WO2004040307A2 - Vorrichtung und verfahren zur strukturanalyse und detektion von komplexen glykostrukturen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur strukturanalyse und detektion von komplexen glykostrukturen Download PDF

Info

Publication number
WO2004040307A2
WO2004040307A2 PCT/EP2003/011567 EP0311567W WO2004040307A2 WO 2004040307 A2 WO2004040307 A2 WO 2004040307A2 EP 0311567 W EP0311567 W EP 0311567W WO 2004040307 A2 WO2004040307 A2 WO 2004040307A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lectins
microarray
vicia
immobilized
binding assay
Prior art date
Application number
PCT/EP2003/011567
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2004040307A3 (de
Inventor
Simone Cartellieri
Jürgen Kuballa
Bernd Niemeyer
Heike Helmholz
Original Assignee
Gkss Forschungszentrum
Galab Technologies Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gkss Forschungszentrum, Galab Technologies Gmbh filed Critical Gkss Forschungszentrum
Priority to AU2003301693A priority Critical patent/AU2003301693A1/en
Publication of WO2004040307A2 publication Critical patent/WO2004040307A2/de
Publication of WO2004040307A3 publication Critical patent/WO2004040307A3/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
    • B01J2219/00313—Reactor vessels in a multiple arrangement the reactor vessels being formed by arrays of wells in blocks
    • B01J2219/00315—Microtiter plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00364—Pipettes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00385—Printing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00387—Applications using probes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00427—Means for dispensing and evacuation of reagents using masks
    • B01J2219/00432—Photolithographic masks
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00621—Delimitation of the attachment areas by physical means, e.g. trenches, raised areas
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00635—Introduction of reactive groups to the surface by reactive plasma treatment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00727—Glycopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the invention relates to a device and a method for determining and analyzing complex glycostructures.
  • Carbohydrates can be converted into monosaccharides, disaccharides. Oligosaccharides and polysaccharides can be divided. The oligo- and polysaccharides can in turn be divided into homoglycans or heteroglycans, the heteroglycans with the representatives of the proteoglycans, peptidoglycans, glycolipids and glycoproteins being among the biologically important structural units.
  • Compound carbohydrates that contain conjugated compounds, such as glycolipids and glycoproteins are also referred to as glycoconjugates. Glycoconjugates are one of the central biomolecules of the ropes and are involved in many physiological processes.
  • glycoconjugates plays a major role in the areas of basic research, diagnostics, pharmaceutical research and for drug development.
  • the term glycoconjugates denotes molecules in which a carbohydrate portion (mono-, oligo- or polysaccharide) is covalently bound to a protein or an ipid.
  • glycoconjugates include, in addition to the glycoproteins and glycolipids, in which the protein or lipid portion predominates, also the lipopolysaccharides and the protoglycans, in which the carbohydrate portion predominates.
  • the carbohydrate content of glycoproteins and glycolipids typically consists of up to 20 monosaccharides; for lipopolysaccharides and protoglycans this can be considerably larger.
  • nature uses a wide variety of linkage and branching options in addition to the selection of different monosaccharide building blocks, so that there is a huge variety of structures within this class of substances.
  • Carbohydrates potentially have the greatest number of possible variations in a short sequence within the biological binding partners of proteins.
  • Using a common library of 20 different monosaccharides theoretically 10 15 different structures result for the formation of a hexasaccharide (including branched isomers). If the oligosaccharide chains are branched, one speaks of oligoantennaren connections, whereby normally di- to pentaantennäräre structures are present.
  • the resulting "multivalency" of the molecules in relation to the interaction with a binding partner is an important aspect for the specificity and strength of the binding.
  • the oligosaccharide structures can vary at each glycosylated site of a protein. The differently glycosylated variants are known as glycoforms of this protein or as micro heterogeneity.
  • glycoproteins are first broken down, that is to say the structure to be examined is first destroyed and the glycans or glycopeptides are characterized by means of mass spectroscopy after chromatographic separation.
  • affinity chromatography saccharides or glycoconjugates are purified with the aid of lectins which are bound to gel particles for the use of further analysis steps.
  • the method of serial lectin affinity chromatography is available, in which the sample components are fractionated in a flow-through method using a combination of lectin adsorbents.
  • glycoconjugates it is disadvantageous that purification of the glycoconjugates is necessary because any contamination impairs the analytics. For example, it is necessary to work with large amounts of the purified glycoconjugate - often in the milligram range - which requires a great deal of preparation. So far it has not been possible to detect glycostructures in a uniform process, so that the analysis of glycoconjugates with conventional methods always consists of several sub-steps and is therefore very time-consuming.
  • a central disadvantage of conventional analysis methods is that the glycostructures cannot be analyzed non-destructively, which means that the sample is no longer in its native state, which means that a sample that has been analyzed and that includes glycostructures usually does not can continue to be used.
  • Complex structures such as glycoproteins with more than two or three more or less branched sucker chains (glycans), are generally not covered by the known methods.
  • the object of the invention is therefore to provide a device with which complex carbohydrate structures, such as glycoconjates, can be detected quickly, easily, safely and efficiently and their structure can be determined.
  • the invention solves this technical problem by providing a microarray comprising at least at least two different immobilized lectins directed against the basic structure of a glycoconjugate, the basic structure comprising at least one glycan containing at least two glycosidically linked monosaccharides.
  • the invention is accordingly based on the surprising teaching that complex glycoconjugates, such as glycoproteins or glycolipids, not only interact specifically with one lectin, but that they are able to interact measurably with several lectins in such a way that an analysis of the Structure of the glycoconjugate - the analyte - is possible.
  • This interaction of one and the same analyte, with several different lectins, results in several areas or locations on the array with a special lectin-sucker interaction, which can be detected using various methods known to the person skilled in the art.
  • Immobilization in the sense of the invention is understood to mean all methods for restricting the mobility and solubility of lectins in chemical, biological and / or physical ways.
  • the immobilization can be done by different methods, such as the binding of lectins with each other or to the carrier, by adhering a polymeric matrix in the network 'or immobilization on a membrane.
  • the immobilization becomes a Wash out the lectins in the different washing steps prevented.
  • the biological sample can easily be separated from the immobilized lectin.
  • the lectins can be bound or immobilized on the carrier or microarray by direct carrier connection and by crosslinking.
  • Crosslinking in the sense of the invention is a crosslinking of the detection molecules - that is to say the lectins - with one another or with other polymers.
  • the lectins When immobilized by inclusion, the lectins are enclosed in gel structures or in membranes in such a way that interaction with the glycoconjugates is possible.
  • Lectins e.g. can be immobilized by dropping round spots or by printing lines, whereby planar and non-planar structures such as spheres, cuboids or fibrils and rods can be used as the microarray, which are impregnated or immobilized with different lectins and thus immersed in a spatial arrangement. To be put in order.
  • the immobilization should take place in such a way that (i) that each lectin is assigned a defined position on the support or microarray and (ii) that each position on the microarray or support can be evaluated independently. However, it can also be advantageous that the application sites of different lectins overlap partially or completely or that lectin mixtures are applied in the form of a detection spot.
  • the immobilization can take place, for example, using a method based on semiconductor technology. Printing processes also make it possible to deposit the lectins in defined areas or locations on or on the surface of the microarray, as a result of which stable binding can take place with high coupling efficiency. All immobilization measures of biomolecules known to the person skilled in the art - for example on column materials - can also be used to immobilize the lectins on the array.
  • Selected methods for immobilization are, for example, contact tip printing, ring and pin printing, nanoelectric printing and nanopipetting, bubble jet printing, top spot printing, micro contact printing, micro fluidic networks methods, photolithographic activation methods, photoresist lithography, Electroche ical focusing and micro wet printing.
  • comparatively simple sample application devices from thin-layer chromatography or autosamplers for HPLC and pipette and micropipettes (piston stroke pipettes) are used. With the help of these methods, a lectin spot size of approx. 1 ⁇ m to over 6 mm can be generated.
  • the lectin density per cm 2 can be, for example, in the range from approximately 0.01 to 1000 pmol / cm 2 .
  • the methods mentioned enable simple handling and great precision of the volumes created, as well as very homogeneous lectin spots, which are applied with a high degree of parallelization.
  • the methods that enable a direct synthesis of the lectins on the support have in particular a high integration density and a simple combination of immobilization and coupling. It is possible to prepare the lectins, which can also be referred to as probes, with further methods in order to keep the proportion of unspecificly synthesized or bound lectins low.
  • the lectins can also be immobilized on the microarray by a blot method.
  • the lectins or cells or tissues comprising them are separated by means of electrophoresis.
  • the electrophoretic separation can e.g. by means of a one-dimensional or multidimensional electrophoresis, in particular a 2D electrophoresis.
  • electrophoretically separated or separated lectins are then either placed on the support or Transfer microarray or on a membrane, which is applied in a next step to the carrier or microarray.
  • the microarray comprises at least two different immobilized lectins, the lectins being isolable, selected from the group consisting of Abrus precatorius, Adenia digitata, Agaricus bisporus, Aleuria aurantia, Amaranthus caudatus, Amphicarpaea biacteata, Anguilla anguilla, Arachis hypogaea, Artocarpus integrifolia, Bauhinia purpurea alba, Brachypodium sylvaticum, Canavalia ensiformis, Carcino scorpius rotunda canda, Cicer arietinum, Codium fragile, Crotalaria juncea, Cytisus sessilifolius, Datura stramonium, Dioclea grandifhrinausiallichristinauria, dendella erifone, Erythema, dolomized erythematosus, dolomized
  • lectins which are suitable for binding complex glycostructures or glycoconjugates in such a way that detection and structural analysis are possible can advantageously be isolated from the organisms mentioned.
  • the lectin ABA from Agaricus bisporus, from Aleuria aurantia AAL, from Amaranthus caudatus ACL (ACA), from Anguilla (Eel) anguilla AAA, from Arachis hypogaea PNA, from Artocarpus integrifolia AIL (Jacalin), from Griffonia
  • DB A 'from Erythrina coralldendron Ecor A, from Erythrina cristagalli ECL (ECA), from Euonymos europaeus EEL, from Galanthus nivalis GNL, from Glycine ⁇ tax SBA, from Helix aspersa HAA, from Helix po atia HPA, from Hippeastrum hybrid HHL (AL ), from Lens culinaris LCA, LcH (Lentil), from Lotus tetragonolobus LTL, from Lycopersicon esculentum LEA (Tomato), from Maackia amurensis MAA, from Maclura pomifera MPA, from Narcissus pseudonarcissus NPL, NPA, from Phaseolus coccineus PCA, from Pha ⁇ eolu ⁇ limensis LBA, from Phaseolus vulgaris PHA, from Phytasuumum s PSA, from Pseudomonas aeruginos
  • the microarray comprises at least two different immobilized lectins, the lectins having a binding affinity to the glycostructures to be detected of Kd 10 10 ⁇ s mol / 1.
  • the immobilized lectins comprise a binding linker.
  • Binding linkers in the sense of the invention are all structures which are associated with the lectins in such a way that they can be immobilized covalently or complexly on a support of the microarray or on the microarray itself.
  • the linkers can be, for example, peptide fragments in the range from 0 to 50 amino acids.
  • the lectins comprising linkers are accordingly advantageously not immobilized on the microarray via non-specific adsorption.
  • linkers can also be designed in such a way that an interaction between the individual lectins or lectins and the carriers is excluded in such a way that disturbances or non-specific interactions do not occur or only to a very small extent.
  • the linkers can be used as spacers, for example.
  • linkers in the sense of the invention can also be short synthetic DNA double strands. They can also be used to first immobilize certain lectins in order to then split them off again with the help of specific enzymes, for example those that break down the DNA double strand.
  • the linker is in particular streptavidin and / or biotin.
  • Streptavidin in the sense of the invention is a protein from Streptomyci avidinii which binds to biotin with an affinity of 10 "15 M " 1 and which has a molecular weight of approximately 60,000 Da. It advantageously has a lower unspecific P-action than avidin.
  • Biotin in the sense of the invention are coenzymes of the enzymes that catalyze carboxylations. The very high affinity of biotin for streptavidin as well as for avidin can advantageously be used to immobilize biotinylated reagents.
  • the lectins are immobilized with a packing density of> 50 ng / cm 2 .
  • the resulting surface coverage of> 10% enables an optimal interaction with the glycostructures.
  • the variants of the possible functional The base materials are of course diverse. A requirement for the binding of lectins is the presence of appropriate functional groups on the support material with which the lectin can react.
  • the following variants can be used, among other things: functionalization with carboxyl groups, functionalization with amino groups, functionalization with aldehyde groups, functionalization with phenyl groups, functionalization with thiol groups, functionalization with divinylsulphones (resulting bond: ether, thioether, secondary amines), Functional ionization with carbonyldiimidazole, functionalization with epichlorohydrins (resulting bond: ether, thioether, secondary amines), functionalization with
  • the functionalization is advantageously possible in a rapid reaction, the immobilization of the lectins using the methods described being particularly advantageous since a covalent bond is formed here. This prevents the leaching of the lectins and thereby a loss of binding activity or, if the sample is detached, contamination of these by lectin molecules.
  • Immobilization takes place under individual reaction conditions and is often to be carried out using other chemicals.
  • the immobilization on epoxy groups requires, for example, 8-48 h at pH 8.5-12.
  • the binding of proteins to matrices activated with carboxyl groups takes place at pH 4-6 in 24-48 h.
  • the use of carbodiimide for the reaction is advantageous. Proteins are also immobilized on supports substituted with amino groups using other chemicals such as carbodiimide or NaCNBH 3.
  • tresyl chloride (2,2,2-trifluoroethane sulfonyl chloride) is advantageously used.
  • the functionalization of carrier materials with tresyl chloride is particularly suitable for the binding of proteins, since the reaction takes place under mild conditions (pH 7-9) and does not damage the proteins.
  • the binding takes place via primary amino groups or thiol groups of the amino acids of the protein.
  • the reaction is comparatively quick (a few hours) and takes place without the use of additional chemicals.
  • Tresyl activation is stable for a few months with dry material or when stored in dilute hydrochloric acid.
  • spacer increases the distance between the support surface and the ligand and can therefore contribute to better accessibility of the ligand.
  • Usual spacers consist of two terminal functional groups and a length-selectable C chain, e.g. 6-aminohexanoic acid.
  • the linker used that is to say the carrier functionalization used, can itself already be a spacer.
  • the microarray comprises metal, polypropylene, Teflon, silicon, polyethylene, polyester, polystyrene, nitride, ceramic, quartz and / or glass.
  • Metals in the sense of the invention are all compounds whose cohesion is created by a crystal lattice. The boundary between metals and non-metals is blurred ßig, so that the elements Ce, Sn, As and Sb are metals in the sense of the invention.
  • the metals according to the invention also include the metallic glasses, that is to say materials which are in a meta-stable, largely amorphous state.
  • metallically conductive polymers are metals in the sense of the invention.
  • metals advantageously have, in particular, good strength, good hardness and wear resistance, high toughness and good electrical and thermal conductivity.
  • Polypropylenes in the sense of the invention are thermoplastic polymers of propylene. Polypropylenes are characterized in particular by high hardness, R ückstellêt, stiffness and heat resistance of.
  • the microarray can also include Teflon. Teflon according to the invention are polytetrafluoroethylene, which advantageously have good thermoplastic properties.
  • Polyethylenes are produced in particular by polymerizing ethylene using essentially two different methods, the high-pressure and the low-pressure process. Polyethylenes which are produced in the high-pressure process advantageously have a low density.
  • microarrays comprising polypropylene are essentially determined by the character of the polyethylene as a partially crystalline hydrocarbon.
  • Polyethylenes are advantageously up to 60 ° in all customary solutions. practically insoluble.
  • polar liquids such as alcohol, esters and ketones hardly cause polyethylene to swell at room temperature.
  • Polyethylenes are advantageously completely indifferent to water, alkalis and salt solutions as well as inorganic acids.
  • microarrays or carriers that include polyethylenes have very low water vapor permeability.
  • the microarray can expediently also comprise polyester.
  • polyesters are compounds which are prepared by ring-opening polymerization of lactones or by polycondensation of hydroxycarboxylic acids or of diols and dicarboxylic acids or dicarboxylic acid derivatives.
  • polyesters also include polyester resins, polyester imides, polyester rubbers, polyester polyols and polyester polyuretanes. Polyesters are advantageously thermoplastics and have a distinct material character. For example, they are characterized by high thermal stability and can be processed into alloys with metals such as copper, aluminum and magnesium. However, it can also be provided that the microarray comprises ceramics.
  • Ceramic in the sense of the invention is a collective name for a class of substances composed of in particular inorganic and predominantly non-metallic compounds and elements and in particular comprising more than 30% by volume of crystalline materials.
  • the specialist are various ceramics or ceramic materials known that he can use as a microarray. It can be, for example, so-called pottery, earthenware, split plates, laboratory porcelain, tableware, bone china, aluminum oxide ceramics, permanent magnet materials, silica stones and magnesia stones.
  • clay-ceramic materials a distinction is made between coarse and fine materials in the sense of the invention, fine clay-ceramic materials comprising earthenware, earthenware, stoneware and porcelain.
  • microarray can preferably also comprise glass.
  • Glass in the sense of the invention are substances in the amorphous, non-crystalline solid state, that is to say that the glass state in the sense of the invention can be understood as frozen, supercooled liquid or melt. Glasses are therefore inorganic or organic, mostly oxidic melt products, which have been converted into a solid state by an insertion process without crystallization of the melt phase components. In the context of the invention, crystals, quartz, melts and supercooled melts are of course also to be understood as glasses.
  • the glasses can be, for example, flat glass, container glass, industrial glass, laboratory equipment glass, lead crystal glass, fiber glass, optical glass fibers and others. Of course it is also possible that silicate-free glasses, for example phosphate glasses, are used.
  • the microarray can also be designed such that optical glasses, that is to say, glasses with special optical refractive indices, are used.
  • the invention also relates to a binding assay for determining glycostructures in a sample, the sample being brought into contact with at least two different immobilized lectins to form lectin-sugar complexes and the lectin-sugar complexes in a manner known per se are detected and the lectins can be isolated, selected from the group comprising Abrus precatorius, Adenia digitata, Agaricus bisporu ⁇ , Aleuria aurantia, Amaranthus caudatus, Amphicarpaea biacteata, Anguilla anguilla, Arachis hypogaea, Artocarpus integrifolia, Bauhinia purpuriformum alba, bavarian purpuriform alba, Carcino scorpius rotunda canda, Cicer arietinum, Codium fragile, Crotalaria juncea, Cytisus sessilifolius, Datura stramonium, Dioclea grandiflora, Dolichos
  • Determination of glycostructures by the binding assay according to the invention relates on the one hand to the detection, that is to say the qualitative detection of glycostructures in a sample, and also to the detection of certain patterns on the microarray, which allow conclusions to be drawn as to which immobilized different lectins the same glycostructure interacts in order to determine the structure of the complex oligosaccharide or polysaccharide or the glycoconjugate.
  • a sample in the sense of the invention is the designation for a biological sample taken by sampling or chemical good or a part or a small amount of such, the nature of which is to be tested chemically, biologically, clinically or similarly. Sampling takes place in such a way that the partial quantity taken corresponds to an average of the total quantity.
  • the characteristics determined by examining the sample are used to assess the amount contained in the sample, which allows RUCKSuefsen to the total amount, such as drinking water, food, tissue, cells, cell cultures, sell culture supernatants, transplanted organs and others.
  • the samples can be pretreated by mixing, separating, separating, prefractioning, crushing, adding enzymes or markers - or otherwise.
  • pretreating the samples are known to the person skilled in the art.
  • the sample is taken in such a way that it does not correspond to an average of the total amount.
  • a sample can be all biological and non-biological materials, such as biological tissues and fluids, e.g. blood, lymph, urine, brain fluid and others, as well as environmental waste water, bioreactor fluids, food ingredients, hazardous substances, aerosols, lipid substances and much more.
  • the lectins are physically, chemically and / or biologically by in situ synthesis or by Placing previously synthesized lectins immobilized on the microarray.
  • the carriers or microarrays can be produced in two different ways:
  • Spotting is understood to mean processes in which liquid drops are deposited, whereby essentially round spots are created by surface interaction and drying. Other printing processes allow the substrate to be placed on the surface in defined areas.
  • the lectins are used by Contacc Tip Printing, Ring and Pin Printing and Nanopipetting, Buble Jet Printing, TopSpot Printing, Micro Contact Printing, Micro Fluidic Networks Methods, Photolithographic Activation Methods, Photoresist Lithography, Electro- mical focusing and / or micro wet printing immobilized.
  • the surface of the microarray is activated with poly-L-lysines, aminosilanes, aldehyde silanes, epoxy groups, gold, streptavidin, polylysines, silanes, reactive groups, polyacrylamide pads, immobilized nitrocellulose Aldehydes, agarose aldehyde groups and / or tresyl groups coated.
  • substrate surface treatments advantageously make it possible to improve the durability and the binding capacity of the surface of the microarrays in such a way that the lectins can remain immobilized very well over a relatively long period of time.
  • the surface of the carrier can be made very generally, in particular by the action of biological, physical and / or chemical influences.
  • Physical effects include, for example, polishing, etching, pickling, sandblasting, but also physical processes that lead to hardening, coating, tempering, covering with protective skins and the like.
  • a surface treatment by biological action can include, for example, the overgrowth by microorganisms.
  • a chemical modification of the surface of the carrier includes, for example, treatment with acids, bases, metal oxides and others.
  • the surface of the carrier can be modified that the detection molecules or lectins adhere particularly well to the support or adhere such that their activity is not disadvantageously modified.
  • a surface modification of the carrier naturally also includes a treatment which leads to increased stability and breaking strength, in particular of the microarray. It is of course also possible to make classic surface modifications from histology, such as coating with, for example, protein glycerol, polylysine, activated dextrans and / or chromium gelatin.
  • a labeled or unlabeled lectin, a labeled or unlabeled glycostructure and / or a labeled or unlabeled antibody are added before or after the formation of the sugar-lectin complexes.
  • sample molecules themselves are provided with a marker (enzyme (A), fluorescent or Vis dye (B), biotin (C) ).
  • binding event and washing either: be read out directly (B) or after converting an enzyme substrate and reading out the resulting color signal (A) or (C) after adding another marker (enzyme, fluorescent or Vis dye) which is coupled with avidin / streptavidin.
  • Sandwich After adsorption of the sample molecules, they are provided with the same lectin that is immobilized on the surface (see example). This lectin binds specifically to the glycoconjugate to be determined from the opposite side and is itself marked. After binding, the event can be read out.
  • the same sugar structure is advantageously recognized and detected "twice”. It can be the one sugar spec be determined. Only complex systems with at least two parts of glycosylation are recorded. Only the lectins already present are required, no further antibodies or the like.
  • model adsorptive After adsorption of the sample molecules, the wells are provided with a labeled model adsorptive. As is known, this binds the immobilized lectin.
  • the model adsorptive can only dock onto free binding parts or competes with the sample molecule for these binding sites. A positive signal is obtained if no or only a few sample molecules are attached or according to the ratio that arises in this competitive situation.
  • the detection of systems with only a complex sugar structure is advantageously possible.
  • Known model systems are used.
  • the competitive situation also provides information about the binding constants of the complex with the sample molecule.
  • an enzyme, a dye, a fluorescence marker, a radioisotope, a metal colloid and / or a chelator is used for labeling.
  • Methods are known to the person skilled in the art how he can make markers more sensitive, in particular by means of amplification mechanisms.
  • the lectins are immobilized on micro test plates, glass plates, membranes, braids, fibrils, in particular made of polypropylene, nitrocellulose, glass and / or PVDF.
  • microtiter plates can be used as microtest plates. Microtest plates advantageously have dimensions that allow their use in numerous laboratory routines.
  • microtest plates can be used as standard.
  • the immobilization of the molecules on special laboratory vessels for example microtiter plates, petri dishes, multi-dishes, multi-dishes and other culture vessels and slides, therefore advantageously also enables the use of the existing laboratory means and devices for incubating, freezing, lyophilizing and similar laboratory devices in clinical or research laboratories.
  • microtiter plates with a transparent, non-fluorescent flat bottom or white or black, opaque flat bottom can preferably be used as the micro test plates.
  • a largely planar surface of the microarray is coated with a polymer and subsequently lectins are immobilized on the surface by means of the polymer.
  • the lectins are advantageously immobilized directly via the polymer.
  • the polymer is a polyimide or polystyrene. If the polymer is selected appropriately, for example polyimides, further microarrays or even additional microsystems with the same inorganic surface, for example semiconductor formwork, can also be industrially combined to form a system.
  • Polyimides are in particular high-temperature-resistant polymers; they advantageously have excellent mechanical, thermal and electrical properties.
  • the applications of the polyimide include in particular buffer layers, passivation layers, binding layers and dielectric intermediate layers on the carrier. Polyimides are applied in particular in liquid form and then cured. In this curing step, the polyimide advantageously obtains the desired properties. For the applications, the polyimide can be structured graphically.
  • polyimide can also be used as an adhesion promoter for potting material and as a buffer layer.
  • the polyimide layer for example, reduces the stress in silicon caused by the encapsulation and prevents cracks on the edges. Silicon can be applied to the micro array in interconnects.
  • the polyimide must be cured in particular under very uniform temperature conditions in order to prevent the formation of cracks in the polyimide and color irregularities. Low oxygen values are advantageous, for example, in order to achieve good adhesion.
  • Polystyrene or polystyrene is a thermoplastic that is primarily obtained by radical polymerization of styrene.
  • UV-reactive molecules are preferably covalently immobilized by irradiation with UV light. It is also preferred that the polymer is only applied to the surface of the microarray in predefined areas. In this way, advantageously, similar to circuits, certain Structures, a defined arrangement of the lectin spots or patterns of immobilization of the lectins are predefined. Thus, certain reactions or interactions between lectins and G are lyko Modellen controllable.
  • the surface on which the lectins are to be bound directly is positively and / or negatively charged electrically by plasma treatment.
  • plasma treatment of the polymer surface can advantageously greatly increase the surface energy and enable other processing methods.
  • the ions and radicals of the plasma in particular react with the polymer surface and generate functional groups there which advantageously determine the surface properties of the polymer.
  • the positive or negative charge in particular improves the wettability and / or the binding of the biomolecules.
  • the invention also relates to the use of the microarray and / or the binding assay of the invention for detecting an analyte and / or to a nalysis Pattern A.
  • ellipsometry can also be used.
  • adsorbed layers are measured from one surface using a polarized laser beam.
  • the reflected laser beam with changed polarization can be measured.
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • the to be tested glycostructures can, for example, in production ben be contained include lyko Wegner Natural or synthetic G and derivatives and breakdown products, defined mixtures, synthetic and natural multicomponent mixtures such as, for example, cells, cell supernatants, broths, extracts and / or sera.
  • the screening function of the described microarray and the binding assay is based in particular on the parallel use of many different, or at least two, lectins or lectin systems.
  • the targeted selection of carbohydrate-binding lectins advantageously offers a broad spectrum of binding affinities for defined sugar structures.
  • the use of the microarray and the binding assay thus makes it possible to use lectins in the form of an array for the analysis, in particular structural analysis, of glycoconjugates.
  • glycoconjugates In contrast to the known screening methods, it is advantageously also possible to detect and analyze glycoconjugates based on their glycosylation.
  • the co- and post-translational modes are fications, such as glycosylation, which takes into account and detects proteins that have a decisive influence on the physiological properties of the substances. Due to the high specificity of the selected lectins, even slightly altered sugar structures can be distinguished from one another, and structural information can thus be obtained, above all about unknown glycoconjugates.
  • a pattern analysis of the sample is also advantageously possible. This also enables the comparison of samples - such as cell lines - with each other, which is a common problem in basic research, medicine and clinic.
  • the invention thus enables the detection and analysis of new, unknown glycostructures in complex multi-substance mixtures.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of an exemplary embodiment of the lectin microarray
  • 2 shows an arrangement of immobilized lectins on a 96-well microtiter plate in array format
  • FIG. 1 shows the schematic representation of an exemplary embodiment of the lectin microarray.
  • a lectin is immobilized on the surface of a microtiter well by the high affinity blomplex streptavidin-biotin being formed. Complex glycans of glycoproteins can then bind to the saccharide binding sites of the lectin.
  • FIG. 2 shows the arrangement of immobilized lectins on the surface in array format.
  • FIG. 3 shows the advantage of this application example, which lies in the information that only complex glycoconjugates with at least two glycans are detected, which can interact with both the immobilized lectin and the detection lectin at the same time.
  • This demonstration in the form of a sandwich technique makes the analytical result particularly specific and meaningful. example
  • biotinylated RCA (lectin from F.icinus communis)
  • biotinylated WGA (lectin from Triticum vulgaris)
  • Buffer solution A- BisTris buffer pH 7.0; 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L calcium, manganese and magnesium ions
  • Buffer solution B Buffer A in which 250 ⁇ g / mL BS A (P-Indian serum albumin) are dissolved.
  • Concanavalin A (lectin from Canavalia ensiform), labeled with FITC (fluorescein-5-isothiocyanate, fluorescent dye).
  • biotinylated lectins Con A, RCA. and WGA are each dissolved in buffer A at the following concentrations: Con A: 5.5 ⁇ g / mL
  • the plate is then washed three times with buffer A. Then incubate with 100 ⁇ L buffer B per well for a further 4 h at S ° C. The plate is then washed three times with buffer A.
  • the device produced in this way consists of arranging immobilized lectins on a surface in array format (FIG. 2).
  • the lectins Con A, RCA and WGA labeled with FITC are each dissolved in buffer A at the following concentrations: Con A: 10 ⁇ g / mL RCA: 10 ⁇ g / mL WGA: 10 ⁇ g / mL
  • the plate is then washed three times with buffer A.
  • a positive fluorescence activity is measured in well A 2 and A 3.
  • Well A 1 shows no fluorescence.
  • the glycostructure (s) in the serum each have two glycans (two different glycosylation sites), the glycans have ⁇ -D-galactoses (corresponding to the affinity of RCA see below) and terminal N-acetylglucosamines or sialic acids (according to the affinity of WGA see below).
  • - Mannose-containing structures corresponding to the affinity of Con A do not appear.
  • the properties mentioned apply to the glycoprotein fetuin present in the serum.
  • P-inder-Fetuin has a carbohydrate content of around 30%. It has a total of 6 glycans, one of which
  • glycans are bound with terminal galactoses.
  • the glycostructure ß-D-Gal-1, 4-ß-D-GlcNAc-1, 0-R (terminal lactosamine) is a prerequisite for the binding of a glycan, whereby solid bonds are highly specific only with branched, multivalent N-glycans occurrence.
  • WGA is a chitin-binding lectin that has binding sites for N-acetylglucosamine (GlcNAc) and N-acetyl-neuraminic acid (NeuNAc).
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • NeuroNAc N-acetyl-neuraminic acid
  • the binding strength for oligosaccharides increases strongly with the number of GlcNAc residues.
  • the disaccharide N, N'-diacetyl-cliitobiose is bound 131 times more than the monomer and the trisaccharide N, N ', N' '-triacetyl-chitotriose is 3700 times stronger.
  • WGA binds glycoproteins containing sialic acid.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Mikroarray und einen Bindungsassay zur Detektion und zur Strukturanalyse von komplexen Glykokonjugaten, wobei das Glykokonjugat jeweils mit mindestens zwei verschiedenen Lektinen interagiert.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Strukturanalyse und etektion von komplexen Glykostrukturen
Die Erfindung betrif ft eine Vorrichtung und ein Ver- fahren zur Bestimmung und zur Analyse von komplexen Glykostrukturen .
Kohlenhydrate können in Monosaccharide, Disaccharide . Oligosaccharide und Polysaccharide unterteilt werden . Die Oligo- und Polysaccharide können wiederum in Homoglykane oder Heteroglykane gegliedert werden, wobei die Heteroglykane mit den Vertretern der Proteo- glykane , Peptidoglykane , Glykolipide und Glyko- proteine zu den biologisch wichtigen Strukturein- hei en gehören . Zusammengesetz e Kohlenhydrate , die konj ugierte Verbindungen umfassen, wie beispielsweise Glykolipide und Glykoproteine , werden auch als Glyko- konj ugate bezeichnet . Glykokonjugate gehören zu den zentralen Biomolekülen der Seile und sind an vielen physiologischen Prozessen beteiligt . Sie haben unter anderem Funktionen in der Immunabwehr , Seildifferenzierung, bei Entzündungsprozessen sowie allgemein bei Seil - Seil - Interaktionen . Aufgrund ihrer Eigenschaften und vielfältigen Funktionen im Organismus spielt die Struktur der Glykokonjugate in den Bereichen der Grundlagenforschung, der Diagnostik, der Pharmafor- schung sowie für die Arzneimittelentwicklung eine große Rolle. Der Begriff Glykokonjugate bezeichnet Moleküle, bei denen ein Kohlenhydratanteil (Mono-, Oligo- oder Polysaccharid) kovalent an ein Protein oder ein ipid gebunden ist. Die Vielfalt innerhalb dieser Substanzklasse ist sehr groß, denn zu den Glykokonjugaten gehören neben den Glykoproteinen und Glykolipiden, bei denen der Protein- bzw. Lipidanteil überwiegt, auch die Lipopolysaccharide und die Pro- teoglykane, bei denen der Kohlenhydratanteil überwiegt. Der Kohlenhydratanteil besteht bei den Glykoproteinen und Glykolipiden typischerweise aus bis zu 20 Monosacchariden, bei Lipopolysacchariden und Pro- teoglykanen kann dieser erheblich größer sein. In der Biosynthese dieser komplexen Glykokonjugate nutzt die Natur neben der Auswahl an unterschiedlichen Mono- saccharid-Bausteinen die verschiedensten Ver- knüpfungs- und Verzweigungsmöglichkeiten, so dass eine gigantische Strukturvielfalt innerhalb dieser Substanzklasse vorliegt. Kohlenhydrate weisen innerhalb der biologischen Bindungspartner von Proteinen in einer kurzen Sequenz potentiell die größte Anzahl von Variationsmöglichkeiten auf. Unter Verwendung einer üblichen Bibliothek von 20 verschiedenen Monosacchariden ergeben sich für die Bildung eines Hexasaσcharids (einschließlich verzweigter Isomere) theoretisch 1015 verschiedene Strukturen. Wenn die Oligoεaccharidketten verzweigt sind, spricht man von oligoantennären Verbindungen, wobei normalerweise di- bis pentaantennäre Strukturen vorliegen. Die dadurch gegebene "Multivalenz" der Moleküle in Bezug auf die Wechselwirkung mit einem Bindungs- partner ist ein wichtiger Aspekt für die Spezifität und Stärke der Bindung. An jeder glykosylierten Stelle eines Proteins können die Oligosacharid- strukturen variieren. Die unterschiedlich glyko- sylierten Varianten bezeichnet man als Glykoformen dieses Proteins oder auch als Mikroheterogenität .
Im Gegensatz zu Monosacchariden bzw. Disacchariden oder anderen einfach aufgebauten Molekülen ist die schnelle, einfache und sichere Strukturanalyse von Glykokonj ugaten mit bisherigen Vorrichtungen und Methoden nur bedingt möglich. In den genannten Bereichen, in denen an und mit Glykokonjugaten geforscht wird, sind analytische Verfahren zur Auf- klärung der Identität des BindungsVerhaltens und der Struktur dieser Komponenten jedoch essentiell. Die bei Mono- und Disacchariden mit Erfolg angewandten physikalisch-chemischen Analyseverfahren können nicht mit ausreichendem Erfolg auf den Bereich der Glyko- konjugate übertragen werden, da die Methoden aufgrund der Komplexität der Sielstrukturen sehr zeitaufwendig, kompliziert und wenig spezifisch sind. Aufgrund der großen Bedeutung der Glykokonjugate gab es im Stand der Technik mehrere Bestrebungen, deren Struktur sicher und effektiv zu detektieren.
Es wurde beispielsweise versucht, über massenselek- tive Verfahren eine Aussage über die Struktur zu treffen. Jedoch geben solche Verfahren keine Auskunft über das biospezifische Bindungsverhalten einer Substanz. So erfolgt die Identifizierung und Quantifizierung der Glykosilierungsmuster von Glyko- proteinen durch massenselektive Verfahren. Dabei werden die Glykoproteine zunächst aufgespalten, das heißt, die zu untersuchende Struktur wird zunächst zerstört und die Glykane oder Glykopeptide werden nach chromatographischer Auftrennung mittels Massen- Spektroskopie charakterisiert. Bei einem v/eiteren Verfahren zur Charakterisierung der Glykokonjugate, der Affinitätschromatographie, werden mit Hilfe von Lektinen, die an Gelpartikel gebunden sind, Sacchari- de oder Glykokonjugate für den Einsatz weiterer Analyseschritte aufgereinigt . Um Substanzmischungen zu fraktionieren oder Strukturinformationen über Glykokonjugate zu erhalten, steht vor allem das Verfahren der seriellen Lektin-Affinitätschromatographie zur Verfügung, bei dem die Probenkomponenten im Durchflussverfahren über -eine Kombination von Lektin- Adsorbentien fraktioniert werden.
Bei den genannten Techniken ist es nachteilig, dass eine Aufreinigung der Glykokonjugate notwendig ist, da jegliche Verunreinigungen die Analytik behindern. So ist es erforderlich, dass oft mit größeren Mengen des aufgereinigten Glykokonjugats - häufig im Milligramm-Bereich - gearbeitet werden muss, was einen großen präparativen Aufwand erfordert. Auch ist es bisher nicht möglich, Glykostrukturen in einem einheitlichen Verfahren zu detektieren, so dass die Analytik von Glykokonjugaten mit herkömmlichen Methoden immer aus mehreren Teilschritten besteht und daher sehr zeitintensiv ist. Ein zentraler Nachteil der herkömmlichen Analyseverfahren ist jedoch, dass die Glykostrukturen nicht zerstörungsfrei analysiert werden können, das heißt, die Probe befindet sich nicht mehr in ihrem nativen Sust nd, wodurch auch eine einmal analysierte Probe, die Glykostrukturen um- fasst, in der Regel nicht weiterverwendet werden kann. Komplexe Strukturen, wie z.B. Glykoproteine mit mehr als zwei oder drei mehr oder weniger verzweigten Sucker-Ketten (Glykanen) , werden von den bekannten Verfahren in der Regel nicht erfasst.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung bereitzustellen, mit der komplexe Kohlenhydrats ruk- turen, wie Glykokonj gate, schnell, einfach, sicher und effizient detektiert und in ihrer Struktur bestimmt werden können.
Die Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung eines Mikroarrays, umfassend min- destens zwei voneinander verschiedene immobilisierte, gegen die Grundstruktur eines Glykokonjugates gerichtete Lektine, wobei die Grundstruktur mindestens ein Glykan, enthaltend mindestens zwei glykosidisch ver- knüpfte Monosaccharide, umfasst.
Der Erfindung liegt demgemäß die überraschende Lehre zugrunde, dass komplexe Glykokonjugate, wie Glykopro- teine oder Glykolipide, nicht nur mit einem Lektin spezifisch wechselwirken, sondern dass sie in der Lage sind, so mit mehreren Lektinen in messbare Interaktion zu treten, dass eine Analyse der Struktur der Glykokonjugate - des Analyten - möglich ist. Durch diese Wechselwirkung ein und desselben Analy- ten, mit mehreren verschiedenen Lektinen, entstehen auf dem Array mehrere Bereiche oder Orte mit einer speziellen Lektin-Sucker-Wechselwirkung, die mit verschiedenen, dem Fachmann bekannten, Methoden detek- tiert werden können. Diese Orte der spezifischen Wechselwirkung ergeben auf dem Mikroarray ein bestimmtes Muster, insbesondere wenn die Lektine auf dem Mikroarray in einer bestimmten geometrischen Ordnung - beispielsweise in mehreren Linien oder in einem Raster - immobilisiert sind. Durch bekannte Algorithmen der Bioinformatik und Strukturanalytik ist es möglich, von diesem Muster auf die Struktur und das Bindeverhalten des Glykokonjugates bzw. auf die Glykosylierung einer Struktur zu schließen. Es kann beispielsweise vorgesehen sein, dass zwei, drei, vier oder mehrere Dutzend verschiedene Lektine auf einem geordneten Raster - immobolisiert sind. Wenn die Bereiche, in denen Lektin-Kohlenhydrat Wechselwirkungen oder Lektin-Sucker Bindungsereignisse stattfinden, mit einem Marker detektiert werden bzw. wenn durch diese Wechselwirkung zum Beispiel ein elektrischer Impuls freigesetzt wird, der gemessen werden kann, bildet sich für jedes zu untersuchende Glykokonjugat ein spezifisches Muster oder ein Impulsalgorithmus heraus, anhand dessen analoge bzw. homologe Strukturen bestimmt werden können. Während Monosaccharide, Disacchariden sowie einfach aufgebaute Oligosaccharide und einfache, nicht komplexe Polysaccharide mit physikalischen oder chemischen Me- thoden ausreichend charakterisiert werden können, ist dies bei komplexen Glykokonjugaten nicht möglich. So ist es aber mit Vorteil möglich, komplexe Glykokonjugate mit dem erfindungsgemäßen Mikroarray einfach, sicher und schnell zu detektieren und zu analysieren.
Unter Immobilisierung im Sinne der Erfindung sind alle Methoden zur Einschränkung der Beweglichkeit und Löslichkeit von Lektinen auf chemischen, biologischen und/oder physikalischen Wegen zu verstehen. Die Immo- bilisierung kann durch unterschiedliche Methoden erfolgen, wie der Bindung der Lektine untereinander oder an Träger, durch Festhalten im Netzwerk einer polymeren Matrix 'oder die Immobilisierung auf einer Membran. Durch die Immobilisierung wird ein Auswaschen der Lektine bei den verschiedenen Waschschritten verhindert. Weiterhin kann nach dem Prozess der Interaktion die biologische Probe leicht wieder vom immobilisierten Lektin abgetrennt werden. Die Bindung bzw. die Immobilisierung der Lektine an den Träger bzw. Mikroarray kann durch direkte Trägerverbindung und durch Quervernetzung erfolgen. Die Trägerbindung bzw. Quervernetzung erfolgt gemäß der Erfindung insbesondere ionisch/adsorptiv oder durch kovalente Bindung. Die Quervernetzung im Sinne der Erfindung ist eine Vernetzung der Detektionsmole- küle - das heißt der Lektine - untereinander oder mit anderen Polymeren. Bei der Immobilisierung durch Ein- schluss werden die Lektine in Gelstrukturen bzw. in Membranen so eingeschlossen, dass eine Interaktion mit den Glykokonjugaten möglich ist.
Auf den Mikroarray können Lektine z.B. durch Auf- tropfen von runden Spots oder durch Aufdrucken von Linien immobilisiert werden, wobei als Mikroarray planare wie auch nicht planare Gebilde wie Kugeln, Quader oder Fibrillen und Stäbe eingesetzt werden können, die mit unterschiedlichen Lektinen imprägniert oder immobilisiert und so in eine räumliche An- Ordnung gebracht werden.
Dem Fachmann sind zahlreiche Möglichkeiten bekannt, die Lektine auf dem Mikroarray zu immobilisieren. Die Immobilisierung sollte hierbei so erfolgen, (i) dass jedem Lektin eine definierte Position auf dem Träger oder Mikroarray zugeordnet und (ii) dass jede Position auf dem Mikroarray oder Träger unabhängig ausgewertet werden kann. Es kann aber auch vorteilhaft sein, dass sich die Auftragungsorte verschiedener Lektine teilweise oder vollständig überlappen oder dass Lektingemische in Form eines Detektionsspots aufgetragen werden. Die Immobilisierung kann beispielsweise mit einem an die Halbleitertechnik an- gelehnten Verfahren erfolgen. Auch Druckverfahren ermöglichen es, die Lektine in definierten Flächen oder Orten an oder auf der Oberfläche des Mikroarrays abzulegen, wodurch eine stabile Bindung mit hoher Kopplungseffizienz erfolgen kann. Alle dem Fachmann bekannten Immobilisierungsmaßnahmen von Biomolekülen - z.B. an Säulenmaterialien - können ebenfalls verwandt werden, um die Lektine auf dem Array zu immobilisieren.
Ausgewählte Verfahren zum Immobilisieren sind beispielsweise das Contact Tip Printing, Ring and Pin Printing, Nanoelectric Printing and Nanopipetting, Buble Jet Printing, TopSpot Printing, Micro Contact Printing, Micro Fluidic Networks-Methoden, Photo- lithographic Activation-Verfahren, Photoresist Li- thography, Electroche ical Focusing und Micro Wet Printing. Es können aber auch vergleichsweise einfache Probenauftragsgeräte aus der Dünnschichtchromatographie oder Autosampier für die HPLC sowie Pipet- ten und Mikropipetten (Kolbenhubpipetten) eingesetzt werden. Mit Hilfe dieser Verfahren kann eine Lektin- Spot-Größe von ca. 1 μm bis über 6 mm erzeugt werden. Die Lektindichte pro cm2 kann erfindungsgemäß bei- spielsweise im Bereich von ca. 0,01 bis 1000 pmol/cm2 liegen. Die genannten Verfahren ermöglichen eine einfache Handhabung und eine große Präzision der angelegten Volumina sowie sehr homogene Lektinspots, die mit einer hohen Parallelisierung auftragen werden. Die Verfahren, die eine direkte Synthese der Lektine auf dem Träger ermöglichen, weisen insbesondere eine hohe Integrationsdichte und eine einfache Kombination von Immobilisierung und Kopplung auf. Es ist möglich, die Lektine, die auch als Sonden bezeichnet werden können, mit weiteren Verfahren vorzubereiten, um den Anteil unspezifisch synthetisierter bzw. gebundener Lektine gering zu halten.
Die Lektine können jedoch auf dem Mikroarray auch durch ein Blot-Verfahren immobilisiert werden. Hierzu werden die Lektine oder sie umfassende Zellen oder Gewebe mittels einer Elektrophorese aufgetrennt. Die elektrophoretische Auftrennung kann z.B. mittels einer eindimensionalen oder mehrdimensionalen Elektro- phorese, insbesondere einer 2D-Elektrophorese, erfolgen.
Die elektrophoretisch aufgetrennten bzw. separierten Lektine werden dann entweder auf den Träger bzw. Mikroarray übertragen bzw. auf eine Membran, die in einem nächsten Schritt auf den Träger oder Mikroarray aufgebracht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Mikroarray mindestens zwei voneinander verschiedene immobilisierte Lektine, wobei die Lektine isolierbar sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Abrus precatorius, Adenia digitata, Agaricus bisporus, Aleuria aurantia, Amaranthus caudatus, Amphicarpaea biacteata, Anguilla anguilla, Arachis hypogaea, Artocarpus integrifolia, Bauhinia purpurea alba, Brachypodium sylvaticum, Canavalia ensiformis, Carcino scorpius rotunda canda, Cicer arietinum, Codium fragile, Crotalaria juncea, Cytisus sessilifolius, Datura stramonium, Dioclea grandiflora, Dolichos biflorus, Erythrina coralldendron, Erythrina cristagalli, Euonymos europaea, Galanthus nivalis, Glycine max, Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia, Helix aspersa, Helix pomatia, Hippeaεtrum hybrid, Hordeum vulgäre, Hura crepitaus, Latyrus odoratus, Latyrus sativuε, Latyrus tingitanus, Lens culinaris, Lima; glavus , Limulus polyphemus, Lotus tetragonolobus , Lycopersicon esculentum, Maackia amurensis, Maclura po ifera, Macrotyloma axillare, Momordica charantia, Narcissus pseudonarcissus, Oryza εativa, Phaseolus coccineus, Phaseolus limensis, Phaseolus vulgaris, Phytolacca americana, Pisum sativum, Phosphocarpus tetragonolobus , Pseudomonas aeruginosa, Ricinus communis, Sambucus nigra, Seeale cereale, Solanum tuberosum, Sophora japonica, Triticum vulgaris, Tritricho onas mobilensis (Protozoe) , Ulex europaeus, Vicia cracca, Vicia ervilia, Vicia graminea, Vicia faba, Vicia sativa, Vicia villosa, Viscum album, Wisteria floribunda, weiterhin können folgende humane, insbesondere rekombinant hergestellte, Lektine eingesetzt werden: E-Selecin (human, recombinant) , L-Selectin (human, recombinant) und/oder P-Selectin (human, recombinant) sowie Galectine (human) . Aus den genannten Organismen können mit Vorteil spezifische Lektine isoliert werden, die dazu geeignet sind, komplexe Glykostrukturen bzw. Glykokonjugate so zu binden, dass eine Detektion und Strukturanalyse möglich ist. So kann beispielsweise aus Agaricus bisporus das Lektin ABA, -aus Aleuria aurantia AAL, aus Amaranthus caudatus ACL (ACA) , aus Anguilla (Eel) anguilla AAA, aus Arachis hypogaea PNA, aus Artocarpus integrifolia AIL (Jacalin) , aus Griffonia
(Bandeiraea) si plicifolia GSL BSL, aus Bauhinia purpurea alba BPL (BPA) , aus Canavalia ensiformis Con
A, aus Datura stramonium DSA, aus Dolichos biflorus
DBA, ' aus Erythrina coralldendron Ecor A, aus Erythrina cristagalli ECL (ECA) , aus Euonymos europaeus EEL, aus Galanthus nivalis GNL, aus Glycine πtax SBA, aus Helix aspersa HAA, aus Helix po atia HPA, aus Hippeastrum hybrid HHL (AL) , aus Lens culinaris LCA, LcH (Lentil) , aus Lotus tetragonolobus LTL, aus Lycopersicon esculentum LEA (Tomato) , aus Maackia amurensis MAA, aus Maclura pomifera MPA, aus Narcissus pseudonarcissus NPL, NPA, aus Phaseolus coccineus PCA, aus Phaεeoluε limensis LBA, aus Phaseolus vulgaris PHA, aus Phytolacca americana PWM, aus Pisu sativum PSA, aus Pseudomonas aeruginosa I PA-I, aus P.icinus communis RCA60 und RCA130, aus Sambucus nigra SNA, aus Solanum tuberosum STA (Potato) , aus Sophora japonica SJA, aus Triticum vulgaris WGA (Wheat Germ Agglutinin) , aus Tritrichomonas mobilensis (Protozoe) TML, aus Ulex europaeus I UEA-I, aus Vicia faba VFA, aus Vicia villosa WA, aus Viscum album VAA und aus Wisteria floribunda WFA (WFL) gewonnen werden, weiterhin sind die humanen (rekombinant, aus einer CHO Zelllinie) Lektine E-Selecin (human) CDS2E, ELAM-1, CD62L, LAM- 1, L-Selectin (human) LECAM-1, MEL-14, CD62P, GMP- 140, P-Selectin (human) LECAM-3 und/oder PADGEM sowie Galectine gewinnbar, wobei "L" einem Lektin ent- spiύcht und "A" einem Agglutinin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaεst der Mikroarray mindestens zwei voneinander verschiedene immobilisierte Lektine, wobei die Lektine zu den zu detektierenden Glykostrukturen eine Bindungsaffinität von Kd ≤ 10~s mol/1 aufweisen. Mit Vorteil ist es bei einer Bindungεaffinität von Kd ≤ 10"* mol/1 möglich, die Interaktion zwischen Glykokonj ugat und immobilisierten Lektinen so genau zu analysieren und zu detektieren, dass ein qualitativer Nachweis des Glykokonjugates und eine Strukturanalyse effizient möglich ist.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfassen die immobilisierten Lektine einen Bindungslinker. Bindungslinker im Sinne der Erfindung sind alle Strukturen, die so mit den Lektinen assoziiert sind, dass diese kovalent oder komplex auf einem Träger des Mikroarrays bzw. auf dem Mikroarray selbst immobilisiert werden können. Die Linker können beispielsweise Peptidfragmente im Bereich von 0 bis 50 Aminosäuren sein. Die Lektine, die Linker umfassen, werden demgemäß vorteilhafterweise nicht über eine unspezifische Adsorption auf dem Mikroarray immobilisiert. Die Linker können auch so ausgebildet sein, dass eine Interaktion zwischen den einzelnen Lektinen bzw. Lektinen und den Trägern so ausgeschlossen ist, dass Störungen bzw. unspezifische Interaktionen nicht oder nur in sehr geringem Umfang auftreten. In solch einem Fall können die Linker beispielsweiεe als Abstandshalter eingesetzt werden. Linker im Sinne der Erfindung können demgemäß auch kurze synthetische DNA-Doppelstränge sein. Sie können auch dazu einge- setzt werden, bestimmte Lektine zunächst zu immobilisieren, um sie dann mit Hilfe spezifischer, beispielsweise DNA-Doppelstrang abbauender Enzyme, wieder abzuspalten. So ist es beispielsweise möglich, die komplexen Glykokonjugatstrukturen in einem ersten Schritt mit mehreren spezifischen Lektinen inter- agieren zu lassen, wobei ausgewählte Lektine dann durch einen Abspaltungsschritt mittels spaltbarer Linker vom Mikroarray gelöst werden, so dass die Glykokonjugatstrukturen in einer Probe nun mit anderen Lektinen wechselwirken können, die z.B. eine andere Bindungsaffinität als die abgespaltenen Lektine aufweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Linker insbesondere Streptavidin und/oder Biotin. Streptavidin im Sinne der Erfindung ist ein Protein aus Streptomyciε avidinii, das mit einer Affinität von 10"15 M"1 an Biotin bindet und das ein Molekulargewicht von zirka 60.000 Da aufweist. Es weist vorteilhafterweise eine geringere unspezifische P-eaktion als Avidin auf. Biotin im Sinne der Erfindung sind Coenzyme der Enzyme, die Carboxylierungen katalysieren. Die sehr hohe Affinität von Biotin für Streptavidin als auch für Avidin kann vorteilhafterweise zur Immobilisierung von biotinylierten Reagenzien genutzt werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Mikroarrays werden die Lektine mit einer Packungs- dichte von > 50 ng/cm2 immobilisiert. Eine daraus resultierende Oberflächehbelegung von > 10 % ermöglicht eine optimale Wechselwirkung mit den Glykostrukturen. Die Varianten der möglichen Funktionali- sierungen von Trägermaterialien sind selbstverständlich vielfältig. Voraussetzung für die Anbindung von Lektinen ist das Vorhandensein von entsprechenden funktionellen Gruppen auf dem Trägermaterial, mit denen das Lektin reagieren kann. Es können unter anderem folgende Varianten eingesetzt werden.- Funk ionaliεierung mit Carboxylgruppen, Funktionali- sierung mit Aminogruppen, Funktionalisierung mit Aldehydgruppen, Funktionalisierung mit Phenylgruppen, Funktionalisierung mit Thiolgruppen, Funktiona- lisierung mit Divinylsulphone (entstehende Bindung: Ether, Thioether, sekundäre Amine) , Funk ionaliεierung mit Carbonyldiimidazol, Funktionalisierung mit Epichlorhydrine (entstehende Bindung: Ether, Thioether, sekundäre Amine) , Funktionalisierung mit
Glutaraldehyd (entstehende Bindung: Michaels Adduct,
Schiffsehe Base; Vorteil: gute Stabilität der
Bindung) , Funktionalisierung mit Hydrazine
(entstehende Bindung.- Amid-Bindung) , Funktionalisierung mit Periodat (entstehende Bindung.- Alkylamin) , Funktionalisierung mit Diazonium (entstehende Bindung: Azo) , Funktionalisierung mit Tri- chloro-S-triazine (entstehende Bindung: Triazinyl) , Bisoxirane (entstehende Bindung-. Alkyla ide, Ether, Thioether) , Cyanbromid (entstehende Bindung: Isoharnstoff, Imid, (carbamat) , Funktionalisierung mit 4-Nitropheny-chloroformate (entstehende Bindung: Anhydrid, Carbamat, Urethan) , Funktionalisierung mit Epoxidgruppen und die Funktionalisierung mit orga- nischen Sulfonylchloriden (Tosylchlorid, Tresyl- chlorid) (entstehende Bindung: Alkylamin) .
Mit Vorteil ist die Funktionalisierung in einer schnellen Reaktion möglich, wobei die Immobilisierung der Lektine über die beschriebenen Methoden besonders vorteilhaft ist, da εich hier eine kovalente Bindung ausbildet . Das verhindert die Auswaschung der Lektine und dadurch einen Verlust an Bindungsaktivität oder beim erwünschten Ablösen der Probe eine Kontamination dieser durch Lektin-Moleküle .
Die Immobilisierung erfolgt bei individuellen Reaktionsbedingungen und ist häufig unter Verwendung weiterer Chemikalien durchzuführen. Die Immobilisierung an Epoxidgruppen erfordert beispielεweise 8 - 48 h bei pH-Werten von pH 8,5 - 12. Die Anbindung von Proteinen an mit Carboxylgruppen aktivierte Matrices erfolgt bei pH 4 - 6 in 24 - 48 h. Dabei ist die Verwendung von Carbodiimid für die Pveaktion vorteilhaft. Die Immobilisierung von Proteinen an mit Aminogruppen substituierte Träger erfolgt ebenfalls unter Verwendung weiterer Chemikalien wie Carbodiimid oder NaCNBH3.
Vorteilhafterweise wird eine Funktionalisierung mit Tresylchlorid (2,2, 2-Trifluorethan-sulfonylchlorid) verwendet. Die Funktionalisierung von Trägermaterialien mit Tresylchlorid eignet sich besonderε für die Anbindung von Proteinen, da die Reaktion unter milden Bedingungen stattfindet (pH 7-9) und die Proteine nicht schädigt. Die Bindung erfolgt über primäre Aminogruppen oder Thiolgruppen der Aminosäuren des Proteins. Die Reaktion ist vergleichsweise schnell (wenige Stunden) und läuft ohne den Einsatz weiterer Chemikalien ab. Die Tresylaktivierung ist bei trockenem Material oder bei Lagerung in verdünnter Salzsäure einige Monate stabil.
Mitunter ist es sinnvoll, den Träger unter Einbindung eines so genannten Spacers, eines Abs andεhalters , zu funktionalisieren. Dieser Spacer vergrößert die Distanz zwischen Trägeroberfläche und Ligand und kann daher zu einer besseren Zugänglichkeit des Liganden beitragen. Übliche Spacer bestehen aus zwei ter- inalen funktioneilen Gruppen und einer in der Länge wählbaren C-Kette wie z.B. 6-Aminohexansäure . Der verwendete Linker, das heißt die verwendete Träger- funktionalisierung, kann auch bereits selbst einen Spacer darstellen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst der Mikroarray Metall, Polypropy- len, Teflon, Silizium, Polyethylen, Polyester, Poly- styren, Nitrid, Keramik, Quarz und/oder Glas. Metalle im Sinne der Erfindung sind alle Verbindungen, deren Zusammenhalt durch ein Kristallgitter entsteht. Die Grenze zwischen Metallen und Nichtmetallen ist flie- ßend, so dass auch die Elemente Ce, Sn, As und Sb im Sinne der Erfindung Metalle sind. Zu den Metallen gemäß der Erfindung gehören auch die metallischen Gläser, das heißt Werkstoffe, die sich in einem meta- stabilen, weitgehend amorphen Zustand befinden. Selbstverständlich sind auch metallisch leitfähige Polymere Metalle im Sinne der Erfindung. Vorteilhafterweise weisen Metalle im Sinne der Erfindung insbesondere eine gute Festigkeit, eine gute Härte und Verschleißbeständigkeit, eine hohe Zähigkeit und eine gute elektrische und thermische Leitfähigkeit auf. Polypropylene im Sinne der Erfindung sind thermoplastische Polymere des Propylens . Polypropylene zeichnen sich insbesondere durch eine hohe Härte, Rückstellfähigkeit, Steifheit und Wärmebestandigkeit aus. Der Mikroarray kann jedoch auch Teflon umfassen. Teflon gemäß der Erfindung sind Polytetrafluoro- ethylene, die vorteilhafterweise gute thermoplastische Eigenschaften aufweisen. Polyethylene entstehen insbesondere durch eine Polymerisation von Ethylen nach im Wesentlichen zwei unterschiedlichen Methoden, dem Hochdruck- und dem Niederdruckverfahren. Polyethylene, die im Hochdruckverfahren hergestellt werden, weisen vorteilhafterweise eine geringe Dichte auf. Die Eigenschaften von Mikroarrays, die Polypropylen umfassen, werden im Wesentlichen durch den Charakter des Polyethylen als partiell kristallinem Kohlenwasserstoff bestimmt. Vorteilhafterweise sind Polyethylene bis zu 60° in allen üblichen Lösungs- mittein praktisch unlöslich. Vorteilhafterweise bewirken polare Flüssigkeiten wie Alkohol, Ester und Ketone bei Zimmertemperatur kaum eine Quellung von Polyethylenen. Gegen Wasser, Laugen und Salzlösungen sowie anorganische Säuren verhalten sich Polyethylene vorteilhafterweise völlig indifferent. Mikroarrays oder Träger, die Polyethylene umfassen, haben z.B. eine sehr geringe Wasserdampfdurchlässigkeit . Der Mikroarray kann jedoch zweckmäßigerweise auch Polyester umfassen. Polyester im Sinne der Erfindung sind Verbindungen, die durch Ringöffnungspolymerisation von Lactonen oder durch Polykondensation von Hydroxycarbonsäuren bzw. von Diolen und Dicarbon- säuren bzw. Dicarbonsäurederivaten hergestellt wer- den. Polyester im Sinne der Erfindung umfassen auch Polyesterharze, Polyesterimide, Polyesterkautschuke, Polyesterpolyole und Polyesterpolyuretane . Polyester sind vorteilhafterweise Thermoplaste und besitzen ausgesprochenen WerkstoffCharakter . Sie zeichnen sich beispielsweise durch eine hohe Thermostabilität aus und können zu Legierungen mit Metallen, wie beispielsweise Kupfer, Aluminium und Magnesium, verarbeitet werden. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass der Mikroarray Keramik umfaεst. Keramik im Sinne der Erfindung ist eine Sammelbezeichnung für aus insbesondere anorganischen und überwiegend nicht- metallischen Verbindungen und Elementen aufgebaute und insbesondere zu mehr als 30 Vol.% kristalline Materialien umfassende Stoffklasse. Dem Fachmann sind verschiedene Keramiken bzw. keramische Werkstoffe bekannt, die er als Mikroarray einsetzen kann. Es kann sich beispielsweise um so genannte Töpferware, Steingutgeschirr, Spaltplatten, Laborporzellan, Ge- schirrporzellan, Knochenpσrzellan, Aluminiumoxidkeramik, Dauermagnetwerkstoffe, Silicasteine und Magnesiasteine handeln. Bei tonkeramischen Werkstoffen wird im Sinne der Erfindung in grobe und feine Werkstoffe unterschieden, wobei feine tonkeramische Werkstoffe Irdengut, Steingut, Steinzeug und Porzellan umfassen. Es können jedoch mit Vorteil auch sonderkeramische Werkstoffe wie Glas-, Oxidkeramik, SiC-Steine und schmelzflüssig gegossene Steine als Mikroarray eingesetzt werden. Bevorzugt kann der Mikroarray auch Glas umfassen. Glas im Sinne der Erfindung sind Stoffe im amorphen, nichtkristallinen Festzustand, das heißt, der Glaszustand lässt sich im Sinne der Erfindung als eingefrorene unterkühlte Flüssigkeit bzw. Schmelze auffasεen. Gläser sind daher anorganische oder organische, meist oxidische Schmelzprodukte, die durch einen Einführvorgang ohne Auskristallisation der Schmelzphasenkomponenten in einen festen Zustand überführt wurden. Selbstverständlich sind im Sinne der Erfindung auch Kristalle, Quarz, Schmelzen und unterkühlte Schmelzen als Gläser aufzufassen. Die Gläser können zum Beispiel Flachglas, Behälterglas, Wirtschaftsglas, Laborgeräteglas, Bleikristallglas, Faserglas, optische Glasfasern und andere sein. Selbstverständlich ist es auch möglich, daεs Silicat-freie Gläser, beispielsweise Phosphatgläser, eingesetzt werden. Der Mikroarray kann j doch auch so beschaffen sein, dass optische Gläser, das heißt, z.B. Gläser mit besonderen optischen Bre- chungsindexen, eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Bindungsassay zur Bestimmung von Glykostrukturen in einer Probe, wobei die Probe mit mindestens zwei voneinander verschiede- nen immobilisierten Lektinen unter Ausbildung von Lektin-Ξucker-Komplexen in Kontakt gebracht wird und die Lektin-Sucker-Komplexe in an sich bekannter Weise detektiert werden und die Lektine isolierbar sind, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Abrus precatorius, Adenia digitata, Agaricus bisporuε, Aleuria aurantia, Amaranthus caudatus, Amphicarpaea biacteata, Anguilla anguilla, Arachis hypogaea, Artocarpus integrifolia, Bauhinia purpurea alba, Brachypodium εylvaticum, Canavalia ensiformiε, Carcino scorpius rotunda canda, Cicer arietinum, Codium fragile, Crotalaria juncea, Cytisus sessilifolius, Datura stramonium, Dioclea grandiflora, Dolichos biflorus, Erythrina coralldendron, Erythrina cristagalli, Euonymos europaea, Galanthus nivalis, Glycine max, Griffonia
(Bandeiraea) si plicifolia, Helix aspersa, Helix pomatia, Hippeastrura hybrid, Hordeum vulgäre, Hura crepitaus, Latyrus odoratus, Latyrus sativus, Latyrus tingitanus, Lenε culinariε, Limax glavus, Li ulus polyphemus, Lotus tetragonolobus, Lycopersicon esculentum, Maackia amurensis, Maclura pomifera, Macrotyloma axillare, Momσrdica charantia, Narcissus pseudonarcissus, Oryza sativa, Phaseolus coccineus , Phaseolus limensis, Phaseolus vulgaris, Phytolacca americana, Pisum sativum, Phosphocarpus tetragonolobus, Pseudomonas aeruginosa, Ricinus communis, Sambucus nigra, Seeale cereale, Solanum tuberosum, Sophora japonica, Triticum vulgaris, Tritrichomonas mobilensis (Protozoe) , Ulex europaeus, Vicia cracca, Vicia ervilia, Vicia graminea, Vicia faba, Vicia sativa, Vicia villosa, Viscum album, Wisteria floribunda, weiterhin können folgende humane, insbesondere rekombinant hergestellte, Lektine eingesetzt werden: E-Selecin (human, recombinant) , L-
Selectin (human, recombinant) und/oder P-Selectin
(human, recombinant) sowie Galectine (human) . Die
Bestimmung von Glykostrukturen durch den erfindungs- gemäßen Bindungsassay betrifft zum einen die Detek- tion, das heißt den qualitativen Nachweis von in einer Probe befindlichen Glykostrukturen, als auch die Detektion von bestimmten Pattern auf dem Mikroarray, die Rückschlüsse darüber zulassen, mit welchen immobilisierten unterschiedlichen Lektinen ein und dieselbe Glykostruktur wechselwirkt, um so die Struktur des komplexen Oligo- oder Poly- saccharides oder des Glykokonjugates zu bestimmen. Eine Probe im Sinne der Erfindung ist die Bezeichnung für ein durch Probenentnahme entnommenes biologisches oder chemisches Gut oder eines Teiles bzw. einer kleinen Menge eines solchen, dessen Beschaffenheit chemisch, biologisch, klinisch oder ähnlich geprüft werden soll . Die Probenentnahme erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Die durch Untersuchung der Probe ermittelten Merkmale dienen der Beurteilung der durch die Probe e fassten Menge, die RUCKSchlüεse auf die Gesamtmenge, z.B. Trinkwasser, Lebensmittel, Gewebe, Zellen, Zellkulturen, Sellkultur-Überstände, transplantierte Organe und anderes , zulässt. Für die Untersuchung können die Proben durch Mischen, Serteilen, Separieren, Vorfraktionieren, Zerkleinern, Sugabe von Enzymen oder Markern - bzw. anders vorbehandelt werden. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten der Vorbehandlung der Proben bekannt. Selbstverständlich kann es auch vorgesehen sein, dass die Probe so entnommen wird, dass sie keinem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht . Eine Probe können alle biologischen und nichtbiologischen Materialien sein, wie biologische Gewebe und Flüssigkeiten, z.B. Blut, Lymphe, Urin, Gehirnflüssigkeit und andere, sowie Umweltabwässer, Bioreaktorenflüssigkeiten, Lebensmittelinhaltsstoffe, Gefahren- Stoffe, Aerosole, Lipid ischungen u.v.a. mehr.
In einer vorteilhaften Ausführung form des Bindungs- assays werden die Lektine physikalisch, chemisch und/oder biologisch durch in situ Synthese oder durch Ablegen zuvor synthetisierter Lektine auf dem Mikroarray immobilisiert. Für den Bindungsassay können unabhängig von der Art der immobilisierten Lektine die Träger oder Mikroarrays auf zwei prinzipiell ver- schiedenen Wegen hergestellt werden:
1. Ablegen und Immobilisieren von zuvor synthetisierten oder aus Bibliotheken stammenden Lektinen an definierten Positionen eines funktionali- sierten Trägermaterials . Hierfür können sowohl Spotting als auch Druckverfahren eingesetzt werden. Unter Spotting versteht man Verfahren, bei denen Flüssigkeitεtropfen abgelegt werden, wobei durch Oberflächenwechselwirkung und Trocknen im Wesentlichen runde Spots entstehen. Andere Druckverfahren ermöglichen das Substrat in definierten Flächen auf der Oberfläche abzulegen.
2. In si u-Synthese der Lektine an definierten Po- sitionen des Trägers oder des Mikroarrays durch sukzessive Kopplung monomerer Synthesebausteine.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform werden die Lektine durch Contacc Tip Printing, Ring and Pin Printing and Nanopipetting, Buble Jet Printing, TopSpot Printing, Micro Contact Printing, Micro Fluidic Networks-Methoden, Photolithographic Activa- tion-Verfahren, Photoresist Lithography, Electroche- mical Focusing und/oder Micro Wet Printing immobilisiert .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Er- findung ist die Oberfläche des Mikroarrays mit Poly- L-Lysinen, Aminosilanen, Aldehydsilanen, Epoxy-Grup- pen, Gold, Streptavidin, Polylysinen, Silanen, reaktiven Gruppen, Polyacrylamid-Pads , immobilisierter Nitrocellulose, aktivierten Aldehyden, Agarose- Aldehyd-Gruppen und/oder Tresyl-Gruppen beschichtet. Durch derartige Substratoberflächenbehandlungen ist es vorteilhafterweise möglich, die Haltbarkeit und die Bindungskapazität der Oberfläche der Mikroarrays so zu verbessern, dass die Lektine sehr gut über einen längeren Zeitraum immobilisiert bleiben können. Selbstverständlich kann die Oberfläche des Trägers ganz allgemein, insbesondere durch Einwirken von biologischen, physikalischen und/oder chemischen Einflüssen erfolgen. Physikalisches Einwirken sind beispielsweise das Polieren, Ätzen, Beizen, Sandstrahlen, aber auch physikalische Verfahren, die zu einem Härten, Beschichten, Vergüten, Überziehen mit Schutzhäuten und ähnlichem fuhren. Eine Oberflächenbehandlung durch biologische Einwirkung kann bei- spielsweise das Bewachsen durch Mikroorganismen umfassen. Eine chemische Modifikation der Oberfläche der Träger beinhaltet beispielsweise die Behandlung mit Säuren, Basen, Metalloxiden und anderen. Die Oberfläche der Träger kann so modifiziert werden, dass die Detektionsmolekule bzw. die Lektine auf dem Träger besonders gut haften bzw. so haften, dass sie in ihrer Aktivität nicht nachteilig modifiziert werden. Eine Oberflächenmodifizierung der Träger umfasst selbstverständlich auch eine Behandlung, die zu einer erhöhten Stabilität und Bruchfestigkeit insbesondere des Mikroarrays führt. Eε können selbstverständlich auch klassische Oberflächenmodifizierungen aus der Histologie vorgenommen werden, wie daε Beschichten mit z.B. Eiweißglycerin, Polylysin, aktivierten Dextranen und/oder Chromgelatine.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden vor oder nach der Ausbildung der Zucker-Lektin-Komplexe ein markiertes oder unmarkiertes Lektin, eine markierte oder unmarkierte Glykostruktur und/oder ein markierter oder unmarkierter Antikörper zugesetzt.
Mit Vorteil können folgende Detektionssysteme eingesetzt werden:
Direkt : Die Probenmoleküle selbst werden mit einem Marker versehen (Enzym (A) , Fluoreszenz- oder Vis- Farbstoff (B) , Biotin (C) ... )
Nach dem Bindungsereignis und dem Waschen kann entweder : direkt ausgelesen werden (B) oder nach Umsetzung eines Enzy substrates und Auslesung des entstehenden Farbsignals (A) oder (C) nach Zugabe eines weiteren Markers (Enzym, Fluoreszenz- oder Vis-Farbstoff) , der mit Avidin/Streptavidin gekoppelt ist.
Mit Vorteil wird ein einfaches, schnelles, direktes Ergebnis erreicht, da die Probe selbst markiert wird.
Indirekt: Nach Adsorption der Probenmoleküle werden diese mit einem für das zu bestimmende Glykokonjugat spezifischen Antikörper oder Lektin versehen. Dieser ist wiederum markiert. Nach erfolgter Bindung kann das Ereignis ausgelesen werden.
Durch die "doppelte" Spezifität wird vorteilhafterweise sehr gezielt eine bestimmte Substanz nachge- wieεen.
Sandwich: Nach Adsorption der Probenmoleküle werden diese mit dem selben Lektin versehen, welches auf der Oberfläche immobiliεiert ist (siehe Ausführungs- beiεpiel) . Dieses Lektin bindet an das zu bestimmende Glykokonjugat spezifisch von der gegenüberliegenden Seite und ist selbst wiederum markiert. Nach erfolgter Bindung kann das Ereignis ausgelesen werden. Mit Vorteil wird die selbe Zuckerstruktur "doppelt" erkannt und detektiert. Es kann die eine Zuckerspezi- fität bestimmt werden. Es werden nur komplexe Systeme mit mindestens zwei Glykosylierungssteilen erfasst. Es werden nur die ohnehin vorhandenen Lektine benötigt, keine weiteren Antikörper o.a..
Kompetitiv: Nach Adsorption der Probenmoleküle werden die wells mit einem markierten Modelladsorptiv versehen. Dieses bindet bekanntermaßen das immobilisierte Lektin. Das Modelladsorptiv kann nur an noch freie Bindungs teilen andocken bzw. konkurriert mit dem Probenmolekül um diese Bindungsstellen. Es wird ein positives Signal erhalten, wenn keine oder nur wenige Probenmoleküle angebunden sind bzw. nach dem Verhältnis, das sich in dieser KonkurrenzSituation einstellt.
Vorteilhafterweise ist der Nachweis von Systemen mit nur einer komplexen Zuckerstruktur möglich. Es werden bekannte Modellsyεteme eingesetzt. Die ko petitive Situation gibt auch Auskunft über die Bindungs- konstanten des Komplexes mit dem Probenmolekül.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird zur Markierung ein Enzym, ein Farb- stoff, ein Fluoreszenzmarker, ein Radioisotop, ein Metallkolloid und/oder ein Chelator eingesetzt. Dem Fachmann sind Methoden bekannt, wie er Marker insbesondere durch Verstärkungsmechanismen sensitiver ausbilden kann. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Lektine an Mikrotestplatten, Glasplättchen, Membranen, Geflechte, Fibrillen, insbesondere aus Po- lypropylen, Nitrozellulose, Glas und/oder PVDF immobilisiert. Als Mikrotestplatten können z.B. Mikroti- terplatten eingesetzt werden. Vorteilhafterweise weisen Mikrotestplatten Maße auf, die einen Einsatz in zahlreichen Laborroutinen gestatten. Beispielsweise sind zahlreiche Fluoreszenzmessgeräte, Fluoreszenz- spektrometer und -photometer wie Fluoreszenz - mikroskope und ähnliches so ausgebildet, dass Mikrotestplatten als Standard verwandt werden können. Die Immobilisierung der Moleküle auf spezielle Labor- gefäße, beispielsweise Mikrotiterplatten, Petri- schalen, Vielf chschalen, Multischalen und andere Kulturgefäße und Objektträger, ermöglicht daher vorteilhafterweise auch die Verwendung der vorhandenen Labormittel und -gerate zum Inkubieren, Einfrieren, Lyophilisieren und ähnlicher Laborgeräte in klinischen oder Forschungslaboratorien. Als Mikrotestplatten können beispielsweise bevorzugt Mikrotiterplatten mit transparentem, nicht fluoreszierendem Flachboden verwandt werden oder weißem oder εchwarze , undurch- sichtigem Flachboden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungε orm der Erfindung wird eine weitgehende planare Oberfläche des Mikroarrays mit einem Polymer beschichtet und folgend werden Lektine mittels des Polymers auf der Oberfläche immobilisiert. Vorteilhafterweise erfolgt in dieser Ausführungsform die Immobilisierung der Lektine direkt über das Polymer.
Bevorzugt iεt das Polymer so ausgewählt, dass es eine hydrophobe Oberfläche ausbildet und die Oberfläche gegenüber einem wässrigen Medium elektrisch isoliert. Mit Vorteil kann diese hydrophobe glatte Oberfläche unter anderem einen Selbstreinigungsef ekt zeigen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polymer ein Polyimid oder Polystyren. Wählt man das Polymer geeignet aus, z.B. Polyimide, lassen sich auch weitere Mikroarrays oder sogar zusätzliche Microsysteme mit derselben anorganischen Oberfläche, z.B. einer Halbleiterschalung, industriell zu einem System verbinden. Polyimide sind insbeεondere hochtemperaturbeständige Polymere; vor- teilhaft weisen sie ausgezeichnete mechanische, thermische und elektrische Eigenschaften auf. Die Anwendungen des Polyimids umfassen insbesondere Pufferschichten, Passivierungsschichten, Bindeschichten und dielektrische Zwischenschichten auf dem Träger. Poly- imide werden insbesondere flüssig aufgebracht und dann ausgehärtet. Bei diesem Aushärtungsεchritt erhält daε Polyimid mit Vorteil die gewünschten Eigenschaften. Für die Anwendungen kann das Polyimid li- thographisch strukturiert werden. Polyimid kann selbstverständlich auch als Haftungsvermittler für Vergussmaterial und als Pufferschicht eingesetzt werden. Die Polyimidschicht reduziert beispielsweise den Stress im Silicium, der durch die Kapselung hervorgerufen wird und verhindert Risse an den Kanten. Silicium kann in Leitbahnen auf dem Mikroaray aufgebracht sein. Das Polyimid muεs insbesondere unter sehr gleichmäßigen Temperaturbedingungen gehärtet werden, um Risεbildung im Polyimid und Farbungleich- mäßigkeiten zu verhindern. Niedrige Sauerεtoffwerte sind z.B. vorteilhaft, um eine gute Haftung zu erreichen. Polystyren oder Polystyrol ist ein thermoplastischer Kunststoff, der vor allem durch radi- kaiische Polymerisation von Styrol gewonnen wird. Das radikalische Ende einer wachsenden Polymerkette qreift nie eine Doppelbindung im Ring an, da der Ben- ∑olring eine außerordentlich stabile Struktur ist. Hieraus leiten sich mehrere Vorteile bei der Ver- wendung von Polystyrol ab, beispielsweise iεt Polystyrol be tändig gegenüber Säuren, Laugen und Alkohol .
Bevorzugt werden UV reaktive Moleküle durch die Bestrahlung mit UV Licht kovalent immobilisiert. Bevor- zugt ist weiterhin, dass das Polymer nur in vordefinierten Bereichen auf die Oberfläche des Mikroarrays aufgetragen wird. Hierdurch können vorteilhafterweise, ähnlich wie bei Schaltkreisen, bestimmte Strukturen, eine definierte Anordnung der Lektin- Spotε oder Muster der Immobilisierung der Lektine vorgegeben v/erden. Somit sind bestimmte Reaktionen oder Wechselwirkungen zwischen den Lektinen und Glykostrukturen steuerbar.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die Oberfläche, auf der die Lektine direkt gebunden werden sollen, durch Plasmabehandlung positiv und/oder negativ elektrisch geladen. Das heißt, die Oberflächen εind an den unterschiedlichsten Stellen unterschiedlich geladen. Polymere Werkstoffe liegen insbesondere in verschiedenen Formen vor. Die einzelnen Formen stellen unterschied- liehe Anforderungen an den Bearbeitungsprozess . Je nach Ausformung der Oberfläche ist diese z.B. den Plasmen in unterschiedlicher Weise zugänglich. Eine Plasmabehandlung der Polymeroberfläche kann vorteilhafterweise die Oberflächenenergie stark erhöhen und andere Verarbeitungsverfahren ermöglichen. Bei einer Plasmabehandlung reagieren vor allem die Ionen und Radikale des Plasmas mit der Polymeroberfläche und erzeugen dort funktionale Gruppen, welche die Oberflächeneigenschaften des Polymers mit Vorteil beεtim- men. Durch die positive oder negative Ladung wird insbesondere eine bessere Benetzbarkeit und/oder eine bessere Bindung der Biomoleküle erreicht. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Mikroarrays und/oder des erfindungsgemäßen Bindungsassays zum Nachweis eines Analyten und/oder zu einer Pattern Analyse . Neben den genannten Verfahren kann auch die Ellipsometrie eingesetzt werden. Bei dieser Technik werden adsorbierte Schichten (Monolayer und Submono- layer) aus einer Oberfläche mittels eines polarisierten Laserstrahls vermessen. Der reflektierte Laserstrahl mit veränderter Polarisation kann vermes- sen werden.
Die Technik der SPR (Surface Plasmon Resonance) arbeitet mit einem Sensorchip, der aus einer goldbeschichteten Glasplatte, überschichtet mit einem Polymer, besteht. Ein Prisma ist auf der Glasoberfläche installiert. Ein Signal entsteht durch die Änderung des Brechungsindex durch das Prisma, wenn aus der vorbeifließenden Lösung Moleküle an den Sensor adsorbieren. Das Signal zeigt eine Massen- änderung an, die auf der Goldoberfläche stattfindet.
Mit dem erfindungsgemäßen Mikroarray bzw. dem erfindungsgemäßen Bindungsassay können unbekannte Substanzen aus der Gruppe der Glykokonjugate ge- screent, detektiert und analysiert werden. Durch die Verwendung von immobilisierten Lektinen ist es vorteilhafterweise möglich, dass co- und poεttranεla- tionale Veränderungen der Proteine-, wie die Glykosi- lierung, nachgewiesen und analysiert werden. Dies ist von besonderer Bedeutung, da gerade die Gly- kosilierung von Proteinen deren Bioaktivität moduliert und einen entscheidenden Einfluss auf die Funktion, die Verfügbarkeit, die Wechselwirkung, die Kom- partimentierung und die Lebensdauer dieser Substanz im Organismus hat. Ebenso spielt die Glykosilierung der Lipide eine große Rolle für deren Funktion als Rezeptoren in der Signalübertragung. Die zu untersuchenden Glykostrukturen können beispielsweise in Pro- ben enthalten sein, die natürliche oder synthetische Glykostrukturen umfassen sowie deren Derivate und Abbauprodukte, definierte Stoffmischungen, synthetische und natürliche Vielstoffmischungen, wie zum Beispiel Zellen, Zeilüberstände, Nährlösungen, Extrakte und/oder Seren. Die Screeningfunktiσn des beschriebenen Mikroarrays und des Bindungsassays beruht insbesondere auf dem parallelen Einsatz vieler verschiedener, mindestens aber von zwei Lektinen oder Lektin- systemen. Die gezielte Auswahl kohlenhydratbindender Lektine bietet mit Vorteil ein breites Spektrum an Bindungsaffinitäten zu definierten Zuckerstrukturen. Somit macht die Verwendung des Mikroarrays und des Bindungsassays den Einsatz von Lektinen in Form eines Arrays für die Analyse, insbesondere Strukturanalyse, von Glykokonjugaten möglich. Es ist vorteilhafterweise im Unterschied zu den bekannten Screening- verfahren auch möglich, Glykokonjugate anhand ihrer Glykosylierung nachzuweisen und zu analysieren. Es werden damit die co- und posttranεlatiσnalen Modi- fikationen, wie Glykosylierungen, der Proteine berücksichtigt und detektiert, die einen entscheidenden Einfluss auf die physiologischen Eigenschaften der Substanzen haben. Durch die hohe Spezifität der aus- gewählten Lektine können auch geringfügig veränderte Zuckerstrukturen voneinander unterschieden werden und dadurch StrukturInformationen vor allem über unbekannte Glykokonjugate gewonnen werden. Durch den Einsatz verschiedener Lektine mit sich ergänzenden Bin- dungεspezifitäten ist mit Vorteil auch eine Pattern- Analyεe der Probe möglich. Dies ermöglicht auch den Vergleich von Proben - wie z.B. von Zelllinien - untereinander, welches eine häufige Problematik in Grundlagenforschung, Medizin und Klinik ist. Die Er- findung ermöglicht so den Nachweis und die Analyse neuer unbekannter Glykostrukturen in komplexen Vielstoffgemisehen.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand eines Bei- spiels anhand der zugehörigen Zeichnungen erläutert werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu sein.
Es zeigen:
Fig . 1 eine schematische Darstellung eines Aus- führungsbeiεpiels des Lektin-Mikroarrays ; Fig. 2 eine Anordnung von immobilisierten Lektinen auf einer 96-well Mikrotiterplatte im Arrayformat und
Fig. 3 von Con A gebundene Oligosaccharid-Strukturen.
Die Figur 1 zeigt die schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des Lektin-Mikroarrays . Ein Lek- tin wird an die Oberfläche einer Mikrotiterplatten- Vertiefung immobilisiert, indem sich der hochaffine Blomplex Streptavidin-Biotin ausbildet. An die Saccharidbindungsstellen des Lektins können anschließend komplexe Glykane von Glykoproteinen binden.
Die Figur 2 zeigt die Anordnung von immobilisierten Lektinen auf der Oberfläche im Arrayformat.
Die Figur 3 zeigt den Vorteil dieses Anwendungsbei- spiels, der in der Information liegt, dass nur komplexe Glykokonjugate mit mindestens zwei Glykanen nachgewiesen werden, die sowohl mit dem immobilisierten Lektin als auch mit dem Detektions-Lektin gleichzeitig wechselwirken können. Durch diesen Nachweis in Form einer Sandwich-Technik ist die Spezifität und Aussagekraft des Analysenergebnisses besonders hoch. Beispiel
Material :
Herstellung des Arrays :
- Fluoreszenzspektrometer in Form eines Mikrotiterplatten-Readers
96 well Mikrotiterplatce, planar (flacher Boden) , schwarz, nicht transparent; die Platte ist am Boden der wells gleichmäßig mit Streptavidin beschichtet
- biotinyliertes Concanavalin A (Lektin aus Canavalia ensiformis)
- biotinyliertes RCA (Lektin aus F.icinus communis) - biotinyliertes WGA (Lektin aus Triticum vulgaris)
Pufferlösung A-. BisTris-Puffer pH 7,0; 0,15 mol/L NaCl, 1 mmol/L Calcium-, Mangan- und Magnesium-Ionen - Pufferlösung B: Puffer A, in dem 250 μg/mL BSA (P-inderserum Albumin) gelöst sind.
Einsatz des Arrays :
- Pufferlösung A : BisTris-Pu fer pH 7,0; 0,15 mol/L NaCl, 1 mmol/L Calcium-, Mangan- und
Magnesium-Ionen
- Fetales Rinderserum, sterilfiltriert, 1:500 verdünnt mit Puffer A Detektion:
- Pufferlösung A: BisTris-Puffer pH 7,0; 0,15 mol/L NaCl, 1 mmol/L Calcium-, Mangan- und Magnesium-Ionen
Concanavalin A (Lektin aus Canavalia ensifor- is) , mit FITC (Fluorescein-5-iεothiocyanat , Fluoreszenzfarbstoff) markiert.
- RCA (Lektin aus Ricinus communis) , mit FITC (Fluorescein-5-iεothiocyanat ,
Fluoreszenzfarbstoff) markiert
- WGA (Lektin aus Triticum vulgaris) , mit FITC (Fluorescein-5-isothiocyanat ,
Fluoreszenzfarbstoff) markiert
Herstellung des Lektin-Arrays :
Die biotinylierten Lektine Con A, RCA. und WGA werden jeweils zu folgenden Konzentrationen in Puffer A gelöst: Con A: 5,5 μg/mL
RCA: 3, 0 μg/mL
WGA : 4,5 μg/mL
Je 100 μL der Lektinlösungen werden in ein Well der Mikrotiterplatte pipettiert und für 4 h bei 8 °C inkubiert. Pipettierschema: A 1 : ConA A 2: RCA A 3 : WGA Die erzielte Belegung beträgt dann 100 - 400 ng Lektin/c 2 bzw. 70 - 300 ng Lektin/well (entsprechend 1 - 4 pmol/well) .
Die Platte v/ird anschließend dreimal mit Puffer A gewaschen. Danach wird mit 100 μL Puffer B pro well für weitere 4 h bei S °C inkubiert. Die Platte wird anschließend wieder dreimal mit Puffer A gewaschen. Die so hergestellte Vorrichtung besteht aus der An- Ordnung von immobilisierten Lektinen auf einer Oberfläche im Arrayformat (Fig. 2) .
Einsatz des Lektin-Arrays :
100 μL des 1:500 verdünnten fetalen Rinderserums werden auf die Wells AI, A2 und A3 gegeben (pipettiert) und für 4 h bei 8 °C inkubiert. Die Platte wird anschließend dreimal mit Puffer A gewaschen.
Die mit FITC markierten Lektine Con A, RCA und WGA werden jeweils zu folgenden Konzentrationen in Puffer A gelöst: Con A: 10 μg/mL RCA: 10 μg/mL WGA: 10 μg/mL
Je 100 μL dieser Lektinlösungen werden in die Wells der Mikrotiterplatte pipettiert und für 4 h bei 8 °C inkubiert. Pipettierschema: A I: FITC-ConA A 2: FITC-RCA
A 3 : FITC-WGA
Die Platte wird anschließend dreimal mit Puffer A. gewaschen.
Messung und Auswertung :
Die Auswertung erfolgt im Fluoreszenzspektrometer
(Mikrotiterplatten-Reader) . Dabei wird die relative
Fluoreszenzaktivität in den Wells bestimmt . Die An- regungs ellenlänge beträgt 485 nm . Die Emission wird gemessen bei 535 nm .
Ergebnis :
In Well A 2 und A 3 wird jeweils eine positive Fluoreszenzaktivität vermessen. Well A 1 zeigt keine Fluoreszenz. Dies deutet auf die Bindung einer komplexen Glykostruktur aus dem Serum an die Lektine RCA und WGA hin. Entsprechend den Bindungsaffinitäten von RCA und WGA kann hiermit auf folgende Strukturen geschlossen werden.- die Glykostruktur (en) im Serum besitzen je zwei Glykane (zwei unterschiedliche Glykoεylierungs- stellen) die Glykane weisen ß-D-Galactosen (entεprechend der Affinität von RCA s.u.) und terminale N-Acetylglucoεamine oder Sialinsäuren (entsprechend der Affinität von WGA s.u.) auf. - Mannosehaltige Strukturen entsprechend der Affinität von Con A (s.u.) treten nicht auf. Die genannten Eigenschaften treffen auf das im Serum vorliegende Glykoprotein Fetuin bekanntermaßen zu. P-inder-Fetuin besitzt einen Kohlenhydratanteil von etwa 30 % . Es besitzt insgesamt 6 Glykane, von denen
-. bi- und triantennäre N-Glykane mit endständigen Sialinsäuren sind.
Bindungsspezifitäten der verwendteten Lektine:
RCA: Generell werden Glykane mit terminalen Galac- tosen gebunden. Die Glykostruktur ß-D-Gal-1, 4-ß-D- GlcNAc-l,0-R (terminales Lactosamin) gilt als Voraussetzung für die Bindung eines Glykans, wobei feste Bindungen hochspezifisch nur mit verzweigten, multi- valenten N-Glykanen zustande kommen.
WGA ist ein chitinbindendes Lektin, das Bindungsstellen für N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und N-Acetyl- neuraminsäure (NeuNAc) besitzt. Die Bindungsstärke für Oligosaccharide nimmt mit der Anzahl der GlcNAc- Reste stark zu. Das Disaccharid N, N'-Diacetyl- cliitobiose wird 131-mal stärker gebunden als das Monomer und das Trisaccharid N,N' ,N' '-Triacetyl- chitotriose 3700-mal stärker. WGA bindet sialinsäure- haltige Glykoproteine .

Claims

Patentansprüche
1. Mikroarray umfassend mindestens zwei voneinander verschiedene immobilisierte, gegen die Grundstruktur eines Glykokonjugats gerichtete Lektine, wobei die Grundstruktur mindestens ein Glykan, enthaltend mindestens zwei glykosidisch verknüpfte Mono- saccharide, umfasst.
2. Mikroarray nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich- net, dass die Lektine isolierbar sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Abrus precatorius, Adenia digitata, Agaricus bisporus, Aleuria aurantia, Amaranthus caudatus, Amphicarpaea biacteata, Anguilla anguilla, Arachis hypogaea, Artocarpus integrifolia, Bauhinia purpurea alba, Brachypodium sylvaticum, Canavalia ensiformis, Carcino εcorpius rotunda canda, Cicer arietinum, Codium fragile, Crotalaria juncea, Cytisus sessilifolius, Datura stra onium, Dioclea grandiflora, Dolichos biflorus, Erythrina coralldendron, Erythrina cristagalli, Euony os europaea, Galanthus nivalis, Glycine max, Griffonia
(Bandeiraea) simplicifolia, Helix aspersa, Helix po atia, Hippeaεtrum hybrid, Hordeum vulgäre, Hura crepitaus, Latyrus odoratus, Latyrus sativus, Latyrus tingitanus, Lens culinaris, Limax glavus, Limulus polyphemus, Lotus tetragonolobus, Lycopersicon esculentum, Maackia amurensis, Maclura pomifera, Macrotyloma axillare, Mo ordica charantia, Narcissus pseudonarcissus, Oryza sativa, Phaseolus coccineus, Phaseolus li ensis, Phaseolus vulgaris, Phytolacca americana, Pisum sativum, Phosphocarpus tetragonolobus, Pseudomonas aeruginosa, Ricinus communis, Sambucus nigra, Seeale cereale, Soianum tuberosum, Sophora japonica, Triticum vulgaris, Tritrichomonas mobilensis (Protozoe) , Ulex europaeus, Vicia cracca, Vicia ervilia, Vicia graminea, Vicia faba, Vicia sativa, Vicia villosa, Viscum album, Wisteria floribunda, E-Selecin (human, recombinant) , L-Selectin (human, recombinant) , P-Selectin (human, recombinant) und/oder Galectine (human) .
3. Mikroarray nach einem der Ansprüche 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lektine zu den detektierenden Glykostrukturen eine Bindungsaffinität von Kd ≤ -EÜ-6 mol/1 aufv/eisen.
4. Mikroarray nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Lektine einen Bindungs-Linker und/oder eine Funktiσnalisierungs- gruppe umfassen.
5. Mikroarray nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker und/oder die Funktionalisierungsgruppe ausgewählt εind aus der Gruppe bestehend aus Streptavidin, Biotin, Carboxyl- gruppen, Aminogruppen, Aldehydgruppen, Phenylgruppen, Thiolgruppen, Divinylsulphone, Carbonyldiimidazol,
Epichlorhydrinen, Glutaraldehyd, Hydrazinen, Perio- dat, Diazonium, Trichloro-S-triazine, Bisoxirane, Cyanbromid, 4-Nitropheny-chloroformate, Epoxidgruppen und/oder Sulfonylchloride .
6. Mikroarray nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lektine in einer
Packungsdichte von > 50 ng/cm2 immobilisiert sind.
7. Mikroarray nach einem der Ansprüche 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroarray Metall, Polypropylen, Teflon, Silizium, Polyethylen, Polyester, Polystyren, Nitrid, Keramik, Quarz und/oder Glas umfasst.
8. Bindungsassay zur Bestimmung von Glykostrukturen in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die
Probe mit mindestens zwei voneinander verschiedenen immobilisierten Lektinen unter Ausbildung von Lektin- Sucker-Komplexen in Kontakt gebracht v/ird und die Lektin-Zucker Komplexe detektiert werden, wobei die Lektine isolierbar sind, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Abrus precatorius, Adenia digitata, Agaricus bisporus, Aleuria aurantia, Amaranthus caudatus, Amphicarpaea biacteata, Anguilla anguilla,. Arachis hypogaea, Artocarpus integrifolia, Bauhinia purpurea alba, Brachypodium sylvaticum, Canavalia enεifor iε, Carcino scorpiuε rotunda canda, Cicer arietinum, Codium fragile, Crotalaria juncea, Cytisus sessilifolius, Datura stramonium, Dioclea grandiflora, Dolichos biflorus, Erythrina coralldendron, Erythrina cristagalli, Euonymos europaea, Galanthus nivalis, Glycine max, Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia, Helix aεpersa, Helix pomatia, Hippeastrum hybrid, Hordeum vulgäre, Hura crepitaus, Latyrus odoratus, Latyrus sativus, Latyrus tingitanus, Lens culinaris, Limax glavus , Li ulus polyphemus, Lotus tetragonolobus, Lycopersicon esculentum, Maackia amurensis, Maclura pomifera, Macrotyloma axillare, Momordica charantia, Narcissus pseudonarcissuε, Oryza sativa, Phaseolus coccineus, Phaseolus limensis, Phaseoluε vulgaris, Phytolacca americana, Piεum sativum, Phosphocarpus tetragonolobus, Pseudomonas aeruginosa, Ricinus communis, Sambucus nigra, Seeale cereale, Solanum tuberosum, Sophora japonica, Triticum vulgaris, Tritrichomonas mobilensis (Protozoe), Ulex europaeus, Vicia cracca, Vicia ervilia, Vicia graminea, Vicia faba, Vicia sativa, Vicia villosa, Viscum album, Wisteria floribunda, E-Selecin (human, recombinant) , L-Selectin (human, recombinant) , P-Selectin (human, recombinant) und/oder Galectine (human) .
9. Bindungsassay nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lektine physikalisch, chemisch und/oder biologisch durch in situ-Synthese oder durch Ablegen zuvor synthetiεierter Lektine auf einem Mikroarray immobilisiert werden.
10. Bindungsassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lektine durch Contact Tip Printing, Ring and Pin Printing,- Nanopipetting, Buble Jet Printing, TopSpot Printing, Micro Contact Printing, Micro Fluidic Networks-Methoden, Photolithographic Acti-vation- Verfahren, Photoresist Lithography, Electrochemical Focusing und/oder Micro Wet Printing immobilisiert werden.
11. Bindungsassay nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Oberfläche des
Mikroarrays mit Poly-L-Lysinen, Atninosilanen, Alde- hydsilanen, Epoxy-Gruppen, Gold, Streptavidin, reaktive Gruppen, Polyacryla id-Pads , immobilisierter Nitrocellulose, aktivierten Aldehyden, Agarose- Aldehyd-Gruppen und/oder Tresyl-Gruppen beschichtet wird .
12. Bindungsassay nach einem der Ansprüche 3 biε 11, dadurch gekennzeichnet, dass vor oder nach der Aus- bildung der Zucker-Lektin-Ko plexe mindeεtens ein markiertes oder unmarkiertes Lektin, mindestens eine markierte oder unmarkierte Glykostruktur und/oder mindestens ein markierter oder unmarkierter Antikörper zugesetzt werden.
13 . Bindungεasεay nach einem der Ansprüche 8 bis 12 , dadurch gekennzeichnet, dass zu der Markierung ein Enzym, ein Farbstoff , ein Fluoreszenzmarker, ein Radioisotop , ein Metallkolloid und/oder ein Chelator eingesetzt werden.
14 . Bindungsassay nach einem der Ansprüche 8 bis 13 , dadurch gekennzeichnet , dass die Lektine an Mikrotiterplatten, Glasplättchen, Membranen, Geflechte, Fibrillen, insbesondere aus Polypropylen, Nitrozellulose , Glas und/oder PVDF, immobilisiert werden.
15. Bindungsassay nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitgehend planare Oberfläche des Mikroarrays mit einem Polymer beschichtet wird und folgend Lektine mittelε des Polymers auf der Oberfläche immobilisiert werden.
16. Bindungsassay nach einem der Ansprüche 8 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als das Polymer ein Polyimid oder Polystyrol verwendet werden.
17. Bindungsassay nach einem der Ansprüche 8 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer nur in vordefinierten Bereichen auf die Oberfläche des Mikroarrays aufgetragen wird.
18. Bindungsassay nach einem der Ansprüche 8 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche durch Plasmabehandlung positiv und/oder negativ elektrisch geladen wird.
19. Verwendung eines Mikroarrays nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und/oder eines Bindungsassays nach einem der Ansprüche 8 bis 18 zum Nachweis eines Analyten und/oder zu einer Pattern Analyse.
PCT/EP2003/011567 2002-10-18 2003-10-17 Vorrichtung und verfahren zur strukturanalyse und detektion von komplexen glykostrukturen WO2004040307A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003301693A AU2003301693A1 (en) 2002-10-18 2003-10-17 Device and method for analyzing the structure of complex glycostructures and for detecting same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10249608.0 2002-10-18
DE2002149608 DE10249608A1 (de) 2002-10-18 2002-10-18 Vorrichtung und Verfahren zur Strukturanalyse und Detektion von komplexen Glykostrukturen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004040307A2 true WO2004040307A2 (de) 2004-05-13
WO2004040307A3 WO2004040307A3 (de) 2004-08-19

Family

ID=32087168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2003/011567 WO2004040307A2 (de) 2002-10-18 2003-10-17 Vorrichtung und verfahren zur strukturanalyse und detektion von komplexen glykostrukturen

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2003301693A1 (de)
DE (1) DE10249608A1 (de)
WO (1) WO2004040307A2 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006002382A2 (en) * 2004-06-24 2006-01-05 The Scripps Research Institute Arrays with cleavable linkers
EP2037274A1 (de) * 2007-09-11 2009-03-18 GALAB Technologies GmbH Lektinbasierter Glykan-Assay

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997049989A2 (en) * 1996-06-25 1997-12-31 Interactiva Biotechnologie Gmbh Broad specificity affinity arrays: a qualitative approach to complex sample discrimination
WO2001084147A1 (en) * 2000-05-04 2001-11-08 Procognia, Ltd. Method and composition for analyzing a carbohydrate polymer
US20020110933A1 (en) * 1998-07-14 2002-08-15 Peter Wagner Arrays of proteins and methods of use thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE451508B (sv) * 1979-01-30 1987-10-12 Otsuka Pharma Co Ltd Bestemning av substanser med tumorassocierade glykobindningar medelst lektiner som specifikt binder till terminala galaktos (beta 1 - 3 eller beta 1 - 4)-n-acetylglukosamin- eller -n-acetylgalaktosamingrupper samt cance
EP0057236A4 (de) * 1980-07-25 1982-10-14 Otsuka Pharma Co Ltd Verfahren zum feststellen der tumorgebundenen glukoseseitenkette, verfahren zur diagnose von tumoren sowie "kit" dazu.
GB8726271D0 (en) * 1987-11-10 1987-12-16 Univ London Protein glycosylation assay
EP0399464A3 (de) * 1989-05-24 1992-03-25 Eiji Ishikawa Testverfahren für eine Substanz mit einer spezifischen Zuckerkette
ES2140511T3 (es) * 1993-11-16 2000-03-01 Wako Pure Chem Ind Ltd Procedimiento para separar y medir glicoproteinas.
CA2133772A1 (en) * 1993-11-19 1995-05-20 Yuji Yamada Method for assaying glycoconjugate and reagent thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997049989A2 (en) * 1996-06-25 1997-12-31 Interactiva Biotechnologie Gmbh Broad specificity affinity arrays: a qualitative approach to complex sample discrimination
US20020110933A1 (en) * 1998-07-14 2002-08-15 Peter Wagner Arrays of proteins and methods of use thereof
WO2001084147A1 (en) * 2000-05-04 2001-11-08 Procognia, Ltd. Method and composition for analyzing a carbohydrate polymer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERTL P ET AL: "Electrochemical biosensor array for the identification of microorganisms based on lectin-lipopolysaccharide recognition." ANALYTICAL CHEMISTRY. UNITED STATES 1 SEP 2001, Bd. 73, Nr. 17, 1. September 2001 (2001-09-01), Seiten 4241-4248, XP002280826 ISSN: 0003-2700 *
HOUSEMAN B T ET AL: "Carbohydrate Arrays for the Evaluation of Protein Binding and Enzymatic Modification" CHEMISTRY AND BIOLOGY, CURRENT BIOLOGY, LONDON, GB, Bd. 9, April 2002 (2002-04), Seiten 443-454, XP002273879 ISSN: 1074-5521 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006002382A2 (en) * 2004-06-24 2006-01-05 The Scripps Research Institute Arrays with cleavable linkers
WO2006002382A3 (en) * 2004-06-24 2006-10-12 Scripps Research Inst Arrays with cleavable linkers
EP2037274A1 (de) * 2007-09-11 2009-03-18 GALAB Technologies GmbH Lektinbasierter Glykan-Assay
WO2009033753A1 (de) * 2007-09-11 2009-03-19 Galab Technologies Gmbh Lektinbasierter glykan-assay
US8409811B2 (en) 2007-09-11 2013-04-02 Galab Technologies Gmbh Lectin-based glycan assay

Also Published As

Publication number Publication date
DE10249608A1 (de) 2004-05-06
AU2003301693A1 (en) 2004-05-25
WO2004040307A3 (de) 2004-08-19
AU2003301693A8 (en) 2004-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69429606T2 (de) Immobilisierter kohlehydrat-biosensor
DE69737818T2 (de) Ein für die Messung einer Änderung der Dicke oder Masse an seiner Oberfläche geeignetes Affinitätsprobenarray
Laurent et al. Glycoarrays—tools for determining protein–carbohydrate interactions and glycoenzyme specificity
US8088596B2 (en) Method of microorganism detection using carbohydrate and lectin recognition
JP5215298B2 (ja) グリコシル化された基質から切断される末端単糖の固相検出
CN101308141B (zh) 一种分析糖蛋白的方法
US8008094B2 (en) Methods for analyzing interactions between proteins and sugar chains
US20140274771A1 (en) Methods for making microarrays and their uses
WO2006137311A1 (ja) 糖鎖あるいは複合糖質の解析装置
EP0979408B1 (de) Cluster verstärkter optischer sensor
WO2001040796A2 (en) Glycoarrays on the surface of biochips
US20060172339A1 (en) Particle-based multiplex assay for identifying glycosylation
WO2007082057A2 (en) Lectin arrays and translational applications
WO2004040307A2 (de) Vorrichtung und verfahren zur strukturanalyse und detektion von komplexen glykostrukturen
EP1451558A1 (de) Spr-sensorflächenträger
JP4515387B2 (ja) 糖鎖構造プロファイリング技術
EP1390139B1 (de) Verfahren zur herstellung eines arrays zur detektion von komponenten aus einer biologischen probe
EP1495326A1 (de) Verfahren zum immobilisieren von molekülen auf oberflächen
EP1453959A2 (de) Verfahren zur selektion und identifikation von peptid- oder proteinmolekülen mittels phage display
DE202006016699U1 (de) Anordnung zum Erfassen von Substanzen, Herstellung der Anordnung und ihre Verwendung
WO2007036352A2 (de) Candida-diagnose-chip
Huang et al. Immobilization and Detection Strategies for Multifunctional Glycochips
DE102006020131A1 (de) Nano- und mikrostrukturierter Biosensor und Verfahren zu seiner Herstellung
Engel Electrophoretic analysis of glycoproteins and their interactions with lectins studied by means of microchip capillary electrophoresis in the liquid phase and of gas-phase electrophoretic molecular mobility analyzer at atmospheric pressure
Zou et al. Covalent immobilization of carbohydrates on sol–gel-coated microplates

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP