WO2004053127A1

WO2004053127A1 - 対応付け分子およびその構成要素のライブラリーの製造方法および利用方法

Info

Publication number: WO2004053127A1
Application number: PCT/JP2003/014750
Authority: WO
Inventors: Etsuko Miyamoto; Masamichi Ishizaka; Hiroshi Yanagawa
Original assignee: Keio University
Priority date: 2002-12-11
Filing date: 2003-11-19
Publication date: 2004-06-24
Also published as: AU2003284420A1; JPWO2004053127A1; JP4441623B2

Abstract

　RNA又はmRNAライブラリーから、ランダムプライマーで逆転写により一本鎖DNAを形成し、さらに該一本鎖DNAを鋳型として、該一本鎖DNAの相補鎖DNAの5'末端のみがリン酸化されている二本鎖DNAライブラリーを形成し、該二本鎖DNAライブラリーと、末端がリン酸化されていない核酸からなるアダプターとをライゲーションしてライゲーテッド二本鎖DNAライブラリーを形成し、該ライゲーテッド二本鎖DNAライブラリーをテンプレートとして、対応付け分子の形成に必要な配列を持つプライマーを用いたPCRにより、対応付け分子cDNAライブラリーを作成することにより、対応付け分子cDNAライブラリーを製造する。

Description

明細書

対応付け分子およびその構成要素のライブラリーの製造方法および利用方法技術分野

本発明は、対応付け分子およびその構成要素のライブラリーの製造方法および利用方法に関する。背景技術

現在、多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。ゲノムシーケンスの研究では、第 2幕のポストシーケンスの研究として、解読したゲノム情報からその意味を解析する研究、すなわち、遺伝子や蛋白質の構造や機能解析 (非特許文献 1、非特許文献 2 )、および蛋白質間、核酸-蛋白質間相互作用解析などが期待されている（非特許文献 3、非特許文献 4 )。

蛋白質間の相互作用を解析する方法としては、免疫沈降（非特許文献 5 )、 GST 融合蛋白質によるプルダウン ·アツセィ（非特許文献 6 )、 TAP法（非特許文献 7 )、酵母ヅ一ハイブリッド法（非特許文献 8 )などが知られている。一方、もともとは進化分子工学のツールとして誕生した「遺伝子 (遺伝子型）と蛋白質 (表現型）の対応付け」を特徴とする以下に示す方法も、ポストゲノム機能解析における蛋白質間などの相互作用を解析する方法どして期待されている（非特許文献 9 )。代表的な方法は、 in vitroウィルス法（非特許文献 1 0、非特許文献 1 1、特許文献 1 )、 STABLE法（非特許文献 1 2 )、ファージディスプレー法（非特許文献 1 3 )、リボソーム .ディスプレイ法（非特許文献 1 4、特許文献 2 ) 、 m A-ペプチドヒュ一ジョン（mRNAデイスプレイ；)法（非特許文献 1 5 )などである。

このようなボストゲノム機能解析によって、蛋白質間および蛋白質-核酸間などの相互作用ネットワーク解析から重要な生体酵素の発見などによる医薬品の創製などが期待され、医療、食料、エネルギー、環境など多くの分野の産業で優れたネットワーク解析技術が所望されている。蛋白質間および蛋白質-核酸間などの相互作用ネヅトワーク解析のためには、ペイト蛋白質との相互作用解析に用いる RNAライブラリー又は cDNAライブラリー作成方法は欠かせない要素技術となる。ポストゲノム構造および機能解析研究のツールとして様々なものが開発されてきている。どのような解析方法であっても、蛋白質間および蛋白質-核酸間の解析に共通して欠かせないものは、 RNAライブラリー又は cDNAライブラリ一である。ライブラリーの質が高ければ、解析結果も質が高いものとなるため、要素技術としてライブラリー作成技術は重要である。ボストゲノム機能解析の蛋白質間および蛋白質-核酸間の解析方法である in vitroウィルス（IVV) 法（非特許文献 1 0、非特許文献 1 1、特許文献 1、特許文献 3 )において、 RNA又は cDNAライブラリ一作りとしてこれまで知られていた技術は、組織から抽出した Aライブラリ一から、あるいは既存の cDNAライブラリーから、発現ベクターにクローニングを介してライブラリーを構築する方法、あるいは、クローニングを介さずに直接ライブラリーを構築する方法（非特許文献 1 6 )があった。

<非特許文献 1 >

Saegusa A. Japan boosts proteomics and cell biology... Nature 401, 6751 (1999) <非特許文献 2 >

Dalton R, Abbott A. Can researchers find recipe for proteins and chips? Nature 402， 6763 (1999)

<非特許文献 3 > .

宮本悦子、柳川弘志（2000 ) シリーズ 'ポストシークェンスのゲノム科学 3 : プロテオミクス， pp. 136- 145

<非特許文献 4 >

宫本悦子、柳川弘志 (2001 ) 蛋白質 ·核酸，酵素、 46(2) , pp. 138-147

<非特許文献 5 >

Xiong et al. 1993 Nature 366, 701-704

<非特許文献 6 >

Kaelin, et al. 1991 Cell 64, 521-532

<非特許文献 7 >

Guillaume Rigaut, et al., Nature Biotechnology 17， 1030 (1999)

<非特許文献 8 >

Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245 (1989)

<非特許文献 9 >

Mendelsohn A.R, Brent R. Protein interaction methods— toward an endgame. Science 284, 1948 (1999)

<非特許文献 1 0 >

Miyamoto-Sato E， et al. The constraction of the virus type assignment molecule in evolutionary molecular engineering. Viva Origino 25， 35 (1997)

<非特許文献 1 1 >

Nemoto N， et al. In vitro virus: Bonding of mRNA bearing puromycin at the 3 '-terminal end to the C- terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. FEBS Lett. 414, 405 (1997)

<特許文献 1 >

国際公開パンフレヅト第 WO 9 8 / 1 6 6 3 6号

<非特許文献 1 2 >

Doi N, Yanagawa H. STABLE: orotein-DNA fusion system ror screening of combinatorial protein libraries in vitro. FEBS Lett. 457, 227 (1999)

<非特許文献 1 3 >

Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science 228, 1315 (1985)

<非特許文献 1 4 >

Mattheakis, L.C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91， 9022-9026

<特許文献 2 >

国際公開パンフレヅト第 W0 9 5 / 1 1 9 2 2号

<非特許文献 1 5 >

Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297

<特許文献 3 >

国際公開パンフレヅト第 WO 0 2 / 4 6 3 9 5号

<非特許文献 1 6 >

Hammond, P.W., Alpin, J., Rise, C.E., Wright, M.C., and Kreider, B.L. 2001. In vitro selection and characterization of Bcl-XL binding proteins from a mix of tissue-specific mRNA display libraries. J. Biol. Chem. 276: 20898-20906 発明の開示

ボストゲノム機能解析研究のヅールとして様々なものが開発されてきている。どのような解析方法であっても、蛋白質の解析に共通して欠かせないものは、質の高い Aライブラリ一や cDNAライブラリ一の構築である。 IWのためのライブラリ一作成方法の従来法としては、ランダムプライミング法によりストヅプコドンを持たない 0KF領域を多く含むように工夫した DNA断片を、 IVV形成のための 5' UTR、 3' tail配列を持った発現ベクターにクローニングしてライブラリーを構築する方法があつたが、この方法では、クローニングを介するためライブラリ一の規模が制限され、ライブラリーの質はよいものとは言えなかった。また、ライブラリ一の構築に時間がかかった。さらに、上述の、クロ一ニングを介さずに直接ライプラリーを構築する方法として、ランダムプライミング法によりストヅプコドンを持たない 0RF領域を多く含むように工夫した DNA断片を、 IVV形成のための配列を持ったテンプレートを作成し、特定配列で PCI こよってライブラリーを構築する方法があった。この方法では、 3' ランダムプライマ一で逆転写し、さらに、 5，ランダムプライマ一で二本鎖 DNAの相補鎖を形成しているので、 3³および 5，末端の両端ともランダムプライマ一を使用することからライブラリ一の平均長が短くなる問題点があった。

よって、本発明では、対応付け分子（IVV) のライブラリ一に適した 3' UTRを含まないテンプレートを含み、両端にランダムプライマ一を使用したときのようなラィブラリ一の平均長が短くならないライブラリ一を実現することを課題とする。本発明者らは、ランダムプライマーとアダプターを組み合わせて使用することにより、 mRNAライブラリーからでも、 IVVに適した、 3， UTRを含まないテンプレート効率の高いライブラリ一が作成でき、両端にランダムプライマーを使用したときの平均長が短くなる問題が解決できることを見出し、本発明を完成した。

本発明は、以下のものを提供する。

1 . UNA又は mRNAライブラリーから、ランダムプライマーで逆転写により一本鎖 DMを形成し、さらに該一本鎖 DNAを鎵型として、該一本鎖 DNAの相補鎖 DNAの 5'末端のみがリン酸化されている二本鎖 DNAライブラリ一を形成し、

該ニ本鎖 DNAライブラリーと、末端がリン酸化されていない核酸からなるァダプ夕一とをライゲーシヨンしてライゲ一テヅドニ本鎖 MAライブラリーを形成し、該ライゲーテヅドニ本鎖 DNAライブラリ一をテンプレ一トとして、対応付け分子の形成に必要な配列を持つプライマ一を用いた PCIUこより、対応付け分子 cDNA ライブラリーを作成する

ことを含む対応付け分子 cDNAライブラリ一の製造方法。

2 . アダプターが二本鎖であり、ライゲ一シヨンされる本鎖とライゲ一ションされない副鎖からなる 1の製造方法。

3 . 副鎖が本鎖よりも鎖長が短い 2記載の製造方法。

4 . 一本鎖 DNAの相補鎖 DNAの 5，末端のみがリン酸化されている二本鎖 DNAライブラリーを、一本鎖 DNAを錶型として、 RNase H、 MAポリメラーゼ Iおよび DNA リガーゼ存在下で形成する 1〜 3のいずれか 1項に記載の製造方法。

5 . 対応付け分子 cDNAライブラリ一を構成する cDNAが、 5³末端にプロモー夕一とェンハンサ一を有する配列を含み、 3'末端にライゲ一シヨンのァクセプ夕一配列を含む 1〜 4のいずれか 1項に記載の製造方法。

6 . プロモ一夕一配列が SP6プロモーターで、ェンハンサー配列がオメガ配列又はオメガ配列の一部であり、ァクセプ夕一配列が 2〜 1 0塩基のポリ A配列である 5記載の製造方法。

7 . 1〜 6のいずれか 1項に記載の製造方法により得られる対応付け分子 cD NAライブラリーを転写することを含む、対応付け分子 RNAライブラリーの製造方法。

8 . 7に記載の製造方法により得られる対応付け分子 RNAライブラリーを構成する対応付け分子 RNAの 3'末端にスぺ一サーをライゲーシヨンすることを含む、対応付け分子ライゲーテッド RNAラィブラリ一の製造方法。

9 . スぺ一サ一が、対応付け RNA分子にライゲーシヨンする末端の反対の末端にピューロマイシン又はピュ一ロマイシン誘導体を有し、かつ、塩基配列で 10 - lOObp相当の長さを持ち、該スぺ一サ一は、該ピューロマイシン又はピューロマィシン誘導体を介して、該対応付け分子ライゲ一テッド RNAラィブラリ一のテンプレートから翻訳された蛋白質と連結するものである 8記載の製造方法。

1 0 . 該スぺ一サ一が、該対応付け分子ライゲーテツド RNAライブラリ一から翻訳された蛋白質と連結しないものである 8記載の製造方法。

1 1 . 7に記載の製造方法により得られる対応付け分子 RNAライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。

1 2 . 8又は 9に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲ一テツド M Aライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。

1 3 . 8又は 1 0に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲ一テツド Aライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。

1 4 . 7に記載の製造方法で得られる対応付け分子 RNAライブラリ一を細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。

1 5 . 8又は 9に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲ一テツド RN Aライブラリーを細胞内で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムブラィミングラィブラリ一の製造方法。

1 6 . 8又は 1 0に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテツド MAライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリ一の製造方法。

1 7 . 該蛋白質を C末端ラベル化法で修飾することを含む、 1 1、 1 3、 1 4又は 1 6に記載の製造方法。

1 8 . 核酸のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質と核酸の相互作用解析方法であって、ライブラリーが、 1、 5、 7〜1 0のぃずれか1項に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。

1 9 . 蛋白質のライブラリ一と蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリーが、 1 7に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。

2 0 . 対応付け分子のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリ一が、 1 2又は 1 5に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。

2 1 . 相互作用が共翻訳スクリーニング法により解析される、 2 0記載の方法。

2 2 . ライブラリ一のスクリ一ニングを含む進化分子工学による機能蛋白質の創製方法であって、ライブラリ一が、 1 2又は 1 5に記載の製造方法により得られるライブラリーである前記方法。

2 3 . 2 0に記載の蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、 1 9又は 2 0に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。

2 4 . 2 1に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、 1 9又は 2 0に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。

2 5 . 2 2に記載の該機能蛋白質の創製方法を行い、ついで、 1 9又は 2 0 に記載に記載の該蛋白質間相互作用解析を行うことを含む蛋白質の創製方法。本発明においては、ライプラリーの規模を保ち、質の高いライブラリーを実現し、かつ簡単で短時間で作成可能なライブラリーを実現する手段として、 RNA又は mRNAライプラリーから、クローニングベクターを介することなく、対応付け分子（IVV)形成に必要な配列（以下、「特定配列」ともいう）を 5' および 3³末端に含むことを特徴とする IVV cDNAライブラリーを作成する。すなわち、 RNA又は m Aライブラリーから、 5，末端に特定配列を持つアダプター領域を含むランダムプラィマーで逆転写により一本鎖 DNAを形成し、さらに該一本鎖 DNAを錶型として、該一本鎖 DNAの相補鎖 DNAの 5'末端のみがリン酸化されている二本鎖 DNAを形成したものであることを特徴とする二本鎖（ds)DNAライブラリ一を作成し、さらに、該 dsDNAラィブラリ一に特定配列を含むアダプターをライゲーシヨンすることによりライゲーテツド dsDNAライブラリーを作成する。該ライゲ一テツド dsDNAライブラリーをテンプレートとして対応付け分子（ I VV )形成に必要な 5'および 3，末端配列を持つプライマーで PCRを行うことにより IVV cDNAライブラリ一を作成する。ついで、該 IVV cDNAライブラリ一を転写した IVV RNAライブラリ一、該 IVV RNAラィブラリーを翻訳した IVVランダムプライミングライブラリーを作成することができる。

従来は、一本鎖 DNAを錶型として相補鎖 DNAを合成して二本鎖 DNAを形成する際に 5'末端にランダムプライマーを用いていたが、その方法では、作成された二本鎖 DNAの 3，末端および 5'末端の両端ともにランダムプライマーを用いているためにライブラリーの平均長が短いものとなってしまう問題点がある。本発明では、 RNA又は mRNAライプラリ一から、ランダムプライマーで逆転写により形成された一本鎖 DNAを錶型として形成された片側の相補鎖 DNAの 5'末端のみがリン酸化されていることを特徴とする dsDNAライプラリーとリン酸化されていないアダプタ一をライゲーシヨンする手段を利用する。このとき、アダプターが二本鎖であり、ライゲーシヨンされる本鎖とライゲ一シヨンされない副鎖からなること、さらに副鎖は本鎖よりも鎖長が短いことを特徴とするアダプターを用いたライゲ一テツド dsDNAライブラリーを作成することができる。また、このとき、該一本鎖 DNAを铸型として、 RNase H、 MAポリメラ一ゼ Iおよび DNAリガーゼ存在下で形成されたものである dsDNAライブラリ一を用いて、ライゲ一デヅド dsDNAライブラリーを作成し、ライゲーテツド dsDNAライプラリーをテンプレートとして特定配列を持つプライマ一を用いた PCRにより IVV cDNAライブラリ一を作成することもできる。 I VV cDNAライブラリ一は、 5' 末端にプロモ一夕一とェンハンサ一を有した特定の配列を含み、 3'末端にライゲーシヨンのァクセプ夕一配列を含むものでもよい。従来のアダプタ一のライゲーシヨンでは、アダプタ一をリン酸化するために、セルフライゲーシヨンやライブラリー .テンプレートの両端にライゲ一シヨンされてしまうためにクローニングでは方向性が決められない問題点があり、 PCRでも方向性がまちまちのテンプレートが出来てしまいテンプレートの質が落ちてしまうなどの問題点がある。本発明では、アダプタ一は、用いるリガ一ゼに応じて選択することが好ましく、ライゲーシヨンを DNAリガーゼで行う場合は、ァダプ夕一は一部二本鎖とし、アダプターをリン酸化しないことでアダプターのセルフライゲーシヨンによるコンカマーが出来ることを防ぎ、 5，末端がリン酸化された二本鎖 DNAと比較してアダプターの長さが十分短いことから、優先的にアダプタ —と二本鎖 DNAのライゲ一シヨンが促進されることを利用している。このとき、アダプタ—の方向が定まってライゲーシヨンされるように、アダプタ一がライゲ

—シヨンされる本鎖とライゲ一シヨンされない副鎖からなること、副鎖は本鎖よりも鎖長が短いことを特徴とするアダプターを用いることができる。また、ライゲーシヨンを RNAリガ一ゼで行う場合は、アダプタ一は一本鎖とし、ここでもァダプ夕一をリン酸化しないことでアダプタ一のセルフライゲーシヨンを防ぎ、かつアダプタ一の長さが 5'末端がリン酸化された一本鎖 DNAと比較して十分短いことから、優先的にアダプタ一と一本鎖 DNAのライゲーシヨンが促進されることを利用できる。ただし、 IVVランダムライブラリー作成時では、テンプレートの 3' 末端が RNAリガーゼの良いァクセプ夕一となるための配列（A配列）を有しており、テンプレート同士のライゲ一シヨンが起こる確率は、 DNAリガーゼを用いた作成方法より断然高くなる点が不利である。 1つの回避手段としては、 A配列をライゲ一シヨン後に PCRで付加するようにすれば問題ないが、それでも、 RNAリガ一ゼは DNAリガ一ゼに比較してライゲ一シヨン効率が落ちるので、総合的に見て、ラィゲ一シヨンを DNAリガーゼで行う手段が好ましい。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のランダムブライミングライブラリ一とその構成要素と製法の説明図である。

図 2は、本発明のライブラリーの評価の結果（電気泳動写真）を示す。

A: マウス脳とマウス精巣（polyA+) RNAライブラリーに含まれる RNAの調査のために、 1 3種類の特定の遺伝子や MAのプライマ一を用いて RT-PCRによりそれらの存在を確認した。レーン 1 ― 13; c-fos, fosB, fral， fra2, c-jun, junB, junD, ? -ァクチン遺伝子， 18S リボゾーム RNA， c-rafl ₅ Hras, S15 リボゾーム蛋白質遺伝子， jmj遺伝子の順。

B : マウス脳とマウス精巣（polyA+) MAライブラリーから作成した IVV cDNAライブラリー（029)と IVV cDNAライブラリ一（0' )においても同様に、 1 3種類の特定の遺伝子や RNAのプライマ一を用いて PCI こよりそれらの存在を確認した。レーン 1 - 13; c-fos, fosB, fral， fra2, c- jun, junB, junD, ァクチン遺伝子， 18S リボゾーム RNA, c- rafl, Hras, S15 リボゾーム蛋白質， jmj遺伝子の順。図 3は、本発明のライブラリーを用いた IVVの共翻訳スクリーニング法による相互作用検出の概略および結果（電気泳動写真）を示す。

A: マウス脳の IVVライブラリーとベイトとして c-fosを用いて、無細胞共翻訳スクリーニングを行い、スクリーニング後のライブラリーを RT- PCRで増幅して再びペイトと共に無細胞共翻訳スクリ一二ングすることを 3回繰り返すことにより内在 c- junを濃縮した。

B: Aにおいて、マウス脳の IVVライブラリ一の内在 c-junの濃縮について、各ラウンドごとのスクリーニング後の RT- PCR産物を 1 %ァガロースゲルで電気泳動し、 c-junのプローブを用いてサザン ·プロヅ卜した。 M; DIGラベルしてある分子量マーカ一（ロシュ ·ダイァグノスティック）

図 4は、本発明のライブラリーから検出されたべィトと相互作用のある蛋白質の例を示す。図 3の Aに示す方法により得られた 3ラウンド目のライブラリーをクローニングしシ一ケンスして検出した内在 c-jun配列の一例。

図 5は、本発明のライブラリーを用いた IVVの物質や蛋白質との相互作用解析の一次スクリーニングと二次スクリーニングの概略を示す。

図 6は、翻訳テンプレート（A) ならびにその構成要素であるコード分子（B ) およびスぺーサ一分子（C ) の構成を示す。翻訳テンプレートは、コード分子由来のコード部とスぺ一サー分子由来のスぺーサ一部からなる。 F1および F2は蛍光色素を示す。

図 7は、 C末端修飾された蛋白質（C末端ラベル化蛋白質）（A) 、本発明の翻訳テンプレート（B ) 、および、修飾剤（C ) の構成を示す。

図 8は、無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。

A: ペイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数（I )であっても複数（Π )であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子 (結合体)であっても構わない。

B: ベイトの共存下、プレイが無細胞翻訳系で翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数（I )であっても複数（I I )であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであつても、対応付け分子 (結合体)であっても構わない。

図 9は、複合べィトを用いた場合の無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。

複合べィトを構成する一部のペイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは、単数（I )であつても複数（Π )であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。また、複合べイトは、図に示した無細胞翻訳系で翻訳されたポリペプチドと DNAベィトの組合せに限られず、無細胞翻訳系で翻訳された複数又は単独のポリべプチドと、無細胞翻訳系で共存する複数又は単独のペイト（たとえば、 DNAペイトなど）の組み合わせが挙げられる。

図 1 0は、無細胞共翻訳による複合体のスクリーニング方法の概略を示す。図 8および 9で示したような無細胞共翻訳による複合体形成の工程（ 1 )、その複合体のプレイをスクリーニングする工程（2)、および、プレイの解析の工程（3 ) により、無細胞共翻訳とスクリーニングをトータルに in vitroで実現することができる。プレイが対応付け分子でかつ複数であれば、 RT-PCR又は PCIUこよってプレイをコードする mRNA又は DNAを再構成することにより再度（ 1 )の工程からスクリ —ニングを繰り返すことができる。また、得られたプレイを解析後、ペイトとして（1)の工程からスクリーニングを新たに繰り返すことができる。発明を実施するための最良の形態

本発明のライブラリ一およびその製法の概略を図 1を参照して説明する。

本発明に使用される RNA又は] nMAライブラリ一は、原核、真核生物、ウィルスなどあらゆる種のいかなる組織から抽出した MA又は mRNAライブラリーでも構わない。また、解読したゲノムや cDNAライブラリ一を転写した MAライブラリ一やそれを再現した人工の RNAライブラリー、あるいは自然には存在しない配列を含む人工の cDNAライブラリーを転写した RNAライブラリーでも構わない。一本鎖（ ss )DNAラィブラリ一は、上記の MA又は mRNAラィブラリ一を特定配列を持つランダムプライマーで逆転写（図 1、 I )したライブラリ一である。この際の逆転写酵素としては特に定めはなく、 Superscript II RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen), Sensiscript Reverse Transcriptase(Qiagen)などで良レヽ。また、ランダムプライマーのアダプタ一部分の特定配列については、最終的に対応付け分子のライブラリ一を作成できるものあれば制限はないが、通常には、図 1にあるように、 3' tail又は Tag 2と 3⁵ tailを含む配列となる。ここで、 3' tail は、 A配列としてポリ Ax 8配列、又は XA配列として Xhol配列や 4塩基以上で（C又は G)藤 (C又は G)の配列と A配列の組み合わせが挙げられる。 Tag 2は、親和性タグ配列として Flag-tag配列、 HA- tag、 IgGのプロティン A( zドメイン）などの抗原抗体反応を利用したもの、 His-tagなど、蛋白質を検出又は精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、 C末端ラベル化蛋白質合成の際は、 XA配列の組み合わせが好ましく、 IVV形成の際は、 A配列が好ましい。また、 3， tailの XA配列又は A配列は、 IVVの PEGスぺ —サ一や翻訳をさらに促進する PEG(Boc)スぺ一サ一とのライゲ一シヨンの際に必要な配列でもある。

対応付け分子の構成は、例えば、 W0 02/46395に記載されており、対応付け分子の形成に必要な配列、すなわち、特定配列は当業者であれば、このような公知の構成に基づき、適宜設定できる。

dsDNAラィブラリ一は、上記の ssDNAラィブラリーを二本鎖 DNAに合成（図 1、 I I ) したものである。この際、 MAポリメラ一ゼ Iによる相補鎖 DNAの合成と RNase Hによる RNA分解を同時に行い、さらに、 DNAリガーゼで、 DNAポリメラーゼ Iにより合成された DNA間のニックをつなく、。合成された二本鎖 DNAライブラリ一は、 DNAポリメラーゼ Iにより合成された相補鎖のみ 5'末端がリン酸化されており、 3³末端に特定の配列を持つことが重要な特徴である。なお、 dsDNAライブラリ一は、この方法により形成されることが好ましいが、一本鎖 DNAの相補鎖 DNAの 5'末端のみがリン酸化されている dsDNAライブラリーが形成される限り、他の酵素を用いたり、他の原理によって形成してもよい。

ラィゲ一テッド dsDNAラィブラリ一は、上記の dsDNAラィブラリ一に、特定配列を持つアダプタ一を DNAリガーゼによりライゲ一シヨン（図 1、 I I I )したものである。この際に、アダプタ一主鎖の 5，末端はリン酸化されていないことでセルフラィゲ一シヨンを回避することが特徴であり、ライゲ一シヨン効率の良い DNAリガーゼでライゲ一シヨンできるようにアダプタ一の 3，末端に主鎖より短い副鎖をハイブリダィゼーシヨンし二本鎖にしておくことが好ましい。ここで、アダプタ一の副鎖の 5'末端もリン酸化されていないことが必要であり、理論的には主鎖より短ければよいが、ハイブリダィゼ一シヨンの有効性を考えると 6bp以上であることが好ましい。ライゲーシヨンを MAリガ一ゼで行う場合は、アダプタ一は一本鎖とし、ここでもアダプタ一をリン酸化しない。ただし、 IVVランダムライブラリ一作成時では、テンプレートの 3，末端が RNAリガーゼの良いァクセプ夕一となるための配列（ A配列）を有しており、テンプレート同士のライゲ一シヨンが起こる確率は、 DNAリガ一ゼを用いた作成方法より断然高くなる点が不利である。また、 UNAリガーゼは DNAリガーゼに比較してライゲ一ション効率が落ちるので、総合的に見て、ライゲ一シヨンを DNAリガ一ゼで行うことが好ましい。また、ァダプ夕一の特定配列については、最終的に対応付け分子のライブラリ一を作成できるものあれば制限はないが、通常には、図 1にあるように、 5' UTR又は 5' UTR と T ag 1を含む配列となる。 5' UTRは、転写プロモーターと翻訳ェンハンサ一からなり、転写プロモー夕一は T7/T3又は SP6などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、転写プロモーターとしては SP6、翻訳のェンハンサー配列としてはオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましい。翻訳ェンハンサ一のオメガ配列の一部（029 )は、 TMVのオメガ配列の一部を含んだものである（Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、および、 WO 02/48347の図 3参照）。 Tag 1については、先程の Tag 2と同様であるが、 Ta 1と Tag 2の両方を配する場合は、異なる Tag配列を配するようにする。ライゲ一シヨンされるアダプターには、これら 5' UTR又は UTR と Tag 1の一部又は全部の配列が含まれる場合がある。

本発明の IVV cDNAライブラリ一は、上記のライゲーテッド dsDNAライブラリ一をテンプレ一トとして、特定の配列を有する 5'および 3，プライマ一で PCR (図 1、 IV)を行い合成する。 5，および 3，プライマ一は、 5，UTR、 Tag 1、 Tag 2、 3， tailの特定の配列でアニーリングし、かつ 5，UTR、 Ta 1、 Tag 2、 3， tailの一部をァダプ夕一配列として含む場合がある。この PCRで 5，UTR、 Tag 1、 Tag 2、 3' tailなどの特定配列を持つ cDNAライブラリーが完成する。

本発明の IVV MAライブラリーは、上記の IVV cDNAライブラリーを転写（図 1、 V)して得られる。この際、この IVV RNAライブラリ一をこのまま翻訳することや C末端ラベル化剤存在化に翻訳することで C末端ラベル化蛋白質ライブラリ一を合成することが可能である。転写の酵素は、特定配列に選択した T3, T7又は SP6 などの酵素となる。

本発明の IVVラィゲーテッド RNAラィブラリ一は、上記の IVV RNAラィブラリ一をスぺ一サ一とライゲーシヨン（図 1、 VI )して得られる。スぺーサ一としては、 IVV形成の場合は IVVの PEGスぺ一サ一、および C末端ラベル化蛋白質合成のための PEG(Boc)スぺーサ一などが考えられる。ライゲーシヨン酵素としては、 RNAリガーゼを用いる方法が代表的だが、その他、 DNAリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。

本発明の IVVランダムプライミングライブラリーは、上記の IVVライゲーテツド UNAライブラリーを無細胞翻訳系又は細胞内で翻訳（図 1、 VI I )して得られる。

IVVの PEGスぺ一サ一および C末端ラベル化蛋白質合成の PEG(Boc )スぺ一サ一は、 CCA領域、 PEG領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならず PEG部を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。 PEG領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、 400〜30, 000で、好ましくは; U 000〜； 10, 000、より好ましくは 2, 000〜6, 000である。また、 CCA領域にはピュ一ロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピュ一ロマイシンについては、ピューロマイシン（Puromycin) 、 3， -N-アミノアシルビユ一ロマイシンァノヌクレオシド (3，-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS—ァミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンの PANS- Gly、ノ、'リンの PANS- Val、ァラニンの PANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応する PANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として 3' -アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった 3' -N-アミノアシルアデノシンアミ'ノヌクレ才シド (3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, MNS—ァミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンの MNS-Gly、パリンの MNS-Val、ァラニンの AANS- Ala、その他、全アミノ酸に対応する MNS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。 CCA領域は、 5 '側に 1残基以上の DNAおよび/又は RNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、 C>(U又は T)>G>Aの順で好ましい。配列としては、 dC-ピュ一口マイシン， rC-ピューロマイシンなど、より好ましくは dCdC-ピュ一ロマイシン rCrC-ピューロマイシン， rCdC-ピューロマイシン， dCrC-ピュ一ロマイシンなどの配列で、アミノアシル- tRMの 3'末端を模倣した CCA配列 (Philipps G.R. (1969) Nature 223, 374-377)が適当である。 C末端ラベル化蛋白質合成のための PEG(Boc) スぺーサ—では、以上のピュー口マイシン誘導体のァミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピュ一口マイシンを欠いた CCA領域も考えられる。 PEG部は修飾物質を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、あるいは固定化などのための夕グとして利用することが出来る。少なくとも 1残基の MAおよび/又は RNAの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビォチン、又は His-tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。

C末端ラベル化剤は、タンパク質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのぺプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基（残基を含む）をもつァクセプ夕一部が、ヌクレオチドリンカ一を介して修飾部と結合した構成をもつ。この修飾剤の存在下でタンパク質合成を行い、得られる C末端修飾タンパク質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、タンパク質相互作用の検出が可能となる。修飾部には、 PEG部と同様に修飾物質が含まれる。修飾物質として、非放射性修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルォレセイン系列、ローダミン系列、 Cy3、 Cy5、ェォシン系列、 NBD 系列等の蛍光色素や、緑色蛍光タンパク質（GFP) 等の蛍光性タンパク質がある。また、非蛍光性物質としては、ビォチンのような補酵素、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。ァクセプ夕一部は、タンパク質の翻訳系で、ペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基をもち、好ましくはピュー口マイシン又はその誘導体の残基をもつ。ピューロマイシンはアミノアシル tRNAと類似した構造をもち、タンパク質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度ではタンパク質の C末端に結合することが知られている（Miyamoto-Sato, E. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182) 。本発明で用いることができるピュ一ロマイシン誘導体は、ピュ一口マイシンと類似した構造を有し、タンパク質の C末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。具体例としては、 3，-N-アミノアシルピユーロマイシンアミノヌクレオシド、 3， - N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。修飾部とァクセプ夕一部との間をつなく、ヌクレオチドリンカ一とは、具体的には、リボヌクレオチド又はデォキシリボヌクレオチドが 1個ないし複数個つながった核酸又は核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（-rC-)又はデォキシリボヌクレオチド（- dC -)が 1個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。その他、修飾部とァクセプ夕一部との間に揷入することによって修飾タンパク質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。本発明修飾剤においては、ヌクレオチドリンカ一が 2' -デォキシシチジル酸、 2' -デォキシシチジル-（3⁵ , 5' )- 2' -デォキシチジル酸、リボシチジル酸、又は、リボシチジル -(3' , 5，）-リボシチジル酸であることが好ましい。修飾剤は、上記修飾部とァクセプ夕一部とを所望のヌクレオチドリンカ一を介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記ァクセプ夕一部を固相担体上に結合させ、核酸合成機を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデォキシヌクレオチドホスホアミダイト、機能性修飾物質として蛍光物質やピオチンなどを結合したホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。上記各部の種類又は結合の種類によっては液相合成法で結合させるかあるいは両者を併用することもできる。また、機能性修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうる二トリロトリ酢酸ゃィミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。

無細胞タンパク質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ゥサギ網状赤血球抽出液、大腸菌 S30抽出液等が挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系の中に、翻訳テンプレートであるライブラリ一を加え、 C末端ラベル化の場合は、同時に 1〜100〃Mの修飾剤を加え、 25〜37°Cで 1〜数時間保温することによって C 末端修飾タンパク質が合成される。対応付けの場合は、翻訳テンプレートであるライブラリーを加えて、 25〜37°Cで 1〜数時間保温するだけで対応付け分子が合成される。合成された両修飾タンパク質は、そのまま次の精製プロセス又は検出プロセス、あるいは直接細胞への導入に供することができる。細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジヨウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等に至るまでいかなる細胞でもよい。これらの細胞の中に、上記 C末端ラベル化又は対応付けされた両修飾タンパク質を直接導入することもできるし、あるいは、翻訳テンプレートであるライブラリ一を導入し、 C末端ラペル化の場合は、同時に 1 〜 100〃Mの修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジクシヨン法等により細胞の中 ' に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾タンパク質が合成される。対応付けの場合は、対応付けテンプレートであるライブラリ一を導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって対応付け分子が合成される。合成された両修飾タンパク質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセス又は検出プロセスに供することができる。また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。

対応付け分子のライブラリ一は、進化分子工学として、ダーウィン進化機構を利用して、「変異 (Mutation)」、「選択（Selection^ 、「増幅 (Amplification^ の 3つの単位操作を繰り返すことで漸進的に進化させ、所望の機能を獲得した物質を創製することで工学的に応用することが可能であり、また、ゲノム機能解析への応用として、 cDNAライブラリーから所望の物質や蛋白質と相互作用を持つ一群の遺伝子配列を網羅的に解析可能である（図 5 )。本発明のライブラリーとして IVVの cMAをもちいて、一次スクリーニングで物質や蛋白質と相互作用を検出し (図 3の共翻訳スクリーニングはその一例）、さらに、相互作用の詳細を FCCSやマイクロアレイなどの二次スクリーニングで解析することが可能である。また、本発明のライブラリーは、 IVV又は C末端ラベル化蛋白質のライブラリーとして、単独で FCCSやマイクロアレイなどにより物質ゃ蛋白質との相互作用解析に利用することも可能である。また、もちろん本発明のライブラリ一を IVVを用いた進化分子工学に応用し、一次スクリーニングにより機能性蛋白質の創出に利用することも可能であり、その際に、一次スクリーニングと二次スクリーニングを組み合わせて、創出した機能性蛋白質の相互作用の詳細を解析することも可能である。この場合に、対応付け分子の共翻訳スクリーニング/セレクションを用いた解析は非常に有効である。なぜなら、共翻訳スクリーニング/セレクション法によつて、ペイト蛋白質と直接又は間接的に相互作用のある蛋白質を網羅的に検出することが可能となったからである。さらに、共翻訳スクリーニング/セレクション法などによる一次スクリーニング後に、二次スクリーニングとして、物質ゃ蛋白質と相互作用の詳細を FCCSやマイクロアレイなどにより解析することが可能である。以上の解析は、 in vitroにおける共翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み合わせて利用することもできる。また、一次スクリーニングで対応付け分子を利用するときは A配列のコード部を利用し、二次スクリーニングでは、対応付け分子を利用するときは A配列のコ一ド部、 C末端ラベル化蛋白質を利用するときは X A配列のコード部をプライミングによって変更して使用することで、それそれの効果を使い分けることが出来る。

上記で得られた IVVライブラリー又は C末端ラベル化タンパク質のライプラリ一と「標的分子」を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接触せしめ、該修飾タンパク質又は該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析することが出来る。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光ィメ一ジングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子ィメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。「標的分子」とは、 IW又は C末端ラベル化タンパク質と相互作用する分子を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。タンパク質としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、およびその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいは c D N Aライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいは c D NAライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳および精製されたタンパク質を用いることができる。

これら標的分子と IVV又は C末端ラペル化タンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルヮ一ルス結合、および静電力による結合のうち少なくとも 1つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、タンパク質レセプ夕一とリガンドの間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合および解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合および解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合および解離が挙げられる。

以下、共翻訳スクリーニング /セレクションを用いた解析方法の例について説明する。解析方法には、相互作用の検出方法および相互作用する蛋白質のスクリ一二ング方法が含まれる。

本発明検出方法は、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、プレイとして本発明のライブラリ一を用いるものである。

好ましくは、ペイトおよびプレイに特定の様式で分離用修飾および検出用標識を行い、そして、無細胞翻訳系においてべィトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりペイトとプレイとを接触させることを主な特徴とするものである。本明細書においては、無細胞翻訳系においてペイ卜の存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりペイトとプレイとを接触させることを「無細胞共翻訳」ともいう。

本明細書において、ベイトおよびプレイの用語は、物質間の相互作用の解析の技術分野で通常に用いられる意味を有する。すなわち、既知の物質である蛋白質や核酸などをべィト（おとり）と呼び、それと相互作用する物質である蛋白質や核酸などをプレイ（獲物）と呼ぶ。本発明では、プレイは蛋白質であることが好ましい。

ここで、ベイトとしては、あらゆる蛋白質（ペプチドを含む）、核酸、抗体、ホルモンなどのリガンド、金属などの任意のものから構成される複合体が挙げられ、天然のものでも人工のもののいずれでも構わない。ペイトとしての分子量の制限などは特にない。たとえば蛋白質であれば、機能ドメイン又は機能ドメインを含む完全長蛋白質などが挙げられる。プレイライプラリーを用いる場合は、完全長蛋白質とすることでより網羅的検出が可能となる。

また、プレイとしては、好ましくは、蛋白質のライブラリーが用いられる。プレイとしての分子量の制限などは特にない。

本発明検出方法は、好ましくは、上述のように、ペイトとプレイとの間の相互作用の検出において、ペイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明検出方法の好ましい構成は、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用檫識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ペイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ペイ卜とプレイとの間の相互作用の通常の検出方法と同様でよい。

ペイトおよびプレイの分離用修飾および検出用標識は、複合体の検出に適合したものが適宜選択されるが、無細胞共翻訳において、ペイトとプレイとが共に検出用標識で標識されたり、分離用修飾を受けたりしないように行われる必要がある。そのため、プレイは、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされるか、又は、対応付け分子とされ、それに応じて、ベイトは分離用修飾を有するものとされる。

プレイが融合蛋白質とされる場合には、ペイトは分離用修飾を有するようにする。ペイトが蛋白質である場合には、ペイトは、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質として、無細胞翻訳系において、ペイトを含む融合蛋白質をコードする mR N Aの翻訳が行われることにより無細胞翻訳系に存在させることが好ましい。

ベイトが蛋白質の場合の分離用修飾の例としては、蛋白質として、 GST蛋白質や TAP法などに用いられている CBP (カルモジュリンビーズとの親和性により分離可能）やプロテイン A( IgG-プロティン A親和性により分離可能 )、親和性タグとして、各種の抗体タグなどとの融合蛋白質とすることが挙げられる。ペイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ペイトをそのまま、分離用修飾を有するペイトとして使用できる。プレイの検出用修飾としては、 GFP (green fluorescent protein)などの蛍光蛋白質との融合蛋白質とすることが挙げられる。

上記の融合蛋白質をコードする mR N Aの調製およびこの mRN Aの無細胞翻訳系での翻訳は通常の方法に従って行うことができる。 mR NAは、無細胞転写翻訳系において、 D N Aの転写により生成するものであってもよい。

プレイが対応付け分子とされる場合には、ペイトには任意の分離用修飾を施すことができる。ペイトが蛋白質である場合には、上述の分離用修飾の例が挙げられる他、ベイトが核酸やドラッグなどの場合の分離用修飾の例としては、ストレれる。ペイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ペイトをそのまま、分離用修飾を有するペイトとして使用できる。

対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分子は、通常には、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現形の発現に関与する蛋白質を含む表現型分子とが結合してなる分子である。この蛋白質としてプレイを用いることによりプレイを対応付け分子とすることができる。このような対応付け分子は、無細胞翻訳系において、プレイをコードする mRN Aの翻訳を、翻訳されたプレイが該 mRN Aと会合するように行うこと、又は、無細胞転写翻訳系において、プレイをコードする DN Aの転写および翻訳を、翻訳されたプレイが該 DN Aと会合するように行うことにより形成することができる。従って、この製造の際に、ペイトを存在させることにより、無細胞共翻訳を行うことができる。すなわち、下記（1) 又は（2) により無細胞共翻訳を行うことができる。

(1)無細胞翻訳系において、前記べィトの存在下で、前記プレイをコードする mRNAの翻訳を、翻訳されたプレイが該 mRNAと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ペイトとプレイとを接触させる。

(2)無細胞転写翻訳系において、前記べィトの存在下で、前記プレイをコードする DN Aの転写および翻訳を、翻訳されたプレイが該 DN Aと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。

以下、上記（1) および（2) の態様について説明する。

(1) の態様では、 mRNAが、その 3'末端に結合したスぺ一サ.一領域と、スぺーサ一領域に結合した、ぺプチド転移反応によってぺプチドと結合し得る基を含むぺプチドアクセプ夕一領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該 m RN Aと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、 in vitroウィルス方法が挙げられる。

mRN Aは、好ましくは、転写プロモーターおよび翻訳ェンハンサ一を含む 5' 非翻訳領域と、 5'非翻訳領域の 3'側に結合した、プレイをコードする 0RF領域と、 0RF領域の 3'側に結合した、ポリ A配列を含む 3'末端領域を含む核酸である。好ましくは、ポリ A配列の 5，側に、 S匪 S (Sは G又は C)配列を含む発現増幅配列（例えば制限酵素 Xholが認識する配列）が更に含まれる。 5'末端に Cap構造があってもなくても良い。

ポリ A配列は、少なくとも 2残基以上の dAおよび/又は rAの混合あるいは単一のポリ Α連続鎖であり、好ましくは、 3残基以上、より好ましくは 6以上、さらに好ましくは 8残基以上のポリ A連続鎖である。

翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモ一夕一と翻訳ェンハンサ一からなる 5' UTR、および、ポリ A配列を含む 3'末端領域の組み合わせがある。 3'末端領域のポリ A配列の効果は通常には 10残基以下で発揮される。 5' UTRの転写プロモ一夕一は T7/T3又は SP6などが利用でき、特に制限はない。好ましくは SP6であり、特に、翻訳のェンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合は SP6を用いることが特に好ましい。翻訳ェンハンサ一は好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、 TMVのオメガ配列の一部（029; Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、および、 WO 02/48347の図 3参照）を含んだものが好ましい。

また、翻訳効率に関し、 3⁵末端領域においては、 Xhol配列とポリ A配列の組み合わせが好ましい。さらに、 0RF領域の下流部分、すなわち Xhol配列の上流に親和性夕グがついたものとポリ A配列の組み合わせが好ましい。親和性夕グ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるァフィニティ一分離分析用タグである Flag- tag配列又は His-tag配列である。ポリ A配列効果としては、 Flag- tag等の親和性夕グに Xhol配列がついたものとそこへさらにポリ A配列がついたものの翻訳効率が上昇する。ここで、 His-tagについては、 Xhol配列のない構成でも十分な翻訳効率を示し、有効である。

上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。

5' UTRを SP6+029とし、 3³末端領域を、たとえば、？1& + 1101+ ₁₁(11ニ8)又は^3+ A_n (n=8)とすることで、各長さは、 5' UTRで約 49bp、 3'末端領域で約 38bp又は約 26 bpであり、 PCRのプライマ一にアダプタ一領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドや cDNAライブラリ一から PCRによって、 5 ' UTRと 3'末端領域をもったコード領域を簡単に作成できる。コ一ド領域において、翻訳は 0RF領域を超えてされてもよい。すなわち、 0RF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。

ぺプチドアクセプ夕一領域は、ぺプチドの C末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、 3，- N-アミノアシルビユ一ロマィシンアミノヌクレオシド (3， -N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS - アミノ酸）、例えばァミノ酸部がグリシンの PANS- Gly、ノリンの PANS-Val、ァラニンの PANS- Ala、その他、全アミノ酸に対応する PANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として 3' -アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった 3' -N-アミノアシルァテノシンアミノヌクレオシド ' -Aminoacyiaaenosine aminonucleoside, AAN S -アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンの AA S- Gly、バリンの AA S- Val、ァラニンの AANS- Ala、その他、全アミノ酸に対応する NS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。

ペプチドァクセプ夕ー領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と 1残基もしくは 2残基のデォキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてべプチドの C末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピュー口マイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、 PANS-アミノ酸、 MNS-ァミノ酸などが挙げられる。

ぺプチドアクセプ夕一領域は、ピュー口マイシンのみの構成でもかまわないが、 5'側に 1残基以上の DNAおよび/又は RNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、 dC-ピューロマイシン， rC-ピューロマイシンなど、より好ましくは dCdC -ピューロマイシン， rCrC -ピューロマイシン， MC-ピュ一ロマイシン， d CrC-ピュー口マイシンなどの配列で、ァミノァシル - tRNAの 3，末端を模倣した CCA 配列 (Philipps, G.R. (1969) Nature 223, ³フ4-³77)が適当である。塩基の種類としては、 C>(U又は T)>G>Aの順で好ましい。 .

スぺ—サ—領域は、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分とした PEG 領域である。スぺ一サー領域は、通常には、 PEG領域の他に、核酸の 3³末端に結合できるドナー領域を含む。

核酸の 3'末端に結合できるドナ一領域は、通常、 1以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には 1〜1 5、好ましくは 1〜2である。ヌクレォチドはリボヌクレオチドでもデォキシリボヌクレオチドでもよい。ドナ一領域は修飾物質を有していてもよい。

ドナ一領域の 5，末端の配列は、プレイをコードするコード領域とのライゲ一ション効率を左右する。コ一ド領域とスぺーサ一領域をライゲ一シヨンさせるためには、少なくとも 1残基以上を含むことが必要であり、ポリ A配列をもつァクセプ夕一に対しては、少なくとも 1残基の dC (デォキシシチジル酸）又は 2残基の dCdC (ジデォキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、 C>(U又は T)>G>Aの順で好ましい。

PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、 PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が 20 bp以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が 400以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が 10 bp以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が 1000以上であることを意味する。

PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、 400〜30, 000、好ましくは1，000〜10, 000、より好ましくは 2，000〜8, 000である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約 400より低いと、このスぺーサ一領域を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが (Liu, R" Barrick, E" Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzyraology, vol. 318, 268-293)、分子量 1000以上、より好ましくは 2000以上の PEG を用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量 1000以上で良好であり、分子量 400 以下では DNAスぺーサ一と性質がそれほどかわらず不安定となることがある。ポリエチレングリコ一ルを主成分とするスぺーサ一領域を有することによって、対応付け分子がゥサギ網状赤血球のみならず小麦胚芽の無細胞翻訳系でも形成可能となり、両翻訳系での遺伝子型分子の安定性が飛躍的に向上し、翻訳後の処理を施すことが不要となる。

( 2 ) の態様では、 D NAが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、 D N Aがビォチンにより標識され、 D N A—分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写および翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該 D N Aと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、 STABLE法が挙げられる。

ェマルジヨンは、通常には、 2種の界面活性剤およびミネラルオイルと、無細胞転写翻訳系の反応液を混合して形成される W/0型のェマルジヨンである。 W/0型のェマルジョンを形成するには、通常には、界面活性剤の HLB(hydrophile-lipophile balance)値が 3. 5〜 6である必要がある。 2種の界面活性剤を混合した場合の HLB 値は、個々の界面活性剤の HLB値から簡単な計算式で求められる。例えば、 Span 85(HLB=1.8および Tween 80(HLB=15.0)を、それそれ 40.2〃 1および 9.8〃 1の割合で混合することによりとなる。界面活性剤とミネラルオイルの割合は、通常 1 ： 1 8 (容量比）である。また、反応液の割合はェマルジヨン全体に対して 1〜5 0 % (容量比）であり、通常は 5 %である。界面活性剤とミネラルオイルの混合物に、撹袢しながら、低温で、反応液をいくつかに分けて添加し、混合することによりェマルジヨンを形成することができる。転写および翻訳の反応は、ェマルジョンの温度を上げることにより、開始させることができる。

プレイをコードする D N Aの調製およびこの D N Aの無細胞転写翻訳系での転写および翻訳は通常の方法に従って行うことができる。

上述のように、ペイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行うことにより、無細胞共翻訳により形成された複合体を特異的に検出することができる。

ペイトとプレイの無細胞共翻訳において、無細胞共翻訳を行う無細胞翻訳系 (無細胞転写翻訳系を含む）については、大腸菌 E. coli、ゥサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。 in vitroウィルス法では、対応付け分子の形成は、大腸菌 E. coliではかなり不安定であるが、ゥサギ網状赤血球の系 (Neraoto N, Miyamoto-Sato E, Yanagawa H. (1997) FEBS Lett. 414, 405; Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1²²⁹7)では安定であることが確認 Z7

されており、さらに小麦胚芽の系（特開 2002-176987)ではより安定であることが確認されている。 STABLE法では、大腸菌 E. coli、ゥサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。

無細胞共翻訳における翻訳又は転写および翻訳の条件は、用いる無細胞翻訳系に応じて適宜選択される。

無細胞翻訳系に添加するべィ卜とプレイのテンプレートは、無細胞翻訳系が転写も生じる無細胞転写翻訳系であれば、 RNAおよび DNAのどちらでも構わない。以下、ペイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。

本態様の共翻訳スクリーニングにおけるベイトとして、図 6に示すように、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と PEGスぺ一サ一部からなることを特徴とする翻訳テンプレートを利用する。コード部は、蛋白質に翻訳される情報であり、どのような配列でも良いが、好ましくは、コード部の 3'末端領域にァクセプ夕一

(A配列）を持つ、あるいは、コード部の 3'末端領域にァクセプ夕一 (A配列）を持ち、かつ A配列の 5'上流に翻訳増幅配列（X配列）を持つことを特徴とする。コ一ド部の A配列として、短いポリ A配列を含む。短いポリ A配列とは、通常には 2〜 1 0塩基の Aからなる配列である。 X配列として、 (C又は G)NN(C又は G)配列を有する配列、たとえば、 Xhol配列を有することを特¾¾とする。 PEGスぺ一サ一部は、ポリエチレングリコールを主成分とした PEG領域、コ一ド部と連結するためのドナー領域、および 3，末端に CCA領域を持つ。 PEGスぺ一サ一部は、ドナ一領域のみ、 CCA領域のみでもかまわないが、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分とした PEG領域を含む構成をとる。 CCA領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ぺプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする。 PEG領域のポリエチレングリコールの分子量は、 500以上であることを特徴とする。また、ドナ一領域および/又は CCA領域において、少なくとも 1つの機能付与ュニヅト（F )を含むことを特徴とする。機能付与ュニヅト（F 1あるいは/かつ F 2 )が、該翻訳テンプレートおよび/又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビォチンなどが考えられ、蛍光性物質として、 Fluorescein, Cy5, 又はローダミングリーン（RhG)などが考えられる。これらのコード部や翻訳テンプレート、およびそのライプラリー、さらに、リボソーム上で翻訳された蛋白質やそのライブラリ一に関するものである。

ペイトの翻訳テンプレート（図 6の A )は、コード分子（図 6の B )に由来するコ ―ド部と PEGスぺーサ一分子（図 6の C )に由来する PEGスぺ一サ一部からなる。本態様では、基本的にはコード部の配列によらず、コード部に PEGスぺーサ一部を連結（ライゲーシヨン）することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。しかしながら、さらにコード部の構成や PEGスぺーサ一部の種類によって、その翻訳効率をより向上させることが可能である。以下にその詳細を記載する。

本態様のコード部（図 6の B )は、 5'末端領域、 0RF領域、 3'末端領域からなり、 5，末端に Cap構造があってもなくても良い。また、コード部の配列には特に制限はなく、あらゆるベクタ一やプラスミドに組み込まれたものとしての利用が考えられる。また、コード部の 3'末端領域は、 A配列としてポリ Ax 8配列、又は X配列として Xhol配列や 4塩基以上で SNNS( Sは G又は C )の配列を持つもの、および A配列と X配列の組み合わせとしての XA配列がある。 A配列、 X配列、又は XA配列の上流に親和性タグ配列として Flag- tag配列、からなる構成が考えられる。ここで、親和性夕グ配列としては HA- tagや IgGのプロテイン A( zドメイン）などの抗原抗体反応を利用したものや His- tagなど、蛋白質を検出又は精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、 XA配列の組み合わせが重要であり、 X配列のなかで、最初の 4塩基が重要であり、 SNNSの配列を持つものが好ましい。また、 5，末端領域は、転写プロモーターと翻訳ェンハンサ一からなり、転写プロモー夕一は T7/T3又は SP6などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、翻訳のェンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましく、プロモー夕一としては、 SP6を用いることが好ましい。翻訳ェンハンサ一のオメガ配列の一部 (029 )は、 TMVのオメガ配列の一部を含んだものである（Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、および、 WO 02/48347の図 3参照）。コード部の 0RF領域については、 DNAおよび/又は RNAからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、ェキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、あるいは、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。

本態様の PEGスぺ一サー分子（図 6の C )は、 CCA領域、 PEG領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならず PEG領域を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピュー口マイシンを持つことが好ましい。 PEG領域のポリェチレングリコールの分子量の範囲は、 400〜30，000で、好ましくは 1， 000〜； 10, 000、より好ましくは 2，000〜6, 000である。また、 CCA領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ビューロマイシンについては、ピューロマイシン（Puromycin) 、 3，アミノアシルビユ一ロマイシンアミノヌクレオシド (3' -N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸) 、例えばァミノ酸部がグリシンの PANS-Gly、ノリンの PANS- Val、ァラニンの PANS- Ala、その他、全アミノ酸に対応する PANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として 3' - アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった 3，- N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド (3，- Aminoacyladenosine aminonucleoside, MNS -アミノ酸) 、例えばアミノ酸部がグリシンの AA S- Gly、ノリンの AANS- Val、ァラニンの AA S-Ala、その他、全アミノ酸に対応する AANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。本翻訳テンプレートでは、以上のピュ一口マイシン誘導体のァミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いた CCA領域も考えられるが、リボソーム上で蛋白質と結合不能なピューロマイシンを含むことで、より翻訳効率を高められる。その理由は定かではないが、蛋白質と結合不能なピューロマイシンがリボソームを刺激することでターンオーバーが促進される可能性がある。 CCA領域（CCA)の 5' 側に 1残基以上の DNAおよび/又は Aからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、 C>(U又は T)>G>Aの順で好ましい。配列としては、 dC-ビューロマイシン， rC-ピューロマイシンなど、より好ましくは dCdC-ピュ一ロマイシン， rCrC-ピューロマイシン， rCdC-ピュ一ロマイシン， dCrC-ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル- tRNAの 3，末端を模倣した CCA配列 (Philipps G.R. (1969) Nature 223, 374-377)が適当である。本発明の一態様では、これらのピュー口マイシンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。

本態様の PEGスぺーサ一部は修飾物質 (F 1および/又は F 2 )を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、又は固定化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも 1残基の DNAおよび/又は RNAの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ピオチン、又は His-tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。また、コード部の 5'末端領域を SP6+029とし、 3，末端領域を、たとえば、 Flag+XhoI+A_n (n=8)とすることで、各長さは、 5，末端領域で約 60bp、 3'末端領域で約 40bpであり、 PCRのプライマーにァダブ夕一領域として設計可能な長さである。これによつて新たな効果が生み出された。すなわち、あらゆるベクターやプラスミドや cDNAライブラリ一から PCIUこよって、本態様の 5'末端領域と 3'末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に、 3，UTRの代わりとして PEGスぺーサ一部をライゲーションすることで、翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。

本態様の PEGスぺーサ一分子とコード分子のライゲ一シヨンは、その方法については、一般的な DNAリガ一ゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。 RNAリガーゼを用いるライゲ一シヨンでは、コ一ド部でライゲーシヨン効率に影響を与える範囲としては 3'末端領域の A配列が重要であり、少なくとも 2残基以上の dAおよび/又は rAの混合又は単一のポリ A連続鎖であり、好ましくは、 3残基以上、より好ましくは 6から 8残基以上のポリ A連続鎖である。 PEGスぺ一サ一部のドナ一領域の 5，末端の DNAおよび/又は RNA配列は、ライゲーシヨン効率を左右する。コード部と PEGスぺーサ一部を、 RNAリガーゼでライゲーシヨンするためには、少なくとも 1残基以上を含むことが必要であり、ポリ A配列をもつァクセプ夕一に対しては、少なくとも 1残基の dC (デォキシシチジル酸）又は 2残基の dCdC (ジデォキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、 C>(U又は T)>G>Aの順で好ましい。さらに、ライゲ一シヨン反応時に、 PEG 領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することが好ましい。次に、プレイとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。

本態様の共翻訳スクリーニングにおけるプレイとして、図 7に示すように、翻訳テンプレートによって C末端修飾された蛋白質 (二対応付け分子）を利用する。翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と PEGスぺ一サー部からなる。コード部の 3'末端に A配列を有し、 A配列は、短いポリ A配列を含む。 PEGスぺ一サ一部は、ポリエチレングリコールを主成分とした PEG領域において、ポリエチレングリコールの分子量が 400以上であることを特徴とする、また、ドナー領域および/又は CCA領域において、少なくとも 1つの修飾物質 (F 1および/又は F 2 )を含むことを特徴とする。また、 CCA領域は、該翻訳テンプレートによつて翻訳された蛋白質と、ベプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とし、代表的には CCA領域にピューロマイシンを有する。また、修飾物質 (F 1および/又は F 2 )が、該翻訳テンプレートおよび/又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラペル化することを特徴とする。固定化物質としてピオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、 Fluorescein, Cy5, 又はローダミングリーン（MiG)などが考えられる。これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質 (二対応付け分子）および蛋白質 ( =対応付け分子)のライブラリーに関するものである。

プレイは、翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、翻訳テンプレ —卜で C末端修飾された蛋白質（図 7の A ;対応付け分子）であり、翻訳テンプレート（図 7の B )と、 PEGによって C末端修飾された蛋白質（図 7の C )の構成に特徴を持つ。以下詳細に記述する。

翻訳テンプレート（図 7の B )の PEGスぺーサ一部は、ビュ一口マイシンがアミノ酸と連結できることを特徴とする以外は上記のペイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様である。また、コード部も上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様であるが、特に、対応付けに適した構成としては、 3'末端領域を A配列にすることが重要であり、トータル蛋白の対応付けの効率が著しく向上してフリー蛋白質の量が激減する。ここでも、コード部の 5³ 末端領域を SP6+029とし、 3，末端領域を、たとえば、 Flag+XhoI+A_n(n=8)とすることで、各長さは、 5，末端領域で約 60bp、 3，末端領域で約 40bpであり、 PCRのブライマ一にアダプタ一領域として設計できる長さである。これによつて、あらゆるベクタ—やプラスミドゃ cDNAライブラリ一から PCRによって、本態様の 5，末端領域と 3'末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、 PEGスぺ一サ一部をライゲーシヨンすることで、対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られる。本態様の PEGによって C末端修飾された蛋白質（図 7の C )は、蛋白質の相互作用検出などにおいて、コード部を利用しない場合、たとえば、 FCCS測定、蛍光リ —ダ一、プロテインチップなどに応用する場合は、 RNase Aなどで意図的に切断してもよい。切断することによって、コード部の妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。また、単独の対応付け分子をプレートやビーズゃスライドガラスに固定することも可能である。

無細胞共翻訳を、図 8を参照して説明する。図 8に示すように、ペイトの存在下でプレイが in vitroで翻訳される。図 8の Aおよび Bに示されるように、べィトが蛋白質であって、無細胞翻訳系でプレイと同時に翻訳される場合と、ペイトが、核酸やホルモンなどであって、無細胞翻訳系に添加される場合がある。図 8 に示すように、プレイは融合蛋白質又は対応付け分子とされる。

複合体は、ベイトと一つのプレイが結合して形成されること（I )'の他に、ベィトに結合したプレイにさらに別のプレイが結合することにより形成されること ( II) もある。

本発明検出方法によれば、 in vitroで複合体の形成を行うことができるので、一貫して in vitroで蛋白質間又は核酸-蛋白質間などの相互作用を検出できる。ベイトが蛋白質である場合は、ベイトとしては、目的蛋白質との相互作用のための機能ドメインのみの蛋白質、機能ドメインを含む蛋白質、又は完全長蛋白質などが挙げられる。ここで、完全長蛋白質を用いることは、複数の機能ドメインを有することが一般に予測されるため、さらに網羅的にプレイを検出可能となることから、好ましい。完全長蛋白質は、単独で完全長の蛋白質でもよいし、完全長の蛋白質を再構成する複数のペイ卜の集まりでもよい。

ペイトは、図 9に示したように、複合体であってもよく、これを「複合べィト」 2003/014750

33 と呼ぶ。複合体することによって、より非特異的な吸着を減らすことができ、かつ完全長蛋白質と同様の効果として、より網羅的にプレイを検出することが可能となる。

以上のように、無細胞共翻訳で考えられる複合体としては、単独のペイトと単独のプレイの複合体、複合べィトとプレイの複合体、ペイトと複数のプレイの複合体、および、複合ペイトと複数のプレイの複合体が可能である。従って、本発明検出法により検出可能な相互作用は、ペイトとプレイとの間の直接の相互作用だけでなく、複合体を形成するための間接的な相互作用をも包含するものである。本発明における無細胞共翻訳で最も重要なことは、蛋白質がネィティブな状態でフォールデイングしており、翻訳されたての変性していない状態であり、相互作用するべきペイトとプレイ又はペイトとペイトゃプレイとプレイが無細胞翻訳系に共存しており、速やかに相互作用できると言うことと考えられる。このことは、別々に翻訳して翻訳直後に混合して共存させるよりも、共に翻訳したものの方が優れた結果が得られたことにより支持される。すなわち、 in vitroで翻訳された蛋白質がネイティブなフォールディング状態で、蛋白質又は核酸などと出会うことができるため、速やかに相互作用による複合体の形成が可能となったためと思われる。

従来の相互作用の検出法では、ペイトを大腸菌で大量に発現精製する必要があつた。例えば、 TAP法などでペイトとプレイの相互作用を細胞で発現させる場合は、最低一ヶ月の準備が必要であった。また、 GST融合蛋白によるプルダウン法を採用している mRNAディスプレイ法では、ペイトを大腸菌などで大量に発現させて精製するため、最低 2〜3週間かかり、大腸菌で発現しないものはべィトに出来ないなどの問題があり、さらに、プレイと相互作用させるにはプレイの 50〜； 100 倍の量のペイトを添加する必要があった。無細胞共翻訳では、無細胞翻訳系において、ほぼ同量の mRNA又は DNAテンプレートを添加すればよいだけとなり、べィトを細胞で発現させる必要は全くなくなり作業時間の大幅な短縮が行える。さらに、複合べィトゃ完全長蛋白質によって、ペイ卜とプレイの相互作用をより強化し特異的なものとし、非特異的な結合の検出を回避することができる。また、複合べィトによって、その第二のペイトと相互作用するより多くのプレイを網羅的に解析できる。

これまで、一貫して in vitroで相互作用による複合体形成とスクリーニングを実現するシステムは存在しなかったが、以上の本発明検出法によって、ベイトも含めて完全に in vitroで翻訳とスクリーニングを行って、蛋白質間又は蛋白質 - 核酸間の相互作用を非特異的な検出を回避しかつ網羅的に検出可能なシステムを構築できる。従って、本発明は、本発明検出方法を利用したスクリーニング方法も提供する。

本発明スクリーニング法は、ペイトとプレイが無細胞共翻訳を通して相互作用して複合体を形成し、複合体のスクリーニングによってペイトと相互作用するプレイを解析することを特長とする。従って、本発明スクリーニング方法は、本発明検出方法により、ペイ卜とプレイとの間の相互作用を検出する検出工程を含む他は、ペイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、および、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ペイトと相互作用するプレイの通常のスクリ一ニング方法と同様でよい。

本発明スクリーニング方法は、選択工程で選択されたプレイを調製する調製ェ程をさらに含み、調製されたプレイを、検出工程で使用されたべィトの代わりに又はそのべィトと共に用いて、検出工程、'選択工程および調製工程を繰り返すことが好ましい。この態様は、例えば、図 1 0に示すように、 1 )プレイおよびべィトが相互作用を形成する無細胞翻訳系における無細胞共翻訳の工程、 2)ペイ卜と相互作用しているプレイを検出するスクリーニングの工程、 3 )プレイを分析および解析する工程、および 4) 3 )で分析および解析されたプレイを新たな次のペイトとし、 1 )から繰り返す工程から構成される。 1 )および 2)の工程が検出工程および選択工程に相当し、 3)の工程が調製工程に相当する。すなわち、検出工程のうちの、ペイトとプレイを接触させる工程が無細胞共翻訳の工程に相当し、検出ェ程のうちの複合体の検出および選択工程がスクリ一二ングの工程に相当する。本発明スクリーニング法では、選択工程で選択されたプレイを再度検出工程に付してもよい。

本発明スクリーニング法では、ペイ卜と複数のプレイの集団であるプレイ 'ライブラリーとの無細胞共翻訳を行い、スクリーニングの工程において、 2つ以上のプレイが検出されてもよい。

図 9に示すように、複合べィトとプレイが共存し、相互作用によって複合べィトとプレイの複合体を形成する場合がある。この無細胞共翻訳で、プレイ 'ライブラリーの複数のプレイがペイトと共存し、相互作用によってべィトと複数のプレイの複合体を形成することによって、スクリーニングにおいて、一挙に網羅的な相互作用する複数のプレイを検出できる。また、ベイトが完全長蛋白質であることによって、完全長蛋白質は一般に相互作用の機能ドメインを複数含むので、より多くのプレイを網羅的に検出可能となる。

さらに、図 9に示すように、複合ペイトと相互作用する複数のプレイの複合体を形成することによって、複合ペイトと相互作用する複数のプレイを検出でき、また、第二のペイトがべィトとプレイの相互作用の補強剤となり、より特異的な相互作用が実現されることによって、網羅的検出における非特異的検出の回避が可能となる。 in vitroウィルス法や STABLE法など進化分子工学的手法では、プレィは対応付け分子（fusion)となる。プレイ ·ライブラリーや複数のプレイを用いた場合の複合体の形成では、プレイは直接べィ卜と相互作用する場合としない場合がある。

複合体のスクリーニングにより得られた複合体が対応付け分子である場合には、図 1 0に示すように、複合体を形成するプレイを RT- PCR又は PCRにより検出し、さらに、 PCR産物をプレイとして再スクリーニングする（プレイの再構築）、あるいは、 PCR産物から解析したプレイを新たな次のペイトとしてスクリーニングしてもよい。ここで、 PCR産物から再スクリーニングする、あるいは、 PCR産物から解析したプレイを新たな次のペイトとしてスクリーニングする方法は、 in vitro ウィルス法や STABLE法など進化分子工学的手法においてのみ可能であり、ブルダゥン法、 TAP法など蛋白質を直接解析する方法ではできない。

対応付け分子を用いた場合には、スクリーニングの後、 RT- PCR又は PCRによつて蛋白質プレイの遺伝子配列を知ることが出来る。図 8および 9に示すように、ここでの蛋白質プレイとは、ペイトと相互作用しているプレイ又はそのプレイと相互作用しているプレイなどであり、ペイ卜と相互作用しているすべての複数のプレイが網羅的に解析できる。さらにプレイの再スクリ一ニングが必要な場合は、 RT - PCR又は PCIlの産物である DNAテンプレートを転写し、同じサイクルを繰り返す。また、 RT- PCR又は PCRとそれに続くシークェンスによってプレイが定まつた場合は、その蛋白質プレイはべィトとして使えるようになる。はじめのペイトに対して相互作用するプレイが複数個見つかれば、複合べィトを形成することが出来るようになり、さらにより多くのプレイを検出することが出来るようになる。

無細胞共翻訳を用いると、プルダウン法や TAP法においても一貫して in vitro で蛋白質間相互作用を検出できることになるが、 TAP法では対応付け分子を形成していないので、プレイの解析において直接的に蛋白質を解析しなければならない。そこで、プルダウン法や TAP法をスクリーニングの方法として in vitroウイルス法や STABLE法に応用すれば、対応付け分子を形成しているので、 RT- PCR又は PCRによって、相互作用するプレイの解析においてその遺伝子配列を簡単に検出することが出来る。さらに、無細胞共翻訳を用いると、 in vitroウィルス法や ST ABLE法において、一貫して in vitroで蛋白質間相互作用を検出できることになる。また、プレイの数が莫大な場合は、サイクルを回すことで再スクリーニングによりプレイを絞り込むことが可能である。また、解析されたプレイは、次の解析では、ペイトとして使うことができ、ペイトの数が増えれば、ペイ卜の複合化が進み、さらなるプレイが検出されることにつながる。このように、プレイをべイトとして次のサイクルで使用することは、.対応付け分子を用いる in vitroウィルス法や STABLE法などでのみ簡単に実現できる。しかしながら、 mRNAディスプレイなどの方法では、新しいペイ卜の GST融合蛋白を大腸菌で大量合成と精製が必要であり、ペイトの用意に時間がかかり困難である。無細胞共翻訳によれば、その必要もなく簡単にサイクルを回すことが出来る。

無細胞共翻訳後の複合体のスクリーニングにおいて、無細胞共翻訳によって出来た複合体を壊すことなくプレイを網羅的にスクリ一ニングできることが好ましい。このために、親和性タグなどによってべィトに固定化の仕組みを持たせ、ベイトと相互作用するプレイを検出してもよい。その固定化の仕組みは、いかなるものでも構わない。たとえば、既存の TAP法などのように、 IgG-プロテイン A親和性やカルモジュリンビーズを用いた 2段階のスクリーニングを行う方法、あるいはプルダウン法のように、ストレプトアビジン又はアビジン-ピオチン親和性、 G ST - tag、 Flag-tag, T7-tag, His-tagなどを利用した一段階又は二段階のスクリ一二ングを行う方法が挙げられる。

プレイ 'ライブラリーとしては、 cDNAライブラリー（ランダムプライミング · ライブラリ一、 dTプライミング 'ライブラリ一）、ランダム 'ライブラリー、ぺプチド 'ライブラリ一、ホルモン 'ライブラリ一、抗体 ·ラィブラリ一、リガンド . ライプラリ一、医薬化合物ライブラリ一などが挙げられ、いかなるライブラリーでも構わない。たとえば、プレイ 'ライブラリ一としてランダムプライミング · cDNAライブラリーを用いた場合、このライブラリーには完全長プレイは望めないが、機能ドメインを含むプレイは期待できる。このようなライブラリ一は、特に、複合ペイトゃ完全長蛋白質との組み合わせによるスクリーニングに用いると、プレイの網羅的検出に有効となる。

ランダムプライミングライブラリーの例としては、マルチクローニングサイト ( MCS )の 5，側に、転写プロモ一夕一として SP6の RNAポリメラ一ゼのプロモー夕一 (SP6 )と、翻訳ェンハンサ一としてタバコモザイクウィルスの TMVオメガ配列の一部（029)とを含んだ 5'非翻訳 (UTR)領域を持ち、かつ MCSの 3，側に親和夕グ配列として、抗原抗体反応によるァフィ二ティー分離分析用タグである Flag-tag配列を、 MCSに組み込まれた挿入配列から発現した蛋白質の C末端に Flag-tagが付加されるように含む 3，末端を持つベクターの MCSに、ランダムプライミングで得られた cDNAが組み込まれたものが挙げられる。

上記の本発明検出方法は、ペイトとプレイとを接触させ複合体を形成させるェ程を含んでいる。従って、この工程に準じて、ペイトとそのべィトと相互作用するプレイとの複合体を形成させる方法が提供される。

本発明形成方法は、ペイトとペイトと相互作用する蛋白質であるプレイとの複合体の形成において、プレイとして本発明のライブラリ一を用いるものであり、好ましくは、さらに、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明形成方法の好ましい構成は、ペイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ペイ卜とそのべィ卜と相互作用するプレイとを接触させることを含む、ペイ卜とプレイとの複合体の通常の形成方法と同様でよい。ペイトおよびプレイの特定の様式での検出用標識および分離用修飾ならびに無細胞共翻訳については、本発明検出方法に関し説明した通りでよい。実施例

以下、具体的に本発明の IVVランダムプライミングライブラリ一とその作成に使用され得るラィゲ一テッド dsDNAラィブラリ―、 IVV cDNAラィブラリ一および I VVライゲ一テツド RNAライブラリーの作成についての実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。実施例 1 IVVランダムプライミングライブラリーの作成とライブラリ一からの共翻訳スクリーニング

図 1に概略を示す方法に従って IWランダムライブラリーを作成した。すなわち、 MAライブラリ一を錶型として、 9塩基からなるランダム配列と特定配列 (tag 2 配列）を含むランダムプライマーを用いてランダムプライミング法により逆転写で mRNAに相補的な一本鎖 cDNA( ssDNA)ライブラリーを合成する（1 )。 RNase Hにより cDNAと RNAの二本鎖から RNAのみを分解すると同時に、 DNAポリメラ一ゼ I による cDNAに相補的な DNAを合成し、さらに、 DNAリガーゼにより DNAポリメラ一ゼ Iにより合成された MA間にある二ヅクを修正して dsDNAライブラリ一を合成する（11 )。合成された二本鎖 cDNAは DNAポリメラ一ゼ I により合成された側のみ 5'末端にリン酸基を持つのでこれを利用し、特定配列（5' UTR二プロモー夕 — +ェンハンサ一）を持つアダプタ一を DNAリガーゼを用いて結合し、ライゲーテヅド dsDNA ライブラリー）を合成する（111 )。アダプターとランダムプライマーの特定配列を利用して PCRを行い、 5，側にプロモーターとェンハンサ一の配列、 3' 側に A tailをもつ IWの cDNAライブラリーを作成する（IV)。次に IVV cDNAライブラリ一を転写して IVV RNAライブラリーとし（V)、 IVVとするためのスぺ一サーをラィゲーシヨンし（VI )、さらに、無細胞翻訳系で翻訳すれば、対応付け分子のライブラリーとなる（VI I )。以下、詳細を説明する。 RNAライプラリーとして、市販のマウス脳又はマウス精巣 (polyA+) RNAライブラリ一（組織抽出 RNAライブラリ一を oligo dTカラムで精製したもの； clontech)を購入した。

また、あらかじめ、アダプターを設計し MAを合成した。ここでは、対応付け分子の形成に適した 5， UTR配列（プロモ一夕一 SP6+ェンハンサ一 029又は 0，）をライブラリーに特定配列として付加するための設計を行った。マウス脳 (polyA+) RNA ライブラリーには、ェンハンサ一 029をもつアダプタ一を使用し、マウス精巣（po lyA+) RNAライブラリ一には、ェンハンサ一 0，をもつアダプタ一を使用した。ェンハンサ一 029用のアダプターの主鎖（配列番号 1 )と副鎖（gaattcgc)、又は、ェンハンサ一 0，用のアダプターの主鎖 (配列番号 2 )と副鎖 (ggaattcg)は、各々 TEバヅファ一（10mM Tris-Cl， pH8.0, ImM EDTA)に溶解して 100 Μとし、主鎖と副鎖をそれそれ 10 1ずつ等モルで混合した。 90°Cで 2分間加熱し、 70°Cで 5分加熱し、 60°Cのウォー夕一バスにセヅトしてバスのヒ一夕一を切ってゆつくりと 60°C から室温まで下げた。 5〃1ずつに分注して- 20°Cに保存した。

まず、マウス脳 (polyA+) RNAライブラリ一を一本鎖 DNAに逆転写した（図 1 , 1)。マウス脳（polyA+) RNAライブラリー（1.4pmole/0.5〃g)を 0.5〃g、 3，ランダムプライマ一（配列番号 3 )を 2pmolと DEPC水とを加えて 12.0 1とし、 70°Cで lOminカロ熱し、氷上で 1分間冷却した。これを用いて、 Superscript I I RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)により 45°Cで lh逆転写反応を行った。次に、逆転写反応で合成した一本鎖 DNA(ssMA)ライブラリ一を全量用いて、 E. c oli DNAリガ一ゼ、 E. coliポリメラ一ゼ I、および E. coli RNase H (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)により 16°Cで 2h反応させ、さらに T4 DNAポリメラーゼにより 16°Cにおいて 5minの反応で末端を平滑化し、二本鎖 DNAを合成した（図 1 , 11 )。次に、この二本鎖 DNAの 5'末端がリン酸化されていることを利用して、先に準備したアダプターを用いてライゲ一シヨンした（図 1 , 111 )。合成した二本鎖 DNA(dsDNA)ライプラリーをエタノール沈殿し、の DEPC水に溶解した。これに、 100〃Mの準備したアダプタ一を 1.0 z l添加し、 50〃1 ligation high (T0Y0B0)を加えて、 16°Cでー晚反応させ、精製 (DNA purification kit ； QIAGEN)した後 50〃1とした。次に、 PCR (EX Taq Hot Start Version; TaKaRa)を行つた（図 1 , IV)。 50〃1のライゲ一シヨンした二本鎖 DNA (ライゲーテッド dsDNA) ライブラリーから 2 z lをテンプレートとして、 IVVに必要な特定配列（029 )を持つ 5，PCRプライマ一（配列番号 4 )と 3' PCRプライマ一（配列番号 5 )、又は、 IVVに必要な特定配列（0' )を持つ 5' PCRプライマー（配列番号 6 )と 3' PCRプライマ一（配列番号 7 )を用いて、 IVV cDNAライブラリ一（029)、および IVV cDNAライブラリ一（0 ' )を作成した。 PCRの条件は、全量 100〃1、 22サイクル（94°Cで 30秒、 60。Cで 30秒、 72°Cで 90秒を 1サイクルとし、最後の伸長反応は、 72°Cで 180秒）とした。

作成した IW cDNAライブラリ一を評価した。評価の結果は図 2に示した。もとのマウス脳、又はマウス精巣（polyA+) RNAライブラリーにどのような遺伝子が含まれるかを、遺伝子に特異的なプライマー (配列番号 8〜3 3 )を用いて RT- PCRで検出し（図 2の A)、それらの遺伝子について、マウス脳（polyA+) RNAライブラリ一から作成した IVV cDNAライブラリ一（029)とマウス精巣（polyA+) RNAライブラリーから作成した IVV cDNAライブラリ一（0，）において、もとの RNAライブラリ一と同様に遺伝子が存在しているかを確認した（図 2の B )。どちらのライブラリーでも、もとの RNAライブラリ一を反映して各遺伝子が検出された。すなわち、ラィブラリーの作成工程で、もとの Aライプラリーの質を落とすことなく IVV cDN Aライブラリ一を作成できた。

次に、マウス脳（polyA+) RNAライブラリーから作成した IVV cDNAライブラリー (029)を用いて、 IWの共翻訳スクリーニングに従って、転写（図 1 , V)して、スぺーサ一をライゲ一シヨン（図 1， VI )し、そして小麦胚芽の無細胞翻訳系で、 IV Vライゲーテヅドライブラリーをプレイの翻訳テンプレートとし、 C- fos mRNAをペイ卜の翻訳テンプレートとし、共翻訳スクリーニングと RT-PCR( One step RT-P CR kit (QIAGEN), プライマー；配列番号 4と 5、プログラム； RT- QH30，）を 3ラゥンド回すと c- Fos蛋白質と相互作用する c-Jun蛋白質の遺伝子がサザンブロッテイング（サザン）で明確に検出された（図 3の B )。さらに、 3ラウンド回したライブラリーをクロ一ニングしたところ、 c-Jun蛋白質の遺伝子は約 1/4を占めることがわかった。また、クロ一ニングしたライブラリ一内在の c-Jmi蛋白質の遺伝子をシーケンスして確認した（図 4 )。詳細は以下の通りである。

ペイト C- Fos蛋白質の作成方法は以下の通りであった。 pCMV- FosCBPzzベクター (配列番号 3 4 )から、 TaKaRa Ex Taq (宝酒造）を用いて、 PCR (プライマー 5' SP6(0 29)T7- FosCBPzz (配列番号 3 5 )と 3， FosCBPzz (配列番号 3 6 )、 PCRプログラム CYC B 1 (表 1参照））によって DNAテンプレートを準備した。 MAテンプレートを R iboMAX ™ Large Scale RNA Production Systems (Promega)を用いて転写（37°C , 2h)を行い、ペイト c-Fos蛋白質の mRNAテンプレートを準備した。共存させるペイト DNA は、 Fos/Junの結合配列を含む DNA-Fos/Jun (配列番号 3 7 )をテンプレートとし、 PCR(ブラィマー 5， DNA (配列番号 3 8 )と 3' DNA (配列番号 3 9 )、 PCRプログラム V- 2 (表 1参照））によって準備した。

プレイのマウス脳 cDNAライブラリーの作成方法は以下の通りであった。図 1に従って IVVランダムライブラリーを作成した。 RNAライブラリ一として、市販のマウス脳（polyA+) RNAライブラリ一（組織抽出 RNAライブラリーを oligo dTカラムで精製したもの； clontech)を購入した。アダプター設計は、対応付け分子の形成に適した 5' UTR配列（プロモー夕一 SP6+ェンハンサ一 029又は 0，：)をライブラリーに、 IVV形成に必要な配列として付加するための設計を行った。マウス脳 (polyA+) RN Aライブラリ一には、ェンハンサー 029をもつアダプターを使用した。ェンハンサ一 029用のアダプタ一の主鎖（配列番号 1 )と副鎖（gaattcgc )は、各々 TEバッファ — ( lOmM Tris-Cl , ρΗδ. Ο, ImM EDTA)に溶解して； 100〃Μとし、主鎖と副鎖をそれそれずつ等モルで混合する。 90°Cで 2分間加熱し、 70°Cで 5分加熱し、 60 °Cのウォー夕一バスにセヅトしてバスのヒ一夕一を切ってゆつくりと 60°Cから室温まで下げる。 5〃1づつに分注して- 20°Cに保存する。次に、マウス脳（polyA+) RNAライブラリ一を一本鎖 DNAに逆転写する（図 1 , 1 )。マウス脳（polyA+ ) RNAラィブラリー（1.4pmole/0.5 /g)を 0.5〃g、 3，ランダムプライマ一（配列番号 3 )を 2 pmolと DEPC水とを加えて 12.0 lとし、 70°Cで lOmin加熱し、氷上で 1分間冷却した。これを用いて、 SuperScriptl l RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)で 45°Cで Ih逆転写反応を行った。次に、逆転写反応で合成した一本鎖 MAを全量用いて、 E. coli DNAリガーゼ、 E. coli ポリメラ一ゼ I、および E. c ol i RNase H(SuperScript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)で 16⁰Cで 2h 反応し、さらに T4 DNAポリメラーゼで 16°Cで 5minで末端を平滑化し、二本鎖 DNA を合成した（図 1， 11 )。次に、この二本鎖 DNAの 5'末端がリン酸化されていることを利用して、先に準備したアダプターを用いてライゲーシヨンした（図 1 , 111 )。合成した二本鎖 DNAライプラリ一をエタノール沈殿し、 4〃1の DEPC水に溶解した。これに、 100〃Mの準備したアダプタ一を 1.0〃1添加し、 50〃1 ligation high(T0 Y0B0)を加えて、 16°Cでオーバ一ナイトで反応させ、精製 (DNA purification kit ； QIAGEN)した後 50〃1とした。次に、 PCR(EX Taq Hot Start Version; TaKaRa)を行つた（図 1 , IV)。 50〃1のライゲ一シヨンした二本鎖 DNAライブラリーから 2〃1をテンプレートとして、 IVVに必要な特定配列（029)を持つ 5' PCRプライマ一（配列番号 4 )と 3，PCRプライマ一 (配列番号 5 )を用いて、 IVV cDNAライブラリ一を作成した。 PCRの条件は、全量 100 z l、 22サイクル（94°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 90 秒を 1サイクルとし、最後の伸長反応は、 72°Cで 180秒）とした。

これらペイト c-Fos蛋白質の mMAテンプレート、プレイのマウス脳 cDNAライブラリー、そして共存させるベイト MAを小麦の無細胞翻訳系 (Wheat Germ Extract (Promega))を用いて 50 / 1で共翻訳 (26°C, 60min)させた。 50〃 1のサンプルに対し、 IgG結合バッファ一 (lOmM Tris - Cl， pH8.0, 150mM NaCl, 0. 1% NP40) 50〃1を添加し計 100 l (共翻訳サンプル）とした。その後、 IgGァガロース（Sigma)を IgG結合バッファーで 2回洗浄し、これに共翻訳サンプル（100 / 1 )を加え、 4 °Cで 2時間回転攪拌した。結合バッファ一で 3回、 TEV切断バッファ一（lOmM Tris-Cl, pH8.0₃ 150mM NaCl, 0. 1% NP40, 0.5inM EDTA, ImM DTT) で 1回洗浄、 IgGァガロ —スに結合したペイト /プレイ複合体を TEVプロテア一ゼ（GIBC0- BRL)で切断した ( 1 6 °C、 2時間）。さらに、上清 90〃1を 300〃1 カルモジュリン結合バッファ一と 0.3〃1 1M CaCl ₂、さらに、 500〃1カルモジュリン結合バッファ一で 2回洗浄した 50 / 1 カルモジュリンビーズを加えて 4 °Cで 1時間回転攪拌した。遠心後、 1000^ 1 カルモジュリン結合バッファーで 3回洗浄した。 50〃1カルモジュリン溶出バッファーを加えて、氷上で 1〜 2分放置し、遠心後、 50〃1を回収した。回収した溶液をテンプレートとして、 RT- PCR(One step RT-PCR kit (QIAGEN)、プライマ一；配列番号 4と 5、プログラム； RT- QH30' (表 1参照））を行った。この操作（図 3 )を 3ラウンド繰り返した後のライブラリーをクローニングしてシ一ケンスした。

以上から、本発明のライブラリ一は、ライブラリ一として非常に質が高いこと、および、 IWのライブラリーとして利用できることが証明された。

表 1 プログラム名： CYCB1

反応条件：

95°C 1 min

15サイクル

4°C ポーズプログラム名： V - 2

反応条件：

35サイクル

4°C ポーズプログラム名 RT-QH30'

反応条件：

60°C 30 min

95°C 15 min

94°C 30 sec

60°C 30 sec 1st- 2ndラウンド： 32サイクル， 3rdラウンド： 30サイクル 72 °C 3 min

72°C 10 min 実施例 2 IVVランダムブライミングライブラリ一の作成

実施例 1において、配列番号 5の 3， PCRプライマーの代わりに、配列番号 4 0 の 3， PCRプライマーを使用する他は、実施例 1と同様に IVVランダムプライミングライブラリ一の作成および評価を行った。この結果、実施例 1と同様の結果が得られた。実施例 3 IVVランダムプライミングラィブラリ一の作成

実施例 2において、ェンハンサ一 029用のアダプタ一の主鎖および副鎖として、配列番号 1および gaattcgcの代わりに配列番号 4 1および ggaattcgの配列を有するものを使用する他は、実施例 2と同様に IVVランダムプライミングライブラリ一の作成および評価を行った。この結果、実施例 1と同様の結果が得られた。産業上の利用分野

本発明によれば、 IVVのセレクション/スクリーニングに用いるライブラリーとその製法が提供される。従来、ランダムプライマ一によるライブラリー作成では、平均長が短くなる問題がある。また、クロ一ニングを介在する作成方法の場合、元の RNAライブラリーの規模や質を下げる問題がある。本発明では、二本鎖 DNAを合成する際に Klenowフラグメントで 5'側ランダムプライマ一を使用する方法 (Hammond, P.W., Alpin, J., Rise, C.E., Wright, M.C and Kreider, B.L. 2001. In vitro selection and characterization of Bcl-XL binding proteins from a mix of tissue-specific mRNA display libraries. J. Biol. Chem. 276: 20898-20906.)の代わりに、 RNase H, DNA ポリメラ一ゼ I，そして DNAリガ一ゼ存在下で二本鎖 DNAを合成すると、合成された相補鎖のみがリン酸化されていることを利用して、アダプターを相補鎖にライゲ一シヨンすることで、 DNA鎖の方向性を定めると同時に、平均長が短くなることも回避し、このライゲ一シヨンした相補鎖 DNAを PCRのテンプレートとし、クロ一二ングを介さず直接 PCRにより cDNAライブラリ一を作成するため、元の RNAライブラリーの規模や質を損なわないランダムプライミングライブラリーが提供可能となる。また、クロ一ニングが必要な従来法に比べて、ライブラリ一作成作業は 1ヶ月から 3日へ 1/10に短縮される。

クローニングを介さない方法においては、テンプレート作成のためのランダムプライマ—を ₅'および ₃，末端の両端に用いるためにライブラリ一の平均長が短くなる問題があつたが、本発明では、ランダムプライマ一（特定配列を持つァダプ夕一付き）を最初の RNAライブラリーからの逆転写時のみに用いて、二本鎖 DNAとする際には用いないで、アダプターをライゲーシヨンする方法を採用する。二本鎖 DNAとしたときの相補鎖 DNAのみが 5'がリン酸化されていることを利用して、特定配列を持つリン酸化されていないアダプタ一をライゲーシヨンすることで（ここでは、ライゲ一シヨン効率が高い DNAリガーゼを用い、 PCRテンプレートの方向性を定めるために、長さの短い配列をハイプリダイゼ一シヨンした一部二本鎖のアダプタ一を用いる。）、平均長が短くなることを回避し、かつライゲ一シヨンの際の副産物も少なく質の良い PCRのテンプレートを作成することで、質の高いライブラリ一を実現できる。

一方、ランダムプライミングによる対応付けライブラリ一を作成する際のラィブラリーの質を左右する他の要因としては、ライブラリ一のテンプレートの中で対応付け分子を形成できるテンプレートの存在率を向上させることが考えられる。この場合、フレームのズレが 1/3、 5，UTR/(mF/3，UTRの 3領域の枠組みのズレが 1/ 3、さらに、表と裏で 1/2なので、組み合わせると 1/18の確率となる。さらに、ラィブラリーの作成にクローニングを介すると、ベクターへのライゲーシヨンでバィヤスがかかり、元のライブラリーの質を保つことは難しい。本発明では、クロ一二ングを介することがないために元のライブラリーの質を保つことが容易になり、かつライブラリーの規模はクロ一ニングを介して細胞を用いた場合は 10⁸/ml であるのに対して試験管内で作成するので 10^{1 4}/mlが実現できるため、最終的にライブラリーのテンプレートの中で対応付け分子を形成できるテンプレートの量は大幅に増加し、極微量存在しているテンプレートでもスクリーニングゃセレクションの際の RT- PCRで増幅可能なライブラリ一が作成できることになる。

Claims

請求の範囲

1 . RNA又は mRNAライブラリーから、ランダムプライマーで逆転写により一本鎖 DNAを形成し、さらに該一本鎖 DNAを錶型として、該一本鎖 DNAの相補鎖 DNAの 5，末端のみがリン酸化されている二本鎖 DNAライブラリーを形成し、

該ニ本鎖 DNAライブラリーと、末端がリン酸化されていない核酸からなるァダプ夕一とをライゲーシヨンしてライゲ一テッド二本鎖 DNAラィブラリ一を形成し、該ライゲーテヅドニ本鎖 DNAライブラリーをテンプレートとして、対応付け分子の形成に必要な配列を持つプライマ一を用いた PCRにより、対応付け分子 cDM ライブラリ一を作成する

ことを含む対応付け分子 cDNAライブラリ一の製造方法。

2 . アダプタ一が二本鎖であり、ライゲ一シヨンされる本鎖とライゲーションされない副鎖からなる請求項 1の製造方法。

3 . 副鎖が本鎖よりも鎖長が短い請求項 2記載の製造方法。

4 . 一本鎖 DNAの相補鎖 MAの 5'末端のみがリン酸化されている二本鎖 DNAライブラリーを、一本鎖 DMを鎵型として、 RNase H、 DNAポリメラーゼ Iおよび DM リガーゼ存在下で形成する請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の製造方法。

5 . 対応付け分子 cDNAライブラリ一を構成する cDNAが、 5'末端にプロモータ —とェンハンサーを有する配列を含み、 3，末端にライゲーシヨンのァクセプ夕ー配列を含む請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の製造方法。

6 . プロモー夕一配列が SP6プロモータ一で、ェンハンサー配列がオメガ配列又はオメガ配列の一部であり、ァクセプ夕ー配列が 2〜1 0塩基のポリ A配列である請求項 5記載の製造方法。

7 . 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の製造方法により得られる対応付け分子 cDNAライブラリ一を転写することを含む、対応付け分子 RNAライブラリーの製造方法。

8 . 請求項 7に記載の製造方法により得られる対応付け分子 RNAライブラリ一を構成する対応付け分子 RNAの 3'末端にスぺーサーをライゲーシヨンすることを含む、対応付け分子ライゲーテッド RNAラィブラリ一の製造方法。

9 . スぺーサ一が、対応付け RNA分子にライゲ一シヨンする末端の反対の末端にピューロマイシン又はピュ一ロマイシン誘導体を有し、かつ、塩基配列で 10 -lOObp相当の長さを持ち、該スぺ一サ一は、該ピュ一ロマイシン又はピューロマイシン誘導体を介して、該対応付け分子ライゲ一テツド RNAライブラリ一のテンプレートから翻訳された蛋白質と連結するものである請求項 8記載の製造方法。

1 0 . 該スぺ一サ一が、該対応付け分子ライゲーテヅド RNAライブラリーから翻訳された蛋白質と連結しないものである請求項 8記載の製造方法。

1 1 . 請求項 7に記載の製造方法により得られる対応付け分子 RNAライブラリ一を無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリ一の製造方法。

1 2 . 請求項 8又は 9に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲ一テッド RNAライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。

1 3 . 請求項 8又は 1 0に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテツド RNAライブラリ一を無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライプラリーの製造方法。

1 . 請求項 7に記載の製造方法で得られる対応付け分子 RNAライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成する'ことを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。

1 5 . 請求項 8又は 9に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッド RNAライブラリーを細胞内で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライプラリ一の製造方法。

1 6 . 請求項 8又は 1 0に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテツド RNAライプラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。

1 7 . 該蛋白質を C末端ラベル化法で修飾することを含む、請求項 1 1、 1 3、 1 4又は 1 6に記載の製造方法。

1 8 . 核酸のライブラリ一と蛋白質との相互作用を解析する蛋白質と核酸の相互作用解析方法であって、ライプラリーが、請求項 1、 5、 7〜1 0のいずれか 1項に記載の製造方法で得られるライブラリ一である前記方法。

1 9 . 蛋白質のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリーが、請求項 1 7に記載の製造方法で得られるライブラリ一である前記方法。

2 0 . 対応付け分子のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライプラリーが、請求項 1 2又は 1 5に記載の製造方法で得られるライブラリ一である前記方法。

2 1 . 相互作用が共翻訳スクリーニング法により解析される、請求項 2 0記載の方法。

2 2 . ライプラリーのスクリーニングを含む進化分子工学による機能蛋白質の創製方法であって、ライブラリ一が、請求項 1 2又は 1 5に記載の製造方法により得られるライブラリ一である前記方法。

2 3 . 請求項 2 0に記載の蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、請求項 1 9又は 2 0に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。

' 2 4 . 請求項 2 1に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、請求項 1 9又は 2 0に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。

2 5 . 請求項 2 2に記載の該機能蛋白質の創製方法を行い、ついで、請求項 1 9又は 2 0に記載に記載の該蛋白質間相互作用解析を行うことを含む蛋白質の創製方法。