WO2004032966A1 - 細胞増殖抑制剤 - Google Patents

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WO2004032966A1
WO2004032966A1 PCT/JP2003/013061 JP0313061W WO2004032966A1 WO 2004032966 A1 WO2004032966 A1 WO 2004032966A1 JP 0313061 W JP0313061 W JP 0313061W WO 2004032966 A1 WO2004032966 A1 WO 2004032966A1
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WO
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amino acid
atb
antibody
cell growth
acid transporter
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PCT/JP2003/013061
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Takahiro Hatanaka
Iwao Ohizumi
Jun-Ichi Nezu
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a cell growth inhibitor comprising an amino acid transporter ATB D '+ inhibitor as an active ingredient.
  • Mammals need to take in nutrients from outside the body, and it is known that there are many transport proteins in cells. It is the amino acid transporter (amino acid transport protein) that transports amino acids, and a large number of amino acid transporters have been found so far (see Non-Patent Document 1).
  • amino acid transporter amino acid transport protein
  • ATB Q '+ is an amino acid transporter expressed in the small intestine, lung and mammary gland. Functionally, ATB Q '+ is a Na + and C1-driven neutral and basic amino acid transport system. It plays an important role in the absorption of amino acids in the intestinal tract (see Non-Patent Document 1). Cloning of human ATB G ' + has recently been reported (see Non-Patent Document 4). C At present, the transport function of ATB Q ' + has been studied only for amino acids as substrates. Its transport function has a very strong aggregating power and is supplied with energy by the concentration gradient of Na + and C1- in and out of the membrane and the membrane potential difference.
  • ATB Q ' + is a variety of compounds such as amino acids (eg, glycine and proline), neurotransmitters (eg, monoamines and GABAs), and osmolyte (osmolyte) (eg, taurine and benzoin). Belongs to the gene family of Na + and C1 one driven transporters. Construction In particular, ATB Q '+ is very closely related to GABA and betaine transporters. ATB Q ' + is a 12-transmembrane protein consisting of 642 amino acids (Non-Patent Document 4). The homology at the amino acid level between human and mouse is 88%, and the homology in the extracellular region of TM3-4 is 77%.
  • ATB G '+ The physiological function of ATB G '+ is that of neutral and basic amino acids (see Non-Patent Documents 4 and 5), D-amino acids (Non-patent Document 6), carnitine (Non-Patent Document 7), It is thought to be involved in the efficient absorption of nutrients in the gastrointestinal tract and the efficient uptake of substances into cells by co-transporting sodium ions and one molecule of chloride ions into cells. Have been.
  • Patent Document 1 As for the ATB Q ' + gene and protein of the antigen, there is a PCT application (Patent Document 1), in which ATB G ' + is described as a glycine transporter.
  • ATB G + is expressed in the following organs. Master blot (Clontec h); lung, trachea, salivary gland (high), mammary gland, stomach, pituitary (low), large intestine, uterus, testis, prostate (lower) (Non-patent document 4).
  • ATB Q '+ is expressed in the following organs. Northern blot; large intestine (high), lung (low) (see Non-Patent Documents 5 and 8). Immunostaining; large intestine (see Non-Patent Document 6), lung, and trachea (all on the luminal side) (presented in Mager, in PharmaConference 2001, Interlaken, Switzerland).
  • Patent Document 1 WO2000 / 14221 pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Ganapathy, V. et al., In Current Topics in Membranes. Ed. Barrett. K. E. and Donowi tz. M., 2001, Vol. 50, p. 379-412.
  • Non-Patent Document 2 Os iecka et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1987, Vol. 242, p. 443-449.
  • Non-Patent Document 3 Hatanaka et al., Pharm. Res., 1999, Vol. 16, p. 1770-1774.
  • Non-Patent Document 4 Sloan, J.L., Mager, S., J. Biol. Chen, 1999, Vol. 274, p. 23740-23745
  • Non-Patent Document 5 Hatanaka et al., J. Clin. Invest. 2001, Vol. 107, p. 1035-10 43
  • Non-Patent Document 6 Hatanaka et al., Biochem. Biophys. Res. Co. thigh un., 2002, Vol. 291, p. 291-295.
  • Non-Patent Document 7 Nakani shi et al., J. Physiol., 2001, Vol. 532 (2), p. 297-304
  • Non-Patent Document 8 Ugawa et al., Am. J. Physiol., 2001, Vol. 281, G365-G370 Invention disclosure
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and it is an object of the present invention to provide a cell growth inhibitor containing an amino acid transport enzyme ATB G + inhibitor as an active ingredient, particularly a cancer cell proliferation such as colorectal cancer. It is to provide an inhibitor.
  • L-2-phenylglycine is a canine small intestinal brush border membrane that shows strong ATB Q '+ activity, and has a stronger affinity than similar L-alanine and L-phenylalanine. Therefore, it is considered to be a competitive inhibitor having strong specificity for ATB Q '+ (Hatanaka et al. 2002, J. Pharm. Pharmcol.).
  • L-2-phenyldaricin which is considered to be one of the inhibitors of ATB Q '+, as a test substance, and tested cells against human colon cancer lines SW60, HT-29 and breast cancer line MCF-7. A proliferation test was performed.
  • the present inventors have found that cell growth can be suppressed by inhibiting the activity of the amino acid transporter ATB Q ' + , and completed the present invention.
  • the findings discovered by the present inventors have made it possible to develop a cytostatic agent targeting the amino acid transporter ATB Q '+. That is, the findings found by the present inventors show that cell growth can be suppressed by inhibiting the activity of the amino acid transporter ATB Q + .
  • suppression of amino acid transport activity ATB Q '+ activity is considered to be an important indicator.
  • the cell growth inhibitor of the present invention is greatly expected to be used for suppressing the growth of cancer (for example, colon cancer, breast cancer, etc.).
  • the present invention relates to a cell growth inhibitor comprising an amino acid transporter ATB G ′ + inhibitor as an active ingredient, and more specifically,
  • the amino acid transporter ATB Q + inhibitor is a substance that inhibits the transport function of the amino acid transporter ⁇ ° ′ + by binding to the amino acid transporter — ATB G ′ +, according to (1).
  • a cytostatic agent A cytostatic agent
  • amino acid transporter ATB 0 inhibitors L- amino acids, N0S inhibitors, Fuenirudarishin derivatives, carnitine, the group consisting of prodrug-based D- amino acids or amino acids, or, selected from these derivatives compounds
  • the cell growth inhibitor according to (1)
  • Amino acid transporter ATB ° '+ inhibitor is amino acid transporter A
  • the cell growth inhibitor according to (1) which is an antibody that binds to TB; (7) the antibody that binds to the amino acid transporter ATB Q + is an antibody having cytotoxic activity; Cytostatic,
  • cytostatic agent of [7] wherein the cytotoxic activity is an antibody-dependent cell-mediated cytotoxic activity (ADCC activity);
  • the present invention provides a cell growth inhibitor comprising an amino acid transporter ATB Q + inhibitor as an active ingredient.
  • the amino acid transporter targeted by the cytostatic agent of the present invention—Yuichi ATB G ′ + is a Na + and C1-driven amino acid transporter, and is a neutral or basic amino acid (Sloan et al., J. Am. Biol. Chem., 274, p23740-23745, 1999, Hat anaka et al., J. Clin. Invest., 107, pl035-1043, 2001) and D-amino acids (Hatanaka et al., Biochem. Biophys). Res.
  • Carnitine (Nakanishi et al., J. Physiol., 532, 2, P297-304, 2001), etc. were converted to two molecules of sodium ion and one molecule of chlorine. It is thought to be transported into cells by co-transport with ions, and to be involved in efficient absorption of nutrients in the digestive tract and efficient uptake of substances into cells.
  • amino acid sequence of the amino acid transporter ATB G '+ protein and the nucleotide sequence of the gene encoding the protein are already publicly available. Is knowledge.
  • the amino acid transporter ATB G + inhibitory substance of the present invention inhibits the transport via the amino acid transporter ATB Q ' + and suppresses cell growth, or the amino acid transporter ATB G ' + It is not particularly limited as long as it binds and suppresses cell growth by cytotoxic activity.
  • the substance that inhibits the transport via the amino acid transporter ATB Q + include, for example, a substance that binds to the amino acid transporter ATB G ′ + and inhibits the transport function of the amino acid transporter ATB Q ′ + , Supota ATB Q + suppresses but substances and the like expression, preferred are those which inhibit + transport function 'amino acid transporter ATB Q bonded to +' amino acid transporter ATB Q.
  • amino acid transporter ATB Q ' + inhibitor in the present invention examples include a synthetic low-molecular compound, an antibody, a protein, a peptide, a natural compound, and the like. Specifically, a NOS inhibitor, phenyldaricin, carnitine (Carnitine) (tine), D-amino acid, or amino acid-based prodrugs, or derivatives thereof.
  • the N0S inhibitor in the present invention is preferably an N0S inhibitor having a basic structure of a neutral or basic L-amino acid structure, more preferably L-arginine, L-lysine (lysin). ), L-citrulline (ci trul line) or L-ornicin (ornithine) as a basic structure, and more preferably an N0S inhibitor, more preferably arginine, lysine, citrulline, ornosine, L-NNA ( N G - ni tro- L- arginine) , L- NAME (N G - ni t ro-L-argi nine methyl ester), L-NMMHA (N G -monomethyl-L-homoarginine), L - negation A (N G , If-dimethyl-L-arginine), L-NMEA ( NG -monoethyl-L-arginine), L-NMMA ( NG -monomethy 1-
  • the phenyldaricin or its derivative of the present invention is usually a drug or a prodrug having a phenylglycine structure, and preferably a phenyldaricin derivative having a free Q! Amino acid and a strong lipoxyl group (at physiological pH).
  • the carnitine or a derivative thereof of the present invention is preferably carnitine or its acyl ester, and more preferably carnitine, acetyl carnitine, and propionyl carnitine.
  • the D-amino acids in the present invention are preferably D-alanine, D-serine, D-methionine, D-leucine, D-mouthine. Tryptophan, D-threonine, D-histidine
  • D-phenylalanine, D_glutamine, or a derivative thereof more preferably D-alanine, D-serine, D-methionine, D-mouth isine, D-glutamine.
  • -Tributophane or a derivative thereof more preferably D-alanine, D-serine, D-methionine, D-leucine, D-tributofan.
  • the amino acid-based prodrug in the present invention is preferably a prodrug having an amino acid functional group (including a D- or L-amino acid), and more preferably a ⁇ -carboxyl ester having aspartic acid or glutamic acid. It is a prodrug or an alkoxyl ester prodrug, or a carboxylic ester prodrug having a neutral or basic amino acid.
  • the above compound can be appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include a radioactive label and a fluorescent label.
  • the amino acid transporter ATB G + inhibitor in a preferred embodiment of the present invention includes an amino acid transporter II. ' + Antibodies to the protein.
  • Antibodies usually recognize and bind to ATB G ' + proteins.
  • the antibody contained in the cell growth inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it binds to the amino acid transporter ATB G '+.
  • it is an antibody that specifically binds to the amino acid transporter ATB Q '+, and more preferably, it is an antibody having cytotoxic activity.
  • the cytotoxic activity in the present invention is, for example, an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity, a complement-dependent cytotoxicity.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CDC activity means cytotoxic activity by the complement system
  • ADCC activity means that when a specific antibody is attached to a cell surface antigen of a target cell, an Fc receptor-containing cell (immune Cells, etc.) through the Fcr receptor and damage target cells.
  • Whether the anti-amino acid transporter ATB Q ' + antibody has ADCC activity or CDC activity can be measured by a known method (for example, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies). in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)).
  • an effector cell a complement solution, and a target cell are prepared.
  • the spleen is removed from a CBA / N mouse or the like, and the spleen cells are separated in RPMI 1640 medium (GIBC0). After washing with the same medium containing 10% fetal calf serum (FBS, HyClone), adjust the cell concentration to 5 x 10 V ml to prepare effector cells.
  • RPMI 1640 medium GIBC0
  • FBS fetal calf serum
  • CEDARLA E Dilute Baby Rabbit Complement
  • GIBC0 10% FBS-containing medium
  • Spleen cancer cell lines (AsPC_l, Capan-2, etc.) were transformed with 0.2mCi of 51 Cr-sodium chromate (Amersham (Pharmacia Biotech) in a DMEM medium containing 10% FBS at 37 ° C for 1 hour for radiolabelling. After radiolabeling, cells were washed 3 times with 10% FBS RPMI 1640 medium containing, by preparing a cell concentration to 2 x i0 5 / ml, to prepare a target cell.
  • ADCC activity or CDC activity is measured.
  • A is the radioactivity (cpm) of each sample
  • B is the radioactivity (cpm) of the sample to which 1% NP-40 (manufactured by Hanui) was added
  • C is the radioactivity (cpm) of the sample containing only target cells. Show.
  • target cells and 50 l of the anti-amino acid transporter ATB Q ' + antibody are added to a 96-well flat bottom plate (manufactured by Becton Dickinson) and reacted on ice for 15 minutes. Then, add complement solution 100 ⁇ 1 and incubate for 4 hours in a carbon dioxide incubator overnight. The final antibody concentration is 0 or 3 g / ml. After culturing, collect 100 xl supernatant and measure the radioactivity using a gamma counter. The cytotoxic activity can be determined in the same manner as the measurement of ADCC activity.
  • the antibody used as an active ingredient of the cell growth inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it binds to an antigen (amino acid transporter ATB G + protein or its partial peptide), and may be a mouse antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, Hidge antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies and the like can be used as appropriate.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody because a homogeneous antibody can be stably produced. Polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • Hybridomas that produce monoclonal antibodies basically use known techniques 2003/013061
  • -1 o-and can be manufactured as follows. That is, a desired antigen or a cell that expresses the desired antigen is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method, and the obtained immune cells are compared with known parent cells by a normal cell fusion method.
  • the antibody can be produced by screening and screening monoclonal antibody-producing cells (i.e., hybridomas) by a conventional screening method.
  • the antigen can be prepared according to a known method, for example, a method using a baculovirus (W098 / 46777, etc.).
  • hybridomas The production of hybridomas is described, for example, by the method of Milstein et al. (Kohler. G. and
  • the method can be carried out according to, for example, Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
  • immunization may be carried out by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, inserting the clone into an appropriate vector, introducing the clone into a host, and using a gene recombination technique can be used (for example, Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Clar shed in the United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • cDNA for the variable region (V region) of the antibody is synthesized from the hybridoma inRNA using reverse transcriptase.
  • the DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated to the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and inserted into an expression vector.
  • the DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the C region of the antibody.
  • the expression control region for example, an expression vector that is expressed under the control of an enhancer or promoter.
  • host cells can be transformed with the expression vector to express the antibody.
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans such as a chimeric antibody and a humanized antibody
  • modified antibodies are produced using known methods.
  • a chimeric antibody is an antibody comprising a heavy chain and light chain variable region of a non-human mammal, such as a mouse antibody, and a heavy chain and light chain constant region of a human antibody, and DNA encoding the mouse antibody variable region. Is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, and this is integrated into an expression vector, introduced into a host, and produced.
  • the humanized antibody is also called a reshaped human antibody.
  • the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal such as a mouse antibody, is converted to the complementarity determining region of a human antibody. It has been transplanted, and its general gene recombination technique is also known.
  • a MA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was prepared by constructing an MA sequence that has an overlapping portion at the end. It is synthesized by PCR from individual oligonucleotides.
  • the obtained DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, then incorporated into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application Publication number W0 96/02576).
  • Human antibody FRs linked via CDRs are selected so that the complementarity-determining regions form a favorable antigen-binding site. If necessary, amino acids in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • a method for obtaining a human antibody is known.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen in vitro, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, for example, U266, and have an antigen-binding activity.
  • a desired human antibody see Japanese Patent Publication No. 59878.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain antibody (scFv) on the surface of a phage by a phage display method using phage display.
  • scFv single-chain antibody
  • a human antibody can be obtained by preparing an appropriate expression vector for the sequence.
  • These methods are already well-known and can be referred to TO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, W0 95/01438, W0 95/1 5388. it can.
  • an antibody gene When an antibody gene is once isolated and introduced into an appropriate host to produce an antibody, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • animal cells When eukaryotic cells are used as hosts, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used.
  • Animal cells include (1) mammalian cells, for example, CH0, COS, myeloma, BHK (baby ams ter kidney), HeLa, Vero, (2) amphibian cells, for example, African oocyte, or (3) Insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • plant cells cells of the genus Nicotiana cotiani), for example, cells derived from Nicotiana 'Tavacam tabotum', are known.Callus culture is performed.
  • Fungal cells include yeast, for example, Saccharomyces ⁇ accharowces For example, Saccharomyces serevisiae), filamentous fungi, for example, the genus Aspergillus, such as Uispergillus niger) are known.
  • yeast for example, Saccharomyces ⁇ accharowces
  • filamentous fungi for example, the genus Aspergillus, such as Uispergillus niger
  • prokaryotic cells there are production systems that use bacterial cells.
  • bacterial cells Escherichia coli and Bacillus subtilis are known.
  • An antibody can be obtained by introducing the antibody gene of interest into these cells by transformation, and culturing the transformed cells with cells.
  • the antibody of the present invention may be an antibody variant.
  • an antibody variant refers to an amino acid sequence variant of an antibody in which one or more amino acid residues have been modified. Point to ant. Regardless of the modified amino acid variant, it is included in the “antibody variant” of the present invention if it has the same binding specificity as the original antibody. Such variants may have at least 75%, more preferably at least 80%, still more preferably at least 85, even more preferably at least 90%, the amino acid sequence of the variable domain of the heavy or light chain of the antibody. And most preferably, it has less than 100% sequence homology or similarity with an amino acid sequence having at least 95% amino acid sequence homology or similarity.
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof, as long as it binds to the amino acid transporter ATB Q ' + protein and inhibits the function of the protein.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, Fv, or single chain Fv (scFv) in which Hv or L chain Fvs are linked by an appropriate linker.
  • a suitable host cell for example, Co, MS et al., J. Immunol.
  • the H chain V region and L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Pro Natl. Acad. A (1988) 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and L chain V region in the scFv can be from any of the antibodies described herein.
  • As the peptide linker connecting the V regions for example, any single-chain peptide consisting of 12 to 19 residues is used.
  • the DNA encoding the scFv is selected from the group consisting of DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody and MA encoding the L chain or L chain V region.
  • the DNA portion encoding the entire amino acid sequence or the desired amino acid sequence is designated as ⁇ , amplified by a PCR method using a pair of primers defining both ends thereof, and then a DNA encoding a peptide linker portion, and It is obtained by amplifying a combination of a pair of primers that are defined such that both ends are linked to an H chain and an L chain, respectively.
  • DNAs encoding scFv are prepared, an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method. By using it, scFv can be obtained according to a conventional method. These antibody fragments can be obtained, expressed, and produced by a host in the same manner as described above.
  • an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Methods for modifying antibodies have already been established in this field.
  • the “antibody” in the present invention also includes these antibodies.
  • the antibody used in the present invention may be a bispecific antibody (bispeciic ant ibody).
  • the bispecific antibody may be a bispecific antibody having an antigen binding site that recognizes a different epitope on the amino acid transporter ATB Q ' + molecule, or one of the antigen binding sites may be an amino acid transporter ATB It may recognize Q ' + and the other antigen binding site may recognize a cytotoxic substance such as a radioactive substance, a chemotherapeutic agent, or a cell-derived toxin. In this case, it is possible to cause a cytotoxic substance to act directly on cells expressing the amino acid transporter ATB G ' + to specifically damage tumor cells, thereby suppressing the growth of tumor cells.
  • Bispecific antibodies can be prepared by combining HL pairs of two types of antibodies, or by fusing hybridomas producing different monoclonal antibodies to produce bispecific antibody-producing fusion cells. You can also. Further, bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • the antibody expressed and produced as described above can be purified by a known method used for ordinary protein purification.
  • protein A columns Antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining affinity columns, chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescence immunoassay can be used.
  • Whether or not a specific molecule binds to the amino acid transporter ATB Q '+ of the present invention can be determined by those skilled in the art by a known method.
  • Known methods include, for example, immunoprecipitation, West Western blotting, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), EIA (enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (radioimmunoassay), fluorescent immunoassay, surface And a method using a biosensor utilizing the plasmon resonance phenomenon.
  • test sample is brought into contact with the amino acid transporter ATB ° '+, the binding between the amino acid transporter ATB G ' + and the test sample is detected, and the compound that binds to the amino acid transporter ATB G ' + You just have to select
  • the test sample is not particularly limited. For example, cell extract, cell culture supernatant, fermented microorganism product, marine organism extract, plant extract, purified or crude protein (including antibody), peptide, non-peptide Compounds, synthetic low-molecular compounds, and natural compounds.
  • the amino acid transporter is brought into contact with a test sample, for example, as a purified protein, as a form bound to a carrier, as a fusion protein with other proteins, as a form expressed on a cell membrane, or as a membrane fraction. be able to.
  • a test sample for example, as a purified protein, as a form bound to a carrier, as a fusion protein with other proteins, as a form expressed on a cell membrane, or as a membrane fraction.
  • a potential candidate for the cytostatic of the present invention is identified. For selection, it is useful to detect whether these compounds inhibit the transport function of amino acid transporter ATB Q '+.
  • Whether or not a specific molecule inhibits the transport function of amino acid transporter can be determined by a known method, for example, by labeling a substrate such as an amino acid with a radioactive substance (such as) or a fluorescent substance, Can be determined by, for example, measuring the amount of the amino acid incorporated into cells expressing the amino acid transporter.
  • a substance that suppresses the expression of the amino acid transporter ATB G ′ + can also be used.
  • Such substances include, for example, antisense oligonucleotides to the amino acid transporter ATB Q '+ gene.
  • the antisense oligonucleotide include an antisense oligonucleotide that hybridizes to any part of DNA or mRNA encoding the amino acid transporter ATB A ' + .
  • the antisense oligonucleotide is preferably an antisense oligonucleotide to at least 15 or more consecutive nucleotides in the DNA or mRNA of the amino acid transposon.
  • At least 15 or more consecutive nucleotides are antisense oligonucleotides containing a translation initiation codon.
  • antisense oligonucleotide derivatives and modifications thereof can be used.For example, modified lower alkyl phosphonates such as methylphosphonate type and ethylphosphonate type, phosphorothioate modification or phosphoramidate Modifications and the like can be mentioned.
  • Cells targeted by the cell growth inhibitor of the present invention are not particularly limited, but are preferably cancer cells such as colon cancer, breast cancer, and knee cancer, and are particularly preferably colon cancer cells or breast cancer cells. .
  • the cell growth inhibitor of the present invention is used for the treatment and prevention of diseases caused by cell proliferation, particularly cancer such as colon cancer or breast cancer.
  • amino acid transporter ATB Q '+ is expressed in the plasma membrane on the blood vessel side.
  • amino acid transporter ATB Q '+ inhibitors eg, antibodies that bind to amino acid transporter ATB Q ' +
  • amino acid transporter ATB G '+ function in normal tissues
  • cancer cells such as colorectal cancer
  • abnormalities of the amino acid transporter ATB G ' + in cancer cells such as colorectal cancer are considered to be related to enhanced uptake of amino acids required for protein synthesis accompanying cancer cell proliferation, inferred from physiological functions. It is possible.
  • the cell growth inhibitor of the present invention is considered to be a novel anticancer agent having an effect of nutrient blockade by the amino acid transporter ATB Q ' + inhibitor.
  • a cell growth inhibitor containing an antibody that binds to amino acid transport protein ATB Q ′ + as an active ingredient is characterized in that the antibody specifically binds to ATB Q: + and binds to tumor cells.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be added as necessary according to a conventional method.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be added as necessary according to a conventional method.
  • surfactants, excipients, colorants, flavors, preservatives, stabilizers, buffers, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrants, lubricants, fluidity enhancers examples include, but are not limited to, flavoring agents and other commonly used carriers.
  • examples include pyrrolidone, gelatin, medium chain fatty acid toridaricelide, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, and inorganic salts.
  • Examples of the dosage forms of the above drugs include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft hard capsules, film coatings, pellets, Sublingual preparations, pastes, etc., parenteral preparations include injections, suppositories, transdermal preparations, ointments, plasters, topical solutions, etc. You can choose the type.
  • the cell growth inhibitor of the present invention can be administered either orally or parenterally, but is preferably parenterally administered.
  • injection, nasal administration, pulmonary administration Dosage forms, transdermal administration forms and the like can be mentioned.
  • the injection form include systemic or local administration by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose can be selected, for example, in the range of 0.001 mg / kg to 100 mg / kg body weight at a time. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient.
  • the therapeutic agent of the present invention is not limited to these doses.
  • the therapeutic agent of the present invention can be formulated according to a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical Science, lateted ion, Mark Publishing Co immediately any, Eastern, USA). Or a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • FIG. 1 is a photograph showing the expression status of the amino acid transporter ATB Q ′ + in various cancer cell lines.
  • the photo on the left is a photo when PCR was performed using a combination of the D1 and D2 primers, and the photo on the right is a photo when PCR was performed using a combination of the D5 and D6 primers.
  • ⁇ The correspondence between L numbers and cell lines is as follows (Table 1) TCP 1 A549 Lung TCP 14 DU-145 Prostate TCP 27 BxPC-3 Pancreas
  • TCP1 corresponds to Pell 1 and TCP2 corresponds to Pell 2.
  • N indicates the case where no type III DNA was added, and G indicates the case where human chromosomal DNA was added.
  • FIG. 2 is a graph showing the cell growth inhibitory effect of L-2-phenyldaricin on various cancer cell lines.
  • RNA was prepared using IS0GEN (Futsubojin) or TRIzol (Invitrogen) according to the standard method recommended by each manufacturer.
  • Colorectal cancer HT-29, LS 174T, COLO 205, LoVo, SW620
  • Prostate cancer cell line DU-145, PC-3 LNCap.
  • FGC, 22Rvl • Leukemia cell lines: BALL-1, P39 / TSU, K-view, CCRF-CEM, J0K-1
  • Knee cancer cell lines BxPC-3, Capan-K MIA PaCa-2, PANC-K AsPC-1 (1-2) RT-PCR analysis
  • a single-stranded cDNA was synthesized from the total RNA using the SUPERSCRIPT TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) according to the standard method recommended by the manufacturer. Oligo dT (12-18mer) was used as a primer for the reverse transcription reaction. A part of this cDNA was designated as type II, and PCR analysis was performed under the following conditions using primers specific to the human ATB G ' + gene.
  • TaKaRa ExTa (TaKaRa) 0.3 L
  • ATB D ' + may be highly expressed in the tumor sites of the above colon, breast and knee cancer patients.
  • L-2-phenyldaricine (phenyl glycine) is a strong ATB Q ' + active in the small intestinal brush border membrane of dogs. Compared to the similar L-alanine and L-phenylalanine in the intestinal brush border membrane, it is a stronger affinity. Therefore, it is considered to be a competitive inhibitor having strong specificity for ATB (Hatanaka et al. 2002, J. Pharm. Pharmacol.).
  • L-2-phenyldaricin was dissolved in a medium containing 0% FBS to prepare a 20 mM L-2-phenyldaricin solution. The medium used was SWDM, IMDM was used for HT29, and RPMI was used for MCF-7. This solution was diluted with a medium to prepare 2, 0.2, 0.02 and 0.002 mM L-2-phenyldaricin solutions.
  • FIG. 2 shows the results of the cell proliferation test.
  • SW60 did not inhibit cell growth due to L-2-Phenylglycine.
  • HT29 and MCF-7 inhibited cell growth in a concentration-dependent manner.
  • Cell growth inhibition in HT29 was approximately 10% in the presence of 10 x M L-2-Phenylglycine, reaching an equilibrium.
  • Cell growth inhibition in MCF-7 was about 10% in the presence of ImM L-2-Phenylglycine.
  • a substance that inhibits the activity of the amino acid transporter ATB Q '+ has an effect of suppressing cell proliferation. This has made it possible to develop cytostatics targeting the amino acid transporter ATB G ' + .
  • Such a cell growth inhibitor is greatly expected to be used for suppressing the growth of cancer (for example, colorectal cancer).

Abstract

アミノ酸トランスポーターATB０,＋の阻害剤の一つと考えられるL-2-フェニルグリシンを被検物質として、ヒト大腸癌株および乳癌株に対しての細胞増殖試験を行い、濃度依存的な細胞増殖抑制効果を見出した。このことはATB０,＋の活性を阻害することにより、細胞増殖を抑制しうることを示すものである。癌細胞などの増殖抑制剤の開発において、アミノ酸トランスポーターATB０,＋の活性の抑制は重要な指標となると考えられる。

Description

明細 細胞増殖抑制剤 技術分野
本発明は、 アミノ酸トランスポ一ター ATBD'+阻害物質を有効成分とする細胞増殖 抑制剤に関する。
^景技術
哺乳動物は、 生体外から栄養源を取り込む必要性があり、 細胞には多くの輸送 タンパク質が存在することが知られている。 アミノ酸の輸送を行っているのはァ ミノ酸トランスポーター （アミノ酸輸送タンパク質） であり、 現在までに多数の アミノ酸トランスポーターが見出されている （非特許文献 1参照） 。
アミノ酸トランスポーターは天然アミノ酸だけでなく、 L-ひ -メチルド一パ、 NO S阻害剤などの薬剤の輸送にも関与していることが報告されている （非特許文献 2 及び 3参照） 。
ATBQ' +は、 小腸、 肺および乳腺に発現するアミノ酸輸送体である。 機能的には、 ATBQ' +は、 Na+および C1—駆動型中性および塩基性アミノ酸輸送システムである。 これは、 腸管におけるアミノ酸の吸収において重要な役割を果たしている（非特許 文献 1参照）。 ヒト ATBG' +のクローニングが最近報告されている（非特許文献 4参照） c 現時点で、 ATBQ' +の輸送機能は、 基質としてのアミノ酸についてのみ研究されて いる。 その輸送機能は非常に集積力が強く、 Na+および C1—の膜内外濃度勾配なら びに、 膜電位差によりエネルギー供給されている。 ATBQ' +は、 アミノ酸 (例えば、 グリシンおよびプロリン）、 神経伝達物質（例えば、 モノアミンおよび GABA)、 なら びに浸透圧調節物質 (osmolyte) (例えば、 タウリンおよびべ夕イン）のような様々 な化合物に対する Na+および C1一駆動型輸送体の遺伝子ファミリーに属する。 構造 的に、 ATBQ' +は、 GABA輸送体およびべタイン輸送体に非常に密に関連している。 ATBQ' +は、 ァミノ酸 642個からなる 12回膜貫通型夕ンパクである（非特許文献 4)。 また、 ヒトーマウス間でのアミノ酸レベルでの相同性は 88%であり、 TM3- 4の細胞 外領域における相同性は 77%である。 ATBG' +の生理機能は、 中性および塩基性アミ ノ酸 (非特許文献 4および 5参照)や、 D-アミノ酸 (非特許文献 6)、 カルニチン (非特 許文献 7)等を 2分子のナトリウムイオンおよび 1分子の塩素イオンとの共輸送によ り細胞内に運搬し、 消化管における栄養物質の効率的な吸収や、 細胞内への物質 の効率的な取り込みに関与していると考えられている。
また、 抗原の ATBQ' +の遺伝子およびタンパク質に関しては、 PCT出願 （特許文献 1 ) が存在し該出願では ATBG' +はグリシントランスポーターとして記載されてい る。
ヒトにおいて ATBG +は以下の臓器で発現している。 Master blot (禮, Clontec h) ； 肺、 気管、 唾液腺 （高） 、 乳腺、 胃、 下垂体 （低） 、 大腸、 子宮、 精巣、 前 立腺 （更に低い） （非特許文献 4)。
また、 マウスにおいて ATBQ' +は以下の臓器で発現している。 Northern blot； 大腸 （高） 、 肺 （低） （非特許文献 5および 8参照)。 免疫染色； 大腸 （非特許文献 6参照）、 肺、 気管 (全て管腔側) (Mager, in PharmaConference 2001, Interlake n, Swi tzerlandにて発表）。
しかしながら、 ATBQ' +の癌細胞増殖への関与は不明であり、 ATBQ' +の機能を阻 害することにより癌細胞の増殖に影響を与えるか否かの議論は行われていなかつ た。
〔特許文献 1〕 国際公開第 2000/14221号パンフレツト
〔非特許文献 1〕 Ganapathy, V. ら著， In Current Topics in Membranes. Ed. Ba rret t. K. E. and Donowi tz. M. , 2001年, Vol. 50, p. 379-412
〔非特許文献 2〕 Os ieckaら著， J. Pharmacol. Exp. Ther. , 1987年， Vol. 242， p. 443-449 〔非特許文献 3〕 Hatanakaら著， Pharm. Res. , 1999年， Vol. 16， p. 1770-1774
〔非特許文献 4〕 Sloan, J. L. , Mager, S.著， J. Biol. Chen , 1999年， Vol. 274, p. 23740-23745
〔非特許文献 5〕 Hatanakaら著， J. Cl in. Invest. 2001年， Vol. 107, p. 1035-10 43
〔非特許文献 6〕 Hatanakaら著， Biochem. Biophys. Res. Co腿 un. , 2002年， Vol. 291, p. 291-295
〔非特許文献 7〕 Nakani shiら著， J. Physiol. , 2001年， Vol. 532 (2) , p. 297-304
〔非特許文献 8〕 Ugawaら著， Am. J. Phys iol. , 2001年， Vol. 281, G365-G370 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 ァミノ 酸トランスポー夕一 ATBG +阻害物質を有効成分とする細胞増殖抑制剤、 特に大腸 癌などの癌細胞増殖抑制剤を提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った。 L-2-フエニルダ リシン (phenylglyc ine)は、 強い ATBQ' +活性を示すィヌ小腸刷子縁膜で、 類似の L- ァラニン（alanine)および L-ファニルァラニン（phenylalanine)に比べ強いァフィ 二ティ一を示すことから、 ATBQ' +に特異性の強い競合的阻害剤であると考えられ ¾ (Hatanaka et al. 2002, J. Pharm. Pharmcol. )。 本発明者らは、 ATBQ' +の阻害 剤の一つと考えられる L- 2-フエニルダリシンを被検物質として、 ヒト大腸癌株 SW6 0、 HT- 29および乳癌株 MCF- 7に対しての細胞増殖試験を行った。 その結果、 SW60に おいては L- 2-フエニルダリシンによる細胞増殖抑制が認められなかった。 一方、 H T - 29及び MCF- 7においては L- 2-フェニルグリシン濃度依存的な細胞増殖抑制が認め られた。 RT- PCRの結果から、 MCF- 7および HT- 29では ATBQ +の発現が高く、 SW60に おいては ATBQ' +は検出限界以下であった。 以上より、 L- 2-フエニルダリシンによ る細胞増殖抑制は、 非特異的細胞毒性ではなく ATBQ' +の機能阻害によることが示 唆された。
上記の如く本発明者らは、 アミノ酸トランスポーター ATBQ' +の活性を阻害する ことにより、 細胞増殖を抑制することが可能であることを見出し、 本発明を完成 させた。 本発明者らによって見出された知見により、 アミノ酸トランスポ一夕一 A TBQ' +を標的として、 細胞増殖抑制剤を開発することが可能となった。 即ち、 本発 明者らによって見出された知見は、 アミノ酸トランスポーター ATBQ +の活性を阻 害することにより、 細胞増殖を抑制しうることを示すものである。 癌細胞などの 増殖抑制剤の開発において、 アミノ酸トランスポー夕一 ATBQ' +の活性の抑制は重 要な指標となるものと考えられる。 本発明の細胞増殖抑制剤は、 癌 （例えば、 大 腸癌、 乳癌等） の増殖の抑制に利用されることが大いに期待される。
本発明は、 アミノ酸トランスポーター ATBG' +阻害物質を有効成分とする細胞増 殖抑制剤に関し、 より具体的には、
〔1〕 アミノ酸トランスポー夕一 ATBQ' +阻害物質を有効成分とする細胞増殖抑 制剤、
〔2〕 アミノ酸トランスポーターが Na+および C1—駆動型アミノ酸トランスポータ 一である、 〔1〕 に記載の細胞増殖抑制剤、
〔3〕 アミノ酸トランスポーターが ATBQ' +である、 〔1〕 に記載の細胞増殖抑 制剤、
〔4〕 アミノ酸トランスポーター ATBQ +阻害物質が、 アミノ酸トランスポー夕 — ATBG' +に結合することによりアミノ酸トランスポーター ΑΤΒ°' +の輸送機 能を阻害する物質である、 〔1〕 に記載の細胞増殖抑制剤、
〔5〕 アミノ酸トランスポーター ATB0 阻害物質が、 L-アミノ酸、 N0S阻害剤、 フエニルダリシン誘導体、 カルチニン、 D-アミノ酸、 もしくはアミノ酸を 基礎とするプロドラッグからなる群、 あるいは、 これらの誘導体化合物群 より選択される、 〔1〕 に記載の細胞増殖抑制剤、
〔6〕 アミノ酸トランスポーター ATB°' +阻害物質がアミノ酸トランスポーター A TB に結合する抗体である、 〔1〕 に記載の細胞増殖抑制剤、 〔7〕 アミノ酸トランスポーター ATBQ +に結合する抗体が、 細胞傷害活性を有 する抗体である、 〔6〕 に記載の細胞増殖抑制剤、
〔 8〕 細胞傷害活性が抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性 （ADCC活性） である、 〔7〕 に記載の細胞増殖抑制剤、
〔9〕 補体依存性細胞傷害活性 （CDC活性） を有する抗体である、 〔7〕 に記載 の細胞増殖抑制剤、
〔1 0〕 アミノ酸トランスポーター ATBQ' +阻害物質がアミノ酸トランスポー夕 一 ATBQ' +の発現を抑制する物質である、 〔1〕 に記載の細胞増殖抑制剤、 〔1 1〕 癌細胞の増殖を抑制する、 〔1〕 〜 〔1 0〕 のいずれかに記載の細胞 増殖抑制剤、
〔1 2〕 癌細胞が大腸癌細胞、 膝臓癌細胞または乳癌細胞である、 〔1 1〕 に 記載の細胞増殖抑制剤、
を提供するものである。
本発明は、 アミノ酸トランスポーター ATBQ +阻害物質を有効成分とする細胞増 殖抑制剤を提供する。 本発明の細胞増殖抑制剤の標的となるアミノ酸トランスポ —夕一 ATBG' +は、 Na+および C1-駆動型アミノ酸トランスポーターであり、 中性また は塩基性アミノ酸（Sloan et al. , J. Biol. Chem. , 274, p23740-23745, 1999, Hat anaka et al. , J. Cl in. Invest. , 107, pl035-1043, 2001)や、 D-アミノ酸 (Hata naka et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 291, p291-295, 2002) カルニ チン (Nakanishi et al. , J. Physiol. , 532, 2, P297-304, 2001)等を 2分子のナ トリウムイオンおよび 1分子の塩素イオンとの共輸送により細胞内に運搬し、 消化 管における栄養物質の効率的な吸収や、 細胞内への物質の効率的な取り込みに関 与しているものと考えられている。
アミノ酸トランスポーター ATBG' +タンパク質のアミノ酸配列および該タンパク 質をコードする遺伝子 （GenBankァクセッション No. 151978) の塩基配列は既に公 知である。
本発明のアミノ酸トランスポ一夕一ATBG +阻害物質は、 アミノ酸トランスポー 夕一 ATBQ' +を介した輸送を阻害し、 細胞の増殖を抑制するもの、 あるいはァミノ 酸トランスポーター ATBG' +に結合し、 細胞傷害活性により細胞の増殖を抑制する ものであれば、 特に限定されない。 アミノ酸トランスポーター ATBQ +を介した輸 送を阻害する物質としては、 例えば、 アミノ酸トランスポーター ATBG' +に結合し てアミノ酸トランスポ一夕一 ATBQ' +の輸送機能を阻害する物質、 アミノ酸トラン スポーター ATBQ +の発現を抑制する物質などが挙げられるが、 好ましいのはアミ ノ酸トランスポーター ATBQ' +に結合してアミノ酸トランスポーター ATBQ' +の輸送 機能を阻害する物質である。
本発明におけるアミノ酸トランスポーター ATBQ' +阻害物質としては、 例えば、 合成低分子化合物、 抗体、 タンパク質、 ペプチド、 天然化合物等が挙げられるが、 具体的には、 N0S阻害剤、 フエニルダリシン、 カルニチン（Carni t ine)、 D -ァミノ 酸、 もしくはアミノ酸を基礎とするプロドラッグ (Amino acid-based prodrugs) , あるいは、 これらの誘導体等を例示することができる。
本発明における N0S阻害剤としては、 好ましくは中性または塩基性 L -ひ-アミノ 酸構造を基本構造とする N0S阻害剤であり、 より好ましくは L-アルギニン（arginin e)、 L-リジン（lysin)、 L -シトルリン（ci trul l ine)、 または L -オル二シン（ornithi ne)を基本構造とする N0S阻害剤であり、 さらに好ましくはアルギニン、 リジン、 シトルリン、 オル二シン、 L- NNA (NG- ni tro- L- arginine)、 L- NAME (NG- ni t ro-L-argi nine methyl ester)、 L-NMMHA (NG-monomethyl-L-homoarginine) , L -匪 A (NG, If - d imethyl-L-arginine)、 L-NMEA (NG-monoethyl-L-arginine)、 L-NMMA (NG-monomethy 1-L-arginine) > L-NABE (NG-L- ni tro- L-argi nine benzyl ester)、 L- NIL (L- N6- (1- i iiiinoe thy 1) -lysine)、 L-TC (L-thioci trul l ine)、 L-MTC (S-methyl-L-thioci trull i ne)、 L-NIO (L-N5- (1-iminoet yl) -orni thine) GGA ( a-guanidinoglutaric acid) , またはカナバニン（canavanine)である。 また、 本発明のフエニルダリシンもしくはその誘導体としては、 通常、 フエ二 ルグリシン構造を有するドラッグもしくはプロドラッグであり、 好ましくはフリ 一の Q!アミノ酸およびひ力ルポキシル基を有するフエニルダリシン誘導体 （生理 的な pHにおいて酸性化合物ではない） 、 もしくは 3-または 4-カルポキシフエニル グリシンを含む 3-または 4-力ルポキシルエステルプロドラッグであり、 さらに好 ましくは L-2-フエニルダリシンである。
また、 本発明のカルニチンもしくはその誘導体としては、 好ましくはカルニチ ンもしくはそのァシルエステルであり、 より好ましくは、 カルニチン、 ァセチル カルニチン、 プロピオニルカルニチンである。
また、 本発明における D -アミノ酸（amino acids)としては、 好ましくは D-ァラニ ン（alanine)、 D-セリン（serine)、 D -メチォニン（methionine)、 D -口イシン（leuci ne) 、 D-トリプトファン（tryptophan)、 D -スレオニン（threonine)、 D-ヒスチジン
(hist idine)、 D-フエ二ルァラニン（phenylalanine)、 D_グルタミン（glutamine)、 またはこれらの誘導体であり、 より好ましくは D-ァラニン、 D-セリン、 D-メチォ ニン、 D -口イシン、 D -トリブトファン、 またはこれらの誘導体であり、 さらに好 ましくは D-ァラニン、 D -セリン、 D -メチォニン、 D -ロイシン、 D -卜リブトフアン である。
また、 本発明におけるアミノ酸を基礎とするプロドラッグとしては、 好ましく はアミノ酸官能基 （D -または L-アミノ酸を含む） を有するプロドラッグであり、 より好ましくはァスパラギン酸もしくはグルタミン酸を有する β -カルポキシルェ ステルプロドラッグもしくはァ-力ルポキシルエステルプロドラッグ、 または、 中 性もしくは塩基性アミノ酸を有するひ -カルボキシルエステルプロドラッグである < 本発明において、 上記化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる, 標識としては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識等を挙げることができる。
また本発明の好ましい態様におけるアミノ酸トランスポーター ATBG +阻害物質 としては、 アミノ酸トランスポーター ΑΤΒ。' +タンパク質に対する抗体である。 該 3061
- 8 - 抗体は、 通常、 ATBG' +タンパク質を認識して結合する。
本発明の細胞増殖抑制剤に含有される抗体はアミノ酸トランスポーター ATBG' + と結合する限り特に制限はない。 好ましくはアミノ酸トランスポーター ATBQ' +と 特異的に結合する抗体であり、 さらに好ましくは細胞傷害活性を有する抗体であ る。
本発明における細胞傷害活性とは、 例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害 (ant i body-dependent cel l-mediated cytotoxici ty： ADCC)活性、 補体依存性細胞傷害
(complement-dependent cytotoxic i ty： CDC) 活性などを挙げることができる。 本発明において、 CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味し、 ADCC活性とは 標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、 その Fc部分に Fc r受容体保 有細胞 （免疫細胞等） が Fc r受容体を介して結合し、 標的細胞に傷害を与える活 性を意味する。
抗アミノ酸トランスポーター ATBQ' +抗体が ADCC活性を有するか否か、 又は CDC活 性を有するか否かは公知の方法により測定することができる （例えば、 Current p rotocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Edi tor, John E, Col igan et al. , John Wi ley & Sons, Inc. , (1993)等) 。
具体的には、 まず、 エフェクター細胞、 補体溶液、 標的細胞の調製を行う。
( 1 ) エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、 RPMI 1640培地 (GIBC0社製）中で脾臓細胞を 分離する。 10%ゥシ胎児血清 (FBS、 HyClone社製）を含む同培地で洗浄後、 細胞濃 度を 5 x lOVmlに調製し、 エフェクター細胞を調製する。
( 2 ) 補体溶液の調製
Baby Rabbi t Complement (CEDARLA E社製）を 10% FBS含有培地（GIBC0社製）にて 1 0倍希釈し、 補体溶液を調製する。
( 3 ) 標的細胞の調製
塍臓癌細胞株 （AsPC_l、 Capan- 2等） を 0. 2mCiの51 Cr- sodium chromate (Amersham Pharmacia Biotech社製）とともに、 10% FBS含有 DMEM培地中で 37°Cにて 1時間培 養することにより放射性標識する。 放射性標識後、 細胞を 10% FBS含有 RPMI 1640 培地にて 3回洗浄し、 細胞濃度を 2 x i05/mlに調製して、 標的細胞を調製する。
次いで、 ADCC活性、 又は CDC活性の測定を行う。 ADCC活性の測定の場合は、 96ゥ エル ϋ底プレート（Beckton Dickinson社製）に、 標的細胞と、 抗アミノ酸トランス ポー夕一 ATBQ' +抗体を 50 ずつ加え、 氷上にて 15分間反応させる。 その後、 エフ ェクタ一細胞 100 i lを加え、 炭酸ガスインキュベータ一内で 4時間培養する。 抗体 の終濃度は 0または 10 g/mlとする。 培養後、 の上清を回収し、 ガンマカウ ンター（C0BRAI IAUT0- GMMA、 MODEL D5005、 Packard Instrument Co即 any社製）で放 射活性を測定する。 細胞傷害活性 (¾)は (A- C) I (B-C) X 100により求めることができ る。 Aは各試料における放射活性（cpm)、 Bは 1 % NP- 40 (半井社製）を加えた試料に おける放射活性 (cpm)、 Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性 (cpm)を示す。
一方、 CDC活性の測定の場合は、 96ゥエル平底プレート（Becton Dickinson社製） に、 標的細胞と、 抗アミノ酸トランスポーター ATBQ' +抗体を 50 lずつ加え、 氷上 にて 15分間反応させる。 その後、 補体溶液 100 < 1を加え、 炭酸ガスインキュべ一 夕一内で 4時間培養する。 抗体の終濃度は 0または 3 g/mlとする。 培養後、 100 x l の上清を回収し、 ガンマカウンターで放射活性を測定する。 細胞傷害活性は ADCC 活性の測定と同様にして求めることができる。
本発明の細胞増殖抑制剤の有効成分として使用される抗体は、 抗原 （アミノ酸 トランスポーター ATBG +タンパク質またはその部分ペプチド） と結合する限り特 に制限はなく、 マウス抗体、 ラット抗体、 ゥサギ抗体、 ヒッジ抗体、 キメラ抗体、 ヒト型化抗体、 ヒト抗体等を適宜用いることができる。 抗体は、 ポリクロ一ナル 抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、 均質な抗体を安定に生産 できる点でモノクローナル抗体が好ましい。 ポリクローナル抗体およびモノク口 ーナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、 基本的には公知技術を使用 2003/013061
- 1 o - し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 所望の抗原や所望の抗原を発現す る細胞を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常の スクリーニング法により、 モノクローナルな抗体産生細胞 ひ、イブリドーマ） を スクリーニングすることによって作製できる。
抗原の調製は公知の方法、 例えばバキュロウィルスを用いた方法 （W098/46777 など） 等に準じて行うことができる。
Λイブリドーマの作製は、 たとえば、 ミルスティンらの方法 （Kohler. G. and
Mi l s te in, C. , Methods Enzymol. (1981) 73 : 3-46) 等に準じて行うことができ る。 抗原の免疫原性が低い場合には、 アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子 と結合させ、 免疫を行えばよい。
また、 抗体遺伝子をハイプリドーマからクローニングし、 適当なベクターに組 み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組 換え型抗体を用いることができる （例えば、 Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larr ick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publ i shed in the Uni ted King dom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照) 。 具体的には、 ハイプリドーマの inRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 （V領域） の cDNAを合成する。 目的と する抗体の V領域をコードする DNAが得られれば、 これを所望の抗体定常領域 （C領 域） をコードする DNAと連結し、 これを発現ベクターへ組み込む。 または、 抗体の V領域をコードする DNAを、 抗体 C領域の DNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよ レ^ 発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモーターの制御のもとで発現す るよう発現ベクターに組み込む。 次に、 この発現ベクターにより宿主細胞を形質 転換し、 抗体を発現させることができる。
本発明では、 ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的 に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Chimeric) 抗体、 ヒト型化 （H umanized) 抗体などを使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用いて製 造することができる。 キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物、 例えば、 マウス抗体 の重鎖、 軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、 軽鎖の定常領域からなる抗体であり、 マウス抗体の可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと 連結し、 これを発現べク夕一に組み込んで宿主に導入し産生させることにより得 ることができる。
ヒ卜型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 ヒト以外の哺乳動 物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域 (CDR; complementari ty determining region) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝 子組換え手法も知られている。 具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレー ムワーク領域 （f ramework region； FR) を連結するように設計した MA配 を、 末 端部にオーバ一ラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチ ドから PCR法により合成する。 得られた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DNAと 連結し、 次いで発現べクタ一に組み込んで、 これを宿主に導入し産生させること により得られる （欧州特許出願公開番号 EP 239400, 国際特許出願公開番号 W0 96/ 02576参照） 。 CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好な 抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体の相補 性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームヮ ーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
また、 ヒト抗体の取得方法も知られている。 例えば、 ヒトリンパ球を//? vitro で所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、 感作リンパ球をヒトミ エロ一マ細胞、 例えば U266と融合させ、 抗原への結合活性を有する所望のヒト抗 体を得ることもできる （特公平卜 59878参照） 。 また、 ヒト抗体遺伝子の全てのレ パートリ一を有するトランスジエニック動物を所望の抗原で免疫することで所望 のヒト抗体を取得することができる （国際特許出願公開番号 W0 93/12227, W0 92/ 03918, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/34096, W0 96/33735参照） 。 さらに、 ヒト抗体ライブラリーを用いて、 パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知 られている。 例えば、 ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体 （scFv) としてファージ ディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、 抗原に結合するファージを選 択することができる。 選択されたファージの遺伝子を解析すれば、 抗原に結合す るヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。 抗原に結合 する scFvの DNA配列が明らかになれば、 当該配列を適当な発現ベクターを作製し、 ヒト抗体を取得することができる。 これらの方法は既に衆知であり、 TO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, W0 95/01438, W0 95/1 5388を参考にすることができる。
抗体遺伝子を一旦単離し、 適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、 適 当な宿主と発現べクタ一の組み合わせを使用することができる。 真核細胞を宿主 として使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用いることができる。 動 物細胞としては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば、 CH0, COS, ミエローマ、 BHK (baby h ams ter kidney) , HeLa, Vero, (2) 両生類細胞、 例えば、 アフリカッメガエル卵 母細胞、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば、 s f 9, sf 21, Tn5などが知られている。 植物細胞としては、 ニコティアナ cotiani) 属、 例えばニコティアナ 'タバカ ム Wcotiana tabacum) 由来の細胞が知られており、 これをカルス培養すればよ レ^ 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス < accharowces、 属、 例 えばサッカロミセス ·セレビシェ Saccharomyces serevisiae) 、 糸状菌、 例え ば、 ァスペルギルス Uispergillus 属、 例えばアスペスギルス ·ニガ一 Uisperg illus niger) などが知られている。 原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる 産生系がある。 細菌細胞としては、 大腸菌 . coli) 、 枯草菌が知られている。 これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、 形質転換され た細胞を^ で培養することにより抗体が得られる。
また、 本発明の抗体は、 抗体変異体であってもよい。 本発明において、 抗体変 異体とは、 1またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、 抗体のアミノ酸配列バリ アントを指す。 どのように改変されたアミノ酸バリアントであれ、 元となった抗 体と同じ結合特異性を有すれば、 本発明における 「抗体変異体」 に含まれる。 こ のような変異体は、 抗体の重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインのァミノ酸配列と少 なくとも 75%、 より好ましくは少なくとも 80%、 さらに好ましくは少なくとも 8 5 さらにより好ましくは少なくとも 90%、 そして、 最も好ましくは少なくとも 95%のァミノ酸配列相同性または類似性を有するァミノ酸配列と 100 %よりも少な い配列相同性、 または類似性を有する。
また、 本発明の上記抗体はアミノ酸トランスポーター ATBQ' +タンパク質と結合 し、 該タンパク質の機能を阻害するかぎり、 抗体の断片またはその修飾物であつ てもよい。 例えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F (ab' ) 2、 Fv、 または H鎖もしくは L鎖の Fvを適当なリンカーで連結させたシングルチエイン Fv (scFv)が挙げられる。 具体的には、 これら Fab、 F (ab' ) 2、 Fv、 または H鎖もしくは L鎖の Fvを適当なリン 力一で連結させたシングルチェィン Fv (scFv)、 をコ一ドする遺伝子を発現べク夕 一に導入後、 適当な宿主細胞で発現させる（例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immun ol. (1994) 152, 2968-2976, Bet ter, M. & Horwi tz, A. H.， Methods in Enzymo logy (1989) 178, 476-496, Academic Press Inc.、 Plueckt un, A. & Skerra, A. , Methods in Enzymo logy (1989) 178, 476-496, Academic Press Inc.、 Lamoy i, E. , Methods in Enzymo logy (1989) 121, 663-669, Bird, R. E. et al. , TIB TECH (1991) 9， 132-137参照）。 scFvは、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結する ことにより得られる。 この scFvにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、 リンカ一、 好 ましくはペプチドリンカ一を介して連結される（Huston, J. S. et al. , Pro Na t l. Acad. Sc i. U. S. A (1988) 85, 5879-5883)。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、 本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V領域を連結するペプチドリンカーとしては、 例えば 12- 19残基からなる任意の一 本鎖ペプチドが用いられる。 scFvをコードする DNAは、 前記抗体の H鎖または H鎖 V 領域をコードする DNA、 および L鎖または L鎖 V領域をコードする MAのうち、 それら の配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を铸型とし、 その両端を規定するプライマ一対を用いて PCR法により増幅し、 次いで、 さらにべ プチドリンカ一部分をコードする DNA、 およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結され るように規定するプライマ一対を組み合わせて増幅することにより得られる。 ま た、 一旦 scFvをコードする DNAが作製されると、 それらを含有する発現べクタ一、 および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ることができ， また、 その宿主を用いることにより、 常法に従って scFvを得ることができる。 こ れらの抗体断片は、 前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、 宿主により産生 させることができる。 抗体の修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の 各種分子と結合した抗体を使用することもできる。 このような抗体修飾物は、 得 られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。 なお、 抗体の 修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。 本発明における 「抗体」 に はこれらの抗体も包含される。
さらに、 本発明で使用される抗体は二重特異性抗体 （bispeci i ic ant ibody) で あってもよい。 二重特異性抗体はアミノ酸トランスポー夕一 ATBQ' +分子上の異な るェピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特性抗体であってもよいし、 一方の抗原結合部位がアミノ酸トランスポーター ATBQ' +を認識し、 他方の抗原結 合部位が放射性物質、 化学療法剤、 細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質を認識 してもよい。 この場合、 アミノ酸トランスポーター ATBG' +を発現している細胞に 直接細胞傷害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を与え、 腫瘍細胞の増殖 を抑制することが可能である。 二重特異性抗体は 2種類の抗体の HL対を結合させて 作製することもできるし、 異なるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ を融合させて、 二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、 得ることもできる。 さら に、 遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように発現、 産生された抗体は、 通常のタンパク質の精製で使用されて いる公知の方法により精製することができる。 例えば、 プロテイン Aカラムなどの ァフィ二ティ一カラム、 クロマトグラフィーカラム、 フィルタ一、 限外濾過、 塩 析、 透析等を適宜選択、 組み合わせることにより、 抗体を分離、 精製することが できる (Ant ibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
抗体の抗原結合活性（Ant ibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lan e, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用すること ができる。 例えば、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
特定の分子が本発明のアミノ酸トランスポーター ATBQ' +に結合するか否かは、 当業者においては公知の方法により測定することができる。 公知の方法としては、 例えば、 免疫沈降法、 ウェストウェスタンブロッテイング法、 ELISA (酵素結合免 疫吸着検定法） 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） 、 蛍光免疫法、 表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサ一を用いた方法、 などが挙げら れる。
このようなアミノ酸トランスポーター ATBQ +への結合活性を指標に、 本発明の 細胞増殖抑制剤の候補化合物をスクリ一二ングすることが可能である。 具体的に は、 アミノ酸トランスポ一ター ATB°' +に被検試料を接触させ、 アミノ酸トランス ポーター ATBG' +と被検試料との結合を検出し、 アミノ酸トランスポーター ATBG' + に結合する化合物を選択すればよい。 被検試料としては特に制限はなく、 例えば、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 精製もしくは粗精製タンパク質 （抗体を含む） 、 ペプチド、 非ペプチド性化合物、 合成低分子化合物、 天然化合物が挙げられる。 アミノ酸トランスポーターは、 例 えば、 精製したタンパク質として、 担体に結合させた形態として、 他のタンパク 質との融合タンパク質として、 細胞膜上に発現させた形態として、 膜画分として 被検試料に接触させることができる。 このようにして得られたアミノ酸トランス ポーター ATBG +に結合する化合物から、 本発明の細胞増殖抑制剤の有力な候補を 選択するために、 これら化合物がアミノ酸卜ランスポー夕一 ATBQ' +の輸送機能を 阻害するか否かを検出することが有用である。 特定の分子がアミノ酸トランスポ 一夕一の輸送機能を阻害しているか否かは、'公知の方法、 例えば、 放射性物質 （" じなど） 、 蛍光物質などでアミノ酸などの基質を標識し、 該基質がアミノ酸トラ ンスポーター発現細胞に取り込まれた量を測定すること等により判断することが できる。
本発明の細胞増殖抑制剤の有効成分としては、 アミノ酸トランスポーター ATBG' +の発現を抑制する物質を使用することもできる。 このような物質としては、 例え ば、 アミノ酸トランスポーター ATBQ' +遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレ ォチドなどが挙げられる。 7ンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 例えば、 アミノ酸トランスポ一タ一 ATB ΰ' +をコードする DNAまたは mRNAのいずれかの箇所に ハイプリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。 このアンチセ ンスオリゴヌクレオチドは、 好ましくはアミノ酸トランスポ一夕一の DNAまたは mR NA中の連続する少なくとも 15個以上のヌクレオチドに対するァンチセンスォリゴ ヌクレオチドである。 さらに好ましくは、 連続する少なくとも 15個以上のヌクレ ォチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 アンチ センスオリゴヌクレオチドとしては、 それらの誘導体や修飾体を使用することが でき、 例えば、 メチルホスホネート型やェチルホスホネート型のような低級アル キルホスホネート修飾体、 ホスホロチォェ一ト修飾体またはホスホロアミデート 修飾体等が挙げられる。
本発明の細胞増殖抑制剤の標的となる細胞としては特に制限はないが、 好まし くは大腸癌、 乳癌、 膝臓癌等の癌細胞であり、 特に好ましくは大腸癌細胞または 乳癌細胞である。
本発明の細胞増殖抑制剤は、 細胞増殖に起因する疾患、 特に大腸癌あるいは乳 癌等の癌の治療、 予防を目的として使用される。
アミノ酸トランスポ一夕一 ATBQ' +は上述のように、 血管側の細胞膜では発現し ていないことから、 アミノ酸トランスポ一夕一 ATBQ' +阻害物質 （例えば、 ァミノ 酸トランスポーター ATBQ' +に結合する抗体） は、 正常組織のアミノ酸トランスポ 一夕一 ATBG' +機能を阻害することなく、 例えば、 大腸癌等の癌細胞に対して、 特 異的に作用するものと考えられる。 また、 大腸癌等の癌細胞におけるアミノ酸卜 ランスポーター ATBG' +の異常は、 生理的機能から推察すると、 癌細胞増殖に伴う タンパク質合成に必要なアミノ酸の取り込み亢進に関与しているものと考えられ る。 従って、 本発明の細胞増殖抑制剤は、 アミノ酸トランスポーター ATBQ' +阻害 物質による栄養遮断を薬効とする新規抗癌剤となるものと考えられる。 また、 本 発明の好ましい態様における、 アミノ酸トランスポー夕一 ATBQ' +に結合する抗体 を有効成分とする細胞増殖抑制剤は、 該抗体が ATBQ: +に特異的に結合し腫瘍細胞 に対して傷害性を持つ細胞を活性化させる作用 （抗体依存性細胞傷害活性； ADCC 活性） 、 あるいは補体タンパク質による細胞破壊作用 （補体依存性細胞傷害活 性； CDC活性） による殺作用を薬効とする新規抗癌剤となるものと期待される。 本発明の薬剤の製剤化にあたっては、 常法に従い、 必要に応じて薬学的に許容 される担体を添加することができる。 例えば界面活性剤、 賦形剤、 着色料、 着香 料、 保存料、 安定剤、 緩衝剤、 懸濁剤、 等張化剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 流 動性促進剤、 矯味剤等が挙げられるが、 これらに制限されず、 その他常用の担体 を適宜使用することができる。 具体的には、 軽質無水ケィ酸、 乳糖、 結晶セル口 ース、 マンニトール、 デンプン、 カルメロースカルシウム、 カルメロースナトリ ゥム、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース、 ポリビニルァセ夕一ルジェチルァミノアセテート、 ポリビニルピロリドン、 ゼラ チン、 中鎖脂肪酸トリダリセライド、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、 白糖、 カルボキシメチルセルロース、 コーンスターチ、 無機塩類等を挙げることができ る。
上記薬剤の剤型の種類としては、 例えば経口剤として錠剤、 粉末剤、 丸剤、 散 剤、 顆粒剤、 細粒剤、 軟 '硬カプセル剤、 フィルムコーティング剤、 ペレット剤、 舌下剤、 ペースト剤等、 非経口剤として注射剤、 坐剤、 経皮剤、 軟膏剤、 硬膏剤、 外用液剤等が挙げられ、 当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の 剤型を選ぶことができる。
本発明の細胞増殖抑制剤は、 経口、 非経口投与のいずれでも可能であるが、 好 ましくは非経口投与であり、 具体的には、 注射剤型、 経鼻投与剤型、 経肺投与剤 型、 経皮投与型などが挙げられる。 注射剤型の例としては、 例えば、 静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射などにより全身または局部的に投与すること ができる。 また、 患者の年齢、 症状により適宜投与方法を選択することができる。 投与量としては、 例えば、 一回につき体重 lkgあたり 0. OOOlmgから lOOOmgの範囲で 選ぶことが可能である。 あるいは、 例えば、 患者あたり 0. 001〜100000mg/bodyの 範囲で投与量を選ぶことができる。 しかしながら、 本発明の治療薬はこれらの投 与量に制限されるものではない。 また、 発明の治療薬は、 常法に従って製剤化す ること力 sでき (例えば、 Remington' s Pharmaceut ical Sc ience, l ates t ed i t ion, Mark Publ i shing Co即 any, Eas tern, U. S. A) 、 医薬的に許容される担体や添加物 を供に含むものであってもよい。 図面の簡単な説明
図 1は、 各種癌細胞株におけるアミノ酸トランスポーター ATBQ' +の発現状態を 示す写真である。 写真左は、 D1プライマーと D2プライマーの組み合わせで PCRを行 つた場合、 写真右は、 D5プライマーと D6プライマーの組みあわせで PCRを行った場 合の写真である。 ゥエル番号と細胞株の対応は以下のようになつている （表 1 ) TCP 1 A549 Lung TCP 14 DU-145 Prostate TCP 27 BxPC-3 Pancreas
TCP 2 NCI-H460 Lung TCP 15 PC - 3 Prostate TCP 28 Capan-1 Pancreas
TCP 3 NCI-H23 Lung TCP 16 LNCap.FGC Prostate TCP 29 MIA PaCa-2 Pancreas
TCP 4 NCI-H522 Lung TCP 17 22Rv1 Prostate TCP 30 PANG- 1 Pancreas
TCP 5 HT-29 Colon TCP 18 BALL-1 Leukemia TCP 31 AsPC-1 Pancreas
TCP 6 LS 174T Colon TCP 19 P39/TSU Leukemia
TCP 7 COLO 205 Colon TCP 20 KU812 Leukemia
TCP 8 LoVo Colon TCP 21 CGRF-CE Leukemia
TCP 9 SW620 Colon TCP 22 JOK-1 Leukemia
TC 10 MCF7 Breast TCP 23 Daudi Lymphoma
TCP 1 1 DA- B-231 Breast TCP 24 EB-3 Lymphoma
TCP 12 ZR-75-1 Breast TCP 25 Ramos Lymphoma
TCP 13 BT-474 Breast TCP 26 P3HR-1 Lymphoma
尚、 TCPlはゥエル 1に、 TCP2はゥエル 2にそれぞれ対応する。 Nは铸型 DNAを加え なかった場合、 Gはヒト染色体 DNAを加えた場合をそれぞれ表わす。
図 2は、 L- 2-フエニルダリシンの各種癌細胞株に対する細胞増殖抑制効果を示 す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。
〔実施例 1〕 ヒト ATBQ' + RT-PCR解析
( 1 - 1 ) 全 NAの調製
次のヒト癌細胞株より、 IS0GEN (二ツボンジ一ン社） 、 あるいは TRIzol (Invi t rogen社） を用いて、 それぞれのメーカー推奨の標準的な方法に従い total RNAを 調製した。
•肺癌細胞株： A549、 NCト画、 NCI-H23 NCI-H522
•大腸癌： HT- 29、 LS 174T、 COLO 205、 LoVo、 SW620
·乳癌細胞株： MCF7、 MDA-MB - 231、 ZR-75-L BT-474
•前立腺癌細胞株： DU-145, PC-3 LNCap. FGC、 22Rvl •白血病細胞株： BALL- 1、 P39/TSU, K觀、 CCRF- CEM、 J0K-1
• リンフォーマ細胞株： Daudi、 EB- 3、 Ramos, P3HR-1
•膝臓癌細胞株： BxPC-3, Capan-K MIA PaCa-2, PANC-K AsPC-1 (1 -2) RT- PCR解析
上記の全 RNAより、 SUPERSCRIPT™ First-Strand Synthesis System for RT - PCR (Invitrogen社） を用い、 メーカー推奨の標準的な方法に従い、 1本鎖 cDNAを合成 した。 逆転写反応のプライマーとしてはオリゴ dT (12〜18mer) を用いた。 この cD NAの一部を铸型とし、 ヒト ATBG'+遺伝子に特異的なプライマーを用いて、 以下の 条件により PCR解析を行った。
<反応液組成 >
• TaKaRa ExTa (TaKaRa社) 0.3 L
• Ta Start™ Antibody (CLONTECH社） 0.
· ΙΟχ ExTaqバッファー （TaKaRa社) 3j L
• 2.5niM dNTPs (TaKaRa社) 2.4 iL
• 20 xMプライマー 各 0.6^L
'铸型 cDNA 3 L
Z全量 30 ぐ反応条件 > .
• 94°C、 2分→ (94。C、 30秒→68°C、 2分） x 35サイクル→72°C、 5分 ぐプライマー >
· D1： 5'- cag ttt cag ttt gga gga ttc ttc -3' (配列番号： 1)
• D2： 5'- tta etc cag tct cat tea ttc cac -3' (配列番号： 2) •D5： 5'- ctg ctt ggt ttt gtt tct cct tgg -3' (配列番号： 3) • D6： 5' - aat cat ac cca gcc taa age aac -3' (配歹 'J番号： 4)
PCRの結果を図 1に示した。 大腸癌細胞 5株 （レーン 5- 9) のうち、 2株 （HT- 29、 LS174T) で強い発現が認められた。 また、 Lovo細胞でも中程度の発現が認められ た。 乳癌細胞 4株 （レーン 10- 13) では、 全ての細胞で ΑΤΒβ'+の発現が認められ、 そ のうち MCF7と ΒΤ- 474で強い発現が認められた。 滕臓癌細胞 5株 （レーン 27-31) の うち、 2株 (BxPC - 3、 Capan-1) で強い発現が認められた。 癌は heterogeneousであ るにもかかわらず、 図 1のように大腸癌、 乳癌、 膝臓癌では 40%以上の細胞株に A TBD'+が高発現しており、 臨床でも同様に 40%以上の大腸癌、 乳癌、 膝臓癌患者の 腫瘍部位に ATBG' +が高発現している可能性が示唆された。
〔実施例 2〕 L- 2-Pheiiylglyciiieのヒト大腸癌株 SW60、 HT29および乳癌株 MCF - 7 に対する細胞増殖抑制作用
L-2-フエニルダリシン (phenyl glycine)は強い ATBQ' +活性を示すィヌ小腸刷子縁 膜で類似の L-ァラニン（alanine)および L-フエ二ルァラニン（phenylalanine)に比 ベ強いァフィ二ティ一を示すことから、 ATB に特異性の強い競合的阻害剤である と考えられる（Hatanaka et al. 2002, J. Pharm. Pharmacol. )。 L- 2-フエニルダ リシンを 0%FBSを含む培地で溶解し、 20mM L- 2-フエニルダリシン溶液を調製した。 培地としては SW60、 HT29には IMDMを、 MCF- 7には RPMIを用いた。 また、 この溶液を 培地で希釈して 2、 0.2、 0.02ならびに 0.002mM L - 2 -フエニルダリシン溶液を調製 した。
ヒト大腸癌株 SW60、 HT29および乳癌株 MCF-7を培地でそれぞれ 4X106、 1.6X106、 1.6X106細胞/ mLに調製した。 この懸濁液 25 L/well (それぞれ 1X105、 4X104、 4 X 細胞) にあらかじめ 12% FBSを含む培地 25 xL/wellを添加しておいた 96well プレートに蒔き、 50 Lの L- 2- Phenylglycine溶液を添加した。 5% C02' 一夕一で培養し、 培養 4日目に生細胞数を MTS assayで定量化した。
図 2に細胞増殖試験結果を示した。 SW60においては L- 2- Phenylglycineによる細 胞増殖抑制が認められなかった。 一方、 HT29および MCF- 7においては濃度依存的な 細胞増殖抑制が認められた。 HT29における細胞増殖抑制は 10 xM L-2-Phenylglyci ne存在下で約 10%を示し、 平衡に達した。 MCF-7における細胞増殖抑制は ImM L-2-P henylglycine存在下で約 10%であった。
RT-PCRの結果から、 MCF- 7および HT29では ΑΤΒ +の発現が高く、 SW60においては A ΤΒ +は検出限界以下であった （図 1 ) 。 以上より、 L-2-ファニルダリシンによる 細胞増殖抑制は、 非特異的細胞毒性ではなく ATBQ' +の機能阻害によると考えられた c 産業上の利用の可能性
本発明により、 アミノ酸トランスポーター ATBQ' +の活性を阻害する物質は細胞 増殖を抑制する効果があることが見出された。 これによりアミノ酸トランスポー ター ATBG' +を標的として、 細胞増殖抑制剤を開発することが可能となった。 この ような細胞増殖抑制剤は、 癌 (例えば、 大腸癌等） の増殖の抑制に利用されるこ とが大いに期待される。

Claims

請求の範囲
I. アミノ酸トランスポーター ATBG'+阻害物質を有効成分とする細胞増殖抑制 剤。
2. アミノ酸トランスポ一ターが Na+および 駆動型アミノ酸トランスポーター である、 請求項 1に記載の細胞増殖抑制剤。
3. アミノ酸トランスポー夕一が ATBG'+である、 請求項 1に記載の細胞増殖抑 制剤。
4. アミノ酸トランスポーター ATBQ +阻害物質が、 アミノ酸トランスポー夕一 A TBQ' +に結合することによりアミノ酸トランスポ一夕一 ATBQ +の輸送機能を阻 害する物質である、 請求項 1に記載の細胞増殖抑制剤。
5. アミノ酸トランスポ一夕一 ATBQ +阻害物質が、 L -アミノ酸、 N0S阻害剤、 フ ェニルグリシン誘導体、 カルチニン、 D-アミノ酸、 もしくはアミノ酸を基礎 とするプロドラッグからなる群、 あるいは、 これらの誘導体化合物群より選 択される、 請求項 1に記載の細胞増殖抑制剤。
6. アミノ酸トランスポーター ATBD +阻害物質がアミノ酸トランスポーター ATB に結合する抗体である、 請求項 1に記載の細胞増殖抑制剤。
7. アミノ酸トランスポーター ATBfl +に結合する抗体が、 細胞傷害活性を有す る抗体である、 請求項 6に記載の細胞増殖抑制剤。
8. 細胞傷害活性が抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性 （ADCC活性） である、 請求項 7に記載の細胞増殖抑制剤。
9. 補体依存性細胞傷害活性 （CDC活性） を有する抗体である、 請求項 7に記載 の細胞増殖抑制剤。
10. アミノ酸トランスポーター ATB°'+阻害物質がアミノ酸トランスポーター A TBQ'+の発現を抑制する物質である、 請求項 1に記載の細胞増殖抑制剤。
I I . 癌細胞の増殖を抑制する、 請求項 1 ~ 10のいずれかに記載の細胞増殖 抑制剤。
癌細胞が大腸癌細胞、 滕臓癌細胞または乳癌細胞である、 請求項 1 1に 記載の細胞増殖抑制剤。
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