WO2004042058A2 - Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren - Google Patents

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WO2004042058A2
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Timo Hillebrand
Peter Bendzko
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InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the invention relates to novel formulations of buffers for the isolation, purification and recovery of long- and short-chain nucleic acids.
  • the areas of application of the method are all laboratories dealing with nucleic acid isolation, such as forensic medicine, food diagnostics, medical diagnostics, molecular biology, biochemistry, genetic engineering and all other adjacent areas.
  • DNA is isolated from cells and tissues by digesting the starting nucleic acid fractions under strongly denaturing and reducing conditions, sometimes also using protein-degrading enzymes
  • Phenol / chloroform extraction steps are purified and the nucleic acids are obtained from the aqueous phase by dialysis or ethanol precipitation (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning").
  • kits are based on the well-known principle of binding nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different chaotropic salts and use as suspension materials suspensions of finely ground glass powder (e.g. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), diatomaceous earth (Fa. Sigma ) or silica gel. (Diagen, DE 41 39 664 AI).
  • a method for isolating nucleic acids which is practicable for a large number of different applications is shown in US Pat. No. 5,234,809 (Boom).
  • a method for isolating nucleic acids from nucleic acid-containing starting materials by incubating the starting material with a chaotropic buffer and a DNA-binding solid phase is described there.
  • the chaotropic buffers implement both the lysis of the starting material and the binding of the nucleic acids to the solid phase.
  • the method is well suited for isolating nucleic acids from small sample amounts and is particularly useful in the area of isolating viral nucleic acids.
  • the physico-chemical principle of the commercially available systems for the isolation of nucleic acids based on the binding of nucleic acids to the surfaces of mineral supports which are used according to the known state of the art, is said to consist in the disruption of superordinate structures of the aqueous environment by which the nucleic acids on the surface of mineral materials, especially glass or. Adsorb silica particles.
  • the disturbance of the superordinate structures of the aqueous environment always occurs in the presence of chaotropic ions and is almost quantitative at high concentrations.
  • all commercially available systems for isolating nucleic acids contain buffer compositions with high ionic strengths of chaotropic salts, for the binding of nucleic acids to a nucleic acid binding solid phase.
  • chaotropic salt solutions eg guanidine isothiocyanate, guandine hydrochloride, sodium perchlorate or sodium iodide
  • Chaotropic salts are highly toxic substances.
  • the method (like the chaotropic methods) is based on the lysis of the starting material, the binding of the nucleic acid to a mineral carrier material, the subsequent washing of the bound nucleic acids with washing buffers containing ethanol, the removal of ethanol and the final elution of the nucleic acids with an elution buffer of low ionic strength or Water.
  • the lysis step is not required for special protocols, for example the isolation of PCR fragments from amplification batches.
  • a necessary binding buffer is added to the PCR reaction mixture and incubated with the mineral carrier material. This is followed by washing again with an ethanol-containing washing buffer, followed by ethanol removal and finally the elution of the bound nucleic acid from the carrier material.
  • the step of removing residual alcohol is particularly problematic in applications for
  • the essence of the invention lies in the simultaneous use of mono- and multi-, preferably divalent, cations for the binding of the nucleic acids to the solid phase.
  • Na + , K + and NH 4 + in the form of the corresponding salts are preferably used as monovalent cations.
  • Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ and Mn 2+ in the form of the corresponding salts are preferably used as divalent cations.
  • a particularly preferred embodiment is the combined use of Na + and Mg 2+ .
  • the mono- and multi-, preferably divalent, cations can be used in a wide variety of proportions.
  • the success occurs in the wide range of mono: divalent cations in a molar ratio of 9: 1 to 1: 9.
  • Combinations of 7: 3 to 3: 7 and 6: 4 to 4: 6 are preferred, and the embodiment with the same (1: 1) or almost the same molar amounts of mono- and divalent cations is particularly preferred.
  • the total cation concentration in the solution before binding to the solid phase is preferably ⁇ 0.5 M.
  • nucleic acids are in a solution that already contains mono- or divalent cations, e.g. B. after a previous lysis of different starting materials, then the existing amount of cations is taken into account when setting the optimal cation concentration according to the invention. If the lysis buffer contains divalent cations that are contained in the solution after lysis, only the required amount of monovalent cations is added (and vice versa).
  • washing buffers used according to the invention contain no alcoholic component, as in all other methods of the prior art.
  • the use of the buffer formulations according to the invention enables the purification of PCR products from a complex PCR reaction batch for a subsequent sensitive sequencing reaction and without a single washing step in the form of an automated application (binding of the PCR products to the filter membrane of a 96-well plate ) in less than 10 min.
  • Previous Methods based on the binding of the nucleic acid to a solid phase require approx. 45 min-1h.
  • the procedure is now extremely simple and only includes mixing the PCR mixture with one of the binding buffers according to the invention, transferring the mixture to the feed plate, sucking through the solution and subsequently eluting the PCR products with water or with a 10 mM Tris buffered aqueous solution.
  • PCR products can be cleaned extremely quickly, safely and inexpensively.
  • the throughput can be increased dramatically (even if equipment costs decrease; e.g. a washing tool is no longer required for a robot).
  • the quality of the purified PCR products is very high, which is shown by the clean sequence reactions (example 2).
  • nucleic acids can also be isolated from complex biological samples in excellent quality and quantity without washing steps or by means of a washing buffer without alcohol.
  • the isolation of a plasmid DNA described in DE 100 33 991 in an example without a washing step was not carried out from the previously prepared, clarified lysate.
  • the plasmid DNA to be isolated was first prepared in pure form using known standard methods and this plasmid DNA was incubated again with a buffer, bound to a solid phase and subsequently detached from the solid phase after the necessary removal of the alcohol of the binding buffer.
  • the present invention it is now possible to purify plasmid DNA directly from the clarified lysate, again no washing with an alcohol-containing washing buffer is necessary or the plasmid DNA can also be isolated without a washing step directly after binding to a solid phase.
  • the plasmid DNA is again of excellent quality and quantity (exemplary embodiment 3).
  • the invention also makes it possible to isolate genomic nucleic acids from complex biological samples extremely quickly, inexpensively and simply. For example, only a standard digestion of the starting material is carried out using, for example, a classic protease K digest in a compatible buffer, then the lysed sample is mixed with one of the non-chaotropic binding buffers according to the invention and the mixture is incubated with a nucleic acid-binding solid phase, possibly with a non-alcoholic washing buffer washed (or possibly without a washing step) and subsequently the genomic nucleic acid isolated from the solid phase using water or a Tris solution. The quality of the isolated DNA is again very high and can be used immediately for other applications.
  • Another variant of the present invention results from the observation that the pH of the binding buffer used has a significant influence on both the yield of the nucleic acids to be obtained and a selectivity towards the fragment lengths of e.g. PCR products to be purified. It is not necessary to combine mono- and multivalent salts in one solution. Divalent and particularly preferably Mg or Ca salts are preferably used.
  • the pH value of the binding buffer exclude small PCR products from isolation.
  • surprising effects can be seen from the combination of salt and alcohol in the binding buffer in connection with the choice of pH.
  • the alcoholic component in the binding buffer causes a selectivity with regard to the size fractionation of DNA fragments.
  • a reduction in the pH of the binding buffer tends to reduce the yield from smaller DNA fragments to complete inhibition of recovery. This is particularly important when heterogeneous sample mixtures are available.
  • the pH is adjusted to 5-9.5 and particularly preferably to 8-9.5, 6.5-8 or 5-6.5. This makes it possible to record certain fragment sizes, ie certain fragment sizes are not recovered. It should be pointed out here that the formulation “no recovery” is not to be understood as absolute, ie traces of nucleic acid fragments could always be recovered unspecifically. In the case of binding buffers without alcohol, DNA fragments are recovered in quantitative amounts and over the size range 100 bp bis 10,000 bp preferably at a pH of> 8.5.
  • the present invention through the combination of the salt component and alcohol component and the modification of the pH, enables binding buffers to be developed which allow selective recovery of certain nucleic acid fragments to enable heterogeneous initial samples. The present invention thus enables, in universal form, a significant simplification of methods for isolating nucleic acids from complexes containing the nucleic acid samples.
  • the process no longer requires toxic chemicals, the amounts of salts used are dramatically reduced, which leads to a significant relief for the environment, the processes require fewer process steps and are therefore significantly faster than all the previously used techniques. In particular in high throughput, inexpensive and extremely fast processes are now available.
  • the composition of the buffer formulations can also be used to achieve selective size fractionation of DNA fragments to be recovered.
  • Buffer TH 1 (5 mM NaCl; 5 mM MgCl 2 / Tris HCl, isopropanol)
  • Buffer TH 2 (10 mM MgCl 2 / Tris HCl, isopropanol)
  • Buffer TH 3 (10 mM NaCl / Tris HCl, isopropanol)
  • the buffer THl is a combination of a monovalent and a divalent salt with a total ion strength of 10 mM.
  • the buffers TH2 and TH3 each contain only one salt (with a monovalent cation or with a divalent cation) at a total strength of 10 mM.
  • 130 ⁇ l of the respective buffers were mixed with an aqueous solution of 50 ⁇ l containing a commercial DNA ladder (from FERMENTAS) and the mixture was transferred to a centrifugation column with a glass fiber flow. The mixture was then centrifuged at 10,000 rpm for 1 min and the centrifugation column was transferred to a new reaction vessel.
  • the bound fragments are eluted by adding 30 ⁇ l of a 10 mM Tris-HCl solution and subsequent centrifugation for 1 min. The total time for isolating the DNA fragments was therefore only about 2 minutes.
  • the eluates obtained were applied to a 1.2% agarose gel and separated electrophoretically. As can be clearly seen in the electrophoretic representation, the DNA fragments can only be recovered efficiently with the combination buffer. In contrast, the binding buffers, each containing only one salt, show only very little binding mediation. (Illustration 1)
  • 3 samples were mixed with 800 ⁇ l of a washing buffer without alcohol (10 mM NaCl / 10 mM MgCl 2 / Tris HCl) and centrifuged for 1 min and then the plasmid DNA was eluted from the column with 10 mM Tris-HCl and 3 samples were treated with 70% Washed ethanol, then the ethanol removed and the plasmid DNA again eluted by adding 10 mM Tris HCl.
  • a washing buffer without alcohol 10 mM NaCl / 10 mM MgCl 2 / Tris HCl
  • the table below illustrates the preparation time required, the quality and quantity of the isolated plasmid DNA.
  • Binding buffer each containing 50 mM MgCl 2 and optionally 20% isopropanol as well as 100 mM Tris HCl with varying pH values.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Formulierungen von Puffern zur Isolierung, Reinigung und Rückgewinnung von lang- und kurzkettigen Nukleinsäuren. Die Anwendungsgebiete des Verfahrens sind alle mit Nukleinsäure-Isolierungen sich beschäftigenden Laboratorien, wie forensische Medizin, Lebensmitteldiagnostik, medizinische Diagnostik, Molekularbiologie, Biochemie, Gentechnik und alle anderen angrenzenden Gebiete. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Nukleinsäure enthaltende Lösung mit Zusätzen so einstellt, dass sie monovalente und multivalente Kationen sowie einen Alkohol und ggf. weitere Zusätze enthält, sie danach mit der festen Phase in Kontakt bringt, den Träger anschliessend ggf. wäscht und die Nukleinsäure von der festen Phase löst oder dass sie multivalente und/oder monovalente Kationen, ggf einen Alkohol und ggf. weitere Zusätze enthält und ein bestimmter pH-Wert zwischen 7 und 10 eingestellt wird. Als monovalente Salzkomponente wird Ammoniumchlorid, Natriumchlorid und/oder Kaliumchlorid verwendet. Als multivalente Salzkomponente wird Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Zinkchlorid und/oder Manganchlorid, verwendet. Eine besonders bevorzugte Variante ist der Einsatz gleicher molarer Mengen von Natriumchlorid und Magnesiumchlorid.

Description

Neuartige Pufferformulierungen zur Isolierung, Reinigung und Rückgewinnung lang- und kurzkettiger Nukleinsäuren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neuartige Formulierungen von Puffern zur Isolierung, Reinigung und Rückgewinnung von lang- und kurzkettigen Nukleinsäuren.
Die Anwendungsgebiete des Verfahrens sind alle mit Nukleinsäure-Isolierungen sich beschäftigenden Laboratorien, wie forensische Medizin, Lebensmitteldiagnostik, medizinische Diagnostik, Molekularbiologie, Biochemie, Gentechnik und alle anderen angrenzenden Gebiete.
Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Nukleinsäurefraktionen über
Phenol-/Chloroform-Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wäßrigen Phase gewonnen werden (Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ).
Diese "klassischen Verfahren" zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h ), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.
Verschiedene alternative Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen Ausgangsmaterialien ermöglichen, die aufwendige und gesundheitsschädigende Phenol-/Chloroform-Extraktion von Nukleinsäuren zu umgehen sowie eine Reduzierung der zeitlichen Aufwendungen zu erreichen.
Alle diese Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1979, 76, 615-619) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA- Bande enthaltende Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HC1 [pH 7,2]; 200mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und abschließend von den Trägerpartikeln abgelöst.
Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften angewendet (Marko, M.A., Chipperfield, R. und Birnboim, H.G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382-387).
Darüber hinaus existieren heute weltweit auch eine Vielzahl von Reagenziensystemen vor allem zur Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen und für die Isolierung von Plasmid DNA aus bakteriellen Lysaten, aber auch für die Isolierung von längerkettigen Nukleinsäuren (genomische DNA, zelluläre Gesamt- RNS) aus Blut, Geweben oder auch Zellkulturen.
Alle diese kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen feingemahlener Glaspulver (z.B. Glasmilk , BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa.Sigma) oder auch Silicagele. (Diagen, DE 41 39 664 AI).
Ein für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen praktikables Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in US 5,234,809 (Boom) dargestellt. Dort ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch die Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA-bindenden festen Phase beschrieben. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials wie auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet , um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung.
Entscheidende Nachteile des Verfahrens bestehen aber u.a. darin, dass der durch die chaotropen Puffer realisierte Aufschluss nicht für alle Materialien einsetzbar ist bzw. auch für größere Mengen an Ausgangsmaterialien nur extrem ineffizient und unter einem großen Zeitaufwand realisiert werden kann. Darüber hinaus sind mechanische Homogenisierungsverfahren notwendig, wenn z.B. DNA aus Gewebeproben isoliert werden soll. Weiterhin müssen für verschiedene Fragestellungen auch immer verschieden hohe Konzentrationen unterschiedlicher chaotroper Puffer eingesetzt werden. Das Verfahren ist damit in keiner Weise universell einsetzbar.
Das physiko-chemische Prinzip der nach dem bekannten Stand der Technik heute eingesetzten und kommerziell verfügbaren Systeme zur Isolierung von Nukleinsäuren auf der Basis der Bindung von Nukleinsäuren an die Oberflächen mineralischer Träger soll dabei in der Störung übergeordneter Strukturen des wässerigen Millieus bestehen, durch welche die Nukleinsäuren an der Oberfläche von mineralischen Materialien, insbesondere von Glas-bzw. Silicapartikeln adsorbieren. Die Störung der übergeordneten Strukturen des wässerigen Millieus erfolgt dabei immer unter Anwesenheit chaotroper Ionen und ist bei hohen Konzentrationen dieser fast quantitativ. Auf dieser beschriebenenen physiko-chemischen Basis enthalten alle kommerziell verfügbaren Systeme zur Isolierung von Nukleinsäuren Pufferkompositionen mit hohen Ionenstärken chaotroper Salze, für die Bindung von Nukleinsäuren an eine Nukleinsäurenbindende feste Phase.
Spezifische Modifikationen dieser Verfahren betreffen den Einsatz von spezifischen Trägermaterialien, welche für bestimmte Fragestellungen applikative Vorteile zeigen (Invitek GmbH WO 95/34569), die jedoch die gleichen Nachteile aufweisen.
All den beschriebenen Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren über die Bindung der Nukleinsäuren an mineralische feste Phase unter Verwendung chaotroper Salzlösungen ist gemeinsam, dass für die Bindung der Nukleinsäuren an die verwendeten Trägermaterialien hohe Konzentrationen eingesetzt werden müssen. Dabei sind gerade chaotrope Salze (z.B. Guanidinisothiocyanat, Guandinhydrochlorid, Natriumperchlorat oder Natriumjodid) hochtoxisch wirksame Substanzen. Die Verwendung findenden Puffersysteme mit sehr hohen Ionenstärken bewirken oftmals ein Verschleppen von Salzkontaminationen in die zu isolierenden Nukleinsäuren und sind oftmals die Ursache dafür, dass eine Reihe von down- stream-Applikationen (PCR, Restriktionsverdau, Hybridisierungen, Ligationen) nicht oder nur teilweise realisierbar sind. Darüber hinaus besteht beim Umgang mit chaotropen Puffern ein erhebliches gesundheitliches Risko (insbesondere bei Langzeitanwendungen) sowie eine erhebliche Umweltbelastung durch in Abwasser eingebrachte Schadstofflasten. In der Patentschrift DE 198 56 064 wird zum erstenmal ein neuartiges Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren beschrieben. Dabei erfolgt erstmals die Bindung der zu isolierenden Nukleinsäuren an mineralische Träger ohne die Verwendung der bisher dazu benötigten chaotropen Salze hoher Ionenstärken. Das Verfahren basiert (wie auch die chaotropen Verfahren) auf der Lyse des Ausgangsmaterials, der Bindung der Nukleinsäure an ein mineralisches Trägermaterial, dem nachfolgenden Waschen der gebundenen Nukleinsäuren mit ethanolhaltigen Waschpuffern, der Ethanolentfernung und der finalen Elution der Nukleinsäuren mit einem Elutionspuffer geringer Ionenstärke bzw. Wasser. Für spezielle Protokolle z.B. der Isolierung von PCR-Fragmenten aus Amplifikationsansätzen wird der Lyseschritt nicht benötigt. Der PCR-Reaktionsansatz wird mit einem notwendigen Bindungspuffer versetzt und mit dem mineralischen Trägermaterial inkubiert. Anschließend erfolgt wieder ein Waschen mit einem ethanolhaltigen Waschpuffer, nachfolgend die Ethanolentfernung und final die Elution der gebundenen Nukleinsäure vom Trägermaterial. Daß Verfahren ohne die Verwendung chaotroper Puffer deutliche Vorteile besitzen, zeigt sich daran, dass nach der Erstbeschreibung weitere Patentschriften auch die potenziellen Vorteile dieser neuen Bindungschemie beschreiben (z.B. DE 100 33 991).
Interessanterweise zeigt sich, dass alle weltweit kommerziell verfügbaren System zur Isolierung von Nukleinsäuren basierend auf der Bindung der Nukleinsäuren an mineralische Trägermaterialien (Magnetpartikel, Membranen, Carrier-Suspensionen u.a.) prinzipiell nach dem beschriebenen Verfahren arbeiten. Seit der Erstbeschreibung durch Vogelstein und Gillespie werden die gebundenen Nukleinsäuren immer mit Alkohol oder acetonhaltigen Salzlösungen gewaschen. Die Waschschritte sind essentieller Bestandteil der Extraktionsprotokolle und dienen neben der Entfernung von gebundenen unerwünschten inhibitorischen Stoffen immer auch der notwendigen Entfernung der für die Bindung der Nukleinsäuren notwendigen Salze.
Die Verwendung von Alkohol oder acetonhaltigem Waschpuffer bedeutet aber immer einen ganz erheblichen und bisher nicht gelösten Nachteil. Es ist bekannt, das selbst Spuren von Alkohol in der finalen Nukleinsäure downstream- Applikationen ganz erheblich beeinträchtigen kann. Deshalb ist es immer notwendig, einen Ethanolentfernungsschrirt im eigentlichen Verfahren zur Isolierung oder Aufreinigung von Nukleinsäuren zu integrieren. Dieser ist immer problematisch bei der Verwendung magnetischer Partikel oder partikulärer Carrier-Suspensionen, beansprucht einen erheblichen zeitlichen Aufwand und kann zu einem irreversiblen Verlust der Nukleinsäure führen, vor allem bei der Übertrocknung der Carrier-
Materialien.
Besonders problematisch ist der Schritt der Entfernung von Restalkohl bei Applikationen zur
Isolierung von Nukleinsäuren im Hochdurchsatzbereich.
Im Allgemeinen werden bis zu 30 min benötigt, um Membranen in Filterplatten oder magnetische Partikel im Rahmen von automatisierten Nukleinsäure-Reinigungsverfahren vom
Restalkohol zu befreien.
Darüber hinaus sind auch die eigentlichen Waschschritte mit alkoholischen Waschpuffern gerade im Hochdurchsatzbereich zeitaufwendig und natürlich auch kostenintensiv.
Aus diesen Nachteilen des bisherigen Standes leitet sich die Aufgabe ab, den Einsatz alkoholischer Komponenten zu vermeiden und damit eine erhebliche Verkürzung der Isolierungs- und Reinigungsverfahren zu erreichen.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert
Basierend auf der Verwendung nichtchaotroper Pufferformulierungen, wie in der Patentschrift DE 198 56 064 schon aufgeführt, zeigt sich, dass für die Bindung zu isolierender Nukleinsäuren nur unerwartet geringe Konzentrationen notwendig sind.
Der Kernpunkt der Erfindung liegt im gleichzeitigen Einsatz von mono- und von multi-, bevorzugt divalenten Kationen für die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase.
Als monovalente Kationen werden bevorzugt Na+, K+ und NH4 + in Form der entsprechenden Salze eingesetzt. Als divalente Kationen werden bevorzugt Mg2+, Ca2+, Zn2+ und Mn2+ in Form der entsprechenden Salze eingesetzt. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist der kombinierte Einsatz vom Na+ und Mg2+.
Die mono- und multi-, bevorzugt divalenten Kationen können gemäß der Erfindung in den unterschiedlichsten Mengenverhältnissen eingesetzt werden. Der Erfolg tritt im breiten Bereich von mono-:divalenten Kationen im molaren Verhältnis von 9:1 bis 1:9 ein. Bevorzugt sind Kombinationen von 7:3 bis 3:7 und 6:4 bis 4:6, besonders bevorzugt ist die Ausführungsform mit gleichen (1:1) bzw. nahezu gleichen molaren Mengen von mono- und divalenten Kationen. Die Gesamt-Kationenkonzentration in der Lösung vor der Bindung an die feste Phase ist bevorzugt < 0,5 M.
Wenn die Nukleinsäuren in einer Lösung vorliegen, die bereits mono- oder divalente Kationen enthält, z. B. nach einer vorangegangenen Lyse unterschiedlichster Ausgangsmaterialien, dann wird die vorhandene Menge der Kationen bei der Einstellung der gemäß der Erfindung optimalen Kationenkonzentration berücksichtigt. Wenn also der Lysepuffer divalente Kationen enthält, die nach der Lyse in der Lösung enthalten sind, wird nur noch die benötigte Menge monovalenter Kationen zugesetzt (und umgekehrt).
Ein besonders wichtiges Merkmal der Erfindung ist auch, dass die gemäß der Erfindung verwendeten Waschpuffer keine alkoholische Komponente enthalten, wie bei allen anderen Verfahren des Standes der Technik.
Überraschend ist dabei, dass bei der Kombination von Salzen eines monovalenten mit einem multivalenten Kation die für eine Bindung notwendigen Konzentrationen in einem Bereich liegen, in den Pufferformulierungen bestehend nur aus jeweils einem Salz nicht mehr für die Bindung ausreichend sind. So ermöglicht die Kombination von Magnesiumchlorid und Natriumchlorid noch bei Mengen von weniger als jeweils 5 mM jeweils die Bindung von Nukleinsäuren eines weiteren Größenspektrums (Beispiel 1). Die Verwendung der Mischung von Salzen monovalenter mit multivalenten Kationen als Bestandteile von Bindungspuffern für die Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger ist bisher noch nicht beschrieben. Das überraschende Ergebnis ermöglicht nunmehr eine völlig neue Strategie zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus komplexen Ausgangsproben. Da überraschenderweise nur noch extrem geringe Salzkonzentrationen in Bindungspuffern notwendig sind, wird es möglich, Nukleinsäuren aus komplexen Proben oder aus Lösungen, welche eine Vielzahl an zu entfernenden Stoffen enthalten, mit neuartigen Waschpuffern ohne das bisher notwendige Ethanol bzw. auch gänzlich ohne einen Waschschritt zu isolieren.
Dies hat enorme Vorteile für die Isolierung von Nukleinsäuren und löst die geschilderten Probleme der Verwendung von alkoholhaltigen Waschpuffern insbesondere bei automatisierten Hochdurchsatzanwendungen in idealster Weise. So ermöglicht die Verwendung der erfindungsgemäßen Pufferformulierungen z.B. die Aufreinigung von PCR-Produkten aus einem komplexen PCR-Reaktionsansatz für eine nachfolgende empfindliche Sequenzierungsreaktion und ohne einen einzigen Waschschritt in Form einer automatisierten Applikation (Bindung der PCR-Produkte an die Filtermembran einer 96-Well-Platte) in weniger als 10 min. Bisherige Verfahren auf der Basis der Bindung der Nukleinsäure an eine feste Phase benötigen ca. 45 min - lh. Darüber hinaus ist der Verfahrensablauf nunmehr extrem einfach und beinhaltet lediglich das Mischen des PCR-Ansatzes mit einem der erfindungsgemäßen Bindungspuffer, das Überführen des Ansatzes auf die Füterplatte, das Durchsaugen der Lösung und die nachfolgend Elution der PCR-Produkte mittels Wasser bzw. mittels einer 10 mM Tris gepufferten wässrigen Lösung. Damit können PCR-Produkte extrem zeitsparend, ungefährlich und preiswert aufgereinigt werden. Der Durchsatz kann dabei dramatisch erhöht werden (auch bei sinkendem apparativen Aufwand; z.B.wird kein Wasch-Tool mehr bei einem Roboter benötigt). Die Qualität der aufgereinigten PCR-Produkte ist sehr hoch, was sich an den sauberen Sequenzreaktionen zeigt (Beispiel 2).
Weiterhin zeigt sich überraschender Weise, dass man Nukleinsäuren auch aus komplexen biologischen Proben in exzellenter Qualitiät und Quantität auch ohne Waschschritte oder mittels eines Waschpuffers ohne Alkohol isolieren kann. Die in der Offenlegungschrift DE 100 33 991 in einem Beispiel beschriebene Isolierung einer Plasmid DNA ohne einen Waschschritt erfolgte nicht aus dem zuvor hergestellten, geklärten Lysat. Die zu isolierende Plasmid-DNA wurde mittels bekannter Standardverfahren erst in reiner Form hergestellt und diese Plasmid-DNA nochmals mit einem Puffer inkubiert, an eine feste Phase gebunden und nachfolgend nach der notwendigen Entfernung des Alkohols des Bindungspuffers wieder von der festen Phase abgelöst.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es nunmehr möglich, Plasmid-DNA direkt aus dem geklärten Lysat aufzureinigen wobei wiederum kein Waschen mit einem alkohohaltigen Waschpuffer notwendig ist bzw. die Isolierung der Plasmid DNA auch ohne Waschschritt direkt nach der erfolgten Bindung an eine feste Phase erfolgen kann. Die Plasmid DNA ist dabei wiederum von exzellenter Qualität und Quantität (Ausfuhrungsbeispiel 3).
Die Erfindung gestattet es weiterhin, auch extrem schnell, preiswert und einfach genomische Nukleinsäuren aus komplexen biologischen Proben zu isolieren. So wird lediglich ein Standardaufschluß des Ausgangsmaterials mittels z.B. eines klassischen Protease K-Verdaus in einem dafür kompatiblen Puffer durchgeführt, anschließend die lysierte Probe mit einem der erfindungsgemäßen nichtchaotropen Bindungspuffer versetzt und der Ansatz mit einer Nukleinsäure bindenden festen Phase inkubiert, ggf. mit einem nichtalkoholischen Waschpuffer gewaschen (oder ggf. ohne einen Waschschritt) und nachfolgend die genomische Nukleinsäure mittels Wasser oder einer Tris-Lösung von der festen Phase isoliert. Die Qualität der isolierten DNA ist wiederum sehr hoch, sie ist sofort für weitere Applikationen einsetzbar.
Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung ergibt sich aus der Beobachtung, dass der pH- Wert der verwendeten Bindungspuffer von wesentlichen Einfluss auf sowohl die Ausbeute an den zu gewinnenden Nukleinsäuren ist als auch eine Selektivität gegenüber den Fragmentlängen von z.B. aufzureinigenden PCR-Produkten besitzt. Dabei ist es nicht notwendig mono- und multivalente Salze in einer Lösung mit einander zu kombinieren. Bevorzugt werden divalente und besonders bevorzugt Mg- oder Ca-salze verwendet.
Dies ermöglicht es, über die Wahl des pH- Wertes des Bindungspuffers z.B. kleine PCR- Produkte von der Isolierung auszuschließen. Darüber hinaus zeigt sich auch, das über die Kombination von Salz und Alkohol im Bindungspuffer im Zusammenhang mit der Wahl des pH-Wertes überraschende Effekte sichtbar werden. Die alkoholische Komponente im Bindungspuffer bewirkt eine Selektivität im Hinblick auf die Größenfraktionierung von DNA- Fragmenten. Tendenziell bewirkt eine Reduktion des pH- Wertes des Bindungspuffers eine Reduzierung der Ausbeute von kleineren DNA-Fragmenten bis hin zur kompletten Inhibition der Rückgewinnung. Dies ist besonders dann bedeutsam, wenn heterogene Probengemische vorliegen.
So kann bei pH- Werten >8 eine fast quantitative Rückgewinnung von DNA-Fragmenten eines breiten Größenspektrums (100 bp bis 10 000 bp) mit Bindungspuffern erreicht werden, wenn der Bindungspuffer eine alkoholische Komponente enthält.
Bei Bindungspuffern mit Alkohol wird der pH- Wert auf 5-9,5 und besonders bevorzugt auf 8- 9,5, 6,5-8 bzw. 5-6,5 eingestellt. Damit ist die Erfassung bestimmter Fragmentgrößen möglich, d.h. bestimmte Fragmentgrößen werden nicht zurückgewonnen. Es sei hier darauf verwiesen, dass die Formulierung „keine Rückgewinnung" sich nicht als absolut versteht, d.h. Spuren an Nukleinsäurefragmente immer unspezifisch zurückgewonnen werden könnten. Bei Bindungspuffern ohne Alkohol erfolgt eine Rückgewinnung von DNA-Fragmenten in quantitativen Mengen und über das Größenspektrum 100 bp bis 10 000 bp bevorzugt bei einem pH- Wert von >8,5. Letztlich ermöglicht die vorliegende Erfindung über die Kombination der Salzkomponenten und Alkoholkomponente sowie die Modifizierung des pH-Wertes, Bindungspuffer zu entwickeln, welche es erlauben, eine selektive Rückgewinnung von bestimmten Nukleinsäurefragmenten aus heterogenen Ausgangsproben zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit in universeller Form eine deutliche Vereinfachung von Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Komplexen die nukleinsäureenthaltenden Proben.
Das Verfahren benötigt keine toxischen Chemikalien mehr, die eingesetzten Mengen an Salzen sind dramatisch reduziert, was zu einer deutlichen Umweltentlastung führt, die Verfahren benötigen weniger Verfahrensschritte und sind dadurch deutlich schneller als alle bisher verwendeten Techniken. Insbesondere im Hochdurchsatz stehen nunmehr preiswerte und extrem schnelle Verfahren zur Verfugung. Über die Zusammensetzung der Pufferformulierungen kann darüber hinaus eine selektive Größenfraktionierung von zurückzugewinnenden DNA-Fragmenten erreicht werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erklärt. Die Ausführungsbeispiele sollen aber keine Limitierung der Erfindung darstellen.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1:
Aufreinigung eines Spektrums an DNA-Fragmenten aus einer wässrigen Lösung . Vergleich verschiedener Bindungspuffer hinsichtlich der Bindungseffizienz.
Puffer TH 1(5 mM NaCl; 5 mM MgCl2/Tris HCl, Isopropanol) Puffer TH 2 (10 mM MgCl2/Tris HCl, Isopropanol) Puffer TH 3 (10 mM NaCl/Tris HCl, Isopropanol)
Der Puffer THl ist eine Kombination aus einem monovalenten und einem divalenten Salz bei einer Gesamtionenstärke von 10 mM. Die Puffer TH2 und TH3 enthalten nur jeweils ein Salz (mit einem monovalenten Kation bzw. mit einem divalenten Kation) bei einer Gsamtionenstärke von 10 mM. 130 μl der jeweiligen Puffer wurden mit einer eine kommerzielle DNA-Leiter (Fa. FERMENTAS) enthaltenen wässrigen Lösung von 50 μl gemischt und der Ansatz auf eine Zentrifugationssäule mit einem Glasfaserfließ überführt. Anschließend wurde 1 min bei 10 000 rpm zentrifugiert und die Zentrifugationssäule in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die Elution der gebundenen Fragmente erfolgt durch die Zugabe von 30 μl einer 10 mM Tris-HCl-Lösung und nachfolgender Zentrifugation für 1 min. Die Gesamtzeit der Isolierung der DNA-Fragmente betrug damit nur ca. 2 min. Die erhaltenen Eluate wurden auf ein 1,2 % Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Wie in der elektrophoretischen Darstellung deutlich zu sehen ist, erfolgt eine effiziente Rückgewinnung der DNA-Fragmente nur mit dem Kombinationspuffer. Die jeweils nur ein Salz enthaltenen Bindungspuffer dagegen zeigen nur noch eine sehr geringe Bindungsvermittlung. (Abbildung 1)
Beispiel 2:
Aufreinigung von PCR-Produkten aus einem komplexen PCR-Reaktionsansatz und nachfolgende
Verwendung der aufgereinigten PCR-Produkte für eine DNA-Sequenzierung.
50 μl PCR-Reaktionsansätze wurden mit 130μl Bindungspuffer THl und TH4 (50 mM NaCl; 50 mM MgCl2 /Tris HCl, Isopropanol) versetzt, nachfolgend auf eine Zentrifugationssäule mit Glasfaserfließ überführt, für 1 Minute zentrifugiert und abschließend die DNA wieder mittels 10 mM Tris HCl von der Säule eruiert. Die isolierten PCR-Produkte wurden dann für die Sequenzierung eingesetzt. Die Sequenzierungsergebnisse belegen, dass ohne die Verwendung von bisher notwendigen Waschschritten alle störenden Komponenten effizient entfernt wurden und eine hochreine DNA vorliegt. (Abbildungen 2-5)
Beispiel 3:
Isolierung von Plasmid DNA aus bakteriellen Lysaten. Vergleich der Reinheit der isolierten Plasmid DNA bei unterschiedlichen Waschbedingungen bzw. ohne einen Waschschritt.
2 ml einer bakteriellen Übernachtkultur (XL-1 mit Plasmid pGEM) wurden zentrifugiert und das Pellet mit 200 μl Solution I (Tris, EDTA, Rnase A) resuspendiert. Danach erfolgte die Zugabe von 200 μl Solution II (SDS/NaOH). Die Reaktionsgefäße wurden mehrmals kurz vorsichtig geschüttelt. Nachfolgend erfolgte die Zugabe 200 μl einer Solution III (250 mM MgCl/Tris HCl). Die Reaktionsgefäße wurden kurz und vorsichtig geschüttelt und für 5 min bei Maximalgeschwindigkeit zenrifugiert. Der geklärte Überstand wurde mit 100 μl Isopropanol gemischt und auf eine Zentrifugationssäule mit einem Glasfaserfließ gegeben und für 1 min zentrifugiert. Nachfolgend wurden jeweils 3 Proben sofort mit 10 mM Tris versetzt (kein waschen),
3 Proben wurden mit 800 μl eines Waschpuffers ohne Alkohol (lOmM NaCl/lOmM MgCl2/Tris HCl) versetzt und für 1 min zentrifugiert und nachfolgend die Plasmid-DNA mit 10 mM Tris-HCl von der Säule eluiert und 3 Proben wurden mit 70%igem Ethanol gewaschen, nachfolgend der Ethanol entfernt und die Plasmid DNA wiederum durch Zugabe von 10 mM Tris HCl eluiert.
Die nachfolgende Tabelle illustriert die notwendige Präparationszeit, die Qualität und Quantität der isolierte Plasmid DNA.
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Beispiel 4:
Aufreinigung eines Spektrums an DNA-Fragmenten aus einer wässrigen Lösung . Vergleich verschiedener Bindungspuffer hinsichtlich der Bindungseffizienz in Abhängigkeit vom pH- Wert des Bindungspuffers.
50 μl einer wässrigen Lösung, enthaltend 2 μg DNA Ladder (Fermentas) wurden mit 130μl Bindungspuffer (R1-R8) ersetzt, nachfolgend auf eine Zentrifugationssäule mit Glasfaserfließ überführt, für 1 Minute zentrifugiert und abschließend die DNA wieder mittels 10 mM Tris HCl von der Säule eluiert. Die isolierten DNA-Fragmente wurden dann gelelktrophoretisch aufgetrennt. (Abbildung 6)
Bindungspuffer: enthaltend jeweils 50 mM MgCl2 und optional 20% Isopropanol sowie 100 mM Tris HCl mit variierenden pH- Werten.
R1+ (pH 6,5/ mit Isopropanol) Rl (pH 6,5/ ohne Isopropanol) R2+ (pH 7,0/ mit Isopropanol) R2 (pH 7,0/ ohne Isopropanol R3+ (pH 7,5/ mit Isopropanol) R3 (pH 7,5/ ohne Isopropanol R4+ (pH 8,0/ mit Isopropanol) R4 (pH 8,0/ ohne Isopropanol R5+ (pH 8,5/ mit Isopropanol) R5 (pH 8,5/ ohne Isopropanol R6+ (pH 9,0/ mit Isopropanol) R6 (pH 9,0/ ohne Isopropanol R7+ (pH 9,5/ mit Isopropanol) R7 (pH 9,5/ ohne Isopropanol R8+ (pH 10,0/ mit Isopropanol) R8 (pH 10,0/ ohne Isopropanol

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Lösung durch Bindung an eine feste Phase, dadurch gekennzeichnet, dass man die Nukleinsäure enthaltende Lösung mit Zusätzen so einstellt, dass sie monovalente und multivalente Kationen sowie einen Alkohol und ggf. weitere Zusätze enthält, sie danach mit der festen Phase in Kontakt bringt, den Träger anschließend ggf. wäscht und die Nukleinsäure von der festen Phase löst oder dass sie multivalente und/oder monovalente Kationen, ggf einen Alkohol und ggf. weitere Zusätze enthält und ein bestimmter pH- Wert zwischen 5 und 10 eingestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als monovalente Salzkomponente Ammoniumchlorid, Natriumchlorid und/oder Kaliumchlorid verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als multivalente Salzkomponente Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Zinkchlorid und/oder Manganchlorid, verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als monovalente Salzkomponente Natriumchlorid und als multivalente Salzkomponente Magnesiumchlorid verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die monovalente und die multivalente Salzkomponente im molaren Mengenverhältnis 9:1 bis 1:9 verwendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die monovalente und die multivalente Salzkomponente im molaren Mengenverhältnis 7:3 bis 3:7 verwendet werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die monovalente und die multivalente Salzkomponente im molaren Mengenverhältnis 6:4 bis 4:6 verwendet werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die monovalente und die multivalente Salzkomponente im molaren Mengenverhältnis 1:1 bis nahezu 1:1 verwendet werden.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Salzkomponenten Natriumchlorid und Magnesiumchlorid im molaren Verhältnis 1 : 1 verwendet werden.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Endkonzentration der Salzkomponenten in der Lösung > 5mMol beträgt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Alkohol Ethanol oder Isopropanol verwendet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als weitere Zusätze Tris-HCl oder Polyvinylpyrrolidon verwendet werden.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase alle Trägermaterialien eingesetzt werden, die bei der Isolierung mit chaotropen Reagenzien Anwendung finden.
14 Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Trägermaterialien Glasfaservliese, Silicamembranen, oder Membranen, die funktioneile Gruppen tragen, die Glasfaservliesen oder Silicamembranen entsprechen, eingesetzt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phasen Suspensionen aus SiO2, Aerosilen oder magnetisierten Silikapartikeln eingesetzt werden.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Waschpuffer Lösungen von monovalenten und multivalenten Salzkomponenten mit geringerer Ionenstärke, als für die vorhergehende Bindung notwendig war, ohne alkoholische Komponente eingesetzt werden.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Elutionspuffer Wasser oder Wasser mit Tris-HCl-Zusatz verwendet wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als multivalente Kationen divalente Kationen verwendet werden.
19. Verfahren nach Anspruch 1 und 18, dadurch gekennzeichnet, dass als multivalente Kationen Mg2+-, Ca2+-, Zn2+- oder Mn2+-salze verwendet werden.
20. Verfahren nach Anspruch 1 und 18, dadurch gekennzeichnet, dass als monovalente Kationen NH4 +-, Na+- oder K+-salze verwendet werden.
21. Verfahren nach Anspruch 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Endkonzentration der Salzkomponenten in der Lösung > 5mMol beträgt.
22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Alkohol Ethanol, Isopropanol und/oder Polyethylenglykole unterschiedlicher Molekulargewichte verwendet werden.
23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH- Wert des Bindungspuffers mit Tris-HCl eingestellt wird.
24. Verfahren nach Anspruch 1 und 23, dadurch gekennzeichnet, dass der pH- Wert des Bindungspuffers ohne Alkoholzusatz auf 8,5 - 9,5 eingestellt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 1 und 23, dadurch gekennzeichnet, dass der pH- Wert des Bindungspuffers mit Alkoholzusatz auf 5 - 9,5 eingestellt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 1, 23 und 24, dadurch gekennzeichnet, dass der pH- Wert des Bindungspuffers mit Alkoholzusatz auf 8 - 9,5 eingestellt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 1, 23 und 24, dadurch gekennzeichnet, dass der pH- Wert des Bindungspuffers mit Alkoholzusatz auf 6,5 - 8 eingestellt wird.
28. Verfahren nach Anspruch 1, 23 und 24, dadurch gekennzeichnet, dass der pH- Wert des Bindungspuffers mit Alkoholzusatz auf 5 - 6,5 eingestellt wird.
29. Testkit zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien enthaltend eine wässerige Lösung, die monovalente und/oder multivalente Kationen enthält, ggf einen Alkohol, ggf. weitere Zusätze zur Einstellung des pH- Wertes eine feste Phase, bevorzugt als fester Bestandteil von Zentrifugenröhrchen, 96
Well- oder 384 Well Filtrationsplatten,
Wasch- und Elutionspuffer
30. Testkit zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien enthaltend eine wässerige Lösung, die monovalente und multivalente, bevorzugt divalente,
Kationen enthält, eine feste Phase, bevorzugt als fester Bestandteil von Zentrifugenröhrchen, 96
Well- oder 384 Well Filtrationsplatten,
Wasch- und Elutionspuffer ohne Alkoholzusatz.
31. Testkit nach Anspruch 29 und 30, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase Glasfaservliese, Glasmembranen, Siliciumträger oder Aerosile sind.
32. Testkit nach Anspruch 29, 30 und 31, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase lose Schüttungen, bevorzugt SiO2, gefällte Kieselsäure, pyrogene Kieselsäure oder magnetische Silicapartikel eingesetzt werden.
33. Testkit nach Anspruch 29 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase Membranen mit funktionellen Gruppen verwendet werden.
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