protein of the present invention, such as cancer.
  • ⁇ (Eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, tentacle cancer, brain tumor , Melanoma, hematological tumors, etc., neurodegenerative diseases (eg, Prevention of Luzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc., autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, 'glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.) ⁇ Can be used for therapeutic drug screening tests.
  • neurodegenerative diseases eg, Prevention of Luzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, 'glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome,
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention is confirmed to stably maintain exogenous DNA by mating, and is subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA. I can do it. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the animal produced after the transfer of the DNA means that all the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. I do.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells. 'Homozygous animals having the introduced DNA on both homologous chromosomes are obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed and pass all the offspring to have the DNA.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is ultimately suppressed by inhibiting the function of endogenous normal DNA.
  • Inactive refractory disease may occur, and it can be used as a disease model animal. For example, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functionally inactive refractory state of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention is used for inhibiting the function of a normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention (dominant negat). ive effect).
  • the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred is free of the present invention.
  • the prophylactic / therapeutic agent for the protein or function-inactive type refractory disease of the present invention for example, cancer, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, liver Cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.), neurodegenerative disease.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.
  • It can also be used for screening tests.
  • the protein-producing cells of the present invention can be specified, apoptosis, its relationship with differentiation or proliferation, or Alternatively, the signal transduction mechanism in them can be examined, and their abnormalities can be examined, etc., which are useful research materials for elucidating the protein of the present invention and its action.
  • the above-mentioned test was conducted. It is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic drug by using the method and the quantification method. It is still possible to study and develop a method for treating DNA associated with the protein of the present invention using the DNA transfer product of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated, and a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a reporter gene eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • test compound is administered to the animal according to the above (7), and the expression of the reporter gene is detected.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits is provided.
  • the non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA which is artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, thereby suppressing the expression ability of the DNA.
  • the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter, the knockout of the present invention) This is sometimes referred to as DNA.)
  • a non-human mammal embryonic stem cell hereinafter abbreviated as ES cell).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence or inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame of the codon or disrupting the function of the promoter or exon.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene represented by a hygromycin resistance gene, a lacZ ( ⁇ -galactosidase gene), cat ( A DNA sequence that disrupts exon function by introducing a reporter gene, such as chloramphenicol acetyltransferase gene, or terminates gene transcription in the intron between exons.
  • a reporter gene such as chloramphenicol acetyltransferase gene
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene is introduced into the chromosome of the animal by, for example, a homologous recombination method, and the obtained ES cells are used in the present invention.
  • the DNA sequence on or in the vicinity of the DNA as a probe was used as a primer for Southern hybridization analysis or the DNA sequence on the evening-targeting vector and the DNA sequence in the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector. Analysis by the PCR method It can be obtained by selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • the original ES cells for inactivating the DNA of the present invention by the homologous recombination method or the like may be used as described above, and the method of the known Evans and Kaufma may be used. It may be newly established according to. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, it is an alternative pure immunological and genetic background. For example, for the purpose of obtaining ES cells in which C57BLZ6 mice or C57BLZ6 mice were cultured, the number of eggs collected was improved by crossing with DBAZ2.
  • BDFi mice can be used satisfactorily because they have a high number of eggs collected and their eggs are robust, and they have C57BLZ6 mice as their background.
  • the obtained ES cells can be advantageously used when a pathological model mouse is created, because the genetic background can be replaced with C57BLX6 mice by pack-crossing with C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germ line chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, than suffices ES cell number of about 1 colony (about 50),
  • the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between male and female, and the early stage of culture can be greatly reduced by enabling early selection of male cells.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ontogenetic potential.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblast
  • LIF 10000 U / ml
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% Culture at about 37% CO 2, 90% air
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin Z0.1-5 mM EDTA, preferably about 0.1 % Trypsin (ZlmM EDTA) treatment, and seeding on freshly prepared feeder cells.
  • Such subculture is usually performed every 11 to 13 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • DNA of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention.
  • Expression-deficient cells are useful in cell biology studies of the proteins of the invention in the mouth.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is, for example, introduced into the mouse embryonic stem cell or mouse egg cell the targeting vector prepared as described above,
  • the DNA sequence in which the DNA of the present invention of the targeting vector is inactivated by the introduction causes homologous recombination to replace the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination. Thereby, the DNA of the present invention can be knocked out.
  • the cells in which the DNA of the present invention was knocked out were compared with the DNA sequence on the Southern Eight hybridization solution ⁇ 1 or the evening getter vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe.
  • the DNA can be determined by PCR analysis using the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used as the getter vector as a primer.
  • the cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by homologous recombination is cloned and the cells are cloned at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both a cell having a normal DNA locus of the present invention and a cell having an artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially obtained from the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the DNA locus of the present invention with mutation added thereto, for example, by judging coat color or the like.
  • the individual obtained in this manner is usually an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention. A homozygous deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which the evening-getting vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg by a microinjection method.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention it can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination of the gene.
  • the individual in which the DNA of the present invention is knocked out can be used for the animal obtained by mating after confirming that the DNA has been knocked out. Breeding can be performed in a breeding environment.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it may be caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. It can be a model for disease, and is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention.
  • the present invention is characterized in that a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and changes in the animal are observed and measured.
  • a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect against a disease caused by the disease for example, cancer.
  • Examples of the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention used in the screening: ining method include the same as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound. Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound and compared with a non-treated control animal, and the change in each organ, tissue, symptom of disease or the like of the animal is used as an index. The therapeutic and prophylactic effects of the test compound can be tested.
  • Methods for treating a test animal with a test compound include, for example, oral administration and intravenous injection, which are appropriately selected according to the symptoms of the test animal, properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, properties of the test compound, and the like.
  • test compound for example (for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor , Melanoma, hematological tumors, etc., neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, siedalen syndrome, insulin resistant diabetes)
  • a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and the test compound non-administration group
  • the difference in the degree of onset of cancer and the degree of healing of cancer are observed over time in the above tissue. .
  • the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a prophylactic / therapeutic effect against a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a medicament such as a safe and low toxic prophylactic / therapeutic agent for the disease. Further, a compound derived from the compound obtained by the above-mentioned screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (Eg, alkali metals) and the like, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Acid succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans or mammals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bush, horses, horses, cats, animals And monkeys).
  • the administration halo of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, it is generally used in adult (assuming a body weight of 60 kg) breast cancer patients. Administers about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg of the compound per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., but, for example, the compound is usually in the form of an injection in an adult (assuming a body weight of 60 kg) breast cancer patients It is convenient to administer by intravenous injection about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the present invention provides a compound which promotes or inhibits the activity of a promoter for a DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention and detecting the expression of a reporter gene. Or provide a method of screening for its salts.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be a non-human mammal deficient in DNA expression in the present invention described above, wherein the DNA of the present invention is obtained by introducing a reporter gene. Inactivated, the repo overnight One in which one gene can be expressed under the control of the promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • the reporter gene the same one as described above is used, and a 3-galactosidase gene (1 acZ), a soluble alkaline phosphatase gene or a luciferase gene is preferable.
  • the reporter gene is under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a tissue expressing the protein of the present invention originally 3-galactosidase is expressed instead of protein. Therefore, by staining with a reagent that serves as a substrate for 0-galactosidase, such as 5-promo-1-chloro-3-indolyl-j8-galactopyranoside (X-gal), it is convenient.
  • a reagent that serves as a substrate for 0-galactosidase such as 5-promo-1-chloro-3-indolyl-j8-galactopyranoside (X-gal)
  • X-gal 5-promo-1-chloro-3-indolyl-j8-galactopyranoside
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at 37 ° C. After reacting in the vicinity of X for about 30 minutes to 1 hour, the j8-galactosidase reaction is stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA / PBS solution, and the coloration may be observed. Further, mRNA encoding 1acZ may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, alkali metal). Is used, especially with physiologically acceptable acids Salting is preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid Succinic acid, tarta
  • a compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention can inhibit the expression of the protein of the present invention and the function of the protein, and thus, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer) , Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.)
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer
  • Prostate cancer esophageal cancer
  • stomach cancer e.g, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.
  • testicular cancer thyroid cancer
  • kidney cancer brain tumor, melanoma, blood tumor, etc.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and of low toxicity and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA when administered orally administered, generally the adult In a breast cancer patient weighing 60 kg, the compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 ing per day.
  • the single dose of the compound when administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound that inhibits the promoter activity of DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection to an adult.
  • the compound When administered to a breast cancer patient (assuming a body weight of 60 kg), the compound should be used in an amount of about 0.01-
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused by DNA expression deficiency of the invention or the development of therapeutic agents.
  • transgenic animal a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal).
  • transgenic animal transgenic animal
  • By preparing a protein it becomes possible to specifically synthesize the protein and examine its action in living organisms.
  • by binding an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line in which this is expressed the action of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of the protein of the present invention itself can be achieved.
  • Deoxycidin triphosphate ATP Adenosine triphosphate
  • a 1 a Alanine
  • Th r Threonine
  • TC thiazolidine-1 (R) monolithic lipoxamide group
  • DCC N, N'-dicyclohexylcarposimide
  • Example 2 shows the amino acid sequence of the MTp53IG-1 protein obtained in Example 1 (4).
  • FIG. 9 shows the base sequence of the primer used in Example 1 (4): FIG.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 (4).
  • Example 3 shows the amino acid sequence of MTP53IG-1 protein variant obtained in Example 1 (4).
  • [SEQ ID NO: 17] 3 shows the amino acid sequence of MTp53IG-1 protein variant type-2 obtained in Example 1 (4).
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of MTP53IG-1 protein variant Ipu-3 obtained in Example 1 (4).
  • Example 2 shows the amino acid sequence of MTp53IG-l (D) protein variant obtained in Example 4, ipu-2.
  • Example 4 shows the amino acid sequence of the MTp53IG-1 (D) protein palindand type-11 obtained in Example 4.
  • [SEQ ID NO: 29] 3 shows the amino acid sequence of the MTp53 IG-1 (D) protein obtained in Example 4.
  • FIG. 5 shows the nucleotide sequence of a DNA containing the full-length gene (excluding poly A) encoding the MTp53IG-1 (D) protein obtained in Example 4.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 4.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 4.
  • Example 7 shows the amino acid sequence of the partial peptide used in Example 6.
  • Escherichi a col i JM109 / MTp53IG-l obtained in Example 4 described below has been registered on March 12, 2003 and has the German name of 1-1 Chuo No. 6 (Postal Code 305-8566), Totoku, Tsukuba, Ibaraki, Japan. Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary under the deposit number FERM BP-8327.
  • Escherichia col i JMlQ9 / MTp53IG-l (D) obtained in Example 4 described below has been available since March 12, 2003, Tsukuba ⁇ Totoru 1 Chuo No. 6 in Ibaraki, Japan (zip code 305-8566) Deposit No. FERM BP-8328 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary.
  • the present invention will be more specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
  • the MTp53 gene was digested with Bam HI and Eco RI, and incorporated into a pIND vector (attached to the Ecdysone-Inducible Mammalian Expression System (Invitrogen)) treated with the same enzyme to obtain a pID-MTp53 vector.
  • the amino acid sequence at position 175 replaces arginine (R) with histidine (H).
  • a pIND-WTp53 vector in which a wild-type p53 gene was incorporated into a pIND vector was also prepared.
  • a pIND-CAT vector Invitrogen
  • CAT chloramphenicylase transferase
  • the -MTp53 vector, the pID-WTp53 vector or the pIND-CAT vector were co-transfected with the pVgRXR vector (attached to the Ecdysone-Inducible Mammalian Expression System (invitrogen)).
  • transfected cell lines H1299-MTp53, H1299-fTp53, HI299-CAT
  • GEBCO BRL geneticin
  • Zeosin Invitrogen
  • H1299-MTp53 induced MTp53 expression H1299-WTp53 induced WTp53 expression
  • HI299-CAT induced CAT expression Furthermore, by Western blotting using an anti-p53 antibody (Oncogene), it was confirmed that the expression of MTp53 was induced in H1299-MTp53 and that of ⁇ ⁇ 53 was induced in H1299-WTp53.
  • primer 3 SEQ ID NO: 6
  • primer 4 SEQ ID NO: 7
  • the elongation reaction was carried out using Marathon-ready human cololectal adenocarcinoma cDNA (CL0NTECH) as type III.
  • a primer 9 (SEQ ID NO: 10) and a primer 10 (SEQ ID NO: 11) were designed, and the mRNA prepared from H1299-MTP53 cells was reverse transcribed with the primer 9, and the PCR was performed using NA for type III.
  • a reaction (reaction cycle of 94 for 30 seconds, followed by 31 reaction cycles of 94 for 10 seconds-65 for 5 seconds-68 for 1 minute) was performed.
  • the cDNA fragments obtained in each reaction were sequenced and their base sequences were ligated. As a result, a full-length gene sequence having a total base sequence of 4550 bp (SEQ ID NO: 3) including 0RF of 11Obp (SEQ ID NO: 2) encoding 370 amino acids (SEQ ID NO: 1) was obtained.
  • the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is named MTP53IG-1 protein.
  • MTP53IG-1 protein The protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is named MTP53IG-1 protein.
  • a protein having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) in which 11 amino acids are added to the N-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was converted to the amino acid sequence of MTP53IG-1 protein variant type-1 and SEQ ID NO: 1.
  • the protein having the obtained amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) was designated as MTp53IG-1 protein variant type-13.
  • an oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) for the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 was designed, and a phosphorothiated oligonucleotide was synthesized, purified by HPLC (Amersham Pharmacia Biotech), and used for an introduction experiment.
  • a lipase sequence (SEQ ID NO: 15) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 was phosphorothioated in the same manner, and used by HPLC purification (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the primer 11 (SEQ ID NO: 31) and the primer 12 (SEQ ID NO: 32) were designed, and the mRNA prepared from H1299-MTp53 cells (Example 1 (2)) was used as the primer 12 (SEQ ID NO: 32).
  • a PCR reaction was performed using the cDNA reversely transcribed in step 1 for type I (reaction cycle of 94 for 1 minute followed by reaction cycles of 94 for 10 seconds-6IT 30 seconds-72 for 1 minute 30 seconds 35 times).
  • MTP53IG-1 (D) protein The protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 was named MTP53IG-1 (D) protein.
  • D The protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 was named MTP53IG-1 (D) protein.
  • MTp53IG-l (D) protein variant type-1 a protein having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 27) in which 11 amino acids are added to the N-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 is referred to as MTp53IG-l (D) protein variant type-1.
  • a protein having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 25) having 12 amino acids added to the N-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 was converted to the MTP53IG-1 (D) protein variant type 1-2, SEQ ID NO: 29
  • the protein having an amino acid sequence in which 14 amino acids were added to the N-terminal side of the sequence (SEQ ID NO: 23) was designated as MTP53IG-1 (D) protein variant Vein Ip-3.
  • a plasmid containing the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 is named pCR-BluntII-TOPO-MTp53IG-l (D), and this plasmid is introduced into Escherichia coli JM109 to form a transformant. Escherichia coli 109 / MTp53IG-l (D) was obtained.
  • a plasmid containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 was designated as pT7Blue-MTP53IG-1, and this plasmid was introduced into Escherichia coli top 109 to obtain a transformant Escherichia coli 109 / MTp53IG-1.
  • pT7-Blue-MTP53IG-1 and pCDNA3.1 (+) were digested with restriction enzymes Hind III and Xba I, and ligated using TaKaRa Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo). Plasmid DNA was introduced into Escherichia coli 109 by a known method to obtain a transformant (clone). Plasmids were extracted from this transformant, and the nucleotide sequence of the insert was confirmed using a sequencer (Applied Biosystem II :: ABI3100) to construct an animal cell expression vector pCDNA3.1 (+)-MTP53IG-1.
  • the cells were fixed with a 10% neutral formalin solution (Wako Pure Chemical Industries) at room temperature for 30 minutes and washed with PBS. Then, use a crystal violet (SIGMA) solution (dissolved in ethanol so that the crystal violet becomes 10%, and dilute it 100 times with PBS). Cells were stained at room temperature for 2 hours, washed with distilled water and air-dried. The area of the stained cells was measured with the ImagPro application (Media Cybernetics).
  • SIGMA crystal violet
  • SEQ ID NO: 1 299-313 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 300-314 of the amino acid sequence represented by 17; sequence Nos. 302-316 of the amino acid sequence represented by 18; SEQ ID NOs: 301-315 of the amino acid sequence represented by 23; SEQ ID NO: 299-313 of the amino acid sequence represented by 25; SEQ ID NO: 2.7
  • SEQ ID NO: 33 A 15-residue partial peptide (SEQ ID NO: 33) consisting of the amino acids 298-312 of the amino acid sequence represented by 7, and 287-301 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 It was synthesized by Fmoc solid phase synthesis method.
  • KLH Keyhole limpet hemocyanin
  • One immunized animal was a male male egret KBL: JW (10-week-old, Oriental yeast), and sensitization was performed by subcutaneous injection on the back and repeated three times every 14 days.
  • 0.5 mg of antigen was used for one sensitization, and whole blood was collected 52 days after the first sensitization to obtain serum.
  • the whole amount of the obtained serum was concentrated by ammonium sulfate salting out method, and the obtained crude IgG fraction was purified by a protein A affinity column (Amersham-Pharmacia), and the purified IgG fraction was purified by polyclonal chromatography. The null antibody fraction was used.
  • MTP53IG-1 protein (a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18) was detected using the peptide antibody prepared in Example 6.
  • Example 8 8 ⁇ 10 5 monkey kidney-derived COS-7 cells were seeded on a 6 cm Petri dish, cultured overnight, and then used Lipofectamin2000 (Invitrogen) according to the attached protocol to obtain the pCDNA3.1 (+) obtained in Example 5. -Introduced MTp53IG-l and PCDNA3.1 (+) (Invitrogen). The next day, the cells were detached, and SDS-PAGE was performed according to a conventional method, followed by Westin blotting. The peptide antibody prepared in Example 6 was used as the primary antibody, and the anti-Peacock IgG-HRP conjugate (Juckson ImmunoReseardi) was used as the secondary antibody. Detection was performed using ECL (Amersham-Pharmacia) according to the attached manual. As a result, it was confirmed that the peptide antibody prepared in Example 6 recognized the MTp53IG-1 protein.
  • Example 8 Lipofectamin2000 (Invitrogen) according to the attached protocol to obtain the
  • a protein of the present invention (a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 29), a polynucleotide encoding the protein,
  • Antibodies and the like include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer) Cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor, etc., autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, siedalen syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus) It is useful as a diagnostic marker.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer
  • the protein of the present invention, the polynucleotide of the present invention, the compound or its salt that promotes the activity of the protein of the present invention, and the compound or its salt that promotes the expression of the gene of the protein of the present invention include, for example, autoimmune diseases ( E.g., myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, chronic rheumatism, systemic lupus erythematosus, etc.) .
  • autoimmune diseases E.g., myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, chronic rheumatism, systemic lupus erythematosus, etc.
  • the antibody of the present invention, the antisense polynucleotide of the present invention, a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention, a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention include, for example, cancer (eg, , Colorectal healing, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor Prevention)-Can be used safely as a therapeutic agent.
  • cancer eg, Colorectal healing, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma, blood tumor Prevention

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Abstract

本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドは、例えば癌、神経変性疾患、自己免疫疾患などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質またはポリヌクレオチドを用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性もしくは該タンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物は、例えば癌、神経変性疾患、自己免疫疾患などの予防・治療剤として使用することができる。

Description

明 細書 新規タンパク質およびその D NA 技術分野
' 本発明は、 新規タンパク質、 その D NA、 該タンパク質遺伝子の発現を調節 する化合物のスクリーニング方法、 該スクリーニング方法で得られる化合物、 ， 該化合物を含有する医薬などに関する。 さらに詳しくは、 癌、 神経変性疾患ま たは自己免疫疾患の予防 ·治療剤などに関する。 背景技術
最近の研究の進展によって癌は複数の遺伝子変異が体細胞に蓄積し、 その結 果として細胞の増殖制御ができなくなる遺伝子の病気であることが証明されて きている。 これらのうち、 P53は、 ヒト癌で最も高頻度に異常が検出されている 癌抑制遺伝子であり、 Gl arres t , apopt os i sの誘導、 DNAに傷を受けた場合のチ エックポイント機構などの多様な生理機能を有していることが明らかにされて いる。 これらの機能は、 p53タンパク質が転写因子として作用し、 その標的遺伝 子の発現制御を行うことにより発揮されるものと考えられている。 そのため、 この P53に異常が生じる （変異型 p53) と、 上記作用が発揮されなくなり、 細胞 は癌化に進んでいくと考えられる。 一方、 p53を欠失している癌細胞に変異型 P53を導入すると、 癌細胞が軟寒天中でもコロニーを形成する、 または胆癌ヌ一 ドマウスモデルで腫瘍を形成するようになる （ネィチャージエネテイクス、 4巻、 42- 46頁、 1993年） 等の報告から、 変異型 p53は、 ただ単に正常な p53 (野生型 P53) の機能を失うだけではなく、 変異型 P53自身が、 積極的に癌化に関わって いることが示唆されている。 変異型 p53には、 変異している位置の相違によりい くつかのタイプに分かれ、 175番目のアルギニン （R) がヒスチジン （H) に置換 した変異型 P53を有する癌が、 最も予後が悪いという報告がある （キャンサーリ サーチ、 55巻、 5217 - 5221頁、 1995年） 。 さらに、 この変異型 p53も野生型 p53と 同様に、 下流遺伝子を誘導することが報告されている （オンコジーン 1-2巻、 194卜 1952頁、 1996年） 。 変異型 p53より誘導される遺伝子の中には細胞増殖、 薬 剤耐性、 アポト一シスの制御に関する遺伝子が報告されており （ジーン、 277巻、 15 - 30頁、 2001年） 、 これらの異常は癌化に密接に関与していると考えられる。 また、 P53の変異は癌のみでなく、 関節リウマチ （Semi n Ar thr i t i s Rheum 4月 号、 31 (5)巻、 299-310頁、 2002年） でも報告されている。
ヒトを含めた大部分の生物の細胞にはアポト一シス機構が備わっており、 こ れは胚発生期の形態形成、 組織の恒常性の維持、 有害 ·不要細胞の除去といつ た多彩な生命現象に関与している。 その反面、 アポトーシスの異常は、 癌や神 経変性疾患などの多くの疾患発症の原因にもなつていることから、 アポト一シ スの研究は疾患治療の面からも注目を集めている。 アポトーシスシグナルはァ ポトーシス促進に働く分子と抑制に働く分子のバランスで制御されている。 さ らに、 このシグナルに細胞増殖シグナルが関与することで、 細胞の生死が決定 されていると考えられる。 現在までに多数の細胞増殖あるいはアポトーシス制 御分子が報告されているが、 未知の制御分子の存在も考えられる。
遺伝子発現を網羅的に解析するために、 cDNAゃォリゴヌクレオチドを固定化 したマイクロアレイ法が開発され、 疾患特異的な遺伝子発現の変化を見出す技 術が普及し、 その有用性が確忍されている。 例えば、 （ 1116 1 社の661½¾ 1 システムは各種の疾患の診断や創薬標的遺伝子の発見に多用されつつある。 し かし、 GeneCh ipのプローブの多くは EST配列を基に作製されており、 その EST配 列を含む cDNAがコードするタンパク質が不明なことが多い。
新たな細胞増殖やアポトーシスの制御に関する遺伝子は、 その遺伝子の発現 亢進や発現減少に起因する種々の疾患、 例えば癌、 神経変性疾患、 自 S免疫疾 患などの予防や治療に役立つ医薬品の開発を可能にする。 これより、 ヒト由来 の新規な細胞増殖やアポトーシスの制御に関する遺伝子を見出すことが望まれ ていた。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 癌細胞 株から新規な塩基配列を有する cDNAをクローニングすることに成功し、 それに コードされるタンパク質が細胞増殖やアポトーシスに関係することを見出した。 本発明者は、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完 成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
( 2 ) 配列番号： 1、 配列番号： 16、 配列番号： 17または配列番号： 1 8で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
( 3 ) 配列番号： 23、 配列番号： 25、 配列番号： 27または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
(4) 上記 （1) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(5) 上記 （1) 記載のタンパク質または上記 （4) 記載の部分ペプチドを コ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(6) DNAである上記 （5) 記載のポリヌクレオチド、
(7) 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 19、 配列番号： 20また は配列番号： 21で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(8) 配列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 26、 配列番号： 28 または配列番号： 30で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(9) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(10) 上記 （9) 記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体、
(11) 上記 （10) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載のタンパ ク質または上記 （4) 記載の部分ペプチドを生成、 蓄積せしめ、 こ—れを採取す ることを特徴とする上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （4) 記載の部 分べプチドまたはその塩の製造法、
(12) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （4) 記載の部分べプチ ドまたはその塩を含有してなる医薬、 '
(13) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(14) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
(15) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （4) 記載の部分べプチ ドまたはその塩に対する抗体、
(16) 上記 （15) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(17) 上記 （15) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(18) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実 質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
(19) 上記 （18) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(20) 上記 · (1) 記載のタンパク質もしくは上記 （4) 記載の部分べプチ ドまたはその塩を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記載のタンパク質もし くは上記 （4) 記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する 化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
(21) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （4) 記載の部分べプチ ドまたはその塩を含有してなる、 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記
(4) 記載の部分べプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物ま' たはその塩のスクリーニング用キット、
(22) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上 記 （1) 記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、
(23) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる、 上記 （1) 記 載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスク リーニング用キット、
(24) 上記 （15) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載 のタンパク質の定量方法、
(25) 癌の予防 ·治療剤である上記 （16) または （19) 記載の医薬、
(26) 神経変性疾患または自己免疫疾患の予防 ·治療剤である上記 （ 1 2) または （13) 記載の医薬、
(27) 癌、 神経変性疾患または自己免疫疾患の診断薬である上記 （14) または （17) 記載の診断薬、
(28) (癌細胞の） アポトーシス促進剤である上記 （16) または （1 9) 記載の医薬、 (29) (癌細胞以外の細胞の） アポトーシス抑制剤である上記 （12) ま たは （13) 記載の医薬、
(29 a) 神経変性疾患または自己免疫疾患のアポトーシス抑制剤である上 記 （12) または （13) 記載の医薬、
(30) 哺乳動物に対して、 （a) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またその塩、 または （b) 該 タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与する ことを特徴とする癌の予防 ·治療法、
(31) 哺乳動物に対して、 （a) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またその塩、 または （b) 該 タンパク質の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩の有効量を投与する ことを特徴とする神経変性疾患または自己免疫疾患の予防 ·治療法、
(32) (a) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の活性を阻害する、 または （b) 該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する ことを特徴とする癌の予防 ·治療法、
(33) (a) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の活性を促進する、 または （b) 該タンパク質の遺伝子の発現を促進する ことを特徴とする神経変性疾患または自己免疫疾患の予防 ·治療法、
(34) 癌の予防 ·治療剤を製造するための （a) 上記 （1) 記載のタンパク 質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またその塩、 または （b) 該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用、 (35) 神経変性疾患または自己免疫疾患の予防 ·治療剤を製造するための (a) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活 性を促進する化合物またその塩、 または （b) 該タンパク質の遺伝子の発現を促 進する化合物またはその塩の使用などを提供する。
さらに、
(36) 上記 （20) 記載のスクリーニング方法または上記 （21) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質もし くは上記 （4) 記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物また はその塩、
(37) 上記 （20) 記載のスクリーニング方法または上記 （21) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質もし くは上記 （4) 記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物また はその塩、
(38) 上記 （36) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (39) 上記 （37) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (40) 上記 （22) 記載のスクリーニング方法または上記 （23) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質遺伝 子の発現を阻害する化合物またはその塩、
(41) 上記 （22) 記載のスクリーニング方法または上記 （23) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質遺伝 子の発現を促進する化合物またはその塩、
(42) 上記 （40) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (43) 上記 （41) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(44) 癌の予防 ·治療剤である上記 （38) または （42) 記載の医薬、 (45) 神経変性疾患または自己免疫疾患の予防 ·治療剤である上記 （3 9) または （43) 記載の医薬、
(46) 癌細胞のアポトーシス促進剤である上記 （38) または （42) 記 載の医薬、
(47) (癌細胞以外の細胞の） アポト一シス抑制剤である上記 （39) ま たは （43) 記載の医薬、
(48) 神経変性疾患または自己免疫疾患のアポ卜一シス抑制剤である上記 (39) または （43) 記載の医薬なども提供する。 発明を実施するための最良の形態
配列番号： 1または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 （以下、 本発明のタンパク 質と称することもある） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例、 肝 細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 勝臓 細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム 細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋 細胞、 線維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファ —ジ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞も しくはガン細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大 脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状 腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であ つても'よい。
配列番号： . 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特 に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァ ミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸- 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好 ましい。
配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する アミノ酸 S3列などが挙げられる。 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 2 9で表されるァミノ 酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 2 9で表されるァ ミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質な どが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 細胞増殖促進活性、 アポトーシス抑 制作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学的に） 同質であることを示す。 したがって、 細胞増 殖促進活性が同等 （例、 約 0. 01〜100倍、 好ましくは約 0. 1〜10倍、 より好まし くは 0. 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の 分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
細胞増殖促進活性などの活性の測定は、 公知の方法に準じて行うことができ、 例えば、 Internat ional Journal of Cancer 88巻、 162〜171頁、 2000年に記載 の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
アポトーシス抑制作用などの活性の測定は、 公知の方法に準じて行うことが でき、 例えば、 Proceedings of the Nat ional Academy of Sc iences of the Uni ted States of America 92巻、 7162〜7166頁、 1995年に記載の方法またはそ れに準じる方法に従って測定することができる。
また、 本発明のタンパク質としては、 例えば、 （1 ) ( 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好まし くは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程 度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 (i i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好 ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付 加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましく は 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5 ) 個） のアミノ酸が揷入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 1で表され るアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された ミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパ ク質などのいわゆるムティン、
( 2 ) (i) 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例 えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個 程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミ ノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列 に 1または 2個以上 （例えば 1〜2 O 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 ( 1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 2 9で 表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好まし くは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程 度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 (iv) 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が 他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたァ ミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿 入、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 (カルボキシル末端) である。 配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明のタンパ ク質は、 C.末端が力ルポキシル基 （- C00H) 、 カルポキシレート（- C00—) 、 アミ ド （_CONH2) またはエステル （- COOR) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピル、 n -ブチルなどの C ι_6アルキル基、 例えば、 シクロペンチ ル、 シクロへキシルなどの c3—8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひーナ フチルなどの C 6_12ァリ一ル基、 例えば、 ベンジル、 フェネチルなどのフエニル 一（：卜2アルキル基もしくはひ一ナフチルメチルなどの —ナフチルー ( 卜2アル キル基などの C 7— 14ァラルキル基、 ピバロイルォキシメチル基などが用いられる。 本発明のタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルポキシレ一 ト） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されてい るものも本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例え ば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン 残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アル カノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断され て生成する N末端のダル夕ミン残基がピ口ダル夕ミン酸化したもの、 分子内の アミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば- 0H、 - SH、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 ィ ンドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセ チル基などの C ,_6アルカノィル基などの ァシル基など） で保護されている もの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質な ども含まれる。
本発明のタンパク質の例としては、 例えば配列番号： 1または配列番号： 2 9で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。 具体例と しては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、 配列番 号： 1 6で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 1 7で表 されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 1 8で表されるァミノ 酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 2 3で表されるアミノ酸配列を有す るタンパク質、 配列番号： 2 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 2 9で表されるァミノ酸配列を含有する夕ンパク質などがあげられる。
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明のタンパク質 の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明のタンパク質と同様の 性質を有するものであればいずれのものでもよい。 例えば、 本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 20個以上、 好ましくは 50個以上、 さらに好ましくは 70個以上、 より好ましくは 100個以上、 最も好ましくは 200個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。 また、 本発明の部分ペプチドは、 該アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が 欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましく は数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入され、 または、 そのアミノ酸配列中の 1 または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに 好ましくは 1〜 5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。 また、 本発明の部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 （- C00H) 、 カルポキ シレート （- C00_) 、 アミド （- C0NH2) またはエステル （- C00R) の何れであつ てもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明のタンパク質と同様に、 C末端以外に力ルポキシル基 (またはカルポキシレート） を有しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基で保護され ているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピロダル夕 ミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護 されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ぺプ チドなども含まれる。 — ·
本発明の部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。 本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的に許容され る酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属） などとの塩が用いら れ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まレぃ。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるい は有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハ ク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベ ンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、 前述したヒ トや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって 製造することもできるし、 タンパク質をコードする D N Aを含有する形質転換 体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド合 成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはそのアミド 体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 その ような樹脂としては、 例えば、 'クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベ ンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4 _ベンジルォキシベンジルァ ルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒド ロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹 脂、 4一 （2 '， 4 '—ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 ( 2 '， 4 'ージメトキシフエ二ルー F m o cアミノエチル) フエノキシ樹脂 な^を挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ά—ァミノ基と側鎖官能 基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公 知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパ ク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希— 釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質もし くは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 力ルポ ジイミド類としては、 D C C、 Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν— ェチルー N'— ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いられ る。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t， H O〇 B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物ま たは H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミ ノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク 質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例え ば、 N， N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチレアセトアミド， N—メ チルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲ ン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコ一ル類、 ジメチルスル ホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフラン などのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 俳 酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。 反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られ ている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 t〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択さ れる。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニン ヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を 行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができ る。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァ セチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t一ペンチルォキ シカルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4 _メトキシベンジルォキシ 力ルポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフル ォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2一二トロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフィノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへ プチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環 状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4—ニト口べンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4—クロ口べ ンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルボニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級 (Cト 6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジル才 キシカルポニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが 用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テ トラヒドロピラエル基、 t—ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz し C 12 — B z l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキ シ— 2， 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメ チル、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fm o cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4, 5 -トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 HONB, N—ヒドロキシスクシミ ド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 H〇B t) とのエステル〕 などが用いられ る。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸ァ ミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 ？ ー黒ぁ¾ぃほ？（1ー炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジィソプロピルェチルアミン、 トリエ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナ卜リゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 20 C〜40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオア二ソール、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフィド、 1 , 4一ブタンジチオール、 1-2—エタンジチオールなど のようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾー ル保護基として用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエノ一ル処理 により除去され、 トリブトプアンのィンドール保護基として用いられるホルミ ル基は上記の卜 2—エタンジチオール、 1 , 4一ブタンジチオールなどの存在下 の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどに よるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の α—カルボキシル基をアミド化して保護した 後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該 ぺプチド鎖の Ν末端の ーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部 分ペプチドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質また は部分べプチドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記したよ うな混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護タンパク質またはべプチドを精製した後、 上記方法に よりすベての保護基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ること ができる。 この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して 精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の夕ンパク質またはべプチドのァ ミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末 端アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エス テルとした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望のタ ンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の部分べプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のぺプチドの合成法に 従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断することに よって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成 法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の部分ペプチドを 構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が 保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造する ことができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の （i) 〜 （V) に記載された方法が挙げられる。
(i) M. Bodanszky および M.A. OndettK ペプチド ·シンセシス （Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(ii) Schroederおよび Luebke、 ザ ·ペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 'タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年）
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出，蒸留，カラムクロマトグ ラフィー ·液体ク口マトグラフィ一 ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分 ぺプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが遊 離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に 変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によつて遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述した本発 明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるもので あってもよい。 好ましくは DNAである。 DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲ ノム DN Aライブラリ一、 前記した細胞■組織由来の cDNA、 前記した細 胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織 より totalRNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT-PCR法と略称する) によ つて増幅することもできる。 本発明のタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば （1) 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DNA、 (2) 配列番号： 2で表される塩基 配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 前記した配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的 に同質の性質を有するタンパク質をコードする DNA、 (3) 配列番号： 28 で表される塩基配列を含有する DNA、 (4) 配列番号： 28で表される塩基 配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 前記した配列番号： 29で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質 的に同質の性質を有するタンパク質をコ一ドする DN Aであれば何れのもので もよい。
配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DNAとしては、 例えば配列番 号： 3で表される塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 19で表される塩基 配列を含有する DNA、 配列番号： 20で表される塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 21で表される塩基配列を含有する DNAなどが挙げら lる。
配列番号： 28で表される塩基配列を含有する DNAとしては、 例えば配列 番号： 22で表される塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 24で表される 塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 26で表される塩基配列を含有する D NA、 配列番号： 30で表される塩基配列を含有する DNAなどが挙げられる。 配列番号： 2または配列番号： 28で表される塩基配列とハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2 または配列番号： 28で表される塩基配列と約 50%以上、 好ましくは約 6 0%以上、 さらに好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 特 に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩 基配列を含有する DN Aなどが用いられる。 '
ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のラ イブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこ とができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン卜な条件に従って行なうこ とができる。 .
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜40 mM、 好ましくは約 19〜2 OmMで、 温度が約 50〜70°C、 好ましくは約 60〜65 の条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が ¾も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 3で表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番 号： 16で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAと しては、 配列番号： 19で表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番 号： 17で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAと しては、 配列番号： 2.0で表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番 号： 18で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAと しては、 配列番号： 21で表される塩基配列を含有する DNAが、 配列番号： 29で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとして は、 配列番号： 28で表される塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 30で 表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番号： 27で表されるァミノ 酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 26で 表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番号： 25で表されるァミノ 酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 24で 表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番号： 23で表さ.れるァミノ 酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 22で 表される塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 DNA) として は、 前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであ ればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブ ラリー、 前記した細胞 '組織由来の cDNA、 前記した細胞'組織由来の cD NAライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列蕃号： 2 または配列番号： 28で表される塩基配列を含有する DNAの一部分を有する DNA、 または配列番号： 2または配列番号： 28で表される塩基配列とハイ ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 本発明の タンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DN Aの一 部分を含有する DNAなどが用いられる。
配列番号： 2または配列番号：· 28で表される塩基配列とハイブリダィズで きる DNAは、 前記と同意義を示す。
ハイプリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と 同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする DNAのク ローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と 略記する場合がある） を完全にコードする DNAのクロ一エングの手段として は、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成 DNAプ ライマーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み 込んだ DN Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする DN A 断片もしくは合成 DNAを用いて標識したものとのハイブリダィゼ一シヨンに よって選別することができる。 八イブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のラ イブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこ とができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCR、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA-LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じ る方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードする DN Aは目的によりそのまま、 ま たは所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用するこ とができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有 し、 また 3， 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAG を有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合 成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質 をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断 片を適当な発現べクタ一中のプロモー夕一の下流に連結することにより製造す ることができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR 3 25， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 11 0， pTP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 P SH 19, pSH 15) 、 λファ一ジなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 p XT1、 pRcZCMV、 pRc/RS V p c D N A I /N e oなどが用い られる。
本発明で用いられるプロモータ一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SRo;プロモーター、 SV40プロモーター、 L TRプロモーター、 CMVプロモータ一、 HS V-TKプロモータ一などが挙げ られる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモー夕一、 SRo;プロ モータ一などを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモー夕一、 λPLプ ロモ—ター、 ι ρ ρプロモータ—、 T7プロモータ一などが、 宿主がバチルス 属菌である場合は、 SPOlプロモ一夕一、 SP02プロモー夕一、 p e nP プロモー夕一など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGK プロモータ一、 GAPプロモー夕一、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿 主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモー夕一 などが好ましい。
発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ一力一、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いること ができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺 f云子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が 挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マ一カーとして使用する場合、 目的遺伝子 チミジンを 含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル 配列、 0即 A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひーァ ミラーゼ*シグナル配列、 サブチリシン · グナル配列などが、 宿主が酵母で ある場合は、 MF o! ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動 物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α—インターフエ口 ン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Αを含有す るべクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、.ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ
(Escherichia coli) K 1-2 - DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 巻， 160 (1968)〕 ， J M 103 [Nucleic Acids Research, 9巻， 309 (1981)〕 ， J A221 (Journal of Molecular Biology, 120巻， 517(1978)〕 ， HB 101 [Journal of Molecular Biology, 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 [Genetics, 39 卷， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus
subtilis) MI 114 〔Gene， 24巻， 255 (1983)〕 , 207 -21 [Journal of Biochemistry, 95巻， 87(1984)) などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22 , AH22R -， NA87 - 11 A, DKD- 5D, 2 OB— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharoiyces pombe) N CYC 1913, NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞） 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、
Mamestra brass icae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細 胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細 胞 (ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 In Vivo, 13, 213-217, (1977)) な どが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔Nature，315 巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， Ve r o， チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤ ィニーズハムスター細胞 CH〇 （以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20, マウスミエ口一マ細胞， マウス ATDC 5細胞， ラット GH3, ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69巻， 2110 (1972)や Gene, 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従つて行なう ことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General
Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。 酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182-
187 (1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻， 1929 (1978)などに記載の方法に 従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Teclmology,6, 47- 55 (1988)などに記載の方法に従つて行なうことができる。 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プ ロトコール. 263-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52巻， 456 (1973)に記載 の方法に従つて行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする D NAを含有する発現べクタ一で 形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必、要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩ィ匕マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生 長促進因子などを添加してもよい。 培地の; p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 [Journal of Experiments in Molecul ar Genet ics, 431-433, Cold Spr ing Harbor Laboratory, New York 1972) が好ましい。 ここ に必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 )3—インド リルァクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜4 3 °Cで約 3〜2 4時 間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0 ~ 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間 if ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダー (Burkholder) 最小培地 [Proc. Nat l . Acad. Sci . USA, 77 巻， 4505 (1980)〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 〔Proc. Nat l . Acad. Sc i. USA, 81巻， 5330 (1984)〕 が挙げられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整する のが好ましい。 培養は通常約 2 0 °C〜3 5 で約 2 4〜7 2時間行ない、 必要 に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清 等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜6 . 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日間行ない、 必要 に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜2 0 %の胎児牛血清を含む ME M培地 [； Sc ience, 122巻， 501 (1952)〕 , DM E M培地 01(^，8巻，396 (1959)〕 ， R P M I 1 6 4 0培地 〔The Journal of the American Medical Assoc iat ion 199卷， 519 (1967)〕 , 1 9 9培地
〔Pro.ceeding of the Society for the' Biological Medic ine, 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C 〜4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明の夕 ンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方 法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超 音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適 宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 ト リトン X— 1 0 0™などの界面 ¾f生^力含まれていてもよい。 培褰液中に夕 ― パク質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるい は細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質 の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用 する方法、.透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換ク 口マトグラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグ ラフィ一などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィ 一などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利 用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られ た場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白 修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部 分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 ダリ コシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィ ムィムノアッセィやウェスタンブロッテイングなどにより測定することができ る。
本発明のタンパク質もしくは部分ぺプチドまたはその塩に対する抗体は、 本 発明のタンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれ ば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗体の説明 においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある） に対す る抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗 または 血 清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位 にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生 能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバン トを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行 われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよ びラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 5 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種 動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ド一マを調製することができる。 .抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の 標識化夕シパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性0 を測定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーとミルスタインの方法 〔Nature、 256、 495 (1975)〕 に従い実施するこ とができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) や センダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 / 0 , A P— 15 などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。
用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 : 1 〜20 : 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜80 %程度の濃度 で添加され、 20〜40° (：、 好ましくは 30〜37°Cで 1〜10分間インキュベートするこ とにより効率よく細胞融合を実施できる。
0 モノクローナル抗体産生ハイプリド一マのスクリーニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させ ― た固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放 射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる 細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロ5 ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫 グロプリン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上 清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合 したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 行なうこ仁ができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地とし ては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1〜20 %、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 1640培地、 1〜 10%の牛胎児血清を含む GIT培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイプリドー マ培養用無血清培地 （SFM- 101、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40°C、 好ましくは約 37°Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間 2週間である。 .培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なう ことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価 の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノク.ローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロプリ ンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 DEAE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合 固相あるいはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体 のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうこ とができる。
〔ポリクローナル钪体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に 従って製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） 自体、 あ るいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗 体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパ ク質に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造 することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合 体に関し、 キャリア一蛋白質の種類およびキャリア一蛋白質とハプテンとの混 合比は、 キヤリァー蛋白質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率 良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプ テン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカプルさせる方 法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアー蛋白質の力プリングには、 種々の縮合剤を用い ることができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性ェ ステル、 チオール基、 ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用い られる。 '
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい ' は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なわれる。 ポリクロ一ナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価め測定は、 上記の钪血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこ とができる。
本発明のタンパク質または部分べプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D NA (以下、 アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、 これらの D NAを本発明の D NAと略記する場合がある） ） の塩基配列に相補的な、 また は実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレ ォチドとしては、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) の塩基配列に相補 的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、 MD NAの堯 現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンスポリヌクレ ォチドであってもよいが、 アンチセンス D N Aが好ましい。
本発明の D NAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D NA に相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D NAの相補鎖） の全塩基配列ある いは部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは 約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが 挙げられる。 特に、，本発明の D NAの相補鎖の全塩基配列うち、 （ィ） 翻訳阻 害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 本発明のタンパク質の
N末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列 など） の相補鎖と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリ ヌクレオチドが、 （口） R N a s e Hによる R NA分解を指向するアンチセン スポリヌクレオチドの場合は、 ィ トロンを含む本発明の D N Aの全塩基配列 の相補鎮と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 % 以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレ ォチドがそれぞれ好適である。
具体的には、 配列番号： 2または配列番号： 2 8で表される塩基配列を含有 する D NAの塩基配列に相補的な、 もしくは実質的に相補的な塩基配列、 また はその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、 好ましくは、 配列番 号： 2または配列番号： 2 8で表される塩基配列を含有する D N Aの塩基配列 に相補な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド (より好ましくは、 配列番号： 2または配列番号： 2 8で表される塩基配列を 含有する D N Aの塩基配列に相補な塩基配列、 またはその一部分を有するアン チセンスポリヌクレオチド) が挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5 〜3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレア一ゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D NAを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホ スホロチォエート、 メチルホス ネ一ト、 ホスホロジチォネートなどの化学修 飾りん酸残基に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシ リポース） は、 2， —O—メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていても よいし、 塩基部分 （ピリミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであっても 'よく、 配列番号： 2で表される塩基配列を有する D NAにハイブリダィズする ものであればいずれのものでもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチド は、 公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明の夕ンパク質遺伝子の複製または発現を阻害するこ とのできるアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化した、 ある いは決定されたタンパク質をコードする D N Aの塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 かかるポリヌクレオチド (核酸） は、 本発明のタンパク質遺伝子 . の R NAとハイブリダィズすることができ、 該 R NAの合成または機能を阻害 することができるか、 あるいは本発明のタンパク質関連 R NAとの相互作用を 介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発 明の夕ンパク質関連 R N Aの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 お よび本発明のタンパク質関連 R N Aと特異的にハイブリダイズすることができ るポリヌクレオチドは、 生体内および生体外で本発明の夕ンパク質遺伝子の発 現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用で ある。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または 核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌ クレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあ るペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝子の 5 ' 端ヘアピンル一プ、 5 ' 端 6 _ベ一スペア · リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポ リペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドロ ム領域、 および 3 ' 端ヘアピンループは好 ましい対象領域として選択しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対 象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関 係は、 対象物とハイブリダィズ矛 ことができるポリヌクレオ —との関係ほ、
「アンチセンス」 であるということができる。 7ンチセンスポリヌクレオチド は、 2—デォキシ一D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポ —スを含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グ リコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド 骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特 異的な核酸ポリマ一） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングゃ塩基の 付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それ らは、 2本鎖 DNA、 1本鎖 DNA、 2本鎖 RNA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA： RNAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド (または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、.キャップの付いたもの、 メチル化 されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内 ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネ ート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 カルパメートなど） を持つ もの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌク レアーゼ ·インヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ— L—リ ジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有して る もの、 インターカレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど） を持つ もの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性 の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合 を持つもの （例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで： Γヌ クレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジ ン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつような ものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよび i リ ミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を 含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチ ドはまた糖部分が修飾されていてよぐ、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲン とか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官 能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 RNA、 DNA、 ある いは修飾された核酸 （RNA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例とし ては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシドア ミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それ. に限定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好 ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なも のにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖 に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセ ンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami e t al .， P arm Tech Japan, Vo l . 8, pp. 247, 1992 ; Vol . 8， pp. 395, 1992 ; S. T.
Crooke et al . ed. , Ant i sense Research and Appl i cat ions, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステ リルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸 の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオ シド結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレ ァーゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙 げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコ一ル、 テト ラエチレングリコールなどのグリコ一ルをはじめとした当該分野で知られた水 酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明めタンパク質の生体内や生体外の翻訳系 を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用 できる。 以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本 発明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べ プチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D NA) (以下、 本発明のポリヌ クレオチド、 本発明の D NAなどと略記する場合がある） 、 本発明のタンパク 質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略 記する場合がある） 、 および本発明の D NAのアンチセンスポリヌクレオチド (以下、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある） の用 途を説明する。
本発明のタンパク質は、 細胞増殖促進活性、 アポトーシス抑制作用などを有 するので、 本発明のタンパク質、 本発明のポリヌクレオチド、 本発明の抗体な どは、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パ一キ ンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性 硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） などの疾患マ一カーとして有用であり、 上記疾 患の予防 ·治療剤としても有用である。 さらに、 本発明のアンチセンスポリヌ クレオチド、 本発明のタンパク質の活性を調節 （促進または阻害） する化合物' またはその塩、 本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 （促進または阻害） す る化合物またはその塩なども、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲 状腺癌、'塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マ、 血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無 力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シェ一ダレン症候群、 インスリン抵抗性糖 尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性ェリテマト一デスなど) などの予防'治療剤 として有用である。
また、 本発明のタンパク質の遺伝子は、 .正常組織での発現が低いことから、 副作用の少ない癌の予防 ·治療剤のスクリーニングが可能になる。 また、 変異 型 P53を保持している癌は、 臨床で抗癌剤が効きにくい、予後が悪い等、 悪性度 が高いことが知られている。 本発明のタンパク質遺伝子は、 変異型 P53の下流で 働くことより、 本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのアンチセ ンスポリヌクレオチド、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくは その塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、 または本発明のタンパク質に対する抗体などは、 悪性度の高い癌にも効果的で ある。 '
( 1 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質の活性を阻害すると癌細胞がアポトーシスを起こす。 従 つて、 本発明のタンパク質の活性を調節 （促進または阻害） する化合物または その塩は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝 臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣瘅、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シェ一ダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウ マチ、 全身性エリテマトーデスなど） などの予防 ·治療剤として使用すること ができる。
好ましくは、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道 癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メ ラノ一マ、 血液腫瘍など） などの予防'治療剤として使用することができる。 本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩は、 例えぼ神経変性 疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン 抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） などの予 防 ·治療剤として使用することができる。
したがって、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性を調節する 化合物またはその塩のスクリーニングのための試藥として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明 のタンパク質の活性 （例、 細胞増殖促進活性、 アポト一シス抑制作用など） を 調節 （促進または阻害） する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供 する。
より具体的には、 例えば、 （i) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する 細胞の細胞増殖促進活性またはアポトーシス抑制作用と、 (i i) 本発明のタン パク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物の細胞増殖促進活性 またはアポトーシス抑制作用との比較をすることを特徴する本発明のタンパク 質の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法が用いられる。 具体的には、 上記スクリーニング方法において、 例えば、 （i) と （i i) の場 合において、 細胞増殖促進活性またはアポトーシス抑制作用を、 コロニー形成 能または DNAの断片化を検出する ELISA反応を利用して測定し、 コロニ一面積ま、 たは DNAの断片化量を指標として比較する。
上記細胞増殖促進活性は、 公知の方法、 例えば、 Internat ional Journal of Cancer 88巻、 162〜171頁、 2000年に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従 つて測定することができる。
上記アポ! シス抑制作用は、 公知の方法、 例えば、 Proceed ings of the Nat ional Academy of Sc iences of the Uni ted States of Amer ica 92卷、 7162 〜7166頁、 1995年に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定するこ とができる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙 げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明のタンパク質を産生する 能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファ一に浮遊して調製する。 バッファーには、 pH約 4〜10 (望ましくは、 pH約 6〜8) のリン酸バッファー、 ほ う酸バッファ一などの、 本発明のタンパク質の活性を阻害しないバッファ一で あればいずれでもよい。 ■
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述し た本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するベクターで形質転換され た宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C O S 7細胞、 C H O細胞、 H E K 2 9 3細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スク リーニングには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明のタン パク質を細胞膜上、 細胞内に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。 本 発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、 前記した本発明の形質変換 体の培養法と同様である。
例えば、 上記 . (i i) の場合における活性を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促進させる試 験化合物を、 本発明のタンパク質の活性を促進する化合物として、 上記 （i i) の場合における活性を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害させる試験化合物を、 本発明の タンパク質の活性を阻害する化合物としてそれぞれ選択することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血 漿などから選ばれた化合物である。 該化合物の塩としては、 前記した本発明の ペプチドの塩と同様のものが用いられる。
本発明の夕ンパク質遺伝子も、 細胞増殖およびアポ卜一シス抑制 関わって いることより、 本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 （促進または阻害） す る化合物またはその塩は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食. 道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道瘟、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状— 腺癌、 勝臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 ァ ルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力 症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シェ一ダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿 病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） などの予防 ·治療剤と して使用することができる。 - 好ましくは、 本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその 塩は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤として使用することができる。 本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩は、 例えば神 経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾 患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症， シエーダレン 候群、 ィ ンスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） な どの予防 ·治療剤として使用することができる。
したがって、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) は、 本発明のタンパ ク質の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリ一ニングのための 試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、 （i i i) 本発明のタンパク質を産生する能力を 有する細胞を培養した場合と、 （iv) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク 質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とす るスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、 （i i i) と （iv) の場合における、 前記遺伝子の発現量 (具体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードする mR NA量） を測定して、 比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を認識す る抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウエスタン 解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することが できる。
mR NA量の測定は、 公知の方法、 例えば、 プローブとして配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 2 8もしくは配列番号： 3 0またはその一部を含有 する核酸を用いるノーザンハイブリダィゼ一ション、 あるいはプライマ一とし て配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 2 8もしくは配列番号： 3 0また はその一部を含有する核酸を用いる P C R法またはそれ【こ準じる方法に従い測 定することができる。 例えば、 上記 （iv) の場合における遺伝子の発現を、 上記 （i i i) の場合に比 ベて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促 進させる試験化合物を、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を促進する化合物 として、 上記 （iv) の場合における遺伝子の発現を、 上記 （i i i) の場合に比べ て、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害 させる試験化合物を、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物と してそれぞれ選択することができる。 '
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質もしくは部分ぺプ チドまたはその塩、 または本発明のタンパク質もしくは部分べプチドを産生す る能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク 質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明の タンパク質の活性を調節する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝 子の発現を調節する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用 いられる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 および本発明の タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩はそれぞれ、 例えば 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾 臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一 マ、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤などの安全な医薬として有用である。 本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩、 および本発明の タンパク質の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩はそれぞれ、 例えば、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫 疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマト一デスなど） などの予防 '治療剤などの安全な医薬として有用である。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、 常套手段に 従って製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的 には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 ： カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあ げられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野におい て通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤甩の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネ シゥムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関 節内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは 油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液と しては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが 用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリ アルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ一ル) 、 非ィォ ン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 80、 HCO-50
(.polyoxyethylene (50mol) adduc t o f hydrogenated cas tor o i l) 〕 などと併用 してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解 補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いら れる坐剤は、 上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによ つて調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜 100mg、 その他の剤形では 10〜250mgの上記化合物が含有されていることが好ま しい。
なお前記した各組成物は、 上記化合物との配合により好ましくない相互作用 を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口 的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル ートなどにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のタンパク 質の活性を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人 (体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物またはその塩を約 0. 1〜 100mg、 好ましくは約1. 0〜501½、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口 的に投与する場合は、 該ィ匕合物またはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾 患などによっても異なるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質 の活性を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人 （体重 60kgとし て） に投与する場合、 一日 つき該化合物またはその塩を約 0. 01〜30mg、 好ま しくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. l〜10mgを癌病変部に注射により投与 するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投 与することができる。
例えば、 アルツハイマー病の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を促進 する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとし て） においては、 一日につき該ィ匕合物またはその塩を約 0. l〜100mg、 好ましく は約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場 合は、 該化合物またはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによって も異なるが、 例えば、 アルツハイマー病の治療の目的で本発明のタンパク質の 活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人 （体重 60kgとし て） に投与する場合、 一日につき該ィヒ合物またはその塩を約 0. 01〜30mg、 好ま しくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. l〜10mgを癌病変部に注射により投与 するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投 与することができる。
( 2 ) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合があ る） は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検液中 の本発明のタンパク質の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに 使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検波および標識化された本発明のタンパク質とを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を 測定することを特徴とする被検液中の本発明の夕ンパク質の定量法、 および
(i i) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することを特徴とする被検波中の本発明のタンパク質の定量法を提 供する。
上記 （i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部 を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体 であることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクロ一ナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を 行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的に は、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべき ものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定 法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合 法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔 i〕 、 ci3ln 、 〔¾〕 、 〔i4c〕 などが用いられる。 上記酵素とし ては、 安定で比活性の^:きなものが好ましく、 例えば、 一ガラクトシダーゼ、 β―ダルコシダーゼ、 アル力リフォスファ夕一ゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ 酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミ ン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては， 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用 いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン 系を用いる.こともできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 ま 通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹 脂、 あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体 を反応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること により被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらし て行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じること ができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体ある いは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感 度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタン パク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次 反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体 が、 本発明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体 は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を 識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば， 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができ る。.
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F) と、 抗体と結合した標識抗原 （B) とを分離し (BZF分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量 する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレ ングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1 抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い 第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合 応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検波中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検波中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメト リ一などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定 系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成 書などを参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄 治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 3版 （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 （"Methods in ENZY OLOGYj Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)) , 同書 Vol.
73 (Immunochemical Techniques (Part B)) , Vol. 74 (Immunochemical
Techniques (Part C))、 同書 Vol. 8 (Immunochemical Techniques (Part
Deselected Immunoassays)) ¾ 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoc tonal Antibodies and General Immunoassay Methods)) 同書 Vol . 121 (Immunochemical Techniques (Part r.Hybridoma Technology and
Monoclonal Ant ibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照するこ とができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク 質を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量すること によって、 本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、 例えば癌 (例、 大腸癌、 、乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎 癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 睇臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液 腫瘍など） である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 本発明のタンパク質の濃度の減少が検出きれた場合、 例えば神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無 力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖 尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマト一デスなど） などである、 または 将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタン パク質を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質を 精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタン パク質の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのた めに使用することができる。 ( 3 ) 遺伝子診断薬
本発明の D NAは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明の タンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NAまたは mR NAの異常 (遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 D NAまたは mR N Aの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 D NAまたは mR NAの増加ある いは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明の D NAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン 八イブリダィゼ一シヨンや PCR- SSCP法 （Genomics,第 5巻， 874〜879頁（1989年）、 Proceedings of the Nat ional Academy of Sc iences of the USA, 第 86卷， 2766 〜2770頁（1989年)） などにより実施することができる。
例えば、 ノーザン Λイブリダィゼーシヨンにより発現過多が検出された場合 や PCR- SSCP法により D NAの突然変異が検出された場合は、 例えば癌 （例、 大 腸癌、 乳癌、 肺輝、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、.精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍 など） である可能性が高いと診断することができる。 また、 ノーザンハイプリ ダイゼーションにより発現減少が検出された場合や PCR-SSCP法により D NAの 突然変異が検出された場合は、 例えば神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウ マチ、 全身性エリテマトーデスなど） などである可能性が高いと診断すること ができる。 (4) アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の D NAに相補的に結合し、 該 D NAの発現を抑制することができる 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発 明の夕ンパク質または本発明の D N Aの機能を抑制することができるので、 例 えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、.腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳艟瘍、 メラノ 一マ、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤として使用することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場 合、 自体公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
また、 例えば、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロ ウィルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツ ドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 該アンチ センスポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤な どの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲル力 テーテルのようなカテーテルによって投与できる。 あるいは、 エアロゾル化し て吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、 体内動態の改良、 半減期の長期化、 細胞内取り込み効率の改善を目 的に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリボゾームなどの担 体とともに製剤 （注射剤） .化し、 静脈、 皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ル ートなどにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のアンチセ ンスポリヌクレオチドを投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kg) においては、 一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0. 1〜100rag投与する。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の DNAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ一 ブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のタンパク質をコード する R NAの一部を含有する二重攀 RNA、 本発明のタンパク質をコードする RNAの一部を含有するリポザィムなども、 本発明の遺伝子の発現を抑制する ことができ、 生体内における本発明のタンパク質または本発明で用いられる D . NAの機能を抑制することができるので、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓瘙、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） などの予 防 ·治療剤などとして使用することができる。
二重鎖 RNAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じ て、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 リポザィムは、 公知の方法 (例、 TRENDS in Molecular Medic ine, 7巻， 221 頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造 することができる。 例えば、 本発明のタンパク單をコードする R NAの一部に 公知のリポザィムを連結することによって製造することができる。 本発明のタ ンパク質をコードする R NAの一部としては、 公知のリボザィムによって切断 され得る本発明の RNA上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げら れる。
上記の二重鎖 R NAまたはリボザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場 合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することがで きる。
( 5 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体 （例、 中和抗体） は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前 立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精 巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） などの予防 · 治療剤 （例、 ワクチン、 抗体医薬など） として使用することができる。 活性化 抗体は、 例えば神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群な ど） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエー ダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマ トーデスなど） など予防 ·治療剤 （例、 ワクチン、 抗体医薬など) として使用 することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は低毒性であり、 そのまま 液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対レて経口 的または非経口的 （例、 血管内投与、 皮下投与など） に'投与することができる。 好ましくはワクチンとして定法に従って投与することができる。
本発明の抗体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物と して投与しても良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発 の抗体お よびその塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むも のであっても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する 剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤、 ワクチン等が 用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴 注射剤等の剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って 調整できる。 注射剤の調整方法としては、 例えば、 上記本発明の抗体またはそ の塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁また は乳化することによって調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理 食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補 助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピ レンダリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリ ソルペート 80、 HCO-50 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated castor oi l) 〕 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油等が用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ペンジルアルコール等 を併用してもよい。 調製された注射液は、 適当なアンプルに充填されることが 好ましい。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬 用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 (糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル 剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 このような組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用い られる担体； 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦 形剤としては、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが 用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成^は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の 剤形どしては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤 が挙げられる。 抗体の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg程度、 とりわけ注射剤では 5〜100mg程度、 その他の剤形では 10〜250mg程度の上記抗体 が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防'治療剤の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の乳癌の治療，予防 のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0.01〜20mg/kg 体重程度、 好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. l〜5mg/kg体 重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与す るのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量 を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じて増量し てもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記 i¾体またはその塩と薬理学的 に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成 物は、 経 ΰまたは非経口投与 （例、 血管内注射、 皮下注射など） に適する剤形 として提供される。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
( 6 ) 本発明のタンパク質が関与する'各種疾病の治療 ·予防剤
本発明のタンパク質は、 細胞増殖能またはアポトーシス抑制能などを有する。 したがって、 本発明のタンパク質をコードする DNAに異常があったり、 欠損 している場合あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合には、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆 道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキ ンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性 硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） などの種々の疾患が発症する。
したがって、 本発明のタンパク質および本発明の D NAは、 例えば神経変性 疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン 抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど) などの予 防'治療剤などの安全な医薬として使用することができる。
例えば、 生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているた めに、 本発明のタンパク質の活性が十分に、 あるいは正常に発揮されない患者 がいる場合に、 （ィ） 本発明の DNAを該患者に投与し、 生体内で本発明の夕 ンパク質を発現させることによって、 （口） 細胞に本発明の D NAを挿入し、 本発明のタンパク質を発現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 または ひ、） 本発明のタンパク質を該患者に投与することなどによって、 該患 者における本発明のタンパク質の役割を十分に、 あるいは正常に発揮させるこ とができる。
本発明の D N Aを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 該 D NAを単 独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウィル スァソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常 套手段に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D N Aは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤な の生理学的に認めら れる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのようなカテ 一テルによって投与できる。
本発明のタンパク質を上記の治療，予防剤として使用する場合は、 少なくと も 90%、 好ましくは 95%以上、 より好ましくは 98%以上、 さらに好ましくは 99%以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のタンパク質は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もし くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの 注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のタンパク質等を生理学 的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤な どとともに一般に認められた製剤実施 要求される単位用量形態で混和するこ とによって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示され た範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼ ラチン、 コーンスターチ、 トラガント、'アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよ うな膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖または サッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのよう な香味剤 どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記夕 ィプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のた めの無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油な どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、、 D-ソルビトール、 D-マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタ ノールなど) 、 ポリアルコール (例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 80™、 HC0-50など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などが挙げられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール どと併用してもよい。 また、 緩衝 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 覃乍酸ナトリ ゥム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールな ど） 、 保存剤 （例 ば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤 などと配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填さ れる。
本発明の D NAが揷入されたベクターも上記と同様に製剤化され、 通常、 非 経口的に使用される。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 温血動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ タ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど) に対して投与するこ とができる。
本発明のタンパク質の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 アルッ八イマ一病の治療目的で本発明のタンパク質 を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日.につ き該タンパク質を約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1.0〜50mg、 より好ましくは約 1.0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該タンパク賀の 1回投与量は 投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 アルツハイマー病の治 療目的で本発明のタンパク質を注射剤の形で成人 （体重 60kgとして） に投与す る場合、 一日につき該ダ パク質を約 0.01〜30mg、 好ましくは約 0. 1〜20mg、 よ り好ましくは約 0. 1 ~ 1 Omgを患部に注射することにより投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
( 7 ) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする D NA (以下、 本発明 の外来性 D N Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 D N Aと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 D NAを有する非ヒト哺乳動物、
( 2 ) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1 )記載の動物、
( 3 ) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2 ) 記載の動物、 および
. (4 ) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物におい て発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 D NAまたはその変異 D NAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の D NA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生に おける胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でか つ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフェク シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DE AE—デキストラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって作 出することができる。， また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織鉀胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培 養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公 知の細胞融合法により融合させることにより本発明の DNA転移動物を作出す ることもできる,'。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なか でも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生およ^生物サイクルが比較的 短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス (例えば、 純系として， C57BLZ6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F 系統， BDFi系統， BeDSFi系铳， BALBZc系統， I CR系統など） または ラット （例えば、 Wi s t ar， SDなど） な が好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 DN Aとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。 該異常 DNAとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DNAを意 味し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現 させる DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるに あたっては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し た DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明 のヒト DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNAを有する 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来の DN Aを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本 発明のヒト DNAを結合した DNAコンス卜ラクト （例、 ベクターなど） を対 象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションする ことによつて本発明の D N Aを高発現する D N A転移哺乳動物を作出すること ができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯 草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオ ファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィル スまたはパ年ュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 (i) ウィル ス (例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロ モーター、 （ii) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハ ムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 ェン ドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク 、 ダルタチォ ン S—トランスフェラーゼ、 血小板由来成長因子 ]8、 ケラチン Kl， K1ひお よび Κ14、 コラーゲン I型おょぴ I I型、 サイクリック AMP依存タンパク 質キナーゼ )3 Iサブユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォス ファタ一ゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ (一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵 素 （Na， K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタロチォネィ ン Iおよび I IA、 メタ口プロティナーゼ 1 且織インヒビター、 MHCクラス I抗原 (H-2L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン) 3—水酸化酵素、 甲状 腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ペプチド鑌延長因子 la (EF- 1 ) 、 βァ クチン、 αおよび) 3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎夕 ンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VN P) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 卜ロボニン（：、 平滑 筋 αァクチン、 プレプロエンケフアリン Α、 バソプレシンなどのプロモーター などが用いられる。'なかでも、 全身で高発現することが可能なサイトメガロウ ィルスプロモーター、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 a (EF- 1 ) のプロモー 夕一、 ヒトおよびニヮトリ ) 3ァクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R NAの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネタ一と呼ばれる） を有しているこ とが好ましく、 例えば、 ウィルス由来おょぴ各種哺乳動物由来の各 DNAの配 列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネタ —などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのス プライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DN Aのイントロンの一部な どをプロモーター領域の 5，上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳 領域の 3' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の 肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DN Aライブラリーよりゲノム DNACO全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎 臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DNAを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNAは、 上 記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘 発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前 記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通 常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DNAの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DNA転移後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D NAが存在することは、 作出動 物の後代がすべて、 その胚芽細胞おょぴ体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D NAを有す る。
本発明の外来性正常 DN Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 DN Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA転移後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種 の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D NAを過 剰に有する。
導入 DNAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌 雄の動物を交配する.ことによりすべての子孫が該 D NAを過剰に有するように 繁殖継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発 現させられており、 内在性の芷常 D N Aの機能を促進することにより最終的に 本発明の夕ンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物 として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病 態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 まだ、 本発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明 の夕ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾 患に対する予防 ·治療剤、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、. 前立腺癌、 食 道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状 腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マ、 血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 ァ ルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力 症、'糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿 病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） などの予防 ·治療剤の スクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外 来性 D NAを安定に保持することを確認して該 D NA保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 DNAを前述の プラスミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D NAコンストラク卜は、 通常の DNA工学的手法によって作製することができ る。 受精卵細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 D NA転移後の作出 動物の胚芽細胞において本発明の異常 D NAが存在することは、 作出動物の子 孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DN Aを有すること を意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その 胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D NAを有する。 '導入 DNAを相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配す ることによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができ る。
本発明の異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発 現させられており、 内在性の正常 D NAの機能を阻害することにより最終的に 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル 動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用 いて、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの 疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、.本発明の異常 DNA高発現動物は、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質によ る正常タンパク質の機能阻害 (dominant negat ive作用） を解明するモデルとな る。
また、 本発明の外来異常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のダンパク質または機能不活 性型不応症に対する予防 ·治療剤、 例えば癌 例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立 腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣 癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） 、 神経変性疾患. (例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重 症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵 抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマ卜一デスなど).などの予防' 治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の DN A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
(i) 組織培養のための細胞源としての使用、
(i i) 本発明の D N A転移動物の組織中の D N Aもしくは R N Aを直接分析す るか、 または DNAにより発現されたペプチド組織を分析することによる、 本 発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性 についての解析、
(i i i) DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらも 使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （ii i) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および
(V) 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べ ることができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器にお けるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該 疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の DN A転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシン などのタンパク質分解酵素により、 遊離した DN A転移細胞の取得、 その培養 またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の夕 ンパク質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 ま たはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなど ができ、 本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料とな る。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行な うために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患 療 薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 まだ、 本発明の DNA転 移動物または本発明の外来性 DNA発現ベクターを用いて、 本発明のタンパク 質が関連する疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。
(8) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および 本発明の DNA発瑱不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の )3—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、 (5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の )3—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入する とにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺 乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ齒動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 第 （7) 項記載の動物に、.試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の 発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプロモーター活性を 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺 乳動物が有する本発明の D NAに人為的に変異を加えることにより、 D NAの 発現能を抑制するか、 もしくは該 D N Aがコードしている本発明のタンパク質 の活性を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明のタンパク 質の発現能を有さない （以下、 本発明のノッグアウト D NAと称することがあ る） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 E S細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学 的手法により該 DNA配列め一部又は全部の削除、 他 DNAを揷入または置換 させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コド ンの読み ¾1り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊す ることにより本発明のノックアウト D N Aを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の DNA不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の 具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の D NA を単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐 性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z ( ^—ガラクトシダ ーゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺 伝子） を代表とするレポーター遺伝子等を揷入することによりェキソンの機能 を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結さ せる D NA配列 （例えば、 p o l y A付加シグナルなど） を揷入し、 完全なメ ッセンジャー RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊 するように構築した D NA配列を有する DNA鎖ズ以下、 ターゲッティングべ クタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について本発明の D N A上あるいはその近傍の D NA配列を プローブとしたサザンハイブリダィゼーション解析あるいは夕ーゲッティング ベクター上の DNA配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列をプライマ一とした P C R法により解析し、 本発明のノックアウト E S細胞を選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の D.N Aを不活化させる元 ES細胞と しては、 例えば、.前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kaufmaの方法に準じて新じく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝 的背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C57BLZ6マ ウスや C 57 B LZ 6の採卵数の少なさを D B AZ 2との交雑により改善した BDFiマウス （C 57 BLZ6と DBA/2との F を用いて樹立したもの なども良好に用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫で あるという利点に加えて、 C57BLZ6マウスを背景に持つので、 これを用 いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C57BLZ6マ ウスとパッククロスすることでその遺伝的背景を C 57BLX 6マウスに代え ることが可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効 率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生 殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減する ためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の 性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることがで きる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数 を要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むの で、 培養初期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうこ とが可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間 は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染 色体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常 数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細 fik (例えば、 マウスでは染色 体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体 発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例えば、 STO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (卜 10000U/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95 %空 気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37でで培養するなどの 方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 0.00 1—0.5%トリプシン Z0.1— 5mM EDTA、 好ましくは約 0.1 %トリ プシン ZlmM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一 細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1一 3日毎に 行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場 合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または 細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋など の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. ； L Evans及ぴ ¾!. H. Kaufman, Nature第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. MartinProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル ·ォ ブ ·ェンブリオロジ一 ·アンド ·ェクスペリメンタル ·モルフォロジ一、 第 87 巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分化させて得られる本発明の DNA 発現不全細胞は、 インビト口における本発明のタンパク質の細胞生物学的検討 において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより.、 正常動物と区別 することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製. したターゲヅティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導入により夕ーゲッティングベクターの本発明の D N Aが不活性化された D N A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色 体上の本発明の D N Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の DNAをノックアウトさせることができる。
本発明の D NAがノックアウトされた細胞は、 本発明の D NA上またはその 近傍の DNA配列をプローブとしたサザン八イブリダィゼーシヨン解^ 1または 夕一ゲッティングベクタ一上の DNA配列と、 夕一ゲッティングベクターに使 用したマウス由来の本発明の DNA以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ 一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒ卜哺乳動物胚幹細 胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の DN Aが不活性化され た細胞株をクローニングし、 その細胞 適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒ ト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト哺乳動物の子宮に移植すや。 作出された動物は正常な本発明の D NA座をも つ細胞と人為的に変異した本発明の DNA座をもつ細胞との両者から構成され るキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の DNA座をもつ場合、 こ のようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全 ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D NA座をもつ細胞で構成された個 体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 こ のようにして得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個 体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの 産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション 法で D NA溶液を注入することにより夕ーゲッティングベクターを染色体内に 導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配によ り得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常 の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 DNAの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NA を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザ ィゴート動物は、 母親動物 対して、 正常個体 1 , ホモザィゴート複数になる ような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴー ト動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴート およびへテロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質によ り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活 性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因 究明及び治療法の検討に有用である。
( 8 a ) 本発明の DNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 '予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷な どに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに 用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物 を投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徵とする、 本発明の D NA の欠損や損傷などに起因する疾病、 例えば癌などに対して治療 '予防効果を有 する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリー: iング方法において用いられる本発明の DN A発現不全非ヒト哺 乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物 であってもよい。 具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理 し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変 化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果.を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注 射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選 択す
ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質 などにあわせて適宜選択することができる。
例えば （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌,、 胃癌、 肝臓癌、 胆 道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキ ンソン症候群など） 、 自己免疫疾 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性 硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関 リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） などに対して予防 ·治療効果を有する化合物を スクリーニングする場合、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合 物を投与し、 試験化合物非投与群と癌の発症度合いの違いや癌の治癒度合いの 違いを上記組織で経時的に観察する。 .
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該 試験動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ま しくは約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 · 予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から 選ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起 こされる疾患に対して予防 ·治療効果を有するので、 該疾患に対する安全で低 毒性な予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記ス クリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることがで きる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 (例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容さ れる酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩 酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸.、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒 酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） と の塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与暈は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体 重 60kgとして） の乳癌患者においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投 与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異 なるが、 例えば、 該化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 60kgとして） の乳癌 患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0, 01〜30mg、 好ましくは約 0. 1〜 ,20mg、 より好ましくは約 0. l〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
( 8 b ) 本発明の D NAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物のスクリーニング方法
本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の D NAに対する プロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン グ方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の D NA発現不全非ヒ卜哺乳動物 としては、 前記した本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明 の D N Aがレポ一ター遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポ一夕 一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが 用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 3—ガラクトシ ダーゼ遺伝子 (1 acZ) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはル シフェラ ゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DNAをレポーター遺伝子で尊換された本発明の DNA発現不全非 ヒト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーター の支配下に存在するの 、 レポ一夕一遺伝子がコードする物質の発現をトレー スすることにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の /3—ガラクトシダーゼ遺伝子 （1 acZ) で置換している場合、 本来、 本発明 —のタンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに3—ガラクト シダーゼが発現する。 従って、 例えば、 5—プロモー 4一クロロー 3—インド リル— j8—ガラクトピラノシド （X— ga l) のよう.な 0—ガラクトシダ一ゼ の基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の 動物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明の タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 (PBS) で洗浄後、 X— ga 1を含む染色液で、 室温 または 37 X付近で、 約 30分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を 1 mM EDTA/PBS溶液で洗浄することによって、 j8—ガラクトシダーゼ反応を 停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a cZをコードする mRNAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した 試験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の DNAに対するプロモーター 活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 ァ ルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン 酸、.臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩な どが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する,化合物またはその塩は 本発明のタンパク質の発現の阻害、 該夕ンパク質の機能を阻害することができ るので例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 脬臓癌、 脳腫瘍. メラノーマ、 血液腫瘍など） などの予防'治療剤として有用である。
さ に、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様 に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造する ことができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 本発明の D NAに対するプロモーター活性を阻害 する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） の乳癌患者 においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 よ り好ましくは約 1. 0〜20ing投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1 回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の D NAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人 （体 重 60kgとして） の乳癌患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜
30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. l〜10mgを静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量 を投与することができる。 このように、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAに 対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ 一二ングする上で極めて有用であり、 本発明の D N A発現不全に起因する各種 疾患の原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する D N Aを使って、 その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞 に注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異的にそのタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能 となる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポ^"ター遺伝子を結合させ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体 内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探 索系として使用できる。 本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC- IUB Commiss ion on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野におけ る慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学 異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
デォキシリポ核酸
相補的デォキシリポ核酸
アデニン
チミン
グァニン
シ卜シン
リポ核酸
メッセンジャーリポ核酸
デォキシアデノシン三リン酸
デォキシチミジン三リン酸
デォキシグアノシン三リン酸
デォキシシ ジン三リン酸 ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ： ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ：グリシン
A 1 a ：ァラニン
Va 1 ：パリン
Leu ：ロイシン
I 1 e ：ィソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレオニン
Cy s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グルタミン酸
As p ：ァスパラギン酸
L y s . リ'"ン
A r g ：アルギニン
H i s ：ヒスチジン
Ph e ：フエ二ルァラニン
Ty r ：チロシン
T r p ： トリブトファン
Pro ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン
pG 1 u ：ピログルタミン酸
Se c ：セレノシスティン （sele
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記する。
Me ：メチル基
E t ：ェチル基 B u ：ブチル基
Ph ：フエニル基
TC ：チアゾリジン一 4 (R) 一力ルポキサミド基
To s ： p—トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
B z 1 ：ベンジル
Cl Bzl ： 2， 6—ジクロ口べンジル
Bom ：ベンジルォキシメチル
Z ：ベンジルォキシカルボニル
C 1 -Z ： 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r— Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
Boc ： t一ブトキシカルボ二ル
DNP ：ジニトロフエニル
T r t ： 卜リチル
Bum : t—ブトキシメチル
Fmo c ： N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOB t ： 3， 4ージヒドロ _ 3—ヒドロキシ一 4一ォキソ一
1— 2， 3—べンゾトリアジン
HONB ： 1-ヒドロキシ -5-ノルポルネン -2，3-ジカルボキシイミド
DCC ： N， N' —ジシクロへキシルカルポジイミド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕 .
実施例 1 (4) で得られた MTp53IG-lタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 3〕
実施例 1 (4) で得られた MTP53IG- 1タンパク質をコードする全長遺伝子 （ポ リ Aを除く） を含む DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
実施例 1 (1) で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
実施例 1 (1) で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列畚号： 6〕
実施例 1 (4) で用いられたプライマーの: ^基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 1 (4) で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
実施例 1 (4) で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
施例 1 (4) で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
実施例 1 (4) で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 113
実施例 1 (4) で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
実施例 1 (4) で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕
実施例 1 (4) で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
実施例 3で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号： 15〕 '
実施例 3で用いられたコントロールォリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号： 16〕
実施例 1 (4) で得られた MTP53IG - 1タンパク質バリアント夕イプー 1のアミ 酸配列を示す。
〔配列番号： 17〕 実施例 1 ( 4 ) で得られた MTp53IG- 1タンパク質バリアントタイプ— 2のアミ ノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 8〕
実施例 1 ( 4) で得られた MTP53IG- 1タンパク質バリアント夕イプー 3のアミ ノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 9〕
配列番号 1 6で表されるアミノ酸をコードする塩 配列を示す。
〔配列番号： 2 0〕
配列番号 1, 7で表されるアミノ酸をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 1〕
配列番号 1 8で表されるアミノ酸をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 2〕
配列番号： 2 3で表されるアミノ酸配列の塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 3〕 - 実施例 4で得られた MTP53IG- 1 (D) .タンパク質バリアントタイプ一 3のアミ ノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2 4〕
配列番号： 2 5で表されるア ノ酸配列の塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 5〕
実施例 4で得られた MTp53IG-l (D) タンパク質バリアント夕イプー 2のアミ ノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2 6〕
配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 7〕
実施例 4で得られた MTp53IG- 1 (D) タンパク質パリアンドタイプ一 1のアミ ノ.酸配列を示す。
〔配列番号： 2 8〕
配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 9〕 実施例 4で得られた MTp53 IG-1 (D)タンパク質のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号 : 3 0 3
実施例.4で得られた MTp53IG- 1 (D)タンパク質をコードする全長遺伝子 （ポリ Aを除ぐ） を含む DNAの塩基配列を示す。
〔配列.番号： 3 1〕
実施例 4で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 2〕
実施例 4で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 3〕
実施例 6で用いられた部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。 後述の実施例 4で取得された Escherichi a col i JM109/MTp53IG-lは、 2003年 3 月 12日から、 日本国茨城県つくば市東卜 1-1 中央第 6 (郵便番号 305 - 8566) の独 立行啄法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号 FERM BP-8327 として寄託されている。
後述の実施例 4で取得された Escherichia col i JMlQ9/MTp53IG-l (D)は、 2003 年 3月 12日から、 日本国茨城県つくば巿東卜卜 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号 FERM BP- 8328として寄託されている。 以下において、 実施例により本発明をより具体的にするが、 この発明はこれ らに限定されるものではない。
実施例 1
( 1 ) 変異型 p53ベクターの構築
野生型 p53 (GenBank Access ion No. AF307851) の翻訳開始コドン ATGの Aから 数えて 524番目の塩基を Gから Aに置換したフォワード側およびリバース側のブラ イマ一 （配列番号： 4および配列番号： 5 ) を作製した。 Bam HI- Eco RIサイ トに野生型 p53 (WTp53) ¾pcDNA3. 1 (Invi trogen) に組み込んだ pcDNA3. 1- WTp53ベクターを铸型として、 上記 2種類のプライマーを使用し、 QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (STMTAGENE)を用いて変異型 p53 (MTp53) 遺 伝子を作製した。 方法は添付プロトコールに従った。 MTp53遺伝子を Bam HI と Eco RIで制限酵素処理し、 同酵素で処理した pINDベクター （Ecdysone - Inducible Mammalian Expression System (Invitrogen) に添付) に組み込み、 pI D- MTp53ベクターを得た。 この変異型 p53は 175番目のアミノ酸配列がアルギ ニン （R) からヒスチジン （H) に置換している。 コントロールとして野生型 p53 遺伝子を pINDベクターに組み込んだ pIND-WTp53ベクターも調製した。 もう一つ のコントロールとして CAT (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラー ゼ） が組み込まれた pIND- CATベクター （Invitrogen) も使用した。
(2) 変異型 P53遺伝子発現制御細胞の構築
p53が欠失している肺がん由来細胞株 HI 299 (ATCC) を 6cmシャーレに 4X105個 播種し、 ー晚培養後 Fugene6 (Roche) を用いて、 添付プロトコールに従い上記 (1) で得られた pIND-MTp53ベクター、 pI D-WTp53ベクターまたは pIND-CATベ クタ一と、 pVgRXRベクター (Ecdysone - Inducible Mammalian Expression System (invitrogen)に添付） とをそれぞれ co- transfectionした。 ジエネティ シン （GIBCO BRL) と Zeosin (Invitrogen) により、 それぞれの遺伝子の導入細 胞株 (H1299-MTp53, H1299-fTp53, HI 299-CAT) を選択した。 これら 3種の安定 発現株に、 5 の Muristerone A (上記キットに添付） を添加したところ、
H1299- MTp53では MTp53の発現が、 H1299-WTp53では WTp53の発現が、 HI 299-CATで は CATの発現がそれぞれ誘導された。 さらに、 抗 p53抗体 (Oncogene) を用いた ウエスタンブロッテイング法により、 H1299- MTp53では MTp53の発現が、 H1299 - WTp53では ^Γρ53の発現が誘導されたことを確認した。
(3) GeneChip解析
変異型 P53によって発現誘導される遺伝子群を明らかにするため、 5 M
Muristerone Aを H1299-MTp53、 H1299- WTp53および H1299- CATにそれぞれ添加後、 01-2, 24および 48時間後のこれらの 3種の細胞株から調製した total MAを材料 とし GeneChip (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E; Affymetrix社） を用いて遺伝子発現解析を行った。 実験方法は、 Affymetrix社の実験手引き書 (Expression analysis technical manual) 従つ/こ。 の結果、 変異型 p53によってのみ発現が上昇し、 野生型 P.53では誘導されな い遺伝子 (Affymetrix番号 67069_at； GenBank Accession No. AK026140の部分 配列） を見出した （表 1) o
〔表 1〕
細胞株 （培養時間） Affymetrix番号 67069一 atの相対的発現量
HI 299- CAT (0時間） 0.31
H1299-CAT (12時間) 0.22
H1299-CAT (24時間） 0.11
H1299-CAT (48時間) 0.35
H1299-MTP53 (0時間） 0.67
H1299-MTP53 (12時間） 1.02
H1299-MTP53 (24時間） 1.71
H1299-MTP53 (48時間） 1-60
H1299-WTP53 (0時間） 0.37
H1299-WTP53 (12時間） 0.30
H1299-WTP53 (24時間） 0.17
H1299-WTD53 (48時間） 0.20 (4) 新規遺伝子の単離
上記 (3) で得られた Affymetrix番号 67069_atが含まれる EST配列をもとにプ ライマー 3 (配列番号： 6) およぴプライマー 4 (配列番号： 7) を作製し、 5' -RACEを施行した。 伸長反応は、' Marathon-ready human cololectal adenocarcinoma cDNA (CL0NTECH社） を铸型として行った。 プライマー 3とプラ イマ一 API (前記の Marathon cDNA te即 late に付属） を用いて一次 PCR (94 で 30秒反応後、 .94 5秒- 72で4分の反応サイクルを 5回、 ついで 94 5秒- 70で4分の 反応サイクルを 5回、 ついで 94 5秒 - 68 4分のサイクルを 20回） を行い、 プラ イマ一 4とプライマー AP2 (前記の Marathon cDNA templateに付属） を用いて二 次 PCR (94^で 30秒反応後、 94で5秒- 72で4分の反応サイクルを 5回、 ついで 94^ 5秒 - 70 4分の反応サイクルを 5回、 ついで 94で5秒- 68で4分のサイクルを 20回） を行った。 得られた cDNA断片をシークェンスした結果、 5' 側に 985bpが伸長さ れ、 合計 3005bpの塩基配列を得た。 この 3005bpの塩基配列を再度、 公共データ ベースおよびセレラデータベースに対して Blast検索し、 得られた配列をもとに、 プライマ一 7 (配列番号： 8) およびプライマー 8 (配列番号： 9) を設計し、 上^ (2) で構築した MTp53を誘導した HI 299細胞 （H1299-MTp53) から調整した cDNAを铸型として、 PCR反応 （94 で 30秒反応後、 94で10秒- 63で 5秒 - 72 4分の 反応サイクルを 31回） を行った。 さらに、 プライマー 9 (配列番号： 10) お よびプライマー 10 (配列番号： 1 1) を設計し、 H1299-MTP53細胞から調整し た mMAをプライマー 9で逆転写したゆ NAを铸型に用いた PCR反応 （94 で 30秒反 応後、 94で 10秒- 65で 5秒- 68で1分の反応サイクルを 31回） を行った。
各々の反応で得られた cDNA断片をシークェンスし、 塩基配列を連結した。 そ の結果、 370アミノ酸 （配列番号： 1) をコードする lllObp (配列番号： 2) の 0RFを含む、 合計 4550bpの塩基配列 （配列番号： 3) を有する全長遺伝子配列を 得た。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、 MTP53IG- 1夕 ンパク質と命名する。 MTP53IG- 1タンパク質を既知蛋白質に対して相同性検索を 行ったところ、 相同性のあるタンパク質は認められなかった。
また、 配列番号： 1のアミノ酸配列の N末端側に 1 1アミノ酸が付加された アミノ酸配列 （配列番号： 16) を有するタンパク質を MTP53IG- 1タンパク質バ リアントタイプ— 1、 配列番号： 1のアミノ酸配列の N末側に 12アミノ酸が 付加されたアミノ酸配列 （配列番号： 17) を有するタンパク質を MTp53IG-l夕 ンパク質バリアントタイプ— 2、 配列番号： 1のアミノ酸配列の N末側に 14 アミノ酸が付加されたアミノ酸配列 （配列番号： 18) を有するタンパク質を MTp53IG-l夕ンパ.ク質バリアントタイプ一 3とした。
MTP53IG-1タンパク質バリアントタイプ一 1、 MTP53IG-1タンパク質パリアン ト夕イプー 2および MTP53IG-1タンパク質バリアント夕イプー 3をコードする DNAの塩基配列を、 それぞれ配列番号： 19、 配列番号： 20および配列番号： 2 1に示す。 実施例 2
MTp53IG-l遺伝子の癌細胞株での発現
Megapr ime DNA Label l ing Sys tem (Amersham Pharmac ia Biotech社) を用い て上記実施例 1 ( 4 ) のプライマー 4とプライマー AP2を用いて行った二次 PCR で得られた cDNA断片を、 32 P- dCTPでラベルし、 プローブとした。 Cancer Cel l Line (CL0NTECH社） を用い 7：ノーザンブロッテイングを行った結果、 大腸癌由 来細胞株 SW480および子宮類癌由来細胞株 HeLa S3細胞株で、 MTp53IG-l遺伝子の 発現が認められた。 実施例 3
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞死
MTP53IG- 1遺伝子のアポ 1 ^一シスに及ぼす影響を解析するために、 MTp53IG - 1 アンチセンスオリゴヌクレオチド導入実験を行った。
まず、 配列番号： 3で表される塩基配列に対するアンチ ンス （配列番号： 1 4 ) を設計後、 phosphorothi oate化オリゴヌクレオチドを合成し、 HPLC精製 (Amersham Pharmacia Biotech) して導入実験に用いた。 コントロールオリゴ ヌクレオチドとしては、 配列番号： 1 4で表される塩基配列のリパース配列 (配列番号： 1 5 ) を同様に phosphorothioate化し、 HPLC精製 （Amersham Pharmaci a Biotech) して用いた。
被験細胞として肺がん細胞株 A549を用い、 オリゴヌクレオチド導入前日に 3. 3 X 103個の細胞を 96ゥエルプレート （Fal con社） に播種した。 オリゴヌクレオチ ド導入には Ol igofec tAMINE (Invi trogen社） を使用し、 そのプロトコールに従 つた。 アンチセンスオリゴヌクレオチド （250nM) 導入後 3日目に Cel l death detec t ion EL ISA (Roche社） を用いてコントロールオリゴヌクレオチド導入後 3 日目の細胞と比較した。 アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した場合のァ ポトーシスは、 コントロールオリゴヌクレオチドを導入した場合 （100%) に比 ベ 176%に増加していた。 これより、 MTP53IG- 1遺伝子の発現を抑制すると、 癌 細胞はアポトーシスを起こして細胞死を起こすことが確認された。 実施例 4
プライマー 11 (配列番号： 3 1 ) およびプライマ一 12 (配列番号： 3 2 ) を 設計し、 H1299- MTp53細胞 （実施例 1 ( 2 ) ) から調製した mRNAをプライマー 12 (配列番号： 3 2 ) で逆転写した cDNAを铸型に用いた PCR反応 (94 で 1分反応後 94で 10秒 - 6IT 30秒- 72で1分 30秒の反応サイクルを 35回）を行った。 得られた cDNA断片をシークェンスした結果、 実施例し 配列番号： 2で表される塩基配 列を持つ MTp53IG- l遺伝子断片の他に、 この塩基配列の 743〜745番目の塩基が 欠損した 1107bp (配列番号： 2 8 ) の 0RFを含む全長 4547bp (配列番号： 3 0 ) の cDNA断片も得られた。 この 0RFは配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の 248 番目のアミノ酸が欠損した 369アミノ酸配列 （配列番号： 2 9 ) をコードしてお り、 MTP53IG- 1 (D)遺伝子と命名した。 また、 配列番号： 2 9で表されるァミノ 酸配列を含有するタンパク質を、 MTP53IG- 1 (D)タンパク質と命名した。 この cDNA断片 MTP53IG- 1 (D)夕ンパク質を既知蛋白質に対して相同性検索を行つたと ころ、 相同性のあるタンパク質は認められなかった。
ま 、 配列番号： 2 9のアミノ酸配列の N末端側に 11アミノ酸が付加されたァ ミノ酸配列 （配列番号： 2 7 ) を有するタンパク質を MTp53IG-l (D) タンパク 質バリアントタイプ— 1、 配列番号： 2 9のアミノ酸配列の N末側に 12アミノ酸 が付加されたアミノ酸配列 （配列番号： 2 5 ) を有するタンパク質を MTP53IG-1 (D) タンパク質バリアントタイプ一 2、 配列番号： 2 9のアミノ酸配列の N末 側に 14アミノ酸が付加されたアミノ酸配列 （配列番号： 2 3 ) を有するタンパ ク質を MTP53IG- 1 (D) タンパク貲バリアント夕イプー 3とした。
MTp53IG-l (D) タンパク質バリアントタイプ一 1、 MTp53IG- 1 (D) タンパク 質バリアントタイプ一 2および MTP53IG- 1 (D) タンパク質パリアントタイプ— 3をコードする DNAの塩基配列を、 それぞれ配列番号： 2 6、 配列番号： 2 4お ょぴ配列番号： 2 2に示す。
■ 配列番号： 2 2で表される塩基配列を有する DNAを含むプラスミドを pCR - Blunt I I-TOPO-MTp53IG-l (D)と命名し、 このプラスミドを大腸菌 JM109に導入 し、 形貪転換体 Escherichia col i 109/MTp53IG-l (D)を得た。 同様に配列番号： 21で表される塩基配列を有する DNAを含むプラスミドを pT7Blue- MTP53IG- 1と命名し、 このプラスミドを大腸菌頂 109に導入し、 形質転 換体 Escherichia coli 109/MTp53IG-lを得た。 実施例 5
(1) 動物細胞発現ベクターの構築
pT7-Blue- MTP53IG- 1および pCDNA3.1(+) (Invitrogen) を制限酵素 Hind IIIお よび Xba Iで切断した後、 TaKaRa Ligation Kit Ver.2 (宝酒造）を用いて結合さ せ、 得られたプラスミド DNAを公知の方法により大腸菌 109に導入し、 形質転 換体 （クローン） を得た。 この形質転換体からプラスミドを抽出し、 シークェ ンサー （Applied Biosystem¾::ABI3100) を用いてインサート部分の塩基配列を 確認し、 動物細胞発現ベクター pCDNA3.1(+)- MTP53IG-1を構築した。
同様に pCR-Blunt II- T0P0- MTp53IG(D)および pCDNA3.1(+) (Invitrogen) を制 限酵素 Hind IIIおよび Xba Iで切断した後、 TaKaRa Ligation Kit Ver.2 (宝酒 造）を用いて結合させ、 得られたプラスミド DNAを公知の方法により大腸菌 1109 に導入し、 形質転換体 （クローン） を得た。 この形質転換体からプラスミドを 抽出し、 シークェンサ一 （Applied Biosystem社: ABI3100) を用いてインサート 部分の塩基配列を確認し、 動物細胞発現べク夕一 PCDNA3.1 (+) -MTp53IG-l (D)を 構築した。
(2) MTP53IG-1およ U¾lTp53IG-l (D) 遺伝子による細胞増殖効果
6cmシャーレに、 ヒト肺がん細胞株 H1299 (ATCC) を 2.5X105個ずつ播種し、 ー晚培養後 FuGene6 (Roche)を用いて添付のプロトコールに従い、 実施例 4で得 られた PCDNA3.1 (+) -MTp53IG-K PCDNA3.1 (+)-MTp53IG-l (D)および pCDNA3.1 (+) (Invitrogen) を導入した。 ー晚培養後、 ジエネティシン （Invitrogen) を培 地に加えて 7日間培養した。 その後、 細胞を 6cmシャーレに播種しなおして、 さ らにジエネティシンを添加した培地で 3週間細胞を培養した。 PBSで洗浄後、 10%中性フオルマリン溶液 （和光純薬） にて室温で 30分間固定し、 PBSで洗浄し た。 その後、 クリスタルバイオレット （SIGMA) 溶液 （クリスタルバイオレット が 10%になるようエタノールで溶解し、 それを PBSで 100倍に希釈したもの） で 細胞を室温で 2時間染色し、 蒸留水にて洗浄し風乾させた。 染色された細胞の面 積を ImagProアプリケーション（Media Cybernet i cs社）で測定し 。
その結果、 H1299細胞に pCDNA3. 1 (+)を導入した群の面積を 100%とすると、 PCDNA3. 1 (+) -MTp53IG- 1を導入した群の面積は 200%、 pCDNA3. 1 (+) -MTp53IG- 1 (D)を導入した群の面積は 200 %であった。
このことから MTp53IG-l遺伝子およ 1TP53IG- 1 (D)遺伝子は、 細胞増殖を促進 させることがわかる。 実施例 6
ぺプチド抗体の作製
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 288〜302番目 （配列番号： 1 6で 表わされるアミノ酸配列の 299〜313番目、 配列審号： 1 7で表わされるァミノ 酸配列の 300〜314番目、 配列番号： 1 8で表わされるアミノ酸配列の 302〜316 番目、 配列番号： 2 3で表わされるアミノ酸配列の 301〜315番目、 配列番号： 2 5で表わされるアミノ酸配列の 299〜313番目、 配列番号： 2. 7で表わされる アミノ酸配列の 298〜312番目、 配列番号： 2 9で表わされるアミノ酸配列の 287 〜301番目に相当） のアミノ酸からなる 15残塞の部分ペプチド （配列番号： 3 3 ) を Fmoc固相合成法により合成した。 このペプチドにキーホールリンペット へモシァニン （KLH) をキャリアータンパク質として結合させ、 抗原とした。 免 疫動物は雄性ゥサギ KBL : JW (10週令、 オリエンタル酵母） 一羽を用い、 感作は 背部に皮下注射により行い 14日毎に 3回繰り返した。 1回の感作には抗原 0. 5mgを 用い、 初回感作後 52日目に全採血を行い、 血清を得た。 得られた血清全量を硫 酸アンモニゥム塩析法により.濃縮し、 得られた粗 IgG画分を全量プロテイン Aァ フィニティーカラム （Amersham- Pharmac i a社製） により精製し、 精製 IgG画分を ポリクロ ナル抗体画分とした。 このうち一部を、 ペプチドの固定化カラムで の精製に供した。 固定化にはべプチドのカルポキシル基末端のシスティンを利 用し、 ホウ酸緩衝液を用いてセファロースカラム （Amer sham- Pharmac ia社） に カップリングした。 カラムからの溶出には 8M尿素 Zリン酸緩衝化生理食塩水 (PBS) を用いた。 溶出液を PBSに対して透析して尿素を除いた後、 限外濃縮、 フィルターろ過滅菌することによりァフィ二ティ一精製抗体を取得した。 実施例 7
ペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティング
MTP53IG-1タンパク質 （配列番号： 1 8で表わされるアミノ酸配列を有する夕 ンパク質） の検出を、 実施例 6で作製したペプチド抗体を用いて行った。
6cmシャーレに 8X 105個のサル腎臓由来 COS- 7細胞を播種し、 一晩培養後、 Lipofectamin2000 (Invi trogen) を用いて添付のプロトコールに従い、 実施例 5で得られた pCDNA3. 1 (+) - MTp53IG-lおよび PCDNA3. 1 (+) (Invi trogen) を導入 した。 翌日、 細胞をはがし、 常法に従い SDS- PAGE、 続いてウェス夕ンブロッテ イングを施行した。 一次抗体として実施例 6で作製したペプチド抗体 、 二次 抗体として抗ゥサギ IgG- HRPコンジュゲイト （Juckson ImmunoReseardi社) を用 いた。 検出は ECL (Amersham- Pharmacia社） を用いて添付のマニュアルに従った。 その結果、 実施例 6で作製したペプチド抗体は、 MTp53IG- 1タンパク質を認識 することが確認された。 実施例 8
MTP53IG- 1の細胞内局在
6cmシャーレに 8X 105個のサル腎臓由来 COS- 7細胞を播種し、 一晩培養後、 Lipofectamin2000 (Invi trogen) を用いて添付のプロトコールに従い、 実施例 5で得られた pCDNA3. +) -MTp53IG- 1および pCDNA3. 1 (+) (Invi trogen) を導 Λ した。 更にー晚培養後、 Poly-D-Lysine Cel l ware 4-Wel l Cul ture Sl ide
(BECTON DICKINSON社） に播種しなおし一日培養した。 翌日、 培地を抜き取り 10%中性緩衝ホルマリン液 （wako) で固定した後、 PBSで洗诤し、 次に 0. 1 % Tri ton X-100/PBSで処理した。 PBSで洗浄した後、 3%ゥシ血清アルブミン ZPBS (ブロヅキング溶液） で室温 30分のブロッキング操作を行った。 次にブロッキ ング溶液で希釈した実施例 6で作製したペプチド抗体で室温、 2時間インキュべ ートした後、 PBSで洗浄した。 最後にブロッキング溶液で希釈した FITC標識抗ラ ビット IgG抗体 （SIGMA) で室温、 1時間インキュベートし、 PBSで洗浄後、 蛍光 顕微鏡で観察した。
その結果、 pcDNA3. 1 (+) - MTP53IG- 1導入細胞において、 卿胞質が染まる細胞像 が認められた。 これより、 MTP53IG- 1タンパク質は細胞質に存在することが示唆 された。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質 （配列番号： 1または配列番号： 2 9で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質） 、 該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、 該タンパク質に対する抗体など は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウ マチ、 全身性エリテマトーデスなど） などの診断マーカーとして有用である。 本発明のタンパク質、 本発明のポリヌクレオチド、 本発明のタンパク質の活 性を促進する化合物もしくはその塩、 .本発明のタンパク質の遺伝子の発現を促 進する化合物もしくはその塩は、 例えば自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸 球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢 性関 リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） などの予防 ·治療剤などとし て安全に使用することができる。
本発明の抗体、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、 本発明のタンパク 質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の発 現を阻害する化合物もしくはその塩は、 例えば癌 （例、 大腸癒、 乳癌、 肺癌、 前立腺瘅、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ、 血液腫瘍など） などの予 防 -治療剤などとして安全に使用することができる。

Claims

請求 の 範囲
I . 配列番号： 1または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
2 . 配列番号： 1、 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 7または配列番号： 1 8 で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
3 . 配列番号： 2 3、 配列番号： 2.5、 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表きれるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
4. 請求項 1記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
5 . 請求項 1記載のタンパク質または請求項 4記載の部分べプチドをコード するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
6 . D N Aである請求項 5記載のポリヌクレオチド。
7 . 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 0または 配列番号： 2 1で表される塩基 Ϊ3列からなるポリヌクレオチド。
8 . 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4、 配列番号： 2 6、 配列番号：.2 8ま たは配列番号： 3 0で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
9 . 請求項 5記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべク夕一。
1 0 . 請求項 9記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体。
I I . 請求項 1 0記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパク質ま たは請求項 4記載の部分ペプチドを生成、 蓄積せしめ、 これを採取することを 特徴とする請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の部分べプチドま たはその: の製造法。
1 2 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の部分ペプチドまた はその塩を含有してなる医薬。
1 3 . 請求項 5記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
1 4. 請求項 5記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
1 5 . 請求項： ί記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の部分ペプチドまた はその塩に対する抗体。
1 6 . 請求項 1 5記載の抗体を含有してなる医薬。
1 7 . 請求項 1 5記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 8 . 請求項 5記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的 に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド。
1 9 . 請求項 1 8記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
2 0 . 請求項.1記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とする、 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求 項 4記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物また はその塩のスクリーニング方法。
2 1 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の部分ペプチドまた はその塩を含有してなる、 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の 部分べプチドまたはその塩の活性を促 itまたは阻害する化合物またはその塩の スクリーニング用キット。
2 2 . 請求項 5.記載のポリヌクレオチドを用いることを特徵とする、 請求項 1記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法。
2 3 . 請求項 5記載のポリヌクレオチドを含有してなる、 請求項 1記載の夕 ンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング用キット。
2 4. 請求項 1 5記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載のタン パク質の定量方法。
2 5 . 癌の予防 ·治療剤である請求項 1 6または請求項 1 9記載め医薬。 2 6 . 神経変性疾患またば自己免疫疾患の予防 ·治療剤である請求項 1 2ま たは請求項 1 .3記載の医薬。
2 7 . 癌、 神経変性疾患または自己免疫疾患の診断薬である請求項 1 4また は請求項 1 7記載の診断薬。
2 8 . アポトーシス促進剤である請求項 1 6または請求項 1 9記載の医薬。
2 9 . アポトーシス抑制剤である請求項 1 2または請求項 1 3記載の医薬。
3 0 . 哺乳動物に対して、 （a) 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またその塩、 または （b) 該タン 86 パク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与すること を特徴とする癌の予防 ·治療法。
' 3 1 . 哺乳動物に対して、 （a) 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またその塩、 または （b) 該タン パク質の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩の有効量を投与すること を特徴とする神経変性疾患または自己免疫疾患の予防 ·治療法。
3 2 . (a) 請^項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩の活性を阻害する、 または （b) 該タンパク質の遺伝子の発現を阻害すること を特徴と'する癌の予防.治療法。
3 3 . (a) 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩の活性を促進する、 または （b) 該タンパク質の遺伝子の発現を促進すること を特徴とする神経変性疾患または自己免疫疾患の予防 ·治療法。 .
3 4. 癌の予防'治療剤を製造するための （a) 請求項 1記載のタンパク質も. しくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またその塩、 ま ,たは （b) 該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用。
3 5. 神経変性疾患または自己免疫疾患の予防 ·治療剤を製造するた の (a) 請求項 1記載の夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性 を促進する化合物またその塩、 または （b) 該タンパク質の遺伝子の発現を促進 する化合物またはその塩の使用。
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