WO2004053499A1 - Ｆｒｅｔを利用した蛍光指示薬 - Google Patents

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WO2004053499A1
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fluorescent
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fluorescent indicator
analyte
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Atsushi Miyawaki
Kenji Nagai
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Riken
Japan Science And Technology Agency
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent indicator for analyzing interaction between molecules using fluorescence resonance energy transfer (FRET), and use thereof. More specifically, the present invention depolarizes FRET caused by the interaction of an analyte with a fluorescent indicator in which two fluorescent molecules having substantially the same fluorescent properties are bound via a target sequence.
  • the present invention relates to a method for analyzing an interaction between molecules, which is characterized in that the interaction between molecules is measured based on the measurement.
  • Fluorescence analysis of biological systems is advantageous in that it can be performed non-invasively compared to other biological techniques.
  • biological reporter constructs have been developed that can be used, for example, to monitor reactions in cells.
  • various analyzes can be performed by introducing this protein into cells via a gene construct and expressing it.
  • GFP green fluorescent protein
  • Miyawaki et al. (1997) Nature, 388, 882-887, describe a GFP-based Ca 2+ sensing system.
  • An object of the present invention is to provide a fluorescent indicator capable of easily and visually detecting the interaction between a target protein and an analyte, and a method for using the fluorescent indicator. More specifically, the present invention provides a fluorescent indicator based on homo-FRET (fluorescence resonance energy transfer) utilizing fluorescent molecules with a small storage shift, and develops a system for visualizing intermolecular interactions. It was an issue to be solved.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-described problems, and as a result, the analyte binds or acts to change the steric structure of the indicator. It has been found that an analyte can be detected and measured by using a fluorescent indicator to which a fluorescent molecular component having the same fluorescent characteristics is bound. The present invention has been completed based on this finding.
  • a fluorescent molecule component having substantially the same fluorescent characteristics is bonded to the N-terminal side and the C-terminal side of the target sequence, which binds or acts on the analyte to change the three-dimensional structure of the indicator.
  • Fluorescent indicators are provided.
  • a target sequence to which an analyte binds or acts to change the conformation of the indicator a donor fluorescent molecule component covalently bound to the target sequence;
  • a fluorescent indicator comprising:
  • the donor fluorescent molecule and the acceptor fluorescent molecule are molecules having substantially the same fluorescence characteristics, and the binding of the analyte causes a change in the three-dimensional structure in the target sequence, and then the relative relationship between the donor molecule and the acceptor molecular component.
  • a fluorescent indicator is provided that causes a change in position or direction and that the polarization characteristics of the fluorescence observed when excited by irradiation light having a certain polarization characteristic tend to differ from those of the irradiation light (depolarization).
  • the fluorescent molecule component is a fluorescent protein or a variant thereof.
  • the fluorescent molecule component is a yellow fluorescent protein or a variant thereof.
  • the fluorescent molecule component is the fluorescent protein Venus.
  • the fluorescent indicator further comprises a target peptide component and a linker component, and the target sequence of the analyte further comprises a peptide binding domain for binding the target peptide component;
  • a linker component covalently bonds the target sequence and the target peptide component of the analyte, and the target sequence and the target peptide component covalently binds to either the receptor fluorescent molecule component or the donor fluorescent molecule component;
  • the analyte bound to the target sequence induces a change in the relative position or orientation of the target peptide component and the peptide binding domain, which in turn causes a change in the relative position or orientation of the donor and receptor molecules.
  • the fluorescence indicator observed when excited by the irradiation light having a certain polarization characteristic has a strong tendency to differ from that of the irradiation light (depolarization), thereby providing a fluorescent indicator.
  • the target sequence is calmodulin, cGMP-dependent protein kinase, steroid hormone receptor, ligand binding domain of steroid hormone receptor, protein kinase. , Inositol-1,4,5-triphosphate receptor, or recoverine.
  • the target sequence of the analyte is calmodulin.
  • the target peptide component is skeletal muscle myosin light chain kinase (skMLCKp), smooth muscle myosin light chain kinase (smMLCK), calmodulin kinase II (CaMKII), force redesmon, force / respinoremin, phosphofenolect kinase, force / Resineperin, phosphorylase kinase, Ca2 + ATPase, 59 Kda phosphodiesterase (PDE), 60 Kda phosphodiesterase (PDE), ditricoxide synthase, type I adenylyl cyclase, Bordetella pertussis adenylyl cyclase, neuromodulin, Spectrin, myristoylated alanine ritulin C kinase substrate (MARCKS), MacMARCKS (F52), b-Adducin, heat shock protein HSP90a, human immunodeficiency
  • the linker component is a peptide component.
  • one linker component is from 1 to 30 amino acid residues.
  • the target sequence of the analyte on which the analyte acts to change the steric structure of the indicator is an amino acid sequence that is cleaved by the enzyme.
  • the fluorescent indicator of the present invention is a single polypeptide.
  • the fluorescent indicator of the present invention further comprises a localization sequence.
  • the localization sequence is a nuclear localization sequence, an endoplasmic reticulum localization sequence, a peroxisome localization sequence, a mitochondrial localization sequence, a Golgi localization sequence, or a cell membrane localization sequence.
  • a method for detecting or measuring an analyte in a sample comprising:
  • the extent of fluorescence resonance energy transfer in the sample is measured by measuring depolarization.
  • depolarization is measured by determining fluorescence anisotropy.
  • the sample is a living cell
  • the contacting step comprises incorporating the fluorescent indicator into the cell.
  • the step of incorporating the fluorescent indicator into the cell comprises transfecting the cell with an expression vector comprising an expression control sequence operably linked to a nucleic acid sequence encoding the expression of the fluorescent indicator.
  • an expression vector comprising an expression control sequence operably linked to a nucleic acid sequence encoding the expression of the fluorescent indicator.
  • FIG. 1 shows the structures of the fluorescence indicators W- cameleon and W-SCAT of the present invention. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the fluorescent indicator of the present invention has a fluorescent molecule component having substantially the same fluorescent property bound to the N-terminal side and the C-terminal side of the target sequence, which binds or acts on the analyte to change the three-dimensional structure of the indicator. Things. More specifically, the fluorescent indicator of the present invention is a target sequence that changes the steric structure of the indicator by binding or acting on an analyte;
  • a donor fluorescent molecule component covalently linked to the target sequence
  • the donor fluorescent molecule and the acceptor fluorescent molecule are molecules having substantially the same fluorescence characteristics, and the binding of the analyte causes a change in the three-dimensional structure in the target sequence, and then the relative relationship between the donor molecule and the acceptor molecular component. It is characterized in that the position or direction changes, and the polarization characteristics of the fluorescence observed when excited by irradiation light having certain polarization characteristics tend to differ from those of the irradiation light (depolarization). To do. When a fluorescent molecule is excited with vertically polarized light, it is usually polarized vertically after the chromophore of the fluorescent molecule is excited and before the fluorescent molecule is rotated, in order to complete the fluorescence emission.
  • the detected fluorescence is detected.
  • FRET homotransfer
  • excitation of fluorescent molecules is required. It is necessary that the fluorescence spectrum and the fluorescence spectrum overlap (the Stokes shift is small), and GFP mutants such as CFP, YFP or RFP are suitable.
  • to produce a fluorescent indicator to produce what was bound to the same fluorescent molecule to the N-terminus and C-terminus of Domein causing structural changes by substrate sites or C a 2 + Protea Ichize as the target sequence, to produce a fluorescent indicator.
  • a fluorescent indicator By using such a fluorescent indicator, it becomes possible to monitor the activity of caspase 3 associated with apoptosis or the change in intracellular Ca 2+ concentration.
  • the fluorescent molecule in the present invention means any molecule that can emit light when excited by an appropriate electromagnetic ray.
  • a fluorescent protein can be used as the fluorescent molecule.
  • the donor fluorescent molecule component and the acceptor fluorescent molecular component have substantially the same fluorescence characteristics, and preferably, both have the same fluorescence.
  • the fluorescent molecule used in the present invention is preferably selected in view of the efficiency of FRET, and the efficiency of FRET can be tested according to the techniques described herein and well known to those skilled in the art.
  • Covalently linked means a covalent bond or other covalent linkage between two molecules.
  • the covalent linkage includes a divalent component linking the two molecules.
  • Target sequence refers to an amino acid sequence that can bind to an analyte. Preferred target sequences change conformation upon binding to the analyte.
  • Target peptide means a peptide that can bind to a target sequence. The target peptide is a partial sequence of the peptide that binds to the target sequence.
  • Analyte means a molecule or ion in solution that binds to a target sequence and changes the conformation of the target sequence.
  • the analyte may bind reversibly or irreversibly to the target sequence.
  • Component means a group of a molecule that is linked to another group of the indicator. That is, a “fluorescent molecule component” is a group of a fluorescent molecule that is bound to a target sequence component or a linker component. “Target sequence component” is the group of the target sequence that is attached to the fluorescent molecule component. “Target peptide component” is the group of the target peptide of the target sequence. “Linker component” refers to the group of a molecular linker that is attached to both the donor and the acceptor fluorescent molecular component.
  • “Operatively linked” means that the components are in a relationship that allows them to function.
  • a regulatory sequence operably linked to a coding sequence is ligated in such a way that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the regulatory sequences.
  • "Regulatory sequence” refers to a polynucleotide necessary for the expression of a coding sequence and non-coding sequences to which it is linked. Regulatory sequences include promoters, ribosome binding sites, transcription termination sequences, and the like.
  • the regulatory sequence may further include a leader sequence and a sequence on the other side of the fusion protein.
  • Polynucleotide means at least 10 nucleotides or more in length.
  • the nucleotide may be a ribonucleotide, a deoxynucleotide, or a variant thereof, and may be single-stranded or double-stranded.
  • the fluorescent indicator of the present invention which utilizes fluorescence resonance energy transfer (FRET) to detect or measure an analyte, comprises two molecules having emission and excitation spectra that are a donor fluorescent molecule component and an acceptor fluorescent molecular component.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the donor fluorescent molecule component and the acceptor fluorescent molecular component used in the present invention are components having substantially the same fluorescence characteristics, and are preferably the same components.
  • the excitation spectrum of the acceptor fluorescent molecular component is selected so as to overlap the emission spectrum of the donor fluorescent molecular component.
  • the donor and receptor fluorescent molecular components (in the present invention, they have substantially the same fluorescent properties) are bound to a target sequence component whose steric structure changes upon binding of the analyte. The change in the three-dimensional structure changes the relative position and direction of the donor and receptor fluorescent molecules, thereby causing depolarization.
  • the fluorescent molecule component is covalently bound to the amino and carboxy terminals of the target sequence component.
  • the donor fluorescent molecule component and the receptor fluorescent molecular component can move closely to each other when the analyte is bound. Alternatively, the donor and receptor components move away from each other during analyte binding. You may.
  • the receptor component covalently binds to a target peptide component that is bound to a target sequence component, and the target peptide component is covalently bound to a target sequence component via a linker component.
  • the linker component is flexible, allowing the target peptide component to bind to the target sequence component.
  • the donor component is excited by light of the appropriate intensity within the excitation spectrum of the donor component. The donor component emits the absorbed energy as fluorescence. If the acceptor fluorescent molecular component is located at a position that can quench the excited donor component, the fluorescent energy is transferred to the acceptor component and fluorescence is emitted.
  • FRET is caused using one type of fluorescent molecule (ie, a fluorescent molecule having substantially the same fluorescent characteristics) (also referred to as homo-FRET in the present specification).
  • a fluorescent molecule having substantially the same fluorescent characteristics also referred to as homo-FRET in the present specification.
  • observation of homo-FRET can be performed by measuring the depolarization of fluorescence.
  • Factors that cause fluorescence depolarization include fluorescence reabsorption, FRET, and rotational Brownian motion of fluorescent molecules.
  • the rotational relaxation time of fluorescent proteins such as GFP has been measured to be 30 to 40 nsec, which is the lifetime of GFP fluorescence.
  • the polarization intensity can be evaluated using the anisotropy of fluorescence.
  • the fluorescence anisotropy (Anisotropy; A) can be determined by the following equation.
  • I parallel
  • I vertical
  • the fluorescence in the sample can be measured using a fluorescence polarization measuring device.
  • the excitation line from the excitation source passes through the excitation optics.
  • the excitation beam excites the sample with the excitation optics.
  • the fluorescent molecules in the sample emit radiation having a wavelength different from the excitation wavelength.
  • the collection optics then collects the radiation from the sample.
  • the device has a temperature controller to maintain the sample being scanned at a constant temperature.
  • a multi-axis conversion stage moves a microtiter plate holding multiple samples.
  • the electronics associated with the multi-axis conversion stage, temperature controller, autofocus function, and imaging and data acquisition are managed by a suitably programmed digital computer.
  • a system For detection of homotransfer FRET by depolarization, a system can be set up that can be used in vitro (in a cuvette or plate) or in vivo (under a microscope, in a cell), which emphasizes the polarization component of the optical system.
  • the measurement of the degree of fluorescence polarization can be performed using a commercially available apparatus such as a fluorescence polarization measurement apparatus BEACON (TAKARA).
  • TAKARA fluorescence polarization measurement apparatus
  • Methods for measuring the degree of fluorescence polarization are known to those skilled in the art, and are described, for example, in Proteins and Nucleic Acids, Enzymes, Vol. 42, No. 1, p77-81 (19997), and the like. ing.
  • any fluorescent molecule can be used.
  • GFP cnidarian green fluorescent protein
  • Mutants include cyan fluorescent protein (CFP), yellow fluorescent protein (YFP), red fluorescent protein (RFP) or blue fluorescent protein (BFP).
  • CFP cyan fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • These fluorescent proteins can be obtained from such sources as Pacdfic Northwest jellyfish, Aequorea victoria, the sea pansy, Reniila reniformis and Phialidium gregarium (Ward, WW, et al., Photochem. Photobiol., 35: 803-808 (1982); and Levine , LD, et al., Comp. Biochem. Physiol., 72B: 77-85 (1982)).
  • low molecular organic compounds such as fluorescein, rhodamine, Alexa, and Cy can be used.
  • a protein is a jellyfish-derived fluorescent protein if it contains 150 consecutive amino acids with 85% or more homology to the amino acid sequence of the wild-type jellyfish-derived fluorescent protein.
  • green fluorescent protein GFP
  • yellow fluorescent protein YFP
  • mutants thereof used herein includes not only known green fluorescent proteins and yellow fluorescent proteins but also all of these mutants. Meaning.
  • the green fluorescent protein gene has been isolated and sequenced (Prasher, DC et al. (1992), "Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein, Gene 111: 229-233). Numerous mutant amino acid sequences have also been reported, for example, in Roger Y. Tsin, Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 509-44, and references therein.
  • the green fluorescent protein GFP
  • the yellow fluorescent protein YFP
  • a mutant thereof for example, those derived from Owang jellyfish (for example, Aequorea victoria) can be used.
  • GFP GFP
  • YFP YFP
  • mutants Examples of GFP, YFP and their mutants are shown below.
  • the notation of F 99 S indicates that the amino acid residue at position 99 has been changed from F to S, and other amino acid substitutions will be indicated in the same manner.
  • G F P having an amino acid mutation of F 99 S, Ml 53 ⁇ , V 163 A;
  • GFP having an amino acid mutation of S65T having an amino acid mutation of S65T
  • GFP having an amino acid mutation of F 64 L, S 65 T;
  • GFP having an amino acid mutation of S202F, T203I;
  • G F P having an amino acid mutation of T 203 I, S 72 A, Y145F;
  • G F P (YFP) having an amino acid mutation of S 65 G, S 72 A, T 203 F;
  • G F P (YFP) having an amino acid mutation of S 65 G, S 72 A, T 203 H;
  • GFP mutants CFP, YFP, RFP or mutants thereof are preferable to use.
  • YFP mutant Venus can be used.
  • Nagai, T. et al. (2002) Nature Biotecnology 20, 87-90 can be referred to.
  • Venus is a fluorescent protein obtained by substituting phenylalanine at position 46 of YFP with leucine, which is 30 to 100 times higher in Escherichia coli than in conventional GFP, and 3 to 10 times higher in mammalian cells. : Achieves 100 times the brightness and can provide fluorescence that is sufficiently detectable with ordinary equipment.
  • the efficiency of FRET between the donor and receptor fluorescent molecule components is due to the two fluorescent molecules It can be adjusted by adjusting the ability to interact.
  • the nature of the target sequence component, the target peptide component and the linker component also affect FRET and the response of the indicator to the analyte. In general, it is desirable that a large conformational change occurs in a target sequence component.
  • the target sequence component is a protein or a part thereof that changes its three-dimensional structure upon binding of an analyte.
  • proteins include calmodulin (CaM), cGMP-dependent protein kinase, steroid hormone receptor (or its ligand binding domain), protein kinase (:, inositol-1,4,5-triphosphate receptor) Or Reco Vesin (e.g., 1; Katzenellenbogen, JA & Katzenellenbogen, BS Chemistry & Biology 3: 529-536 (1996), and Ames, JB, et al., Curr.Opin. Struct. Biol. 6 : 432-438 (1996).)
  • the target sequence component preferably binds to the target peptide as well as the analyte.
  • the targeting peptide component can include any of the amino acid sequences of Table 1 or a portion thereof. However, the target peptide must be able to bind to the target sequence component.
  • the targeting peptide may be a partial sequence of a calmodulin-binding domain.
  • the target peptide components listed in Table 1 are recognized by the target sequence component CaM (see, for example, Crivici, A. & Ikura, M. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 84-116 (1995)). .
  • the target peptide component may be modified to enhance the response of the fluorescent indicator to the analyte.
  • Other target peptide components for other target sequences are known to those skilled in the art. table 1
  • sraMLCK (smMLCKp) ARRKWQKTGHAVRAIGRLSS (SEQ ID NO: 2)
  • PhK (PhK5) LRRLIDAYAFRIYGHWVKKGQQQNRG (SEQ ID NO: 8)
  • Type I AC AC (AC-28) IKPAKRMKFKTVCYLLVQLMHCRKMFKA (SEQ ID NO: 14) Borderella periussis AC IDLLWKIARAGARSAVGTEA (SEQ ID NO: 15)
  • HIV-1 gpl60 YHRLRDLLLIVKRIVELLGRR (SEQ ID NO: 22)
  • GIP gastrin inhibitory peptide
  • HIV-1 g P 160 human immunodeficiency virus envelope glycoprotein 160;
  • HSP heat shock protein
  • MARCKS myristoylated alanine-rich C kinase substrate
  • MHC myosin heavy chain
  • PhK phosphorylase kinase
  • the length of the VIP, vasoactive intestinal peptide linker component is selected to optimize the rate and specificity of the conformational change upon FRET and analyte binding.
  • the linker component preferably has a length and flexibility such that the target sequence component and the target peptide component can freely interact and respond to the concentration of the analyte.
  • the average distance between the donor and the acceptor fluorescent molecule components is preferably from about 1 nm to about 10 nm, more preferably from about 1 nm to about 6 nm, particularly preferably It is from 1 nm to about 4 nm. If one linker molecule is too short or too rigid, the donor and receptor molecular components cannot easily change.
  • the linker component is preferably a peptide component.
  • Preferred linker components are 1-30 amino acid residues, preferably 1 ⁇ 15 is a peptide of amino acid residue.
  • One example of a linker is -Gly-Gly-linker.
  • the linker component may include a flexible spacer amino acid sequence.
  • the linker component for example, Huston, JS, et al., PNAS 85: 5879-5883 (1988), Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6: 989-995 (1993), and Newton, DL, et al., Biochemistry 35: 545-553 (1996).
  • the target sequence may be any as long as the analyte binds or acts to change the three-dimensional structure of the indicator.
  • a protease site can be used as the target sequence.
  • caspase 3 is used as the protease
  • DEVD can be used as the amino acid sequence of the target sequence.
  • the fluorescent indicator may include a localization sequence. Depending on the localization sequence, the indicator is delivered to a specific site within the cell by fusing with a suitable intracellular organelle targeting signal or localization host protein.
  • a polynucleotide encoding a localization sequence or signal sequence can be ligated or fused to the 5, terminus of the polynucleotide encoding the fluorescent indicator, resulting in a signal polypeptide resulting in a fusion polynucleotide or polypeptide. It can be located at the amino terminus of the peptide.
  • signal peptides are thought to have the function of transporting fusion polypeptides via the endoplasmic reticulum.
  • the secreted protein is then transported to the Golgi apparatus, to the secretory vesicles and extracellular space, and preferably to the external environment.
  • the signal peptide that can be used in the present invention may be a pre-peptide containing a protease recognition site.
  • the localization sequence may be a nuclear localization sequence, an endoplasmic reticulum localization sequence, a peroxosome localization sequence, a mitochondrial localization sequence, or a localization protein.
  • the localization sequence may be, for example, the target sequence described in Protein Targeting, Chapter 35, Stryer, L., Biochemistry (4th ed.)-WH Freeman, 1995.
  • the localization sequence may be a localization protein.
  • the localization sequence include a sequence targeting the nucleus (KKKRK) (SEQ ID NO: 32), Sequence targeting tochondria (amino terminal is MLRTSSLFTRRVQPSLFR ILRLQST-) (SEQ ID NO: 33), sequence targeting ER (KDEL (SEQ ID NO: 34), C-terminal) (Signal sequence is N-terminal Present), a sequence that targets peroxisomes (SKF (SEQ ID NO: 35), at the C-terminus), a sequence that targets translation or insertion into the cell membrane ([CaaX] CAAX (SEQ ID NO: 36), CC (SEQ ID NO: 37), CXC (SEQ ID NO: 38), or ⁇ (SEQ ID NO: 39) at the C-terminus, a sequence targeting the cytoplasmic side of the cell membrane (fusion to SNAP-25), or Golgi Sequences targeting the body (fusion to furin) and the like.
  • Fluorescent indicators can be produced as fusion proteins by recombinant DNA technology.
  • the recombinant production of a fluorescent protein is performed by expressing a nucleic acid encoding the protein.
  • Nucleic acids encoding fluorescent proteins can be obtained by methods known to those skilled in the art.
  • a protein-encoding nucleic acid can be isolated by PCR of O jellyfish-derived cDNA using primers based on the DNA sequence of O jellyfish green fluorescent protein.
  • Various mutants of the fluorescent protein can be prepared by site-directed mutagenesis or random mutagenesis of the nucleic acid encoding the fluorescent protein. Random mutagenesis can be performed by PCR using 0.1 mM MnCl or disrupting the nucleotide concentration balance.
  • Construction of the expression vector and expression of the gene in the transfected cells can be performed according to molecular cloning techniques known to those skilled in the art. These details are described in Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989), as well as Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., Eds., (Current Protocols, A joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., most recent Supplement).
  • the nucleic acid used to transfect cells with a sequence encoding the expression of the polypeptide is generally an expression vector containing an expression control sequence operably linked to the nucleotide sequence encoding the expression of the polypeptide.
  • the term “nucleotide sequence encoding the expression of a polypeptide” as used herein refers to the transcription and translation of mRNA. Refers to a sequence that produces a polypeptide. For example, sequences including introns are also included.
  • expression control sequence refers to a nucleic acid sequence that regulates the expression of a nucleic acid to which it is operatively linked.
  • An expression control sequence is operably linked to a nucleic acid sequence when the expression control sequence controls and regulates the transcription and translation of the nucleic acid sequence.
  • Expression control sequences can include suitable promoters, enhancers, transcription terminators, initiation codons (ie, ATG) before the protein coding gene, intron splicing signals, and stop codons.
  • Methods well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors that contain the coding sequence for the fluorescent indicator and the appropriate transcriptional / translational control signals. These methods include in vitro recombinant DNA technology, synthetic technology, in vivo recombination and genetic recombination (see, for example, Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989). Technology). Transformation of a host cell with the recombinant DNA can be performed by conventional techniques well known to those skilled in the art. When the host cell is a prokaryotic cell, such as E.
  • a DNA transfection method such as a calcium phosphate coprecipitation method, microinjection, electoporation, insertion of a ribosome or a plasmid encapsulated in a viral vector can be used.
  • Eukaryotic cells can transfect together a DNA sequence encoding the fusion polypeptide of the present invention and a foreign DNA molecule encoding an appropriate phenotype such as the simple herpes thymidine kinase gene. .
  • Eukaryotic cells can also be transiently infected or transformed to express proteins using eukaryotic viral vectors such as Simian Virus 40 (SV40) or Pasipapiroma Virus (Eukaryotic Viral Vectors , Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982 See).
  • eukaryotic viral vectors such as Simian Virus 40 (SV40) or Pasipapiroma Virus (Eukaryotic Viral Vectors , Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982 See).
  • eukaryotic host cells are used as host cells.
  • Any conventional method for isolating and purifying the polypeptide of the present invention expressed in a microorganism or eukaryotic cell can be used, for example, preparative chromatography separation and immunological separation (monoclonal or monoclonal). Polyclonal antibody or antigen).
  • a variety of host / expression vector systems can be used to express the sequence encoding the fluorescent indicator.
  • a bacterium transformed with a recombinant pacteriophage DNA, plasmid DNA, or cosmid DNA expression vector containing a sequence encoding a fluorescent indicator a yeast transformed with a recombinant yeast expression vector containing a sequence encoding a fluorescent indicator
  • Plant cells infected with a recombinant virus expression vector containing a sequence encoding a fluorescent indicator eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV
  • recombinant plasmid expression containing a sequence encoding a fluorescent indicator Plant cells transformed with a vector (eg, Ti plasmid); an insect cell line infected with a recombinant viral expression vector (eg, baculovirus) containing a sequence encoding a fluorescent indicator; or a sequence encoding a fluorescent indicator Recombinant virus expression vector containing (E.g., retro
  • transcription and translation elements eg, constitutive or inducible promoters, transcription enhancer elements, transcription terminators, etc.
  • inducible promoters such as pacteriophage, plac, ptrp, pL of ptac (ptrp-lac hybrid promoter) can be used.
  • a promoter derived from the genome of the mammalian cell eg, meta-oral thionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus eg, retrovirus long terminal repeat; adenovirus late
  • vaccinia virus 7.5K promoter e.g, retrovirus long terminal repeat; adenovirus late promoter
  • Insertion sequences encoding fluorescent indicators can also be transcribed using recombinant DNA or promoters produced by synthetic techniques.
  • a number of expression vectors may be advantageously selected depending upon the use intended for the fluorescent indicator being expressed. For example, when producing a large amount of a fluorescent indicator, a vector that directs high-level expression of a fusion protein product that is easily purified is desirable. It is preferably processed to include a cleavage site that assists recovery of the fluorescent indicator. In yeast, a number of vectors containing constitutive or inducible promoters can be used. For example, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch.
  • a constitutive yeast motor such as ADH or LEU2 or an inducible motor such as GAL can be used (Cloning in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press, Wash., DC, 1986) 0
  • a vector that promotes the integration of foreign DNA into the yeast chromosome can be used.
  • a promoter When a plant expression vector is used, expression of the sequence encoding the fluorescent indicator can be promoted by a promoter.
  • a vinoless promoter such as the 35S RNA and 19S RNA promoters of CaMV (Brisson, et al., Nature 310: 511-514, 1984), or a coat protein promoter for TMV (Takamatsu, et al., EMBO J. 6: 307-311, 1987) can be used.
  • a small subunit of RUBISC0 Coruzzi, Et al., 1984, EMBO J.
  • the fluorescent indicator can be expressed using an insect system.
  • foreign genes can be expressed using Autographa california nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) as a vector. This virus grows on Spodoptera frugiperda cells.
  • a sequence encoding a fluorescent indicator is cloned into a non-essential region of the virus (eg, a polyhedrosis gene) and placed under the control of the AcNPV promoter. If the sequence encoding the fluorescent indicator is inserted correctly, the polyhedrosis disease gene will be inactivated and an unobstructed recombinant virus will be produced.
  • viruses can be used to infect Spodoptera frugiperda cells and express the inserted gene in the cells (see, eg, Smith, et al., J. Viol. 46: 584, 1983; and US Pat. 4, 215, 051).
  • eukaryotic cell systems preferably mammalian cell expression systems
  • eukaryotic cells that have the cellular machinery for proper processing of the primary transcript, glycosylation, phosphorylation, and secretion of the gene product are used as host cells for expression of the fluorescent indicator.
  • host cell strains include, but are not limited to, CH0, VER0, BHK, HeLa, C0S MDCK, Jurkat, HEK-293, and WI38.
  • Mammalian cell lines that direct expression using recombinant viruses or viral elements can be constructed.
  • the sequence encoding the fluorescent indicator can be ligated to an adenovirus transcription / translation control complex (eg, the late promoter and three leader sequences).
  • This chimeric gene can be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into a non-essential region of the viral genome (eg, the E1 or E3 region) results in a recombinant virus that is viable in the infected host and capable of expressing a fluorescent indicator (eg, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3655-3659, 1984).
  • a fluorescent indicator eg, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3655-3659, 1984.
  • the vaccinia virus 7.5K promoter can be used (eg, Mackett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 7415-7419, 1982; Mackett, et al., J. Virol. 49: 857-864, 1984; Panicali, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931, 1982). It is also possible to use vectors based on sipapilloma virus, which have the ability to replicate as extrachromosomal elements (Sarver, et al., Mol. Cell. Biol. 1: 486, 1981).
  • the plasmid replicates about 100-200 copies per cell. Transcription of the inserted cDNA does not require the plasmid to integrate into the host chromosome, which will produce high levels of expression.
  • One of these vectors can be used for stable expression by including a selectable marker such as the neo gene in the plasmid.
  • the retroviral genome can be modified and used as a vector capable of inducing and directing the expression of a fluorescent indicator gene in host cells (Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6349-6353, 1984). High levels of expression can be achieved by using inducible promoters such as the metallotionin promoter and heat shock promoter.
  • the host cell is prepared using appropriate expression control elements (eg, promoters, enhancers, sequences, transcription terminators). And a polyadenylation site) and a fluorescent indicator cDNA regulated by a selectable marker.
  • appropriate expression control elements eg, promoters, enhancers, sequences, transcription terminators.
  • a polyadenylation site e.g., promoters, enhancers, sequences, transcription terminators.
  • a fluorescent indicator cDNA regulated by a selectable marker.
  • the selection technique in the recombinant plasmid confers resistance to selection, allowing cells to stably integrate the plasmid into the chromosome, grow and form a colony, which can be cloned and established as a cell line.
  • the recombinant cells can be allowed to grow for 1-2 days in a rich medium, and then switched to a selective medium.
  • a number of selection systems can be used, including, for example, simple hereditary kinase (Wigler, et al., Cell, 11: 223, 1977), hypoxanthine'guanine phospholiposinole transferase (Szybalska & Szybalski, Natl. Acad. Sci.
  • adenine phosphoribosyltransferase (Lowy, et al., Cell, 22: 817, 1980) gene, respectively, in tk-, hgprt- or aprt cells. Can be used.
  • dhfr Wang, et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567, 1980; 0 'Hare, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, which confers antimetabolites resistance to methotrexate resistance. , 8: 1527, 1981
  • gpt (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • trpB which allows cells to use indole instead of tryptophan
  • hisD Hardtman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, which allows cells to use histinol instead of histidine
  • 0DC ornithine decarboxylase; (McConlogue L., In: Current Communications) which confers resistance to the orditin decarboxylase inhibitor 2- (difluoromethyl) -DL-orditin. in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed., 1987).
  • the DNA sequence encoding the fluorescent indicator polypeptide of the present invention may be any suitable host cell. Can be expressed in vitro by introducing DNA into the DNA. That is, the recombinant fluorescent protein of the present invention can be produced by expressing a nucleic acid in prokaryotic cells such as Escherichia coli or eukaryotic cells such as yeast and mammalian cells.
  • the construct may include a tag to facilitate isolation of the fluorescent indicator.
  • a polyhistidine tag consisting of six histidine residues can be added to the amino terminus of a fluorescent protein.
  • the polyhistidine tag makes it possible to easily isolate proteins in a single operation using nickel chelate chromatography.
  • the fluorescent indicator of the present invention is a fusion protein produced by recombinant DNA technology.
  • the single polypeptide includes a donor component, a peptide linker component, and an receptor component.
  • the donor component can be located amino-terminal to the acceptor component in the polypeptide.
  • Such fusion proteins usually have the following structure: (Amino Terminus) Donor Fluorescent Molecular Component—Peptide Linker Component—Acceptor Fluorescent Molecular Component (Carpoxy Terminus).
  • the donor component may be located carboxy-terminal to the receptor component in the fusion protein.
  • Such fusion proteins usually have the following structure: (amino-terminal) receptor fluorescent molecular component-peptide linker component-donor fluorescent molecular component (carboxy-terminal).
  • the present invention also includes a fusion protein containing a kamino-like amino acid sequence at the amino terminal and / or carboxy terminal (for example, a polyhistidine tag).
  • Fluorescent indicators encoded by the recombinant nucleic acids include sequences encoding the expression of a donor fluorescent molecular component, an acceptor fluorescent molecular component, and a peptide linker component. Each component is selected such that upon expression of the fusion protein, the donor and receptor components exhibit FRET upon excitation of the donor component.
  • the recombinant nucleic acid can be incorporated into an expression vector that contains an expression control sequence operably linked to the recombinant nucleic acid.
  • Expression vectors can be configured to function in prokaryotic or eukaryotic cells by including appropriate promoters, replication sequences, markers, and the like. The expression vector can be transfected into a host cell for expression of the recombinant nucleic acid.
  • Host cells can be used to purify fluorescent indicator fusion proteins. Can be selected for bell expression. E. coli is useful for this purpose. Alternatively, the host cells can be other prokaryotic or eukaryotic cells.
  • the linker peptide can be selected to include an amino acid sequence that is recognized by a protease.
  • the cells may be cultured cells or cells in vivo.
  • pRSET B / Venus (Nagai, T. et al. (2002) Nature Biotecnology 20, 87-90) as type ⁇ , 5 -attggatcccatggtgagcaagggcgagg-3 (Rosie IJ 440), 5 '-catgcatgcgggcggcggtcacgaactc-3' ( Tori self (J number 4 1) PCR was performed using PCR, and the PCR product was cut with restriction enzymes fe! I and Sphl. PRSET B / YC2. 12 (Nagai, T. et al.
  • Escherichia coli was transformed using pRSET B / W-cameleon or pRSET B / W-SCAT, and cultured at 37 ° C. for 15 hours on an LB plate containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. A single colony was picked up, placed in a test tube containing 20 ml of LB medium containing 50 / zg / ml of ampicillin, and cultured at 200 rpm at room temperature for 4 days. After the culture, E. coli was recovered by centrifugation and dissolved in 10 ml of PBS (-). After disrupting the cells using a French press, the insoluble fraction was removed by centrifugation. 800-/-1 Ni-NTA agarose (QIAGEN) was added to the supernatant, mixed by inversion at room temperature for 1 hour, and the protein was purified according to the attached protocol.
  • QIAGEN Ni-NTA agarose
  • the W-camleon solution obtained above was dissolved in 1 ml of a measurement solution (50 mM HEPES (pH 7.5), 100 ⁇ EGTA or 50 mM HEPES (pH 7.5), 100 ⁇ EGTA, ImM CaCl 2 ). The dilution ratio was 1/10000. 2 ⁇ l of the W-SCAT solution obtained above diluted 10 times and active caspase3 (CPP32, MBL) lUnit were added to a reaction buffer (20 mM HEPES (pH 7.5), lOOmM NaCl, ImM EDTA, lOmM DTT, 10% sucrose) and 20 ⁇ l, 37. The reaction was performed at C for 2 hours.
  • a conformational change induced by a ligand can be monitored by FRET.
  • the fluorescent indicator of the present invention can be produced in situ by introducing a gene into a cell or a living body, a large amount of a soluble recombinant protein is expressed and purified, purified and labeled in vitro, and microinjected into a cell. There is no need to return. Further, the fluorescent indicator of the present invention can target a cell structure.
  • the conventional method using various fluorescent indicators using FRET which uses fluorescent substances with different colors (sv)
  • uses a wide range of wavelengths for one FRET observation so that fluorescent dyes of other colors are used. Simultaneous observation with is restricted.
  • the wavelength range used for FRET observation can be narrowed, and thus it is suitable for multicolor imaging. For example, if FRET imaging is performed based on CFP, YFP, and RFP based on fluorescence anisotropy, three events can be monitored simultaneously in one cell.

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Abstract

　本発明の目的は、ストークスシフトの小さい蛍光分子を利用して、ホモFRET（蛍光共鳴エネルギー転移）に基づいた蛍光指示薬を提供し、分子間相互作用の可視化システムを開発することである。本発明によれば、分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列のＮ末端側とＣ末端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分子成分を結合させた蛍光指示薬が提供される。

Description

明細書
F R E Tを利用した蛍光指示薬
技術分野
本発明は、 蛍光共鳴エネルギートランスファー （F R E T) を利用した分子間 の相互作用を分析するための蛍光指示薬、 並びにその利用に関する。 より詳細に は、 本発明は、 実質的に同一の蛍光特性を有する 2分子の蛍光分子が標的配列を 介して結合した蛍光指示薬と、 分析物質とを相互作用させることにより生じる F R E Tを偏光解消に基づいて測定することを特徴とする分子間の相互作用を分析 する方法に関する。
背景技術
生物学的系の蛍光分析法は、 他の生物学的手法と比較して非侵襲的に行うこと ができる点で有利である。 蛍光分析法の物理的手法の開発と共に、 例えば細胞内 での反応のモニターとして用いられる生物学的レポーター構築物が開発されてき た。 特に、 固有蛍光に補助因子を必要としない蛍光タンパク質を開発できれば、 このタンパク質を遺伝子構築物を介して細胞中に導入して、 発現させるこにより 各種の分析を行うことができる。 蛍光蛋白質としては、 特に Aequorea victoria 由来の緑色蛍光蛋白質（G F P )が公知である。 Miyawaki 他 （1997) Nature, 388, 882-887には、 G F Pに基づいた C a 2 +感知系が記載されている。
生物学的系の検討 （特に、 分子間の相互作用の検討など） を目的とする F R E Tに基づく方法の例は、 Miyawaki 他 (1997) Nature, 388, 882-887 に記載され ている。 しかしながら、 従来の蛍光分子を利用した F R E Tは、 何れも異なる色
(スぺクトル）を有する 2種類の蛍光分子を利用するものである。この方法では、 —つの FRET観測で、可視領域のかなりの部分を使用することになり、例えば、他 の色の蛍光色素の同時観測が制限されるという問題があった。 発明の開示
本発明は、 標的蛋白質と分析物質との相互作用を簡単かつ視覚的に検出するこ とを可能にする蛍光指示薬、 並びに該蛍光指示薬の利用方法を提供することを解 決すべき課題とした。 より詳細には、 本発明は、 スト一タスシフトの小さい蛍光 分子を利用して、 ホモ FRET (蛍光共鳴エネルギー転移） に基づいた蛍光指示薬を 提供し、 分子間相互作用の可視化システムを開発することを解決すべき課題とし た。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 分析物質が結合又 は作用して指示薬の立体構造を変化させる分析物質の標的配列の N末端側と C末 端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分子成分を結合させた蛍光指示薬を 用いることによって、 分析物質を検出及び測定できることを見出した。 本発明は この知見に基づいて完成したものである。
即ち、 本発明によれば、 分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化 させる標的配列の N末端側と C末端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分 子成分を結合させた蛍光指示薬が提供される。
本発明によれば、 好ましくは、
分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列； 標的配列に共有的に結合したドナー蛍光分子成分；及び、
標的配列に共有的に結合したァクセプタ一蛍光分子成分；
を含む蛍光指示薬であって；
ドナー蛍光分子とァクセプター蛍光分子が実質的に同一の蛍光特性を有する分 子であり、 分析物質の結合により標的配列中に立体構造の変化が生じ、 次いでド ナー分子及ぴァクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、 ある偏 光特性を有した照射光によって励起した場合に観察される蛍光の偏光特性が照射 光のものと異なる傾向が強くなる （偏光解消）、 蛍光指示薬が提供される。
好ましくは、 蛍光分子成分は蛍光蛋白質又はその変異体である。
好ましくは、 蛍光分子成分は黄色蛍光蛋白質またはその変異体である。 好ましくは、 蛍光分子成分は蛍光蛋白質 Venusである。
好ましくは、 蛍光指示薬がさらに標的べプチド成分とリンカー成分を含み、 分 析物質の標的配列が標的べプチド成分を結合するためのぺプチド結合ドメィンを さらに含み、
リンカー成分が分析物質の標的配列と標的べプチド成分とを共有的に結合し、 標的配列と標的べプチド成分がァクセプター蛍光分子成分又はドナー蛍光分子成 分の何れかに共有的に結合し、
標的配列に結合した分析物質が標的べプチド成分及びべプチド結合ドメィンの 相対的位置又は方向の変化を誘導し、 次いでドナー分子及ぴァクセプター分子成 分の相対的位置又は方向に変化が生じ、 これによりある偏光特性を有した照射光 によつて励起した場合に観察される蛍光の偏光特性が照射光のものと異なる傾向 が強くなる （偏光解消）、 蛍光指示薬が提供される。
好ましくは、 標的配列は、 カルモジュリン、 cGMP依存性蛋白質キナーゼ、 ステ ロイドホルモン受容体、 ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、 蛋 白質キナーゼ。、イノシトール- 1， 4, 5-トリホスフエ一ト受容体、又はレコベリン である。
好ましくは、 分析物質の標的配列はカルモジュリンである。
好ましくは、標的ペプチド成分は、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ（skMLCKp)、平 滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ（smMLCK)、 カルモジュリンキナーゼ II (CaMKII)、 力 レデスモン、 力/レスぺノレミン、 ホスホフノレク トキナーゼ、 力/レシネゥリン、 ホス ホリラーゼキナーゼ、 Ca2+ATPァーゼ、 59 Kdaホスホジエステラーゼ（PDE)、 60 Kda ホスホジエステラーゼ（PDE)、 二トリックォキシドシンターゼ、 I型アデ二リルシ クラーゼ、 Bordetella pertussis アデ二リルシクラーゼ、 ニューロモジュリン、 スぺク ト リ ン、 ミ リス トイル化ァラニンリ ツチ C キナーゼ基質（MARCKS)、 MacMARCKS (F52)、 b- Adducin、 ヒートショック蛋白質 HSP90a、 ヒ ト免疫不全ウイ ルスエンベロープグリコプロテイン 160 (HIV- 1 gpl60)、 ブラッシュボーダーミ オシン重鎖- I (BBMHBI)、希ミオシン重鎖 (MHC；)、 マストパラン、 メリチン、 グルカ ゴン、セクレチン、血管作動性腸ぺプチド （VIP)、ガストリン阻害ぺプチド （GIP)、 又はカルモジュリン結合ぺプチド- 2 (Model ぺプチド CBP2)のカルモジュリン結 合ドメインである。
好ましくは、 リンカー成分はべプチド成分である。
好ましくは、 リンカ一成分は 1から 3 0アミノ酸残基である。
好ましくは、 分析物質が作用して指示薬の立体構造を変化させる分析物質の標 的配列は、 酵素により切断されるアミノ酸配列である。
好ましくは、 本発明の蛍光指示薬は、 シングルポリぺプチドである。
好ましくは、 本発明の蛍光指示薬は、 さらに局在化配列を含む。
好ましくは、 局在化配列は核局在化配列、 小胞体局在化配列、 ペルォキシソー ム局在化配列、 ミトコンドリア局在化配列、 ゴルジ体局在化配列、 又は細胞膜局 在化配列である。
本発明の別の側面によれば、 試料中の分析物質を検出又は測定する方法であつ て、
( 1 ) 試料と本発明の蛍光指示薬とを接触させる工程；
( 2 ) ドナー成分を励起させる工程；及び
( 3 ) 試料中の分析物質の濃度や活性に対応した試料中の蛍光共鳴エネルギー転 移の程度を測定する工程；
を含む方法が提供される。
好ましくは、 試料中の蛍光共鳴エネルギー転移の程度を、 偏光解消を測定する ことにより測定する。
好ましくは、 蛍光異方性を求めることにより偏光解消を測定する。
好ましくは、 試料が生細胞であり、 接触工程が蛍光指示薬を細胞中に取り込ま せることを含む。
好ましくは、 細胞へ蛍光指示薬を取り込ませる工程が、 蛍光指示薬の発現をコ 一ドする核酸配列に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクターを細胞に トランスフエクシヨンすることを含む。 本発明のさらに別の側面によれば、 本発明の蛍光指示薬をコードする核酸、 当 該核酸を含む発現べクタ一、 並びに当該核酸又は発現べクタ一を有する形質転換 体が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の蛍光指示薬である W- cameleon及び W- SCATの構造を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の蛍光指示薬は、 分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化 させる標的配列の N末端側と C末端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分 子成分を結合させたものである。 より具体的には、 本発明の蛍光指示薬は、 分析 物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列；
標的配列に共有的に結合したドナー蛍光分子成分；及び、
標的配列に共有的に結合したァクセプター蛍光分子成分；
を含むものであり、
ドナー蛍光分子とァクセプター蛍光分子が実質的に同一の蛍光特性を有する分 子であり、 分析物質の結合により標的配列中に立体構造の変化が生じ、 次いでド ナー分子及ぴァクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、 ある偏 光特性を有した照射光によつて励起した場合に観察される蛍光の偏光特性が照射 光のものと異なる傾向が強くなる （偏光解消） ことを特徴とするものである。 蛍光分子を、 垂直方向で偏光した光で励起する場合、 蛍光分子の発色団が励起 された後、 この蛍光分子が回転する前に、 蛍光放出が完了するために、 通常は、 垂直方向に偏光した蛍光が検出される。 しかし、 この蛍光分子の近くに同じ蛍光 分子が存在すると、 FRETが生じ、観測される蛍光の偏光解消が生じる。 このよう に同じ蛍光分子の間で起こる FRET (ホモトランスファー） は、 偏光解消法で測定 することができる。 ホモトランスファー FRETが実現するためには、蛍光分子の励 起と蛍光スペク トルに重なりがあること （ストークスシフトが小さいこと） が必 要であり、 G F P変異体である C F P、 Y F P又は R F Pなどが適している。 本発明では、標的配列としてプロテア一ゼの基質部位又は C a 2 +によって構造 変化を起こすドメィンの N末端と C末端に同じ蛍光分子を結合させたものを作製 し、 蛍光指示薬を作製した。 このような蛍光指示薬を用いることにより、 アポト 一シスに伴うカスペース 3の活性、又は細胞内 C a 2 +濃度の変化をモニターする ことが可能になる。
本発明における蛍光分子とは、 適当な電磁線で励起した際に発光することがで きる任意の分子を意味する。 蛍光分子としては、 例えば、 蛍光蛋白質を使用する ことができる。
本発明では、 ドナー蛍光分子成分とァクセプター蛍光分子成分は、 実質的に同 —の蛍光特性を有するものであり、 好ましくは、 両者は同一の蛍光分である。 本 発明で用いる蛍光分子は、 F R E Tの効率の点から選択することが好ましく、 F R E Tの効率は本明細書に記載並びに当業者に周知の技術に従って試験すること ができる。
「共有的に結合」 とは、 共有結合又は 2分子間の他の共有的連結を意味する。 共有的な連結としては、 2分子を連結する二価成分が挙げられる。
「標的配列」 とは、 分析物質と結合できるアミノ酸配列を意味する。 好ましい 標的配列は、分析物質と結合すると立体構造が変化する。 「標的ペプチド」 は標的 配列と結合できるペプチドを意味する。 標的ペプチドは、 標的配列と結合するぺ プチドの部分配列である。
「分析物質」 は、 標的配列に結合する溶液中の分子又はイオンを意味し、 標的 配列の立体構造を変化させるものである。 分析物質は標的配列に可逆的に結合し ても非可逆的に結合してもよレ、。
「成分」 とは、 指示薬の他の基に連結している分子の基を意味する。 即ち、 「蛍 光分子成分」 は、標的配列成分またはリンカー成分に結合している蛍光分子の基 である。 「標的配列成分」 は、 蛍光分子成分に結合している標的配列の基である。 「標的ペプチド成分」 は、 標的配列の標的ペプチドの基である。 「リンカ一成分」 は、 ドナー及びァクセプター蛍光分子成分の両方に結合している分子リンカーの 基を意味する。
「作動的に連結」 とは、 対象成分が機能するような関係に位置していることを 意味する。 コード配列に作動的に連結した調節配列は、 コード配列の発現が調節 配列に適合した条件下で達成されるように連結している。 「調節配列」 は、それが 連結しているコード配列及ぴ非コ一ド配列の発現に必要なポリヌクレオチドを意 味する。 調節配列としては、 プロモーター、 リボソーム結合部位、 転写終結配列 などが挙げられる。 調節配列はさらに、 リーダー配列及ぴ融合蛋白質の相手側の 配列などを含んでいてもよい。
「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも 1 0ヌクレオチド以上を意味する。 ヌクレオチドはリボヌクレオチド、 デォキシヌクレオチド、 又はそれらの改変体 でもよく、 一本鎖でも二本鎖でもよい。
分析物質を検出又は測定するために蛍光共鳴エネルギー転移 （FRET)を利用す る本発明の蛍光指示薬は、 ドナー蛍光分子成分とァクセプター蛍光分子成分とな る放射及び励起スぺク トルを有する 2分子の蛍光分子成分を含む。 本発明で用い るドナー蛍光分子成分及びァクセプター蛍光分子成分は、 実質的に同一の蛍光特 性を有する成分であり、 好ましくは同一の成分である。 また、 ァクセプター蛍光 分子成分の励起スぺク トルがドナー蛍光分子成分の放射スぺクトルと重複するよ うに選択する。 ドナー及ぴァクセプター蛍光分子成分 （本発明では、 これらは実 質的に同一の蛍光特性を有する） は、 分析物質の結合により立体構造が変化する 標的配列成分に結合している。 立体構造の変化により ドナー及ぴァクセプター蛍 光分子の相対的位置及ぴ方向が変化し、 これにより、 偏光解消が生じる。
蛍光分子成分は標的配列成分のァミノ末端及びカルボキシ末端に共有的に結合 していることが好ましい。 これにより、 ドナー蛍光分子成分及ぴァクセプター蛍 光分子成分は、 分析物質が結合した際に互いに密接に移動できる。 あるいは、 ド ナー及ぴァクセプター成分は、 分析物質の結合の際に互いに離れるように移動し てもよい。 一例としては、 ァクセプター成分は、 標的配列成分に結合している標 的ぺプチド成分に共有的に結合し、 標的べプチド成分はリンカ一成分を介して標 的配列成分に共有的に結合している。 リンカ一成分はフレキシブルなもので、 標 的ぺプチド成分が標的配列成分に結合することができる。 ドナー成分は、 ドナー 成分の励起スぺクトル内の適当な強さの光によって励起される。 ドナー成分は吸 収したエネルギーを蛍光として放出する。 ァクセプター蛍光分子成分が励起状態 のドナー成分を消光できる位置に存在する場合、 蛍光エネルギーはァクセプター 成分に転移されて、 蛍光が放出される。
本発明では、 1種類の蛍光分子 （即ち、 実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光 分子） を用いて FRETを起こす （本明細書では、 ホモ FRETとも言う）。 ホモ FRET の観察は、一般的には、蛍光の偏光解消を測定することにより行うことができる。 蛍光の偏光解消を起こす要因としては、 蛍光の再吸収、 FRET、 及ぴ蛍光分子の回 転ブラウン運動がある。 し力 し、 一番自由度が高いと考えられる細胞質内環境に おいてさえ、 GFP などの蛍光蛋白質の回転緩和時間は 3 0〜4 0 n s e cと測定 されており、 これは GFPの蛍光の寿命 （3〜4 n s e c ) と比べて非常に長いた め、 蛍光分子の発色団自身が偏光を解消するほど高速に回転する可能性は極めて 低い。 また、 GFP が十分に希釈された条件下または細胞内のように光路長が極め て短い状況下では蛍光の再吸収による影響はまず起きないものと考えられる。 従 つて、 蛍光分子からの蛍光に偏光の解消が認められた場合には、 FRETが生じたも のと結論付けることができる。
偏光の強さは、 蛍光の異方性を用いて評価することができる。 蛍光の異方性 (Anisotropy; A) は、 以下の式により求めることができる。
A= [ I (平行） 一 I (垂直) ] / [ I (平行） + 2 X 1 (垂直) ]
式中、 I (平行） は入射光の偏光方向と平行な蛍光成分ベク トルを示し、 I (垂 直） は入射光の偏光方向と垂直な蛍光成分ベク トルを示す。
試料中の蛍光は、 蛍光偏光度測定装置を用いて測定できる。 通常、 励起源から の励起線は励起光学系を通過する。 励起光学系により励起線は試料を励起する。 これに応答して、 試料中の蛍光分子は、 励起波長とは異なる波長を有する放射線 を放出する。 次いで、 回収光学系が試料からの放射線を回収する。 このデバイス には、スキャン中の試料を一定の温度に維持するための温度調節器を有している。 —例としては、 多軸転換ステージにより、 複数の試料を保持するマイクロタイタ 一プレートが移動する。 多軸転換ステージ、 温度調節器、 自動焦点機能、 並びに 画像化とデータ収集に関連した電子装置は、 適当にプログラムされたデジタルコ ンピューターによって管理されている。
偏光解消によるホモトランスファー FRETの検出は、 インビトロ （キュベッ トや プレート内） やインビポ （顕微鏡下、 細胞内） で行えるようなシステム （光学系 の偏光成分を重視したもの） をセットアップすることができる。
蛍光偏光度の測定は、 例えば、 蛍光偏光度測定装置 B E A C O N (TAKARA) な どの市販の装置を用いて行うことができる。 また、 蛍光偏光度の測定方法は当業 者に既知であり、 例えば、 蛋白質 ·核酸.酵素、 4 2卷、 N o . 1、 p 7 7 - 8 1 ( 1 9 9 7 ) などに記載されている。
本発明では任意の蛍光分子を使用できる。 例えば、 刺胞動物の緑色蛍光蛋白質 (GFP)及ぴその変異体を使用することができる。変異体としては、シアン蛍光蛋白 質 （CFP)、 黄色蛍光蛋白質 （YFP)、 赤色蛍光蛋白質 （RFP) または青色蛍光蛋白質 (BFP) などが挙げられる。これらの蛍光蛋白質は、 Pacdfic Northwest jellyfish, Aequorea victoria、 the sea pansy、 Reniila reniformis 及び Phialidium gregarium など力 ら得られる ( Ward, W. W.， 他， Photochem. Photobiol. , 35 : 803 - 808 (1982)； and Levine, L. D. , 他， Comp. Biochem. Physiol. , 72B: 77 - 85 (1982) )。 あるいは、 フルォレセイン、 ローダミン、 Alexa、 Cyなどの低分子有機 化合物を使用することができる。
有用な励起及び放射スぺク トルを有する各種クラゲ由来蛍光蛋白質は、 ォワン クラゲ由来の天然 GFP のアミノ酸配列を改変することによって作製されている
(Prasher, D. C. , 他、 Gene, 111 : 229 - 233 (1992) ; Heim, R. , 他， Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 91 : 12501-04 (1994)； 米国特許出願番号 08/337, 915 ;国際出願 PCT/US95/14692;及び米国特許出願番号 No. 08/706, 408) 0 GFPの cDNAは、 これら 他の蛋白質をコードする cDNAと連結してもよく、得られる融合体も蛍光で相手の 蛋白質の生化学的特徴を保持している場合がある （Cubitt, A. B.，他、 Trends Biochem. Sci. 20:448-455 (1995))。 また、 変異誘発により励起又は発光波長が シフトした GFP変異体が作製されている （Heim, R. &Tsien, R. Y. Current Biol. 6:178 - 182 (1996))。野生型クラゲ由来の蛍光蛋白質のアミノ酸配列と 85 %以上 の相同性を有する 150の連続するアミノ酸が含まれていれば、 その蛋白質は、 クラゲ由来の蛍光蛋白質である。
本明細書で言う、 緑色蛍光蛋白質 （GFP)、 黄色蛍光蛋白質 （YFP) または それらの変異体とは、 各々公知の緑色蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質だけでなく、 それらの変異体の全てを包含する意味である。 例えば、 緑色蛍光蛋白質遺伝子は 単離され配列も決定されている（Prasher， D. C. ら（1992)， "Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein ， Gene 111： 229— 233)。 その他の蛍光蛋白質又はその変異体のアミノ酸配列も多数報告されており、 例え ば、 Roger Y. Tsin, Annu. Rev. Biochem.1998. 67:509-44、 並びにその引用文献に 記載されている。
緑色蛍光蛋白質（GFP)、黄色蛍光蛋白質（YFP) またはそれらの変異体と しては、 例えば、 ォワンクラゲ （例えば、 ェクオレア · ビクトリア （Aequorea victoria)) 由来のものを使用できる。
GFP、 YFPとそれらの変異体の一例を以下に示す。 なお、 F 99 Sという 表示は、 99番目のアミノ酸残基が Fから Sに置換していることを示し、 他のァ ミノ酸置換についても同様の表示に従って示す。
野生型 GFP ；
F 99 S, Ml 53 Τ, V 163 Aのアミノ酸変異を有する G F P ；
S 65 Tのアミノ酸変異を有する GFP ；
F 64 L, S 65 Tのアミノ酸変異を有する GF P ；
S 65 T, S 72 A, N 149 K, Ml 53 Τ, I 167 Tのアミノ酸変異を有 する GF P ；
S 202 F, T203 Iのアミノ酸変異を有する GFP ；
T 203 I , S 72 A, Y145Fのァミノ酸変異を有する G F P ；
S 65 G, S 72 A, T 203 Fのアミノ酸変異を有する G F P (YFP) ;
S 65 G, S 72 A, T 203 Hのアミノ酸変異を有する G F P (YFP) ;
S 65 G, V 68 L, Q 69 K, S 72 A, T 203 Yのアミノ酸変異を有する
GFP (EYF P-V 68 L, Q 69 K) ；
S 65G, S 72 A, T 203 Yのアミノ酸変異を有する G F P (EYFP) ; S 65G, S 72 A, K 79 R, T 203 Yのアミノ酸変異を有する G F P (Y F P) ；
本発明では GFP変異体である CFP、 YFP, RFP又はそれらの変異体を 使用することが好ましく、 例えば、 YFP変異体である Venusを用いることがで きる。 Venus については、 Nagai, T. 他（2002) Nature Biotecnology 20, 87-90 を参照できる。 Venusは、 YFPの 46番目のフエ二ルァラニンをロイシンに置換 することにより得られる蛍光蛋白質であり、 従来の GFPと比較して、 大腸菌内で 30〜100倍、 ほ轧類の細胞内で 3〜： 100倍の明るさを達成し、通常の装置でも十分 検出可能な蛍光を提供することができる。
本発明で使用できる他の蛍光分子としては、 Vibrio fischeri株 Y- 1由来の黄 色 光蛋白質、 Peridinin-c lorophyll (dinoflagellate Symbiodinium sp.由来 蛋白質）、 Synechococcusなどの海洋シァノバクテリア由来の phycob i 1 i蛋白質（例 えば、 フィコエリスリン及ぴフィコシァニンなど）、又はフィコエリスロビリンで 再構築したオート麦由来のオートフィトクロムなどが挙げられる。 これらの蛍光 蛋白質は Baldwin, T. 0,， 他， Biochemistry 29:5509-5515 (1990), Morris, B. J., 他， Plant Molecular Biology, 24 :673-677 (1994), 及び Wilbanks, S. M.， 他， J. Biol. Chem. 268:1226-1235 (1993), 及ぴ Li 他， Biochemistry 34： 7923-7930 (1995)などに記載されている。
ドナー及ぴァクセプター蛍光分子成分間の FRETの効率は、 2つの蛍光分子が相 互作用する能力を調節することによって調節することができる。 標的配列成分、 標的ペプチド成分及びリンカ成分の性質も FRET及び分析物質に対する指示薬の 応答に影響する。 通常、 大きな立体構造変化が標的配列成分に生じることが望ま しい。
標的配列成分は、 分析物質の結合に際して立体構造が変化する蛋白質又はその 一部である。 そのような蛋白質の例としては、カルモジュリン（CaM)、 cGMP-依存 性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体 （又はそのリガンド結合ドメイン）、 プロテインキナーゼ (：、 イノシトール- 1, 4，5-トリホスフェート受容体、又はレコ ベジンなどが挙げられる (例; 1ば、 Katzenellenbogen, J. A. & Katzenellenbogen, B. S. Chemistry & Biology 3 : 529- 536 (1996) , 及ぴ Ames, J. B. , 他、 Curr. Opin. Struct. Biol. 6 : 432-438 (1996)を参照）。 標的配列成分は好ましくは、 分析物質 以外に標的べプチドにも結合する。
標的ぺプチド成分は表 1の任意のァミノ酸配列またはその一部を含むことがで きる。 但し、 標的ペプチドは標的配列成分に結合できなくてはならない。 標的ぺ プチドは、 カルモジュリン結合ドメィンの部分配列でもよい。 表 1に挙げた標的 ペプチド成分は標的配列成分 CaMによって認識される （例えば、 Crivici, A. & Ikura, M. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 84—116 (1995)を参照）。 標 的ぺプチド成分を改変して、 分析物質に対する蛍光指示薬の応答を増強してもよ い。 他の標的配列に対する他の標的ぺプチド成分も当業者には既知である。 表 1
標的 配列
SkMLCK (M13) KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL (配列番号 1 )
sraMLCK (smMLCKp) ARRKWQKTGHAVRAIGRLSS (配列番号 2 )
CaMKII ARRKLKGAILTTMLATRNFS (配列番号 3 )
Caldesmon GVRNIKSMWEKGNVFSS (配列番号 4 )
Calspermin ARRKLKAAVKAVVASSRLGS (配列番号 5 ) 5790
PFK (Mil) FMNNWEVYKLLAHIRPPAPKSGSYTV (配列番号 6 )
Calcineurin ARKEVIRNKIRAIGKMARVFSVLR (配列番号 7 )
PhK (PhK5) LRRLIDAYAFRIYGHWVKKGQQQNRG (配列番号 8 )
(PhK13) RGKFKVICLTVLASVRIYYQYRRVKPG (配列番号 9 )
Ca2+ -ATPase (C28W) LRRGQILWFRGLNRIQTQIKVVNAFSSS (配列番号 1 0 )
59- kDa PDE RKHLQRPIFRLRCLVKQLEK (配列番号 1 1 )
60- kDa PDE TEKMWQRLKGILRCLVKQLEK (配列番号 1 2 )
NOS (N0-30) KRRAIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ (配列番号 1 3 )
Type I AC (AC- 28) IKPAKRMKFKTVCYLLVQLMHCRKMFKA (配列番号 1 4 ) Borderella periussis AC IDLLWKIARAGARSAVGTEA (配列番号 1 5 )
Neuromodulm KAHKAATKIQASFRGHITRKKLKGEKK (配列番号 1 6 )
Spectrin KTASPWKSARLMVHTVATFNSIKE (配列番号 1 7 )
MARCKS KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKSKK (配列番号 1 8 )
F52 or MacMARKS KKKKKFSFKKPFKLSGLSFKR RK (配列番号 1 9 )
β -Adducin KQQKEKTRWLNTPNTYLRVNVADEVQRNMGS (配列番号 2 0 )
HSP90a KDQVANSAFQERLRKHGLEVI (配列番号 2 1 )
HIV - 1 gpl60 YHRLRDLLLIVKRIVELLGRR (配列番号 2 2 )
BBMHBI QQLATLIQKTYRG RCRTHYQLM (配列番号 2 3 )
Dilute MHC RAACIRIQKTIRGWLLRKRYLCMQ (配列番号 2 4 )
Mastoparan INLKAALAKKIL (配列番号 2 5 )
Melittin GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (配列番号 2 6 )
Glucagon HSQGTFTTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (配列番号 2 7 )
Secretin HSDGTFTSELSRLRDSARLQRLLQGLV (配列番号 2 8 )
VIP HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNS ILN (配列番号 2 9 )
GIP YADGTFISDYSAIMNKIRQQDFVNWLLAQQQKS (配列番号 3 0 )
Model ぺプチド CBP2 _ KLWKKLLKLLKKLLKLG ( B列番号 3 1 ) 略号の説明
AC, アデ二リルシクラーゼ；
BBMHCI, brush- borderミオシン重鎖- 1；
CaMKII, カルモジュリンキナーゼ II；
CBP2, カルモジュリン結合べプチド- 2 ;
GIP, ガストリン阻害べプチド；
HIV-1 gP160, ヒト免疫不全ウィルスエンベロープ糖蛋白質 160;
HSP, ヒートショック蛋白質；
MARCKS, ミリストイル化ァラニンリッチ Cキナーゼ基質；
MHC, ミオシン重鎖；
N0S, 二トリックォキシドシンターゼ；
PDE, ホスホジエステラーゼ；
PFK, ホスホフルク トキナーゼ
PhK, ホスホリラーゼキナーゼ；
sk_, smMLCK, 骨格筋及ぴ平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ；
VIP, 血管作動性腸ペプチド リンカ一成分の長さは、 FRET及び、分析物質の結合により立体構造変化の速度 及び特異性を最適化するように選択する。 リンカ一成分は、 標的配列成分と標的 ぺプチド成分とが自由に相互作用して分析物質濃度に応答できるような長さと柔 軟さを有することが好ましい。 FRET効果を最適化するために、 ドナー及びァクセ プター蛍光分子成分の平均距離は、 好ましくは約 1 nm から約 10 nmであり、 よ り好ましくは約 1 nmから約 6 nmであり、 特に好ましくは 1 nmから約 4 nmであ る。 リンカ一分子が短すぎたり堅固すぎると、 ドナー及ぴァクセプター分子成分 は容易に一を変えることができない。 リンカ一成分が長すぎると、 標的ペプチド 成分は効率的に標的配列成分に結合できない。 リンカー成分は好ましくはべプチ ド成分である。 好ましいリンカ一成分は、 1〜3 0アミノ酸残基、 好ましくは 1 〜 1 5ァミノ酸残基のぺプチドである。 リンカーの一例は、 - Gly- Gly- リンカー である。
リンカー成分はフレキシブルなスぺーサーアミノ酸配列を含んでもよい。 リン カー成分については、 例えば、 Huston, J. S. , 他， PNAS 85 : 5879-5883 (1988)， Whitlow, M. , 他， Protein Engineering 6 : 989-995 (1993)， 及び Newton, D. L. , 他， Biochemistry. 35 : 545 - 553 (1996)などに記載されている。
標的配列は、 分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させるもの でればよく、例えば、酵素によって認識されて切断される配列でもよい。例えば、 標的配列としてプロテア一ゼの基質部位を使用することができる。 プロテアーゼ としてカスペース 3を用いる場合は、標的配列のァミノ酸配列として DEVDを使用 することができる。
蛍光指示薬には局在化配列が含まれていてもよい。 局在化配列により、 指示薬 は、 好適な細胞内小器官標的シグナル又は局在化宿主蛋白質と融合することによ り細胞内の特定の部位に運ばれる。 局在化配列又はシグナル配列をコードするポ リヌクレオチドを蛍光指示薬をコ一ドするポリヌクレオチドの 5， 末端に連結又 は融合することができ、 これによりシグナルぺプチドは生じる融合ポリヌクレオ チド又はポリぺプチドのァミノ末端に位置することができる。
真核細胞の場合、 シグナルぺプチドは融合ポリぺプチドを小胞体を経由して輸 送する機能を有すると考えられている。 分泌蛋白質は次いでゴルジ体に運ばれ、 分泌小胞及び細胞外空間、 そして好ましくは外部環境に運ばれる。 本発明で使用 できるシグナルぺプチドは、 蛋白質分解酵素認識部位を含むプレブロぺプチドで あよい。
局在化配列 は核局在化配列、 小胞体局在化配列、 ペルォキソ一ム局在化配列、 ミトコンドリァ局在化配列、又は局在化蛋白質でもよい。局在化配列は、例えば、 Protein Targeting , 35章、 Stryer, L. , Biochemistry (4th ed. ) - W. H. Freeman, 1995に記載されている標的配列でもよい。局在化配列は、局在化蛋白質でもよレ、。 局在化配列の具体例としては、 核を標的とする配列 (KKKRK) (配列番号 3 2 )、 ミ トコンドリアを標的とする配列（ァミノ末端が MLRTSSLFTRRVQPSLFR ILRLQST- ) (配列番号 3 3 )、 小胞体を標的とする配列 (KDEL (配列番号 3 4 )、 C -末端に） （シ グナル配列は N末端に存在する）、ペルォキシソームを標的とする配列（SKF (配列 番号 3 5 )、 C-末端に）、 細胞膜へのプレニレーシヨン又は揷入を標的とする配列 ( [CaaX] CAAX (配列番号 3 6 )， CC (配列番号 3 7 )， CXC (配列番号 3 8 ) , 又は ∞ （配列番号3 9 ) 、C -末端に）、 細胞膜の細胞質側を標的とする配列（SNAP - 25 への融合）、 又はゴルジ体を標的とする配列（furinへの融合）などが挙げられる。 蛍光指示薬は組み換え DNA技術により融合蛋白質として製造できる。 蛍光蛋白 質の組み換え生産は、 蛋白質をコードする核酸の発現により行う。 蛍光蛋白質を コードする核酸は、 当業者に既知の方法で入手できる。 例えば、 蛋白質をコード する核酸は、 ォワンクラゲ緑色蛍光蛋白質の DNA配列に基づいたプライマーを用 いてォワンクラゲ由来 cDNAの PCRによって単離することができる。蛍光蛋白質の 各種変異体は、 蛍光蛋白質をコードする核酸の部位特異的変異誘発又はランダム 変異誘発によって作製することができる。 ランダム変異誘発は、 0. 1 mM MnCl を 用いたりヌクレオチド濃度のパランスを崩して PCRを行うことにより行うことが できる
発現ベクターの構築及ぴトランスフエクションした細胞での遺伝子の発現は、 当業者に公知の分子クローニング手法に従って行うことができる。 これらの詳細 は、 Sambrook他， Molecular Cloning― A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) 、 並ぴに Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 他, eds. , (Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. , most recent Supplement)に言己載されてレヽる。
ポリべプチドの発現をコードする配列で細胞をトランスフエクシヨンするため に使用する核酸は一般に、 ポリべプチドの発現をコードするヌクレオチド配列に 作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクターである。ここで言う〃ポリぺプ チドの発現をコードするヌクレオチド配列"とは、 mRNA の転写及び翻訳により、 ポリペプチドを産生する配列を言う。 例えば、 イントロンを含む配列もこれに含 まれる。 ここで言う"発現調節配列"とは、 それが作動的に連結している核酸の発 現を調節する核酸配列を言う。 発現調節配列が核酸配列の転写及び翻訳を調節お よび制御する際に、 発現調節配列は核酸配列に作動的に連結している。 発現調節 配列は、 好適なプロモーター、 ェンハンサー、 転写ターミネータ一、 蛋白質コー ド遺伝子の前の開始コドン （即ち、 ATG)、ィントロンのスプライシングシグナル、 及ぴ停止コドンなどを含むことができる。
当業者に周知の方法を使用して、蛍光指示薬のコード配列と、適当な転写'翻訳 調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。 これらの方法として は、 インビトロ組み換え D N A技術、 合成技術、 インビポ組み換え '遺伝組み換 えなど力 S挙げられる (例えば、 Maniatis, 他， Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. , 1989に記載の技術を参照）。 組 み換え D N Aによる宿主細胞の形質転換は当業者に周知の慣用技術によって行う ことができる。 宿主細胞が大腸菌などの原核細胞である場合、 D N Aを取り込む ことができるコンビテント細胞は、 対数増殖期後に回収し、 当業者に周知の C a C 1 2法で処理した細胞を用いて作製することができる。 あるいは、 M g C 1 2又 は R b C 1を使用することもできる。 形質転換は、 宿主細胞のプロトプラストを 作成後、 またはエレクトロポレーシヨンにより行うことができる。
宿主細胞が真核細胞である場合、 リン酸カルシウム共沈殿法、 マイクロインジ ェクシヨン、 エレクト口ポレーシヨン、 リボソーム又はウィルスベクターに封入 したプラスミドの挿入などの D N Aトランスフエクション法を使用することがで きる。 真核細胞は、 本発明の融合ポリペプチドをコードする D NA配列と、 単純 ヘルぺスチミジンキナーゼ遺伝子などの適当な表現型をコードする外来 D N A分 子とを一緒にトランスフエクシヨンすることができる。 サルウィルス 4 0 ( S V 4 0 ) 又はゥシパピローマウィルスなどの真核ウィルスベクターを使用して、 真 核細胞を一過的に感染または形質転換して蛋白質を発現させることもできる (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed. , 1982 を参照)。 好ましくは、 真核細胞宿主を宿主細胞として使用する。
微生物又は真核細胞で発現させた本発明のポリぺプチドの単離及び精製方法は 任意の慣用方法を使用することができ、 例えば、 プレパラティブクロマトグラフ ィ一分離及び免疫学的分離 （モノクローナル又はポリク口ーナル抗体又は抗原を 使用することを含むものなど） などが挙げられる。
蛍光指示薬をコードする配列を発現させるために、 各種の宿主/発現べクタ一 系を使用することができる。 例えば、 蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換 えパクテリオファージ DNA、プラスミド DNA、又はコスミド DNA発現ベクターで形 質転換した細菌；蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクター で形質転換した酵母；蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えウィルス発現 ベクター（例えば、 カリフラワーモザイクウィルス、 CaMV;タバコモザイクウィル ス、 TMV) を感染させた植物細胞、又は蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換 えプラスミド発現ベクター (例えば、 Tiプラスミ ド） で形質転換した植物細胞； 蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えウィルス発現ベクター (例えば、 バ キュロウィルス） を感染させた昆虫細胞系；あるいは、 蛍光指示薬をコードする 配列を含む組み換えウィルス発現ベクター （例えば、 レトロウイルス、 アデノウ ィルス、 ワクシニアウィルス） を感染させた動物細胞系などが挙げられるが、 こ れらに限定されるものではない。
使用する宿主 ベクター系に応じて、 適当な転写及び翻訳要素 （例えば、 構成 的又は誘導性プロモーター、 転写ェンハンサ一要素、 転写ターミネータ一など） を発現ベクター中で使用することができる（例えば、 Bitter, 他， Methods in Enzymology 153 : 516-544, 1987 を参照）。 例えば、 細菌系にクローニングする場 合、 パクテリオファージえ、 plac、 ptrp、 ptac (ptrp - lacハイブリッドプロモー ター）の pLなどの誘導性プロモーターを使用することができる。 哺乳動物細胞系 にクローユングする場合、 哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター （例え ば、 メタ口チォネインプロモーター） 又は哺乳動物ウィルスに由来するプロモー ター （例えば、 レトロウイルスロングターミナルリピート ；アデノウイルス後期 プロモーター；ワクシニアウィルス 7. 5 Kプロモーターなど） を使用することが できる。 組み換え DNA又は合成技術で作製したプロモーターを使用して蛍光指示 薬をコードする挿入配列を転写させることもできる。
細菌系では、 発現する蛍光指示薬の意図する用途に応じて多数の発現ベクター を有利に選択することができる。 例えば、 大量の蛍光指示薬を産生させる場合に は、 容易に精製される融合蛋白質産物の高量の発現を指令するベクターが望まし レ、。 蛍光指示薬の回収を助ける切断部位を含むように加工したものが好ましい。 酵母では、 構成的又は誘導性のプロモーターを含む多数のベクターを使用する こと力 Sできる。 例えば、 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, 他, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988； Grant, 他. , Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N. Y. , Vol. 153， pp. 516-544, 1987； Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash. , D. C.， Ch. 3， 1986 ;並ぴに、 Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N. Y. , Vol. 152， pp. 673-684, 1987； 及ぴ The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern 他 ·， Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982などを参照することができる。 ADH 又は LEU2などの構成的酵母プ口モーターあるいは GALなどの誘導性プ口モーター を使用することができる (Cloning in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press, Wash. , D. C. , 1986) 0 あるいは、 酵母の染色体への外来 DNAの組み込みを促進するベクターを使用する こともできる。
植物の発現ベクターを使用する場合、 蛍光指示薬をコードする配列の発現は、 プロモーターにより促進することができる。例えば、 CaMVの 35S RNA及ぴ 19S RNA プロモーターなどの ウイノレスプロモーター（Brisson, 他， Nature 310: 511—514, 1984)、 又は TMV に対するコート蛋白質プロモーター（Takamatsu, 他， EMBO J. 6 : 307-311, 1987)を使用できる。あるいは、 RUBISC0の小型サブユニット （Coruzzi, 他， 1984, EMBO J. 3 : 1671-1680 ; Broglie, 他， Science 224: 838-843， 1984)な どの植物プロモーター、 又はヒートショックプロモーター （例えば、 大豆 hspl7. 5- E又は hspl7. 3- B (Gurley, 他， Mol. Cell. Biol. 6: 559-565， 1986)な ど） を使用してもよレ、。 これらの構築物は、 Tiプラスミド、 Riプラスミド、植物 ウイ スベクター、 直接 DNA形質転換、 マイクロインジェクション、 エレクト口 ポレーシヨンなどによって植物に導入することができる。 これらの技術について は、 例 ば、 Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463, 1988 ;及ぴ Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. , Blackie, London, Ch. 7-9, 1988 などに記 載されている。
昆虫系を使用して蛍光指示薬を発現することも可能である。 例えば、 オートグ ラファカリフォルニァ核多角体病ウィルス（AcNPV) をベクターとして使用して外 来遺伝子を発現することができる。 このウィルスは、 Spodoptera frugiperda細 胞で生育する。 蛍光指示薬をコードする配列をこのウィルスの非本質領域 （例え ば、多角体病遺伝子）中にクローユングし、 AcNPVプロモーターの制御下に置く。 蛍光指示薬をコードする配列を正しく挿入した場合、多角体病遺伝子は不活化し、 未閉塞の組み換えウィルスが産生する。 これらの組み換えウィルスを使用して Spodoptera frugiperda細胞に感染させ、 その細胞内で挿入した遺伝子を発現さ せることができる （例えば、 Smith, 他， J. Viol. 46 : 584, 1983 ;及び米国特許第 4, 215, 051号を参照）。
真核細胞系、 好ましくは哺乳動物細胞の発現系を使用することにより、 発現し た哺乳動物の蛋白質の適切な翻訳後修飾を行うことが可能になる。 一次転写物の 適切なプロセシング、 グリコシル化、 リン酸化、 及ぴ遺伝子産物の分泌のための 細胞機構を有する真核細胞を、 蛍光指示薬の発現のための宿主細胞として使用す ることが好ましレ、。そのような宿主細胞株としては、 CH0、 VER0、 BHK、 HeLa、 C0S MDCK、 Jurkat, HEK - 293、 並びに WI38などが挙げられるが、 これらに限定される ものではない。 組み換えウィルス又はウィルス要素を利用して発現を指令する哺乳動物細胞系 を構築することができる。例えば、アデノウィルス発現ベクターを使用する場合、 蛍光指示薬をコードする配列をアデノウィルス転写/翻訳調節複合体 （例えば、 後期プロモーター及ぴ 3つのリーダー配列など） に連結することができる。 この キメラ遺伝子をインビトロ又はインビボ組み換えによりアデノウィルスゲノムに 挿入することができる。 ウィルスゲノムの非本質領域 （例えば、 E1又は E3領域） への挿入により感染宿主で生存可能で蛍光指示薬を発現することができる組み換 えウィルス力 S得られる（例えば、 Logan & Shenk， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81： 3655-3659, 1984を参照）。 あるいは、 ワクシニアウィルス 7, 5 K プロモーターを 使用することができる（例えば、 Mackett, 他， Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 79： 7415-7419, 1982； Mackett, 他， J. Virol. 49： 857-864, 1984； Panicali, 他， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 4927-4931, 1982 を参照）。 染色体外要素とし て複製する能力を有するゥシパピローマウィルスに基づくベクターを使用するこ とも可能である （Sarver, 他， Mol. Cell. Biol. 1 : 486, 1981)。 この DNAをマ ウス細胞に導入した直後に、 プラスミドは細胞当たり約 1 0 0〜 2 0 0コピー複 製する。挿入した cDNAの転写には、プラスミドが宿主の染色体に組み込まれるこ とは必要ではなく、 これにより高レベルの発現が生み出される。 これらのベクタ 一は、 neo遺伝子などの選択マーカーをプラスミド中に含めることによって安定 した発現のために使用することができる。 あるいは、 レトロウイルスゲノムを改 変して、 宿主細胞内での蛍光指示薬遺伝子の発現を誘導及び指令することができ るベクターとして使用することができる（Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6349-6353, 1984)。 高レベルの発現は、 メタロチォニン ΠΑプロモータ ー及ぴヒートショックプロモーターなどの誘導性プロモーターを使用することに よって達成することができる。
組み換え蛋白質の長期間の高収量の生産のためには、 安定な発現が好ましい。 ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを使用する代わりに、 宿主細胞は、 適当 な発現調節要素 （例えば、 プロモーター、 ェンハンサー、 配列、 転写ターミネ一 ター、 ポリアデニレーシヨン部位など） および選択マーカーで調節された蛍光指 示薬 cDNAで形質転換することができる。組み換えプラスミド中の選択マ一力一は 選択に対する耐性を付与し、 細胞が染色体にプラスミドを安定に組み込み、 成長 してコロユーを形成し、 これをクローユングして細胞株として樹立することがで きる。 例えば、 外来 DMの導入後、 組み換え細胞を富裕培地で 1〜2日間増殖さ せ、 その後に選択培地に切り替えることができる。 多数の選択系を使用すること ができるが、例えば、単純へルぺスチミジンキナーゼ（Wigler, 他， Cell, 11 : 223， 1977)、ヒポキサンチン'グァニン ·ホスホリポシノレトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48 : 2026, 1962)、 及びアデニンホス ホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy， 他， Cell, 22： 817, 1980) 遺伝子をそれ ぞれ、 tk- , hgprt-又は aprt細胞で使用することができる。 また、 代謝拮抗物質 耐性を、メソトレキセートに対する耐性を付与する dhfr (Wigler, 他， Pro Natl. Acad. Sci. USA, 77： 3567, 1980； 0' Hare, 他， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8 : 1527, 1981)、 ミコフエノール酸に対する f性を付与する gpt (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 : 2072, 1981)、 ァミノダルコシド G- 418 に対 する耐性を付与する neo (Colberre-Garapin, 他， J. Mol. Biol. , 150： 1, 1981)、 及ぴハイグロマイシンに対する耐性を付与する hygro (Santerre, 他， Gene, 30： 147, 1984)遺伝子の選択の基礎として使用することができる。
近年、 さらに別の選択遺伝子が報告されている。 例えば、 細胞がトリプトファ ンの代わりにィンドールを使用することを可能にする trpB、細胞がヒスチジンの 代わりにヒスチノールを使用することを可能にする hisD (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 8047, 1988)、 並びに、 オル二チンデカルポキ シラーゼインヒビターである 2— (ジフルォロメチル) 一 D L—オル二チンに対 する耐性を付与する 0DC (ornithine decarboxylase; (McConlogue L. , In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed.， 1987)などが挙げられる。
本発明の蛍光指示薬ポリぺプチドをコ一ドする D NA配列は、 適当な宿主細胞 に D N A導入することによりインビトロで発現することができる。 即ち、 本発明 の組み換え蛍光蛋白質は、 大腸菌などの原核細胞、 又は酵母や哺乳動物細胞など の真核細胞において核酸を発現することによって作製することができる。
構築物は、 蛍光指示薬の単離を簡単にするためのタグを含んでいてもよい。 例 えば、 6個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジンタグを蛍光蛋白質のァミノ 末端に付加することができる。 ポリヒスチジンタグにより、 ニッケルキレートク 口マトグラフィ一により一回の操作で蛋白質を簡単に単離することが可能になる。 好ましくは、 本発明の蛍光指示薬は、 組み換え DNA技術で作製した融合蛋白質 である。 ここで、 シングルポリぺプチドは、 ドナー成分、ぺプチドリンカー成分 及びァクセプター成分を含む。 ドナー成分は、 ポリペプチド中のァクセプター成 分に対してァミノ末端側に位置することができる。 そのような融合蛋白質は通常 以下のような構造を有する： （ァミノ末端） ドナー蛍光分子成分一ペプチドリン カー成分ーァクセプター蛍光分子成分 （カルポキシ末端)。あるいは、 ドナー成分 は、融合蛋白質中のァクセプター成分に対してカルボキシ末端に位置してもよい。 そのような融合蛋白質は通常以下の構造を有する：（ァミノ末端）ァクセプター蛍 光分子成分ーぺプチドリンカー成分一ドナー蛍光分子成分 （カルボキシ末端)。さ らに、 ァミノ末端及び/又はカルボキシ末端に付カ卩的なアミノ酸配列 （例えば、 ポリヒスチジンタグなど） を含む融合蛋白質も本発明に包含される。
組み換え核酸によってコードされる蛍光指示薬は、 ドナー蛍光分子成分、 ァク セプター蛍光分子成分及ぴぺプチドリンカー成分の発現をコードする配列を含む。 各構成要素は、 融合蛋白質への発現により、 ドナー成分が励起する際にドナー及 ぴァクセプター成分が FRETを示すように選択される。組み換え核酸は、組み換え 核酸に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクター内に組み込むことがで きる。 発現ベクターは、 適当なプロモーター、 複製配列、 マーカーなどを含むこ とによって原核細胞または真核細胞で機能するように構成することができる。 発現ベクターは、 組み換え核酸の発現のために宿主細胞にトランスフエクショ ンすることができる。 宿主細胞は、 蛍光指示薬融合蛋白質を精製するために高レ ベルの発現のために選択することができる。 大腸菌 （E. coli) はこの目的に有用 である。 あるいは、 宿主細胞は、 その他の原核細胞でも真核細胞でもよい。 リン カーペプチドは、 プロテアーゼによつて認識されるァミノ酸配列を含むように選 択することができる。 細胞は培養細胞でもインビボの細胞でもよい。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明は実施例によって限 定されるものではない。 実施例
( 1 ) W- cameleonの遺伝子構築
pRSETB/Venus (Nagai, T. 他（2002) Nature Biotecnology 20, 87- 90)を錶型に、 5 -attggatcccatggtgagcaagggcgagg-3 ( 酉己 歹 IJ ¾· 4 0 ) 、 5' -catgcatgcgggcggcggtcacgaactc-3' (酉己歹 (J番号 4 1 プフイマ一 Iこ用レヽて PCRを行ない、 PCR産物を制限酵素 fe !Iと Sphlで切断した。 pRSETB/YC2. 12 (Nagai, T. 他（2002) Nature Biotecnology 20， 87- 90)を 1Ιと Sphlで切断することに より ECFP遺伝子を取り除き、そこに上記の制限酵素処理済 PCR産物をライゲーシ ヨンさせ、 W-cameleon タンパク質を大腸菌内で発現させることが出来る pRSETB/W- cameleonを得た。 W- cameleonの構造を図 1 (下段） に示す。
( 2 ) W- SCATの遺伝子構築
pRSETB/Venus (Nagai, T. 他（2002) Nature Biotecnology 20， 87 - 90)を铸型に、 5， -gctggtaccatggtgagcaagggcgagg-3' ( 酉己 列 番 号 4 2 ) 、 5， -gcagaattctcacttgtacagctcgtccatgcc-3 (酉己歹 !j番^ " 4 3 ) ¾rプフイマ一に用 いて PCRを行い、 PCR産物を制限酵素 ∞1、 り RIで切断後、 pRSETBの同制限酵 素サイ トにライゲーシヨ ンすることにより、 pRSETB/Venus - KE を得た。 pRSETB/Venus (Nagai, T. 他（2002) Nature Biotecnology 20, 87- 90)を铸型に、 5， -attggatcccatggtgagcaagggcgagg-3' ( 酉己 歹 U 番 号 4 4 ) 、 a -gctggtaccatcgacctcatcagtgatcccggcggcggtcacgaa-3 (目 G列番号 4 5 )をプ ライマーに用いて PCRを行ない、 PCR産物を制限酵素 と Kpnlで切断した。 この制限酵素処理済 PCR産物を pRSETB/Venus- KEの Ba K Kpnlサイトにライゲ —シヨンすることにより W- SCAT タンパク質を大腸菌内で発現させることが出来 る pRSETB/W- SCATを得た。 W- SCATの構造を図 1 (上段） に示す。
( 3 ) タンパク質の発現、 精製
pRSETB/W-cameleonまたは pRSETB/W- SCAT を用いて大腸菌を形質転換し、 50 μ g/mlのアンピシリンを含む LBプレート上で 37°C、 15時間培養した。 シングルコ ロニーをピックアップし、 50 /z g/mlのアンピシリンを含む 20mlの LB培地が入つ た試験管に穑菌し、 200rpm、 室温で 4日間培養した。 培養後遠心分離により大腸 菌を回収し 10mlの PBS (-)に溶解した。 フレンチプレスを用いて菌体を破砕後、 遠心分離により不溶性画分を取り除いた。 上清に 800 // 1 の Ni- NTA agarose (QIAGEN)を加え、 室温にて 1時間転倒混和後、 添付プロトコールに従って、 タン パク質を精製した。
( 4 ) 蛍光異方性の測定
上記で得られた W- cameleon溶液を 1ml の測定溶液 （50mM HEPES (pH7. 5) , 100 μ Μ EGTAまたは 50mM HEPES (pH7. 5) , 100 Μ EGTA, ImM CaCl2) に溶解した。 希 釈率は 1万分の 1とした。上記で得られた W - SCAT溶液を 10培希釈したもの 2 μ 1 と active caspase3 (CPP32, MBL) lUnit を反応用緩衝液（20mM HEPES (pH7. 5)， lOOmM NaCl, ImM EDTA, lOmM DTT, 10% sucrose)に加え 20 μ 1とし、 37。Cで 2時 間反応させた。 Active caspase3を加えないものを対照に用いた。反応後 lmlPBS (-) を加えた。上記それぞれのタンパク質の蛍光異方性を Beacon (TAKARA)を用いて測 定した。 測定の結果を以下の表 2に示す。 以下の結果から、 本発明の蛍光指示薬 である W- cameleonおよび W- SCATを用いることによって、 試料中の分析物質を検 出 ·測定できることが分かる。 表 2 ：蛍光異方性の測定結果
入射光の偏光方向 入射光の偏光方向と
と平行な蛍光成分 と垂直な蛍光成分 蛍光異方性 （mA)
W-SCAT3
casp3なし 2555. 7 1362. 7 225. 8
casp3あり 2712. 5 1265. 2 276. 0
W - came
Caなし 688. 47 321. 5 275. 6
Caあり 631. 42 312. 0 254. 4
注：表中の数字は PMT (光電子倍増感管） で測定したときの蛍光強度 （相対的 な値） を示す。 産業上の利用可能性
本発明によれば、リガンドに誘導された立体構造変化を FRETによりモニターす ることができる。 本発明の蛍光指示薬は、細胞又は生体への遺伝子導入により in situで作製することができるため、大量の可溶性組み換え蛋白質を発現及び精製 し、 それをインビトロで精製及び標識し、 細胞にマイクロインジェクションで戻 す必要がない。 また、 本発明の蛍光指示薬は、 細胞構造を標的とすることができ る。
さらに、従来の FRETを利用した各種蛍光指示薬は異なる色（スベタ トル） を有 する蛍光物質を利用している方法では、 1つの FRET観測で広範囲の波長域を使用 するため、 他色の蛍光色素との同時観察が制限される。 それに対し本発明では原 理上 1色しか用いないため、 FRET観測に用いる波長域を狭小化でき、従って多色 のイメージングに適する。 例えば、 CFP、 YFP、 RFPそれぞれを基に蛍光異方性解 消による FRETイメージングを行なえば、 1つの細胞の中で 3つの事象を同時にモ 二ターすることが可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . 分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列の N末端側と C末端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分子成分を結合させ た蛍光指示薬。
2 . 分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列； 標的配列に共有的に結合したドナー蛍光分子成分；及ぴ、
標的配列に共有的に結合したァクセプタ一蛍光分子成分；
を含む蛍光指示薬であって；
ドナー蛍光分子とァクセプター蛍光分子が実質的に同一の蛍光特性を有する分 子であり、 分析物質の結合により標的配列中に立体構造の変化が生じ、 次いでド ナー分子及ぴァクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、 ある偏 光特性を有した照射光によって励起した場合に観察される蛍光の偏光特性が照射 光のものと異なる傾向が強くなる （偏光解消）、 請求項 1に記載の蛍光指示薬。
3 . 蛍光分子成分が蛍光蛋白質である、請求項 1又は 2に記載の蛍光指示薬。
4 . 蛍光分子成分が黄色蛍光蛋白質またはその変異体である、 請求項 1から
3の何れかに記載の蛍光指示薬。
5 . 蛍光分子成分が蛍光蛋白質 Venusである、 請求項 1から 4の何れかに記 載の蛍光指示薬。
6 . 蛍光指示薬がさらに標的べプチド成分とリンカー成分を含み、 分析物質 の標的配列が標的べプチド成分を結合するためのぺプチド結合ドメインをさらに 含み、
リンカー成分が分析物質の標的配列と標的べプチド成分とを共有的に結合し、 標的配列と標的べプチド成分がァクセプター蛍光分子成分又はドナー蛍光分子成 分の何れかに共有的に結合し、
標的配列に結合した分析物質が標的ぺプチド成分及びべプチド結合ドメィンの 相対的位置又は方向の変化を誘導し、 次いでドナー分子及ぴァクセプター分子成 分の相対的位置又は方向に変化が生じ、 これによりある偏光特性を有した照射光 によって励起した場合に観察される蛍光の偏光特性が照射光のものと異なる傾向 が強くなる （偏光解消）、 請求項 1カゝら 5の何れかに記載の蛍光指示薬。
7 . 標的配列が、 カルモジュリン、 cGMP依存性蛋白質キナーゼ、 ステロイド ホルモン受容体、 ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、 蛋白質キ ナーゼ C、イノシトール- 1， 4, 5-トリホスフエ一ト受容体、又はレコベリンである、 請求項 1から 6の何れかに記載の蛍光指示薬。
8 . 分析物質の標的配列がカルモジュリンである、 請求項 7に記載の蛍光指 示薬。
9 . 標的ぺプチド成分が、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ（skMLCKp)、平滑筋ミ オシン軽鎖キナーゼ（smMLCK)、 カルモジュリンキナーゼ II (CaMKII)、 カルデス モン、 カルスペルミン、 ホスホフ レクトキナーゼ、 力/レシネゥリン、 ホスホリラ ーゼキナーゼ、 Ca2+ATPァーゼ、 59 Kdaホスホジエステラーゼ（PDE)、 60 Kdaホ スホジエステラーゼ（PDE)、 二トリックォキシドシンターゼ、 I型アデ二リルシク ラーゼ、 Bordetella per ussisアデ二リノレシクラーゼ、 ニューロモジュリン、 ス ぺク ト リン、 ミ リス トイル化ァラニンリ ツチ C キナーゼ基質（MARCKS)、 MacMARCKS (F52)、 b - Adducin、 ヒートショック蛋白質 HSP90a、 ヒ ト免疫不全ウイ ゾレスエンベロープグリコプロテイン 160 (HIV- 1 gpl60)、 ブラッシュボーダーミ オシン重鎖- I (BBMHBI)、 希ミオシン重鎖 (MHC)、 マス トパラン、 メリチン、 グルカ ゴン、セクレチン、血管作動性腸ぺプチド （VIP)、ガストリン阻害ぺプチド （GIP)、 又はカルモジュリン結合べプチド- 2 (Model ぺプチド CBP2)のカルモジュリン結 合ドメインである、 請求項 6に記載の蛍光指示薬。
1 0 . リンカー成分がぺプチド成分である、 請求項 6に記載の蛍光指示薬。
1 1 . リンカ一成分が 1から 3 0アミノ酸残基である、 請求項 1 0に記載の 蛍光指示薬。
1 2 . 分析物質が作用して指示薬の立体構造を変化させる分析物質の標的配 列が、 酵素により切断されるアミノ酸配列である、 請求項 1から 5の何れかに記 載の蛍光指示薬。
1 3 . シングルポリぺプチドである、 請求項 1力 ら 1 2の何れかに記載の蛍 光指示薬。
1 4 . さらに局在化配列を含む、 請求項 1力 ら 1 3の何れかに記載の蛍光指 示薬。
1 5 . 局在化配列が核局在化配列、 小胞体局在化配列、 ペルォキシソーム局 在化配列、 ミ トコンドリア局在化配列、 ゴルジ体局在化配列、 又は細胞膜局在化 配列である、 請求項 1から 1 4の何れかに記載の蛍光指示薬。
1 6 . 試料中の分析物質を検出又は測定する方法であって、
( 1 )試料と請求項 1力 ら 1 5の何れかに記載の蛍光指示薬とを接触させる工程；
( 2 ) ドナー成分を励起させる工程；及び
( 3 ) 試料中の分析物質の濃度や活性に対応した試料中の蛍光共鳴エネルギー転 移の程度を測定する工程；
を含む方法。
1 7 . 試料中の蛍光共鳴エネルギー転移の程度を、 偏光解消を測定すること により測定する、 請求項 1 6に記載の方法。
1 8 . 蛍光異方性を求めることにより偏光解消を測定する、 請求項 1 7に記 載の方法。
1 9 . 試料が生細胞であり、 接触工程が蛍光指示薬を細胞中に取り込ませる ことを含む、 請求項 1 6から 1 8の何れかに記載の方法。
2 0 . 細胞へ蛍光指示薬を取り込ませる工程が、 蛍光指示薬の発現をコード する核酸配列に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクターを細胞にトラ ンスフヱクシヨンすることを含む、 請求項 1 9に記載の方法。
2 1 . 請求項 1から 1 5の何れかに記載の蛍光指示薬をコードする核酸。
2 2. 請求項 2 1に記載の核酸を含む発現べクタ一。
2 3 . 請求項 2 1に記載の核酸又は請求項 2 2に記載の発現ベクターを有す る形質転換体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006083382A2 (en) * 2004-12-02 2006-08-10 Vanderbilt University Measuring forster resonance energy transfer with polarized and depolarized light
WO2007018315A1 (ja) * 2005-08-09 2007-02-15 Japan Science And Technology Agency タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブ

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4803976B2 (ja) * 2003-07-09 2011-10-26 独立行政法人科学技術振興機構 細胞内ｉｐ３測定用分子センサー
EP1767635B1 (en) * 2004-05-20 2013-07-31 Riken Fluorescent protein
FR2872287B1 (fr) * 2004-06-28 2007-03-16 Cis Bio Internat Sa Procede d'amelioration de la detection des signaux de fluorescence lors d'un transfert d'energie non radiatif
JP4557685B2 (ja) * 2004-11-15 2010-10-06 独立行政法人理化学研究所 蛍光蛋白質
EP1866443A4 (en) * 2005-04-04 2009-04-08 Blueshift Biotechnologies Inc SCREENING USING POLARIZATION ANISOTROPY IN FREIGHT EMISSIONS
JP2007049943A (ja) * 2005-08-18 2007-03-01 Kyoto Univ 細胞内カルシウムイオン指示機能を有するポリペプチド
ATE555387T1 (de) * 2005-10-12 2012-05-15 Allergan Inc Tests der molekularen oder subzellulären nähe unter verwendung von depolarisierung nach resonanzenergietransfer (daret)
US8180421B2 (en) * 2007-12-12 2012-05-15 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Resonance energy transfer based detection of nosocomial infection
CN103228669B (zh) 2010-09-27 2016-02-24 国立大学法人京都大学 基于荧光共振能量转移的原理的单分子型fret生物传感器接头
JP6393260B2 (ja) * 2012-07-06 2018-09-19 イノベーティブ テクノロジーズ イン バイオロジカル システムズ エセ．エレ． 蛍光融合ポリペプチド、該ポリペプチドを含むバイオセンサー及びそれらの使用
US10899804B2 (en) 2016-03-10 2021-01-26 Osaka University Fluorescent protein
EP3276005B1 (en) * 2016-07-29 2019-01-09 Miltenyi Biotec GmbH Composition and method for affecting the binding of antigen-binding polypeptides to antigens
US11099177B2 (en) 2016-09-09 2021-08-24 Regents Of The University Of Minnesota Protein kinase allostery sensor and methods of making and using same
US20210181181A1 (en) * 2017-12-15 2021-06-17 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Synthetic Fluorescent Protein Biosensors and Use Thereof in Drug Screening Methods

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000073437A1 (en) * 1999-05-27 2000-12-07 Merck Frosst Canada & Co. Assays for caspase activity using green fluorescent proteins
JP2002153279A (ja) * 2000-11-22 2002-05-28 Okazaki National Research Institutes 緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質の作成方法、および前記方法により作成されるバイオセンサー蛋白質

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5998204A (en) * 1997-03-14 1999-12-07 The Regents Of The University Of California Fluorescent protein sensors for detection of analytes
JP2002253261A (ja) * 2001-03-05 2002-09-10 Inst Of Physical & Chemical Res 蛍光タンパク質

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000073437A1 (en) * 1999-05-27 2000-12-07 Merck Frosst Canada & Co. Assays for caspase activity using green fluorescent proteins
JP2002153279A (ja) * 2000-11-22 2002-05-28 Okazaki National Research Institutes 緑色蛍光蛋白質の蛍光特性を制御することが可能なバイオセンサー蛋白質の作成方法、および前記方法により作成されるバイオセンサー蛋白質

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAUTIER I. ET AL.: "Homo-FRET microscopy in living cells to measure monomer-dimer transition of GFP-tagged proteins", BIOPHYSICAL JOURNAL, vol. 80, June 2001 (2001-06-01), pages 3000 - 3008, XP002977865 *
MIYAWAKI A. ET AL.: "Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin", NATURE, vol. 388, 28 August 1997 (1997-08-28), pages 882 - 887, XP002926405 *
See also references of EP1571448A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006083382A2 (en) * 2004-12-02 2006-08-10 Vanderbilt University Measuring forster resonance energy transfer with polarized and depolarized light
WO2006083382A3 (en) * 2004-12-02 2006-12-07 Univ Vanderbilt Measuring forster resonance energy transfer with polarized and depolarized light
US8031338B2 (en) 2004-12-02 2011-10-04 Vanderbilt University Measuring Forster resonance energy transfer with polarized and depolarized light
WO2007018315A1 (ja) * 2005-08-09 2007-02-15 Japan Science And Technology Agency タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブ

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