WO2004034780A2 - Método para la producción de proteínas recombinantes en la glándula mamaria de mamíferos no transgénicos - Google Patents

Método para la producción de proteínas recombinantes en la glándula mamaria de mamíferos no transgénicos Download PDF

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    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Definitions

  • the present invention relates to a method for the production of bioactive proteins; specifically of proteins of biopharmaceutical interest using the mammary gland as a bioreactor and recombinant adenoviruses as vectors for gene transfer.
  • the treatment of a large number of diseases requires the administration of bioactive proteins.
  • biopharmaceuticals can be purified from blood and tissues in a process that, in addition to being long and expensive, carries the risk of transmission of infectious agents, such as those that cause AIDS and hepatitis.
  • transgenesis lies in the fact that it is possible to create a transgenic population from the founder animal by natural reproduction.
  • G0 initial transgenic 0
  • G0 transgenic 0
  • a long additional time is required to multiply by crossing the G0 lines with high levels of expression, until reaching an adequate reaction capacity that allows entry into the market.
  • transgenic progeny will not express the exogenous protein at the same levels as the original founder.
  • Somatic cloning as an alternative way for the production of transgenic animals allows to overcome some of the above limitations, however, the high cost as well as the ineffectiveness of this technique threaten its practice in a more routine way.
  • the use of transgenic mammals as biofactories also implies the construction of complex expression cassettes, where the exogenous gene is linked to regulatory sequences that only allow its expression in the mammary glandular epithelium during lactation. On many occasions these regulatory sequences do not work efficiently, causing small amounts of recombinant protein to be synthesized in other tissues, with a detrimental effect on the animal's health.
  • EGM mammary glandular epithelium
  • transgenes contained in the adenoviral vectors are generally very vigorous, assuming that once the virus infects, it remains episomal and therefore the expression is not affected by the effects of position.
  • expression of transgenes from adenoviral vectors is generally lost in approximately ten days. This is basically due to the high immune response that rises against infected cells due to the antigenicity of the viral proteins expressed in these cells.
  • helper-dependent vectors only retain the elements required for replication and packaging, the 1TR (inverted terminal repeats) and the packaging sequence respectively, have a cloning capacity of up to 36 Kb and in gene therapy assays in live have shown great stability.
  • the present invention relates to a method that allows the production of heterologous proteins with high yields in the milk of non-transgenic animals. More specifically, the present invention relates to the use of helper-dependent adenoviral vectors of the type ⁇ E1 ⁇ E3 to transfer foreign genes to EGM cells. Cells transformed by this pathway synthesize and secrete the protein of interest in its biologically active form into milk.
  • adenoviral vectors are used to transfer the Foreign DNA inside EGM cells. Once infection occurs, viral DNA remains episomal in the nucleus of the infected cell allowing expression of the transgene of interest contained therein.
  • the method of the present invention involves infusion of a solution containing adenoviral vectors directly through the teat canal.
  • Animals should preferably be ruminants (eg cattle, sheep or goats). Animals can be subjected to a hormonal induction of mammogenesis and lactation or animals that are in the natural phase of lactation can be used.
  • transgenes are transferred into the mammary secretory cells where they are transcribed and where the translation and post-translational processes that the protein of interest requires before being secreted into milk occurs.
  • milking the animal eg cow, sheep or goat
  • it is transformed into a biofactory for the production of foreign proteins of biopharmaceutical interest.
  • Viral vectors must contain an expression cassette that includes the DNA encoding the protein of interest, a sequence that encodes a secretion signal that may or may not be characteristic of the heterologous gene, a promoter that does not necessarily have to be specific to the glandular epithelium. breast and a cut and polyadenylation sequence.
  • Viral vectors are preferably based on human adenoviruses type 2 and 5.
  • adenoviral vectors devoid of the El and E3 genes or vectors devoid of all adenovirus coding sequences (helper dependent or disemboweled) can be used.
  • adenoviral vectors with defective replication (Ex. ⁇ E1 ⁇ E3) according to the method of the present invention allows obtaining high levels of recombinant proteins in milk for approximately 10 days in immunocompetent animals.
  • the use of these vectors is a good option when large amounts of recombinant protein are not required, for example, when you only want to perform a physical, chemical and biological characterization of the protein of interest or when a therapeutic treatment requires few amounts of the protein in question as is the case of erythropoietin and tissue plasminogen activator.
  • helper-dependent adenoviral vectors are the best option when it is desired to obtain large amounts of the protein of interest.
  • These vectors have been shown to be very stable in EGM, guaranteeing the expression of the recombinant protein in milk for periods as long as 5 months in immunocompetent animals.
  • the stability of the gutted vectors in the EGM can be improved depending on the level of immunogenicity of the recombinant protein or by inducing immunosuppression in the treated animals.
  • These vectors also have a cloning capacity of up to 36 Kb, which allows them to accept the insertion of multiple expression cassettes.
  • the adenoviral vectors of the present invention contain an expression cassette consisting of a promoter that may or may not be specific for EGM, a sequence that encodes a protein of interest, and a cleavage and polyadenylation sequence.
  • constitutive promoters can be used that can be heterologous to the transformed cell.
  • suitable promoters include the human cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter, the actin promoter, the SV 40 virus early promoter, the myosin promoter and the Rous Sarcoma Virus (RSV) promoter.
  • V Rous Sarcoma Virus
  • Very useful could also be the promoters that naturally direct the expression of specific genes of the mammary gland.
  • promoters of ⁇ SI -casein, ⁇ S2-casein, ⁇ -lactoglobulin, ⁇ -casein, ⁇ -casein, promoters of serum acidic protein and ⁇ -lactalbumin can be used.
  • the sequence encoding the protein of interest may be its complementary DNA which may or may not include an intron which may increase expression levels. It is also possible to use, if the capacity of the vector allows, genomic DNA that includes the introns of the gene of interest and has been shown to be able to induce higher levels of expression than those obtained when using complementary DNA.
  • any unrelated heterologous protein can be expressed in milk using the system proposed here. Particularly beneficial could be the production of proteins with prophylactic or therapeutic value for humans and animals.
  • proteins obtainable by this route include, but are not limited to antigens (eg, hepatitis B surface antigen), growth factors (eg, human growth hormone, epidermal growth factor, growth factor similar to insulin, granulocyte and macrophage colony stimulating factor, nerve growth factor, erythropoietin, etc.), coagulation factors (eg FVIII and FIX), antibodies, cytokines (eg Interleukin 6 or Interleukin 2), ⁇ l -antitrypsin, human serum albumin, ⁇ -globin, tissue plasminogen activator, tumor suppressor proteins (eg P53), protein C, interferons.
  • antigens eg, hepatitis B surface antigen
  • growth factors eg, human growth hormone, epidermal growth factor, growth factor similar to insulin, granulocyte and
  • Each heterologous protein produced according to this invention must be linked to a signal peptide that guarantees its secretion in milk.
  • the signal peptide can be a component of the heterologous protein when said protein is naturally secretable.
  • a heterologous signal peptide must be assembled in such a way that said peptide directs the secretion of the protein of interest.
  • the stability of the messenger RNA is largely determined by the region located at the 3 'end of the gene. This region must include a cut and polyadenylation sequence that may be characteristic of the heterologous gene, although those derived from the genes of globins, bovine growth hormone gene, virus thymidine kinase gene
  • Herpes Simplex or the early region of the SV40 virus are known.
  • Adenoviral vectors of human origin have been shown to be capable of efficiently infecting mammary epithelial cells in ruminants, their stability in the secretory epithelium largely depends on the degree of immunogenicity of the proteins that are expressed from their genome, which which includes both the proteins of viral origin and the protein of biopharmaceutical interest that is desired to be produced.
  • Adenoviral vectors with defective replication (Ex.
  • ⁇ E1 ⁇ E3 are capable of promoting the expression of high concentrations of the recombinant protein but have a very low stability due to the strong immune response that viral proteins induce against the infected cell.
  • helper-dependent or gutted adenoviral vectors do not contain viral genes in their genome, hence the immune reaction against the infected cell is much less and is only determined by the level of immunogenecity of the recombinant protein that is desired to be produced. We found that these vectors are very stable, simultaneously guaranteeing the expression of high levels of the protein of biopharmaceutical interest in the milk of treated animals.
  • adenoviral vectors with defective replication can be performed following the conventional techniques reported in the literature (Tong-Chuan He et al .; Proc Nati Acad Sci U S A. 1998, 95 (5): 2509-14). Both the packaging and the amplification of the viral particles are carried out in HEK-293A cells or in any other line that complements the deficiency of the adenovirus used. Construction of the helper-dependent adenoviral vector can be carried out according to Robin J. Parks et al. (Proc Nati Acad Sci US A. 1996, 93 (24): 13565-70), for which co-infection with an adenovirus is required. helper who must provide in trans the structural proteins necessary for the adequate packaging of the vector. In both cases the vectors are extracted from the cells through three rounds of freezing and thawing.
  • adenoviral vectors The functionality of the expression cassette contained in adenoviral vectors can be tested in vitro by infection of a culture of mammary epithelial cells. By virtue of infection, the protein of interest can be detected in the culture medium. In this sense, the HC11 or KIM-2 mammary epithelial cell lines of murine origin and MAC-T of bovine origin could be particularly useful.
  • CsCl gradient ultracentrifugation is an essential step in eliminating possible adenovirus contamination assistant.
  • Adenoviruses purified by this route must be dialyzed, assuming that high concentrations of CsCl could interfere with viral infection in cells and tissues. Once adenoviruses are dialyzed, they can be stored at -80 ° C without appreciable changes in their titer. Animals The present invention is applicable to all mammals, although ruminants are preferred due to their high milk production capacity.
  • Animals can be used at an early stage of sexual maturity, which are subjected to a hormonal regimen to induce mammogenesis and subsequent lactation.
  • a hormonal regimen to induce mammogenesis and subsequent lactation.
  • the animal Before the infusion containing the adenoviral vectors, the animal must be milked to eliminate the milk contained in the cisterns.
  • the mammary gland is then infused with an isosmotic solution through the teat canal until the udder is full, the udder is massaged to make the solution reach all of the alveoli, and the solution is removed by milking. This step should be repeated one or two more times to guarantee the complete rinsing of the mammary gland and the distension of the ducts and alveoli.
  • the isosmotic solution PBS, NaCl 0.9%, glucose 5%, HBS tissue culture medium can be used. Infusion of the solution containing the viral particles is done directly through the teat canal.
  • isosmotic solutions such as glucose 5%, PBS, NaCl 0.9%, HBS, or a tissue culture medium (eg DMEM) can be used.
  • the viral concentration in the solution to be infused may be variable although concentrations of 1 x 10 9 PFU / ml or higher are preferred.
  • the optimal volume of the infusion can vary depending on the size of the mammary gland, for chivas, for example, the optimal volumes range between 50 and 300 ml per mammary gland.
  • a cannula attached to a syringe can be used.
  • the infusion should be done slowly and during and after the infusion, massage should be done to ensure that the solution is homogeneously distributed and reaches all the mammary epithelial cells.
  • Milk, from treated animals, can be obtained by conventional manual or mechanized milking methods. Caseins and fats are separated from serum, most of which is stored at -20 ° C while small samples are used to detect and quantify the protein of interest using commonly known techniques (eg ELISA, Western or biological activity). Sera containing appreciable amounts of the protein of interest are mixed and used as an active raw material for purification of heterologous protein. The purification process can vary considerably depending on the protein in question.
  • the method for the production of high levels of recombinant protein in milk requires the following steps: 1.
  • This step involves: a) - construction of the recombinant adenoviral genome b) - production of viral particles in cell line 293 c) - amplification and purification of adenoviral vectors.
  • Infection of mammary epithelial cells This step involves: a) - induction of mammogenesis and lactation in case it is not desired to use animals in the natural lactation phase.
  • Figure 2 Shows the strategy used for the construction of the helper-dependent adenivirus genome containing the hEPO gene.
  • Figure 3 Assay of hGH expression in the milk of mice infused with 2.5x10 6 GTU per mammary gland of an ⁇ E1 ⁇ E3 adenovirus containing the hGH gene under the control of a human cytomegalovirus promoter.
  • C- the negative control
  • Figure 4 Assay of hEPO expression in the milk of mice infused with lxl O 8 GTU by mammary gland of an ⁇ E1 ⁇ E3 adenovirus containing the hEPO gene under the control of a human cytomegalovirus promoter.
  • C- the negative control
  • B Concentration of hEPO in milk depending on the postpartum day.
  • Figure 5 Shows the presence of hGH in the milk of chivas infused with 2x10 "GTU per mammary gland of an adenoviral vector ⁇ E1 ⁇ E3 that contains the hGH gene under the control of a promoter of human cytomegalovirus.
  • Figure 6 Results of an ELISA showing hEPO levels in goat milk infused with a helper-dependent adenoviral vector containing the hEPO gene under the control of a human cytomegalovirus promoter.
  • Example 1 Construction of adenoviral vectors ( ⁇ E1 ⁇ E3) containing the hGH and hEPO genes.
  • the adenoviral vectors with defective replication were constructed based on the Adeasy system (Tong-Chuan He et al .; Proc Nati Acad Sci US A. 1998, 95 (5): 2509-14), as transfer vector the plasmid pAdTrack was used -CMV (Fig. 1).
  • the AdEasy-based system constitutes a quick and simple alternative for the construction of recombinant adenoviruses, for which a two-step process is required in which the expression cassette is first cloned into a transfer vector, and subsequently transferred to the adenoviral genome by recombination. of homologs in the bacterial strain BJ5183.
  • the recombinant adenoviral genome is then digested with the Pac I endonuclease and transfected into the 293 or 911 cell line.
  • the formation of the infective virions as well as the subsequent amplification could be monitored by the expression of the green fluorescent protein contained in the transfer plasmid pAdTrack-CMV.
  • Example 2 Construction of helper dependent adenoviral vectors.
  • Helper-dependent adenoviral vectors were constructed by cloning an expression cassette containing the erythropoietin gene at the multiple cloning site of plasmid pSH-1. In order to provide the resulting plasmid with an optimal size to maximize packaging efficiency, it was transferred to the pStuffer-26 vector by recombination of homologs in the bacterial strain BJ5183 (Fig. 2). As a result of the recombination, a plasmid over 28 kb, which once digested with Pac I endonuclease is transfected into the 293-Cre cell line and subsequently infected with adenovirus AdlnvL ⁇ L-GFP helper.
  • Cre recombinase in cells of line 293 -Cre promotes recombination between the Lox P sites flanking the packaging sequence in the helper adenovirus. This loses the ability to be packaged but retains its ability to replicate and therefore to provide viral proteins in trans for the formation of viral particles containing the helper-dependent adenoviral vector genome.
  • hEPO from adenoviral vectors in culture of mammary epithelial cells.
  • HC11 mammary epithelial cells were infected.
  • Cells were grown in DMEM medium supplemented with EGF (10Og / ml) and insulin (10 ⁇ g / ml).
  • EGF EGF
  • insulin 10 ⁇ g / ml
  • the adenoviral vectors were added at a rate of 20 viral particles per cell. After 24 hours the medium was replaced by medium supplemented with EGF and insulin but without SFB serum.
  • the medium was harvested, the proteins contained in one milliliter of medium were precipitated with trichloroacetic acid and resuspended in 40 ul of H 2 0 of which 20 ul was used for electrophoresis and subsequent western blot assay.
  • Example 4 Expression of human growth hormone (hGH) and human erythropoietin (hEPO) in the milk of mice.
  • hGH human growth hormone
  • hEPO human erythropoietin
  • the treated mice began to be milked from day 2 post partum.
  • the collected milk was diluted 1 in 5 with separation buffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM CaCl 2 ) and the caseins were separated from the serum by centrifugation at 4 o C for 30 minutes at 15,000 g.
  • the hGH content in the milk samples was detected by Western blot and quantified by ELISA (hGH ELISA, Boehringer Mannheim, Cat. No. 1 585 878) (Fig. 3).
  • the hEPO content was also detected by Western blot and quantified by ELISA (ELISA manufactured in the CIGB) (Fig. 4).
  • Example 5 Induction of lactation in goats.
  • Recombinant adenoviruses as vectors to transfer genes to the mammary gland can be used in virtually any mammalian species, however ruminants are preferred due to their high milk production capacity.
  • Animals can be used in a early stage of sexual maturity at which mammogenesis and lactation can be hormonally induced or animals in natural lactation can be used. If the animals to be treated are, for example, chivas, hormonal induction can be carried out by supplying estradiol (0.25 mg / kg, im) and progesterone (0.75 mg kg, im) on days 1, 3, 5, 7, 9, 11 and 13 while prednisolone (0.4 mg / kg, im) should be administered on days 14 to 16 with daily massages on the udder from day 5.
  • Example 6 Infusion of a recombinate adenovirus ( ⁇ E1 ⁇ E3) containing the hGH gene in the mammary gland of chivas.
  • Lactating goats were administered 10 mg of diazepam intramuscularly to decrease stress during treatment.
  • the animals were milked extensively to eliminate as much milk as possible in the cisterns, the mammary glands were rinsed twice by infusion with 200 ml of saline solution at 37 ° C and subsequent milking. All infusions were made directly through the teat canal, using a catheter attached to a 50 ml syringe. The infusions were carried out slowly while simultaneously infused udders were massaged.
  • the udder In goats, the udder can be separated into two independent halves, one of which was infused with the solution containing the adenoviral vectors, the other with saline alone and used as an internal negative control. 200 ml of saline containing a viral load of 10 9 GTU / ml was infused into each mammary gland, that is, each mammary gland received a total of 2 x 10 "viral particles. After the infusion, the patient was massaged udder to facilitate the homogeneous distribution of the solution and to reach all ducts and alveoli. The infused solution was removed the following day by milking.
  • Example 7 Infusion of a recombinant adenovirus dependent on helper containing the erythropoietin gene in the mammary gland of goats. Lactating goats were administered intramuscularly 10mg of diazepam to reduce stress during treatment. The animals were milked extensively to eliminate as much milk as possible in the cisterns, the mammary glands were rinsed twice by infusion. with 200 ml of saline solution at 37 ° C and subsequent milking. All infusions were made directly through the teat canal, using a catheter attached to a 50 ml syringe. The infusions were carried out slowly while simultaneously infused udders were massaged.
  • the udder In goats, the udder can be separated into two independent halves, one of which was infused with the solution containing the adenoviral vectors, the other with saline alone and used as an internal negative control. 200 ml of saline containing a viral load of 10 9 PFU / ml was infused into each mammary gland, that is, each mammary gland received a total of 2 x 10 "viral particles. After the infusion, the udder for facilitate the solution to be homogeneously distributed and reach all the ducts and alveoli. The infused solution was removed the following day by milking.
  • Example 8 Detection of hGH and hEPO in goat milk infused with adenoviral vectors. Milk from the infused animals was collected by hand milking from 48 hours post infusion. Two daily milkings were performed, one in the morning and the other in the late afternoon. Most of the collected milk was stored at -70 ° C for the subsequent purification of the protein, while small samples were used to detect and quantify the content of hGH or hEPO in each of the batches. Detection of hGH or hEPO in milk was carried out as follows.
  • HGH quantification was performed by ELISA.
  • Boehringer Mannheim hGH ELISA Cat. No. 1,585,878, was used. The entire procedure was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • the quantification of hEPO was carried out using a sandwich ELISA manufactured at the Center for Genetic Engineering and Biotechnology, C. Habana, Cuba
  • hGH In animals infused with adenoviral vectors of the ⁇ E1 ⁇ E3 type, hGH could be detected until day 11 post infusion reaching 0.3 mg / ml in the first 3 days (Fig. 5C). In the case of animals inoculated with helper-dependent adenoviral vectors, hEPO levels were also considerably high (Fig. 6). The use of these vectors yielded expression levels higher than 0.2 mg / ml during the first 5 weeks and declining linearly until reaching 5ng / ml on day 145 post infusion. Advantages of the proposed solution.
  • the method proposed in the present invention constitutes a solution to the ever increasing needs for the production of biopharmaceuticals with a protein constitution.
  • the present invention enables large-scale production of proteins whose biological activity is closely related to complex post-translational processing and hence require the biosynthetic machinery of cells of higher organisms.
  • the method proposed here makes the production of these proteins possible in a quick, simple and economically feasible process.
  • the present invention allows to respond in a short time to changes in market needs, its application does not involve large technical requirements and its reaction capacity can be easily adjusted depending on the needs.
  • the present invention saves time and resources as an alternative for the study of post translational modifications in the mammary gland of different species. Taking into account that the coding sequence for the study protein is contained in an adenoviral vector, it can be transferred to the mammary gland of a wide range of species, thus allowing the study of the differential modifications suffered by the same protein in dependence of the species where it occurs.

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Abstract

Método que permite la producción de proteínas de interés bio-farmacéutico a partir de la glándula mamaria de animales no transgénicos. Los genes que codifican para dichas proteínas son transferidos a las células epiteliales mamarias empleando vectores adenovirales. Tales vectores pueden estar basados en adenovirus con replicación defectiva como el ΔE1ΔE3, o en adenovirus dependientes de ayudante a los cuales se les han eliminado todas o casi todas las secuencias adenovirales codificantes. Mediante este método es posible la producción altos niveles de proteínas recombinantes en la leche permitiendo de esta forma la producción a gran escala de proteínas de interés biofarmacéutico en su forma biológicamente activa.

Description

MEMORIA DESCRIPTIVA
MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN LA GLÁNDULA MAMARIA DE MAMÍFEROS NO TRANSGÉNICOS.
La presente invención se relaciona con un método para la producción de proteínas bioactivas; específicamente de proteínas de interés biofarmacéutico empleándose la glándula mamaria como biorreactor y adenovirus recombinantes como vectores para la transferencia génica. El tratamiento de un gran número de enfermedades, requiere la administración de proteínas bioactivas. Estos biofármacos se pueden purificar a partir de la sangre y tejidos en un proceso que además de ser largo y costoso, encierra el riesgo de trasmisión de agentes infecciosos, tales como los causantes del SIDA y la hepatitis.
El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha permitido emplear bacterias y levaduras como sistemas hospederos para la producción de proteínas de interés biofarmacéuticó en un proceso relativamente barato. Sin embargo, en muchas ocasiones la actividad biológica de dichas proteínas, se ve comprometida debido fundamentalmente al ineficiente procesamiento post- traduccional de estos sistemas de expresión, de aquí que la producción de un gran número de biofármacos proteicos en su forma biológicamente activa requiera de la maquinaria biosintética de células eucarióticas superiores. En este sentido los sistemas basados en baculovirus y cultivo de tejido de células de mamíferos han devenido en estrategias viables. Sin embargo la fermentación de células animales es un proceso caro y técnicamente exigente. El empleo de la glándula mamaria de animales transgénicos como sistema biorreactor se ha identificado como una solución potencial a los anteriores problemas. La ventaja fundamental de la transgénesis radica en el hecho de que, es posible crear una población transgénica a partir del animal fundador mediante reproducción natural. A pesar de las prometedoras perspectivas de esta tecnología, existen en la actualidad limitaciones que impiden su uso de una forma más generalizada. Particularmente cuando se trabaja con animales grandes se requiere mucho tiempo y recursos para producir un pequeño número de la generación inicial 0 (G0) transgénica. Solo una pequeña proporción de esta G0 transgénica expresa en su leche la proteína de interés a niveles razonables como para permitir la entrada en una fase comercial. Se requiere además un tiempo adicional largo para multiplicar mediante cruce las líneas G0 con altos niveles de expresión, hasta alcanzar una capacidad de reacción adecuada que permita la entrada en el mercado. En este período de escalado también se corre el riesgo de que la progenie transgénica no exprese la proteína exógena a los mismos niveles que el fundador original. La clonación somática como una vía alternativa para la producción de animales transgénicos permite sobreponerse a algunas de las limitaciones anteriores sin embargo el alto costo así como la ineficacia de esta técnica atentan contra su práctica de una forma más rutinaria. El empleo de mamíferos transgénicos como biofábricas implica además la construcción de complejos cassettes de expresión, donde el gen exógeno está unido a secuencias reguladoras que solo permitan su expresión en el epitelio glandular mamario durante la lactación. En muchas ocasiones estas secuencias reguladoras no funcionan eficientemente, provocando que pequeñas cantidades de proteína recombinante se sinteticen en otros tejidos, con un efecto detrimental para la salud del animal.
La transferencia de genes directamente a las células del epitelio glandular mamario (EGM) en animales adultos resulta una estrategia muy prometedora. Esta tecnología podría no solo disminuir el costo de producción de biofármacos sino que también reducir considerablemente el tiempo necesario para la obtención de estos. La transformación in vivo del EGM se puede llevar a cabo en cualquier animal, independientemente de su fondo genético y con un mínimo de requerimientos técnicos.
Ya en trabajos tempranos (Archer y col.; Proc Nati Acad Sci U S A. 1994, 91(15):6840-4) se evaluó la factibilidad de emplear vectores retrovirales para transferir el gen de la hormona de crecimiento humano (hGH) a las células epiteliales mamarias de chivas. La hGH se pudo detectar en la leche aunque a muy bajas concentraciones, y esta expresión cayó a niveles básales después del primer día. En los documentos de patentes US 5,215,904 y W099/43795 también se describen métodos donde se emplean retrovirus como vectores para la transformación del EGM. La endocitosis mediada por receptor en EP 725141 A4 y el empleo de complejos basados en policationes y/o lípidos en US 5,780,009 también se han descrito como alternativas para introducción de genes en el EGM. Aunque estos trabajos permiten obtener la proteína de interés en la leche de los animales tratados, hasta el momento las eficiencias reportadas son muy bajas y los niveles de proteínas obtenidos no exceden el orden de nanogramos por mililitro, lo cual constituye una limitante cuando se desea emplear estos métodos como procesos productivos. Los vectores adenovirales pueden infectar un amplio rango de tipos celulares independiente de que estas estén o no en división. La expresión de los transgenes contenidos en los vectores adenovirales es por regla general muy vigorosa, partiendo de que una vez que el virus infecta, este se mantiene episomal y por tanto la expresión no se ve afectada por los efectos de posición. Sin embargo, la expresión de transgenes a partir de vectores adenovirales, generalmente se pierde en aproximadamente diez días. Esto se debe básicamente a la elevada respuesta inmune que se levanta contra las células infectadas a causa de la antigenicidad de las proteínas virales expresadas en dichas células.
Con el objetivo de obtener una expresión más prolongada de un gen de interés, se han desarrollado nuevos vectores adenovirales a los cuales se les ha eliminado la mayoría o todas sus secuencias codificantes (Robin J. Parks y col.; Proc Nati Acad Sci U S A. 1996, 93(24):13565- 70). La amplificación de estos vectores se realiza mediante la coinfección de las células productoras con un segundo virus, el cual provee en "trans" todas las proteínas adenovirales, de aquí que a esta nueva generación de vectores se les denomine "Dependientes de Ayudante o
Destripados". Los vectores dependientes de ayudante solamente retienen los elementos requeridos para la replicación y el empaquetamiento, los 1TR (inverted terminal repeats) y la secuencia de empaquetamiento respectivamente, poseen una capacidad de clonaje de hasta 36 Kb y en ensayos de terapia génica in vivo han demostrado una gran estabilidad.
La habilidad de los vectores adenovirales para transferir genes in vivo a las células epiteliales mamarias de ratones fue mostrada por Yang y colaboradores (Cáncer Lett. 1995, 98(1):9-17).
Desde entonces hasta la fecha se han publicado varios trabajos donde se emplean adenovirus para transferir genes al EGM pero en ninguno de ellos se espera que el producto del gen de interés sea secretado en la leche.
La posibilidad de emplear adenovirus como herramientas para la producción de compuestos bioactivos es divulgada en la solicitud de patente WO97/17090. Sin embargo, a pesar de que en este documento se plantea la posibilidad de transformar la glándula mamaria con estos vectores, tanto los detalles experimentales como los resultados mostrados se centran básicamente en la transformación in vitro de cultivos de tejidos, ninguno de los cuales es de células epiteliales mamarias. La única materialización de la invención que se revela en WO97/17090 que describe la infección con adenovirus del EGM, implica la inyección de un adenovirus recombinante en la glándula mamaria de vacas lactantes; sin embargo, según este método, los niveles de infección y por tanto de producción de proteínas recombinantes son considerablemente bajos y por consiguiente no se da demostración alguna de que la transformación del EGM con vectores adenovirales pueda constituir una alternativa viable para la producción de biofármacos en su forma biológicamente activa.
Descripción detallada de la invención: La presente invención se relaciona con un método que permite la producción de proteínas heterólogas con altos rendimientos en la leche de animales no transgénicos. Más específicamente la presente invención se refiere al empleo de vectores adenovirales del tipo ΔE1ΔE3 y dependientes de ayudante para transferir genes foráneos a las células del EGM. Las células transformadas por esta vía sintetizan y secretan en la leche la proteína de interés en su forma biológicamente activa.
Por consiguiente, es un objeto de esta invención proporcionar un método simple y eficiente mediante el cual se pueden obtener grandes cantidades de proteínas complejas de interés biofarmacéutico en su forma bioactiva a partir de la leche de mamíferos no transgénicos. El método aquí propuesto permite la eficiente transformación in vivo de las células del epitelio glandular mamario garantizando que estas dispongan del material genético necesario para sintetizar y secretar una proteína de interés biofarmacéutico en la leche del animal tratado. Específicamente en la presente invención se emplean vectores adenovirales para transferir el ADN foráneo al interior de las células del EGM. Una vez que ocurre la infección, el ADN viral se mantiene episomal en el núcleo de la célula infectada permitiendo la expresión del transgén de interés contenido en él.
El método de la presente invención involucra la infusión de una solución que contiene los vectores adenovirales directamente a través del canal del pezón. Los animales deben ser preferentemente rumiantes (Ej bovinos, ovinos o caprinos). Los animales pueden ser sometidos a una inducción hormonal de mamogénesis y lactación o se pueden emplear animales que se encuentren en fase natural de lactación. En virtud de la infección, los transgenes son transferidos al interior de las células secretoras mamarias donde son transcriptos y donde ocurre la traducción y los procesos post-traduccionales que requiere la proteína de interés antes de ser secretada en la leche. Mediante el ordeño del animal (Ej. Vaca, oveja o chiva) este se transforma en una biofactoría para la producción de proteínas foráneas de interés biofarmacéutico. Los vectores virales deben contener un cassette de expresión que incluya el ADN codificante para la proteína de interés, una secuencia que codifique para una señal de secreción que puede o no ser propio del gen heterólogo, un promotor que no necesariamente debe ser específico del epitelio glandular mamario y una secuencia de corte y poliadenilación.
Los vectores virales se basan preferentemente en los adenovirus humanos tipo 2 y 5. Como una opción se pueden emplear vectores adenovirales carentes de los gene El y E3 o vectores carentes de todas la secuencias codificantes del adenovirus (vectores dependientes de ayudantes o destripados).
El empleo de vectores adenovirales con replicación defectiva (Ej. ΔE1ΔE3) según el método de la presente invención permite obtener altos niveles de proteínas recombinantes en la leche durante aproximadamente 10 días en animales inmunocompetentes. El uso de estos vectores constituye una buena opción cuando no se requieren grandes cantidades de proteína recombinante, por ejemplo, cuando solo se desea realizar una caracterización físico-química y biológica de la proteína de interés o cuando un tratamiento terapéutico requiere pocas cantidades de la proteína en cuestión como es el caso de la eritropoietina y el activador tisular del plasminógeno. Alternativamente, según el método aquí propuesto, los vectores adenovirales dependientes de ayudante constituyen la mejor opción cuando se desea obtener grandes cantidades de la proteína de interés. Estos vectores han demostrados ser muy estables en el EGM garantizando la expresión en la leche de la proteína recombinante durante períodos tan prolongados como 5 meses en animales inmunocompetentes. La estabilidad de los vectores destripados en el EGM puede ser mejorada en dependencia del nivel de inmunogenicidad de la proteína recombinante o mediante la inducción de inmunosupresión en los animales tratados. Estos vectores poseen además una capacidad de clonaje de hasta 36 Kb lo cual les permite aceptar la inserción de múltiples cassettes de expresión. Cassette de expresión
Los vectores adenovirales de la presente invención contienen un cassette de expresión que consta de un promotor que puede o no ser específico del EGM, una secuencia que codifica para una proteína de interés y una secuencia de corte y poliadenilación. Para la construcción del cassettte de expresión se pueden emplear promotores constitutivos que pueden ser heterólogos para la célula transformada. Ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor inmediato temprano de citomegalovirus humano (CMV), el promotor de actina, el promotor temprano del virus SV 40, el promotor de miosina y el promotor de Rous Sarcoma Virus (RSV). De gran utilidad también podrían ser los promotores que de forma natural dirigen la expresión de genes específicos de la glándula mamaria. Se pueden emplear por ejemplo promotores de α SI -caseína, α S2-caseína, β-lactoglobulina, κ-caseína, β-caseína, promotores de la proteína acídica del suero y de α-lactoalbúmina
La secuencia que codifica para la proteína de interés puede ser su ADN complementario que puede o no incluir un intrón el cual puede incrementar los niveles de expresión. También se puede utilizar, si la capacidad del vector lo permite, el ADN genómico que incluye los intrones propios del gen de interés y se ha demostrado que es capaz de inducir niveles de expresión superiores a los obtenidos cuando se emplea ADN complementario.
Virtualmente cualquier proteína heteróloga no relacionada puede ser expresada en la leche empleando el sistema aquí propuesto. Particularmente provechosa podría ser la producción de proteínas con valor profiláctico o terapéutico para humanos y animales. Ejemplos de proteínas que se pueden obtener por esta vía incluyen, pero no están limitados a antígenos (Ej antígeno de superficie de la hepatitis B), factores de crecimiento (Ej. Hormona de crecimiento humano, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento similar a la insulina, factor estimulador de colonias de granulositos y macrófagos, factor de crecimiento nervioso, eritropoietina, etc), factores de coagulación (Ej. FVIII y FIX), Anticuerpos, citoquinas ( Ej. Interleukina 6 o Interleukina 2), αl -antitripsina, seroalbúmina humana, β-globina, activador tisular del plasminógeno, proteínas supresoras de tumores (Ej. P53), proteína C, interferones. Cada proteína heteróloga producida acorde a esta invención debe estar unida a un péptido señal que garantice su secreción en la leche. El péptido señal puede ser un componente de la proteína heteróloga cuando dicha proteína es naturalmente secretable. Cuando la proteína que se desea producir no es una proteína secretable, entonces en la construcción genética se debe ensamblar un péptido señal heterólogo de forma tal que dicho péptido dirija la secreción de la proteína de interés. La estabilidad del ARN mensajero está determinada en gran medida por la región ubicada en el extremo 3 'del gen. Esta región debe incluir una secuencia de corte y poliadenilación que puede ser propia del gen heterólogo, auque comúnmente se emplean aquellas derivadas de los genes de globinas, del gen de la hormona de crecimiento bovina, del gen de timidina kinasa del virus
Herpes Simple o de la región temprana del virus SV40.
Vectores adenovirales
Se ha demostrado que los vectores adenovirales de origen humano son capaces de infectar eficientemente las células epiteliales mamarias en rumiantes, su estabilidad en el epitelio secretor depende en gran medida del grado de ¡nmunogenicidad de las proteínas que se expresan a partir de su genoma, lo cual incluye tanto las proteínas de origen viral como la proteína de interés biofarmacéutico que se desea producir. Los vectores adenovirales con replicación defectiva (Ej.
ΔE1ΔE3) son capaces de promover la expresión de altas concentraciones de la proteína recombinante pero poseen una estabilidad muy reducida a causa de la fuerte respuesta inmune que las proteínas virales inducen contra la célula infectada.
Los vectores adenovirales dependientes de ayudante o destripados no contienen en su genoma genes virales de aquí que la reacción inmune contra la célula infectada sea mucho menor y solo esté determinada por el nivel de inmunogenecidad que posea la proteína recombinante que se desee producir. Nosotros comprobamos que estos vectores son muy estables garantizando de forma simultánea la expresión de altos niveles de la proteína de interés biofarmacéutico en la leche de los animales tratados.
La construcción de los vectores adenovirales con replicación defectiva se puede realizar siguiendo las técnicas convencionales reportadas en la literatura (Tong-Chuan He y col.; Proc Nati Acad Sci U S A. 1998, 95(5):2509-14). Tanto el empaquetamiento como la amplificación de las partículas virales se realizan en las células HEK-293A o en cualquier otra línea que complemente la deficiencia del adenovirus empleado. La construcción del vector adenoviral dependiente de ayudante se puede realizar acorde a Robin J. Parks y colaboradores (Proc Nati Acad Sci U S A. 1996, 93(24): 13565-70), para lo cual se requiere de la coinfección con un adenovirus ayudante que debe proveer en trans las proteínas estructurales necesarias para el adecuado empaquetamiento del vector. En ambos casos los vectores son extraídos de las células mediante tres rondas de congelación y descongelación.
La funcionalidad del cassette de expresión contenido en los vectores adenovirales puede ser ensayada in vitro mediante la infección de un cultivo de células epiteliales mamarias. En virtud de la infección, la proteína de interés puede ser detectada en el medio de cultivo. En este sentido podrían ser particularmente útiles las líneas de células epiteliales mamarias HC11 o KIM-2 de origen murino y MAC-T de origen bovino.
Es aconsejable la purificación de las partículas víricas mediante doble centrifugación en gradiente de CsCl para eliminar de esta forma los detritos celulares y las partículas defectivas que podrían interferir con la eficiente infección de las células epiteliales mamarias. Cuando se purifican vectores adenovirales dependientes de ayudante la ultracentrifugación en gradiente de CsCl es un paso imprescindible para eliminar la posible contaminación con el adenovirus ayudante. Los adenovirus purificados por esta vía deben ser dializados, partiendo de que altas concentraciones de CsCl podrían interferir con la infección viral en células y tejidos. Una vez dializados los adenovirus pueden ser almacenados a -80°C sin cambios apreciables en su título. Animales La presente invención es aplicable a todos los mamíferos, aunque los rumiantes son preferidos debido a su alta capacidad de producción de leche. Se pueden emplear animales en una etapa temprana de su madurez sexual, los cuales son sometidos a un régimen hormonal para inducir mamogénesis y posterior lactación. Cuando se emplean animales en fase natural de lactación, por regla general, los niveles de producción de leche y por tanto de la proteína de interés son superiores a los obtenidos en animales cuya lactación fue inducida hormonalmente. Infusión
Antes de la infusión que contiene los vectores adenovirales el animal debe ser ordeñado para eliminar la leche contenida en las cisternas. La glándula mamaria es entonces infundida con una solución isosmótica a través del canal del pezón hasta que la ubre esté llena, se le dan masajes a la ubre para hacer que la solución alcance la totalidad de los alvéolos y la solución es removida mediante ordeño. Este paso se debe repetir una o dos veces más para garantizar el total enjuague de la glándula mamaria y la distensión de los ductos y alvéolos. Como solución isosmótica se puede emplear PBS, NaCl 0.9%, glucosa 5%, HBS medio de cultivo de tejido. La infusión de la solución conteniendo las partículas virales se realiza directamente a través del canal del pezón. Como líquido portador se pueden emplear soluciones isosmóticas tales como glucosa 5%, PBS, NaCl 0.9%, HBS, o un medio de cultivo de tejidos (Ej. DMEM). La concentración viral en la solución a infundir puede ser variable aunque concentraciones de 1 x 109 PFU/ml o superiores son preferidas. El volumen óptimo de la infusión puede variar en dependencia del tamaño de la glándula mamaria, para chivas por ejemplo los volúmenes óptimos oscilan entre 50 y 300 mi por glándula mamaria.
Para realizar la infusión a través del canal del pezón se puede emplear una cánula acoplada a una jeringuilla. La infusión se debe hacer lentamente y durante y después de la infusión se deben dar masajes para garantizar que la solución se distribuya homogéneamente y alcance la totalidad de las células epiteliales mamarias. Colecta de la proteína heteróloga
La leche, a partir de los animales tratados, se puede obtener mediante los métodos convencionales de ordeño manual o mecanizado. Las caseínas y las grasas son separadas del suero, la mayor parte del cual es almacenado a -20° C mientras que pequeñas muestras son empleadas para detectar y cuantificar la proteína de interés con el uso de técnicas comúnmente conocidas (Ej. ELISA, Western o actividad biológica). Los sueros que contengan cantidades apreciables de la proteína de interés son mezclados y empleados como materia prima activa para la purificación de la proteína heteróloga. El proceso de purificación puede variar considerablemente en dependencia de la proteína en cuestión.
De esta forma, el método para la producción de altos niveles de proteína recombinante en la leche acorde a la presente invención requiere de los siguientes pasos: 1. La construcción de un adenovirus recombinante que contenga un cassette de expresión del gen deseado. Este paso involucra: a)- construcción del genoma adenoviral recombinante b)- producción de partículas víricas en la línea celular 293 c)- amplificación y purificación de los vectores adenovirales. 2. Infección de las células epiteliales mamarias. Este paso involucra: a)- inducción de mamogénesis y lactación en caso que no se desee emplear animales en fase de lactación natural. b)- Infusión de una solución conteniendo las partículas víricas en la glándula mamaria. 3. Obtención de la proteína recombinante. Este paso involucra: a)- ordeño del animal tratado b)- detección y cuantificación de la proteína heteróloga en la leche colectada c)- purificación de la proteína heteróloga. Breve descripción de las figuras. Figura 1: Muestra la estrategia usada para la construcción de los vectores adenovirales ΔEl ΔE3 conteniendo los genes de hGH y hEPO.
Figura 2: Muestra la estrategia usada para la construcción del genoma del adenivirus dependiente de ayudante conteniendo el gen de hEPO.
Figura 3: Ensayo de expresión de hGH en la leche de ratonas infundidas con 2.5x106 GTU por glándula mamaria de un adenovirus ΔE1ΔE3 conteniendo el gen de la hGH bajo el control de un promotor de citomegalovirus humano. A) Ensayo de western blot: el control negativo (C-) se refiere a la leche de un ratón infundido con un adenovirus carente del cassette de expresión hGH, los carriles 2,3,4,5,6,7,8,9 contienen muestras de leches colectadas en los correspondientes días post parto. B) Concentración de hGH en la leche en dependencia del día post parto. Figura 4: Ensayo de expresión de hEPO en la leche de ratonas infundidas con lxl O8 GTU por glándula mamaria de un adenovirus ΔE1ΔE3 conteniendo el gen de la hEPO bajo el control de un promotor de citomegalovirus humano. A) Ensayo de western blot: el control negativo (C-) se refiere a la leche de un ratón infundido con un adenovirus carente del cassette de expresión hEPO, los carriles 2,3,4,5,6,7,8,9 contienen muestras de leches colectadas en los correspondientes días post parto. B) Concentración de hEPO en la leche en dependencia del día post parto. Figura 5: Muestra la presencia de hGH en la leche de chivas infundidas con 2x10" GTU por glándula mamaria de un vector adenoviral ΔE1ΔE3 que contiene el gen de la hGH bajo el control de un promotor de citomegalovirus humano. A) electroforesis de las muestras de leche colectadas en los primeros diez días post infusión, el control negativo corresponde a la leche de una glándula mamaria infundida con un vector adenoviral carente del cassette de expresión de hGH; el control positivo corresponde a hGH recombinante purificada a partir de células bacterianas. B) ensayo de Western blot donde se muestra la expresión de hGH en la leche de chivas; el control negativo corresponde a la leche de una glándula mamaria infundida con un vector adenoviral carente del cassette de expresión de hGH; el control positivo corresponde a hGH recombinante purificada a partir de células bacterianas. C) Concentración de hGH en la leche de chivas en dependencia del día post infusión.
Figura 6: Resultados de un ELISA donde se muestra los niveles de hEPO en la leche de chivas infundidas con un vector adenoviral dependiente de ayudante que contiene el gen de la hEPO bajo el control de un promotor de citomegalovirus humano.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN.
Ejemplo l:Construcción de los vectores adenovirales (ΔE1ΔE3) conteniendo los genes de hGH y hEPO.
Los vectores adenovirales con replicación defectiva fueron construidos basados en el sistema Adeasy (Tong-Chuan He y col.; Proc Nati Acad Sci U S A. 1998, 95(5):2509-14), como vector de transferencia se empleó el plásmido pAdTrack-CMV (Fig. 1). El sistema basado en AdEasy constituye una alternativa rápida y sencilla de construcción de adenovirus recombinantes para lo cual se requiere un proceso en dos pasos en el cual el cassette de expresión es primeramente clonado en un vector de transferencia, y subsecuentemente transferido al genoma adenoviral mediante recombinación de homólogos en la cepa bacteriana BJ5183. El genoma adenoviral recombinante es entonces digerido con la endonucleasa Pac I y transfectado en la línea celular 293 o 911. En nuestro caso la formación de los viriones infectivos así como la posterior amplificación pudo ser monitoreada por la expresión de la proteína fluorescente verde contenida en el plásmido de transferencia pAdTrack-CMV. Ejemplo 2: Construcción de vectores adenovirales dependientes de ayudante.
Los vectores adenovirales dependientes de ayudante se construyeron mediante el clonaje de un cassette de expresión conteniendo el gen de eritropoietina en el sitio múltiple de clonaje del plásmido pSH-1. Con el objetivo de aportarle al plásmido resultante una talla óptima que permita maximizar la eficiencia de empaquetamiento, este fue transferido al vector pStuffer-26 mediante recombinación de homólogos en la cepa bacteriana BJ5183 (Fig. 2).Como resultado de la recombinación se genera un plásmido de más de 28 kb, que una vez digerido con la endonucleasa Pac I es transfectado en la línea celular 293-Cre y posteriormente infectada con el adenovirus ayudante AdlnvLψL-GFP. La expresión de la recombinasa Cre en las células de la línea 293 -Cre promueve la recombinación entre los sitios Lox P que flanquean la secuencia de empaquetamiento en el adenovirus ayudante. Este pierde la capacidad de ser empaquetado pero conserva su habilidad para replicarse y por tanto para proveer en trans las proteínas virales para la formación de partículas víricas conteniendo el genoma del vector adenoviral dependiente de ayudante.
Ejemplo 3: Expresión de hormona de crecimiento humana (hGH) y Eritropoietina humana
(hEPO) a partir de vectores adenovirales en cultivo de células epiteliales mamarias.
Para comprobar el correcto funcionamiento de los cassettes de expresión de hGH y hEPO en los vectores construidos, se infectaron las células epiteliales mamarias HC11. Las células se cultivaron en medio DMEM suplementado con EGF (lOηg/ml) e insulina (10 μg/ml). Cuando las células alcanzaron un 80 % de confluencia se les adicionaron los vectores adenovirales a razón de 20 partículas víricas por célula. Al cabo de 24 horas el medio fue reemplazado por medio suplementado con EGF e insulina pero sin suero SFB. Pasadas 48 horas el medio se cosechó, las proteínas contenidas en un mililitro de medio fueron precipitadas con ácido tricloroacético y resuspendidas en 40 μl de H20 de los cuales 20 μl se utilizaron para electroforesis y subsecuente ensayo de western blot.
Ejemplo 4: Expresión de hormona de crecimiento humana (hGH) y Eritropoietina humana (hEPO) en la leche de ratones. La capacidad que poseen los adenovirus para infectar el EGM y promover la subsecuente secreción en la leche de la proteína de interés fue ensayada en ratones. Se hicieron tres grupos experimentales de 5 ratonas cada uno. A las ratonas de la línea B6D2F1 en el día 17 de gestación se les infundieron 100 μl por glándula mamaria de una preparación que contenía en dependencia del grupo experimental: I- 2.5x107 GTU/ml del adenovirus (ΔE1ΔE3) conteniendo el gen del la hGH; II- lxlO9 GTU/ml del adenovirus (ΔE1ΔE3) conteniendo el gen de hEPO; III- solución salina.
Los ratones tratados se comenzaron a ordeñar a partir del día 2 post parto. La leche colectada se diluyó 1 en 5 con buffer de separación (10 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM CaCl2) y las caseínas se separaron del suero mediante centrifugación a 4o C durante 30 minutos a 15 000 g. El contenido de hGH en las muestras de leche fue detectado por Western blot y cuantificado por ELISA (hGH ELISA, Boehringer Mannheim, Cat. No. 1 585 878) (Fig. 3). El contenido de hEPO también fue detectado por por Western blot y cuantificado por ELISA (ELISA manufacturado en el CIGB) (Fig. 4). Ejemplo 5: Inducción de lactación en chivas. Los adenovirus recombinantes como vectores para transferir genes a la glándula mamaria pueden ser empleados virtualmente en cualquier especie de mamíferos, sin embargo los rumiantes son preferidos debido a su alta capacidad de producción de leche. Se pueden usar animales en una etapa temprana de la madurez sexual a los cuales se les puede inducir hormonalmente la mamogénesis y lactación o se pueden emplear animales en fase natural de lactación. Si los animales a tratar son por ejemplo chivas la inducción hormonal se puede realizar mediante el suministro de estradiol (0.25 mg/kg, i.m) y progesterona (0.75 mg kg, i.m.) en los días 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13 mientras que prednisolona (0.4 mg/kg, i.m) debe ser administrada en los días 14 al 16 con masajes diarios en la ubre a partir del día 5.
Ejemplo 6: Infusión de un adenovirus recombinate (ΔE1ΔE3) conteniendo el gen de la hGH en la glándula mamaria de chivas.
A chivas en fase de lactación se les administró intramuscularmente lOmg de diazepán para disminuir el estrés durante el tratamiento. Los animales fueron ordeñados extensivamente para eliminar la mayor cantidad posible de leche en las cisternas, las glándulas mamarias fueron enjuagadas dos veces mediante la infusión con 200 mi de solución salina a 37° C y posterior ordeño. Todas las infusiones se realizaron directamente a través del canal del pezón para lo cual se empleó un catete acoplado a una jeringuilla de 50 mi. Las infusiones se realizaron lentamente mientras que de forma simultánea se les daban masajes en las ubres infundidas.
En chivos, la ubre se puede separar en dos mitades independientes, una de ellas fue infundida con la solución conteniendo los vectores adenovirales mientras que la otra solo con salina y se empleó como control negativo interno. A cada glándula mamaria se le infundió 200 mi de solución salina conteniendo una carga viral de 109 GTU/ml, o sea, cada glándula mamaria recibió un total de 2 x 10" partículas víricas. Después de la infusión se les dieron masajes a la ubre para facilitar que la solución se distribuyera homogéneamente y alcanzara la totalidad de ductos y alvéolos. La solución infundida se removió al siguiente día mediante ordeño. Ejemplo 7: Infusión de un adenovirus recombinante dependiente de ayudante conteniendo el gen de eritropoietina en la glándula mamaria de chivas. A chivas en fase de lactación se les administró intramuscularmente lOmg de diazepán para disminuir el estrés durante el tratamiento. Los animales fueron ordeñados extensivamente para eliminar la mayor cantidad posible de leche en las cisternas, las glándulas mamarias fueron enjuagadas dos veces mediante la infusión con 200 mi de solución salina a 37° C y posterior ordeño. Todas las infusiones se realizaron directamente a través del canal del pezón para lo cual se empleó un catete acoplado a una jeringuilla de 50 mi. Las infusiones se realizaron lentamente mientras que de forma simultánea se les daban masajes en las ubres infundidas. En chivos, la ubre se puede separar en dos mitades independientes, una de ellas fue infundida con la solución conteniendo los vectores adenovirales mientras que la otra solo con salina y se empleó como control negativo interno. A cada glándula mamaria se le infundió 200 mi de solución salina conteniendo una carga viral de 109 PFU/ml, o sea, cada glándula mamaria recibió un total de 2 x 10" partículas víricas. Después de la infusión se les dieron masajes a la ubre para facilitar que la solución se distribuyera homogéneamente y alcanzara la totalidad de ductos y alvéolos. La solución infundida se removió al siguiente día mediante ordeño.
Ejemplo 8: Detección de hGH y hEPO en la leche de chivas infundidas con vectores adenovirales. La leche a partir de los animales infundidos se comenzó a colectar por ordeño manual a partir de las 48 horas post infusión. Se realizaron dos ordeños diarios, uno en la mañana y otro al final de la tarde. La mayor parte de la leche colectada se almacenó a -70° C para la posterior purificación de la proteína, mientras que pequeñas muestras fueron usadas para detectar y cuantiftcar el contenido de hGH o hEPO en cada uno de los lotes. La detección de hGH o hEPO en la leche se llevó a cabo como sigue. A muestras de 150 μl de leche se les adicionaron cuatro volúmenes de buffer de separación (10 mM Tris-HCl, 10 mM CaC ) y se centrifugaron a 4° C durante 30 minutos a 15 000 g para separar el suero de la grasa y las caseínas. La fracción del suero fue recobrada y las proteínas contenidas en 10 μl fueron separadas mediante SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 12.5%. Las proteínas se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa y marcadas con un anticuerpo policlonal anti-hGH (1/500). Las bandas inmunorreactivas fueron visualizadas mediante el sistema quimioluminiscente (ECL) de Amersham Pharmacia Biotech (Fig. 5B).
La cuantificación de hGH se realizó mediante ELISA. Se empleó el ELISA de hGH de Boehringer Mannheim (Cat. No. 1 585 878). Todo el procedimiento se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante.
La cuantificación de hEPO se llevó a cabo mediante un ELISA sandwich manufacturado en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, C. Habana, Cuba
En los animales infundidos con vectores adenovirales del tipo ΔE1ΔE3, la hGH se pudo detectar hasta el día 11 post infusión alcanzando los 0.3 mg/ml en los primeros 3 días (Fig. 5C). En el caso de los animales inoculados con los vectores adenovirales dependientes de ayudante los niveles de hEPO también fueron considerablemente altos (Fig. 6). El empleo de estos vectores rindió niveles de expresión superiores a los 0.2 mg/ml durante las primeras 5 semanas y declinando linealmente hasta llegar a 5ng/ml en el día 145 post infusión. Ventajas de la solución propuesta. El método propuesto en la presente invención constituye una solución a las necesidades cada vez más crecientes de producción de biofármacos de constitución proteica. Específicamente la presente invención permite la producción a gran escala de proteínas cuya actividad biológica está estrechamente relacionada con complejos procesamientos post traduccionales y de aquí que requieran de la maquinaria biosintética de las células de organismos superiores. El método aquí propuesto hace posible la producción de dichas proteínas en un proceso rápido, sencillo y económicamente factible. En este sentido la presente invención permite dar respuesta en breve tiempo a los cambios en las necesidades del mercado, su aplicación no involucra grandes requerimientos técnicos y su capacidad de reacción puede ser fácilmente ajustada en dependencia de las necesidades.
Adicionalmente la presente invención permite salvar tiempo y recursos como una alternativa para el estudio de las modificaciones post traduccionales en la glándula mamaria de diferentes especies. Teniendo en cuenta que la secuencia codificante para la proteína de estudio está contenida en un vector adenoviral, este puede ser transferido a la glándula mamaria de un amplio rango de especies, permitiendo de esta forma el estudio de las modificaciones diferenciales que sufre una misma proteína en dependencia de la especie donde se produzca.

Claims

REIVINDICACIONESMÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN LA GLÁNDULA MAMARIA DE MAMÍFEROS NO TRANSGÉNICOS
1. Un método para la producción de proteínas heterólogas en la leche de mamíferos no humanos mediante la transformación del EGM con vectores adenovirales, que comprende los siguientes pasos: a) Inducción de la lactación de un mamífero en etapas tempranas de su madurez sexual; b) Remoción de la leche y lavado exhaustivo del interior de la glándula mamaria previo a la infusión viral; c) Infusión a través del canal del pezón hasta completar la capacidad de la glándula mamaria de una solución conteniendo vectores adenovirales que portan los genes que codifican para las proteínas heterólogas de interés; d) Vaciado de la glándula mamaria entre las 4 y 24 horas post infusión; e) Colecta de la leche contenida en la glándula mamaria a partir de las 48 horas post infusión; f) Purificación a partir de la leche de las proteínas heterólogas de interés.
2. El método de la reivindicación 1, donde el vector adenoviral contiene la mayoría de los genes adenovirales.
3. El método de la reivindicación 1, donde el vector adenoviral es un adenovirus carente de la mayoría o todos los genes adenovirales y requiere de un adenovirus ayudante que le provea en trans las proteínas necesarias para la formación de las partículas víricas.
4. El método de la reivindicación 1, donde las proteínas heterólogas de interés son seleccionadas del grupo consistente de factores de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humano, el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento similar a la insulina, el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos, factor de crecimiento nervioso, eritropoietina, factores de coagulación tales como FVIII y FIX, anticuerpos, citoquinas tales como Interleukina 6 o Interleukina 2, αl -antitripsina, seroalbúmina humana, β-globina, activador tisular del plasminógeno, proteínas supresoras de tumores tales como P53, proteína C e interferones.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007098717A2 (es) 2006-02-28 2007-09-07 Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la peste porcina clásica
WO2016037297A1 (es) * 2014-09-12 2016-03-17 Universidad De Concepcion Método para la producción de proteínas recombinantes en glándula mamaria de mamíferos mediante la transformación del epitelio glandular mamario con vectores adenoasociados

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU23576A1 (es) * 2006-02-28 2010-09-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la influenza aviar
CN1869217B (zh) * 2006-05-22 2013-08-07 李青旺 以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法
AU2009266603B2 (en) 2008-06-30 2013-01-24 Cho-A Pharm Co., Ltd. Gene of porcine alpha-s1 casein, a promoter of the same and use thereof
EP2793936A4 (en) * 2011-12-19 2015-05-27 Lfb Usa Inc RECOMBINANT HUMAN ALPHA-1-ANTITRYPINE FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES
WO2018085967A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Guangzhou Institutes Of Biomedicine And Health, Chinese Academy Of Sciences Genetically humanized mammals expressing human serum albumin and uses thereof
EP4003957B1 (en) 2019-07-25 2024-04-17 Medichem, S.A. Process for the synthesis of n-alkyl-4-pyridinamines

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997048806A1 (en) * 1996-06-20 1997-12-24 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
WO1999043795A1 (en) * 1998-02-24 1999-09-02 Her Majesty In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Canada Trans-somatics with gene transfer into mammary epithelial cells

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5780009A (en) * 1995-01-20 1998-07-14 Nexia Biotechnologies, Inc. Direct gene transfer into the ruminant mammary gland
AU7719596A (en) * 1995-11-07 1997-05-29 Baylor College Of Medicine Adenovirus-mediated production of bioactive proteins by mammalian cells and animals
WO2002034282A2 (en) * 2000-10-27 2002-05-02 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Mammary secreted protein 36 (msp36) for cancer treatment and diagnosis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997048806A1 (en) * 1996-06-20 1997-12-24 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
WO1999043795A1 (en) * 1998-02-24 1999-09-02 Her Majesty In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Canada Trans-somatics with gene transfer into mammary epithelial cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARCHER J. S. ET AL: "Human growth hormone (hGH) secretion in milk of goats after direct transfer of the hGH gene into the mammary gland by using replication-defective retrovirus vectors" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 91, num. 75, 19 Julio 1994 (1994-07-19), páginas 6840-6844, XP002088503 ISSN: 0027-8424 *
See also references of EP1557084A2 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007098717A2 (es) 2006-02-28 2007-09-07 Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la peste porcina clásica
WO2016037297A1 (es) * 2014-09-12 2016-03-17 Universidad De Concepcion Método para la producción de proteínas recombinantes en glándula mamaria de mamíferos mediante la transformación del epitelio glandular mamario con vectores adenoasociados

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