WO2004029256A2 - Vector para la producción de plantas angiospermas transplastómicas - Google Patents

Vector para la producción de plantas angiospermas transplastómicas Download PDF

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Eduardo Aguiar Cabeza
Annery del Carmen GONZÁLEZ QUINTERO
Osmany RAMOS GONZÁLEZ
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Definitions

  • This invention relates to the branch of Biotechnology and more specifically to Plant Genetic Engineering.
  • useful DNA constructs are provided to introduce high efficiency and express foreign genes in plastids of Angiosperm plants and demonstrate their usefulness in obtaining high efficiency transplastomic plants that express heterologous proteins, in particular vaccine antigens and proteins.
  • Plant genetic engineering is a technology that has proven very productive for basic research and commercial production of new biotechnological products (see: Hammond J. Curr. Top. Microbiol. Immunol 1999, 240: 1-19; Simoens C and Van Montagu M. Reproduction Update 1995, 1: 523-542).
  • heterologous genes in plastids has the following advantages over their nuclear counterpart: 1) a level of transgene expression 10 to 50 times higher than in the nucleus given the high number of copies of each genome per plastidium; 2) the insertion of the new genes can be site specific by homologous recombination avoiding the effects of position, silencing and other phenomena that influence the expression of the genes introduced to the cell nucleus; 3) gene expression in operons is possible, which is very desirable when it comes to engineering the metabolic pathways or altering characters that are multigenic; 4) the heritability of the genetic information is maternal, so it is avoided that through the pollen the new introduced characters are dispersed in the environment, thus eliminating possible damages to the environment. Additionally, the expression of genes in plastids offers the possibility of accumulating heterologous proteins there that in that microenvironment could have greater stability, or from which they could be more easily purified.
  • the region of the plastid genome that is most universally conserved in terms of structure and nucleotide sequence between Angiosperm plants is that of the operons that are transcribed in opposite directions atpB and rbcL.
  • these genes contain DNA segments greater than 1500 base pairs (bp) with homologies greater than 85% between plastids of plants belonging to different classes (dicotyledonous or monocotyledonous) and more than 91% nucleotide homology when analyzing plants of the same class (see Table 1).
  • the intergenic region between these two operons has a very low nucleotide level homology (less than 50%) between the plastids of dicotyledonous and monocotyledonous plants.
  • Table 1 Homology at the nucleotide level between the rbcL and atpB genes of plants of different species and classes.
  • the major subunit of the ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase-oxygenase (Rubisco) is encoded by the plastics gene rbcL.
  • rbcL The major subunit of the ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase-oxygenase (Rubisco) is encoded by the plastics gene rbcL.
  • rbcS nuclear gene rbcS
  • the Prrn promoter is constitutive, while the translational transcription of the RNAs produced by the PsbA promoter is induced by light and depends on its 5 'non-translatable region.
  • the deletion of the region 5 'non-translatable psbA gene makes the expression of its mRNA independent of light, however its translation is affected (Staub JM and Maliga P. Plant J. 1994, 6: 547-553; Eibi C; Zou Z ; Beck A; et al. Plant J. 1999, 19: 333-345).
  • promoters have sequences -35 and -10 homologous to the consensus described for bacterial promoters and are transcribed dependent on a polymerase encoded by the plastid genome (PEP) (Hess W. and Borner T. Int. Rev. Cytol. 1999, 190 : 1-59).
  • PEP plastid genome
  • kanamycin Daniell H. Methods in Molecular Biology 1997, 62: 463-489
  • spectinomycin Svab Z; Hajdukiewicz P; Maliga P. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1990, 87: 8526-8530; Svab Z. and Maliga P. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90: 913 -917
  • the gene that confers resistance to the selection compound is cloned in the transformation vector under appropriate signals for its correct expression in the plastids.
  • the vector for the stable transformation and expression of heterologous genes in plastids of Angiosperm plants proposed by the present invention contains a group of its own characteristics that distinguish it: 1) a transposon is not used to insert DNA fragments into the plastid genome; 2) the atpB and rbcL edge regions belong to Angiosperm plants of different kinds forming an artificial intergenic region; 3) multiple cloning sites in the transcriptionally inactive artificial intergenic region, allow the insertion of one or more heterologous genes without affecting the correct transcription, mRNA processing and expression of the atpB and rbcL genes; 4) the design of our vector allows the expression of the introduced genes without the need for carrying promoter or terminator sequences, as long as the coding sequences for proteins are preceded by a ribosome binding site (this helps to reduce undesirable recombination events and to a saving of metabolic resources of plastids, allowing greater stability of the heterologous DNA fragment and an increase in the frequency of production of homoplasmic plants);
  • the design and extension of the atpB-rbcL region, with its artificial intergenic region forms the basis of the present object of the invention because it allows us to efficiently and stably insert genes and operons into the genome of the plastids of Angiosperm plants of any species , without causing any functional alteration.
  • the artificial intergenic region the challenge of being able to introduce a foreign gene into it, without affecting the interaction between rbcL and atpB promoters, and their natural transcription rates, had to be solved.
  • the rbcL border must comprise a DNA fragment carrying part of the gene and its entire non-transcribable 5'regulatory region.
  • This fragment includes: 1) the rbcL PEP (polymerase-encoded polymerase-dependent) promoter with the associated CDF sequences; 2) the 5 'non-translatable region of the rbcL gene and 3) the coding sequence for rbcL to the region corresponding to the N-terminal of the alpha-helix 8.
  • the rbcL edge in the vector object of this invention it will extend from position -291 of the nucleotide sequence that codes for this protein in tobacco, to position +1233 (Trp-411 in the amino acid sequence) from the translation start codon of this gene.
  • a DNA fragment that includes: 1) the adjacent rbcL promoter and the loop-like sequences close to the beginning of transcription that stabilize the transcripts produced by this promoter; 2) atpB promoters including its NEP promoter; 3) the 5 'non-translatable region of the atpB gene and 4) the coding sequence for atpB up to about 300 bp before the stop codon of this gene.
  • the atpB edge extends from position -654 of the nucleotide sequence encoding this protein in rice, to position +1211 from the translation start codon of this gen.
  • the rbcL promoter that contains the edge-atpB allows a gene of interest to be expressed with stability in the opposite direction to the transcription of atpB-atpE.
  • a genetic cassette containing one or more foreign genes could be cloned under a functional promoter in plastids, and in this way we would obtain their expression enhanced by transcription from two promoters in tandem.
  • the construction described above is the basis of the vector object of this invention, where it will also be introduced into the MCSl, in the 5'-3 'direction from the rbcL promoter of the border-atpB, a gene that codes for a marker that allows selection positive of the transformed cells, bordered by repeated DNA sequences that will facilitate by homologous recombination the elimination of the marker once the homoplasmic transplastomic plants are obtained, if this were desired.
  • Termination of transcription of the marker gene, or of any other gene that is inserted into the MCSl, will be given by a bacterial terminator that is placed adjacent to the 5 'end of the rbcL edge (preferably the bidirectional terminator rrnBTlT2 of the rrnB operon .coli (Brosius J; Dull TJ; Sleeter DD; Noller HFJ Mol. Biol. 1981, 148: 107-127) preventing transcriptional activity of the inserted fragment interferes with the normal functioning of the natural promoter of this edge.
  • Figure 1-B the general structure of the vector object of this invention is shown in Figure 1-B, where the gene, or genes, of interest can be cloned under the rbcL promoter of the edge-atpB forming a mono or polycistronic transcriptional unit (Figure 1-C), or under other functional promoters in plastids being able to obtain, for example, a polycistronic unit under two tandem promoters ( Figure 1-D), or two independent transcriptional units under different combinations of promoter regions ( Figures-E and Figure 1-F).
  • Figure 1-C mono or polycistronic transcriptional unit
  • Figure 1-D polycistronic unit under two tandem promoters
  • Figures-E and Figure 1-F two independent transcriptional units under different combinations of promoter regions
  • hygromycin As a selection marker, since although this antibiotic is extremely toxic to dicotyledonous plants such as tobacco, and therefore should be used sparingly, it is much more effective as a selective agent for obtaining monocot plants with genetically modified plastids. Therefore, the hgh gene coding for resistance to hygromycin-B in Klebsiella (Gritz L. and Davies J. Gene 1983, 25: 179-188), containing a suitable Shine-Dalgarno region, is cloned into the low MCSl the rbcL edge-atpB promoter ( Figure 1-B).
  • the marker gene was introduced bordered by two repeated DNA sequences that allow its elimination by homologous recombination ( Figure 1-B), once the transplastomic plants are obtained removes the selective agent from the culture medium.
  • the repeated sequences we use in our construction are from the region that codes for the p0 p0 slO protein (Dunn JJ and Studier FWJ Mol. Biol. 1983, 166: 477-535).
  • Our vectors have the particularity that by eliminating only the marker gene, the rest of the regulatory sequences of its operon remain unchanged ( Figures 1-C, 1-D, 1-E and 1-F); Thus, any gene transcriptionally fused to the marker gene will continue its expression unchanged, saving the resources of the vector.
  • This architecture is another of the quantities that distinguish the vector object of this invention from other systems described as vehicles for the genetic modification of plastids. It is obvious that other genes that confer resistance to antibiotics such as spectinomycin (Chinault AC; Blaskeley V. A; Roessler E; Willis DG; et al. Plasmid 1986, 15: 119-131), or sulfonamides (Guerineau F; Mullineaux P. Nucleic Acid Res 1989, 17: 4370), could also be used to facilitate the selection of transplastomic plants. In the same way, genes that confer resistance to herbicidal compounds such as glyphosate (Shah DM; Horsc RB; Klee HJ; Kishore GM; and others.
  • Figure 1 A, base structure for the construction of the vector object of the present invention showing the region containing sites for cloning (MCSl ) bounded by: the edge-atpB £ J
  • rbcLpr- promoter of the rbcL gene general structure of the vector object of the present invention (rbcLpr- promoter of the rbcL gene, atpBpr- promoter of the aipB gene, Transcription terminator of non-plastid origin, Marker-selection marker gene, Rl, R2- repeated sequences which allow to ehminar the marker gene by homologous recombination).
  • C, D, E, F variants of the vector object of the present invention showing the possibilities of expressing one or more genes of interest (gen, geni, gen2) as units monocistronic (E, F) bicistronic (C, E, F) or tricistronic (D), under one (C, E, F) or more
  • Figure 2 Vector map for transformation of plastids of Angiosperm plants pNTPA-f.
  • Figure 3 Vector map for transformation of plastids of Angiosperm plants
  • FIG. 1 Map of the intermediate vector for gene expression in pNTEP plastids.
  • FIG. 1 Southern blot of 10 ⁇ g of AD ⁇ of purified chloroplasts by sucrose gradient, digested with Pst I and using the 32 'fragment of the rbcL gene as a 32 P labeled probe.
  • Lane-1 unprocessed plant
  • lanes-2 to 6 transformed plants (it can be seen that they are all homoplasmic)
  • lanes 7 and 8 transformed plants grown in the absence of the selection agent during the last in vitro culture cycle (note that in the first of them the total elimination of the marker gene by recombination has not yet occurred).
  • Lane-1 unprocessed plant
  • lanes 2-5 transplastomic plants expressing HBsAg (note the signal revealed by the hepatitis B virus antibody at the expected height of approximately 25 KDa).
  • FIG. 7 Western blot demonstration of the use of our transformation vectors for plastid expression of the protein chains that make up a monoclonal antibody. 10 ⁇ g of total leaf proteins were analyzed in each run. Lane-1: unprocessed plant; lanes 2-5: transplastomic plants expressing the recombinant CB-Hep.l antibody (note the signals corresponding to the heavy (50 KDa) and light (25 KDa) chains of the immunoglobulin).
  • Example No.1 Construction of vectors for stable transformation and expression of heterologous genes in plastids of Angiosperm plants. a) Obtaining the rbcL edge. The rbcL-edge fragment was constructed as follows: using the oligonucleotides described in sequences No.ly No.2, a 1524 bp DNA fragment corresponding to the gene encoding tobacco RBCL was amplified by chain reaction of polymerase (PCR). Purified DNA from leaf chloroplasts of N. tabacum var. SR1.
  • the amplified DNA fragment was cloned into the pBluescript II SK vector (Stratagene, USA), previously digested with the restriction enzymes EcoRN and Spel / Klenow, obtaining the clones pBSrbcL.
  • pBSrbcL The amplified DNA fragment was cloned into the pBluescript II SK vector (Stratagene, USA), previously digested with the restriction enzymes EcoRN and Spel / Klenow, obtaining the clones pBSrbcL.
  • Several of the positive clones were subjected to automatic AD ⁇ sequencing, and it was shown that despite using a high fidelity polymerase when performing the PCR (Pfu AD ⁇ Polymerase, Promega, USA) all clones had mutations.
  • clone pBSrbcL13 (containing a mutation in the SacII-BamHI fragment of the rbcL gene) was digested with the restriction enzymes ⁇ col and EcoRI, which cut the rbcL sequence at positions -162 and -29, and this fragment of the rbcL gene was replaced by a synthetic AD ⁇ fragment with the -124 to -97 region altered so that it formed an "ideal" binding site of the lac repressor (Sequence ⁇ o.3).
  • the mutation present in the rbcL13 clone was ehminated by replacing the SacII-BamHI fragment of pBR322rbcL13lacOp with a Mutant-free SacII-BamHI fragment obtained from another sequenced pBSrbcL clone.
  • a Mutant-free SacII-BamHI fragment obtained from another sequenced pBSrbcL clone.
  • the edge-atpB fragment was constructed as follows: using the ohgonucleotides described in the laso.5 and ⁇ o.6 sequences, a 1754 bp AD ⁇ fragment corresponding to the gene encoding the rice ATPB was amplified by reaction in polymerase chain (PCR). For the PCR, purified AD ⁇ of leaf chloroplasts of Oriza sativa var. IAC-18.
  • the amplified AD ⁇ fragment was cloned into the pBluescript vector II KS (Stratagene, USA), previously digested with the restriction enzyme HincII, (towards the 5 'region of the cloned fragment the HincII site (SalI) is restored) obtaining the clones pBSatpB.
  • HincII restriction enzyme
  • SalI HincII site
  • Several of the positive clones were subjected to automatic DNA sequencing, selecting a completely correct clone. Through HindIII-SalI digestion (the original sequence is restored and the Sal ⁇ site is lost) and ligation, a synthetic DNA fragment carrying additional restriction sites and part of the region was added to the 5 'region of the selected clone of atpB.
  • the approximately 1Kb DNA fragment containing the gene that codes for hygromycin resistance (hgh) was obtained from pBSBar plasmid, by PCR amplification using the ohgonucleotides described in sequences No.9 and No.10, which incorporate a Shine-Dalgarno type region 7 bp before the start of translation and restriction sites to facilitate the manipulation of this fragment.
  • the amplified DNA was digested with Kpnl and cloned into the pUC19 vector previously digested with Smal (the S al site is preserved after ligation) and Kpnl, to give rise to the pUC19Hyg plasmid.
  • the pET3xb vector was initially digested with BamHI-Ndel, and the 780pb fragment obtained was re-digested with Taql / Klenow and Kpnl so that a DNA fragment of approximately 3 lOpb was obtained that we cloned into the pUC19 vector previously digested with Smal and Kpnl, to obtain the plasmid pUC-Spacer.
  • the slO gene fragment cloned into the pUC-Spacer was cleaved by digestion with Xbal / Klenow and Kpnl and introduced 3 'of the hgh gene into the vector pUC19-linker-Hyg digested with EcoRI / Klenow and Kpnl, to obtain plasmid pUC19-linker-Hyg-spacer.
  • the second 5 'cloned repeated edge to the hgh gene was introduced obtaining the spacer by digestion of the pUC-Spacer with EcoRJTKlenow and BamHI, and inserting it into the pUC19-linker- Hyg-spacer previously digested with Smal and BglII, obtaining the plas idio pUC- linker- spacer-Hyg-spacer.
  • the bidirectional terminator rrnBTlT2 from E.coli was obtained by digestion with BspHI Mung bean nuclease and HindlII of the vector pTrcHisB (Invitrogen, USA) and by cloning the 470pb band in the pBluescript II SK digested with Hindffl and Smal (pBS-rrnTlT2).
  • the vector for the stable transformation and expression of heterologous genes in plastids of Angiosperm plants proposed by this invention was assembled step by step as follows: the selection cassette with repeated borders was excised by digestion with Notl / Klenow and I left the plasmid pBS -linker-spacer-Hyg-spacer-rrnTlT2, and was inserted into vector pBR322 previously digested with EcoRI Klenow and Sal ⁇ to produce plasmid pBR322-s ⁇ -Hyg-sp-T; then, the plasmid obtained was digested with BamHI / Klenow and Xbal and the rbcL edge extracted from the pBR322rbcLOK construct was inserted by digestion with HindlII / Klenow and Xbal conforming the vector pBR-sp-Hyg-sp-T-rbcL ; finally, the atpB-edge was cleaved from the complete pBSatpB plasmid by digestion
  • the pVTPA-f vector allows the stable transformation of Angiosperm plastids and the obtaining of transplastomic plants that express the recombinant proteins encoded by the genes cloned in it, as long as they are preceded by DNA sequences that allow ribosome binding and translation initiation.
  • Vector pVTPA variant of the vector pVTPA-f that allows inserting and expressing in plastids several genes as independent transcriptional units.
  • a vector variant for stable transformation in plastids and the expression of several genes as independent transcriptional units is obtained by inserting within the cloning sites of pVTPA-f a DNA sequence capable of promoting transcription in plastids and terminator sequences of the transcription (see Figure 1-E).
  • a synthetic fragment encoding the promoter of the 16S subunit of plastid ribosomal RNAs (Prrn) (sequence No. 14), and containing cloning sites to facilitate genetic manipulations, was inserted between the EcoRI and Smal sites of the pBluescript II SK vector, to obtain the plasmid pBS-Prrn.
  • the DNA fragment containing the Prm promoter was cleaved from pBS-Prrn by digestion with the HindlII and Mlul enzymes and inserted between these same sites of the pVTPA-f vector to give rise to the pVTPA construct (see Figure 3, and sequence No .fifteen).
  • Example No.2 Expression of a heterologous monoistronic unit in tobacco transplastomic plants (pVTPA-f-GUS).
  • a heterologous gene In order for a heterologous gene to be expressed in transplastomic plants using the pVTPA-f vector, it must have a ribosome-binding region (RBS) at a suitable distance (5 to 15 bp) from the translation start codon. For this reason, in order to facilitate the cloning of genes in our vector for the transformation and expression of genes in plastids, we design an intermediate vector (pVTEP) that allows cloning the gene of interest into it and then cleaving it by enzymatic digestion to insert it into the vector pVTPA-f (or pVTPA).
  • RBS ribosome-binding region
  • the cloning step in the pVJEP vector helps to introduce an RBS to the gene of interest, while allowing an additional transcription terminator or promoter to be added for expression from the vector object of this invention.
  • a synthetic AD ⁇ fragment carrying the tobacco psbA gene promoter with part of its 5 'non-translatable region (between the -68 and -25 position) was cloned in the pBluescript II Sk digested with EcoRI and Smal from the beginning of translation) deleted to avoid controlling the translation of this gene by light (PpsbA * , sequence ⁇ o.16).
  • pBSPpsbA plasmid pBSPpsbA, to which it was added following the PpsbA promoter, by ⁇ del-Sacl digestion (the Sacl site is lost after this cloning), a synthetic fragment that includes a minicistron (to stabilize the rtVR ⁇ A and favor its translation) and provides an RBS and multiple sites for the cloning of a gene in it (sequence No.17).
  • the resulting plasmid was called pBSPpsbA-linker.
  • the pVTEP vector was finally obtained by inserting into the pBSPpsbA-linker digested with BamHJ.
  • Sequence No.18 corresponds to the primary structure of the pNIEP vector (between the Kpnl site and the second site I left), and its map is shown in Figure 4.
  • a version of the pVTEP intermediary vector without the PpsbA promoter and without a minicistron was obtained by digesting it with EcoRI / Mung bean nuclease and SnaBI, and releasing this plasmid to obtain the pVIEP-2 construct.
  • the uidA (gus) gene was obtained from plasmid pDMC200 (CAMBIA) by digestion with ⁇ col and Smal, and was cloned into ⁇ NEP-2 also digested to obtain pVTEP-GUS; from this plasmid the sequence coding for the uidA gene fused to an RBS was obtained by digestion with HindIII-Smal and cloned under the rice rbcL promoter into the vector for transformation of pVTPA-f plastids digested with Mlul / Klenow and HindIII.
  • SR1 SR1
  • SI Salts and Vitamins MS (Murashige T., Skoog F. Physiol. Plant. 1962, 15: 493-497)
  • Microprojectiles for bombardment are prepared using 0.6 ⁇ m gold spherical particles (BioRad), according to published protocol (Russell DR, Wallace KM, Bathe JH, et al.
  • Plant Cell Rep. 1993, 12: 165-169 The transformation is performed using the Biorad PDS-1000 / He system at a pressure of 1100 psi, a shooting distance of 6 cm and one shot per leaf.
  • the bombarded leaves are kept in the same iso-osmotic medium for an additional 14 to 16 hours and subsequently they are passed to medium YES for two days.
  • the bombed leaves are then cut into fragments of approximately 3x3 mm and transferred, with the abaxial side down, to SI medium with 5mg / L of Hygromycin-B (Duchefa, Holland).
  • Resistant corns and green shoots appear between 6 and 8 weeks of cultivation; they are separated from the dead tissue and transferred to the same selective medium for a second and third selection cycles in increasing concentrations of Hygromycin-B (10 mg / L and 15 mg / L). Finally, the resistant shoots obtained are passed to MS medium (MS Salts and Vitamins, Sucrose 30g L, Fitagel 4g / L, pH 5.7) with Hygromycin-B at 15 mg / L, for their development and rooting. All the cultivation is carried out with a regime of 16 light hours and 8 hours of darkness. The GUS activity of some of the clones obtained resistant to hygromycin was analyzed by histochemical assay using X-Gluc according to the methodology described by Jefferson (Jefferson RA Plant Mol. Biol. Rep. 1987, 5: 387-405).
  • the band of approximately 6.8 Kb expected in the positive clones was detected in all the clones ana ⁇ zados and not in the control without transforming (where the characteristic band of 21.5 Kb was detected); When some of these clones were propagated without the selection agent in the culture medium, it was observed in the Southern blot that the size of the DNA band that hybridizes with the labeled probe decreases to 5.5 Kb, which confirms the elimination of the hgh marker gene by homologous recombination between the sequences that surround it.
  • Example No.3 Expression under two promoters of a heterologous monoistronic unit in tobacco transplastomic plants (pVTPA-aadA).
  • pVTPA vector it is possible to express in plastids a gene under the rice and Prm rbcL promoters; for this, the gene encoding the amino glycoside adenyl transferase (aadA, confers resistance to antibiotics streptomycin, spectinomycin and others) was amplified by PCR from the pDElOOl vector (Department of Genetics, University of Ghent Belgium) using the oligonucleotides described in sequences No.20 and No.21.
  • adA amino glycoside adenyl transferase
  • the product of the PCR reaction was cloned directly into the XVV / Klenow digested pVTPA vector under the two aforementioned promoters to give rise to the pVTPA-aadA construct (sequence No.22).
  • the obtaining of tobacco transplastomic plants was reopened according to the methodology described in the previous Example (Example No.2), with the particularity that the selection of the transplastomic clones was initially made using 500 mg / L spectinomycin in the SI medium, and then streptomycin at 500 mg / L during the second selection cycle.
  • Example .4o.4 Expression of a heterologous bi-cistronic unit in tomato transplastomic plants (pVTPA-f-GUS-aadA).
  • the vector object of this invention it is possible to express several genes in the form of a polycistronic unit.
  • the gus gene into the vector pVTPA-f-GUS (Example ⁇ o.2) the aadA gene to form a tristronic unit (considering that the hgh marker gene will also be expressed as part of the mRNA produced from the rbcL promoter), which after allowing the elimination of the selection marker when the homoplasmic transplastomic plants are obtained will express in them the ⁇ -glucuronidase and the amino-glycoside adenyl transferase.
  • the aadA gene was amplified by PCR as described in Example No.3, and cloned into the Apal site of plasmid pVTPA-f-GUS, to give rise to the vector pVTPA-f-GUS-aadA (sequence No.23).
  • This new vector was used to obtain transplastic tomato plants according to the methodology described below: Tomato seeds of the Campbell-28 variety were sterilized with 10% sodium hypochlorite for 15 minutes, and then washed with abundant sterile distilled water.
  • the seeds were germinated for 12 days in the MSO medium (MS salts; Gamborg B5 Vitamins; 30 g L Sucrose; 8 g / L Phytoagar; pH 5.8) diluted in half, and the cotyledonal leaves were collected in liquid MSO medium and cultured with the abaxial side down on a plate with solid medium MSO + lmg / L of zeatin with 0.4 M of mannitol for an osmotic pre-treatment for 4h.
  • the microprojectiles for the bombardment were prepared using 0.6 ⁇ m gold spherical particles and the transformation is carried out using the Biorad PDS-1000 / He system at a pressure of 1100 psi, a shooting distance of 6 cm and a plate shot.
  • Bombed cotyledons are kept in the same iso-osmotic medium for an additional 14 to 16 hours and subsequently passed to MSO + zeatin medium for two days with the abaxial side up.
  • the bombed cotyledons are then transferred, with the abaxial side up, to MSO + zeatin medium with 5mg L of Hygromycin-B (Duchefa, Holland).
  • Resistant corns and green shoots appear between 3 and 6 weeks of cultivation; they are separated from dead tissue and transferred to the same selective medium for a second cycle of selection at 10 mg / L concentration of Hygromycin-B.
  • the present example illustrates not only the potential of the vector developed by us to express several genes as part of the same mRNA, but also confirms the universality of the vectors object of this invention as a vehicle for obtaining transplastomic clones of different Angiosperm plants of the donor plants of the sequences used as borders for the integration of heterologous DNA into the genome of plastids.
  • Example No.5 Expression of two independent transcriptional units in tobacco transplastomic plants (pVTPA-HB-aadA). Obtaining transplastomic plants that express a multimeric vaccine antigen.
  • hepatitis B surface antigen (HBsAg) (Valenzuela P; Gray P; Quiroga M; Zaldivar J; Goodman HM; Rutter WJ Nature 1979, 280: 815-819) was obtained from plasmid pSAO503 (CIGB , Cuba) by digestion with EcoRI / Klenow and Ncol, and was introduced into the vector ⁇ VIEP-2 (see Example No.2) digested with Ncol and Smal, to place a ribosome binding site before the translation start codon .
  • HBsAg hepatitis B surface antigen
  • the pNTPA-HB-aadA vector was used to obtain tobacco transplastomic plants expressing hepatitis B surface antigen, using the transformation protocol described in Example ⁇ o.2.
  • the selection of the transplastomic clones was initially carried out with Hygromycin-B (10 mg / L) and in the end their resistance to Spectinomycin (500mg / L) was checked, and the expression of HBsAg by means of a specific ELISA type test (CIGB, Cuba), and Western blot ( Figure 6). The results obtained are shown in table 5: Table 5.
  • Table 5 Obtaining tobacco transplastomic plants with the construction pVTPA-HB-aadA.
  • Example No.6 Expression of a heterologous gene in plastids under two promoters and a minicistron (pVTPA-GUSl-aadA and ⁇ VTPA-GUS3-aadA).
  • the intermediate vector for the cloning and expression of genes in the object vectors of this invention allows a gene to be cloned therein under the PpsbA promoter and a minicistron designed to increase stability and promote the translation of mRNA produced.
  • this vector it was cloned into the uidA gene as described in Example No.2 to obtain the plasmid pVTEP-GUSl.
  • a genetic construction was performed in which the minicistron was removed from the pVTEP by Ndel + SnaBI digestion, treatment with SI nuclease and recircularization of the plasmid to obtain the pVIEP-3 vector, where the uidA gene of the manner described above giving rise to plasmid pVTEP-GUS3.
  • Both cassettes containing the gus gene were obtained from the intermediate vectors by digestion with HindIII and cloned into the equally digested pVTPA-aadA vector.
  • Transplastomic plants were obtained with both constructions, and the GUS expression levels of 5 clones of each of them were compared by the fluorimetric method using 4-MUG according to the methodology described by Jefferson (Jefferson R. A.
  • Rice transplastomic plants were obtained repeatedly using the following methodology: Embryogenic calluses (21 days) formed in medium N6-2 (Salts and vitamins of medium N6 (Chu CC; et al. Scientia Sinicl975, 18: 659); O.lg / L of myo-inositol are used; Casein hydrolyzate 1 g / L; 2.4 D at 2mg L; Sucrose 30g / L; Fitagel 3 g L, pH 5.7) from mature rice seeds. These calluses are subcultured for 5 days in fresh N6-2 medium and subsequently passed to N6-2 medium with 3mg / L of kinetin for 48-72 hours in the dark.
  • the calluses are subcultured in the same medium supplemented with 0.4 M mannitol for osmotic pretreatment.
  • 30 calluses are placed in the center of the plate to be bombarded with the following conditions (1100 psi pressure, 6cm distance, 0.6 ⁇ m gold particles loaded with plasmid pVTPA-f-GUS-aadA and one shot per plate).
  • the calluses remain in the same osmotic medium for 16h in the dark and then subculture 2 days in N6-2 medium without mannitol under the same conditions.
  • the calluses are transferred to N6-2 medium with 20 mg / L of Hygromycin-B.
  • calluses capable of growing in the presence of the antibiotic are transferred to the same fresh medium for a second cycle of selection for 10 days.
  • the resistant calluses are passed to modified KIBAN regeneration medium (Salts and vitamins of the MS medium; Kinetin 3 mg / L; BAP 0.5 mg / L; NAA 1 mg / L; Maltose 30 g / L; pH5.7; Fitagel 4.5 g / L) plus 30 mg / L of Hygromycin-B, and the green shoots of approximately 2 cm obtained after 3-4 weeks of cultivation in a regime of 16h light and 8h dark, are passed into a micropropagation cycle between Modified liquid MS (Salts and vitamins of the MS medium; Sucrose 30 g / L; BAP 5mg / L, pH 5.7) with 20mg / L of Hygromycin.
  • the shoots are placed in erlenmeyers with 50 ml of said medium and incubated under stirring at 150 rpm at 28 ° C with a photo period of 16 h light and 8 h darkness. Approximately 7 axillary shoots are obtained per explant after 7 days, which are then rooted in solid MS medium plus 30 g / L of Sucrose and 30 mg / L of Hygromycin-B.
  • Table 7 Obtaining rice transplastomic plants (var. IAC-28) with the construction pVTPA-f-GUS-aadA with and without using pre-treatment with cytokinins (kinetin at 3 mg / L).
  • Example No.8 Obtaining of sugarcane transplastomic plants with the construction pVTPA-f-GUS-aadA.
  • sugarcane transplastomic plants The buds of sugarcane field plants (var. Ja60-5) of 6 months of age are taken, disinfected with 70% ethanol for 1 minute and then for 10 minutes in 10% sodium hypochlorite, wash thoroughly with sterile distilled water.
  • Segments of 0.5xlcm are isolated from the base of the young leaves and grown in light in solid medium P + 5 (10 mg / L of myo-Inositol; 500mg / L of Casein Hydrolyzate; Salts and Vitamins MS; Sucrose 20g / L; 5mgL of 2.4D; Fitagel 4g / L; pH 5.7) with 3 mg / L of kinetin for 48 hours, followed by a culture in the same medium with 0.4 M of Mannitol for 6-8h, in the light.
  • P + 5 10 mg / L of myo-Inositol; 500mg / L of Casein Hydrolyzate; Salts and Vitamins MS; Sucrose 20g / L; 5mgL of 2.4D; Fitagel 4g / L; pH 5.7
  • the regenerated shoots are individualized after 4-6 weeks of culture and are rooted in P- medium with the selective agent at 20 mg / L. Respect to Spectinomycin (at 500 mg / L), as well as the expression of the gus gene (by histochemical assay), was evaluated in the obtained clones. The results of two transformation experiments are shown in the following table 8:
  • the present example confirms again, this time through the transformation of a monocot species, the universality of the vectors object of this invention as a vehicle for obtaining transplastomic clones of Angiosperm plants different from the donor plants of the sequences used as borders for integration of heterologous DNA in the genome of plastids.
  • Example No.9 Obtaining transplastomic plants with desirable agronomic characters. Obtaining transplastomic plants with new agronomic characteristics incorporated is essential for the fight against diseases, pests and weeds, increased yields, reduced costs and better product qualities, without the danger of escaping into the environment. of the new genes introduced.
  • the pat (bar) gene of Streptomyces hygroscopicus (Thompson CJ; Movva NR; Tizard R; Crameri R; Davies JE; et al.
  • the vector object of this invention it is feasible to introduce and express in the transplastomic plants genes that confer resistance to pests and diseases, such as for example the genes coding for the entomocidal protein crystals of Bacillus thuringiensis; or for proteins with antimicrobial activity such as chitinases and glucanases; or anti-stress abiotic such as choline oxidase.
  • the modification or introduction of genes that increase the efficiency of the photosynthetic process, or the quality of plant products, are other of the many feasible actions to be carried out with the use of the universal vector for the transformation of Angiosperm plastids proposed here.
  • Example No.10 Expression of proteins of non-agronomic utility in plastids.
  • Example No.5 we demonstrate the usefulness of the vector that we propose here to stably introduce and express genes encoding multimeric proteins in plastids of Angiosperm plants.
  • Other proteins for medical, veterinary or industrial use are equally feasible to be produced in transplastomic plants through the use of our transformation / expression vector system.
  • the fibrinohtic streptokinase agent of great therapeutic utility for the treatment of thrombosis and myocardial infarctions, the 1254 bp DNA fragment encoding the mature protein SKC-2 of Streptococcus was excised from the vector pEKG-3 (Estrada MP; Hernández L; Pérez A; Rodr ⁇ guez P; Serrano R; Rubiera R; Pedraza A; et al.
  • pVIEP-Estrep I obtained by digestion Sal ⁇ + Xhol the cassette for the expression of the streptokinase gene in plastids under the PpsbA promoter and the minicistron; This cassette was cloned into the pVTPA vector (see Example No.1) digested with Sal ⁇ and Xhol to obtain the pVTPA-Estrep plasmid (Sequence No.26).
  • Example No.11 Expression of unoglobulins in plastids.
  • the DNA fragment encoding the heavy and light chains of the specific CB-Hep.l monoclonal antibody against HBsAg were obtained by Ncol-Xbal digestion of the plasmids pHES ⁇ HBsAgCL and pHES ⁇ HBsAgCH (Nadia Ram ⁇ rez, "Tobacco (Nicotiana tabacum L.) transgenic : a system for the production of an anti-HBsAg antibody and its fragments ", PhD thesis, CIGB, 2002) and inserted into the pNTEP vector digested with these same enzymes to obtain plasmids pVEEP-Hc and pVTEP-Lc.
  • the fragment encoding the light chain was cleaved from the pVEEP-Lc by SnaBI-BamHJ digestion, and then inserted into the one encoding the heavy chain in the plasmid pVIEP-Hc by digestion with Smal-BamHI, to obtain the bicistronic construction pVJEP-HcLc, from where both genes were finally introduced into the vector for the transformation of Angiosperm plastids pVTPA-f by HindIII digestion; thus, after searching for the clone with the correct orientation, the plasmid pVTPA-HcLc was obtained which was introduced to tobacco plastids as described in Example ⁇ o.2.
  • transplastomic plants obtained were analyzed by Western blot to detect the presence of both chains of the CB-Hep antibody. l ( Figure 7), and additionally the functionality of the recombinant immunoglobulin obtained using an extract of the transplastomic plants was demonstrated to detect the presence of HBsAg in an ELISA that was revealed with a rabbit polyclonal conjugate with alkaline phosphatase. In this way, while we demonstrate the possibility of obtaining fully functional antibodies with our transformation / expression vectors in transplastomic plants, we reaffirm the possibility of correctly expressing and assembling multimeric proteins in plastids.

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Abstract

Un vector de ADN que permite la inserción estable y la expresión de genes heterólogos en los genomas de plastidios de células de cualquier planta Angiosperma.. En este vector los genes a introducir se pueden insertar en múltiples sitios de clonación localizados en una región intergénica artificial que se obtiene de combinar los operones atpB y rbcL pertenecientes a plantas de clases diferentes (dicotiledóneas o monocotiledóneas). El casete de expresión se integra al genoma mediante recombinación entre las secuencias bordes atpB y rbcL del vector, con las correspondientes regiones homólogas del genoma plastídico; pudiendo expresarse más de un gen de interés a partir del promotor rbcL adyacente a la región borde que codifica para el gen atpB

Description

VECTOR PARA LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS ANGIOSPERMAS
TRANSPLASTÓMICAS
Campo de la invención: Esta invención se relaciona con la rama de la Biotecnología y más específicamente con la Ingeniería Genética de las Plantas. En particular, se proporcionan construcciones de ADN útiles para introducir con alta eficiencia y expresar genes foráneos en plastidios de plantas Angiospermas y se demuestra la utilidad de las mismas para obtener con alta eficiencia plantas transplastómicas que expresan proteínas heterólogas, en particular antígenos vacunales y proteínas de uso farmacéutico. Estado del arte:
La ingeniería genética de las plantas es una tecnología que ha demostrado ser muy productiva para la investigación básica y la producción comercial de nuevos productos biotecnológicos (ver: Hammond J. Curr. Top. Microbiol. Immunol 1999, 240:1-19; Simoens C. y Van Montagu M. Reproduction Update 1995, 1:523-542).
Hasta hace pocos años, la producción de plantas transgénicas mediante el empleo del Agrobacterium, o por métodos directos de transformación se focalizaba en la inserción estable de los genes quiméricos introducidos en el núcleo de la célula vegetal (ver: Hansen G. y Chilton M.D. Curr. Top. Microbiol. Immunol 1999, 240:21-57; Newell C.A. Mol. Biotechnol 2000, 16:53-65). Sin embargo, algunas limitaciones que presenta la transformación nuclear solo pueden ser eliminadas mediante la introducción selectiva de los nuevos genes en los organelos de la célula vegetal (ver: Bogorad L. Trends in Biotechnology 2000, 18:257-263; Heifetz P.B. Biochimie 2000, 82:655-666). En particular, la expresión de genes heterólogos en los plastidios presenta las siguientes ventajas con respecto a su contraparte nuclear: 1) un nivel de expresión del transgen de 10 a 50 veces mayor que en el núcleo dado el alto número de copias de cada genoma por plastidio; 2) la inserción de los nuevos genes puede ser sitio específica por recombinación homologa evitándose los efectos de posición, silenciamiento y otros fenómenos que influyen sobre la expresión de los genes introducidos al núcleo celular; 3) es posible la expresión de genes en operones, lo cual es muy deseable cuando se trata de hacer ingeniería de las vías metabólicas o de alterar caracteres que son multigénicos; 4) la heredabilidad de la información genética es materna, por lo que se evita que mediante el polen se dispersen en el ambiente los nuevos caracteres introducidos, eliminándose así posibles daños al entorno. Adicionalmente, la expresión de genes en plastidios brinda la posibilidad de acumular allí proteínas heterólogas que en ese microambiente pudieran tener una mayor estabilidad, o del cual pudieran ser más fácilmente purificadas.
Diferentes métodos se han reportado para la introducción de genes en plastidios de algas y plantas superiores. En particular, han sido muy empleados el bombardeo con micropartículas aceleradas recubiertas de ADN (Boynton J.E; Gillham E.H; Hosler J.P; y otros. Science 1988, 240:1534-1538; Daniell H; Vivekananda J; Nielsen B; y otros. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1990, 87:88-92; Svab Z; Hajdukiewicz P; Maliga P. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1990, 87:8526-8530), y en menor escala la transformación de protoplastos vegetales mediante PEG (O'Neill C; Horvath G.V; Horvath E; y otros. Plant J 1993, 3:729-738; Golds T; Maliga P; Koop H-U. Biotechnology 1993, 11:95-97), y la microinyección (Knoblauch M; Hibberd J.M; Gray J.C; van Bel A .E. Nature Biotechnol 1999,17:906-909).
La inserción estable en el genoma plastídico de las secuencias de ADN introducidas, se ha logrado mayoritariamente utilizando los eficientes mecanismos de recombinación homologa que naturalmente existen en estos organelos celulares (Blowers A.D; Bogorad L; Shark K.B.; Sanford J.C. Plant Cell 1989, 1:123-132; Staub J.M. y Maliga P. Plant Cell 1992, 4:39-45; Kavanagh T.A; Thanh N.D; Lao N.T; y otros. Genetics 1999, 152: 1111-1122). Es de destacar que cuanto mayores sean las regiones homologas, con más alta frecuencia ocurrirán los eventos de recombinación, siendo estos despreciables cuando las regiones homologas son menores de 137pb (Zoubenko O.N; Allison L.A; Svab Z; Maliga P. Νucleic Acid Res 1994,, 22:3819-3824).
Muchas regiones han sido propuestas como sitios adecuados de recombinación para insertar secuencias quiméricas en plastidios vegetales, entre ellas: rbcL-accD, psbE-petA, trnN- rps7/12, trnN-16SrRΝA operon, psbA-trnH, trnA-trnl, la región 23SrRΝA, etc (Svab Z. y Maliga P. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90:913-917; Zoubenko O.N; Allison L.A; Svab Z; Maliga P. Νucleic Acid Res 1994, 22:3819-3824; Daniell H; Datta R; Narma S; y otros. Νature Biotechnol 1998, 16:345-348; US Pat. 5,877,402; WO 9910513). A pesar de que algunas de estas regiones se recomiendan como universales para la integración de secuencias foráneas de ADΝ en los genomas de plastidios vegetales de diferentes especies de plantas, en realidad presentan algunas limitaciones en cuanto a su universalidad debido a una o más de las siguientes razones: 1) sus secuencias y/o estructuras no son altamente conservadas entre los genomas plastídicos de plantas de especies diferentes; 2) poseen regiones de alta homología muy pequeñas seguidas de, o interrumpidas por, intrones u otras regiones mucho menos conservadas (lo que disminuye la frecuencia de recombinación homologa y por ende de obtención de plantas con plastidios transgénicos (transplastómicas)); 3) se encuentran formando parte de operones naturales de los plastidios, por lo que una alteración dentro de estas estructuras puede afectar las tasas salvajes de transcripción para cada gen del operon o el correcto procesamiento de los RNA policistrónicos (Ohme M; Kamogashira T; Shinozaki K; Sugiura M. Nucleic Acid Res 1985, 13:1045-1056), con las indeseables consecuencias que esto acarrea para el metabolismo del plastidio. De hecho, no es casual que utilizando vectores portadores de las regiones antes mencionadas como sitios de recombinación, solo se han reportado adecuadamente documentadas en publicaciones arbitradas producciones de plantas transplastómicas de tabaco (Svab Z. y Maliga P. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90:913- 917), papa (Sidorov N.A; Kasten D; Pang S.Z; y otros. Plant J 1999, 19:209-216) y tomate (Ruf S; Hermann M; Berger I ; y otros. Νature Biotechnol 2001, 19:870-875), todas especies Solanáceas muy cercanas evolutivamente y a nivel de estructura primaria del ADΝ. Adicionalmente, es de destacar que todos los vectores propuestos que utilizan estas regiones de recombinación muestran una baja eficiencia de producción de plantas transplastómicas homoplásmicas (plantas con todos sus genomas plastídicos homogéneamente transformados). Esto último se debe probablemente a que incluyen el uso de regiones terminadoras y promotores de origen plastídicos mayores de 174 pb (Iamtham S. y Day A. Νature Biotechnol 2000, 18: 1172-1176), lo que provoca que muchos eventos de transformación se malogren por recombinaciones entre estos elementos del vector y regiones homologas del genoma plastídico dando lugar a plastidios no viables (Svab Z. y Maliga P. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90:913-917; Kanevski I; Maliga P; Rhoades D.F; Gutteridge S. Plant Physiol 1999, 119:133-141).
La región del genoma plastídico más umversalmente conservada en cuanto a estructura y secuencia nucleotídica entre las plantas Angiospermas, es la compuesta por los operones que se transcriben en direcciones opuestas atpB y rbcL. De hecho, estos genes contienen segmentos de ADN mayores de 1500 pares de bases (pb) con homologías superiores al 85% entre plastidios de plantas pertenecientes a clases diferentes (dicotiledóneas o monocotiledóneas) y más del 91% de homología nucleotídica al analizar plantas de la misma clase (ver Tabla 1). Por otra parte, la región intergénica entre estos dos operones presenta una homología a nivel nucleotídico muy baja (menos del 50%) entre los plastidios de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas. Tabla 1. Homología a nivel nucleotídico entre los genes rbcL y atpB de plantas de diferentes especies y clases.
Figure imgf000006_0001
La subunidad mayor de la ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa-oxigenasa (Rubisco) está codificada por el gen plastídico rbcL. Experimentalmente se ha determinado que la región carboxilo-terminal de la rbcL forma la alfa-hélice número 8 de esta proteína, y que esta región está involucrada en la interacción con la subunidad menor de esta enzima, codificada por el gen nuclear rbcS (Knight S; Andersson I; Branden C-I. J. Mol. Biol. 1990, 215:113- 160; Curmi P.M.G; Cascio D; Sweet R.M; y otros. J. Biol. Chem. 1992, 267:16980-16989). A partir de estos y otros datos (Kanevski I; Maliga P; Rhoades D.F; Gutteridge S. Plant Physiol. 1999, 119:133-141), y considerando el menor grado de conservación entre las regiones C-terminal de proteínas rbcL de plastidios pertenecientes a especies de plantas diferentes, se plantea la hipótesis de que la alfa-héüce 8 de la rbcL define la especie especificidad de las interacciones entre las dos subunidades que forman la Rubisco.
Se ha demostrado que posiblemente gracias a una estructura tipo lazo que se encuentra cercana al inicio de transcripción del promotor rbcL (posición +1 a +26 a partir del inicio de transcripción), los RNA por él producidos se estabilizan, compensando con esto la disminución de la actividad transcripcional de este promotor durante la oscuridad (Shiina T; Allison L; Maliga P. The Plant Cell 1998, 10:1713-1722). Igualmente, varios segmentos de secuencias posicionados cerca o dentro de la región estructural de este promotor se asemejan a secuencias de factores de unión a ADN de cloroplastos (CDF), y pudieran tener un papel importante en la regulación transcripcional de este promotor. Algunas particularidades que caracterizan la transcripción/traducción del operon atpB-atpE (codificante para las sub-unidades β y ε de la ATP-sintasa de cloroplastos) han sido reportadas (Shinozaki K; Deno H; Kato A; Sugiura M. Gene 1983, 24:147-155; Gatenby A.A; Rothstein S.; No ura M. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1989, 86:4066-4070; Kapoor S; Wakasugi T; Deno H; Sugiura M. Curr. Genet. 1994, 26:263-268). Estos dos genes están solapados, y en particular llaman la atención las características traduccionales de atpE basadas en un corrimiento del marco abierto de lectura, y una región conservada dentro de la región codificante para atpB que contiene un posible promotor de atpE (posiciones +1027 a +1064 de la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína atpB de arroz, tabaco, etc.). La funcionalidad de este promotor in vivo no esta totalmente demostrada, pero no se descarta que juegue algún papel en la regulación transcripcional de atpE.
El posible uso de la región intergénica atpB-rbcL como blanco para la inserción de genes foráneos en plastidios se describe únicamente por Cannon M.C. y Cannon F.C en la soücitud de patente europea No. 0 251 654. Sin embargo, esta patente propone el uso de un transposon bacteriano como vehículo para introducir genes foráneos en la región intergénica de estos dos operones divergentemente transcribibles. No es casual que Cannon M.C. y Cannon F.C. no reportaran la obtención de plantas transplastómicas, ya que la inserción de un transposon en esta región intergénica no solo interrumpe la reportada interacción entre los promotores atpB y rbcL (Hanley-Bowdoin L. y Chua N-H. Mol. Gen. Genet. 1989, 215:217-224), sino que además (como es el caso del maíz y arroz por ejemplo) interrumpe la transcripción del gen atpB a partir del promotor NEP (promotor dependiente de polimerasa nuclear) que se encuentra dentro de la región 5' no traducible del gen rbcL (Welhe A. y Borner T. Trends in Plant Science 1999, 4: 169-170). Es evidente que una correcta transcripción y regulación de la expresión de los productos codificados por estos operones son absolutamente necesarios para el adecuado funcionamiento y viabilidad de los plastidios. Adicionalmente, el vector de expresión descrito por Cannon M.C. y Cannon F.C. no contiene terminadores de la transcripción, un elemento indispensable para la expresión génica en plastidios (Stern D.B. y Kindle K.L. Mol. Cell Biol. 1993, 13:2277-2285; Chen H.C. y Stern D.B. Mol Cell Biol. 1991, 11:4380-4388).
Además de regiones terminadoras de la transcripción, de las cuales también se pueden emplear exitosamente aquellas de origen bacteriano (Chen LJ. y Orozco E.M. Jr. Nucleic Acid Res. 1988, 16:8411-8431), es necesario que los genes introducidos a los plastidios se encuentren bajo promotores funcionales en los mismos. Entre los promotores más empleados para expresar genes en plastidios transgénicos se encuentran los promotores fuertes Prrn del ARNr 16S (Svab Z. y Maliga P. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90:913-917) y el PsbA (Daniell H. Methods in Molecular Biology 1997, 62:463-489). El promotor Prrn es constitutivo, mientras que la transcripción traducción de los ARN producidos por el promotor PsbA es inducida por la luz y depende de su región 5' no traducible. La deleción de la región 5' no traducible del gen psbA hace independiente de la luz la expresión de su ARNm, sin embargo la traducción del mismo se ve afectada (Staub J.M. y Maliga P. Plant J. 1994, 6:547-553; Eibi C; Zou Z; Beck A; y otros. Plant J. 1999, 19:333-345). Estos promotores tienen secuencias -35 y -10 homologas a los consensos descritos para los promotores bacterianos y se transcriben dependiente de una polimerasa codificada por el genoma plastídico (PEP) (Hess W. y Borner T. Int. Rev. Cytol. 1999, 190:1-59). Entre otras similitudes entre los mecanismos de transcripción/traducción de plastidios y bacterias, también se ha demostrado que ARNm policistrónicos pueden ser expresados y eficientemente traducidos en plastidios de tabaco (Staub J.M. y Maliga P. Plant J. 1995, 7:845-848); siendo funcionales en cloroplastos las regiones de unión a ribosomas (RBS) que contienen secuencias tipo Shine-Dalgarno (Stern D.B; Higgs D.C; Yang J. Trends Plant Sci. 1997, 2:308-315).
Para facilitar la selección de las plantas transplastómicas, se ha propuesto entre otras variantes el uso de marcadores de selección positiva como por ejemplo: la kanamicina (Daniell H. Methods in Molecular Biology 1997, 62:463-489), o el más umversalmente utilizado la espectinomicina (Svab Z; Hajdukiewicz P; Maliga P. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1990, 87:8526-8530; Svab Z. y Maliga P. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90:913-917); para lo cual el gen que confiere resistencia al compuesto de selección se clona en el vector de transformación bajo señales apropiadas para su correcta expresión en los plastidios. A tono con la conservación de la naturaleza, se han elaborado tecnologías llamadas "limpias" que permiten eliminar de las plantas que se liberan al medio ambiente los genes que codifican para los marcadores de selección. Dos de estas metodologías aplicadas exitosamente en la producción de plantas transplastómicas son: la co-transformación con dos vectores y posterior segregación y eüminación de los individuos que portan el marcador de selección (Fisher N; Stampacchia O; Redding K; Rochaix J.D. Mol. Gen. Genet. 1996, 251:373-380) y la inserción del gen marcador entre dos secuencias repetidas en el cásete de expresión para la posterior ehminación de este gen por recombinación homologa durante el cultivo en medios no selectivos (Fisher N; Stampacchia O; Redding K; Rochaix J.D. Mol. Gen. Genet. 1996, 251:373-380; Iamtham S. y Day A. Nature Biotechnol. 2000, 18:1172-1176). Descripción detallada de la invención:
El vector para la transformación estable y expresión de genes heterólogos en plastidios de plantas Angiospermas que propone la presente invención, contiene un grupo de características propias que lo distinguen: 1) no se emplea un transposón para insertar fragmentos de ADN en el genoma plastídico; 2) las regiones bordes atpB y rbcL pertenecen a plantas Angiospermas de clases diferentes formando una región intergénica artificial; 3) sitios múltiples de clonación en la región intergénica artificial transcripcionalmente inactiva, permiten la inserción de uno o más genes heterólogos sin afectar la correcta transcripción, procesamiento de los ARNm y expresión de los genes atpB y rbcL; 4) el diseño de nuestro vector permite la expresión de los genes introducidos sin necesidad de que porten secuencias promotoras o terminadoras, siempre y cuando las secuencias codificantes para proteínas estén precedidas por un sitio de unión a ribosomas ( esto contribuye a disminuir eventos indeseables de recombinación y a un ahorro de recursos metabólicos de los plastidios, permitiendo una mayor estabilidad del fragmento de ADN heterólogo y un aumento de la frecuencia de producción de plantas homoplásmicas); 5) la estructura y secuencias de las regiones bordes que propone nuestra invención garantizan la universalidad del presente vector. Además, el vector que proporcionamos constituye una herramienta "limpia" para la introducción de genes en las plantas cultivables por cuanto su diseño permite que se elimine el marcador de selección, por recombinación homologa entre secuencias repetidas, una vez que se han logrado las plantas transplastómicas homoplásmicas.
El diseño y la extensión de la región atpB-rbcL, con su región intergénica artificial, constituye la base del presente objeto de invención pues nos permite insertar de forma eficiente y estable genes y operones en el genoma de los plastidios de plantas Angiospermas de cualquier especie, sin provocarles ninguna alteración funcional. Al diseñar la región intergénica artificial hubo que resolver el reto que representa el poder introducir en la misma un gen foráneo, sin afectar la interacción entre los promotores rbcL y atpB, y las tasas de transcripción natural de los mismos.
Por otra parte, hubo que considerar que los productos de los genes atpB y rbcL constituyen subunidades de enzimas que reaüzan funciones vitales para el mantenimiento de los plastidios y las plantas. Esta última situación impone limitaciones en cuanto a la longitud de los fragmentos seleccionados como bordes para la recombinación, por cuanto es de esperar que determinados dominios de estas proteínas estén involucrados en las interacciones proteína-proteína y pueden determinar el reconocimiento entre las diferentes subunidades de estas enzimas y su correcto plegamiento y funcionalidad. Al utilizar la región atpB-rbcL como sitio de recombinación para la inserción de genes foráneos en los plastidios de plantas de especies diferentes, hay que considerar que se producirán proteínas híbridas, y por tanto merece especial atención lo planteado en el párrafo anterior. De esta forma, para evitar afectaciones en el correcto ensamblaje y funcionalidad de una Rubisco híbrida, postulamos que es necesario mantener invariable en el producto de la recombinación la región del gen rbcL que codifica para la alfa-hélice 8. Así, durante el diseño del vector objeto de esta invención decidimos que el fragmento de ADN para la transformación de plastidios mediante recombinación homologa, que incluye parte de la secuencia traducible del gen rbcL (en lo adelante llamado borde-rbcL), debía extenderse solo hasta la región amino-terminal de la alfa-hélice 8, y más específicamente hasta un triptofano (Trp-411) altamente conservado en esa posición en todas las rbcLs de las plantas Angiospermas.
Con relación a la región que codifica para el gen atpB, no se detecta ningún dominio con marcada variabilidad al comparar las secuencias de proteínas provenientes de plastidios de plantas de diferentes especies. Sin embargo, fueron tenidas en cuenta las particularidades transcripcionales/traduccionales del operon atpB-atpE al elegir el fragmento de ADN, que incluye parte de la secuencia traducible del gen atpB (en lo adelante llamado borde-atpB), para la integración de genes foráneos a plastidios mediante recombinacíón homologa. En nuestro diseño de la región intergénica artificial que nos permita insertar nuevos genes sin afectar la transcripción de atpB y rbcL, nos aprovechamos de la baja homología a nivel nucleotídico que muestra la región entre estos operones cuando comparamos secuencias de plastidios pertenecientes a plantas Angiospermas de clases diferentes. En la construcción genética objeto de esta invención, el borde-rbcL debe comprender un fragmento de ADN que porta parte del gen y toda su región 5'regulatoria no transcribible. Este fragmento incluye: 1) el promotor PEP (dependiente de polimerasa codificada por el plastidio) de rbcL con las secuencias CDF asociadas a él; 2) la región 5' no traducible del gen rbcL y 3) la secuencia codificante para rbcL hasta la región que se corresponde con el N- terminal de la alfa-hélice 8. Así, el borde-rbcL en el vector objeto de esta invención va a extenderse desde la posición -291 de la secuencia nucleotídica que codifica para esta proteína en tabaco, hasta la posición +1233 (Trp-411 en la secuencia aminoacídica) a partir del codón de inicio de traducción de este gen.
Es de destacar que al intentar clonar la región borde-rbcL, descubrimos que la expresión del gen rbcL a partir de su propio promotor es tóxica a la E.coli; por lo que fue necesario sustituir un fragmento poco conservado de la región 5' no traducible de este gen por un operador lac "ideal" (Simons A. y otros. 1984) y además, clonar este borde quimérico en un vector plasmídico de bajo número de copias (pBR322) que será propagado en una cepa bacteriana super-productora del represor lacl como por ejemplo XLl-Blue, JM101, etc. En la construcción genética que proponemos se decidió tomar como el borde-atpB un fragmento de ADN que incluye: 1) el promotor rbcL adyacente y las secuencias tipo lazo cercanas al inicio de transcripción que estabilizan los transcriptos producidos por este promotor; 2) los promotores de atpB incluyendo su promotor NEP; 3) la región 5 'no traducible del gen atpB y 4) la secuencia codificante para atpB hasta unos 300 pb antes del codon de parada del este gen. De esta forma, al diseñar el vector objeto de esta invención el borde-atpB se extiende desde la posición -654 de la secuencia nucleotídica que codifica para esta proteína en arroz, hasta la posición +1211 a partir del codón de inicio de traducción de este gen.
El promotor rbcL que contiene el borde-atpB, permite que a partir de él se pueda expresar con estabilidad un gen de interés en dirección contraria a la transcripción de atpB-atpE. Por conveniencia, bajo este promotor pudiera clonarse un cásete genético conteniendo uno o más genes foráneos bajo un promotor funcional en plastidios, y de esta manera obtendríamos la expresión de ellos potenciada por la transcripción a partir de dos promotores en tándem. Al introducir en un plásmido las regiones bordes anteriormente descritas, para su mantenimiento y multiplicación en E. coli, se clonan una a continuación de la otra separadas por un segmento de ADN que contiene sitios de clonación (MCSl, ver Figura 1-A ) útiles para la inserción de los genes heterólogos que se pretendan introducir posteriormente al genoma de los plastidios. Con esta estructura, en que las direcciones de la transcripción de los genes atpB y rbcL van a ser divergentes, y debido a que la región promotora rbcL está duplicada, se obtienen dos fragmentos de ADN repetidos y en la misma dirección bordeando la región que contiene los sitios de clonación; sin embargo, debido a la baja homología existente en esta región intergénica entre genomas plastídicos de Angiospermas de clases diferentes, no ocurre ningún evento de recombinación homologa ya que solo un fragmento de aproximadamente 90 pb presenta un alto grado de homología. La construcción anteriormente descrita es la base del vector objeto de esta invención, donde además se introducirá en el MCSl, en dirección 5 '-3' a partir del promotor rbcL del borde- atpB, un gen que codifique para un marcador que permita la selección positiva de las células transformadas, bordeado por secuencias de ADN repetidas que facilitarán mediante recombinación homologa la eliminación del marcador una vez obtenidas las plantas transplastómicas homoplásmicas, si esto fuera deseado. La terminación de la transcripción del gen marcador, o de cualquier otro gen que se inserte en el MCSl, estará dada por un terminador bacteriano que se coloca adyacente al extremo 5 ' del borde-rbcL (preferiblemente el terminador bidireccional rrnBTlT2 del operon rrnB de E.coli (Brosius J; Dull T.J; Sleeter D.D; Noller H.F. J. Mol. Biol. 1981, 148:107-127) evitando que la actividad transcripcional del fragmento insertado interfiera el normal funcionamiento del promotor natural de este borde.
De esta forma, la estructura general del vector objeto de esta invención se muestra en la Figura 1-B, donde el gen, o los genes, de interés se pueden clonar bajo el promotor rbcL del borde-atpB formando una unidad transcripcional mono o policistrónica (Figura 1-C), o bajo otros promotores funcionales en plastidios pudiéndose obtener por ejemplo una unidad policistrónica bajo dos promotores en tándem (Figura 1-D), o dos unidades transcripcionales independientes bajo diferentes combinaciones de regiones promotoras (Figurasl-E y Figura 1-F). Para facilitar la selección de las plantas transplastómicas, nosotros decidimos usar como marcador de selección la higromicina, ya que a pesar de que este antibiótico es extremadamente tóxico a plantas dicotiledóneas como el tabaco, y por lo tanto debe ser empleado con moderación, resulta mucho más efectivo como agente selectivo para la obtención de plantas monocotiledóneas con plastidios modificados genéticamente. Por esto, el gen hgh que codifica para la resistencia a la higromicina-B en Klebsiella (Gritz L. y Davies J. Gene 1983, 25:179-188), conteniendo una región Shine-Dalgarno adecuada, es clonado en el MCSl bajo el promotor rbcL del borde-atpB (Figura 1-B).
A fin de ofrecer una herramienta ecológica, en el vector objeto de esta invención el gen marcador fue introducido bordeado por dos secuencias de ADN repetidas que permiten su eliminación mediante recombinación homologa (Figura 1-B), una vez que ya obtenidas las plantas transplastómicas se elimina el agente selectivo del medio de cultivo. Las secuencias repetidas que empleamos en nuestra construcción son provenientes de la región que codifica para la proteína slO del fago T7 (Dunn J.J. y Studier F.W. J. Mol. Biol. 1983, 166:477-535). Nuestros vectores tienen la particularidad de que al eliminar solo el gen marcador, se mantienen inalterables el resto de las secuencias regulatorias de su operon (Figuras 1-C, 1-D, 1-E y 1-F); así, cualquier gen transcripcionalmente fusionado al gen marcador continuará inalterable su expresión, economizándose los recursos del vector. Esta arquitectura es otra de las cuaüdades que distinguen al vector objeto de esta invención de otros sistemas descritos como vehículos para la modificación genética de plastidios. Es obvio que otros genes que confieran resistencia a antibióticos como a la espectinomicina (Chinault A.C; Blaskeley V. A; Roessler E; Willis D.G; y otros. Plasmid 1986, 15: 119-131), o a las sulfonamidas (Guerineau F; Mullineaux P. Nucleic Acid Res 1989, 17:4370), podrían ser también utilizados para facilitar la selección de las plantas transplastómicas. De la misma forma, genes que confieran resistencia a compuestos herbicidas como el glifosato (Shah D.M; Horsc RB; Klee H.J; Kishore G.M; y otros. Science 1986, 233:478-481; Comai L; Facciotti D; Hiatt W.R; Thompson G; y otros. Nature 317:741-744), el glufosinato (DeBlock M; Botterman J; Nandewiele M; Dockx J; y otros. EMBO Journal 1987, 6:2513-2518), asula (Guerineau F; Brooks L; Meadows J; Lucy A; y otros. Plant Mol Biol 1990, 15:127-136), bromoxinil (Stalker D.M. y McBride K.E. J. Bacteriol 1987, 169:955-960), sulfonilureas y imidazolinonas (LaRossa R.A y Smulky D.R. J. Bacteriol 1984, 160:391-394), etc, pueden ser clonados en la región intergénica artificial y empleados como marcadores de selección con la ventaja adicional de que este es un carácter agronómico deseable. Para alguien con experiencia en el estado del arte y las técnicas de la ingeniería genética, es obvio que lo aquí descrito permite utilizar como regiones bordes para la integración de genes en el genoma de plastidios de plantas Angiospermas, cualquier combinación de las regiones atpB y rbcL, con todas o parte de las características descritas, siempre y cuando su fuente sean plastidios de plantas pertenecientes a Angiospermas de clases diferentes (monocotiledóneas o dicotiledóneas). Igualmente, múltiples genes, marcadores de selección y combinaciones de cistrones y operones son posibles de clonar en el MCSl de la región intergénica artificial del vector que aquí se propone (Figura 1-A), a fin de insertarlos establemente y expresarlos en plastidios de cualquier planta Angiosperma. Depósito de microorganismos Los plásmidos pNTPA-HB-aadA, pNTPA-f-GUS, pNIEP fueron depositados bajo las reglamentaioces del Tratado de Budapest para el depósito de microorganismos en el Belgian Coordinated collection of Microorganisms BCCM, LMBP-COLLECΗON con los números de acceso LMBP 4635, LMBP 4636 y LMBP 4637 respectivamente, depositados el 24 de Septiembre, 2002. Descripción de las Figuras: Figura 1. A, estructura base para la construcción del vector objeto de la presente invención mostrando la región que contiene sitios para la clonación (MCSl) acotada por: el borde-atpB £¿J| y el borde-rbcL PHI pertenecientes a Angiospermas de clases diferentes
(monocotiledóneas ó dicotiledóneas).
B, estructura general del vector objeto de la presente invención (rbcLpr- promotor del gen rbcL, atpBpr- promotor del gen aipB, Term- terminador de la transcripción de origen no plastídico, Marcador- gen marcador de selección, Rl, R2- secuencias repetidas que permiten ehminar el gen marcador por recombinación homologa).
C, D, E, F, variantes del vector objeto de la presente invención mostrando las posibilidades de expresar uno o más genes de interés (gen, geni, gen2) como unidades monocistrónicas (E, F) bicistrónicas (C, E, F) o tricistrónicas (D), bajo uno (C, E, F) o más
(D, F) promotores funcionales en plastidios (Pr, Prl, Pr2).
Figura 2. Mapa del vector para transformación de plastidios de plantas Angiospermas pNTPA-f. Figura 3. Mapa del vector para transformación de plastidios de plantas Angiospermas
PNTPA.
Figura 4. Mapa del vector intermediario para la expresión de genes en plastidios pNTEP.
(S/D- secuencia Shine-Dalgarno).
Figura 5. Southern blot de 10 μg de ADΝ de cloroplastos purificados por gradiente de sacarosa, digerido con Pst I y empleando como sonda marcada con 32P el fragmento 5 'del gen rbcL. Carril- 1: planta no transformada; carriles-2 al 6: plantas transformadas (se puede apreciar que todas son homoplásmicas); carriles 7 y 8, plantas transformadas crecidas en ausencia del agente de selección durante el último ciclo de cultivo in vitro (notar que en la primera de ellas aún no ha ocurrido la total eliminación del gen marcador por recombinación) .
Figura 6. Demostración mediante Western blot del uso de nuestros vectores de transformación para la expresión del antígeno de superficie de la hepatitis B en cloroplastos.
10 μg de proteínas totales de hojas fueron anaüzados en cada corrida. Carril-1: planta no transformada; carriles 2-5: plantas transplastómicas que expresan el HBsAg (obsérvese la señal revelada por el anticuerpo contra el virus de la hepatitis B a la altura esperada de aproximadamente 25 KDa).
Figura 7. Demostración mediante Western blot del uso de nuestros vectores de transformación para la expresión en plastidios de las cadenas proteicas que conforman un anticuerpo monoclonal. 10 μg de proteínas totales de hojas fueron analizados en cada corrida. Carril-1: planta no transformada; carriles 2-5: plantas transplastómicas que expresan el anticuerpo recombinante CB-Hep.l (obsérvese las señales correspondientes a las cadenas pesada (50 KDa) y ligera (25 KDa) de la inmunoglobulina).
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN: Ejemplo No.1 : Construcción de vectores para la transformación estable y expresión de genes heterólogos en plastidios de plantas Angiospermas. a) Obtención del borde-rbcL. El fragmento borde-rbcL fue construido de la siguiente forma: utilizando los oligonucleótidos descritos en las secuencias No.l y No.2 se amplificó un fragmento de ADN de 1524 pb correspondiente al gen que codifica para la RBCL de tabaco mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para el PCR se empleó ADN purificado de cloroplastos de hojas de N. tabacum var. SR1. El fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pBluescript II SK (Stratagene, USA), previamente digerido con las enzimas de restricción EcoRN y Spel/Klenow, obteniendo los clones pBSrbcL. Varios de los clones positivos fueron sometidos a secuenciación automática de ADΝ, y se demostró que a pesar de emplear una poümerasa de alta fidelidad al realizar los PCR (Pfu ADΝ Polimerasa, Promega, USA) todos los clones presentaban mutaciones. Este hecho, más otras evidencias no concernientes a la presente invención, nos indicó que la RBCL de tabaco estaba siendo tóxica a la E.coli al expresarse a partir de su propio promotor; por esta razón, decidimos mutagenizar un fragmento poco conservado de la región 5 'no traducible del gen rbcL a fin de crear allí un operador lac "ideal" que nos permitiera clonar este fragmento borde en cepas de E.coli lacl . Para realizar la mutagénesis, el clon pBSrbcL13 (que contiene una mutación en el fragmento SacII-BamHI del gen rbcL) fue digerido con las enzimas de restricción Νcol y EcoRI, que cortan la secuencia de rbcL en las posiciones -162 y -29, y se sustituyó este fragmento del gen rbcL por un fragmento de ADΝ sintético con la región -124 a -97 alterada de forma tal que formara un sitio de unión "ideal" del represor lac (Secuencia Νo.3). Una vez insertado el operador lac en el clon pBSrbcL13 (llamado ahora pBSrbcL131acOp), escindimos el fragmento rbcL mediante restricción con las enzimas Salí y Xbal/Klenow, y lo clonamos en el vector de bajo número de copias pBR322 (Νew England Biolabs, USA) digerido con las enzimas Salí y EcoRN (el sitio Xbal se restituye), para obtener el plásmido pBR322rbcL131acOp, en el cual el gen rbcL se transcribe en dirección Salí -Xbal . A continuación, la mutación presente en el clon rbcL13 fue ehminada sustituyendo el fragmento SacII-BamHI del pBR322rbcL13lacOp por un fragmento SacII-BamHI libre de mutaciones obtenido de otro clon pBSrbcL secuenciado. De esta forma obtenemos el plasmidio pBR322rbcLOK, conteniendo el borde-rbcL (Secuencia Νo.4). b) Obtención del borde-atpB. El fragmento borde-atpB fue construido de la siguiente forma: utilizando los ohgonucleótidos descritos en las secuencias Νo.5 y Νo.6, se amplificó un fragmento de ADΝ de 1754 pb correspondiente al gen que codifica para la ATPB de arroz mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para el PCR se empleó ADΝ purificado de cloroplastos de hojas de Oriza sativa var. IAC-18. El fragmento de ADΝ amplificado se clonó en el vector pBluescript II KS (Stratagene, USA), previamente digerido con la enzima de restricción HincII, (hacia la región 5 'del fragmento clonado se restituye el sitio HincII(SalI)) obteniendo los clones pBSatpB. Varios de los clones positivos fueron sometidos a secuenciación automática de ADN, seleccionándose un clon totalmente correcto. Mediante digestión HindIII-SalI (se restituye la secuencia original y se pierde el sitio Salí) y ligazón, se adicionó a la región 5' del clon seleccionado de atpB, un fragmento sintético de ADN que porta sitios de restricción adicionales y parte de la región 5'no traducible del gen atpB de arroz que contiene el promotor NEP (secuencia No.7), dando lugar al plasmidio pBSatpBcompleto. En este vector el gen atpB se transcribe en dirección HindIII-Xhol. La secuencia nucleotídica del borde-atpB construido se muestra en la secuencia No.8. c) Obtención del cásete de selección con bordes repetidos.
El fragmento de ADN de aproximadamente 1Kb que contiene el gen que codifica para la resistencia a higromicina (hgh) fue obtenido a partir del plasmidio pBSBar, mediante amplificación por PCR empleando los ohgonucleótidos descritos en las secuencias No.9 y No.10, que incorporan una región tipo Shine-Dalgarno 7 pb antes del inicio de traducción y sitios de restricción para facilitar la manipulación de este fragmento. El ADN amplificado fue digerido con Kpnl y clonado en el vector pUC19 previamente digerido con Smal (el sitio S al se conserva después de la ligazón) y Kpnl, para dar lugar al plasmidio pUC19Hyg. A continuación, después de digerir el plasmidio obtenido con HindlII y Smal, se introdujo un fragmento de ADN sintético conteniendo sitios de restricción que nos serán de utilidad para las manipulaciones genéticas y clonajes posteriores (secuencia No.11); el vector así obtenido fue nombrado pUC19-linker-Hyg.
El fragmento de ADN que fungirá como la región repetida que por recombinación homologa permitirá eliminar el gen marcador una vez obtenidas las plantas transplastómicas, fue obtenido de un fragmento de ADN que codifica para la proteína si 0 del fago T7 presente en el vector de expresión pET3xb (Novagen, USA). El vector pET3xb fue inicialmente digerido con BamHI-Ndel, y el fragmento de 780pb obtenido fue re-digerido con Taql/Klenow y Kpnl de forma tal que se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 3 lOpb que clonamos en el vector pUC19 previamente digerido con Smal y Kpnl, para obtener el plasmidio pUC- Spacer.
El fragmento del gen slO clonado en el pUC-Spacer fue escindido mediante digestión con Xbal/Klenow y Kpnl e introducido hacia el 3 'del gen hgh en el vector pUC19-linker-Hyg digerido con EcoRI/Klenow y Kpnl, para obtener el plasmidio pUC19-linker-Hyg-spacer. El segundo borde repetido clonado 5' al gen hgh se introdujo obteniendo el spacer mediante digestión del pUC-Spacer con EcoRJTKlenow y BamHI, e insertándolo en el pUC19-linker- Hyg-spacer previamente digerido con Smal y BglII, obteniendo el plas idio pUC-linker- spacer-Hyg-spacer. El terminador bidireccional rrnBTlT2 de E.coli se obtuvo mediante digestión con BspHI Mung bean nuclease y HindlII del vector pTrcHisB (Invitrogen, USA) y clonando la banda de 470pb en el pBluescript II SK digerido con Hindffl y Smal (pBS-rrnTlT2). Finalmente, mediante digestión con HindlII/Klenow y Xbal se escindió el fragmento de ADN conteniendo el terminador rrnBTlT2 del pBS-rrnTlT2 y se introdujo al vector pUC-linker- spacer-Hyg-spacer hacia el 3' del spacer que está a continuación del gen hgh, con digestión BamHI/Klenow y Xbal; así obtenemos la construcción pUC-linker-spacer-Hyg-spacer- rrnTlT2, de donde el cásete desde el linker hasta el terminador fue escindido mediante digestión HindIII-Xbal y clonado en el vector pBluescript II SK digerido con estas mismas enzimas de restricción para obtener el plásmido con el cásete de selección con bordes repetidos ρBS-linker-spacer-Hyg-spacer-rraTlT2 (secuencia No.12). d) Construcción del vector para la transformación estable y expresión de genes heterólogos en plastidios de plantas Angiospermas, pVTPA-f.
El vector para la transformación estable y expresión de genes heterólogos en plastidios de plantas Angiospermas que esta invención propone se ensambló paso a paso de la siguiente forma: el cásete de selección con bordes repetidos se escindió mediante digestión con Notl/Klenow y Salí del plasmidio pBS-linker-spacer-Hyg-spacer-rrnTlT2, y se insertó en el vector pBR322 previamente digerido con EcoRI Klenow y Salí para producir el plásmido pBR322-sρ-Hyg-sp-T; a continuación, el plásmido obtenido se digirió con BamHI/Klenow y Xbal y en él se inserto el borde-rbcL extraído de la construcción pBR322rbcLOK mediante digestión con HindlII/Klenow y Xbal conformándose el vector pBR-sp-Hyg-sp-T-rbcL; finalmente, el borde-atpB se escindió del plásmido pBSatpB completo mediante digestión con HindIII y Xhol y se clonó en la construcción pBR-sp-Hyg-sp-T-rbcL previamente digerido con HindIII y Salí. De esta forma obtenemos un vector con la estructura descrita en la Figura 1-B, al que llamamos pVTPA-f (ver mapa en la Figura 2) y cuya secuencia nucleotídica del fragmento de ADN clonado entre las posiciones +651 (sitio Salí) y +1 (sitio EcoRI) del vector receptor pBR322, se muestra en la secuencia No.13.
Por sus características, el vector pVTPA-f permite la transformación estable de plastidios de Angiospermas y la obtención de plantas transplastómicas que expresen las proteínas recombinantes codificadas por los genes clonados en él, siempre y cuando los mismos estén precedidos de secuencias de ADN que permitan la unión a los ribosomas y el inicio de la traducción. e) Vector pVTPA: variante del vector pVTPA-f que permite insertar y expresar en plastidios varios genes como unidades transcripcionales independientes. Una variante de vector para la transformación estable en plastidios y la expresión de varios genes como unidades transcripcionales independientes, se obtiene insertando dentro de los sitios de clonación del pVTPA-f una secuencia de ADN capaz de promover la transcripción en plastidios y secuencias terminadoras de la transcripción (ver Figura 1-E). Con este fin, y a modo de ejemplo, un fragmento sintético que codifica para el promotor de la subunidad 16S de los ARN ribosomales de plastidios (Prrn) (secuencia No. 14), y conteniendo sitios de clonación para facilitar las manipulaciones genéticas, fue insertado entre los sitios EcoRI y Smal del vector pBluescript II SK, para obtener el plásmido pBS-Prrn. Posteriormente, el fragmento de ADN conteniendo el promotor Prm fue escindido del pBS-Prrn mediante digestión con las enzimas HindlII y Mlul e insertado entre estos mismos sitios del vector pVTPA-f para dar lugar a la construcción pVTPA (ver Figura 3, y secuencia No.15).
Ejemplo No.2: Expresión de una unidad monocistrónica heteróloga en plantas transplastómicas de tabaco (pVTPA-f-GUS).
Para que utilizando el vector pVTPA-f se pueda expresar un gen heterólogo en plantas transplastómicas, es necesario que el mismo posea una región de unión a ribosomas (RBS) a distancia adecuada (5 a 15 pb) del codón de inicio de la traducción. Por esta razón, a fin de facilitar la clonación de genes en nuestro vector para la transformación y expresión de genes en plastidios, diseñamos un vector intermediario (pVTEP) que permite clonar en él el gen de interés y después escindirlo mediante digestión enzimática para insertarlo en el vector pVTPA-f (o pVTPA). El paso de clonación en el vector pVJEP ayuda a introducir un RBS al gen de interés, al mismo tiempo que permite adicionarle un terminador de la transcripción o promotor adicional para su expresión a partir del vector objeto de esta invención. Para construir el vector pNIEP, se clonó en el pBluescript II Sk digerido con EcoRI y Smal un fragmento sintético de ADΝ que porta el promotor del gen psbA de tabaco con parte de su región 5 'no traducible (entre la posición -68 y -25 a partir del inicio de traducción) delecionada para evitar el control de la traducción de este gen por la luz (PpsbA*, secuencia Νo.16). Así obtenemos el plásmido pBSPpsbA, al cual se le adicionó a continuación del promotor PpsbA , mediante digestión Νdel-Sacl ( el sitio Sacl se pierde después de este clonaje), un fragmento sintético que incluye un minicistrón (para estabilizar el rtVRΝA y favorecer la traducción del mismo) y proporciona un RBS y múltiples sitios para el clonaje de un gen en él (secuencia No.17). Al plásmido resultante se llamó pBSPpsbA-linker. El vector pVTEP se obtuvo finalmente insertando en el pBSPpsbA-linker digerido con BamHJ. y Stul el terminador de la transcripción T7 (Tφ) obtenido del plásmido pET3c (Novagen, USA) mediante digestión con BamHI y EcoRV. La secuencia No.18 se corresponde con la estructura primaria del vector pNIEP (entre el sitio Kpnl y el segundo sitio Salí), y su mapa se muestra en la Figura 4.
Una versión del vector intermediario pVTEP sin el promotor PpsbA y sin minicistrón se obtuvo por digestión del mismo con EcoRI/Mung bean nucleasa y SnaBI, y religando este plásmido para obtener la construcción pVIEP-2.
Para expresar una unidad monocistrónica heteróloga en plantas transplastómicas, el gen uidA (gus) se obtuvo del plásmido pDMC200 (CAMBIA) mediante digestión con Νcol y Smal, y fue clonado en el ρNEP-2 igualmente digerido para obtener el pVTEP-GUS; de este plásmido fue obtenida la secuencia que codifica para el gen uidA fusionada a un RBS mediante digestión con HindIII-Smal y clonada bajo el promotor rbcL de arroz en el vector para transformación de plastidios pVTPA-f digerido con Mlul/Klenow y HindIII. Esta construcción la llamamos pVTPA-f-GUS (secuencia Νo.19) que, mientras se mantenga la selección en las etapas de transformación, va a expresar el gen uidA e hgh como una unidad bicistrónica bajo el promotor rbcL de arroz; sin embargo, una vez que sea eliminado por recombinación el marcador de selección al cultivar las plantas transplastómicas en condiciones no selectivas, se mantendrá la expresión del gen uidA como una unidad monocistrónica. La funcionalidad de esta construcción se demostró obteniendo plantas transplastómicas de tabaco según la metodología que describimos a continuación: Se toman hojas de plantas de tabaco (var. SR1) de entre 4 a 6 semanas de crecidas in vitro y se colocan con el lado abaxial hacia arriba en medio de inducción de brotes (SI: Sales y Vitaminas MS (Murashige T., Skoog F. Physiol. Plant. 1962, 15:493-497), BAP lmg/L, ΝAA 0. lmg/L, Sacarosa 25g/L, Fitagel 4g/L, pH 5.7) con 0.4 M de manitol para un pre- tratamiento osmótico por 2 a 4h. Los microproyectiles para el bombardeo se preparan empleando partículas esféricas de oro de 0.6 μm (BioRad), según protocolo publicado (Russell D.R., Wallace K.M., Bathe J.H., y otros. Plant Cell Rep. 1993, 12:165-169). La transformación se realiza empleando el sistema PDS-1000/He de Biorad a una presión de 1100 psi, una distancia de disparo de 6 cm y un disparo por hoja. Las hojas bombardeadas se mantienen en el mismo medio iso-osmótico por 14 a 16 horas adicionales y posteriormente se pasan a medio SI por dos días. A continuación las hojas bombardeadas se cortan en fragmentos de 3x3 mm aproximadamente y se transfieren, con el lado abaxial hacia abajo, a medio SI con 5mg/L de Higromicina-B (Duchefa, Holanda). Los callos resistentes y brotes verdes aparecen entre las 6 y 8 semanas de cultivo; se separan del tejido muerto y se transfieren al mismo medio selectivo para un segundo y tercer ciclos de selección en concentraciones crecientes de Higromicina-B (lOmg/L y 15mg/L). Finalmente, los brotes resistentes obtenidos se pasan a medio MS (Sales y Vitaminas MS, Sacarosa 30g L, Fitagel 4g/L, pH 5.7) con Higromicina-B a 15 mg/L, para su desarrollo y enraizamiento. Todo el cultivo se realiza con un régimen de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad. La actividad GUS de algunos de los clones obtenidos resistentes a Higromicina fue analizada mediante ensayo histoquímico empleando X-Gluc según la metodología descrita por Jefferson (Jefferson R.A. Plant Mol. Biol. Rep. 1987, 5:387-405).
Los resultados de 3 experimentos de transformación y sus controles, se muestran en la Tabla 2
Tabla 2 Obtención de plantas transplastómicas con la construcción pVTPA-f-GUS.
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Adicionalmente, para algunos clones tomados al azar se demostró la integración del fragmento de ADN quimérico en el genoma de los cloroplastos mediante Southern blot (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2da edición. Cold Spring Habor Laboratory Press) de ADN de cloroplastos purificados por gradiente de sacarosa, digerido con Pst I y empleando como sonda marcada un fragmentop del gen rbcL (Figura 5). La banda de aproximadamente 6.8 Kb esperada en los clones positivos fue detectada en todos los clones anaüzados y no en el control sin transformar (donde se detectó la banda característica de 21.5 Kb); cuando algunos de estos clones fueron propagados sin el agente de selección en el medio de cultivo, se observó en el Southern blot que la talla de la banda de ADN que híbrida con la sonda marcada disminuye hasta 5.5 Kb, lo cual confirma la eliminación del gen marcador hgh por recombinación homologa entre las secuencias que lo rodean.
Algunos clones transplastómicos después de ser propagados se llevaron a macetas con tierra para obtener de ellos semillas mediante autocruces. Germinando las semillas obtenidas en medio MS sin y con Higromicina-B a 15mg/L, se demostró la eliminación del marcador de selección en estos clones, mientras que la actividad GUS se mantuvo invariable, por lo que también se confirmó la naturaleza homoplásmica de las plantas así obtenidas. En nuestros experimentos constatamos además, que a diferencia de lo observado cuando se emplea como marcador de selección la resistencia a Espectinomicina, no obtuvimos falsos transformantes al emplear Higromicina-B. Sin embargo, se hizo necesario establecer las concentraciones adecuadas del agente selectivo para poder recobrar las plantas transformadas.
Todos estos datos experimentales confirman la funcionalidad del vector objeto de la presente invención, y su utilidad para obtener plantas transplastómicas que expresen genes de interés cualesquiera que sea la fuente de los mismos.
Ejemplo No.3: Expresión bajo dos promotores de una unidad monocistrónica heteróloga en plantas transplastómicas de tabaco (pVTPA-aadA).
Utilizando el vector pVTPA es posible expresar en plastidios un gen bajo los promotores rbcL de arroz y Prm; para esto el gen que codifica para la amino-glicósido adenil-transferasa (aadA, confiere resistencia a los antibióticos estreptomicina, espectinomicina y otros) fue amplificado por PCR a partir del vector pDElOOl (Dpto. de Genética, Univ. de Gante Bélgica) utilizando los oligonucleótidos descritos en las secuencias No.20 y No.21. El producto de la reacción de PCR se clonó directamente en el vector pVTPA digerido con Xhol/Klenow bajo los dos promotores antes mencionados para dar lugar a la construcción pVTPA-aadA (secuencia No.22). La obtención de plantas transplastómicas de tabaco se reaüzó según la metodología descrita en el Ejemplo anterior (Ejemplo No.2), con la particularidad de que inicialmente se realizó la selección de los clones transplastómicos utilizando espectinomicina a 500 mg/L en el medio SI, y después estreptomicina a 500 mg/L durante el segundo ciclo de selección. En estos experimentos se realizaron transformaciones adicionales con el vector pVSR326MOD (CIIGB, Nueva Delhi, India) para obtener datos que nos permitan hacer comparaciones en cuanto a las frecuencias de obtención de plantas transplastómicas. El vector pVSR326MOD tiene clonado en la región entre los genes rbcL y accD de tabaco dos casetes de expresión que contienen el gen gus bajo la regulación del promotor psbA y el terminador de este mismo gen, y el gen aadA bajo el promotor Prrn y el terminador del gen rbcL. Los resultados de estas transformaciones después de dos rondas de regeneración/selección y tres sesiones de cultivo sin selección se muestran en la tabla 3 : Tabla 3. Comparación de la frecuencia de transformación entre el pVTPA-aadA y el pVSR326MOD.
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Los resultados experimentales obtenidos confirman nuestra hipótesis de que el vector objeto de esta invención tiene una mayor frecuencia de producción de plantas transplastómicas que otros vectores que portan múltiples secuencias de origen plastídico. Adicionalmente, demostramos la posibilidad que nos brinda el vector que proponemos para la expresión de un gen foráneo (en este caso el aadA) bajo dos promotores en tándem, rbcL y Prrn.
Ejemplo Νo.4: Expresión de una unidad bi-cistrónica heteróloga en plantas transplastómicas de tomate (pVTPA-f-GUS-aadA).
En el vector objeto de esta invención es posible expresar varios genes en forma de una unidad policistrónica. A modo de ilustración de esta posibilidad, introdujimos a continuación del gen gus en el vector pVTPA-f-GUS (Ejemplo Νo.2) el gen aadA para formar una unidad tri- cistrónica (considerando que el gen marcador hgh también será expresado como parte del ARΝm producido a partir del promotor rbcL), que después de permitir la eliminación del marcador de selección al ser obtenidas las plantas transplastómicas homoplásmicas expresará en ellas la β-glucuronidasa y la amino-glicósido adenil-transferasa . El gen aadA fue amplificado mediante PCR como se describe en el Ejemplo No.3, y clonado en el sitio Apal del plásmido pVTPA-f-GUS, para dar lugar al vector pVTPA-f-GUS-aadA (secuencia No.23). Este nuevo vector fue empleado para obtener plantas transplástomicas de tomate según la metodología descrita a continuación: Semillas de tomate de la variedad Campbell-28 se esterilizaron con hipoclorito de sodio al 10% por 15 minutos, y después se lavaron con abundante agua destilada estéril. Las semillas fueron germinadas por 12 días en el medio MSO (Sales de MS; Vitaminas B5 de Gamborg; 30 g L Sacarosa; 8 g/L Fitoagar; pH 5.8) diluido a la mitad, y las hojas cotiledonales fueron colectadas en medio MSO líquido y cultivadas con el lado abaxial hacia abajo en una placa con medio sólido MSO + lmg/L de zeatina con 0.4 M de manitol para un pre-tratamiento osmótico por 4h. Los microproyectiles para el bombardeo se prepararon empleando partículas esféricas de oro de 0.6 μm y la transformación se realiza empleando el sistema PDS-1000/He de Biorad a una presión de 1100 psi, una distancia de disparo de 6 cm y un disparo por placa. Los cotiledones bombardeados se mantienen en el mismo medio iso-osmótico por 14 a 16 horas adicionales y posteriormente se pasan a medio MSO + zeatina por dos días con el lado abaxial hacia arriba. A continuación los cotiledones bombardeados se transfieren, con el lado abaxial hacia arriba, a medio MSO + zeatina con 5mg L de Higromicina-B (Duchefa, Holanda). Los callos resistentes y brotes verdes aparecen entre las 3 y 6 semanas de cultivo; se separan del tejido muerto y se transfieren al mismo medio selectivo para un segundo ciclo de selección a concentración de lOmg/L de Higromicina-B. Después de otras 3-4 semanas, los brotes y callos resistentes se pasan para su desarrollo a medio MSO + 0.1 mg/L de zeatina (con Higromicina-B a 15 mg/L), y 3 semanas más tarde a medio MSO + higromicina para su enraizamiento. Todo el cultivo se realiza con un régimen de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad. La resistencia a 500 mg/L de Espectinomicina (Spc1), así como la expresión del gen GUS (mediante ensayo histoquímico), fue evaluada en los clones obtenidos. Los resultados de tres experimentos de transformación se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 4. Obtención de plantas transplastómicas de tomate con la construcción pVTPA-f- GUS-aadA.
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Al cultivar las plantas en tierra, no observamos diferencias fenotípicas entre nuestras plantas transplastómicas y plantas no manipuladas de tomate, por lo que confirmamos la funcionalidad de la proteínas atpB y rbcL híbridas, y la factibilidad de manipular genéticamente las mismas como vía para mejorar la actividad metabólica de los plastidios. El presente ejemplo ilustra no solo la potencialidad del vector por nosotros desarrollado para expresar varios genes como parte de un mismo ARNm, sino además, confirma la universalidad de los vectores objeto de esta invención como vehículo para la obtención de clones transplastómicos de plantas Angiospermas diferentes de las plantas donantes de las secuencias empleadas como bordes para la integración del ADN heterólogo en el genoma de los plastidios.
Ejemplo No.5: Expresión de dos unidades transcripcionales independientes en plantas transplastómicas de tabaco (pVTPA-HB-aadA). Obtención de plantas transplastómicas que expresan un antígeno vacunal multimérico.
El gen que codifica para el antigeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) (Valenzuela P; Gray P; Quiroga M; Zaldivar J; Goodman H.M; Rutter W.J. Nature 1979, 280:815-819) se obtuvo del plásmido pSAO503 (CIGB, Cuba) mediante digestión con EcoRI/Klenow y Ncol, y se introdujo en el vector ρVIEP-2 (ver Ejemplo No.2) digerido con Ncol y Smal, para colocarle un sitio de unión a ribosomas ante el codón de inicio de la traducción. De esta forma obtuvimos el plásmido pVIEP-2-HB, de donde la banda de aproximadamente 820 pb conteniendo el gen que codifica para el antígeno de superficie de la hepatitis B se obtuvo mediante digestión con Xhol y se clonó en el vector pVTPA-aadA (ver Ejemplo No.3) digerido con Salí. Un clon con el gen HBsAg clonado en orientación correcta bajo el promotor de rbcL de arroz, y que además expresa los genes marcadores aadA e hgh bajo el promotor Prrn, se denominó pVTPA-HB-aadA (Secuencia No.24).
El vector pNTPA-HB-aadA se utilizó para obtener plantas transplastómicas de tabaco que expresan el antigeno de superficie de la hepatitis B, mediante el protocolo de transformación descrito en el Ejemplo Νo.2. La selección de los clones transplastómicos se realizó inicialmente con Higromicina-B (lOmg/L) y al final fue chequeada la resistencia de los mismos a Espectinomicina (500mg/L), y la expresión del HBsAg mediante un ensayo tipo ELISA específico (C.I.G.B, Cuba), y Western blot (Figura 6). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 5: Tabla 5. Obtención de plantas transplastómicas de tabaco con la construcción pVTPA-HB- aadA.
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Nuestros resultados confirman la utilidad del vector objeto de esta invención para expresar dos o más genes como unidades transcripcionales independientes en el genoma de las plantas transplastómicas. Adicionalmente, se confirma la utilidad de este vector para expresar en plastidios genes que codifican para proteínas útiles, formen estas complejos multiméricos o no. En particular logramos expresar el antígeno multimérico de superficie del virus de la hepatitis B. Es obvio que lo aquí ejemplificado es aplicable a otros antigenos vacunales, y que los mismos, una vez expresados en las células vegetales, pueden ser formulados como preparaciones capaces de inducir inmunidad contra estos patógenos al ser administradas al hombre o a animales. Otras proteínas multiméricas que pudieran ser expresadas mediante este vector serían las inmunoglobulinas.
Ejemplo No.6: Expresión de un gen heterólogo en plastidios bajo dos promotores y un minicistrón (pVTPA-GUSl-aadA y ρVTPA-GUS3-aadA).
El vector intermediario para la clonación y expresión de genes en los vectores objetos de esta invención, pVCEP (ver Ejemplo No.2), permite clonar en él un gen bajo el promotor PpsbA y un minicistrón diseñado para aumentar la estabilidad y promover la traducción de los ARNm producidos. En este vector se clonó en gen uidA tal y como se describe en el Ejemplo No.2 para obtener el plásmido pVTEP-GUSl.
Para comprobar la funcionalidad del minicistrón, se realizó una construcción genética en la cual el minicistrón fue eliminado del pVTEP mediante digestión Ndel + SnaBI, tratamiento con nucleasa SI y recircularización del plasmidio para obtener el vector pVIEP-3, donde se clonó el gen uidA de la manera anteriormente descrita dando lugar a plásmido pVTEP-GUS3. Ambos casetes conteniendo el gen gus fueron obtenidos de los vectores intermediarios por digestión con HindIII y clonados en el vector pVTPA-aadA igualmente digerido. Las construcciones finalmente obtenidas que contienen el gen gus bajo los promotores rbcL de arroz y PpsbA , se denominaron pVTPA-GUSl-aadA y pVTPA-GUS3-aadA respectivamente, y con ellas se procedió a transformar plantas de tabaco según el protocolo descrito en el Ejemplo No.2.
Plantas transplastómicas fueron obtenidas con ambas construcciones, y se procedió a comparar los niveles de expresión GUS de 5 clones de cada una de ellas por el método fluorimétrico empleando 4-MUG según la metodología descrita por Jefferson (Jefferson R. A.
Plant Mol. Biol. Rep. 1987, 5: 387-405). Los resultados se muestran en la tabla 6:
Tabla 6. Expresión del gen uidA en plastidios de tabaco bajo dos promotores y un minicistrón.
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Como se muestra en la tabla anterior, se obtienen altos valores de actividad GUS en ambas construcciones que expresan el gen uidA bajo los promotores en tándem rbcL de arroz y PpsbA* (promotor psbA modificado). Adicionalmente se evidenció que los valores promedios de la actividad GUS en las plantas transformadas con la construcción que contiene el minicistrón (pVTPA-GUSl-aadA) son significativamente superiores, por lo que se demuestra la funcionalidad de este elemento genético en los plastidios y su utilidad como herramienta que permite incrementar la expresión de los genes en estos organelos celulares. Ejemplo No.7: Obtención de plantas transplastómicas de arroz con la construcción pNTPA-f- GUS-aadA
Plantas transplastómicas de arroz fueron obtenidas de forma repetible empleando la siguiente metodología: Se utilizan callos embriogénicos (21 días) formados en medio N6-2 ( Sales y vitaminas del medio N6 (Chu C.C; y otros. Scientia Sinicl975, 18:659); O.lg/L de mio-inositol; Hidrolizado de caseína 1 g/L; 2,4 D a 2mg L; Sacarosa 30g/L; Fitagel 3 g L, pH 5.7) a partir de semillas maduras de arroz. Estos callos se subcultivan 5 días en medio fresco N6-2 y posteriormente se pasan a medio N6-2 con 3mg/L de kinetina por 48-72 horas en la oscuridad. Antes del bombardeo los callos se subcultivan en el mismo medio suplementado con 0.4 M de manitol para el pre- tratamiento osmótico. Para el disparo se colocan 30 callos en el centro de la placa para ser bombardeados con las siguientes condiciones (1100 psi de presión, 6cm de distancia, partículas de oro de 0.6 μm cargadas con el plasmidio pVTPA-f- GUS-aadA y un disparo por placa). Después del disparo los callos permanecen en el mismo medio osmótico por 16h en la oscuridad y a continuación se subcultivan 2 días en medio N6- 2 sin manitol en las mismas condiciones. Seguidamente, los callos son transferidos a medio N6-2 con 20 mg/L de Higromicina-B. A los 10 días, los callos capaces de crecer en presencia del antibiótico son transferidos al mismo medio fresco para un segundo ciclo de selección por 10 días. Finalmente, los callos resistentes se pasan a medio de regeneración KIBAN modificado (Sales y vitaminas del medio MS; Kinetina 3 mg/L; BAP 0.5 mg/L; NAA 1 mg/L; Maltosa 30 g/L; pH5.7; Fitagel 4.5 g/L) más 30 mg/L de Higromicina-B, y los brotes verdes de aproximadamente 2 cm obtenidos después de 3-4 semanas de cultivo en régimen de 16h luz y 8h oscuridad, se pasan a un ciclo de micropropagación en medio MS líquido modificado (Sales y vitaminas del medio MS; Sacarosa 30 g/L; BAP 5mg/L, pH 5.7) con 20mg/L de Higromicina. Los brotes se colocan en erlenmeyers con 50 mi de dicho medio y se incuban en agitación a 150 rpm a 28 °C con un foto período de 16 h luz y 8 h de oscuridad. Se obtienen aproximadamente 7 brotes axilares por explante al cabo de 7 días, los cuales se pasan a enraizar en medio MS sólido más 30 g/L de Sacarosa y 30 mg/L de Higromicina-B.
En los clones trasplastómicos obtenidos se evaluó la resistencia a Espectinomicina (a 500 mg/L), así como la expresión del gen gus (mediante ensayo histoquímico). Adicionalmente se comprobó que el pre-tratamiento de las células a bombardear con citoquininas, aumenta significativamente la frecuencia de obtención de plantas transplastómicas. Los resultados de estos experimentos de transformación se muestran en la siguiente tabla 7:
Tabla 7. Obtención de plantas transplastómicas de arroz (var. IAC-28) con la construcción pVTPA-f-GUS-aadA con y sin emplear pre-tratamiento con citoquininas (kinetina a 3 mg/L).
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El presente ejemplo confirma mediante la transformación de una especie monocotiledónea, la universalidad y funcionalidad de los vectores objetos de esta invención. Ejemplo No.8: Obtención de plantas transplastómicas de caña de azúcar con la construcción pVTPA-f-GUS-aadA.
La obtención de plantas transplastómicas de caña de azúcar se realizó según el siguiente protocolo: Se toman los cogollos de plantas de campo de caña de azúcar (var. Ja60-5) de 6 meses de edad, se desinfectan con etanol al 70% por 1 minuto y luego por 10 minutos en hipoclorito de sodio al 10%, se lavan abundantemente con agua destilada estéril. Se aislan segmentos de 0.5xlcm de la base de las hojas jóvenes y se cultivan a la luz en medio sólido P+5 (lOOmg/L de mio-Inositol; 500mg/L de Hidrolisado de caseína; Sales y Vitaminas MS; Sacarosa 20g/L; 5mgL de 2,4D; Fitagel 4g/L; pH 5.7) con 3 mg/L de kinetina por 48 horas, seguido de un cultivo en el mismo medio con 0.4 M de Manitol por 6-8h, a la luz. Se bombardea empleando partículas esféricas de oro de 0.6 μm cargadas con el plásmido pVTPA-f-GUS-aadA, empleando el sistema PDS-1000 He de Biorad a una presión de 1100 psi, una distancia de disparo de 6 cm y un disparo por hoja. Los explantes bombardeados se mantienen en el medio P+5 iso-osmótico por 24 horas adicionales a la oscuridad, y posteriormente se pasan a medio P+5 por dos días, para después continuar su cultivo a la oscuridad en medio P+5 con Higromicina-B a 15mg/L. Callos resistentes a Higromicina aparecen a las 4 semanas de cultivo y se pasan a regenerar a la luz en medio sólido P- (igual al P+5 pero sin 2,4D) con Higromicina-B. Los brotes regenerados se individualizan después de 4-6 semanas de cultivo y se pasan a enraizar en medio P- con el agente selectivo a 20 mg/L. La resistencia a Espectinomicina (a 500 mg/L), así como la expresión del gen gus (mediante ensayo histoquímico), fue evaluada en los clones obtenidos. Los resultados de dos experimentos de transformación se muestran en la siguiente tabla 8:
Tabla 8. Obtención de plantas transplastómicas de caña de azúcar con la construcción pNTPA-f-GUS-aadA.
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El presente ejemplo confirma nuevamente, esta vez mediante la transformación de una especie monocotiledónea, la universalidad de los vectores objetos de esta invención como vehículo para la obtención de clones transplastómicos de plantas Angiospermas diferentes de las plantas donantes de las secuencias empleadas como bordes para la integración del ADN heterólogo en el genoma de los plastidios.
Ejemplo No.9. Obtención de plantas transplastómicas con caracteres agronómicos deseables. La obtención de plantas transplastómicas con nuevos caracteres agronómicos incorporados es fundamental para la lucha contra enfermedades, plagas y malezas, el incremento de los rendimientos, la disminución de los costos y mejores cualidades de los productos, sin que exista el peligro de que escapen al ambiente de los nuevos genes introducidos. El gen pat (bar) de Streptomyces hygroscopicus (Thompson C.J; Movva N.R; Tizard R; Crameri R; Davies J.E; y otros. EMBO Journal 1987, 6:2519-2523) que codifica para la fosfinotricina (ingrediente activo del herbicida BASTA™) acetil transferasasa, fue obtenido a partir del plásmido pBS-Bar (C.I.G.B.) mediante digestión Xbal/Sl nucleasa y BamHI y se clonó en el vector pVIEP-2 (Ejemplo No.2) digerido con Ncol/ SI nucleasa y BamHI, para obtener el plásmido pVTEP2-Bar que fue posteriormente digerido con Xhol, y el fragmento de ADN de aproximadamente 670 pb conteniendo el gen pat con un RBS se insertó en el vector pVTPA digerido con Xhol para obtener la construcción pVTP A-Bar (secuencia No.25). Las plantas transplastómicas de tabaco fueron obtenidas según la metodología descrita en el Ejemplo No.2 realizando la selección con 5 mg/L de fosfinotricin (Duchefa, Holanda) en el medio de cultivo. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla 9.
Tabla 9. Obtención de plantas transplastómicas de tabaco resistentes a herbicida con la construcción pVTP A-Bar.
Figure imgf000029_0002
Es obvio que el clonaje y expresión en los vectores objeto de esta invención de otros genes que confieran resistencia a herbicidas, como el glifo sato, asulam, sulfonilureas, imidazolinonas y bromoxinil, por ejemplo, producirán plantas transplastómicas resistentes a estos productos químicos. Igualmente, es obvio que con el empleo del vector objeto de esta invención es factible introducir y expresar en las plantas transplastómicas genes que confieran resistencia a plagas y enfermedades, como por ejemplo los genes que codifican para los cristales proteicos entomocidas de Bacillus thuringiensis; o para proteínas con actividad antimicrobiana como quitinasas y glucanasas; o anti-stress abióticos como colina oxidasa. La modificación o introducción de genes que aumenten la eficiencia del proceso fotosintético, o la calidad de los productos vegetales, son otras de las muchas acciones factibles de realizar con el empleo del vector universal para la transformación de plastidios de Angiospermas que aquí se propone. Ejemplo No.10: Expresión de proteínas de utilidad no agronómica en plastidios. En el Ejemplo No.5 demostramos la utilidad del vector que aquí proponemos para establemente introducir y expresar en plastidios de plantas Angiospermas genes que codifican para proteínas multiméricas. Otras proteínas de uso médico, veterinario o industrial son igualmente factibles de ser producidas en plantas transplastómicas mediante el empleo de nuestro sistema de vectores de transformación/expresión. Para expresar en cloroplastos el agente fibrinohtico estreptoquinasa, de gran utilidad terapéutica para el tratamiento de trombosis e infartos del miocardio, el fragmento de ADN de 1254 pb que codifica para la proteína madura SKC-2 de Streptococcus fue escindido del vector pEKG-3 (Estrada M.P; Hernández L; Pérez A; Rodríguez P; Serrano R; Rubiera R; Pedraza A; y otros. Bio/Technology 1992, 10:1138-1142) mediante digestión con EcoRI, tratamiento con nucleasa SI y finalmente digestión con BamHI, e insertado en el vector intermediario pVIEP (ver Ejemplo No.2) previamente digerido con Ncol, tratado con SI nucleasa y digerido con BamHI. A partir del plásmido obtenido, pVIEP-Estrep, se obtuvo por digestión Salí + Xhol el cásete para la expresión del gen de la estreptoquinasa en plastidios bajo el promotor PpsbA y el minicistrón; este cásete se clonó en el vector pVTPA (ver Ejemplo No.1) digerido con Salí y Xhol para obtener el plasmidio pVTPA-Estrep (Secuencia No.26).
Con el vector pVTPA-Estrep se procedió a transformar plantas de tabaco según el protocolo descrito en el Ejemplo No.2, los resultados se muestran en la tabla 10 (la actividad fibrinolítica de la estreptoquinasa producida en un grupo de clones se determinó mediante la Técnica de placa caseína/plasminógeno (Estrada M.P; Hernández L; Pérez A; Rodríguez P; Serrano R; Rubiera R; Pedraza A; y otros. Bio/Technology 1992, 10:1138-1142). Tabla 10. Expresión de Estreptoquinasa en plastidios de tabaco.
Figure imgf000031_0001
Estos resultados confirman la utilidad de los vectores objeto de esta invención para expresar en plastidios genes que codifican para proteínas útiles, y en particular proteínas de uso farmacéutico o veterinario como trombolíticos, interferones, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, antígenos, receptores celulares u otras. Es obvio que lo aquí ejemplificado es aplicable también a la expresión en plastidios, empleando los vectores de transformación/expresión descritos en el presente documento, de otros tipos de enzimas y proteínas de uso industrial como lipasas, proteasas, etc.
Ejemplo No.11 : Expresión de in unoglobulinas en plastidios. El fragmento de ADN que codifica para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal CB-Hep.l específico contra el HBsAg fueron obtenidas mediante digestión Ncol - Xbal de los plasmidios pHESΩHBsAgCL y pHESΩHBsAgCH (Nadia Ramírez, "Tabaco (Nicotiana tabacum L.) transgénico: un sistema para la producción de un anticuerpo anti- HBsAg y de sus fragmentos", Tesis de doctorado, C.I.G.B., 2002) e insertadas en el vector pNTEP digerido con estas mismas enzimas para obtener los plásmidos pVEEP-Hc y pVTEP- Lc. A continuación, el fragmento que codifica para la cadena ligera fue escindido del pVEEP- Lc mediante digestión SnaBI - BamHJ, e insertado a continuación del que codifica para la cadena pesada en el plásmido pVIEP-Hc por digestión con Smal - BamHI, para obtener la construcción bicistrónica pVJEP-HcLc, de donde ambos genes fueron finalmente introducidos en el vector para la transformación de plastidios de Angiospermas pVTPA-f mediante digestión HindIII; así, después de buscar el clon con la orientación correcta, se obtuvo el plásmido pVTPA-HcLc que fue introducido a plastidios de tabaco al igual que se describió en el Ejemplo Νo.2. Las plantas transplastómicas obtenidas fueron anaüsadas por Western blot para detectar la presencia de ambas cadenas del anticuerpo CB-Hep. l (Figura 7), y adicionalmente se demostró la funcionalidad de la inmunoglobulina recombinante obtenida empleando un extracto de las plantas transplastómicas para detectar la presencia del HBsAg en un ELISA que se reveló con un policlonal de conejo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcaüna. De esta forma, a la vez que demostramos la posibilidad de obtener con nuestros vectores de transformación/expresión anticuerpos completamente funcionales en las plantas transplastómicas, reafirmamos la posibihdad de expresar y ensamblar correctamente proteínas multiméricas en plástidios.

Claims

REIVINDICACIONES
1) Un vector de ADN útil para la transformación estable y expresión de genes en plastidios, donde el gen a expresar se introduce en una región intergénica artificial formada por la combinación de dos regiones 5' no traducibles de genes que se transcriben en direcciones divergentes y pertenecientes a plantas de divisiones o clases diferentes.
2) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 1, útil para lograr una alta frecuencia de transformación estable y expresión de genes en plastidios de plantas Angiospermas, con las siguientes características: a) contiene una región intergénica artificial donde es posible insertar secuencias de ADN que codifican para un polipéptido, bajo señales apropiadas para su transcripción y traducción en plastidios empleando secuencias terminadoras de la transcripción de origen no plastídico, b) la región intergénica artificial está flanqueada por dos genes que se transcriben de forma natural en el genoma de los plastidios en direcciones opuestas, y cuyas secuencias nucleotídicas son idénticas a secuencias codificantes de los genes atpB y rbcL pertenecientes a plastidios de plantas Angiospermas de clases diferentes. c) la región intergénica artificial se compone de: secuencias 5' reguladoras de la transcripción y traducción de los genes atpB y rbcL; sitios de restricción para la inserción de genes de interés seguidos de un terminador de origen no plastídico; y de una segunda región 5' reguladora de la transcripción y traducción de un gen rbcL perteneciente a plastidios de Angiospermas de una clase diferente a la anterior.
3) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 2, que contenga una secuencia nucleotídica flanqueante homologa a la secuencia del gen plastídico rbcL de tabaco o arroz.
4) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 3, donde la secuencia homologa al gen rbcL comprende al menos un fragmento de la secuencia de nucleótidos que abarca desde la posición -291 de la secuencia nucleotídica que codifica para esta proteína en plastidios de tabaco, hasta la posición +1233 a partir del codón de inicio de traducción de este gen.
5) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 4 cuya secuencia flanqueante homologa al gen rbcL comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 4. 6) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 2, que contenga una secuencia nucleotídica flanqueante homologa a la secuencia del gen plastídico atpB de arroz o tabaco.
7) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 6, donde la secuencia homologa al gen atpB comprende al menos un fragmento de la secuencia de nucleótidos que abarca desde la posición -654 de la secuencia nucleotídica que codifica para esta proteína en plastidios de arroz, hasta la posición +1211 a partir del codón de inicio de traducción de este gen.
8) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 7 cuya secuencia flanqueante homologa al gen atpB comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 8.
9) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 2, donde el terminador de la transcripción de origen no plastídico presente en la región intergénica artificial sea el terminador bidireccional rmBTlT2 u otro homólogo a este.
10) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 2, que contenga insertado en la región intergénica artificial un gen que permita la selección de las plantas transplastómicas.
11) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 10, donde el gen que permite la selección puede ser eliminado mediante recombinación homologa entre secuencias de ADN repetidas que se encuentran a ambos extremos del gen. 12) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 11, donde el gen que permite la selección codifica para una proteína que permite a la célula vegetal sobrevivir en presencia de un compuesto antimicrobiano.
13) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 12, donde el compuesto antimicrobiano en cuestión pertenezca al grupo de los amino-glicósidos. 14) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 13, donde el compuesto antimicrobiano sea la Higromicina-B.
15) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 13, donde el compuesto antimicrobiano sea la Espectinomicina.
16) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 12, donde el compuesto antimicrobiano en cuestión pertenezca al grupo de las sulfonamidas.
17) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 16, donde el compuesto antimicrobiano sea la sulfadiazina. 18) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 10, donde el gen que permite la selección codifica para una proteína que permite a la célula vegetal sobrevivir en presencia de un compuesto herbicida.
19) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 18, donde el compuesto herbicida en cuestión pertenezca al grupo de los inhibidores de la glutamina sintetasa.
20) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 19, donde el compuesto herbicida sea el glufosinato (fosfinotricina).
21) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 19, donde el compuesto herbicida sea el bialaphos. 22) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 18, donde el compuesto herbicida en cuestión pertenezca al grupo de los inhibidores de la 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS).
23) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 22, donde el compuesto herbicida en cuestión sea el glifosato (N-fosfometil glicina). 24) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 18, donde el compuesto herbicida en cuestión pertenezca al grupo de los inhibidores de la ruta de síntesis del folato.
25) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 24, donde el compuesto herbicida en cuestión sea el asulam (metil-(4-aminobencenosulfonil)-carbamato).
26) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 18, donde el compuesto herbicida en cuestión pertenezca al grupo de los inhibidores de la acetolactato sintasa.
27) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 26, donde el compuesto herbicida en cuestión sea una sulfonilurea.
28) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 26, donde el compuesto herbicida en cuestión sea una imidazolinona. 29) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 18, donde el compuesto herbicida en cuestión pertenezca al grupo de los inhibidores del fotosistema II.
30) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 29, donde el compuesto herbicida en cuestión sea el bromoxinil (3,5-dibromo-4-hidroxibenzonitrilo).
31) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 10, donde el gen que permite la selección codifica para una proteína que permite a la célula vegetal sobrevivir en presencia de un compuesto tóxico. 32) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 31, donde el compuesto tóxico en cuestión sea la betaína aldehido.
33) Un vector de ADN de acuerdo a las reivindicaciones de la 1 a la 8, que responda a la estructura general descrita en la Figura 1 -A o variantes de la misma. 34) Un vector de ADN de acuerdo a las reivindicaciones de la 1 a la 11, que responda a la estructura general descrita en la Figura 1-B o variantes de la misma.
35) Un vector de ADN de acuerdo a las reivindicaciones de la 1 a la 11, que responda a la estructura general descrita en la Figura 1 -C o variantes de la misma.
36) Un vector de ADN de acuerdo a las reivindicaciones de la 1 a la 11, que responda a la estructura general descrita en la Figura 1-D o variantes de la misma.
37) Un vector de ADN de acuerdo a las reivindicaciones de la 1 a la 11, que responda a la estructura general descrita en la Figura 1-E o variantes de la misma.
38) Un vector de ADN de acuerdo a las reivindicaciones de la 1 a la 11, que responda a la estructura general descrita en la Figura 1 -F o variantes de la misma. 39) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 2, que presente en la segunda región 5' no traducible del gen rbcL una secuencia funcionalmente homologa al sitio de unión del represor lacl de Escherichia coli.
40) Un vector de ADN que presente 5' al inicio de traducción del gen rbcL una secuencia de ADN que permita la represión de la transcripción de este gen en condiciones de no inducción, de forma tal que facilite el mantenimiento y multiplicación del vector en un hospedero cualquiera.
41) Un vector de ADN de acuerdo a la reivindicación 40, que presente en la región 5' no traducible del gen rbcL una secuencia funcionalmente homologa al sitio de unión del represor lacl de Escherichia coli. 42) Un vector de ADN según la reivindicación 41, donde la secuencia nucleotídica del operador del operón lactosa de Escherichia coli se corresponda al menos en parte a la secuencia destacada en la secuencia SEQ. ID. NO: 3
43) Un vector de ADN según las reivindicaciones de la 1 a la 11, que contenga insertado en la región intergénica artificial una o más unidades transcripcionales monocistrónicas o policistrónicas bajo uno o más promotores funcionales en plastidios. 44) Un vector de ADN según las reivindicaciones de la 12 a la 17, que contenga insertado en la región intergénica artificial una o más unidades transcripcionales monocistrónicas o policistrónicas bajo uno o más promotores funcionales en plastidios.
45) Un vector de ADN según las reivindicaciones de la 18 a la 38, que contenga insertado en la región intergénica artificial una o más unidades transcripcionales monocistrónicas o policistrónicas bajo uno o más promotores funcionales en plastidios.
46) Un vector de ADN según las reivindicaciones 43, 44 ó 45, donde al menos uno de los promotores funcionales en plastidios sea uno de los promotores rbcL de la región intergénica artificial. 47) Un vector de ADN según la reivindicación 46, donde uno de los promotores funcionales en plastidios es el promotor rbcL de arroz comprendido en la secuencia SEQ. ID. NO: 8.
48) Un vector de ADN según las reivindicaciones 43, 44 ó 45, donde al menos uno de los promotores funcionales en plastidios sea el promotor psbA* comprendido en la secuencia SEQ. ID. NO: 16 o variantes de la misma.
49) Un vector de ADN según la reivindicación 48, donde un minicistrón se encuentre funcionalmente ligado al promotor psbA*.
50) Un vector de ADN según la reivindicación 49, donde el minicistrón posea una secuencia nucleotídica homologa a la secuencia destacada en la secuencia SEQ. ID. NO: 17 o variantes de la misma.
51) Un vector de ADN para la introducción y expresión estable de genes en plastídios que utilice un minicistrón para aumentar la expresión de los genes introducidos a las células transplastómicas .
52) Un vector de ADN según las reivindicaciones 43, 44 ó 45, donde al menos un gen de interés agrícola, veterinario, farmacéutico, alimentario o industrial sea componente de una de las unidades transcripcionales presentes en el vector.
53) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés agrícola codifique para una proteína con actividad insecticida.
54) Un vector de ADN según la reivindicación 53, donde la proteína insecticida pertenezca a la familia de las proteínas Cry de Bacillus thuringiensis.
55) Un vector de ADN según la reivindicación 53, donde la proteína insecticida sea un inhibidor de proteasas. 56) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés agrícola codifique para un polipéptido con actividad anti-microbiana.
57) Un vector de ADN según la reivindicación 56, donde el polipéptido con actividad anti-microbiana pertenezca a uno de los grupos de las proteínas vegetales relacionadas con la patogenicidad (PR-proteínas).
58) Un vector de ADN según la reivindicación 57, donde la PR-proteína en cuestión sea una glucanasa.
59) Un vector de ADN según la reivindicación 57, donde la PR-proteína en cuestión sea una quitinasa. 60) Un vector de ADN según la reivindicación 57, donde la PR-proteína en cuestión sea una proteína tipo-taumatina.
61) Un vector de ADN según la reivindicación 56, donde el polipéptido en cuestión sea una proteína inactivadora de ribosomas (RIP).
62) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés agrícola codifique para una proteína que confiera resistencia a estrés abióticos.
63) Un vector de ADN según la reivindicación 62, donde la proteína en cuestión tenga actividad colina oxidasa.
64) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés agrícola codifique para una proteína que contribuya a aumentar el rendimiento productivo de la planta donde este se exprese.
65) Un vector de ADN según la reivindicación 64, donde la proteína en cuestión esté involucrada en el mejoramiento de la capacidad fotosintética de la planta.
66) Un vector de ADN según la reivindicación 65, donde la proteína en cuestión tenga actividad fructosa- 1,6 bifosfatasa (FBPasa). 67) Un vector de ADN según la reivindicación 65, donde la proteína en cuestión tenga actividad protoporfirinogeno oxidasa (PROTOX).
68) Un vector de ADN según la reivindicación 65, donde la proteína en cuestión tenga actividad ribulosa bifosfato carboxilasa (RUBISCO).
69) Un vector de ADN según la reivindicación 65, donde la proteína en cuestión participe directa o indirectamente en el proceso de fijación de carbono de la planta donde se exprese. 70) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés agrícola codifique para una proteína que contribuya a aumentar la conservación post-cosecha de los productos de la planta donde este se exprese.
71) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés alimentario codifique para una proteína que contribuya a mejorar la calidad nutricional de los productos de la planta donde este se exprese.
72) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés veterinario o farmacéutico codifica para una citoquina.
73) Un vector de ADN según la reivindicación 72, donde la citoquina pertenezca a la familia de los interferones.
74) Un vector de ADN según la reivindicación 72, donde la citoquina pertenezca a la familia de las interleucinas.
75) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés veterinario o farmacéutico codifica para un polipéptido con actividad moduladora de la respuesta inmune.
76) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés veterinario o farmacéutico codifica para un polipéptido con actividad hormonal.
77) Un vector de ADN según la reivindicación 76, donde el polipéptido con actividad hormonal sea la insulina. 78) Un vector de ADN según la reivindicación 76, donde el polipéptido con actividad hormonal sea una hormona de crecimiento.
79) Un vector de ADN según la reivindicación 76, donde el polipéptido con actividad hormonal sea una hormona somatotrópica.
80) Un vector de ADN según la reivindicación 76, donde el polipéptido con actividad hormonal sea una hormona gonadotrópica.
81) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés veterinario o farmacéutico codifica para un factor de proliferación celular.
82) Un vector de ADN según la reivindicación 81, donde el factor de proliferación celular sea el factor de crecimiento epidérmico (EGF). 83) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés veterinario o farmacéutico codifica para un polipéptido con actividad hematopoyética. 84) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés veterinario o farmacéutico codifica para un receptor celular.
85) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés veterinario o farmacéutico codifica para un inhibidor de proteasas. 86) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés veterinario o farmacéutico codifica para un polipéptido con actividad trombolítica.
87) Un vector de ADN según la reivindicación 86, donde el polipéptido en cuestión es la estreptoquinasa.
88) Un vector de ADN según la reivindicación 86, donde el polipéptido en cuestión es el activador tisular del plasminógeno (t-PA).
89) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés veterinario o farmacéutico codifica para un antígeno vacunal.
90) Un vector de ADN según la reivindicación 89, donde el antígeno vacunal pertenezca a un virus. 91) Un vector de ADN según la reivindicación 90, donde el antígeno vacunal pertenezca a un virus de hepatitis.
92) Un vector de ADN según la reivindicación 91, donde el antígeno vacunal sea el antígeno de superficie de la hepatitis B.
93) Un vector de ADN según la reivindicación 91, donde el antígeno vacunal pertenezca al virus de la hepatitis A.
94) Un vector de ADN según la reivindicación 91, donde el antígeno vacunal pertenezca al virus de la hepatitis C.
95) Un vector de ADN según la reivindicación 90, donde el antígeno vacunal pertenezca al virus de la fiebre aftosa (FMDV). 96) Un vector de ADN según la reivindicación 90, donde el antígeno vacunal pertenezca al virus de inmunodeficiencia humana (HTV).
97) Un vector de ADN según la reivindicación 89, donde el antígeno vacunal pertenezca a una bacteria.
98) Un vector de ADN según la reivindicación 89, donde el antígeno vacunal pertenezca a un protozoario.
99) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen en cuestión codifique para un fragmento de la región variable de una inmunoglobulina. 100) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen en cuestión codifique para una proteína multimérica.
101) Un vector de ADN según la reivindicación 100, donde la proteína multimérica es una inmunoglobulina. 102) Un vector de ADN según la reivindicación 100, donde la proteína multimérica es una hormona.
103) Un vector de ADN según la reivindicación 100, donde la proteína multimérica es un antígeno vacunal.
104) Un vector de ADN según la reivindicación 100, donde la proteína multimérica es una enzima.
105) Un vector de ADN según la reivindicación 100, donde la proteína multimérica es un receptor celular.
106) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés industrial codifique para una proteína componente de un biopolímero. 107) Un vector de ADN según la reivindicación 52, donde el gen de interés industrial codifique para una enzima.
108) Un vector de ADN según la reivindicación 107, donde la enzima sea una proteasa.
109) Un vector de ADN según la reivindicación 107, donde la enzima sea una lipasa.
110) Un vector de ADN según la reivindicación 107, donde la enzima sea una isomerasa. 111) Un vector de ADN según la reivindicación 107, donde la enzima tenga actividad glicosil-hidrolasa.
112) Un vector de ADN según la reivindicación 111, donde la enzima con actividad glicosil-hidrolasa sea una levanasacarasa.
113) Un vector de ADN según la reivindicación 111, donde la enzima con actividad glicosil-hidrolasa sea una invertasa.
114) Un vector de ADN según la reivindicación 111, donde la enzima actividad glicosil- hidrolasa sea una levanasa.
115) Un vector de ADN según la reivindicación 111, donde la enzima actividad glicosil- hidrolasa sea una dextranasa. 116) El cultivo de las células vegetales en presencia de citoquininas, antes de introducirles cualesquiera de los vectores de ADN enunciados en las reivindicaciones de la 1 a la 115, para aumentar la frecuencia de producción de plantas transplastómicas. 117) El empleo de kinetina según la reivindicación 116.
118) Las plantas Angiospermas transplastómicas establemente transformadas con cualquiera de los vectores de ADN enunciados en las reivindicaciones de la 1 a la 115.
119) La progenie de las plantas transplastómicas de la reivindicación 118. 120) Las plantas transplastómicas según las reivindicaciones 118 y 119 que expresen establemente al menos uno de los genes presentes en el vector de ADN utilizado para la transformación.
121) Las plantas transplastómicas de las reivindicaciones 118 y 119 con las proteínas atpB y/o rbcL híbridas. 122) El cultivo de las plantas transplastómicas de la reivindicación 120.
123) El cultivo de las células de las plantas transplastómicas de la reivindicación 120.
124) La purificación y utilización de la proteína o proteínas que producen las células de las plantas de la reivindicación 120 como resultado de la expresión del gen o los genes en cuestión. 125) Las plantas transplastómicas de las reivindicaciones de la 118 a la 121 que sean Angiospermas.
126) Las plantas transplastómicas según la reivindicación 125 que sean dicotiledóneas.
127) Las plantas transplastómicas según la reivindicación 126 que sean solanáceas.
128) Las plantas transplastómicas según la reivindicación 127 que pertenezcan a una de las siguientes especies: tabaco, tomate o papa.
129) Las plantas transplastómicas según la reivindicación 125 que sean monocotiledóneas.
130) Las plantas transplastómicas según la reivindicación 129 que sean gramíneas.
131) Las plantas transplastómicas según la reivindicación 130 que pertenezcan a una de las siguientes especies: arroz, caña de azúcar, maíz, trigo o cebada.
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