CN102834518B - 改进的从磁性玻璃颗粒中的核酸回收 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种使用能够结合核酸的固相，例如磁性玻璃颗粒分离核酸的方法，其中通过乙烯胺化合物的存在增强核酸与固相的结合。本发明还包括用于分离核酸的包含乙烯胺化合物的反应混合物和用于实施所述方法的试剂盒。

Description

改进的从磁性玻璃颗粒中的核酸回收
发明领域
本发明涉及分离核酸的领域，和具体地使用固体支持物分离核酸的领域。
背景技术
分离核酸是分子诊断学中的重要步骤。从样品中分离的核酸的质量和数量大大影响了下游诊断应用的成功。临床和野外应用也要求分离程序迅速且能够自动化。
存在很多程序用于从多种生物和组织中分离核酸。 一些类型的临床和环境样品对核酸的成功分离提出了特别的挑战。例如，某些组织例如骨含有在可以评估核酸以前需要去除的大量细胞外材料。一些生物，例如真菌、植物和细菌具有需要剧烈化学处理的细胞壁或外膜。在剧烈处理中使用的试剂对利用分离的核酸的下游应用造成挑战。此外，在剧烈处理期间的靶核酸的降解可导致下游检测测定中的假阴性结果。但是为了临床上可接受的，诊断程序必须具有足够的灵敏度，即避免在患者样品中的假阴性结果。因此在分子诊断学领域中，需要改进分离核酸的方法，从而使诊断程序灵敏、可信和易于操作。
成功的基于核酸的诊断试验的先决条件是分离没有降解的、无抑制剂的核酸。同时，需要简单、易于自动化的核酸分离程序。最近开始流行使用固体支持物，例如球形微粒分离核酸。特别流行的是含有或覆盖玻璃样物质的磁性微粒，通常被称为“磁性玻璃颗粒”或“MGP”。 使用MGP的核酸分离程序需要相对少的步骤和易于自动化。特别流行的是通过在欧洲公开EP 1 154 443或美国专利6,255,477和6,870,047中描述的溶胶-凝胶法（sol-gel）制备的MGP。
通过溶胶-凝胶法制备的MGP的一般描述和具体实例可在文献中容易地获得 (见例如EP 1 154 443)。这些MGP由覆盖基于二氧化硅的玻璃样材料的铁磁核心组成。铁磁核心一般包含铁氧化物，例如Fe3O4或Fe2O3。核心可为简单的铁核心，或可由复合材料组成。核心也可由结晶的、陶瓷或玻璃样结构组成，其中包埋氧化铁。玻璃涂层可由含氧化硅的无定形材料组成，并可还包含一种或多种另外的金属氧化物例如氧化硼 (B2O3)，氧化铝(Al2O3)，氧化钙 (CaO)，氧化钡 (BaO)，氧化钾 (K2O)，氧化钠(Na2O)，氧化酶 (MgO)或氧化铅(Pb2O3)。在一些实施方案中，玻璃是硅氧化物并也包含在以下浓度范围中的一种或多种化合物：B2O3 (0-30%)，Al2O3 (0-20%)，CaO (0-20%)，BaO (0-10%)，K2O (0-20%)，Na2O (0-20%)，MgO (0-18%)，Pb2O3 (0-15%)。玻璃可也包含小百分比 (0-5%)的若干其他氧化物例如Mn2O3，TiO2，As2O3，Fe2O3，CuO和CoO。 已证明，由硼硅玻璃组合物组成的表面特别有效。硼硅玻璃具有超过25%的氧化硼含量，例如70/30的SiO2/B2O3组成。
有时候用便于核酸结合的官能团修饰磁性颗粒。这样的基团包括（不限于）用于捕获含多聚A的核酸的多聚T寡核苷酸，用于捕获生物素标记的核酸的链霉抗生物素，和用于捕获包含与探针互补的唯一序列的核酸的特定探针序列。 但是，最常用的是具有未修饰表面的磁性颗粒，其能够分离在样品中存在的任意核酸，不管其序列。
使用MGP的一般的核酸分离方案从破坏细胞或组织以释放核酸开始。通常使用的组织破坏程序是化学、酶或物理性质的，包括超声、高压、剪切力、强碱、去垢剂或离液剂、蛋白酶或脂酶。用于化学和酶裂解，裂解试剂一般包括缓冲剂、盐、一种或多种变性物质和离液物质、蛋白酶和任选地核酸酶抑制剂和防腐剂。裂解试剂导致蛋白质的降解，核酸酶的抑制和脂、脂蛋白等的增溶。例如，缓冲剂可为Tris，盐可为钠、钾、铵或镁盐，例如氯化物或醋酸盐，去垢剂可为十二烷基硫酸钠、Triton-X或Tween，离液剂可为尿素、硫脲、亚碘酸钠、十二烷基硫酸钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍或亚氯酸胍，核酸酶抑制剂可为螯合剂例如EDTA，防腐剂可为金属叠氮化物，和蛋白酶可为蛋白酶K。通常，在70至100˚C之间的温度，例如，90 - 95˚C下孵育样品和裂解试剂。
对大多数样品，上面描述的裂解试剂和条件足以获得细胞的裂解和将核酸释放到溶液中。不幸的是，对一些样品类型，裂解造成了主要挑战。一些细胞、生物和组织需要剧烈的裂解条件以破坏细胞壁或组织和释放细胞内含物。例如，革兰氏阳性病原体例如结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）具有富含脂类的肽聚糖细胞壁。检测结核分支杆菌和其他分支杆菌的快速方法是世界范围内的需要。然而，核酸分离经常是达到测定灵敏度期望水平的限制因素。见Neonakis 等人 (2008) Molecular diagnostic tools in mycobacteriology，J. Microbiol. Methods，75:111。目前，在分支杆菌检测测定中的期望灵敏度是通过包括重复洗涤和离心步骤的多步骤核酸分离程序得到。见Shamputa 等人 (2004) Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimens，APMIS ，122:728。然而这样的程序不可自动化，且对大多数使用者不实用。
在使用MGP分离核酸的一般方法中，在样品中的细胞区室已被破碎以释放核酸后，使样品与MGP接触以实现核酸与MGP的结合。可在裂解前将MGP加入样品。例如，MGP可存在于将加入初始样品的容器中。已经发现，MGP的存在不影响样品的裂解。可选地，可首先裂解样品，并仅在裂解步骤完成后引入MGP。
为了实现与MGP的结合，一般将样品与MGP混合并在此结合混合物中孵育足够的时间使结合发生。通过在不同时点测定固定在磁性玻璃颗粒表面上的核酸量，或通过在不同的孵育时间后测定核酸产量，可容易地最优化此步骤。一般，10秒至30分钟之间的孵育时间对核酸是合适的。
在大多数情况下，包含释放的核酸的裂解试剂是适于MGP结合发生的环境。然而，在有些情况下，裂解试剂使环境不适于核酸结合至磁性玻璃颗粒的表面。特别是当磁性玻璃颗粒具有未修饰的表面时，核酸和颗粒表面之间的结合依赖于例如结合混合物的pH和离子强度的条件。已经发现，核酸与MGP的最大结合发生在低pH下，例如 pH 5或更低。然而，对有些应用，可能不能达到结合混合物的这样低的pH。例如，用于裂解分支杆菌的裂解试剂具有12或更高的pH值。在用于分离分支杆菌核酸的一般程序中，在细胞裂解后的中和步骤期间降低pH，但不低于pH9。在pH 9或更高时，核酸与磁性玻璃颗粒的结合是低效的。迄今为止，通过延长的孵育时间克服此结合的低效率。这种解决问题的方式对临床应用是不现实的。此外，延长的孵育对核酸模板的稳定性有威胁，特别是RNA模板。
发明概述
本发明是从包含核酸的样品溶液中分离核酸的方法，其包括使样品溶液接触能够结合核酸的固相和包含亚乙基胺化合物的结合混合物；在核酸可结合固相的条件下孵育包含固相的样品溶液；和从溶液中分离固相。本方法任选地包含在洗脱前洗涤结合的核酸的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在分离后检测核酸。本发明还包括用于分离核酸的反应混合物，所述混合物包含能够结合核酸的固相和亚乙基胺化合物。本发明也包括使用固相从样品中分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：能够结合核酸的固相和亚乙基胺化合物。
发明详述
定义
本文中使用的术语 “亚乙基胺化合物”指具有通式NH2-CH2-CH2-(NH-CH2 -CH2)n–NH2的分子，其中n是0-9或更多。用于本发明的亚乙基胺化合物包括，但不限于，乙二胺 (EDA)，二亚乙基三胺 (DETA)，三亚乙基四胺 (TETA)，四亚乙基五胺 (TEPA)和五亚乙基六胺 (PEHA)。本领域技术人员将理解，其他亚乙基胺化合物可用于本发明。
本文中使用的术语 “样品”指包含目的物质（例如核酸）的混合物或溶液。样品可包含固体或液体组织、体液、真核细胞 (包括植物、真菌、动物或人细胞)的培养物或悬浮物，原核细胞（包括细菌细胞）的培养物或悬浮物。样品可包含病毒。样品也可包含含有目的物质的无细胞溶液。取决于样品的性质，其可能需要化学或物理处理以便于从样品中分离目的物质。例如，可能需要处理样品以从细胞和亚细胞区室中释放核酸。
本文中使用的术语生物样品的“成分”指一类分子(例如，蛋白质、核酸等)或特定靶，例如希望检测的特定蛋白质或核酸序列。
本文中使用的术语 “核酸”指脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)的聚合物 (即，DNA)，多核糖核苷酸(包含D-核糖) (即，RNA)，和嘌呤或嘧啶碱基，或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的任意其他N-糖苷类似物，或其组合。
在本发明的方法中，使用磁性玻璃颗粒从样品中分离核酸，其中核酸与磁性玻璃颗粒的结合通过一种或多种亚乙基胺化合物的存在而增强。
在一些实施方案中，样品包含全细胞。使用适于破坏细胞膜和细胞壁（如果存在）的裂解试剂裂解细胞，从而从细胞和亚细胞区室中释放核酸。破坏细胞和组织的多种方法是本领域已知的。在Sambrook & Russell，Molecular Cloning ， A Laboratory Manual (第3版，2001)中提及和描述了许多方法。
在一些实施方案中，样品包含革兰氏阳性菌。使用包含强化学碱（例如碱金属氢氧化物）、去垢剂和盐并具有高于12的pH的裂解试剂裂解革兰氏阳性菌。在一些实施方案中，将包含革兰氏阳性菌的样品加热至80˚C和100˚C之间，通常约95˚C，并孵育 5和30分钟之间，通常约15分钟。
根据本发明，在适于核酸与磁性玻璃颗粒结合的条件下，使不含细胞和亚细胞区室的含核酸样品与磁性玻璃颗粒接触。已经发现将亚乙基胺化合物加至结合混合物大大增加了核酸与磁性玻璃颗粒表面结合的效率。此现象在高pH下特别有利。在结合混合物中存在金属盐，例如镁或锰盐，例如氯化物或醋酸盐进一步提高结合效率。
在一些实施方案中，亚乙基胺化合物的浓度在10和65 mM之间，例如，16 mM。
在结合步骤后，可从包含亚乙基胺化合物的溶液中分离具有结合的核酸的磁性玻璃颗粒。取决于磁性玻璃颗粒的大小和类型，在孵育期间从液体中分离出颗粒，或在孵育后将颗粒保留在悬浮物中并需要进一步的分离。如需分离步骤，通过应用磁场从样品溶液中分离具有结合的核酸的颗粒。例如，可将磁性玻璃颗粒拉到进行孵育的样品容器的壁或底部。然后可通过吸移或抽吸从样品容器中去除包含样品中存在的任意未结合物质和污染物的液体。
可任选地用一种或多种洗涤溶液洗涤一次或多次具有结合的核酸的磁性玻璃颗粒。 洗涤溶液具有不引起核酸从颗粒表面释放，但可洗去仍与核酸或磁性玻璃颗粒相关的（associated）不想要的污染物的组成。在一些实施方案中，初始的洗涤溶液包含醇，例如乙醇或异丙醇。洗涤溶液也可包含离液盐和缓冲液。在一些实施方案中，随后的洗涤溶液是无醇的，但包含盐、缓冲液和任选地，防腐剂。此洗涤步骤可通过孵育洗涤溶液和结合核酸的磁性玻璃颗粒进行。可在此步骤中重悬颗粒以实现与洗涤液的最大接触。然后从样品容器中去除污染的洗涤溶液。
在最后的洗涤步骤后，可在真空中短暂干燥具有结合的核酸的磁性玻璃颗粒，或允许残留的洗涤液蒸发。如果需要，可从磁性颗粒中分离核酸和任选地从包含磁性颗粒的容器中移除核酸，留下颗粒。可使用具有低盐含量的缓冲液从磁性玻璃颗粒中洗脱核酸。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含Tris。任选地，洗脱缓冲液可包含防腐剂和核酸酶抑制剂，例如螯合剂，例如 EDTA。在其他实施方案中，洗脱缓冲液是含有或不含防腐剂的水。
在一些实施方案中，在下游应用中核酸可保持与磁性颗粒结合。(见例如美国申请公开号20040014070)。在其他实施方案中，核酸从磁性玻璃颗粒上分离，但颗粒与核酸保留在容器中用于下游应用。例如，公开US20040014070教导了通过溶胶-凝胶法制备的磁性玻璃颗粒提高了核酸通过PCR扩增的效率。在其他情况下，核酸在洗脱后可从磁性玻璃颗粒中分离。通常，从包含磁性玻璃颗粒的容器中移除包含核酸的溶液。
在一些实施方案中，分离核酸的方法还包括扩增和检测分离的靶核酸。例如，使用PCR进行扩增和检测，见Principles and Applications for DNA Amplification (H. A. Erlich编，Freeman Press，New York，N.Y.，1992); PCR Protocols ： A Guide to Methods and Applications (Innis，等人编，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)。也可通过连接酶链式反应(LCR) (美国专利号5,185,243，5,679,524和5,573,907)或任意其他合适的核酸扩增技术进行扩增和检测。尽管任意下游分析方法与本发明的分离方法相容，根据本发明的裂解溶液和结合溶液的组成特别地与下游PCR应用相容。
在实时PCR测定中，标记探针产生的信号与输入的靶核酸的量成比例。输入越大，荧光信号越过预定阈值(Ct)越早。因此，可通过相互比较样品或比较样品与具有已知核酸量的对照样品测定靶核酸的相对或绝对量。
在另一个实施方案中，本发明是用于分离核酸的反应混合物。反应混合物可包含裂解试剂，所述试剂包含一种或多种去垢剂，亚乙基胺化合物和任选地，金属盐，例如，镁或锰盐，一种或多种防腐剂，和/或一种或多种螯合剂。在一些实施方案中，裂解试剂具有 12或更高的pH值。在一些实施方案中，反应混合物中的裂解试剂包含浓度为1-10%的一种或多种去垢剂，浓度为0.5-2 mM的一种或多种螯合剂例如 EDTA ，浓度为0.01-0.1%的一种或多种防腐剂，例如叠氮化钠 ，浓度为10-65 mM的亚乙基胺化合物和浓度为5-25 mM的金属盐，例如镁或锰盐，例如氯化物或醋酸盐。
在一些实施方案中，反应混合物还包含含有待分离的核酸的样品。在有些情况下，样品包含裂解的革兰氏阳性菌作为核酸来源。在另一个实施方案中，反应混合物包含磁性玻璃颗粒。在有些情况下，通过在美国专利 6,870,047和其中引用的参考中描述的溶胶-凝胶法制造颗粒。
在另一个实施方案中，本发明是使用磁性玻璃颗粒分离核酸的试剂盒。试剂盒包括裂解试剂，所述试剂包含一种或多种去垢剂，和任选地，一种或多种防腐剂，亚乙基胺化合物和任选地，镁或锰盐。在一些实施方案中，在分开的容器中提供裂解试剂、亚乙基胺化合物和镁或锰盐。在一些实施方案中，裂解试剂可具有12或更高的pH值。在一些实施方案中，试剂盒中包含的裂解试剂包含浓度为1-10%的一种或多种去垢剂，浓度为0.5-2 mM的一种或多种螯合剂例如 EDTA ，浓度为0.01-0.1%的一种或多种防腐剂，例如叠氮化钠 ，浓度为10-65 mM的亚乙基胺化合物和浓度为5-25 mM的镁或锰盐，例如氯化镁或醋酸锰。试剂盒可还包括磁性玻璃颗粒。磁性玻璃颗粒可参入裂解试剂，或存在于试剂盒中的单独容器中。当磁性玻璃颗粒存在于单独的容器中时，可在醇例如异丙醇中悬浮颗粒。在有些情况下，通过在美国专利 6,870,047和其中引用的参考中描述的溶胶-凝胶法制造在本发明的试剂盒中包含的磁性颗粒。在一些实施方案中，试剂盒任选地包含中和试剂、洗涤试剂和洗脱试剂。中和试剂可包含缓冲液、盐和防腐剂并具有6和8之间的pH，最优选pH 7.5。在一些实施方案中，缓冲液可为Tris，盐可为氯化镁和防腐剂可为叠氮化钠。洗涤试剂可包含醇。洗脱试剂可包含缓冲液和防腐剂并具有8.5的pH。
实施例
仅作为说明且不限制本发明的范围，应用本方法从结核分支杆菌(MTB)中分离核酸。
实施例 1:
为了裂解，包含100 µL 结核分支杆菌(MTB)细胞悬浮物或相同体积的在67 mM磷酸盐pH 6.8中的MTB DNA的样品与400 µL 裂解试剂 (50 mM NaOH，1% Triton X-100，1 mM EDTA，0.05% NaN3，pH 12+)混合并在95℃孵育15分钟。然后加入400 µL 中和试剂(8-64 mM 亚乙基胺，200 mM Tris，8-23 mM MgCl2或Mg(OAc)2 0.05% NaN3，pH 7.5)。然后加入100uL 磁性玻璃颗粒 (Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，N.J.) 并在室温或在37℃孵育样品5-30分钟。然后通过去除上清分离磁性玻璃颗粒，并用7.5 mM 柠檬酸钠二水合物，0.05% (w/v) MIT，pH 4.1洗2次。用50-100 µL洗脱试剂(30 mM Tris，pH 8.5，0.2% w/v 对羟基苯甲酸甲酯 (羟苯甲酯)，0.09% NaN3)洗脱核酸。人工或通过Hamilton Star仪器(Hamilton Robotics，Inc.，Reno，Nev.)自动进行裂解后程序。
通过定量PCR又称实时PCR检测分离的核酸。使用50 µL洗脱液和50 µL主混合物（master mix）进行PCR，主混合物包含154 mM 三甲基甘氨酸(Tricine)，110 mM 氢氧化钾，190 mM 醋酸钾，19% 甘油(v/v)，2.3% DMSO，1.16 mM dATP，1.16 mM dCTP，1.16 mM dGTP，1.16 mM dUTP，上游和下游引物，靶探针，内部对照探针，DNA聚合酶，尿嘧啶-N-DNA糖基化酶，0.09% 叠氮化钠 (w/v)，pH 8.50和20 拷贝/反应的内部对照DNA。在COBAS® TAQMAN® 48分析仪上的扩增条件是：在50℃ 5分钟，之后2个循环的98℃ 20秒、61℃秒和70℃秒，然后55个循环的95℃ 25秒、61℃ 40秒和70℃ 20秒。
结果以“达到阈值的循环” (Ct)值 (来自样品的荧光超过背景荧光和因此“越过阈值”的循环数)表示。Ct 反映了核酸模板的初始量。较低的Ct 值指示反应中核酸模板的初始量较多，而较高的Ct 值指示反应中核酸模板的初始量较少。表1-3显示了包含使用本发明的方法分离的核酸的每个PCR反应的Ct 值。
表 1
从全 MTB 中的核酸回收，辅以亚乙基胺和金属盐
*TETA – 三亚乙基四胺。
表 2
从全 MTB 中的核酸回收，辅以不同亚乙基胺和金属盐
*EDA – 乙二胺; DETA – 二亚乙基三胺; TETA – 三亚乙基四胺; TEPA - 四亚乙基五胺; PEHA – 五亚乙基六胺。
表 3
从全 MTB 中的核酸回收，辅以亚乙基胺和不同金属盐
* TETA – 三亚乙基四胺。
表 4
无细胞的 MTB 核酸回收，辅以亚乙基胺和金属盐
* TETA – 三亚乙基四胺。
结果证明，亚乙基胺化合物改进了使用固体支持物例如磁性玻璃颗粒的核酸回收。金属盐，例如，镁或锰盐，例如氯化物或醋酸盐的存在进一步加强了改进。
尽管已参考特定实施例详细描述了本发明，对本领域技术人员显而易见地，可在此发明的范围内进行多种修改。因此本发明的范围不应受限于本文描述的实施例，而是受限于下面提供的权利要求书。

Claims (11)

1.一种从包含核酸的样品溶液中分离核酸的方法，其包括
a. 使样品溶液与能够结合核酸的固相和包含亚乙基胺化合物的结合混合物接触;
b. 在核酸可结合固相的条件下孵育包含固相的样品溶液；和
c. 从溶液中分离固相，
其中所述能够结合核酸的固相包含具有磁性核心和含二氧化硅的外层的颗粒，和其中所述亚乙基胺化合物具有通式NH2-CH2-CH2-(NH-CH2 -CH2)n–NH2，其中n是0 – 9或更大；其中所述方法不包括用酰化剂处理的步骤。
2.权利要求1的方法，其还包括洗涤结合固相的核酸。
3.权利要求1的方法，其还包括从固相洗脱核酸。
4.权利要求1的方法，其中所述样品溶液通过裂解细胞得到。
5.权利要求4的方法，其中所述样品溶液通过裂解选自芽孢杆菌（Bacillus），梭菌（Clostridium），葡萄球菌（Staphylococcus），链球菌（Streptococcus），肠球菌（Enterococcus），分支杆菌（Mycobacterium）及其组合的革兰氏阳性菌得到。
6.权利要求1的方法，其中在步骤（a）中的所述结合混合物还包含镁或锰离子。
7.权利要求1的方法， 其中在步骤（a）中的所述结合混合物还包含碱金属氢氧化物和去垢剂。
8.权利要求7的方法，其中在步骤（a）中的所述结合混合物包含等体积的溶液 1和溶液2的混合物，所述溶液1为50mM NaOH，1% Triton X-100，1mM EDTA，0.05% NaN3，pH 12+；所述溶液2为10-65mM 亚乙基胺，200mM Tris，5-25mM MgCl2，0.05% NaN3，pH 7.5。
9.一种用于使用固相从样品中分离核酸的反应混合物，所述混合物包含：包含具有磁性核心和含二氧化硅的外层的颗粒的能够结合核酸的固相，具有通式NH2-CH2-CH2-(NH-CH2 -CH2)n–NH2的亚乙基胺化合物，其中n是0 – 9或更大，和镁或锰离子；其中所述混合物不包含酰化剂。
10.权利要求9的反应混合物，其还包含碱金属氢氧化物和去垢剂。
11.一种用于使用固相从样品中分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：包含具有磁性核心和含二氧化硅的外层的颗粒的能够结合核酸的固相，具有通式NH2-CH2-CH2-(NH-CH2 -CH2)n–NH2的亚乙基胺化合物，其中n是0 – 9或更大，和一种或多种裂解试剂、中和试剂、洗涤试剂和洗脱试剂，其中所述裂解试剂包含碱金属氢氧化物和去垢剂，中和试剂包含一种所述亚乙基胺化合物，镁或锰离子和缓冲液；其中所述试剂盒不包含酰化剂。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013318156A1 (en) * 2012-09-19 2015-03-19 Beckman Coulter, Inc. Use of divalent ions, proteases, detergents, and low pH in the extraction of nucleic acids
WO2016065218A1 (en) 2014-10-23 2016-04-28 Corning Incorporated Polymer-encapsulated magnetic nanoparticles
US20200032241A1 (en) * 2016-09-30 2020-01-30 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Nucleic acid extraction method and kit using same
CN111278844B (zh) * 2017-09-13 2023-12-19 贝克顿·迪金森公司 用于使用氧化铁颗粒提取核酸的方法和组合物
CN107955810A (zh) * 2017-12-25 2018-04-24 宁波卡尔新材料科技有限公司 一种新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法
WO2020005584A1 (en) * 2018-06-28 2020-01-02 Gen-Probe Incorporated Sample preparation method and system

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1192217A (zh) * 1995-06-08 1998-09-02 曼海姆泊灵格股份公司 磁性色素
WO1999058664A1 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids
CN1370230A (zh) * 1999-08-20 2002-09-18 普罗梅加公司 Dna的同时分离和定量
WO2004013155A2 (en) * 2002-08-02 2004-02-12 Cyclops Genome Sciences Limited Stabilisation of nucleic acids
WO2004042058A2 (de) * 2002-11-08 2004-05-21 InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren
CN1970752A (zh) * 2006-11-29 2007-05-30 吉林大学 用磁性纳米复合材料回收dna的方法及试剂盒
WO2008119488A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-09 Roche Diagnostics Gmbh Alkyl amines improve detection of components of formaldehyde-fixed biological samples
CN101289661A (zh) * 2007-04-20 2008-10-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用固相分离和纯化核酸分子

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
US5573907A (en) * 1990-01-26 1996-11-12 Abbott Laboratories Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity
DE69531542T2 (de) * 1994-02-07 2004-06-24 Beckman Coulter, Inc., Fullerton Ligase/polymerase-vermittelte analyse genetischer elemente von einzelnukleotid-polymorphismen und ihre verwendung in der genetischen analyse
EP1154443A1 (en) 2000-05-12 2001-11-14 Boehringer Mannheim Gmbh Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof
WO1999003883A1 (en) * 1997-07-18 1999-01-28 Brigham And Women's Hospital Compositions and methods based upon the tuberous sclerosis-1 (tsc1) gene and gene product
AU3902799A (en) 1998-05-14 1999-11-29 University Of Hawaii Compositions and methods for genetic transformation of pineapple
US6548256B2 (en) 2000-07-14 2003-04-15 Eppendorf 5 Prime, Inc. DNA isolation method and kit
ATE374837T1 (de) * 2002-01-08 2007-10-15 Hoffmann La Roche Verwendung eines silikamaterials bei der amplifikation
CA2511829A1 (en) * 2002-12-04 2004-06-17 Pamgene Bv Method for hybridisation of immobilized genomic dna
JP5292722B2 (ja) * 2007-05-09 2013-09-18 凸版印刷株式会社 未精製血液をサンプルとする核酸増幅法
EP2157181A1 (de) 2008-08-13 2010-02-24 AGOWA Gesellschaft für molekularbiologische Technologie mbH Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren und Testkit
AT508355B1 (de) 2009-06-29 2011-01-15 Trumpf Maschinen Austria Gmbh Verfahren und vorrichtung zum biegen eines werkstücks

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1192217A (zh) * 1995-06-08 1998-09-02 曼海姆泊灵格股份公司 磁性色素
WO1999058664A1 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids
US20060003357A1 (en) * 1998-05-14 2006-01-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids
CN1370230A (zh) * 1999-08-20 2002-09-18 普罗梅加公司 Dna的同时分离和定量
WO2004013155A2 (en) * 2002-08-02 2004-02-12 Cyclops Genome Sciences Limited Stabilisation of nucleic acids
WO2004042058A2 (de) * 2002-11-08 2004-05-21 InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren
CN1970752A (zh) * 2006-11-29 2007-05-30 吉林大学 用磁性纳米复合材料回收dna的方法及试剂盒
WO2008119488A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-09 Roche Diagnostics Gmbh Alkyl amines improve detection of components of formaldehyde-fixed biological samples
CN101289661A (zh) * 2007-04-20 2008-10-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用固相分离和纯化核酸分子

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
氧化铁磁性纳米粒子的表面修饰及应用;饶通德;《化工文摘》;20091231;59-62 *
磁性二氧化硅微球的表面修饰及其在植物基因组核酸纯化中的应用;张志超 等;《分析化学》;20070131;第35卷(第1期);31-36 *
铁基纳米粒子的制备及其在生物医学中的应用;高倩;《功能材料》;20081231;第39卷(第2期);181-185 *

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