WO2004029104A1

WO2004029104A1 - リン脂質誘導体

Info

Publication number: WO2004029104A1
Application number: PCT/JP2003/012502
Authority: WO
Inventors: Syunsuke Ohhashi; Kazuhiro Kubo; Chika Itoh; Tohru Yasukohchi; Hiroshi Kikuchi; Norio Suzuki; Miho Kurosawa; Hitoshi Yamauchi
Original assignee: Nof Corporation; Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2004-04-08
Also published as: DE60318469T2; EP1550675A1; EP1550675B1; JPWO2004029104A1; AU2003266714A1; JP4808403B2; US20060110436A1; US7531604B2; EP1550675A4; DE60318469D1; AU2003266714A8

Description

明細書リン脂質誘導体技術分野

本発明はリン脂質誘導体に関する。より具体的には、本発明は、アルケニルェ一テル一無水マレイン酸共重合体とリン脂質とを反応させて得ることができるリン脂質誘導体に関する。背景技術

リボソーム製剤に代表される微粒子性薬物キヤリァー及び蛋白製剤等のポリべプチドは静脈内に投与すると血液中での滞留性が悪く、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織（Reticuloendothel ial system：以下「R E S」と略する。）に捕捉されやすいことが知られている。 R E Sの存在は、 R E S以外の臓器への薬物を送達させるターゲッティング型製剤や長時間にわたって血液中に製剤を滞留させ、医薬の放出をコントロールする徐放型製剤として微粒子性薬物キャリアーを利用するに際して大きな障害となる。

従来から、上記製剤に微小循環性を有するような研究がなされてきた。例えば、リボソームの脂質二分子膜の物理化学的性質を比較的容易に調整可能であることから、リボソームのサイズを小さくすることで血中濃度を高く維持する例（バイォキミカ .エト .バイオフイジ力 ·ァクタ、 761巻、 142頁、 1983年）、相転移温度の高いレシチンを利用する例（バイオケミカル.ファーマコロジ一、 32卷、 3381 頁、 1983 年）、レシチンの代わりにスフインゴミエリンを用いる例（バイオケミカル ·ファーマコロジ一、 32卷、 3381頁、 1983年）、リポソ一ムの膜成分としてコレステロールを添加する例（バイオキミ力 'エト 'バイオフイジ力 ·ァクタ、 761卷、 142頁、 1983年）などが提案されている。

また、その他の解決方法として、リボソームの膜表面を糖脂質、糖蛋白質、ァミノ酸脂質、ポリエチレングリコール脂質などで修飾し、微小循環性を付与するとともに R E Sを回避する研究が行われている。例えば、グリコフォン（日本薬学会第 106年会講演要旨集、 336頁、 1986年）、ガングリオシド GM1 (FEBS レター、 223卷、 42頁、 1987年）、フォスファチジルイノシトール（FEBS レター、 223卷、 42頁、 1987年）、グリコフォンとガングリオシド GM3 (特開昭 63-221837号公報）、ポリエチレングリコール誘導体（FEBSレター、 268卷、 235頁、 1990年）、ダルクロン酸誘導体（ケミカル .アンド · ファーマシューティカル · ブレタン、 38 卷、 1663頁、 1990年）、グルタミン酸誘導体（バイォキミカ 'エト ·バイオフイジ力 ' ァクタ、 1108卷、 257頁、 1992年）、ポリグリセリンリン脂質誘導体（特開平 6-228012 号公報）などがその修飾物質として報告されている。

ポリべプチドを修飾する場合には、その結合点を減らしてポリべプチド中のリジン残基等の活性基の残存量を上げる目的で、トリアジンを用いて 2分子の水溶性高分子を導入させた報告等がある。リボソーム製剤においても、水溶性高分子の分子量を上げる目的でトリァジンに 2分子の水溶性高分子を導入し、それを用いてリボソーム表面を修飾した報告がある。しかしながら、リボソーム表面の水溶性高分子の鎖の数を増やすためには、トリアジンを用いて水溶性高分子を導入する場合には、トリアジン環には 2本しか水溶性高分子を導入できないため、トリァジンに 2本の水溶性高分子を含む化合物を多く配合する必要がある。

しかし、その場合、多く配合することにより、本来薬剤と反応させる活性点を消費してしまい、設計すべき薬剤が限定されてしまうといった問題があった。発明の開示

本発明の課題は、リポソームなどの修飾に利用可能なリン脂質誘導体を提供することにある。本発明者らは、アルケニルエーテル一無水マレイン酸共重合体とリン脂質とを反応させて新規なリン脂質誘導体を提供すべく鋭意研究を行った結果、下記に示すリン脂質を提供することに成功した。

すなわち、本発明は、リン脂質であって、 (A) 下記式（1) で表される構成単位 A

(B) 下記式（2A) 及びノ又は下記式（2B) で表される構成単位 B、並び

(C) 下記式（3) で表される構成単位 C ：

〔式（1) 中、 R¹及び R²はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示すが、 R¹ 及び R²が同時にメチル基になることはなく； R³は炭素数 1 3の 2価の炭化水素基を示し； AOはそれぞれ独立に炭素数 2 4のォキシアルキレン基を示し； mはォキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、 4≤m≤ l 00の範囲の数であり； R⁴は水素原子、炭素数 1 20の炭化水素基、又は炭素数 1 20のァシル基を示し、式（2A) 中、 Xはそれぞれ独立に水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム、又は有機アンモニゥムを示し、式（3) 中、 R⁵CO及び R⁶CO はそれぞれ独立に炭素数 8 24のァシル基を示し； R⁷は炭素数 2 4の 2価の炭化水素基を示し； Xは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム、又は有機アンモニゥムを示し； Yは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム、又は有機アンモニゥムを示す〕を必須構成単位として含む共重合体であって、構成単位 Aと構成単位 B及び構成単位 Cの合計とのモル比が 7 / 3〜 3 / 7であり、かつ構成単位 Cを共重合体 1モル中に 1〜 5モルの割合で含むリン脂質誘導体を提供するものである。

本発明の好ましい態様によれば、共重合体中に含まれる構成単位 A、構成単位 B、及び構成単位 Cの総数が 3以上で、かつ 1 5 0以下である上記のリン脂質誘導体；共重合体中に含まれる構成単位 A、構成単位 B、及び構成単位 Cの総数が 5以上で、かつ 5 0以下である上記のリン脂質誘導体； R ¹及び R²が水素原子である上記のリン脂質誘導体；及ぴ R⁷がェチレン基である上記のリン脂質誘導体が提供される。

別の観点からは、本発明により、上記のリン脂質誘導体を含む界面活性剤；上記のリン脂質誘導体を含む可溶化剤；上記のリン脂質誘導体を含む分散剤、好ましくは化粧料用の分散剤；上記のリン脂質誘導体を含有する脂質膜構造体、好ましくはリボソームが提供される。また、医薬を保持した上記の脂質膜構造体又はリボソームが本発明により提供され、その好ましい態様として抗腫瘍剤を保持した上記の脂質膜構造体又はリボソームが提供される。

さらに別の観点からは、上記のリン脂質誘導体の製造方法であって、構成単位 Aと構成単位 Bとを 7 / 3〜3 Z 7のモル比で含む共重合体に対して下記の式

( 4 ) ：

(式中、 R⁵ C O、 R⁶ C O、 R⁷、及び Yは上記と同義である）

で表される化合物を反応させる工程を含む方法が提供される。発明を実施するための最良の形態

本発明のリン脂質誘導体は、式（1) で示されるアルケニルエーテルからなる構成単位 Aと、マレイン酸若しくはその塩又は無水マレイン酸に由来する式（2 A) 及びノ又は式（2 B) で表される構成単位 Bとを含む共重合体であって、さらにリン脂質化合物の残基を有する式（3) で表される構成単位 Cを含むことを特徴としている。

R¹及び R²はそれぞれ独立する水素原子又はメチル基を示すが、 R¹及ぴ R²が同時にメチル基になることはない。好ましくは R¹が水素原子、 R²が水素原子又はメチル基であり、 R³がメチレン基である。 R³は炭素数 1〜3の 2価の炭化水素基であり、より具体的には、例えば、 — CH₂—、一 CH₂CH₂—、 -CH (C H₃) CH₂—、 _CH₂CH₂CH₂—などの炭化水素基を挙げることができ、好ましくは一 CH₂— （メチレン基）である。

AOで表されるォキシアルキレン基は炭素数 2〜4のォキシアルキレン基であり、例えばォキシエチレン基、ォキシプロピレン基、ォキシトリメチレン基、ォキシブチレン基、ォキシテトラメチレン基などが挙げられる。これらのうち、ォキシエチレン基又はォキシプロピレン基が好ましく、特にォキシエチレン基が好ましい。 AOであらわされる m個の炭素数 2〜4のォキシアルキレン基は 1種又は 2種以上でもよい。 2種以上のォキシアルキレン基を含む場合には、その組み合わせ方には制限はなく、ブロック状であってもランダム状であってもよい。構成単位 Aにおいて、 AOで示されるォキシアルキレン基としてォキシエチレン基を含むことが好ましく、ォキシエチレン基の割合がォキシアルキレン基中の 50 〜 1 00質量。 /₀以上であることが好ましく、 70〜100質量％がより好ましく、 100質量％がさらに好ましい。ォキシエチレン基の割合が 50質量⁰ /₀より少ないと、リン脂質誘導体の親油性が高くなり、乳化分散性が低下する場合がある。 mはォキシアルキレン基の平均付加モル数であり、 mは 4〜100、好ましくは 6〜46の数である。 mが 4より小さいと共重合体の大きさに比べてポリオキシアルキレン鎖の鎖長が相対的に短くなって水溶性が低下し、リン脂質誘導体をドラックデリバリーシステムに使用した場合の効果が小さくなる場合がある。また、 mが 1 0 0より大きいとォキシアルキレン基からなるポリアルキレンダリコール鎖の数が相対的に少なくなり、リン脂質誘導体をドラックデリバリーシステムに使用した場合の優位性が小さくなる場合がある。

R ⁴は水素原子又は炭素数 1〜 2 0の炭化水素基又はァシル基を示す。炭化水素基としては、例えば、炭素数 1〜 2 0の脂肪族炭化水素基及び炭素数 1〜 2 0 の芳香族炭化水素基を挙げることができる。炭素数 1〜 2 0の脂肪族炭化水素基としては、メチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチノレ基、 tert—ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、へキシル基、イソへプチル基、 2—ェチルへキシル基、ォクチル基、イソノエル基、デシル基、ドデシル基、イソトリデシル基、テトラデシル基、へキサデシル基、イソセチル基、ォクタデシル基、イソステアリル基、ォクタデセニル基、ォクチルドデシル基、ドコシル基及びデシルテトラデシル基などを挙げることができ、炭素数 1〜 2 0 の芳香族炭化水素基としては、ベンジル基、トリル基、プチルフヱニル基、ジブチルフエニル基、ォクチノレフエニル基、ノニノレフヱ二ノレ基、ドデシルフェニル基、ジォクチルフエニル基及びジノニルフエニル基などを挙げることができる。

炭素数 1〜2 0のァシル基としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、力プリル酸、 2—ェチルへキサン酸、イソノナン酸、力プリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ノレミチン酸、イソパルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ァラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、ォレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エル力酸、安息香酸、ヒドロシキ安息香酸、桂皮酸、及び没食子酸などに由来するァシル基が挙げられる。 R ⁴としては、炭素数 1〜4の炭化水素基又はァシル基が好ましく、炭素数 1〜4の炭化水素基がさらに好ましい。式（1 ) で表される各構成単位 Aにおける R ⁴はそれぞれ独立であり、 1種又は 2種以上であってもよい。

式（2 A)、（2 B )、又は式（3 ) で表される構成単位はマレイン酸若しくはその塩又は無水マレイン酸に由来する構成単位である。塩としては、アルカリ金属原子、アンモニゥム又は有機アンモニゥムの塩が挙げられ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ金属塩、アンモニア由来のアンモニゥム塩、トリェチルァミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン由来の有機アンモニゥム塩が挙げられる。マレイン酸若しくはその塩又は無水マレイン酸をそのまま共重合させてもよいが、共重合させた後に塩に変換してもよレ、。

R ⁵ C O及ぴ R ⁶ C Oはそれぞれ独立に炭素数 8〜 2 4のァシル基を示すが、このァシル基としては通常の脂肪酸に由来するァシル基を用いることができる。 R ⁵ C O及ぴ R ⁶ C Oとしては、例えば力プリル酸、力プリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ォレイン酸、リノール酸、ァラキン酸、ベヘン酸、エル力酸、リグノセリン酸などの飽和及ぴ不飽和の直鎖又は分岐の脂肪酸由来のァシル基をあげることができる。一の構成単位中に含まれる R ⁵ C O及び R ⁶ C Oは同一であっても異なっていてもよい。また、それぞれの構成単位中における R ⁵ C O又は R ⁶ C Oはそれぞれ独立であり、 1種又は 2種以上であってもよい。 R ⁵ C O及び R ⁶ C Oは好ましくは炭素数 1 0〜2 2のァシル基である。炭素数が 2 4を越えると水相への分散が悪く反応性が下がる場合があり、炭素数が 8より少ないと精製工程での結晶性が悪く純度が低くなる場合がある。

Xは、水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム又は有機アンモニゥムの塩が挙げられ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシゥム等のアルカリ金属塩、アンモニア由来のアンモニゥム塩、トリェチルァミン、ピリジン、ジメチルァミノピリジン由来の有機アンモニゥム塩が挙げられる。 Yは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム、又は有機アンモニゥムを示し、好ましくは水素原子又はアルカリ金属原子である。より具体的には、ァルカリ金属原子としてナトリゥム及び力リゥムを挙げることができ、有機アンモ二ゥムとしてはトリエチルァミン由来の有機アンモニゥムなどを挙げることができる。 R ⁷は炭素数 2〜4の 2価の炭化化水素基であり、より具体的には— C H ₂ CH₂ -、 -CH (CH₃) CH₂—、一 CH₂CH₂CH₂—、 -CH₂CH₂CH₂ CH₂—、 — CH (CH₃) CH₂CH₂—、 -CH₂CH (CH₃) CH₂—、 —C H (CH₂CH₃) CH₂—などの炭化水素基を挙げることができ、好ましくは一 CH₂CH₂—であるエチレン基である。

本発明のリン脂質誘導体において、共重合体中に含まれる式（1) で表される構成単位 A、式（2A) 及び又は式（2 B) で表される構成単位 B (構成単位 Bは式（2A) 又は式（2B) のいずれかで表される構成単位のみからなるものであってもよく、あるいは式（2A) 及び式（2B) の構成単位の両者を含むものであってもよい）、及び式（3) で表される構成単位 Cの総数は 3以上で、かつ 1 50以下である。 k ¹を構成単位 Aのモル数、 k ¹¹を構成単位 Bのモル数、 k ¹ ^{1 1}を構成単位 Cのモル数とした場合、 k"、及び k ¹¹¹は以下の関係： 1≤ k ^{1 1 1}≤ 5, 3≤k ^I + k^II+k ^{I I I}≤ 1 50. k (kⁿ+k ^{1 1} ') = 7/3〜 3/ 7を満たし、好ましくは、以下の関係： l ^k H' d 5≤k ^! + kⁿ+k ^{1 1 !}≤ 1 00 , k V (kⁿ+ k ^{! I 1}) = 6Z4〜4Z6を満たし、より好ましくは、以下の関係： l k ¹¹¹^ ? 5≤k ^I + k^II+k ^{I I I}≤ 100, k (k¹¹ + _k i i i) = 6/4〜 4/ 6を満たす。本発明のリン脂質誘導体の分子末端は、水素原子又は重合開始又は連鎖移動により共重合体末端に結合する残基である。構成単位 Cが分子中にランダム状に存在していることが好ましい。

本発明のリン脂質誘導体は、上記の構成単位 A、構成単位 B、構成単位 Cのほか、これらの構成単位と共重合可能な他の単量体に由来する構成単位を含んでいてもよい。例えば、共重合可能な単量体としては、スチレン、酢酸ビュル、ァクリロ二トリノレ、メタクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、ァクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチルなどを挙げることができる。他の共重合可能な単量体に由来する構成単位の割合は、構成単位 A に対して 10モル％以下であることが好ましい。

本発明のリン脂質誘導体は、構成単位 Aと構成単位 Bとを含む共重合体に対して、上記の式（4) で表されるリン脂質化合物を反応させることによって製造することができる。構成単位 Aと構成単位 Bとを含む共重合体は公知の重合体であり、公知の方法（例えば特開平 2— 163108号公報、特開平 9一 25574 0号公報等に記載の方法）を用いて製造することができる。該共重合体は、例えば、構成単位 Aを与える適宜の単量体と、マレイン酸若しくはその塩又は無水マレイン酸とを、有機溶剤中又は水系溶剤中で溶液重合するか、あるいは無溶剤で塊状重合することにより製造することができるが、有機溶剤中での溶液重合又は無溶剤での塊状重合が好ましく、無溶剤での塊状重合がより好ましい。該共重合体において、式（I) で表される構成単位 Aは、重合体中にランダム状又はプロック状のいずれの形態で存在していてもよいが、好ましくはランダム状である。また、式（2A) 及びノ又は式（2B) で表される構成単位は重合体中にランダム状又はプロック状のいずれの形態で存在していてもよいが、好ましくはランダム状である。

構成単位 Bが無水マレイン酸に由来する場合には、有機溶剤中又は無溶媒で塊状重合した場合は、該共重合体中の構成単位 Bは式（2B) で表される構成単位として得ることができる。水系溶剤中で重合を行った場合はマレイン酸又はその塩の構成単位（式（2A) で表される構成単位）として得られる。上記の反応で構成単位 Bが無水物であっても、あるいはカルボン酸又はその塩であってもリン脂質を導入することができる。

重合反応に用いる重合開始剤としては、例えばベンゾィルペルォキシドなどの過酸化物系開始剤、 2， 2' —ァゾビスイソプチロニトリルなどのァゾ系開始剤等が挙げられ、仕込量は単量体の合計仕込量に対して通常 0. 001〜0. 1モル％、好ましくは 0. 005〜0. 1モル％である。また、必要に応じて連鎖移動剤を併用して重合を行うこともできる。反応条件は、通常反応温度 0〜1 20°C、反応時間 1〜 50時間であり、好ましくは反応温度 20〜 100 °C、反応時間 2 〜25時間である。共重合体における構成単位 Aと構成単位 Bとの構成モル比は 7/3〜3ノ7であり、好ましくは 6/4〜4Z6であり、より好ましくは 5ノ 5である。また、該共重合体の質量平均分子量は 10, 000〜1， 000， 0 0 0であり、好ましくは 1 0， 0 0 0〜2 0 0， 0 0 0である。

構成単位 Aと構成単位 Bとを含む共重合体に対して上記の式（4 ) で表されるリン脂質化合物を反応させるにあたり、塩基性触媒又は、脱水縮合触媒の存在下で反応を行うことが好ましい。また、有機溶媒中で反応を行うことも好ましい。塩基性触媒の種類は特に限定されないが、例えば、窒素含有物質としてはトリエチルァミン、ピリジン、ジメチルァミノピリジン、酢酸アンモニゥム等が、有機塩としてはリン酸ナトリゥム、炭酸ナトリゥム、炭酸水素ナトリゥム、ホウ酸ナトリウム及び酢酸ナトリウム等が挙げられる。また、脱水縮合触媒としては、ジシクロへキシルカルポジイミド（D C C )、 1—ェチル— 3— ( 3—ジメチルアミノプロピル）カルポジイミド塩酸塩等が挙げられる。触媒の量は、例えば上記のリン脂質化合物 1モルに対して 0 . 5〜 1 0倍モル、好ましくは 1〜 5倍モルである。反応温度は通常 2 0〜9 0 °C、好ましくは 4 0〜8 0 °Cである。反応時間は 1時間以上、好ましくは 2〜8時間である。 2 0 °Cより低温では反応率が低い場合があり、 9 0 °Cより高温では反応に用いる式（4 ) で表されるリン脂質化合物のァシル基が加水分解する場合がある。

式.（4 ) で表されるリン脂質化合物の添加量は、構成単位 Aと構成単位 Bからなる共重合体（C P )の平均分子量に対して 1〜 5モノレ、好ましくは 1〜4モル、より好ましくは 1〜2モルである。リン脂質化合物の添加量が多すぎると、該共重合体に結合するリン脂質が増えてリポソームの形成が困難になる場合があり、界面活性剤としてはミセルの構成が困難になる場合がある。また、リン脂質化合物の添加量が少なすぎると界面活性剤として親油性基の割合が少なくなりすぎるので、界面活性剤としてのミセルの構成が期待できなくなる場合がある。

本発明のリン脂質誘導体は、脂溶性物質のため界面活性剤として可溶化、乳化、又は分散を行うことができ、あるいは化粧料分野における界面活性剤として用いることができ、さらには脂質膜構造体を形成するためのリン脂質として用いることができる。脂質膜構造体として、リボソームとして用いることが好適である。可溶化できる脂溶性物質は特に限定されないが、例えば高級アルコール、エステル油、トリグリセリン、トコフエロール、及び高級脂肪酸等が挙げられる。化粧料分野における分散剤としての使用形態も特に限定されないが、例えば、ァスコルビン酸等の水溶性物質を脂質二重膜に保持しておく場合などにおいて、本発明の化合物を脂質膜構造形成剤として用いることにより、より安定に対象物質を水溶液中に分散できる。界面活性剤及び分散剤として用いる場合、添加量としては可溶化、分散、乳化などの対象となる物質の全質量に対して 0. 1〜 20質量％、好ましくは 0. 5〜7質量％、より好ましくは 0. 5〜 5質量％である。

また、本発明のリン脂質誘導体は、 pH感受性リン脂質として、例えば分散剤として使用することができる。カチオン性の物質、例えばカチオン性の生理活性物質等や塩基性物質などを水中に分散する場合、例えばカチオン性物質又は塩基性物質を含む微粒子等の表面を上記化合物で被覆することにより、水中に安定に分散することができる。本発明のリン脂質誘導体は、ポリア二オン性基を有するのでイオン結合により安定に分散することができる。

脂質膜構造体中への本発明のリン脂質誘導体の配合量は、医薬の薬効を生体内で有効に発現させるのに充分な量であればよく、特に限定されることはない。例えば、脂質膜構造体に保持させるべき医薬の種類、治療や予防などの用途、脂質膜構造体の形態などにより適宜選択可能である。本発明により提供される脂質膜構造体に保持される医薬の種類は特に限定されないが、例えば、抗腫瘍剤として用いられる化合物が好ましい。これら化合物としては、例えば、塩酸イリノテカン、塩酸ノギテカン、ェキサテカン、 RFS— 2000、 Lu r t o t e c a n、 BNP— 1350、 B a y— 383441、 PNU_ 166148、 I DEC— 132、 BN- 8091 5、 DB_38、 DB— 81、 DB— 90、 DB— 91、 CKD— 620、 T一 0128、 ST— 1480、 ST— 1481、 DRF— 1 042、 DE— 310等のカンプトテシン誘導体、ドセタキセル水和物、パクリタキセル、 I ND—5109、 BMS— 184476、 BMS_ 188797、 T— 3782、 TAX— 101 1、 SB— RA— 31012、 SBT— 1514、 D J - 927等のタキサン誘導体、ィホスファミド、塩酸二ムスチン、カルボコン、シクロホスフアミド、ダカルバジン、チォテパ、ブスルファン、メルファラン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、 6—メルカプトプリンリボシド、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、シタラビン、シタラビンォクホスフアート、テガフール、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルォロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、ァクチノマイシン D、塩酸アクラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸ェビルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ブレオマイシン、ジノスタチンスチマラマー、ネオカルチノスタチン、マイトマイシン C、硫酸ブレオマイシン、硫酸ぺプロマイシン、エトポシド、酒石酸ピノレルビン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、塩酸ァムノレビシン、ゲフィ二チブ、ェキセメスタン、力ぺシタビン、 TNP_470、 TAK— 165、 KW— 2401、 KW— 2 1 70、 KW— 287 1、 KT一 5 555、 KT一 8391、 TZT— 1027、 S— 3304、 CS— 682、 Y M— 5 1 1、 YM— 598、 TAT_ 59、 TAS— 10 1、 TAS— 102、 TA_ 106、 FK— 228、 FK— 31 7、 E 7070, E 7389、 KRN — 700、 KRN— 5500、】一 107088、 HMN— 214、 SM— 1 1 355、 ZD— 0473等を挙げることができる。

また、本発明の脂質膜構造体には遺伝子などを封入してもよい。遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、 D N A及び RN Aのいずれでもよく、特に形質転換等のイン ' ビトロにおける導入用遺伝子や、ィン · ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子、実験動物や家畜等の産業用動物の品種改良に用いられる遺伝子を挙げることができる。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンス DNA、アンチセンス RNA、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子等を挙げることができる。

上記の脂質膜構造体は、さらにリン脂質、コレステロール、コレスタノール等のステロール類、その他の炭素数 8〜 24の飽和及ぴ不飽和のァシル基を有する脂肪酸類、 α—トコフヱロール等の酸化防止剤を含んでいてもよい。リン脂質としては、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジノレグリセロール、カルジォリピン、スフインゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールァミン、セラミドホスホリノレグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、 1、 2—ジミリストイルー 1， 2—デォキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン及びホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは 1種又は 2種以上を組み合わせて用いることができる。これらのリン脂質の脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数 1 2から 2 0の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ォレイン酸、リノール酸等の脂肪酸由来のァシル基を挙げることができる。また、卵黄レシチン及び大豆レシチンのような天然物由来のリン脂質を用いることもできる。

本発明の脂質膜構造体の形態及びその製造方法は特に限定されないが、存在形態としては、例えば、乾燥した脂質混合物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態等を挙げることができる。乾燥した脂質混合物の形態の脂質膜構造体は、例えば、使用する脂質成分をいつたんクロ口ホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによつて製造することができる。脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、一枚膜リボソーム、多重層リボソーム、 O/W 型エマルシヨン、 W/OZW型エマルシヨン、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができるが、これらのうちリボソームが好ましレ、。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されないが、例えば、リポソームやエマルシヨンの場合には粒子径が 5 O n mから 5 ^u mであり、球状ミセルの場合、粒子径が 5 n mから 1 0 0 n mである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その 1層あたりの厚みが 5 n mから 1 0 n mでこれらが層を形成していると考えればよレ、。水系溶媒（分散媒）の組成も特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、クェン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などであってもよい。これらの水系溶媒に対して脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、さらにグルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液等を加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒の p Hを弱酸性から中性付近（p H 3 . 0 から 8 . 0 ) に設定したり、窒素パブリングにより溶存酸素を除去することが望ましい。さらに凍結乾燥保存や噴霧乾燥保存をする場合には、例えば糖水溶液を凍結保存するに際して糖水溶液や多価アルコール水溶液をそれぞれ用いると効果的な保存が可能である。これらの水系溶媒の濃度は特に限定されるべきものではないが、例えば、糖水溶液においては、 2〜2 0 % (W/V) が好ましく、 5〜 1 0 % (W/V ) がさらに好ましい。また、多価アルコール水溶液においては、 1〜5 % (W/V) が好ましく、 2〜2 . 5 % (W/V) がさらに好ましい。緩衝液においては、緩衝剤の濃度が 5〜5 O mMが好ましく、 1 0〜2 0 mMがさらに好ましい。水系溶媒中の脂質膜構造体の濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体における脂質総量の濃度は、 0 . l mM〜5 0 O mMが好ましく、 1 mM 〜 1 0 O mMがさらに好ましい。

脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した脂質混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リボソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することもでき、分散体の製造方法は特に限定されることはない。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルタ一等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。

上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体を乾燥させる方法としては、通常の凍結乾燥や噴霧乾燥を挙げることができる。この際の水系溶媒としては、上記したように糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液、乳糖水溶液を用いるとよい。水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいつたん製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に医薬水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために医薬を効率よく脂質膜構造体に保持させることができるといったメリッ卜がある。例えば、脂質膜構造体に医薬を添加することにより医薬組成物を製造することができ、該脂質膜構造体は疾病の治療及び/又は予防のための医薬組成物として用いることができる。医薬が遺伝子の場合は、遺伝子導入用キットとして用いることも可能である。

医薬組成物の形態としては、脂質膜構造体と医薬とが混合された形態のほか、該脂質膜構造体に医薬が保持された形態でもよい。ここでいう保持とは、医薬が脂質膜構造体の膜の中、表面、内部、脂質層中、及び/又は脂質層の表面に存在することを意味する。医薬組成物の存在形態及びその製造方法は、脂質膜構造体と同様に特に限定されることはないが、例えば、存在形態としては、混合乾燥物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態が挙げられる。

脂質類と医薬との混合乾燥物は、例えば、使用する脂質類成分と医薬とをいつたんクロ口ホルム等の有機溶媒で溶解させ、次にこれをエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことにより製造することができる。脂質膜構造体と医薬との混合物が水系溶媒に分散した形態としては、多重層リポソ一ム、一枚膜リボソーム、 oZw型エマルシヨン、 w/oZw型エマルシヨン、球状ミセル、ひも状ミセル、不定形の層状構造物などを挙げることができるが、特に限定されることはない。混合物としての大きさ（粒子径）や水系溶媒の組成なども特に限定されることはないが、例えばリボソームの場合には 5 0 η π！〜 2 _μ m、球状ミセルの場合は 5〜 1 0 0 n m、ェマルジヨンを形成する場合は 5 0 n m〜5 μ πιである。混合物としての水系溶媒における濃度も特に限定はされることはなレ、。なお、脂質膜構造体と医薬との混合物が水系溶媒に分散した形態の製造方法としてはいくつかの方法が知られており、通常は脂質膜構造体と医薬との混合物の存在様式に応じて下記のように適宜の製造方法を選択する必要がある。製造方法 1

上記の脂質類と医薬との混合乾燥物に水系溶媒を添加し、さらにホモジナイザ一等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等による乳化を行う方法である。大きさ（粒子径）を制御したい場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し慮過）を行えばよレ、。この方法の場合には、まず脂質類と医薬との混合乾燥物を作るために、医薬を有機溶媒に溶解する必要があるが、医薬と脂質膜構造体との相互作用を最大限に利用できるメリットがある。すなわち、脂質膜構造体が層状構造を有する場合にも、医薬は多重層の内部にまで入り込むことが可能であり、一般的にこの製造方法を用いると医薬の脂質膜構造体への保持率を高くすることができる。

製造方法 2

脂質類成分を有機溶媒でいったん溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物に、さらに医薬を含む水系溶媒を添加して乳化する方法である。大きさ（粒子径）を制御したい場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し慮過）を行えばよい。有機溶媒には溶解しにくいが、水系溶媒には溶解する医薬に適用できる。脂質膜構造体がリボソームの場合、内水相部分にも医薬を保持できる長所がある。

製造方法 3

水系溶媒に既に分散したリボソーム、エマルシヨン、ミセル、又は層状構造物などの脂質膜構造体に、さらに医薬を含む水系溶媒を添加する方法である。この方法の適用は水溶性の医薬に限定される。既にできあがつている脂質膜構造体に外部から医薬を添加する方法であるため、医薬が高分子の場合には、医薬は脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとる場合がある。脂質膜構造体としてリボソームを用いた場合、この製造方法 3を用いると、医薬がリボソーム粒子同士の間に挟まったサンドイッチ構造（一般的には複合体あるいはコンプレックスと呼ばれている。）をとることが知られている。この製造方法では、脂質膜構造体単独の水分散液をあらかじめ製造するため、乳化時の医薬の分解を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もたやすいので、製造方法 1や製造方法 2に比べて比較的製造が容易である。

製造方法 4

水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいつたん製造した上でさらに乾燥させた乾燥物に、さらに医薬を含む水系溶媒を添加する方法である。この場合も製造方法 3と同様に医薬は水溶性のものに限定される。製造方法 3と大きく違う点は、脂質膜構造体と医薬との存在様式にある。すなわち、この製造方法 4では、水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいつたん製造した上でさらに乾燥させた乾燥物を製造するために、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状態で存在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるために、前記したように水系溶媒として糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液や乳糖水溶液を用いるのが好ましい。ここで、医薬を含む水系溶媒を添加すると、固体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに水和を速やかに始め、脂質膜構造体を再構成することができる。この時に、医薬が脂質膜構造体内部に保持された形態の構造体が製造できる。

'製造方法 3では、医薬が高分子の場合には、医薬は脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとるが、製造方法 4はこの点で大きく異なっている。この製造方法 4は、脂質膜構造体単独の水分散液をあらかじめ製造するため、乳化時の医薬の分解を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もたやすいので、製造方法 1や製造方法 2に比べて比較的製造が容易であることが挙げられる。また、この他に、凍結乾燥あるいは噴霧乾燥を行うため、製剤としての保存安定性を保証しやすいこと、乾燥製剤を医薬水溶液で再水和しても大きさ（粒子径）を元にもどせること、高分子の医薬の場合でも脂質膜構造体内部に医薬を保持させやすいことなどが長所として挙げられる。

脂質膜構造体と医薬との混合物が水系溶媒に分散した形態を調製するための他の方法としては、リボソームを製造する方法としてよく知られる方法、例えば逆相蒸発法などを別途用いてもよい。大きさ（粒子径）を制御したい場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージヨン（押し出し慮過）を行えばよい。また、上記の脂質膜構造体と医薬との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに乾燥させる方法としては、凍結乾燥や噴霧乾燥が挙げられる。この時の水系溶媒としては、脂質膜構造体単独の場合と同様に糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液や乳糖水溶液を用いるとよい。上記の脂質膜構造体と医薬との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに凍結させる方法としては、通常の凍結方法が挙げられるが、この時の水系溶媒としては、脂質膜構造体単独の場合と同様に、糖水溶液や多価アルコール水溶液を用いるとよレ、。医薬組成物において配合し得る脂質は、使用する医薬の種類などに応じて適宜選択すればよいが、例えば、医薬が遺伝子以外の場合には医薬 1質量部に対して 0 . 1から 1 0 0 0質量部が好ましく、 0 . 5から 2 0 0質量部がより好ましい。また、医薬が遺伝子の場合には、医薬（遺伝子） l gに対して、 1から 5 0 0 n m o 1が好ましく、 1 0から 2 0 0 n m o lがより好ましい。

本発明の脂質膜構造体を含む医薬組成物の使用方法は、その形態に応じて適宜決定することが可能である。ヒト等に対する投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれでもよい。経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、カプセル剤、内服液剤等を挙げることができ、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、点眼剤、軟膏剤、座剤、懸濁剤、パップ剤、ローション剤、エアゾール剤、プラスター剤等を挙げることができる。医薬の分野においては、これらのうち注射剤又は点滴剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、皮下注射、皮内注射などのほか、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。また、化粧料の分野においては、化粧料の形態としては、具体的には、ローション、クリーム、化粧水、乳液、フォーム剤、ファンデーション、口紅、パック剤、皮膚洗浄剤、シャンプー、リンス、コンデイショナ一、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム等を挙げることができる' 実施例

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されるものではない。

製造例 1 共重合体（CP) の製造

下記の化合物を攪拌装置と冷却管を備えた 2 Lフラスコ中で 1 のトルエンに溶解し、窒素雰囲気下に 80 ± 2°Cで 7時間加熱し重合反応を行った。

CH₂ = CHCH₂0 (C₂H₄0) ₁ j CH₃ 556 g (1. 0モル）

無水マレイン酸 1 03 g (1. 05モル）

t e r t—ブチルペルォキシ _ 2—ェチルへキサノエート 4. 3 g (0. 02 モル）

次いで、トルエン及び未反応の無水マレイン酸を 1. 3〜4. OKP aの減圧下に 100 ± 10°Cで留去し、 528 gの共重合体 N o . 1を得た。得られた共重合体 N o . 1は茶色で透明な液体であり、動粘度は 1 00°Cで 206 c S t、験化価は 182KOHmg/gであった。製造例 2

下記の化合物を攪拌装置と冷却管を備えた 5 Lフラスコ中で 2 のトルエンに溶解し、窒素雰囲気下に 80 ± 2°Cで 9時間加熱して重合を行った。

CH₂ = CHCH₂0 (C₂H₄0) ₃₃ CH₃ 1 524 g (1. 0モル）無水マレイン酸 103 g (1. 05モル）

t e r t—ブチノレぺノレオキシ一 2—ェチノレへキサノエート 10. 8 g (0. 0 5モノレ）

次いで、トルエン及び未反応の無水マレイン酸を 1. 3〜4. OKP aの減圧下に 1 10± 10°Cで留去し、 1 518 gの共重合体 No. 2を得た。得られた共重合体 No. 2は 25°Cにおいて茶色の固体であり、験化価は 49. 2 KOHm gZgであった。製造例 3〜 8

表 1に示された式（1) で示される化合物ならびに表 2に示された無水マレイン酸及ぴ触媒を表 1及び表 2で示されたモル比とした以外は製造例 2と同様にして共重合体 N o . 3〜No. 8を調製した。共重合体 No . 3〜No. 8の質量平均分子量、験化価、形状及び有機溶剤に対する溶解性などの特性を表 3に示す。

* ：ォキシエチレン基の割合（質量⁰ /₀) を示す。

注） { } 内はランダム状付加物であることを示す表 2

B P O ：ベンゾィノレペルォキシド

L P O ：ラウロイノレペルォキシド

t -BEH： t e r t一ブチルペルォキシ一 2—ェチルへキサノエ一ト

表 3

実施例 1

共重合体 No. 1一ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン（lmo 1 ) 付加体の合成

ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン 748 mg ( 1 mm o 1 )を、攪拌装置を備えた 10 OmLのフラスコ中で、トルエン 5 OmLを加えて 40°C で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム 82 mg (1 mmo 1 ) を添カ卩し、共重合体 N o. 1を 21. 9 g (0. 98 mmo 1 ) 加えて 40°Cで 5時間反応を行った。反応終了の確認は TLCにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールァミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールァミンと酢酸ナトリゥムとを除去し、トルエンを減圧留去することにより共重合体 No. 1—ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン 19. 8 gを得た。

生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（TL C) によって行った。展開溶媒にはクロ口ホルムとメタノールの混合比が 85 ： 1 5体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。丁じにて1 £値0. 05付近に認められるジステアロイルホスファチジルエタノールァミンのスポッ卜が消失した。生成物の確認は I Rスぺクトルにおいて、ホスファチジノレエタノールアミンのアミノ基が共重合体 No. 1とアミド結合することにより、ァミノ基の 2960 cm-¹ のピークが消失し、新たに 2級アミドのピークが 1 740 c m-¹に見られることにより確認した。実施例 2

共重合体 No. 1—ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン（2mo 1 ) 付加体の合成

ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン 748mg (1 mmo 1 )を、攪拌装置を備えた 10 OmL のフラスコ中で、トルエン 5 OmLを加えて 40°C で攪拌し、さらに酢酸ナ bリウム 82mg (lmmo 1 ) を添カ卩し、共重合体 N o. 1を 1 1. O g (0. 5 mmo 1 ) 加えて 40°Cで 5時間反応を行った。反応終了の確認は下記の TLCにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールァミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールァミンと酢酸ナトリゥムを除去し、トルエンを減圧留去することにより共重合体 No. 1—ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン 10. 4 gを得た。

生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（TL C) によって行った。展開溶媒にはクロ口ホルムとメタノールの混合比が 85 ： 15体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。丁しじにて1 £値0. 05付近に見られるジステアロイルホスファチジルエタノールァミンのスポットが消失した。生成物の確認は I Rスぺクトルにおいて、ホスファチジルエタノールァミンのアミノ基が共重合体 No. 1とアミド結合することにより、ァミノ基の 2960 cm一¹のピークが消失し、新たに 2級アミドのピークが 1 740 c m一¹に見られることにより確認した。実施例 3

共重合体 No. 2—ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（lmo 1 ) 付加体の合成

ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン 748mg ( 1 mm o 1 )を、攪拌装置を備えた 10 OmL のフラスコ中で、トルエン 5 OmLを加えて 40°C で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム 82 m g (1 mmo 1 ) を添カ卩し、共重合体 N o. 2を 20. 9 g (0. 99mmo 1 ) 加えて 40°Cで 5時間反応を行った。反応終了の確認は下記の TLCにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールァミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールァミンと酢酸ナトリウムを除去し、トルエンを減圧留去したのち、トルエン 2 OmLを加え溶解し、へキサン 10 OmLに滴下し、共重合体 No. 2—ジステアロイルホスファチジルェタノールァミンの結晶を得た。結晶はろ過し真空乾燥することにより 1 9. 3 g の目的物の乾燥結晶を得た。

生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（TL C) によって行った。展開溶媒にはクロ口ホルムとメタノールの混合比が 85 ： 15体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。丁しじにて1 £値0. 05付近に見られるジステアロイルホスファチジルエタノールァミンのスポットが消失した。生成物の確認は I Rスぺクトルにおいて、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基が共重合体 No. 1とアミド結合することにより、ァミノ基の 2960 cm一¹のピークが消失し、新たに 2級アミドのピークが 1 740 cm— ¹に見られることにより確認した。実施例 4

共重合体 No. 2—ジステアロイルホスファチジルェタノ一ルァミン（2mo 1 ) 付加体の合成

ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン 748mg ( 1 mm o 1 )を、攪拌装置を備えた 10 OmL のフラスコ中で、トルエン 5 OmLを加えて 40 °C で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム 82 m g (lmmo 1 ) を添加し、共重合体 N o. 2を 10. 5 g (0. 5mmo 1 ) 加えて 40°Cで 5時間反応を行った。反応終了の確認は下記の TLCにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールァミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールアミンと酢酸ナトリウムを除去し、トルエンを減圧留去したのち、トルエン 2 OmLを加え溶解し、へキサン 10 OmLに滴下し、共重合体 No. 2—ジステアロイルホスファチジルエタノールァミンの結晶を得た。結晶はろ過し真空乾燥することにより 10. O gの目的物の乾燥結晶を得た。

生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（TL C) によって行った。展開溶媒にはクロ口ホルムとメタノールの混合比が 85 ： 1 5体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。丁し0にて1 £値0. 05付近に見られるジステアロイルホスファチジルエタノールァミンのスポットが消失した。生成物の確認は I Rスぺクトルにおいて、ホスファチジルエタノールァミンのァミノ基が共重合体 No. 1とアミド結合することにより、ァミノ基の 2960 cm^-1のピークが消失し、新たに 2級アミドのピークが 1 740 cm-¹に見られることにより確認した。実施例 5

共重合体 No. 5—ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン（2 mo 1 ) 付加体の合成

ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン 748mg ( 1 mm o 1 )を、攪拌装置を備えた 10 OmL のフラスコ中で、トルエン 5 OmLを加えて 40°C で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム 82 mg (lmmo 1) を添加し、共重合体 N o. 5を 10. 4 g (0. 49mmo 1 ) 加えて 40°Cで 5時間反応を行った。反応終了の確認は下記の TLCにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールァミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールァミンと酢酸ナトリウムを除去し、トルエンを減圧留去することにより共重合体 No. 5—ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン 1 0. l gを得た。

生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（TL C) によって行った。展開溶媒にはクロ口ホルムとメタノールの混合比が 85 ： 15体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。丁し。にて1 £値0. 05付近に見られるジステアロイルホスファチジルエタノールァミンのスポットが消失した。生成物の確認は I Rスぺクトルにおいて、ホスファチジルエタノールァミンのアミノ基が共重合体 No. 1とアミド結合することにより、ァミノ基の 2960 cm一¹のピークが消失し、新たに 2級アミドのピークが 1 740 cm一¹に見られることにより確認した。実施例 6

共重合体 No. 5 _ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン（lmo 1 ) 付加体の合成

ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン 748 m g (lmmo 1 )を、攪拌装置を備えた 10 OmL のフラスコ中で、トルエン 5 OmLを加えて 40°C で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム 82mg (lmmo 1) を添カ卩し、共重合体 N o. 4を 90. 9 g (0. 99mmo 1 ) 加えて 40°Cで 8時間反応を行った。反応終了の確認は下記の TLCにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールァミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールァミンと酢酸ナトリウムを除去し、トルエンを減圧留去することにより共重合体 No. 4—ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン 85. 4 gを得た。

生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（TL C) によって行った。展開溶媒にはクロ口ホルムとメタノールの混合比が 85 ： 15体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。丁しじにて1 £値0. 05付近に見られるジステアロイルホスファチジルエタノールァミンのスポットが消失した。生成物の確認は I Rスぺクトルにおいて、ホスファチジルエタノールァミンのアミノ基が共重合体 No. 1とアミド結合することにより、ァミノ基の 2960 cm— ¹のピークが消失し、新たに 2級アミドのピークが 1 740 c m-¹に見られることにより確認した。実施例 7 ：化粧水の調整（可溶化剤としての評価）

合成例 6の共重合体 No. 5 _ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（lmo 1 ) 付加物を使用して化粧水を作成した。表 4の組成からなる基材のうち精製水にグリセリン、プロピレングリコールを加え均一に溶解した。その他の基材をェタノールに加え均一にした後、前述の精製水相部に攪拌しながら添加し可溶化し化粧水を得た。

表 4

実施例 8 ：リボソーム乳液の調整（化粧料用分散剤としての評価）

リボソーム調製法

大豆水添ホスファチジノレコリン 645mg、コレステロ一ノレ 299mg及びミリスチン酸 23m g (モル比 1 : 1 : 0. 1) 及び共重合体 No. 2 _ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン（lmo l ) 付加物を混合脂質濃度 5m o 1 %となるように加えて、予め 60°Cに加温した生理食塩水 10〜l lmLを混合脂質濃度 10質量％となるように加えて攪拌し、さらに 60°Cの水浴中でホモゲナイザーにて 1 0分間混合しリボソーム溶液を得た。そのリボソーム溶液を用いて表 5の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を 60°Cに加温し均一に溶解した後、攪拌しながら水相部を同温度で添加しリポソーム乳液を得た。油相部：

へキサデシノレアノレコーノレ 2. Owt% ヮセリン 2. Owt% スクヮラン 5. O t% 流動パラフィン 10. Owt% ポリォキシエチレンモノォレイン酸エステノレ 2. Owt% トコフエ口ール 0.02wt% 香料適量防腐剤適量水相部：

プロピレングリコーノレ 2.0wt% 精製水 67.0wt% リポソーム溶液 10.0wt 実施例 9 ：血中滞留性リボソームとしての評価

(1) リボソームの調製

表 6に示した膜組成比率（処方例 1〜 6、対照例 1〜 2 )の脂質を各々枰取し、クロ口ホルム .メタノール混液（2 ： 1) に溶解させた後、エバポレーターにより有機溶媒を留去し、さらに 1時間減圧乾固させた。次に、この脂質乾燥物（リピドフィルム）に、予め 65 °Cに加温しておいた 1 55mM硫酸アンモニゥム水溶液（pH5. 5) 1 OmLを加え、湯浴につけながらボルテックスミキサーにて軽く撹拌した（ナスフラスコから脂質が剥がれる程度まで)。この脂質分散液をホモジナイザーに移して、 10 s t r o k eホモジナイズした後、種々孔径のポリカーボネートメンブレンフィルターを用いてサイジング（0. 2 μπιΧ 3回、 0. l /imX 3回、 0. 05 μ mX 3回及び 0. 03 im X 3回）を行い、粒子径 10 Onm前後の空リボソーム分散液を調製した。

この空リボソーム分散液 4 m Lを生理食塩水で 2. 5倍希釈し、この希釈したリボソーム分散液を超遠心用チューブに入れ、 65, 000 r pmで 1時間遠心分離した後、上淸を捨て、生理食塩水で遠心前のリボソーム分散液量 1 OmLになるように再懸濁させた（この時点で、トータル脂質濃度として 5 OmMとなるよう調整した）。上記の外水相を生理食塩水に置換した空リボソーム分散液（トータル脂質濃 5 OmM)及びドキソルビシン溶液（医薬濃度： 3. Smg/mL 生理食塩水）を予め 60°Cに加温しておき、容量比で空リボソーム分散液 4に対しドキソルビシン溶液 6を加えた後（最終医薬濃度は 2. Omg/mL,最終脂質濃度は 20mM)、 1時間、 60°Cでインキュベートした。次いでこれを室温にて冷却し、ドキソルビシン含有リボソーム分散液とした。

(2) リボソームの物性

ドキソルビシンのリボソームへの保持率は、上記リボソーム分散液の一部を取つてゲル濾過（セフアデックス G_ 50 ；移動相は生理食塩水）を行い、ボイドボリユームに溶出したリボソーム分画中のドキソルビシンを液体クロマトグラフィ一にて定量することにより求めた。また粒子径は、上記リボソーム分散液の一部を取って準弹性光散乱（QELS) 法にて測定した。その結果、表 6に示すように、処方例 4及び 5以外のリボソームでは、主薬ドキソルビシンの保持率がほぼ 100%であったため、元のリボソーム分散液をそのまま用い、以下に示すラットでの血中滞留性実験用に生理食塩水にて 4/ 3倍希釈した（最終医薬濃度は 1. 5mg/mL、最終脂質濃度は 15mM)。また、処方例 4及ぴ 5のリポソ一ムは、超遠心分離（65, 000 r pm、 1時間）操作を行い、上清の未封入薬物を除去した後、生理食塩水にて最終薬物濃度が 1. 5mgZmLとなるように調製した（最終脂質濃度は処方例 4が約 17. 2 mM,処方例 5が約 17. 9 mM)₀ なお、いずれのリボソームもその粒子径は 50〜100 nmであった。

(3) ラットでの血中滞留性実験

上記処方例 1〜6、対照例 1〜2を用いて、 SD系雄性ラット（6週令）における血中滞留性実験を行った。エーテル麻酔下でラット頸静脈より各リボソーム分散液を投与し（1群 5匹；投与量は 7.5mg ドキソルビシン 5 m Lノ k g)、その後、各採血時点（2、 4、 8、 24、 48、 72、 1 20、 168時間）でエーテル麻酔下、頸静脈よりへパリン採血（0. 5〜lmL) を行い、血漿分離を行った。その後、常法に従い、前処理して HP LC法にて血漿中医薬濃度を測定した。各リボソーム分散液処方の血漿中医薬濃度から台形法にて AUC (0〜 ∞) を算出した。表 6に示すように、対照例 1の本発明の脂質誘導体を含まないリボソーム、あるいは対照例 2の本発明の脂質誘導体のリン脂質部分（DS PE；ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン）のみを添加したリボソームの AUCに比して、本発明のリン脂質誘導体を含むリボソーム処方（処方例 1〜6) では 1オーダー以上大きな AUCが得られ、明らかに高い血中滞留性が認められた。

表 6

注） DSPEl— AKM0531 => PEG鎖分子量 =500, k=30, k30molに対して DSPE Imol DSPEl -AKM0350 → PEG鎖分子量 =300， k=50, k50molに対して DSPE Imol DSPE2— AKM0350 = PEG鎖分子量 =300, k=50, k50molに対して DSPE 2mol DSPEl -AKM1511 → PEG鎖分子量 =1500, k=10, klOmolに対して DSPE Imol HSPC：大豆水添フォスファチジルコリン

Κ=Κ^:+Κ^Π 産業上の利用可能性

本発明のリン脂質誘導体は生体に対して安全性が高く、化粧料の分野などにおける界面活性剤、可溶化剤、又は分散剤として有用である。また、本発明のリン脂質誘導体は、リポソームなどの脂質膜構造体の製造のために用いることができ、本発明のリン脂質誘導体を含む脂質膜構造体、好ましくはリボソームは、血中滞留性に優れるという特徴がある。

Claims

請求の範囲

1. リン脂質であって、

(A) 下記式（1) で表される構成単位 A、

(B) 下記式（2A) 及び/又は下記式（2 B) で表される構成単位 B、並び

(C) 下記式（3) で表される構成単位 C ：

〔式（1) 中、 R¹及び R²はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示すが、 R¹ 及び R²が同時にメチル基になることはなく； R³は炭素数 1〜 3の 2価の炭化水素基を示し； AOはそれぞれ独立に炭素数 2〜4のォキシアルキレン基を示し； mはォキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、 4≤m≤ 100の範囲の数であり； R⁴は水素原子、炭素数 1〜20の炭化水素基、又は炭素数 1〜 20のァシル基を示し、式（2A) 中、 Xはそれぞれ独立に水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム、又は有機アンモニゥムを示し、式（3) 中、 R⁵CO及び R⁶CO はそれぞれ独立に炭素数 8〜 24のァシル基を示し； R ⁷は炭素数 2〜 4の 2価の炭化水素基を示し； Xは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム、又は有機アンモニゥムを示し； Yは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニゥム、又は有機アンモニゥムを示す〕を必須構成単位として含む共重合体であって、構成単位

Aと構成単位 B及び構成単位 Cの合計とのモル比が 7 3〜 3 / 7であり、かつ構成単位 Cを共重合体 1モル中に 1〜 5モルの割合で含むリン脂質誘導体。

2 . 共重合体中に含まれる構成単位 A、構成単位 B、及び構成単位 Cの総数が 3 以上で、かつ 1 5◦以下である請求の範囲第 1項に記載のリン脂質誘導体。

3 . 共重合体中に含まれる構成単位 A、構成単位 B、及び構成単位 Cの総数が 5 以上で、かつ 5 0以下である請求の範囲第 1項に記載のリン脂質誘導体。

4 . R ¹が水素原子であり、 R²が水素原子又はメチル基であり、 R³がメチレン基である請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に記載のリン脂質誘導体。

5 . R⁷がエチレン基である請求の範囲第 1項ないし第 4項のいずれか 1項に記載のリン脂質誘導体。

6 . 請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項に記載のリン脂質誘導体を含む界面活性剤。

7 . 請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項に記載のリン脂質誘導体を含む脂質膜構造体。

8 . リボソームである請求の範囲第 7項に記載の脂質構造体。

9 . 医薬を保持した請求の範囲第 7項又は第 8項に記載の脂質構造体を含む医薬組成物。

1 0 . 医薬が抗腫瘍剤である請求の範囲第 9項に記載の医薬組成物。

1 1 . 請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項に記載のリン脂質誘導体の製造方法であって、構成単位 Aと構成単位 Bとを 7 3〜3 / 7のモル比で含む共重合体に対して下記の式（4 ) ：

(式中、 R⁵CO、 R⁶CO、 R⁷、及び Yは上記と同義である）で表される化合物を反応させる工程を含む方法。