WO2004053126A1

WO2004053126A1 - 低温誘導発現ベクター

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Publication number: WO2004053126A1
Application number: PCT/JP2003/015835
Authority: WO
Inventors: Jun Tomono; Harumi Ueno; Masayuki Kishimoto; Hiroaki Sagawa; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2002-12-11
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2004-06-24
Also published as: AU2003289023A1; KR20050085190A; CN1748027A; EP1582587A4; TWI316091B; JPWO2004053126A1; AU2003289023B2; TW200510534A; US20060148033A1; US7244588B2; CN100379870C; EP1582587A1; CA2508808A1; ATE408692T1; EP1582587B1; DE60323678D1

Abstract

コールドショック蛋白質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコードする領域を有するベクターであって、前記５’非翻訳領域が、該領域が形成するステム構造の距離が変化するように変異を導入されたものであることを特徴とするベクター。

Description

明細書低温誘導発現ベクター技術分野

本発明は、遺伝子組換え技法において使用されるベクター、及び該ベクターを用いた蛋白質の発現方法に関する。背景技術

遺伝子組換え技術を用いた有用蛋白質の生産は、今日では広く用いられている技術である。中でも大腸菌を宿主とした発現系は最も一般的に用いられている発現系であり、多くの蛋白質が組換体によって生産されるようになってきた。これら組換体による有用蛋白質の生産には、 RNAポリメラーゼに認識されるプロモ一ター支配下に目的遺伝子を配置した、いわゆる発現ベクターを構築して用いるのが一般的である。発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、例えば大腸菌を宿主とする場合には、 l a c、 t r p、 t a c、 g a l, a r a等のプロモーター等が使用されている。また、これら大腸菌の RNAポリメラーゼに直接認識されるプロモーター以外のものを利用した発現ベクターとして、大腸菌に感染するバタテリ'オファージ T 7の RNAポリメラーゼに認、識されるプロモーターを利用した p ET—システム（ノバジェン（No v a g e n) 社製）（ジャーナルォブモレキュラーバイオロジー（J. Mo 1. B i o l. ) , 第 189卷、第 1 13〜 1 30頁（1986) 、ジーン（Ge n e) 、第 56卷、第 1 25〜 135頁（1987) 参照）がある。 p ET—システムの場合、 T 7 RNAポリメラーゼを大腸菌内で発現させ、この T 7 RNAポリメラーゼにより発現ベクター上の T 7プロモーター下流に配置された目的遺伝子の転写が行われ、更に宿主の翻訳システムによって目的蛋白質の合成が行われる。

し力しながら、 p ET—システムも含めた多くの大腸菌発現系で目的蛋白質が高レベルで発現された場合、目的蛋白質が不溶性の複合体、いわゆるインクルージョンボディとなり、活性型の目的蛋白質の量が非常に低くなる場合が多い。いくつかのポリべプチドでは、ィンクノレージョンボディを可溶化後リフォールディング操作を行って活性型ポリべプチドを得た例が報告されている力一般的にその回収量は低い場合が多く、また、各目的蛋白質ごとに適切なリフォールディング条件を検討する必要がある。そのため、活性型蛋白質を直接大腸菌内で発現させるシステムが求められていた。

インクルージョンボディの形成は、翻訳されたポリべプチド鎖が正しい立体構造にフォールディングする前の中間体の段階で、分子間相互作用により他のポリぺプチド鎖と絡み合レ、、巨大な不溶性の複合体となることによると考えられている。このような場合、組換体大腸菌の培養温度を通常用いられる 37°Cよりも低い温度（20〜30°C) で行うと活性型蛋白質の発現量が増加することが知られている。これは、リボソームによる翻訳の速度が遅くなることにより、中間体が正しい構造にフォールディングする時間的ゆとりが得られることと、低温条件下で細胞内蛋白質分解酵素の働きが遅くなり、発現された活性型蛋白質の安定性が増すためと推測されている。このように、インクルージョンボディとなる蛋白質の生産には、低温条件下で組換体大腸菌を培養する方法は有効な方法として注目されてきた。

一方、対数増殖期の大腸菌の培養温度を 37°Cから 10〜20°Cに低下させると大腸菌の増殖は一時的に止まり、その間にコールドショック蛋白質と呼ばれる一群の蛋白質の発現が誘導される。該蛋白質はその誘導レベルに応じて第 I群 (10倍以上）第 II群（10倍未満）に分けられ、第 I群の蛋白質としては、 C s pA、 C s pB、 C s pG、及び C s d Aなどが挙げられる（ジャーナルォブパクテリォロジ一（J. B a c t r i o 1. ) 、第 178卷、第 4919 〜4925頁（ 1996) 、ジャーナルォブバクテリオロジー（J. B a c t r i o 1. ) 、第 178卷、第 2994〜 2997頁（1996) 参照）。中でも C s pA (国際公開第 90Z09447号パンフレット参照）は、 37°C から 10°Cへの温度シフトの 1. 5時間後にその発現量は全菌体蛋白質の 13 % までに達することから（プロシーディングズォブザナショナルァカデミ一ォブサイエンシーズォブザ USA (P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA) 、第 87卷、第 283〜287頁（1990) 参照）、低温における組換え蛋白質の生産に c s p A遺伝子のプロモーターを利用することが試みられてきた。

c s p A遺伝子を用いた低温条件下での組換体蛋白質発現系は、上述のように該遺伝子のプロモーターが低温で高効率で転写を開始させること以外に、以下のような有効性が示されて、る。

(1) c s p A遺伝子から転写された翻訳可能な mRNAが機能を有する C s p A蛋白質をコードしていない場合、より具体的には、 C s pA蛋白質の N末端配列の一部のみをコードしている場合には、このような mRNAはコールドショック蛋白質も含めた他の大腸菌蛋白質の発現を長時間阻害し、その間は該 mRNA の翻訳が優先的に行われる（ジャーナルォブバタテリォロジ一（J. B a c t r i o 1. ) 、第 178卷、第 4919~4925頁（1996) 、国際公開第 98/27220号パンフレット参照）。この現象は LACE (low temperature-dependent antibiotic effect of truncated cspA expression ¾g 果と呼ばれている。

(2) c s p A遺伝子の開始コドンから 12塩基下流の位置には、 15塩基からなるダウンストリームボックス（downstream box) と呼ばれる配列があり、低温条件下での翻訳効率を高いものにしている。

(3) c s p A遺伝子 mRNAの転写開始点から開始コドンまでにある 159塩基からなる 5' 非翻訳領域は、 C s pAの発現に対して、 37 °Cでは負の、低温条件下では正の影響を与えている。

特に上記（1) の現象は、 c s pA遺伝子を利用して目的の蛋白質のみを特異的に発現させる可能性を示唆するものであり、高純度の組換え蛋白質生産、構造解析のための同位体標識された蛋白質の調製への応用が期待されている。

一方、該遺伝子のプロモーターの発現調節が不完全であり、その産物が宿主にとって有害であるような遺伝子の場合、発現ベクターを含有する大腸菌を誘導可能な状態まで培養するのが困難であったり、あるいは発現ベクターの構築すら不可能なこともあることが知られている（例えば、米国特許第 5654169号公報参照）。

このような問題を解決するとともに、遺伝子発現の効率をより向上させ、発現産物の取得を容易にする観点から、 c s p A遺伝子の 5 ' 非翻訳領域を使用した発現ベクターの改変が試みられている（国際公開第 9 9 / 2 7 1 1 7号パンフレット参照）。ここには、オペレーターを導入することにより発現制御を厳密にすること、 5，非翻訳領域に変異を導入して遺伝子発現量を向上させること等の改変が開示されている。発明の開示

上記のように低温条件下での蛋白質発現系は非常に有効なシステムと考えられており、さらに発現効率等について改善されることが望まれている。

本発明の目的は、 c s p遺伝子を利用した発現ベクターについて、例えばその遺伝子発現効率を向上させ、より優れた低温条件下での遺伝子発現系を構築することにある。

本発明者らは、かかる目的を達成するために c s p遺伝子由来の 5，非翻訳領域についてその塩基配列の改変を導入し、その効果の評価を行った。その結果、 5 ' 非翻訳領域部分の mR NAが形成するステム間の距離を調節することにより、その下流にコードされる蛋白質の発現量が上昇することを見出した。そして、この改変 5 ' 非翻訳領域をコードする D NAを含有するベクターを構築し、本発明を完成するに至った。

本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明はベクターに関し、コールドショツク蛋白質遺伝子 mR NA由来の 5 ' 非翻訳領域をコードする領域を有するベクタ一であって、前記 5 ' 非翻訳領域が、該領域が形成するステム構造の距離が変化するように変異を導入されたものであることを特徴とする。

第 1の発明において、 5 ' 非翻訳領域に導入される変異としては塩基の挿入若しくは欠失が例示される。特に好適な態様としては、配列表の配列番号 1に示される大腸菌 c s p A遺伝子中の塩基番号 5 9 3〜5 9 8に相当する領域に変異が導入されているベクターが挙げられる。

第 1の発明のベクターは、 5，非翻訳領域をコードする領域がさらにオペレーターを有していてもよい。このようなベクターの 5 ' 非翻訳領域の特に好適な例として配列表の配列番号 2、 3、 4に示される塩基配列の 5 ' 非翻訳領域が挙げられる。

また、第 1の発明のベクターは 5' 非翻訳領域をコードする領域の上流にプロモーターを有していてもよい。さらに、 5' 非翻訳領域をコードする領域の下流に、用いる宿主のリポソ一マル RNAのアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する塩基配列を有していてもよい。

第 1の発明のベクターは、例えばプラスミドベクターであってもよい。

本発明の第 2の発明は目的蛋白質の発現方法に関し、下記工程を包含することを特徴とする。

( 1 ) 目白質をコードする遺伝子を組込んだ第 1の発明のベクターで宿主を形質転換する工程、

(2) 得られた形質転換体を培養する工程、

(3) 培養温度を通常の温度より低下させて目的蛋白質を発現させる工程。

また、第 2の発明においては、工程 (3) と同時もしくはその後にプロモータ一を誘導してもよレ、。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明を具体的に説明する。

本明細書において「領域」とは核酸（DNA又はRNA) 上のある範囲を指す。また、本明細書に記載の「mRNAの 5，非翻訳領域」とは、 DN Aからの転写によって合成される mRNAのうち、その 5' 側に存在し、かつ蛋白質をコードしていない領域をいう。以降の本明細書においては該領域を「5， -UTR (5' -Untranlated Region) 」と記載することがある。なお、特に断らない限り 5' — UTRは大腸菌 c s pA遺伝子の mRNA、あるいはこれが改変されたものの 5' 非翻訳領域をさす。

本明細書において「コールドショック蛋白質遺伝子」とは、生物の生育温度を生理的な温度から低下させた際にその発現が誘導される蛋白質をコードする遺伝子を指す。

本発明に使用される、コーノレドショック蛋白質 mRNAの 5，一 UTRをコードする領域とは、当該遺伝子の mRNAの開始コドンよりも 5，側の部分をコードしている領域である。大腸菌のコールドショック蛋白質遺伝子（c s pA、 c s pB、 c s pG、 c s dA等）にはこの領域が特徴的に見出されており [J. Bactriol.、第 178卷、第 4919〜 4925頁（1996) 、 J. Bactriol.、第 1 78卷、第 2994〜2997頁（1996) ] 、これらの遺伝子から転写された mRNAのうちの 5' 末端より 100塩基以上の部分が蛋白質に翻訳されない。この領域は遺伝子発現の低答性に重要であり、任意の蛋白の mRNA の 5，末端にこの 5' 非翻訳領域を付加することにより、該 mRNAから蛋白質への翻訳が低温条件下で起こるようになる。

なお、本発明に使用される「mRNAの 5' 非翻訳領域」は上記の特定の遺伝子由来のものに限定されるものではなく、コールドショック蛋白質遺伝子に由来し、力 2以上のステム構造を形成しうる 5' 非翻訳領域を本発明に使用することができる。

本発明のベタターには上記に列記されたコールドショック蛋白質遺伝子由来の 5' —UTRをコードする領域を使用することができるが、特に大腸菌 c s pA 遺伝子由来のものが好適に使用できる。大腸菌 c s p A遺伝子の塩基配列は G e nB a n k 遺伝子データベースに受託番号 M 30139として登録、公開されている。この塩基配列を配列表の配列番号 1に示す。さらに、本発明にはその塩基配列を一部改変した 5' —UTRを使用することもでき、例えば国際公開第 9 9/271 17号パンフレツトに記載されたプラスミド pMMO 47、 pMMひ 48等に保持された c s p A遺伝子由来 5，一UTRをコードする領域を使用することができる。上記プラスミド pMMO 48に保持された大腸菌 c s pA遺伝子由来の 5' — UTRをコードする領域の塩基配列を配列番号 5に示す。当該配列は、本願実施例において使用されているプラスミド pCo 1 d 08NC2の保持している 5' —UTRをコードする領域の塩基配列と同一である。

本発明は、 5' — UTRが形成すると予想される二次構造において、ステム間の距離を調整するような変異を 5，一 UTRをコードする領域に導入することを特徴とする。例えば、ステム間に相当する部分に塩基を挿入する、若しくはこの部分の塩基の一部を欠失させることによりステム間の距離を広げる、あるいは狭めることができる。このような変異は、当該変異によって変異を導入していないものに比べてその下流に接続された遺伝子の発現量が上昇する限りにおいて、その導入位置、挿入、あるいは欠失される塩基の数には限定はない。また、当該変異としては、 5' —UTRの有している低温特異的な遺伝子発現を達成する能力を妨げないものが好ましいことは言うまでもない。

大腸菌 c s p A遺伝子由来の 5 ' — U T Rは、配列表の配列番号 1に示される塩基配列において、塩基番号 584〜 593、 598〜 608の領域でそれぞれステム構造を形成することが予想される。したがって、この間の領域（塩基番号 593〜598) 、若しくは変異を導入された 5' — UT Rにおける前記領域に相当する領域に塩基の挿入、若しくは欠失を導入することにより、ステム間の距離を調節することができる。なお、本発明は上記のステム間の距離の調節に限定されるものではない。

前記の欠失変異としては、ステム間の領域の 1塩基〜全塩基の欠失が本発明に包含される。また、揷入変異としては、 1〜100塩基、好ましくは 3〜60塩基、より好ましくは 8〜40塩基の挿入が例示される。

特に本発明を限定するものではないが、下記実施例に記載されたプラスミドべクタ一 p C o 1 d 08 s 2、 pCo l d 08 s l 2、 p C o 1 d 08 s 32に含まれる 5' —UTRは本発明の好適な態様として例示される。前記プラスミドべクターに含まれる 5 ' -UTRの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号 2、 3、 4に示す。

上記の、本発明により作製される、ステム間の距離が調節された 5' -UTR をコードする領域を使用し、本発明の発現ベクターを作製することができる。すなわち、出発材料となる、 5，一 UTRをコードする DNAについて、そこにコードされる m R N Aが形成する二次構造を推定し、ステム間に相当すると予想された位置に公知の手法により挿入または欠失変異を導入し、こうして得られた D NAを適切なプロモーターとともにベクターに組込み、作製すればよい。

本発明のベクターは、ベクターとしての目的を達成できるものであれば一般的に用いられるベクター、例えばプラスミド、ファージ、ウイス等のいずれであつてもよい。さらに、本発明のベクターは宿主に導入された後にはそのゲノム D Ν Α上に組込まれてもかまわない。前記の 5，一 UTRは、本発明のベクターにおいてはプロモーターと目的蛋白質をコードする領域との間に挿入される。本発明に使用されるプロモーターとしては、低温で高いプロモーター活性を有することが期待されるコールドショック蛋白質遺伝子由来のプロモーター、例えば c s pA、 c s p B、 c s pG、 c s d Aといった遺伝子由来のプロモーターが例示されるがこれらに限定されるものではなく、使用する宿主中で RN Aへの転写を開始する活性を有するものであればよい。大腸菌が宿主として用いられる場合には、 l a c、 t r p、 t a c, g a l、 a r a等のプロモーターを使用することができる。

また、本発明のベクターに含有される上記の構成要素以外の領域としては、例えば複製起点、選択マーカーとして使用される薬剤耐性遺伝子、オペレーター、ターミネータ一等の調節配列を有することができる。

前記オペレーターとしては種々の遺伝子の発現調節領域に存在するオペレータ一、例えば、大腸菌ラタトースォペロン由来の 1 a cオペレーターを本発明に使用することができる。 1 a cオペレータ一は適当な誘導物質、例えばラタトースやその構造類似体、特に好適にはィソプロピル一 β—D—チォガラクトシド（I PTG) の使用によってその機能を解除し、プロモーターを作用させることが可能である。このようなオペレーター配列は、通常、プロモーター下流の転写開始点付近に配置される。

本発明のベクターはさらに、オペレーターの機能に必要な調節遺伝子、例えば 1 a cオペレーターに対しては 1 a c I ^q遺伝子等を有していてもよい。

また、上記構成要素に加えて、用いる宿主のリボソ一マル RNAのアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する塩基配列を 5，非翻訳領域の下流に含有させることにより発現効率を上昇させることができる。例えば大腸菌の場合、 1 6 Sリボソ一マル RNAの 1 46 7— 148 1の位置にアンチダウンストリームボックス配列が存在し（Th e EMBO J o u r n a l、第 1 5卷、第 6 6 5〜 674頁（1 996) ) 、この配列と高い相補性を示す塩基配列を含有するコールドショック蛋白質の N末端べプチドをコードする領域を用いることができる。アンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する配列は、開始コドンから数えて 1〜 1 5塩基目程度のところから始まるように配置されると効果的である。目的蛋白質をコードする遺伝子は、該蛋白質がこれらの N末端ペプチドとの融合蛋白質として発現されるようにベクターに組込まれる力、あるいは、目的蛋白質をコードする遺伝子がアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有するように、部位特異的変異導入法により塩基置換が導入されることができる。目的蛋白質が融合蛋白質として発現されるようにベクターに組込まれている場合、該ぺプチドは目的蛋白質が活性を失わなレ、範囲で任意の長さのものであってよい。このような融合蛋白質発現用ベクターは、例えば適当なプロテアーゼによって該融合蛋白質から目的蛋白質を単離できるよう、その接続部分に工夫が施されたもの、精製あるいは検出に利用可能なペプチドと融合蛋白質として発現されるように工夫が施されたもの等であることができる。発現蛋白の精製に利用可能なポリペプチドとしては、特に限定するものではないが、例えばヒスチジン一タグ（H i s— T a g ) やダルタチオン一 S—トランスフェラーゼ（G S T) 等が例示される。

例えば、プラスミドとして構築された本発明のベクターを使用した目的蛋白質の発現は以下のような工程で実施される。本発明のプラスミドベクターに目的の蛋白質をコードする遺伝子をクローユングし、該プラスミドで適当な宿主を形質転換することにより、該蛋白質を発現させるための形質転換体を得ることができる。このような形質転換体は培養温度を低下させることにより、目的蛋白質を特異的に発現する。この際、オペレーターを保持するベクターの場合には、適切な手段で当該オペレータの機能を解除し、プロモーターを誘導してもよい。

本発明のベクターを使用した蛋白質の発現においては、前記の L A C E効果のために目的の蛋白質の翻訳が優先的に行われるため、従来の組換え蛋白質の発現に比較して培養物あたりの目的蛋白質の含量が高い。したがって高純度の目的蛋白質を調製することが可能である。さらに、適切な同位体の存在下に目的蛋白質の発現を実施して同位体標識された蛋白質を調製することができる。こうして得られた高純度の標識蛋白質は NMRによる構造解析に適しており、例えば培養物、もしくはその溶解物を直接 NMR解析に供することも可能である。

実施例

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については 1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行、 T. マニアテイス（T. Maniatis ) ら編集、モレキュラークローユング：ァラボラトリーマニュアル第 2版（Molecular Cloning ： A

Laboratory Manual 2nd ed. ) に記載の方法によった。更に、以下に示すプラスミドの構築には、特に記載のない限り大腸菌 JM 109を宿主とし、 50//g Z ralのアンピシリンを含む LB培地（トリプトン 1%、酵母エキス 0. 5%、 N a C 1 0. 5%、 pH7. 0) あるいは前記培地に 1. 5%の寒天を加え固化させた LB寒天培地を用いた。

参考例プラスミド _p C o 1 d 08NC 2の構築

国際公開第 99/271 17号パンフレツトの記載に基づき、 Escherichia coli JM109/p匪 047 (FERM BP- 6523) (平成 9年（1997年） 10月 31日 (原寄託日）に S本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 30 5— 8566) 、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託）に保持されたプラスミド pMMO 47を出発材料として pCo 1 d 08NC 2を構築した。プラスミド p C o 1 d 08 N c 2は、上流側より順番に 1 a cプ口モーター、改変された大腸菌 c s p A遺伝子由来 5' — UTR、マルチクローユングサイトを有するプラスミドである。また、当該プラスミドは、 1 a c I遺伝子、大腸菌 16 Sリポソ一マル RNA中に存在するアンチダウンストリーム配列に完全に相補的なダウンストリームボックス配列、 6個のヒスチジン残基からなるヒスチジンタグおよびファクター X aの認、識するァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列、をそれぞれ有している。

実施例 1 p Co l d 08 s 2べクターの構築及び蛋白質発現量の検討 (1) プラスミドベクター p C o 1 d 08 s 2の構築

下記の操作に従い、参考例 1記載のプラスミド p C o 1 d 08NC 2の 5，一 U TRをコードする領域に 20塩基の挿入変異を導入した。

プラスミド p C o 1 d 08 NC 2を铸型として、合成プライマー S p 20 F及びプライマー CS P t e r R (プライマー S p 20 F及び CS P t e r Rの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号 6、 7に示す）を用いて P C Rを行なった。 50 n gの pCo l d 08NC 2、 5 μ 1の Ex Ta q緩衝液、 8 // 1の<11^丁？混合液、 5 pmo 1のプライマー S p 20、 5 p m o 1のプライマー C S P t e rR、 0. 5/z lの Ta k a r a Ex Ta q (タカラバイオ社製）をカ卩え、滅菌水を加えて全量を 50 1とした。この反応液について 94 °C、 1分間（変性）、 55°C、 1分間（プライマ^"のアニーリング）、 72°C、 1分間（合成反応）を 1サイクルとする 30サイクルの PCRを実施した。この PCR反応液全量を 3% (wZv) 低融点ァガロース電気泳動を行なった後、約 300 b pの増幅 DN A断片をゲルより精製し、これを 5μ 1の滅菌水に懸濁して増幅断片 SC とした。

合成プライマー S p 2 OR及びプライマー Nh e F 2 (プライマー S p 2 OR 及び N h e F 2の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号 8、 9に示す）を用いて pCo 1 d 08を铸型とした P C Rを同様の条件で行なつた。この P C R反応液全量を 3% (w/v) 低融点ァガロース電気泳動を行なった後、約 150 b pの増幅 DN A断片をゲルより精製し、これを 5μ 1の滅菌水に懸濁して、増幅断片 SNとした。

このようにして得られた増幅断片 SCと SNのそれぞれ 1 μ 1に 5μ 1の Ε χ Ta q緩衝液、 5 μ 1の d Ν Τ Ρ混合液を加え、滅菌水を加えて全量を 50 μ 1 とした。その後 94°C、 10分間加熱し、 60分間かけて 37 °Cまで冷却し、さらに 37°Cで 15分間保温した。ここに 0. 5 1の丁& 1?: & 1： 3 Ex T a qを加えて、 72°Cで 3分間加熱した。

こうして得られた反応液にそれぞれ 5 pmo 1のプライマー Nh e F 2、プライマ一 CSP t e r R、 5 /z lの Ex T a q緩衝液、 5 // 1の01]^丁？混合液を加え、滅菌水を加えて全量を 100 μ 1とした。この反応液について 94°C、 1分間、 55°C、 1分間、 72°C、 2分間を 1サイクルとする 30サイクルの P CRを実施した。この PCR反応液全量を 3% (w/v) 低融点ァガロースで電気泳動した後、約 400 b pの増幅 DNA断片をゲノレより精製し、これを 5 // 1 の滅菌水に懸濁し、増幅断片 S p 20— 1とした。

S p 20— 1を制限酵素 Nh e I、 Ec oR I (ともにタカラバィォ社製）で 2重消化し、生成した DNA断片を 1%低融点ァガロース電気泳動で分離後、抽出精製した。この精製 D N A断片と N h e I及ぴ E c oR Iで消化した p C o 1 d 08を混合し、 DNAライゲーシヨンキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含む LB寒天培地上で生育させた。得られたコロニーからプラスミドを調製し、 DNAシークェンスを行ない、正しく PCR産物が挿入されたプラスミドを選択し、これを p C o 1 d 08 s 2と命名した。この〇0 1 (10852は、 p C o 1 d 08NC 2の 5'— UTR (配列表の配列番号 5、 1 a cオペレータ一中の転写開始点を + 1とした）の+120〜+12 1の間に 5，一 GAGCGGATAACAATTTCACA— 3'の塩基配列（配列番号 1 1) が挿入されている（なお、この位置は配列表の配列番号 1に示した c s p A遺伝子の塩基配列の塩基番号 597〜598間に相当する）。 p C o 1 d 08 s 2に含有されている 5.，一 UTRの塩基配列を配列番号 2に示す。

(2) 蛋白質発現用プラスミドの構築

( 2 ) - 1 プラスミドベクター p C o 1 d 08 s 2— GF Pの構築

ォワンクラゲ由来の GF P蛋白質をコードする遺伝子を下記の操作にしたがつて p Co 1 d 08 s 2に組み込んだ。プラスミド pQB I 63 (タカラバイオ社製）を铸型として、合成プライマー GFP— F及びプライマー GFP— R (ブラィマー G FP- F及び G F P _ Rの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号 11、 12に示す）を用いて PCRを行なった。 50 11 ₈の <381 63、 5 μ 1の E X Ta q緩衝液、 8 μ 1の dNTP混合液、それぞれ 5 pmo 1のプライマー GF P— F、プライマー GF P— R、 0. 5/z lの Ta k a r a Ex T a q

(タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を 5 Ομ 1とした。この反応液について 94°C、 1分間、 55°C、 1分間、 72°C、 1分間を 1サイクルとする 30サイクルの PC Rを実施した。この PC R反応液後の反応液全量を 3%

(w/v) 低融点ァガロース電気泳動を行なった後、約 700 b pの GFP遺伝子を含む増幅 D N A断片をゲルより精製し、これを 5 μ 1の滅菌水に懸濁した。この DNA断片を E c o R Iと Xb a I (タカラバイオ社製）で 2重消化し、 1%低融点ァガロース電気泳動で分離後、抽出精製した。精製した DN A断片と E c oR I及び Xb a Iで消化した p Co 1 d 08 s 2を混合し、 DNAライゲーシヨンキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含む LB寒天培地上で生育させた。得られたコロニーからプラスミドを調製し、 DNAシークェンスを行ない、正しく PCR産物が挿入されたプラスミドを選択し、これを p Co 1 d 08 s 2— GFPと命名した。また、同様にして 5， UTRへの挿入配列のない p C o 1 d 08NC 2に GF P遺伝子を含む増幅 DN A断片を組み込み p Co 1 d 08— GFPとした。

(2) -2 プラスミドベクター pC o 1 d 08 s 2-H296の構築

フイブロネクチン由来のへパリン結合ポリペプチドである H 296フラグメント蛋白質をコードする遺伝子を、下記の操作により pCo l d 08 s 2に組み込んだ。

米国特許第 5198423号に記載のプラスミド pCHl 02を铸型として、合成プライマー H 296— F及びプライマー H 296—R (プライマー H 296 -F及び H 296-Rの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号 13、 14に示す）を用いて PC Rを行なった。 50n gの pCH102、の Ex T a q緩衝液、 8 1の(1]^丁？混合液、それぞれ 5 pmo 1のプライマー H296 — F、プライマー H 296— R、 0. 5 1の Ta k a r a Ex T a qを加え、滅菌水を加えて全量を 5ひ/ z 1とした。この反応液について 94 °C、 1分間、 55°C、 1分間、 72°C、 1分間を 1サイクルとする 30サイクルの P C Rを実施した。この PC R反応液全量を 3% (w/v) 低融点ァガロース電気泳動を行なった後、約 1 k b pの増幅 DN A断片をゲルより精製し、これを 5μ 1の滅菌水に懸濁した。この DNA断片を Ec oR Iと B amHI (タカラバイオ社製）で 2重消化し、生成した DNA断片を 1 %低融点ァガロース電気泳動で分離後、抽出精製した。精製した H296遺伝子を含む DNA断片と E c oR I及び B a mH Iで消化した p Co 1 d 08 s 2を混合し、 DNAライゲーシヨンキット

(タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含む LB寒天培地上で生育させた。得られたコロニーからプラスミドを調製し、 DNAシ一クエンスを行ない、正しく PCR産物が挿入されたプラスミドを選択し、これを p C o l d 08 s 2-H296と命名した。また、同様にして 5，一 UT Rへの挿入配列のない p C o 1 d 08NC 2に H296遺伝子を含む增幅 DN A断片を組み込み p Co 1 d 08—H296とした。

(2) — 3 プラスミドベクター pC o 1 d 08 s 2— 1 a cの構築

i3—ガラクトシダーゼ（1 a c Z) 遺伝子を含むプラスミド pKMO 05 (1 98 3年、ニューヨークアカデミックプレス発行、井上正順編集、エタスぺリメンタルマニピュレーションォブジーンエクスプレッション、第 1 5〜3 2頁）を B amH I、 S a 1 I (タカラバイオ社製）で消化後、 1% (w/v) 低融点ァガロース電気泳動を行ない、 1 a c Z遺伝子を含む DNA断片をゲルより精製してこれを 5 At 1の滅菌水に懸濁した。この精製 DNA断片と B amH I 及び S a 1 Iで消化した p C o 1 d 08 s 2を混合し、 DNAライゲーシヨンキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液 1 0 μ 1を用いて大腸菌 JM1 09を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含む LB寒天培地上で生育させた。得られたコロニーからプラスミドを調製し、 DNAシークェンスを行ない、正しく PCR産物が挿入されたプラスミドを選択し、これを p C o I d 08 s 2- l a cと命名した。また、同様にして 5， — UTRへの揷入配列のない p C o l d 08NC 2に l a c Z遺伝子を含む増幅 DNA断片を組み込み p C o l d 08— l a cとした。

(3) 発現量の評価

(3) — 1 p C o l d 08 s 2—GFP、 pC o l d 08 s 2-H296を用いた発現量評価

実施例 1— (2) — 1及び (2) — 2で作製した p C o 1 d 08 s 2—GF P、 pC o 1 d 08 s 2-H296及び比較対照として p C o l d 08— GFP、 p C o 1 d 08— H296を用いて、大腸菌 B L 2 1 (ノバジェン社製）及び C L

83 [ジャーナノレォブバタテリォロジ一（ J . B a c t r i o 1. ) 、第 1 80巻、第 90〜95頁（1 998) ] を形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれ 50 μ g/ 1のアンピシリンを含む 2. 5m lの LB培地に接種し、 37°Cで一晚振とう培養した。この培養液をそれぞれ 3m 1の同じ培地に 1% (v/v) ずつ植菌して 37 °Cで振とう培養し、濁度が OD 600 nm=0. 2 に達した時点で、培養温度を 15°Cに下げて 15分間保温した。その後、終濃度 ImMになるように I PTGを加え、そのまま培養温度を 15 °Cに保ち 24時間振とう培養した。濁度 (OD600 nm) を測定した後、 2 m 1分の菌体を遠心分離により集め、 Ι Ο Ομ 1の菌体懸濁溶液（50mM トリス塩酸緩衝液、 H7. 5、 15 OmM塩化ナトリウム）に懸濁した。前記の濁度から算出して約 3. 75 X 10⁶個の菌数分に相当する懸濁液をそれぞれ 10%SDSポリアクリルアミド電気泳動に供し、ゲルを CBB (クマジ一ブリリアントブルー）により染色した後、脱色を行なった（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動は、生物化学実験のてびき 2 (化学同人社）に従った）。このゲルについて To t a 1 La b v e r. 1. 11 (No n l i n e a r Dy n ami c s杜 ) による画像解析を行い、 GFP、 H296それぞれの発現量を定量した。この結果より得られた、 p C o 1 d 08 s 2— GF P、 p C o 1 d 08 s 2-H296 を保持する組み換え体による各蛋白質発現量を、それぞれ 5 'U T Rへの挿入のない pCo l d 08— GFP、 pCo 1 dO 8-H296のものに対する倍率として表 1に示した。表 1

プラスミド宿主発現倍率 * p C o 1 d 08 s 2— GF P B L 21 1. 5倍

CL 83 2. 0倍 p C o 1 d 08 s 2-H296 B L 21 1. 5倍

C L 83 1. 5倍

*発現倍率：画像解析の結果から算出される pC o l d 08 s 2クローン体の発現量 C o 1 d 08クローン体の発現量表 1に示したように、 SDSポリアクリルアミドゲノ析の結果、 5'UTR に 20塩基の挿入を持つ p C o 1 d 08 s 2をベクターを用いて作製されたク口ーン体は、 pCo 1 d 08 NC 2のものを上回る発現量を有していた。

(3) -2 _PCo l d 08 s 2- l a cを用いた発現量評価

実施例 1_ (2) — 3で作製した p Co 1 d 08 s 2- 1 a c及び比較対照として pCo l d 08— l a cを用いて、大腸菌 B L 21及び C L 83を形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれ 50 μ g/mlのアンピシリンを含む 2. 5m 1の LB培地に接種し、 37 °Cで一晚振とう培養した。この培養液をそれぞれ 3mlの同じ培地に 1% (v/v) ずつ植菌して 37 °Cで振とう培養し、濁度が OD600 nm=0. 2に達した時点で一部サンプリングした後、培養温度を 15°Cに下げて 15分間保温した。その後、終濃度 ImMになるように I PTG を加えて発現を誘導し、そのまま培養を 15 °cに保ちさらに培養した。これら誘導直前の 37 °C培養液及ひ導後 3時間後、 24時間後にサンプリングされた培養液を試料として 1972年、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行、 J. H. ミラー（J. H. Mi 1 1 e r) 著、ェクスペリメンッインモレキュラージエネテイクス、第 352〜355頁に記載の方法で ]3— ガラクトシダーゼ活性の測定を行ない、その結果を表 2に示した。表 2 ]3—ガラクトシダーゼ活性（ユニット）

プラスミド宿主誘導 3時間後誘導 24時間後 pCold08-lac BL21 10110 49510 85550

CL83 6971 28514 31504

pCold08s2-lac BL21 9151 66314 119770

CL83 5172 56028 72459 表 2に示したように、誘導 24時間後において、 5'UTRに 20塩基の挿入を持つ Co l d08 s 2- l a cを保持する形質転換体は、 p C o 1 d 08— 1 a cを保持するものの 1· 4倍（宿主： BL21) 、 2. 3倍（宿主： CL8 3) の )3—ガラクトシダーゼ活性を有していた。

実施例 2 pCo l d 08 s l 2、 pCo l d 08 s 32ベクターの構築及び蛋白質発現量の検討

(1) プラスミドベクター p C o 1 d 08 s 12ベクターの構築

プライマー S p 20 F及びプライマー C S P t e r Rにかえて、プライマ一 S p 12 F、プライマー S p 12 R (プライマー S p 12 F及び S p 12 Rの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号 15、 16に示す）をそれぞれ使用した他は、上記の実施例 1— (1) の操作に従い、参考例 1記載のプラスミド p Co 1 d 0 8NC2の 5， — UTRをコードする領域に 12塩基の挿入変異が導入されたプラスミド、 pC o 1 d 08 s 12を構築した。

この p C o l d 08 s l 2は、 pCo l d 08Nc 2の 5，一 UTR (配列表の配列番号 5) の + 120〜十 121の間に 5，一 ATGTTTTGTAGA— 3，（配列番号 17) の塩基配列が挿入されている。 pCo l d 08 s l 2に含有されている 5，一 UTRの塩基配列を配列番号 3に示す。

(2) プラスミドベクター p Co 1 d 08 s 32ベクタ一の構築

プライマー S p 20 F及びプライマー S P 20 Rにかえて、プライマー S 3

2 F、プライマー S p 32 R (プライマー S p 32 F及び S p 32 Rの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号 18、 19に示す）をそれぞれ使用した他は、上記の実施例 1一（1) の操作に従い、参考例 1記載のプラスミド pCo l d08N

C 2の 5' — UTRをコードする領域に 32塩基の挿入変異が導入されたプラスミド、 pCo l d 08 s 32を構築した。

この pCo l d 08 s 32は、 pCo l d 08Nc 2の 5，一 UTR (配列表の配列番号 5) の + 120〜"^ h 121の間に 5，一ATGTTTTGTAGAT TTGAAAGAGTAGATTAGTA— 3' (配列番号 20) の塩基配列が挿入されている。 p C o 1 d 08 s 32に含有されている 5，一 UTRの塩基配列を配列番号 5に示す。

(3) プラスミドベクター p Co 1 d 08 s 12— H296、 p C o 1 d 08 s

32— H296の構築

実施例 1— (2) — 1に記載の操作により、 H 296遺伝子を含む約 1 k b p の DN A断片を調製して E c o R Iと B amH Iで 2重消化し、 1 %低融点ァガロース電気泳動で分離後、抽出精製した。この精製 DNA断片と E c o R I及び B a mH Iで消化した p C o 1 d 08 s 12または p C o 1 d 08 s 32を混合し、 DNAライゲーシヨンキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。このライグーション反応液を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含む L B寒天培地上で生育させた。得られたコロニーからブラスミドを調製し、 DNAシークェンスを行ない、正しく PC R産物が挿入されたプラスミドを選択し、これらをそれぞれ P Co l d 08 s l 2 -H296、 p C o 1 d 08 s 32 -H 296と命名した。 (4) pCo 1 d 08 s 12— H296、 p C o 1 d 08 s 32— H 296を用いた発現量の評価

( 3 ) で作製した pCo l d08 s l 2— H296、 pCo l d 08 s 32- H296及び比較対照として pCo 1 d 08-H296を用いて、大腸菌 BL2 1及び C L 83を形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれ 50 μ g 1 のアンピシリンを含む 2. 5m 1の LB培地に接種し、 37 °Cでー晚振とう培養した。この培養液をそれぞれ 3mlの同じ培地に 1% (v/v) ずつ植菌して 3 7°Cで振とう培養し、濁度が OD600 nm=0. 2に達した時点で、培養温度を 15°Cに下げて 15分間保温した。その後、終濃度 1 mMになるように I P T Gを加え、そのまま培養温度を 15°Cに保ち 24時間振とう培養した。こうして得られた培養液について、実施例 1— (3) _1に記載の操作により各組換え体における H 296の発現量を定量した。この結果より得られた、 pCo l d 08 s l 2— H296、 pCo l d 08 s 32-H296を保持する組み換え体による各蛋白質発現量を、 5，UTRへの挿入のない p C o 1 d 08— H296のものに対する倍率として表 3に示した。表 3

プラスミド宿主発現倍率 * pCo l d 08 s l 2-H296 B L 21 1. 3倍

C L 83 1. 5倍 pCo l d 08 s 32-H296 B L 21 1. 4倍

C L 83 1. 8倍

C o 1 d s 32クローン体の発現量/ p C o 1 d 08クローン体の発現量

SDSポリアクリルアミドゲノ析の結果、 5，一 UTR中に 12、 32塩基を揷入したベクターでは、挿入していないものに比べ発現量が上昇することが判明した。産業上の利用の可能性

本発明により、低温条件において高い発現効率を示す発現べクターが提供される。該ベクターを用いることにより、目的の蛋白質を特異的に発現させ、高純度の蛋白質標品を調製することができる。また該べクターを利用して低温条件下で蛋白質発現を行うことにより、活性を保持した蛋白質を効率よく得ることが可能となる。配列表フリーテキスト

SEQ ID NO: 2 Modified 5' Untranslated Region of cspA Gene

SEQ ID NO: 3 Modified 5' Untranslated Region of cspA Gene

SEQ ID NO :4 Modified 5' Untranslated Region of cspA Gene

SEQ ID NO : 5 Modified 5' Untranslated Region of cspA Gene

SEQ ID NO :6 Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO : 7 Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO :8 Synthetic Primer for PCR

SEQ ID N0:9 Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO: 10 ： Synthetic Nucleotide inserted into 5' Untranslated Region of cspA Gene

SEQ ID NO: 11 ： Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO: 12 ： Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO: 13 ： Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO: 14 ： Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO: 15 ： Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO: 16 ： Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO: 17 ： Synthetic Nucleotide inserted into 5' Untranslated Region of cspA Gene

SEQ ID NO: 18 ： Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO: 19 ： Synthetic Primer for PCR

SEQ ID NO : 20 ： Synthetic Nucleotide inserted into 5' Untranslated Region of cspA Gene

Claims

請求の範囲

1. コールドショック蛋白質遺伝子 mRN A由来の 5' 非翻訳領域をコードする領域を有するベクターであって、前記 5，非翻訳領域が、該領域が形成するステム構造の距離が変化するように変異を導入されたものであることを特徴とするベタター。

2. 導入された変異が、塩基の挿入若しくは欠失である請求項 1記載のベクタ

3. 配列表の配列番号 1中の塩基番号 593〜 598に相当する領域に変異が導入されている請求項 1または 2記載のベクター。

4. 5' 非翻訳領域をコードする領域がさらにオペレーターを有している請求項 1〜 3 、ずれか 1項に記載のベタタ一。

5. 配列表の配列番号 2、 3、 4のいずれかで示される塩基配列の 5 ' 非翻訳領域をコ一ドする領域を有している請求項 4記載のベクター。

6. 5' 非翻訳領域をコードする領域の上流にプロモーターを有している請求項 1〜 5レ、ずれか 1項に記載のベタタ一。

7. 5，非翻訳領域をコードする領域の下流に、用いる宿主のリボソ一マル R

NAのアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する塩基配列を有している請求項 1〜 6いずれか 1項に記載のベクター。

8. プラスミドベクターである請求項 1〜 7いずれか 1項に記載のベクター。

9. 下記工程を包含することを特徴とする目的蛋白質の発現方法：

( 1 ) 目的蛋白質をコードする遺伝子を組込んだ請求項 1〜 8いずれか 1項に記載のべクタ一で宿主を形質転換する工程、

(2) 得られた形質転換体を培養する工程、

10. 工程（3) と同時もしくはその後にプロモーターを誘導することを特徴とする請求項 9記載の目的蛋白質の発現方法。