WO2004026341A1

WO2004026341A1 - ガンの免疫治療剤

Info

Publication number: WO2004026341A1
Application number: PCT/JP2003/011895
Authority: WO
Inventors: Akikuni Yagita
Original assignee: Orient Cancer Therapy Co.,Ltd.
Priority date: 2002-09-19
Filing date: 2003-09-18
Publication date: 2004-04-01
Also published as: JPWO2004026341A1; AU2003264488A1; US20060067947A1; EP1552849A1

Abstract

分子標的治療薬のより有効な効果をもたらすことを目的とし、完全寛解率を上げ、完全寛解への期間の短縮化を達成し、免疫療法との相乗効果を達成するための手段を提供するものである。つまり、CTL活性、NKT活性、NK活性及び-VEGF等に着目する新免疫療法と分子標的治療薬特にチロシンキナーゼ阻害剤の併用による相乗効果の達成を課題とする。チロシンキナーゼ阻害剤とIL-12産生誘導剤の併用がガン治療における優位な相乗効果を達成することを見出し本発明を完成した。

Description

明細書ガンの免疫治療剤本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号 2002-273738,2002-281780,2002-354515,2003-161238,2003-169153 カゝらの優先権を請求する。技術分野 '

. 本発明は、癌治療の新たな領域を提供するものである。すなわち、新規な癌治療法として着目されるチロシンキナーゼ阻害剤と医学博士八木田旭邦が開発した NK細胞の活性化能、 NKT.細胞の活性化能、血管新生阻害能、 IL-12の産生誘導能及び IFN yの産生誘導能の動態に着目した新免疫療法の併用による新規なガン治療剤の提供に関する。背景技術

ガン（malignant neoplasms) (cancer) の予防または治療のために有用な物質の選別には、従来、ガン細胞へのその直接的作用が重要視されていた。免疫賦活剤がガン治療に有用であることは認められていたが、免疫賦活剤として得られた化合物はいずれもその抗ガン効果が微弱であり、免疫療法単独または化学療法との併用治療によってもガンの十分な治療効果は達成されていない。

本発明者の医学博士、八木田は、先にガン治療における画期的な手法として、インターロイキン 1 2 (IL-12) を生体内で誘発する物質の有用性に着目し、キノコ菌糸体加工物がその機能を有することを発見し、新免疫療法（Novel Immuno therapy for cancer) (NITC) ともいうべきガン治療法を確立した。従来 IL'12 は、抗ガン効果があるものの生体内に IL-12自体を直接投与した場合には副作用を生じるために患者が治療に耐えられないという事実があり、それ自体を抗ガン剤として使用できなかった。しかし、八木田が報告したキノコ菌糸体加工物を含む製剤は、ガンの治療において著しい治癒 ·延命効果を達成した。つまり八木田は、 IL-12 を生体内で誘発できる有効量のキノコ菌糸体加工物を投与することにより、ガンの治療目的を達成した { (特許文献 1 ) 特開平 1 0— 1 3 9 6 7 0号公報 }。

IL-12 は、 TNF a→IFN y→IL-12→CTL活性というルートでキラー T細胞の活性化効果と増強効果をもつ。つまり IL-12の産生増強は、キラー T細胞の活性化と増強により抗ガン効果が期待される。

八木田は、 IL-12の産生増強の系とは別に NKT細胞の活性化が抗ガン効果に有用であることを報告している。谷口等は、 NKT細胞が有する V a 2 4 V ]3 1 1という特異的な T細胞抗原受容体（T C R ) が認識する特異的な糖脂質抗原を発見し、この抗原が、 αガラクトシルセラミドであることを報告している。更に、 α ガラクトシルセラミドを投与した担ガンマウスでは、 ΝΚΤ細胞が活性化され、ガンの消失はみられないものの転移が抑制されることを証明した。

ΝΚΤ細胞には、もう一つの受容体として ΝΚ細胞抗原受容体（NKR-P1；ナチュラルキラー受容体 P 1 ) があることは報告されている { (非特許文献 1 ) 特集 ΝΚΤ細胞の基礎と臨床：最新医学 5 5巻 4号 2 0 0 0年 8 1 8〜 8 2 3ページ }。

NKR-P1も ΝΚΤ細胞の活性化に関与し、この活性化が抗ガン効果がより優位であることを八木田は見出している { (特許文献 2 ) US2002-0010149A1}。

ガンの分子標的治療剤が新タイプの制癌剤として従来の細胞標的治療剤と対比してその意義が着目されている。そのなかでも特にシグナル伝達阻害作用を有する薬剤としてチロシンキナーゼ阻害剤は注目されている。 ZD1839 (ィレッサ：登録商標ァストラゼネ力）は EGFR (上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼの ATP結合部位における ATPとの競合作用を有し、チロシンキナーゼの自己リン酸化を抑制することでチロシンキナーゼ活性を抑制する。その結果、 EGFRのもつ増殖、浸潤、分化、転移に関連するシグナル伝達〔EGFRの細胞外ドメインに上皮成長因子（EGF) 等のリガンドが結合することにより、細胞内ドメインにある EGFRチロシンキナーゼが活性化し、 EGFRの自己リン酸化および種々の細胞内標的たんぱくのリン酸化を引き起こすことにより細胞表面から核への増殖シグナルが伝達され、 ·癌細胞表面から核への増殖シグナルが伝達され、癌細胞の増殖、浸潤、転移、血管新生を起こす〕を遮断することにより抗癌作用を発現する。 IMC-C225 (EGFR標的モノクローナル抗体）は細胞膜表面の EGFRレセプター部分を認識し、 EGFRの自己リン酸化を抑制することでチロシンキナーゼ活性を阻害する。ハーセプチンは EGFRと相同性をもつ Her2/Neuに対するモノクロ一ナル抗体であり、 STI-571 (ダリベック）は BCR-Ablのチロシンキナーゼ活性の阻害と c一 kitのチロシンキナーゼ活性の阻害能を有する { (非特許文献 2 )血液' 免疫 ·腫瘍 Vol. 7 No.3 2002-7}。

このような分子標的治療剤は新メカニズのガン治療薬として着目されるが、その効果はいまだ革命的とはいえない。たとえば、 ZD1839 (ィレッサ）はァストラゼネ力社が新規に開発した強力かつ選択的な EGFR チロシンキナーゼ阻害剤であり、ヒトでもその有用性が判明している。しかし非小細胞肺癌や前立腺癌などでの臨床成績は PR (部分寛解）力 S 10〜20数。/。で、 CR (完全寛解）は全くないと言ってもよいが、あっても極くまれで完全寛解まで 4ヶ月以上の期間がかかつていた。そこで ZA1839 (ィレッサ）と各種抗癌剤との併用療法が試みられているものの現時点では相加あるいは相乗効果は得られていない。発明の開示

本発明は、上記のような分子標的治療薬のより有効な効果をもたらすことを目的とし、完全寛解率を上げ、完全寛解への期間の短縮化を達成し、免疫療法との相乗効果を達成するための手段を提供するものである。つまり、 CTL活性、 NKT 活性、 NK活性及び- VEGF等に着目する新免疫療法と分子標的治療薬特にチロシンキナーゼ阻害剤の併用による相乗効果の達成を課題とする。

本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤と IL-12産生誘導剤の併用がガン治療における優位な相乗効果を達成することを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、

「 1 . チロシンキナーゼ阻害剤と IL-12産生誘導剤が併用されることを特徴とするガンの治療剤。

2 . チロシンキナーゼ阻害剤が、以下の 1 ) 〜 7 ) の少なくとも 1の受容体に対する選択的標的作用を有する前項 1のガンの治療剤。

1 ) HER2/neu、 2 ) HER3、 3 ) HER4、 4 ) c'kitヽ 5 ) PDGFR、 6 ) bcrabl、 7 ) EGFR

3 . チロシンキナーゼ阻害剤が、選択的 EGFR又は c-kit標的作用を有する前項 1のガンの治療剤。

4 . IL-12産生誘導剤が、 j3 1，3/1,6グルカン構造を有する物質である前項 1〜3 の何れか一に記載のガンの治療剤。

5 . IL-12産生誘導剤が、 β 1,3/1,6グルカン構造を有する茸菌糸体由来成分又は酵母由来成分である前項 4のガンの治療剤。

6 . ガンの化学療法剤及び放射線治療との併用無しに処置される前項 1〜 5の何れか一に記載のガンの治療剤。

7 . ΝΚΤ細胞の NKR-P1に選択的に作用して ΝΚΤ細胞を活性化をおこす物質と併用される前項 1〜6の何れか一に記載のガンの治療剤。

8 . 血管新生阻害能を有する物質と併用される前項 1〜 7の何れか一に記載のガンの治療剤。

9 . 以下の 1 ) 又は 2 ) のいずれか 1をマーカーとしてチロシンキナーゼ阻害剤と IL-12産生誘導剤の併用治療が行われる前項 1〜 8の何れか一に記載のガンの治療剤。

1 ) ΝΚΤΡ値の投与前値が 5.0%以上の測定値を示す、

2 ) Th2値の投与前値が 3 %以上の測定値を示す

1 0 . Thl/Th2比がィレッサ投与前値に比較して投与数ケ月後に増加の測定値を示すことを併用治療の継続のマーカーにする前項 1〜 9の何れか一に記載のガンの治療剤。

1 1. NKTP値の投与前値が、 5.0%未満の測定値を示すことを特徴とする前項 1

0に記載のガンの治療剤。

1 2. IL-12、 INF 0/の測定値が、ィレッサ投与前値に比較して投与数ケ月後の値で低下していないことを併用治療の継続のマーカーにする前項 9に記載のガンの治療剤。

1 3. ガンの治療剤が肺（腺）ガン治療剤であることを特徴とする前項 1〜12 の何れか一に記載のガンの治療剤。

14. 前項 1〜1 3の何れか一に記載のガン治療剤を用いたガンの治療方法。」からなる。図面の簡単な説明

(図 1) 患者のレントゲン図

(図 2) 患者のレントゲン図 .

(図 3) 破骨細胞分化の必須シグナルの図

(図 4) 肺（腺）癌の奏効例

(図 5) 大腸癌の奏効例

(図 6) 各種癌での奏効例

(図 7)ロジスティック回帰係数分析による各マーカーの奏効に対する寄与度（肺腺ガン）

(図 8) ィレッサ投与患者における口ジスティック回帰係数分析による各マーカ一の奏効に対する寄与度（肺腺ガン）

(図 9) ィレッサ投与前における有効例（B群）と無効例（A群）の比較 (図 10) NKTP<5.0における有効例（B群）と無効例（A群）の比較

(図 1 1) 2つの閾値による有効 ·無効群

(図 1 2) ィレッサと新免疫療法との作用時期の相違

(図 1 3) ィレッサ投与前における C群及び D群の比較 (図 1 4 ) C群、 D群におけるサイト力インの相違

(図 1 5 ) ィレッサと NITCとの抗腫瘍作用における相乗作用機序仮説発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳しく説明するが、本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者により普通に理解される意味を持つ。

本発明者の医学博士八木田のガン新免疫療法（NITC) とは 4つの異なる作用機序を組み合わせることからなる治療手段である。

第一の作用機序は、血管新生阻害物質（ベターシヤーク）を投与してガンへの血流を障害してガン縮小をはかる方法である。これは血管内皮細胞増殖因子

(VEGF) を測定することでその効果は判定が可能である。血管新生阻害作用は VEGF値のマイナス（負）値（-VEGF) で評価できる。この VEGF値の替わりに FGF、 HGFなどのその他の血管増殖因子を用いることも血管新生阻害能を評価することが可能である。また VEGFの替わりに血管新生阻害因子の正数値でもその評価が可能である（例えばエンドスタチン値）。

第 2の作用機序は、 β 1,3グルカン構造を担持する化合物を投与して Thlサイトカイン (TNF a、 IFN v、 IL_12)を誘導して CTLを活性化する方法である。 CTL 活性は CD8(+)パーフォリン産生能力で判定が可能であるが、この CD8(+)パーフオリン値には細胞障害性 T細胞 (CTL)と免疫抑制性 T細胞 (STC; Suppressor T cell)とがあり、前者はガン細胞を障害し、後者の活性化は結果的にガンの増殖につながる。したがってその絶体値では評価はできない。しかし前者は IFN yが 10 IU/ml以上かもしくは IL-12値が 7.8 pg/ml以上であれば CTLであり、 IFN yと IL-12が低値であれば STC と判定される。そこで CTL活性は、 IFN T/産生能力 (IFN y値）もしくは IL-12産生能力 (IL-12値)で評価が可能である。

第三及び第四の作用機序である《1,3 グルカン構造を担持する化合物の投与によって活性化される effector細胞は NK細胞と NKT細胞である。この NKと NKT 細胞とは NKR-P1(NK 細胞受容体 CD161( + ))を共有しており、前者は CD3(—） CD161(+)の表面マーカーで NK細胞数は測定可能であり、その活性化は CD3(—） CD161( + )パーフォリン産生能力で判定が可能である。一方後者の NKT細胞は CD3( + )CD161(+)でその細胞数は測定が可能となり、そのパーフォリン産生能力（NKTPと記す）で NKT細胞の活性化は測定可能である。

したがってガン治療における新免疫療法（NITC) であっても一般的な免疫療法であっても、以下の測定項目でそれぞれの effector細胞もしくは血管新生阻害作用を評価することが可能である。具体的には、 CTL活性は IFN γあるいは IL-12 の産生誘導能力で評価が可能である。 ΝΚ細胞の活性化は CD3(—） CD16 + )もしくは CD3(— )CD161( + )パーフォリン値でも評価可能である。 NKT細胞の活性ィ匕は CD3(+)CD161(+)もしくは CD3( + )CD161(+)パーフオリン値（NKTP値）でも評価が可能である。

- 本発明は、上記の新免疫療法にチロシンキナーゼ阻害剤を併用することによる臨床における結果を検討することにより行われた。本発明者は、新免疫療法（N I T C ) として、ガン患者に α 1,3グルカン構造を担持する化合物、 β 1,3グルカン構造を担持する化合物と血管新生阻害作用物質（サメ軟骨）を併用し、 IL-12、 IFN y他の各種サイトカインを測定した。なお、 CD8 ( + )パーフオリン産生は、 ΓΡΝ γ及び IL-12の産生とは強い正の相関性が存在し、この結果、 CD8 ( + ) パーフオリン産生の測定は CTL活性ルートの評価に意義を見出している。

この意義により CD8 ( + ) パーフォリン産生能の測定は、有用な CTL活性化剤（つまり IL-12産生誘発剤）のスクリーニング方法に適用可能であり、このスクリーニング方法を利用すれば CTL活性化能（IL-12産生誘発能）を担持する新規 i3 1,3グルカンの特定が可能である。本発明で使用する、 IL-12産生誘導剤は特に限定せず、広く使用可能である。例えば、 ]3 1,3 グルカン構造を持つ茸菌糸体組成物製剤（例えば ILX商品名：東西医薬研究所、 ILY商品名：セィシン企業、 AHCC：ァミノアップ）、或は 1，3 グルカン構造を持つ各種酵母（海洋性酵母、パン酵母、 NBGTM) が利用できる。また、新規な IL-12産生誘導剤は、 CD8ノーフオリン産生能の測定を組み合わせることで当業者は容易に IL-12産生誘導剤 (CTL活性化剤）を特定可能である。 CTL活性化剤は、本発明で使用する IL-12 産生誘導剤と同義である。

本発明では、この IL-12産生誘導剤とチロシンキナーゼ阻害剤の併用が必須である。具体例では、 ZD1839 (ィレッサ商品名）又は STI571 (ダリベック商品名）を使ったが、各種チロシンキナーゼ阻害剤が有効に利用できる。それらは標的分子として、 HER2/neu、 HER3、 HER4、 c-kit、 PDGFR, bcr-abl、 EGFR等が例示される。最も効果的な分子は EGFR又は c-kitである。

チロシンキナーゼ阻害剤の投与量は、各分子標的化合物の推奨投与量に従うが、 10〜500m g /日の経口投与がおこなわれる。

IL-12産生誘導剤とチロシンキナーゼ阻害剤の併用は、特に限定はされないが、治療初期からでもどちらを先行させていても良い。具体例では、 NITC療法特に IL-12 産生誘導剤を一定期間投与後に、チロシンキナーゼ阻害剤を併用し、劇的な臨床効果を確認した。

本発明では、 IL-12産生誘導剤に加えて、 NK活性化剤又は NKT活性剤の併用が可能である。 -ゲロオリゴ糖、フコィダン等のひ 1,3 グルカン構造を持つ化合物の組成物製剤が NK活性化剤又は NKT活性剤として有用である。 a l,3グルカン構造を持つ化合物は種々知られており、この既知構造と CD3 (—） CD161 ( + )、 CD3 (―) CD161 ( + ) パーフォリン産生能、 CD3 ( + ) CD161 (十）、 CD3 ( + ) CD161 ( + ) パーフォリン産生能の測定を組み合わせれば当業者は容易に NK活性化剤又は N K T活性化剤を特定可能である。なお、 CD3 ( + ) CD161 ( + ) は NKT細胞の受容体 NKR-P1に作用することを意味する。

« 1,3 グルカン構造の糖類物質としては、例えば、ニゲロオリゴ糖（T S O)、フコィダン、硫酸オリゴ糖等が挙げられる。

ニゲロオリゴ糖は、 3— 0— α— D—ダルコビラノシルー D—グルコースを構成単位として含有する糖類である。代表的なものとしては、ニゲロース、 -ゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトース等が挙げられる。また、市販されているニゲロオリゴ糖としては、ニゲロオリゴ糖液糖（販売者 · 武田食品工業株式会社）が挙げられるが、これが含有する主なニゲロオリゴ糖は (1) ニゲロース a -D-Glc p - ( 1, 3) -D-Glc (2) ニゲロシルグルコース α -D-Glc p - ( 1,3) - a -D-Glc p - ( 1,4) -D-Glc (3) ニゲロシルマルトース a 'D'Glc p - ( 1,3) - a -D-Glc p■ ( 1,4) - α -D-Glc p - ( 1,4) -D-Glc (なお、 Glc はダルコース、 pはビラノースの略号である）である。

フコィダンは、狭義ではフコースの 2乃至 6分子に硫酸 1分子が結合した硫酸化フコース含有多糖類であり、これにキシロースあるいはゥロン酸を含有したフコィダン様多糖体を食品レベルで「フコィダン」と称している。フコィダンは、例えばコンブを破砕し、チップ化し、水溶液成分を抽出した後、抽出残渣を遠心分離により除去し、ョードや塩化ナトリゥム等の低分子物質を限外ろ過により除去して凍結乾燥化して製剤化される。

フコィダンとしては、褐藻類由来フコィダン、例えばガゴメコンブ由来のフコィダン、およびォキナヮモズク由来フコィダン等が例示される。ガゴメコンブ等の褐藻類コンブ科由来のフコィダンには少なくとも 3種類のフコィダン、 F—フコィダン ( α— L一フコースのポリマー）、 U—フコィダン ( β— D—グノレク口ン酸と α— D—マンノースを主鎖とし、側鎖に α— L—フコースをもつ）、 G—フコィダン（j3—D _ガラクトースを主鎖とし、側鎖に α— L—フコースをもつ）、が存在しており、いずれのフコイダンもフコースが硫酸化されている。

硫酸オリゴ糖としては、例えば株式会社白子製のスサビノリ（Poryphyra Yezaensis) 由来の抽出物があげられる。該抽出物の主成分は α 1，3結合のガラクタン硫酸のオリゴ糖とひ 1,3 結合および ]3 1，4 結合よりなるガラクタン硫酸のォリゴ糖である。

本発明のチロシンキナーゼ阻害剤と CTL活性化剤（IL- 12産生誘導剤、 INF y 産生誘導剤）との併用、更には NK活性化剤、 NKT活性化剤、新生血管阻害剤との併用は、その適用法を選別することで肺ガン（肺扁平上皮ガン、肺腺ガン、小細胞肺ガン）、胸腺腫、甲状腺ガン、,前立腺ガン、腎ガン、膀胱ガン、結腸ガン、直腸ガン、食道ガン、盲腸ガン、尿管ガン、乳ガン、子宮頸ガン、脳ガン、舌ガン、咽頭ガン、鼻腔ガン、喉頭ガン、胃ガン、肝ガン、胆管ガン、精巣ガン、卵巣ガン、子宮体ガン、転移性骨ガン、悪性黒色腫、骨肉腫、悪性リンパ腫、形質細胞腫、脂肪肉腫等の治療に有効である。

本発明に係るチロシンキナーゼ阻害剤と CTL活性化剤（IL-12産生誘導剤、 INF γ産生誘導剤）の併用、更には ΝΚ活性化剤、 ΝΚΤ活性化剤、新生血管阻害剤との併用は、その活性化を誘導または増強し、さらに活性化を維持できる処方にて用いられる。すなわち、その活性化を誘導または増強し、さらに活性化を維持できる投与量、ならびに投与期間を選択して用いられる。具体的には、その投与量は、 ΝΚ活性化剤又は ΝΚΤ活性化剤である α -1,3グルカン構造を持つ化合物は l g〜40 gZ日程度、好ましくは 5 g〜20 gZ日程度で、 CTL活性化剤 (IL-12産生誘導剤、 INI>産生誘導剤）である -1，3 グルカン構造を持つ化合物は 1 g〜l 0 gZ日程度、好ましくは 3 g〜6 gZ日程度である。また、投与期間は一般的には 10日間〜 24ヶ月間、投与頻度は隔日又は 1〜3回 Z日で、好ましくは連日投与である。当該 CTL活性化剤（IL-12産生誘導剤、 INFy産生誘導剤）、 NK活性化剤、 NKT活性化剤は、好適には経口摂取される。無論、投与量を減少させ、これらを非経口に耐え得る品質に調製することで、非経口摂取 (静脈内または筋肉内投与などを含む）も可能である。

抗ガン（化学療法）剤、放射線、あるいはステロイド併用療法を、本発明の併用に加えて行う場合には、 2種類の免疫系のうち、 TNF_a→IFNy→IL-12→キラ一 T細胞の系統が著しく障害される。そのためこれらは本発明では用いないことが好ましい。伹し抗ガン剤を投与するとき、上記の免疫系を障害しない投与法である低濃度化学療法すなわち 5 FU、 UFT、ミフロール、フルツロン、 CDD P (S/ g lO/ g) の低濃度やタキソテールあるいはタキソール、アドリアマイシン、マイトマイシン、 C PT— 1 1などの低濃度抗ガン剤の投与法等を適用することは有用である。また同様に放射線療法において低容量照射の適用、ステロィド療法においても低濃度投与等を選択する必要がある。細胞および各サイトカインの測定方法を以下に例示する。

(NKT細胞の測定）（NK細胞の測定）（CD8の測定）

NKR-P1を有する NKT細胞の測定は、 NKT細胞の細胞表面に特異的に存在する細胞表面抗原（CD3および CD161) の測定により行うことができる。具体的には、末梢血中のリンパ球について、 CD3が陽性でかつ CD161が陽性（CD3 + CD161 + ) の細胞を検定する。つまり、 NKT細胞の細胞表面抗原である CD3おょぴ CD161 を、モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリ一を使用する Two Color検査により測定する。ここで NKT細胞が活性化されているとは、リンパ球の中で CD3 + CD161 + NKT細胞の割合が 1 0 %以上、より好ましくは 1 6 %以上であることをいう。 NKT細胞活性化能とは、 NKT細胞の割合を 1 0 % 以上、より好ましくは 1 6 %以上に増加せしめる機能、またはある物質を投与する前の NKT細胞の割合より更に増強せしめる機能を意味する。

同様に（CD3— CD161 + ) とは CD3が陰性でかつ CD161が陽性の細胞を検定することである。この方法は NK細胞の測定に有用である。

さらに CD8+とは CD8が陽性の細胞を検定することである。この方法は C T L活性の測定に有用である。

実施例ではガン患者の血液を用いて、血中細胞について細胞表面抗原である CD3、 CD161, CD8について陽性 ·陰性で区別し、各細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いた Two Color検查により常法通り測定した。このとき CD3、 CD161、 CD8に対するモノクローナル抗体は、それぞれコールター社製製又はべクトンディッキンソン社製ものを使用した。

(パーフォリン産生細胞の測定）

末梢血中のリンパ球について、細胞表面抗原である CD3、 CD161、 CD8のうち 2者とパーフォリンについてフローサイトメトリ一を用いた Three Color検査により常法通り測定する。具体的には、採取した血液に固定液を加えて細胞を固定し、膜透過液を添加後抗パーフォリン抗体（Pharmingen社製）を添加して反応させ、さらに P RE— C y 5標識二次抗体（DAKO社製）を添加して反応させ、ついで抗 CD3-PE (Coulter 6604627) 抗体および抗 CD161-FITC (B-D) 抗体を添加して反応させ、その後フローサイトメトリーで測定する。図 ·表中での略語は PERと表示した。

(サイトカインを測定するための試料の調製）

まず、血液より単核球画分を分離調製する。へパリン加末梢血をリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline) (PBS) で 2倍に希釈して混和した後、 Ficoll-Conray液（比重 1. 0 7 7 ) 上に重層し、 4 0 0 Gで 2 0分間遠沈後、単核球画分を採取する。洗浄後、 1 0 %牛胎児血清（F B S) を加えた R PM I — 1 6 4 0培地を加え、細胞数を 1 X 1 0⁶個となるように調製する。得られた細胞浮遊液 2 0 0 μ 1 にフィトへマグルチニン（Phytohemagglutinin) (DIFCO 社製）を 2 0 gZm 1の濃度となるように加え、 9 6穴マイクロプレートにて 5 % C O ₂存在下、 3 7 で 2 4時間培養し、該培養した細胞溶液中のサイト力インを測定する試料とする。

(IL-12の測定）

IL-12 量の測定は自体公知の臨床、生化学的検査を利用できるが、 R&D SYSTEMS社や MBL社より入手することのできる酵素免疫測定法（ELISA) による測定キットが使用される。ここでは R&D SYSTEMS社の測定キットを用いた。実際には 9 6穴マイクロプレートの各穴に測定用希釈液 Assay Diluent RD1Fを 5 0 μ 1、標準液（standard) または前記サイトカイン測定用試料の調製法で調製した試料を 2 0 0 1ずつ分注した後、室温にて静置して 2時間反応させた。その後、西洋わさびパーォキシダーゼ（horse radish peroxidase) (H R P) 標識抗 IL-12抗体を 2 0 0 μ 1ずつ分注し 2時間室温で静置した。各穴の反応液を除去し 3回洗浄後、発色基質溶液を 2 0 0 μ 1ずつ分注し、 2 0分間室温静置後、酵素反応停止溶液を 5 0 μ 1ずつ分注した。 5 5 0 nmを対照として 4 5 0 nmにおける各穴の吸光度を Em a x (和光純薬株式会社製）にて測定した。 IL-12量は、 p gZm 1 として表される。ここで IL-12産生誘発能とは、末梢血単核球画分が刺激により産生する IL-12量を、 7. 8 p g/m 1以上に増強せしめる機能、またはある物質を投与する前の IL-12産生量より増強せしめる機能を意味する。

(IFNyの測定）

IFNyの測定は、 BioSource Europe S.社の IFNy E A S I Aキットを用いて、酵素免疫測定法（E I A法）で測定した。実際には 96穴マイクロプレートの各穴に標準液（standard) または上記調製した試料を 2倍希釈したものを 50 1 ずつ分注し、 HRP標識抗 I FN— γ抗体を 50 μ 1ずつ分注し更に振盪しながら 2時間室温で反応させた。各穴の反応液を除去し 3回洗浄後、発色基質溶液を 200 ^ 1ずつ分注し、振盪しながら 1 5分間室温で反応させ、酵素反応停止溶液を 50 μ 1ずつ分注した。 630 nmを対照として 45011111ぉょび4,90 n mにおける各穴の吸光度を Ema X (和光純薬株式会社製）にて測定した。 IFN γ量は、 I U/m 1 として表される。

(血管新生阻害能の測定）

(血管内皮細胞増殖因子/ VEGFと塩基性繊維芽細胞増殖因子/ b FGF及び血管新生阻害因子ェンドスタチン/ endostatinの測定）

巿,販キットの各酵素免疫固相法（ELISA: enzyme linked immuno sorbent assa y) (ACCUCYTE Human VEGF, ACCUCYTE Human bFGF, ACCUCYTE Human Endostatin: CYTIMMUNE Sciences Inc.) で血清中濃度を測定した。

(Th 2の測定）

T h 2とは、細胞表面抗原 CD 4を有するヘルパー T細胞（100%)の中で、 INF 陰性かつ IL-4陽性細胞の割合値を示すものである。

癌患者血液をブレフエルジン A (B r e f e r d i n A:BFA) 存在下でホルボール 12—ミリステート一 13—アセテート（p h o r b o l 1 2—M y r i s t a t e 13 Ac e t a t e ： PMA) 及ぴィオノマイシン（ I o n o my c i n) を加え、 37 °Cで 4時間刺激した。 PMA，ィオノマイシンで血液中の細胞を刺激してサイトカインを産出させ、 B F Aで細胞内タンパク質の細胞外への輸送を阻害した。このようにして調製された活性化検体に C D 4— P C 5 (B e c kma n C o u 1 t e r社）を加えて細胞表面の C D 4を染色した。次に、 FACS L y s i n g S o l u t i o n (Becton Dickinson) で溶血及ぴ固定処理をした後、更に F AC S P e rme a b i l i z i n g S o 1 u t i o (Becton Dickinson) で細胞膜透過処理を行なった。その後、 I F N- 7 F I T C/ I L- 4 PE (Becton Dickinson) を用いて細胞内サイト力インを染色し、フローサイトメーター（FAC S C a 1 i b u r、 B e e t o n D i c k i n s o n) で?則定し、角军析を行った。

{Th 1/Th 2 (細胞）比の測定 }

Th 1/Th 2細胞比は、フローサイトメトリーによるヘルパー T (Th) 細胞系統 Th r e e c o 1 o r解析検查によって常法により検定した。 T h 1 / Th 2とは、細胞表面抗原 CD 4を有するヘルパー T細胞のなかで I FNy を産生する細胞（Th 1) と I L一 4を産生する細胞（Th 2) の比率を表すもので、 CD 4 X I F N / I L一 4と記す。

まず癌患者血液を、ホルボール 1 2—ミリステート一 1 3—アセテート（p h o r b o l 1 2— My r i s t a t e 1 3 Ac e t a t e) とィ才ノマィシン（ I o n o my c i n) により 37 °Cで 4時間処理し、血液中の細胞を刺激してサイトカインを産生させた。次いでブレフエルジン A (B r e f e r d i n A) を加えて産生反応を停止させ、抗 CD4抗体である CD4— PC 5 (B e e km a n C o u 1 t e r社）を用いて細胞表面マーカーである C D 4を染色し、細胞を固定後、 FAC S L y s i n g S o l u t i o n (日本べクトンディッキンソン社）を用いて溶血処理した。その後 F AC S P e r me a b i l i z i n g S o l u t i o n (日本べクトンディツキンソン社）により細胞膜透過処理を行い、更に抗 I FNy 抗体/抗 I L— 4抗体（FAST IMMUNE I FNy F I TC/ I L— 4 PE，日本べタトンディッキンソン社）で細胞内のサイトカインを染色して、フローサイトメーター（FAC S C a l i b u r、 B e c t o n D i c k i n s o n社）で測定および解析を行った。 (TNF aの測定方法）

1. 単核球の分離調製と培養

へパリン加末梢血をリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline) (PBS) で 2倍に希釈して混和した後、 Conray-ficoll液（比重 1. 0 7 7) 上に重層し、 1 8 0 Orpmで 2 0分間遠沈後、単核球画分を採取した。洗浄後、 1 0 % 牛胎児血清（F B S) を加えた R PM I — 1 6 4 0培地を加え、リンパ球数を 1 X 1 0⁶個/ mlとなるように調製した。得られた細胞浮遊液 2 0 0 μ 1 にフイトへマグルチニン（Phytohemagglutinin： 3 0 μ g/ 1 ) (DIFCO 社製）を 2 Ο μ ΐ加え、 9 6穴マイクロプレートにて 5 %C0₂存在下、 3 7でで2 4時間培養した。培養後は、測定まで凍結保存した。

2. ELISAによる測定

あらかじめ抗ヒト TNF αが固相化されている抗体プレートに標準液又は被検検体を加えて反応させた。次に、プレートを洗浄し、 POD標識抗ヒト TNF α モノクローナル抗体（酵素標識抗体）を加え反応させた。再度プレートを洗浄後、基質を加えて酵素反応を行い、活性を波長 4 9 2腿における吸光度として読み取つた。

なお、臨床検査に用いた各マーカーは何れも市販品を用い、各推奨の方法により測定値を示した。表示される略字は各一般的な表示方法によった。

患者の効果判定は、次の CR (完全寛解）、 PR (部分寛解）、 LNC (長期不変）、 SNC (短期不変）、 PD (病状進行）の 5段階判定を行った。また、各癌種での奏効率とは、各癌種の全症例中の CR、 PR, LNC, SNC, PD の割合を示す（例、症例数 7の結腸癌における、 PR 71.4% とは 7症例中の内 5症例が PRを表す）。実施例

以下に、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。

新免疫療法（NITC) として進行末期癌症例に対し治療を行ってきた。 2002年 4月末現在 3490例中 35.3%の CR、 PRの奏効例を得ている。この NITCは |3 -1，3 グルカンの投与で内因性 TNF 、 IFN 7、 IL-12を誘導して CTL (キラー T細胞）を活性化し、かつひ-1,3グルカンの投与で NKおよび NKT細胞の活性化をはかると共にべターシヤークの経口投与で血管新生阻害をはかる BRM療法である。患者には、 IL-12産生誘発剤、さめ軟骨（セイシン企業）、及ぴひ 1,3構造をもつ糖類等を、各推奨処方により投与された。また、 IL-12 産生誘導剤として、 ILX (東西医薬）、 ILY (セイシン企業）、クレスチン（三共）、イミュトール（NBG) 等を患者の症状により、単独又は併用して投与がなされ、略同一の結果を得た。

(実施例 1 )

症例 1

今回、末期肺腺癌（両肺粟粒性肺転移）で頸椎、胸椎および股関節の骨転移かつ脳転移も認められた症例（NITC PD例）にィレッサ 250mg/日の経口投与を追加したところ 1 ヶ月半で癌性胸水と原発性肺癌が完全に消失かつ右股関節 -類椎 ·胸椎の骨転移も治癒し、 TNF a、 IFN y , 及び IL-12も基準値を超えて活性化され、各種腫瘍マーカーも正常化し CRと判定された。（図- 1) (表- 1)

(以下余白）

症例① 両肺粟粒性肺転移

NS 39y.o. Male 肺腺 Ga. 頸推，胸推■右股関節転移、脳転移

症例 2

前立腺癌で多発骨転移の症例でホルモン抵抗性、抗癌剤抵抗性、免疫療法抵抗性の末期癌症例に ZA1839 (ィレッサ) 250mg/日を NITCに併用追加投与したが 1ヶ月で多発骨転移も完全寛解し PSAの値も 170mg/mlから 4.0ng/mlと正常化した。（CR判定）（表- 2)

(以下余白）

症例 3 .

右肺腺癌で両肺に粟粒性肺転移と多発肋骨転移が認められ、呼吸困難と激しい背部痛が出現していた症例に 2002年 8月 3 日よりィレッサ 1錠 250mg/日を NITCに併用連日投与した。

8月 31日の投与後約 1ヶ月で右肺原発巣は半減し粟粒性肺転移もほとんど消失し、多発肋骨転移も消失した。 TNF a、 IFN y , 及ぴ IL-12 産生誘導も増加し、腫瘍マーカーの CEA が治療前 256ng/ml から 172ng/ml と、また SLX-1 が 480U/mlから 140U/mlと半減以下となった。（PR判定）（図- 2) (表- 3)

(以下余白）

症例③ 両肺粟粒性肺転移

NITCと抗癌剤、放射線との併用は、 IFN T/、 IL-12の産生誘導を阻害するが、 NITC とィレッサの併用は IFN y、 IL-12の産生を抑制せずかえって増加させる傾向が認められた。 Thlサイトカインの産生は骨転移を改善するために重要であり、破骨細胞分化増殖に対し TEAF6を阻害することで阻害作用が認められている。またィレッサは TRAF6の下流の c-fos mRNAのシグナル伝達を阻害することで破骨細胞の分化増殖を阻害することが可能である。（図- 3)

ィレッサは、 c-fos mRNAの発現を抑制して EGFRのチロシンキナーゼシダナル伝達系を抑制すると共に破骨細胞の分化を阻害する。また、新免疫療法（NITC) により ΡΝ γや IL-12等の Thlサイトカインを増量することで破骨細胞の分化を c-fosより上流で阻害し、ィレッサと NITCとは相加あるいは相乗的に骨転移を改善することが可能となる。骨転移に関しては NITCにより Thlサイトカインの産生増強により破骨細胞の分化における TRAF6の産生を抑制し、さらにィレッサによる TRAF6の下流にある c-fos mRNAの発現を抑制して 2重システムで骨転移を阻害する。従って、骨転移に対しても NITCとィレッサは相加あるいは相乗的に作用し症例 1、症例 2および症例 3の骨転移を改善したものと考えられる。ィレッサは癌細胞に直接的あるいは間接的に抗腫瘍性を作用するのに対し、 NITCは /3 -1,3グルカン投与で Thl サイトカイン（TNF a、 IFN y , IL-12) を産生増強し、 CTLのみならず NKや NKT細胞も活性化する。一方、 -1,3ダル力ン投与で NKと NKT細胞を活性し、 effector細胞を活性化する。また、 NITC は ADCC活性化も促進することが分っている。すなわち、ィレッサの分子標的治療と免疫療法とは相互に補いながら癌の治療効果を亢める作用が認められた。ィレッサによる治療では、 EGFR チロシンキナーゼ阻害により癌細胞の縮小 (PR) (約 20%) と増殖の停止（NC) (約 50%) の成績である。 NITCを併用することで ]3 -1,3グルカンで Thlサイトカイン—CTL活性を促し、 α -1,3グルカンで ΝΚおよび ΝΚΤ細胞を活性化することによりそれぞれの effector細胞を增殖、活性化することが可能である。これらの活性化 CTL、 NKおよび NKT細胞がィレッサで発育、増殖の減速あるいは停止状態におちいった腫瘍細胞を攻撃しやすくなることによるものと考えられる。従って人類がこれまで治療不能と考えられた粟粒性肺転移や骨転移など難治性悪性腫瘍も治療可能となる。

(実施例 2 )

症例 4 73歳男性.

2000年 8月 10日に小腸平滑筋肉腫で小腸切除し、 2001年 12月 27 日に肝転移で肝動脈塞栓術を施行し経度に縮小をみた。その後、 2002年 7月肝転移が増大し、腹膜転移も出現した。そのため、 2002年 7月 22 日より、 NITC治療を開始した。 2002年 8月 20 日より、グリベック 400mg/日の投与も開始した。 8月 20 日時点での、 Thl サイトカインの活性化は起こっており、各 TNF a (2570pg/ml) , IFN 17.5IU/ml)、 IL_12(49.8pg/ml)であった。 NK活性も強い値〔CD3(-)CD161(+)： 30.6%〕を示した。しかし、 NKT細胞活性はみとめられなかった〔CD3(+)CD161(+)perforin(+) ： 29.9 %〕。腫瘍マーカーは GAT は 22.9u/ml (正常値 13.6以下）、 BFP： 93ng/ml (正常値 75以下)、 ICTP： 5.2ng/ml (正常値 4.5以下）と高値を示した。約 1ヶ月間、 NITCとダリベックの併用療法を続け、 2002年 9月 18日に測定した各免疫マーカーの値は前回よりも増強していた。各 TNF a (4322pg/ml)、 IFN y (34.8IU/ml), IL-12(98.3pg/ml)、 NK活性 CCD3(-)CD161(+)： 35.4%] , NKT細胞活性 [CD3(+)CD16l(+)perforin(+)： 32.4%〕。腫瘍マーカーは GATは 18.3u/ml (正常値 13.6以下）、 BFP： 79ng/ml (正常値 75以下)、 ICTP： 4.8ng/ml (正常値 4.5以下）であった。そして、驚いたことに、同時に行った超音波検査で肝転移は 50%以上縮小し、異常を示した腫瘍マ一力一も全て改善していた。症例 5 62歳女性子宮筋肉腫

2000年 1月 26 日に子宫筋肉腫で子宮全摘出と両側付属器官の切除を受けた。しかし、腹腔内残存腫瘍が認められた。 2000年 2月から 5月まで、パラプラチン、ェンドキサン、テラルビシンの抗癌剤投与を受けたが PDと判定された。 2001 年 11月 15日に左腹部腹壁に手拳大の腫瘍が出現し、 2002年 1月 23日再切除を施行した。その後、 2002年 2月から 4月までィホマイドの抗癌剤投与したが 2002 年 4月に右腹壁に 6 x 5 c m大の子宮筋肉腫の再々転移が認められた。 2002年 8 月 10日に超音波検査で右腹壁に 103 X 88 X 81mmと左腹壁に 29 x 30 X 27mmの肉腫の増大が認められた。 · 2002年 8月 10日より、ダリベック 400m g /日と NITCの併用療法を行った。 2002年 9月 17 日の超音波検査で右腹壁の腫瘍 58 x 40 x 39mmと左腹壁の腫瘍 15 x 14 x 13mmと半減していた。また、 Thlサイトカインの産生能力の増強が確認された（TNFひ（4106pg/ml)、 IFN y (33.5IU/ml), IL-12(80.6pg/ml)_o

症例 4、症例 5はいずれも末期肉腫である。これらの症例では、 NITC単独では PDであったが、クリベック併用で約 1ヶ月の極めて短い期間でいづれも著名な改善（PR) を得た。これまでのダリベックの投与報告例では 4ヶ月から 6ヶ月の投与で 2 0 %前後の奏効例しか報告されていない。しかし、本臨床例では、極めて短期間に処方例全てで PRを達成した。このことは、 NITC療法特に IL-12 の産生誘発療法とダリベックの併用療法は、上記ィレッサの NITC療法特に IL-12 の産生誘発療法との併用療法と同様に、対癌治療に対して相乗効果が発揮されたものと推定された。かくして、本発明により、チロシンキナーゼ阻害剤と Thlサィトカイン産生増強剤の併用には、対抗癌効果に相乗効果のあることを確認した。なお、抗癌剤と NITCの併用療法では Thlサイトカイン値の著名な抑制が認められたが、本発明のチロシンキナーゼ阻害剤と NITCの併用療法ではいずれも免疫能力を上昇させ、そして抗腫瘍作用においても相乗的に作用することが確認された。

(実施例 3 )

NITC とィレッサとの併用治療における、癌の免疫治療の実施例 1、 2の症例：！〜 5症例を含む 5 5症例での治療結果を総括した。 5 5症例の癌の進行度は、初期段階から進行末期段階であり、癌種類は肺癌、大腸癌、肛門癌、腎癌、舌癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、食道癌、塍癌、咽頭癌、耳下腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌である。また、各症例の NITCとィレッサとの併用治療期間は、約 2〜4 ヶ月間である。また、各症例での、患者には、実施例 1と同様に、 IL-12 産生誘導剤、さめ軟骨（セイシン企業）、及びひ1,3構造をもつ糖類（NE：、 NKT活性化剤）力各推奨処方により投与された。また、ィレッサは、各推奨処方に従い、例えば、症例 1のように、 250m g /日の量を経口投与した。各癌種での奏効率の検討

肺（腺）癌は 15例中 PR症例が 12例の 80%に奏効例が認められた。残り 3例は NC症例であった。肺（腺）癌症例では 4例が粟粒性肺転移症例である。すなわち肺（腺）癌のなかでも粟粒性肺転移は最も予後が不良で呼吸困難を合併し、従来の治療法では全くといってよいほどに改善することは不可能であった。このような粟粒性肺転移症例はィレッサ単独では改善することはあり得ないと考えられる。また肺（腺）癌のィレッサ単独治療例はこれまで奏効例の割合は 20%前後と報告されているが、今回の NITC とィレッサとの併用は 15例中 12例である 80%が PR例という驚くべき改善率を示した（図 4 )。

大腸癌は直腸癌と結腸癌とに分類される。一般に直腸癌は結腸癌に比較し、予後不良と考えられている。 NITC とィレッサとの併用治療による効果は、直腸癌は 4例でいずれも PRと判定され奏効率 100%であった。一方、結腸癌は 7例で PRが 5例（71.4%)、 NCが 1例（14.3%)、そして PDが 1例（14.3%) であつた。従って大腸癌としては PRが 9例（81.8%) という驚くべき改善率を示した (図 5 )。

NITCとィレッサとの併用治療による効果において、肺（腺）、大腸癌以外の癌種で、 PR症例が認められた悪性腫瘍は、肛門癌 2例中 1例の 50%、腎癌 2例中 2例の 100°/。、舌癌は 1例中 1例の 100%、卵巣癌が 4例中 2例の 50%であり、胃癌が 3例中 1例の 33.3%、乳癌は 6例中 1例の 16.7%であった。また、前立腺癌は 2例中 2例が NCであり、腫瘍マーカーの PSAは低下しなかったが骨転移の疼痛は著明に改善した。食道癌は 3例中 2例の 66.7%が NC、滕癌、喉頭癌、耳下腺癌の各 1例は NCで進行が停止していた。膀胱癌と子宮頸癌ではいずれも PD症例のみであった。

NITC とィレッサとの併用治療による効果において、肺（腺）癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、腎癌、舌癌、卵巣癌、胃癌、肛門癌、乳癌の有効例では Thlサィトカインの TNF a、IFN _yおよび IL-12が高値を示す傾向が認められた。また、 VEGFも抑制している傾向が認められた。一方、 NK細胞と NKT細胞においては有効例と無効例とで差は認められなかった。従ってィレッサ（商品名）と免疫療法の併用治療は Thlサイトカインのなかでも IFN yと IL-12とを上昇させ得ることがこのような著効例を見出しているものと考えられる（図 6 )。 . 現在、ィレッサ（商品名）と抗癌剤との併用ではその効果が認められていない、本発明に係る NITC (特に IL-12産生誘導剤）とィレッサとの併用治療では、各癌種での治療効果を確認できた。特に、肺（腺）癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、腎癌、舌癌、卵巣癌、胃癌、肛門癌、乳癌種に対しての NITC (特に IL-12産生誘導剤）とィレッサ（商品名）との併用治療は有効である。

以上より、ガン患者に本発明に係る NITC (特に IL-12産生誘導剤）とィレツサ Rとの併用治療を施すことは、有効なガンの治療方法となる。

(実施例 4 )

免疫療法 (NITC)の単独症例の 46例 (CR:1例、 PR:13例、 LNC:2例、 SNC:22 例、 PD:8例)および免疫療法 (NITC)とィレッサ (250mg/日/経口）追加併用例の 27 例（CR:2例、 PR:20例、 NC:5例、 PD:0例）の合計 73例において、ィレッサ投与の寄与度と各免疫学的因子のそれぞれにおける寄与度 (率)を検討した。結果は、口ジスティック回帰係数によって図 7に示した。

肺腺癌の治療において全体で検討すると、第一はィレッサを投与するか否かが最も重要である。第二が、 IL-12の産生能力と NKT細胞でのパーフォリン産生細胞 (NKTPと記載)がほぼ同率で重要である。ついで IFN T 、 TNFひの産生能力の順で意義があった。

免疫療法 (NITC)とィレツサ投与症例の 2 6例における、免疫学的各ファクターの寄与率を検討した。結果は、ロジスティック回帰係数によって図 8に示した。' その結果、ィレッサ投与前では NKTP細胞（NKT細胞で Perfori 陽性細胞）が最も重要な意義を示した。ィレッサ投与前における患者の免疫能力の差違で本療法での有効群と無効群での識別が可能か否かを判定することは肺腺癌患者の治療方針決定にとって重要なことと考えられた。

そこで、まずィレッサ投与前の NKTP細胞の割合（総リンパ球中の NKTP細胞の割合）を確認し、結果を図 9に示した。 NKTP細胞数（割合）を 5.0%で力ットオフ値とした場合、 92.9%が有効と判定された。し力し、 NKTP力 S 5.0%以下でもなお 57.1%は有効例であり、判定から落ちこぼれている。この 5.0%未満となった症例については、さらに Thl/Th2比で有効例を判定できることが判明した。すなわち、図 8から明らかであるように、ィレッサ投与前後の変化量として Thl/Th2比が非常に高値を示しているので、この指標を用いて NKTPが 5.0%未満の症例を解析した。図 1 0に示されたように、 Thl/Tli2比がィレッサ投与後に増加した場合に 88.9%の割合で有効例を判定できることがわかった。 Thl/Th2比がィレツサ投与後に減少すると 100%無効例となつた。

以上の結果をまとめると、 NKTP値が 5.0%以上であればィレッサと NITC併用で有効性が高く、 NKTP値が 5.0%未満の値でも、 Thl/Tli2比がィレッサ投与後に増加していれば有効性が期待できる可能性が高いことが示唆された。かくして本実施例の分析結果から、 NITCとィレッサ併用投与症例において、 NKTP値のィレッサ投与前値が 5.0%以上、もしくはィレッサ投与後の Thl/Th2比が増加していれば、 NITC とィレッサ併用投与による有効例が有意に高いと判定される (p<0.00l) (図 1 1 ) ことが判明した。 .

(実施例 5 )

実施例 4の臨床例によって、免疫療法 (NITC)とィレッサとの併用療法のさらなる有用性を分析した。分析結果は図 1 2に示した如く、ィレッサ投与 1ヶ月以降に、腫瘍の増殖が抑制される Bタイプとィレッサ投与の効果がない Aタイプに分かれることが判明した。さらに、症状が良くなつた Bタイプでも、さらに 6ヶ月以内に、再燃'再発する Cタイプと再燃しない Dタイプに分かれることが判明した。それぞれの分岐点でどちらのタイプ（A又は Bタイプ、 C又は Dタイプ）にいくかを予測することが出来れば有効なガン免疫治療の指標となる。また、ィレッサ投与後、数週間から 5ヶ月、好ましくは 1ヶ月から 3ヶ月に患者の免疫学的各ファクターを測定することによって、その後の免疫療法 (NITC)とィレッサの併用療法を継続することが有効な治療となるかを予測することが出来れば有効なガン免疫治療の指標となる。そのために、タイプの予測因子を明らかにするために宿主の免疫学的特徴（腫瘍マーカー）を検討した。

その結果、 Aタイ.プ又は Bタイプになるかは、ィレッサ投与前の NKTP値が 5.0%以上であれば Bタイプとなり、たとえ NKTP値が 5.0%未満でもィレッサ投与後の Thl/Th2比が増加していれば Bタイプの方向に向かうことが判明した (図 8〜： 1 1 )。また、 NKTP値が 5.0%未満で、 Thl/Th2比が減少していれば A タイプとなり、ィレッサは効果を発揮しないことが判明した。

—方、 Cタイプ又は Dタイプになるかは、図 1 3に示した結果により Th 2値の割合が 3 %を超えれば Dタイプに向かい、 3 %未満の場合には再燃 ·再発する Cタイプになることが判明した。ただし、 Dタイプに向かう場合にはィレッサ投与後の IL-12、 INF yの値がィレッサ投与後でも低下していないことが重要であると判明した（図 1 4 )。

以上の分析結果をもとに、ィレッサと NITCとの抗腫瘍作用の相違を図 1 5のシェーマに示した。

癌細胞の増殖が著明な場合は抗原も提示されていない。癌細胞は増殖が激しい細胞ほど EGFRが多いはずである。この EGFRのシグナル伝達系のチロシンキナーゼ阻害作用でィレッサが細胞内でシグナルをプロックする。このことによつて癌細胞の核がアポトーシスにおちいり、核の障害が起こり癌細胞の表面に FAS 抗原や癌抗原の Classlまたは ClassII抗原が表出する。その結果 CTL細胞（キラー T細胞）や NK細胞が抗原認識し免疫細胞が癌細胞をターゲットとして攻撃しアポトーシス小体となつた癌細胞を貪食することになる。

従って図 1 5に示した如くィレッサと NITCの併用療法では、まずィレッサが癌細胞での増殖を促す EGFRのシグナル伝達をブロックする。その後、免疫細胞が活性化して癌を攻撃するという時間差があると考えられる。

ィレッサが作用するか否かは NKTパーフォリン活性と Thlサイトカインが重要である。また、腫瘍が一時縮小し、その効果が続くか否かは IFN yと IL-12の産生が投与後も持続することが重要である。またその際に Th2系の免疫系が必要となるものと推定される。産業上の利用可能性

以上の実施例によれば、チロシンキナーゼ阻害剤と IL-12産生誘導剤（Thlサィトカイン産生増強）の併用はガンの治療において相乗効果あることが見出され、ガン治療における画期的な成果を達成した。

Claims

請求の範囲

1 . チロシンキナーゼ阻害剤と IL-12産生誘導剤が併用されることを特徴とするガンの治療剤。

2 . チロシンキナーゼ阻害剤が、以下の 1 ) ~ 7 ) の少なくとも 1の受容体に対する選択的標的作用を有する請求項 1のガンの治療剤。

1 ) HER2/neu、 2 ) HER3、 3 ) HER4、 4 ) c'kit、 5 ) PDGFR, 6 ) bcr.ablヽ 7 ) EGFR

3 . チロシンキナーゼ阻害剤が、選択的に EGFR又は c-kit標的作用を有する請求項 1のガンの治療剤。

4 . IL-12産生誘導剤が、 ]3 1,3/1,6グルカン構造を有する物質である請求項 1〜 3の何れか一に記載のガンの治療剤。

5 . IL-12産生誘導剤が、 1,3/1,6グルカン構造を有する茸菌糸体由来成分又は酵母由来成分である請求項 4のガンの治療剤。

6 . ガンの化学療法剤及び放射線治療との併用無しに処置される請求項 1〜5の何れか一に記載のガンの治療剤。

7 . ΝΚΤ細胞の NKR-P1に選択的に作用して ΝΚΤ細胞の活性化をおこす物質と併用される請求項 1〜 6の何れか一に記載のガンの治療剤。

8 . 血管新生阻害能を有する物質と併用される請求項 1〜 7の何れか一に記載のガンの治療剤。

9 . 以下の 1 ) 又は 2 ) のいずれか 1をマーカーとしてチロシンキナーゼ阻害剤と IL-12産生誘導剤の併用治療が行われる請求項 1〜 8の何れか一に記載のガンの治療剤。

1 ) ΝΚΤΡ値の投与前値が 5.0%以上の測定値を示す、

2 ) Th2値の投与前値が 3 %以上の測定値を示す

1 0 . Thl/Th2比がィレッサ投与前値に比較して、投与数ケ月後に増加の測定値を示すことを併用治療の継続のマーカーにする請求項 1〜 9の何れか一に記載のガンの治療剤。 '

1 1. NKTP値の投与前値が、 5.0%未満の測定値を示すことを特徴とする請求項 10に記載のガンの治療剤。

12. IL-12、 INFo/の測定値が、ィレッサ投与前値に比較して投与数ケ月後の値で低下していないことを併用治療の継続のマーカーにする請求項 9に記載のガンの治療剤。

1 3. ガンの治療剤が肺（腺）ガン治療剤であることを特徴とする請求項 1〜1 2の何れか一に記載のガンの治療剤。

14. 請求項 1〜1 3の何れか一に記載のガン治療剤を用いたガンの治療方法。