新規タンパク質及びそれをコードする D NA 技術分野
本発明は、 新規なタンパク質、 該タンパク質をコードする D NA、 該タンパク 質をコードする完全長 c D NA、 該 D NAを有する組換えベクター、 該 D NAの 部分配列から成るオリゴヌクレオチド、 該 D N Aを導入した遺伝子導入細胞、 及 ぴ該タンパク質に特異的に結合する抗体等に関する。 背景技術
現在、 世界的なレベルで様々な生物のゲノム配列の解明とその解析が進められ ている。 既に約百数十の原核微生物、 下等真核生物の出芽酵母、 多細胞性真核生 物である線虫で、 その全ゲノム配列が決定された。 3 0億塩基対といわれるヒト のゲノムについては 2 0 0 1年 2月にその塩基配列のドラフトが発表されていた が、 2 0 0 3年 4月に完全配列が解読され公表された。 ゲノム配列を明らかにす る目的は、 全ての遺伝子の機能や制御、 あるいは遺伝子間、 タンパク質間、 細胞 間さらには個体間における相互作用のネットワークとして複雑な生命現象を理解 するところにある。 種々の生物種のゲノム情報から生命現象を解明していくこと は、 単に学術分野における研究課題として重要であるのみならず、 そこで得られ る研究成果をいかに産業上の応用へと発展させていくかという点で、 その社会的 な意義も大きレ、。
ところが単にゲノム配列を決定しただけでは、 全ての遺伝子の機能を明らカに できるわけではない。 例えば酵母では、 ゲノム配列から推定された約 6, 000の遺 伝子の約半数しか、 その機能を推定できなかった。 一方、 ヒトには約 1 0万種類 のタンパク質が存在するといわれる。 そこで、 ゲノム配列から明らかにされてく る膨大な量の新しい遺伝子の機能を、 迅速かつ効率的に解明していくための 「ハ イスループット遺伝子機能解析システム」 の確立が、 強く望まれている。
真核生物のゲノム配列では、 多くの場合、 一つの遺伝子がイントロンによって 複数のェクソンに分断されている。 そのため、 ゲノム配列情報だけからそこにコ ードされるタンパク質の構造を正確に予測するには、 多くの問題がある。 一方、 イントロンが除かれた mRNAから作製される cDNAでは、 タンパク質のァミノ酸配 列の情報が一つの連続した配列情報として得られるため、 容易にその一次構造を 明らかにすることが可能である。 ヒトの cDNAの研究では、 これまでに 5 0 0万 以上の EST (Expressed Sequence Tags) データが公共データベースに公開され ている。
これらの情報は、 ヒト遺伝子構造の解明ゃゲノム配列におけるェクソン領域の 予測、 あるいはその発現プロファイルの推定など、 様々な角度から利用されてい る。 ところが、 これらのヒ ト EST情報の多くは cDNAの 3' 末端側近傍に集中し ているため、 特に mRNAの 5' 末端近傍の情報が極端に不足している状況にある。 また、 世界の研究機関 (ヘリックス研究所、 かずさ D NA研究所、 東大医科学研 究所、 ドイツ癌研究センター、 MG Cプロジェクトなど) で行われている解析の 結果明らかにされている c D NAは 4万数千に上り、 数的には 3万数千と言われ る遺伝子座の大半を力パーしていると思われるが、 全長クローンとして取得され ている c D NAの割合は 8 0 %程度であることや、 重複ゃスプライスバリアント が含まれていることを考慮すると、 まだ取得されていない c D NAは多数存在し ていると考えられる。
完全長 cDNAを取得できれば、 その 5' 末端配列からゲノム配列上での mRNA転 写開始点が推定できる上、 その配列の中に含まれる mRNAの安定性や翻訳段階で の発現制御に関わる因子の解析が可能である。 また、 翻訳開始点である atgを 5' 側に含むことから、 正しいフレームでタンパク質への翻訳を行うことができ る。 したがって、 適当な遺伝子発現系を適用することで、 その cDNAがコードす るタンパク質を大量に生産したり、 タンパク質を発現させてその生物学的活性を 解析することも可能になる。 このように、 完全長 cDNAの解析からはゲノム配列 解析を相補する重要な情報が得られる。 また、 発現可能な全長 cDNA クローンは、
その遺伝子の機能の実証的な解析や産業分野での応用への展開において、 その重 要性はきわめて高い。
一方、 同一のゲノムにコードされたタンパク質であっても、 それをコードする mR NAが転写される際、 ゲノム中一部のェクソンが挿入 ·欠失して結合する異 性体 (以下、 これを 「スプライシングバリアント mR A」 と称することがある) がある。 実際、 これらの mRNAが翻訳されて生成される、 複数種の類似のタンパ ク質 (以下、 これらを 「スプライシングバリアント」 と称することがある) が生 体内において確認されている。 スプライシングバリアントは、 組織特異的、 発生 段階特異的、 あるいは疾患特異的に発現し、 それぞれ異なる機能を有していると 考えられている。
例えば、 tyrosine kinase である JAK3遺伝子は、 S型、 B型、 M型の 3種類の スプライスバリアントが存在し、 S型は造血細胞で発現しているのに対し、 B型 と M型は造血細胞と上皮細胞で発現している。 S型と M型が抗体によって共沈し、 同じ細胞で発現していること力 ら、 複数のスプライスバリアントが共に機能し、 細胞内におけるサイトカインのシグナル伝達反応の複雑性をより高めていると推 測されている (例えば、 Lai, K. S. 他、 J. Biol. Chem. 270 (42) , 25028-25036 (1995)を参照)。
このようなスプライシングバリアントの mRNAあるいは cDNAも、 従来の cDNA ライブラリーや ESTからは取得されにくく、 転写開始点を含む完全長 cDNAライ ブラリーにより取得される可能性の高いクローンである (例えば、 W0 9 8 Z 2 2 5 0 7号公報 (S E Q I D N O . 1および N O . 2 ) を参照) 。
特に、 プロテインキナーゼは、 基質であるタンパク質のセリン、 スレオニンあ るいはチロシン残基をリン酸ィヒする酵素であり、 極めて多くのフアミリーが知ら れている。 また、 一般にプロテインキナーゼはタンパク質リン酸ィヒを介する細胞 内シグナル伝達系を調節することにより、 種々の生命現象の制御に関わっている ことが知られており、 疾患との関係が解明されている遺伝子が多い (例えば、 Hunter, T. , Cell, 50: 823-829 (1987)を参照) 。 しかし、 ヒトの遺伝子の約 3
〜4%はプロテインキナーゼの遺伝子であると言われ、 ヒトの体内には約千種も の異なるプロテインキナーゼが存在すると推定されており、 まだ多くのプロティ ンキナーゼ遺伝子がクローニングされないままに残されている。 したがって、 ヒ トにおいて分離が進んでいないスプライシングバリアントを含む新規なプロティ ンキナーゼの全長 cDNAを提供する意義は大きい。 また、 プロテインキナーゼ は、 治療のための標的分子として、 またタンパク質自身に医薬品としての有用性 を期待できる。 したがって、 これらのタンパク質をコードする c DNAの全長を 明らかにすることには大きな意義がある。 発明の開示
本発明は、 完全長 cDNAライブラリーに含まれる cDNAクローンの塩基配 列を解析し、 このうちスプライシングバリアントを含む全長として配列が新規な cDNAについては、 これがコードするタンパク質の生理活性を解析及び同定し、 該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードする DN Aの利用方法を提案 することを目的とする。
本発明者らは、 オリゴキャップ法 (Maruyama, K. , et al. , Gene, 138: 171-174 (1994); Suzuki , Υ. et al. , Gene, 200: 149-156 (1997)) を用い て取得されたスプライシングバリアントを含む配列が新規な c DNAについて、 該 cDNAクローンの塩基配列の相同性に基づきデータベースを検索したところ、 該配列にキナーゼ活性を有するタンパク質に特異的な配列を見出し、 これらの c DNAがコードするタンパク質がプロテインキナーゼであると同定した。 本発明 は、 これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち本発明によれば、 以下の (1) 〜 (1 5) に記載の発明が提供される。
(1) 以下の (a) または (b) のタンパク質。
(a) 配列番号 6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b) 配列番号 6〜1 0のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは数
個のアミノ酸が欠失、 置換及ぴ Zまたは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ キナーゼ活性を有するタンパク質。
(2) 上記 (1) に記載のタンパク質をコードする DNA、
(3) (1) に記載のタンパク質をコードする完全長 cDNA。
(4) 以下の (a) 、 (b) または (c) の何れかの DNA。
( a ) 配列番号 1〜 5のいずれかに記載の塩基配列を有する D N A。
(b) 配列番号 1〜 5のいずれかに記載の塩基配列において、 1若しくは数個の 塩基が欠失、 置換及ぴ Zまたは付加された塩基配列を有し、 かつキナーゼ活性を 有するタンパク質をコードする DNA。
( c ) 配列番号 1〜 5のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有す る D N Aをストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配 列を有し、 かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。
(5) (2) 〜 (4) のいずれかに記載の DNAを含む組換えベクター。
(6) (2) 〜 (4) のいずれかに記載の DNAまたは (5) に記載の組み 換えべクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
(7) (6) に記載の細胞により産生される、 (1) に記載のタンパク質。
(8) (2) 〜 (4) のいずれかに記載の DNAの塩基配列中の連続した 5 〜100塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、 当該センスオリゴ ヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 及び、 当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体か ら成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
(9) (1)または (7) に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体ある いはその部分フラグメント。
(10) 抗体がモノクローナル抗体である ( 9 ) に記載の抗体。
(11) モノクローナル抗体が (1) または (7) に記載のタンパク質のキ ナーゼ活性を中和する作用を有することを特徴とする (10) に記載の抗体。
(12) (1) または (7) に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、 該 被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、 該タンパク質の活性調節物質のスクリ一ユング方法。
(13) (6) に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、 該細胞に導 入されている DNAの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、 該 DNA の発現調節物質のスクリーニング方法。
(14) (1) に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくと も 1以上のァミノ配列情報および Zまたは (2) 〜 (4) のいずれかに記載の D NAの塩基配列から選択される少なくとも 1以上の塩基配列情報を保存したコン ピュータ読み取り可能記録媒体。
(15) (1) に記載のタンパク質および/または (2) 〜 (4) のいずれ かに記載の D N Aを結合させた担体。 図面の簡単な説明
図 1は、 配列番号 6のァミノ酸配列を有するタンパク質に基質として S y n t i d e 2 (配列番号 21) を添加し、 逆相 H PLC上でピークを測定した結果を 示す。
図 2は、 配列番号 9のアミノ酸配列を有するタンパク質に基質として Syn t i d e 2 (配列番号 21) および CaMKI I (配列番号 22) を添加し、 逆相 HP L C上でピークを測定した結果を示す。
図 3は、 配列番号 10のアミノ酸配列を有するタンパク質に基質として Syn t i d e 2 (配列番号 21) および C aMK I I (配列番号 22) を添加し、 逆 相 HP L C上でピークを測定した結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明をさらに詳細に説明する。
( 1 ) 完全長 cDN Aの取得及び塩基配列の解析
本発明の DNAは、 配列番号 6〜10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク 質、 または配列番号 6〜10に記載のアミノ酸配列において 1若しくは数個 (こ こで、 数個とは、 例えば 5個以下、 好ましくは 3個以下、 より好ましくは 2個以 下を意味する) のアミノ酸残基の置換、 欠失及び/または付加を含むアミノ酸配 列からなり、 かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードし得るものであれば 如何なるものであってもよい。 具体的には、 該アミノ酸配列をコードする翻訳領 域のみでも、 あるいはその c DNAの全長を含むものでもよい。
具体的には、 c DNAの全長を含む DNAとしては、 例えば配列番号 1〜5に 記載の塩基配列からなる DNA等が挙げられる。 また、 その翻訳領域としては、 配列番号 1の塩基番号 87〜1 124、 配列番号 2の塩基番号 1 15〜2094、 配列番号 3の塩基番号 1232〜 2764、 配列番号 4の塩基番号 316〜 19 47、 配列番号 5の塩基番号 151〜1881に示される配列を有するものが挙 げられる。 さらに上記の cDN Aの全長でなくても、 上記翻訳領域とその 3'及 び Zまたは 5'端に隣接する、 翻訳領域の発現に最低限必要な部分を含むもの等 も本発明の DN Aに含まれる。
本発明の DNAは、 これを取得できる方法であれば如何なる方法により取得し たものでもよいが、 具体的には例えば下述の方法により取得することができる。 まず、 ヒトの組織あるいは培養細胞等からそれ自体既知の通常用いられる方法に より mRNAを調製する。 次に、 この niRNAを铸型としてオリゴキャップ法
(Maruyama, K. et al. , Gene, 138, 171-174 (1994)) により c DNAを取得す る。 具体的には、 取得した mRNAについて酸性ピロフォスファターゼにより 5, キャップをはずし、 その後露出した 5' 末端のリン酸基を標的に、 オリゴキ ヤップリンカ一を RN Aライゲースを用いて連結する。 ここで、 キャップ構造を 5, 末端に有していない RN A分子について、 上記オリゴキャップリンカ一が結 合しないように、 予め 5' 末端に存在するリン酸基を、 5, キャップは外さない が 5' 端のリン酸基のみ外す活性を有するフォスファタ一ゼ等を用いて外してお くことは有効である。 この RNA分子を鍀型として、 3, 側のプライマーとして
オリゴ dTプライマーを用いて逆転写酵素により逆転写を行った後、 RNA鎖を 分解除去する。
さらに取得された 1本鎖 DNAを鎳型として、 上記オリゴキャップリンカーの 部分配列を有するオリゴヌクレオチドを 5' プライマーとし、 3' 末端に特異的 なプライマー (オリゴ dTプライマー等) を用いてポリメラーゼチェインリアク シ.ヨン (PCR) を行うことにより完全長 cDNAライブラリーを作製すること ができる。 プライマーの鎖長としては、 通常 15〜100塩基、 好ましくは 15〜30 塩基が挙げられるが、 増幅する cDNAの鎖長が長い場合には 25〜35塩基の長 さとすることが好ましく、 また、 Long and Accurate PCR (LA PCR:林健志、 実 験医学別冊 · PCRの最新技術、 羊土社; Cheng, S. et al. , ature 369: 684- 685 (1994)) を用いることが好ましい。
このようにして取得された cDNAは、 これを適当なクローニングベクターに 挿入してクローニングを行う。 ここで用いられるベクターとしては、 取得された c D N Aクローンを細胞に導入して該 c D N Aがコードするタンパク質を発現で きるようなタンパク質発現用ベクターが好ましく用いられる。 具体的には例えば、 宿主が哺乳動物細胞等の場合には p ME 18 SFL 3 (Genbank AB009864) 等が 好ましく、 また大腸菌の場合では、 pET3、 pETl l (ストラタジーン社 製) 、 pGEX (アマシャムフアルマシアバイオテク社製) 等が挙げられ、 酵母 の場合では p E S P— Iエクスプレッションベクター (ストラタジーン社製) 等 が挙げられ、 さらに昆虫細胞の場合では B a c PAK6 (クロンテック社製) 等 が用いられる。 また宿主が動物細胞の場合では、 ZAP Ex p r e s s (スト ラタジーン社製) 、 p SVK3 (アマシャムフアルマシアバイォテク社製) 等が 挙げら; TLる。
かくして取得される cDNAライブラリーは、 それ自体既知の通常用いられる 方法により塩基配列の解析を行う。 本発明の DNAは、 取得された cDNAの 5, 末端あるいは 3, 末端の塩基配列を解析し、 これを NCB I (Na t i o n a 1 C e t e r f o r B i o t e c hn o l o g y I n f o rma t
1 o n ; h t t p / / www. n c b i . n 1 m. n i h . g o v /) の G e nb a nk、 EMBL、 DDB J、 PDB、 E S T等のデータベースについて B LAST (B a s i c l o c a l a l i g nme n t s e a r c h t o o l ; Al t s c hu l , S. F. , e t a 1. , J . Mo 1. B i o l . , 215, 403-410 (1990) ) を用いて検索し、 その全長 について完全に一致する配列が見出されない場合は新規として以下の解析に供す ることとした。
このような完全長 cDNAの塩基配列を有する DNAとしては、 例えば、 配列 番号 1〜 5に記載の塩基配列を有するものが挙げられる。 また、 その翻訳領域と しては、 配列番号 1の塩基番号 87〜1 124、 配列番号 2の塩基番号 1 15〜
2094、 配列番号 3の塩基番号 1232〜 2764、 配列番号 4の塩基番号 3 16〜 1947、 配列番号 5の塩基番号 151〜 1881に示される配列を有す るものが挙げられる。
かくして取得された cDNAの全長として新規な塩基配列を、 BLASTによる 相同性検索 (h omo l o gy s e a r c h) や、 HMMER (隠れ Ma r k o vモデルによる配列解析手法; E d d y , S. R. , B i o i n f o rma t i c s 14, 755-763 (1 998) ) の機能群のひとつである HMM PF AMによるタンパク質特徴検索 (p r o f i l e s e a r c h r h t t p: //v f am. wu s t 1. e d u) 等を行うことにより、 該塩基配列がコ 一ドするタンパク質の機能を推定することができる。
B L AS Tによる相同性検索においては、 検索の結果得られた相同性が十分有 意なヒット配列に付随する種々のァノテーシヨン情報から、 解析対象としている クローンの機能を推定することができる。 ここで、 十分有意なヒット配列とは、 登録されている配列の触媒ドメイン部分と本発明の D N Aのこれに対応する部分 との一致度 (i d e n t i t y) が 30%以上のものか、 e— v a 1 u e (問レヽ 合わせ配列がデータベース中に偶然存在する期待値) として 10— 4以下のものを 示す。
例えば、 上位にヒットした触媒ドメイン配列の多くがキナーゼとしての機能を 確認されたものであるならば、 それと配列上類似である解析対象クローンもまた 同じ機能、 即ち、 キナーゼ活性を持つであろうという予測が成り立つ。
HMM P F AMは、 P f a mというタンパク質プロファイルを集積したデータ ベース中にあるエントリーが有するアミノ酸配列の特徴を、 解析対象である塩基 配列のコードするアミノ酸配列が有するかどうかを洗い出す方法による解析であ る。 プロファイルは一連の同一特徴を持つタンパク質群から抽出されており、 一 配列対一配列の全長に亘る比較では明確ィヒできない機能でも、 配列中にその特徴 領域があればこれを見出し機能予測ができる。 このように、 それがコードするタ ンパク質がキナーゼ活性を有すると予測される cDNAは、 後述する生化学的実験 によりそのキナーゼ活 1·生を確認することができる。
上記で cDNAの全長として新規であるとされたクローンとして具体的には、 配 列番号 1 〜 5に示す塩基配列を有するものが挙げられる。 また、 これらの塩基配 列がコードするアミノ酸配列は配列番号 6〜 1 0に示すものが挙げられる。
かくして取得され、 塩基配列が決定され、 また機能が推定される本発明の D N Aは上記の配列番号 1〜 5に記載の塩基配列、 あるいはその翻訳領域として上記 に示した塩基配列を有するものだけでなく、 これらの塩基配列において、 1若し くは数個 (ここで言う数個とは、 例えば 1 5個以下、 好ましく 9個以下、 より好 ましくは 6個以下を意味する) の塩基が欠失、 置換及び Zまたは付加された塩基 配列を有し、 かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする D NA、 並びに、 これらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつキナーゼ活性を有 するタンパク質をコードする D NA等も含まれる。 これら D NAには前記したと おり、 配列番号 6〜 1 0に記載のタンパク質のァミノ酸配列において 1若しくは 数個のァミノ酸配列が欠失、 置換及び/または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。
ここで、 ストリンジェントな条件でハイブリダイズする D N Aとは、 配列番号 1〜 5に記載の塩基配列と B L A S T解析で 8 0 %以上、'好ましくは 9 0 %以上、
さらに好ましくは 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含む D N A等が挙げら れる。 また、 ストリンジェントな条件下のハイブリダィゼーシヨンとは、 通常の ハイブリダイゼーション緩衝液中で、 温度が 4 0〜 7 0 °C、 好ましくは 6 0〜 6 5 °C等で反応を行い、 塩濃度が 1 5 mM〜 3 0 0 mM、 好ましくは 1 5 mM〜 6 0 mM等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
さらに、 本発明の D NAは、 上述の方法により取得されたものでも、 また合成 されたものでもよレ、。 D NAの塩基配列の置換は、 例えばサイトダイレクテッド ミュータジエネシスキット (宝酒造社製) や、 クイックチェンジサイトダイレク テッドミユータジエネシスキット (ストラタジーン社製) 等の市販キットで容易 に行うことができる。
( 2 ) 新規 c D NAがコードするタンパク質
本発明の D NAがコードするタンパク質の翻訳領域は、 例えば、 該 D NAが有 する塩基配列について 3種類の読み枠によりアミノ酸に変換していき、 最も長い ポリべプチドをコ一ドする範囲を本発明の翻訳領域としてそのァミノ酸配列を推 定することができる。 このようなァミノ酸配列として例えば、 配列番号 6〜 1 0 に記載のもの等が挙げられる。 また、 本発明のタンパク質は、 上記のアミノ酸配 列に限られるものではなく、 該ァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸 が置換、 欠失、 及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつキナーゼ活 性を有するものも含まれる。
本発明のタンパク質の取得方法としては、 (1 ) に記載の本発明の D NAを適 当な方法により転写 Z翻訳する方法が好ましく用いられる。 具体的には、 適当な 発現用ベクター若しくは適当なベクターに適当なプロモーターとともに挿入した 組換えべクターを作製し、 この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換し たり、 適当な培養細胞に導入することにより発現させ、 これを精製することによ り取得することができる。
また、 その N末端または C末端に適当なタグが融合するように設計されたべク ターなどに挿入してタグを付加したタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。
タグとして具体的には、 ダルタチオン一 S—トランスフェラ一ゼ、 ポリヒスチジ ン、 F 1 a gなどが挙げられる。
上記形質転換体が産生するタンパク質には、 タンパク質合成時に重原子などで 置換 ·修飾したァミノ酸を取り込ませることにより修飾することができる。 また、 タンパク質を、 精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることに より、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾 タンパク質とすることができる。 例えば、 N末端ァセチル化、 C末端アミド化な どの末端修飾、 糖鎖付加、 脂質付加、 ァシル化、 メチル化、 スルホン化、 カルボ キシル化、 水酸化、 リン酸化、 AD P—リボシル化などであるが、 必ずしもこれ らに限定されない。 これらの修飾タンパク質も上記したキナーゼ活性を有するも のであれば本発明の範囲に含まれる。
また、 上記形質転換体が産生するタンパク質を、 精製の前又は後に適当なタン パク質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチド を部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。 これらの修 飾タンパク質も上記したキナーゼ活性を有するものであれば本発明の範囲に含ま れる。
本発明のタンパク質の産生を行う際、 本発明の D NAを含む組換えベクターの 作製に用いるベクターとしては、 形質転換体内で該 D NAが発現されるものであ れば特に制限はなく、 プラスミドベクター、 ファージベクターのいずれでもよい。 これらのうち通常は、 該 D NAが導入される宿主に適したプロモーター等の発現 制御領域 D NAが既に挿入されている市販のタンパク質発現用べクターを用いる。 このようなタンパク質発現用ベクターとして、 具体的には例えば、 宿主が大腸菌 の場合では、 p E T 3、 p E T 1 1 (ストラタジーン社製) 、 p G E X (アマシ ャムフアルマシアバイオテク社製) 等が挙げられ、 酵母の場合では p E S P— I エクスプレッションベクター (ストラタジーン社製) 等が挙げられ、 さらに昆虫 細胞の場合では B a c P AK 6 (クロンテック社製) 等が用いられる。 また宿主 が動物細胞の場合では、 Z A P E x p r e s s (ストラタジーン社製) 、 p S
VK3 (アマシャムフアルマシアバイオテク社製) が挙げられ、 宿主が哺乳動物 細胞等の場合には p ME 18 S F L 3 (Genbank AB009864) 等が好ましい。
発現制御領域が挿入されていないベクターを用いる場合には、 発現制御領域と して少なくともプロモーターを挿入する必要がある。 ここでプロモーターとして は、 宿主微生物または培養細胞が保有するプロモーターを用いることができる力 これに限られるものではなく、 具体的には例えば、 宿主が大腸菌の場合には T 3、 T7、 t a c、 1 a cプロモーター等を用いることができ、 酵母の場合には nm t 1プロモーター、 Ga 1 1プロモーター等を用いることができる。 昆虫細胞の 場合には、 ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。 また宿主が動物 細胞の場合には SV 40プロモーター、 CMVプロモーター等が好ましく用いら れる。
また哺乳動物由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、 本発明 の遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。 これらのベクターへの本 発明の DNAの挿入は、 該 DNAまたはこれを含む DNA断片をベクター中のプ 口モーターの下流に該遺伝子 DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を連 結して行えばよい。
このようにして作製した組換えべクターは、 それ自体既知の方法により後述す る宿主を形質転換して、 DN A導入体を作製することができる。 宿主への該べク ターの導入方法として、 具体的には、 ヒートショック法 (J. Mo 1. B i o 1. , 53, 154, (1970) ) 、 リン酸カルシウム法 (S c i e n c e, 221, 551, (1983) ) 、 DEAEデキストラン法 (S c i e n c e, 21 5, 166, (1982) ) 、 インビトロパッケージング法 (P r o c . N a t 1. Ac a d. S c i . USA, 72, 581, (1975) ) 、 ウィル スベクター法 (Ce l l , 37, 1053, ( 1984 ) ) 、 および電気パルス 法 (Chu. e t a l . , N c. Ac i d s Re s. , 15, 1331 (1987) ) 等が挙げられる。
DNA導入体を作製するための宿主としては、 本発明の DN Aが体内で発現す るものであれば特に限定されないが、 例えば大腸菌、 酵母、 バキュロウィルス
(節足動物多角体ウィルス) 一昆虫細胞、 あるいは動物細胞等が挙げられる。 具 体的には、 大腸菌では B L21、 XL-2B 1 u e (ストラタジーン社製) 等、 酵母では SP— Q01 (ストラタジーン社製) 等、 バキュロウィルスでは Ac N P V (J. B i o l. Ch em. , 263, 7406, (1988) ) とその宿 主である S f — 9 (J. B i o l . Ch e m. , 263, 7406, (198 8) ) 等が挙げられる。 また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞 C 127 (J. V i o l . , 26, 291, ( 1978 ) ) やチャイニーズハムスター卵巣細胞 CHO細胞 (P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA, 77, 4216,
(1980) ) 等が挙げられるが、 発現量やスクリーニングの簡便さから好まし くはアフリカミドリザル腎臓由来 COS— 7 (ATCC CRL 1651 :ァメ リカン タイプ カルチャー コレクション保存細胞) 、 ヒ ト胎児腎臓由来 HE K293細胞 (AT C C C R L 1573 ) またはヒト子宮頸部癌 H e L a細胞
(ATCC CCL- 2) が用いられる。
上記したようなタンパク質発現用ベクターを用いる発現方法の他に、 プロモー ターを連結した本発明の DN A断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同 組換え技術 (A. A. Ve r t e s e t a l . , B i o s c i . B i o t e c h n o 1. B i o c h em. , 57, 2036, (1993) ) 、 あるいは トランスポゾンや挿入酉己歹 1) (A. A. Ve r t e s e t a l . , Mo 1 e c u l a r Mi c r o b i o l . , 1 1, 739, (1994) ) 等を用いて D N A導入体を作製することもできる。
上記で得られた培養物は細胞または菌体を遠心分離等の方法により収集し、 こ れを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチーム、 および/または凍結融解等の それ自体既知の適当な方法により破壊した後、 遠心分離や濾過等によりタンパク 質粗精製液を得、 さらに適当な精製方法を組み合わせることにより精製すること ができる。
力べして、 本発明のタンパク質が取得される。 上記したタンパク質発現組換え ベクターを用いる発現方法の他に、 上記 (1 ) で取得された本発明の D NAを無 細胞転写翻訳系 (または無細胞タンパク質合成系とも称する) に供することによ りタンパク質発現を誘導し、 本発明のタンパク質を取得することができる。 本発 明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、 D NAから mR NAへの転写、 および m R N Aからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、 そこに D N Aを加えることによってその D NAがコードしているタンパク質が合成されるよ うなあらゆる系を指す。 無細胞転写翻訳系の具体例としては、 真核細胞、 および パクテリァ細胞、 又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳 系が挙げられる。 無細胞タンパク質合成系として具体的には、 大腸菌、 植物種子 の胚芽、 ゥサギ網状赤血球等の細胞抽出液等の既知のものが用いられる。 これら は市販のものを用いることもできるし、 それ自体既知の方法、 具体的には大腸菌 抽出欲'は、 Pratt, J. M. , Transcription and Tranlation (Ed. by Hames, B. D. and Higgins, S. J. ) , 179-209, IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準 じて調製することもできる。 市販の無細胞タンパク質合成系、 または細胞抽出液 としては、 大腸菌由来のものは、 E. coli S30 extract system (Promega社製) と RTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製) 等が挙げられ、 ゥサギ網状 赤血球由来のものは Rabbit Reticulocyte Lysate Sytem (Promega社製) 等、 さ らにコムギ胚芽由来のものは PR0TEI0S™ (T0Y0B0社製) 等が挙げられる。
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、 本発明のタンパク質の分離、 および精製は、 それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。 具体的 には、 ェピトープペプチド (例えば、 ポリヒスチジンペプチド、 グルタチオン一 S—トランスフェラーゼ (G S T) 、 マルトース結合タンパク質等) をコードす る D NA領域を、 前記した転写翻訳されるべき D NAに導入し、 前記の通り発現 させ、 該タンパク質と親和性を有する物質とのァフィ二ティーを利用して精製す ることができる。
目的とするタンパク質の発現は、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動等 で分離し、 クマシ一ブリリアントブルー (シグマ社製) 等で染色するか、 または 後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体により検出する方法等によ つて確認できる。 また一般的に、 発現されたタンパク質は生体内に存在するタン パク質分解酵素により切断されること (プロセッシング) が知られている。 本発 明のタンパク質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であって も、 キナーゼ活性を有するものであれば、 本発明のタンパク質に含まれる。 (3) 本発明のタンパク質が有する活性の確認
本発明のタンパク質は、 これを上記 (2) に記載のとおり組み換えタンパク質 として作製し、 これを解析することにより (1) で推測した活性を有しているこ とを確認することができる。 さらに下記 (4) に記載の抗体等との組み合わせに より解析することもできる。
本発明のタンパク質が、 キナーゼ活性を有することは、 それ自体既知の常法を 用いることができる。 具体的な方法の例として、 基質を該組み換えタンパク質に 接触させ、 該組み換えタンパク質のキナーゼ活性により基質がリン酸ィ匕される際 に消費される AT P量、 生成物の量を測定する方法等を以下に説明する。
反応液としては、 基質のリン酸化部位がセリン/スレオニンである、 Se rZ Th rプロテインキナーゼの活 を測定する場合は、 マグネシウムイオン、 例え ば 5〜 100 ιηΜの塩化マグネシゥムあるいは酢酸マグネシゥム、 および還元剤 として 1〜10 OmMの 2—メルカプトエタノール或いは 1〜1 OmMのジチォ スレイトールを含む、 リン酸イオンの存在しない、 中性から弱塩基性緩衝液、 例 えば 5 OmMのトリス—塩酸あるいは HEPES緩衝液 (pH7. 0〜8. 0) を用い、 また、 基質のリン酸化部位がチロシンである Ty rプロテインキナーゼ の活性を測定する場合は、 塩化マンガン、 塩化亜鉛、 NaVO3、 ジチオスレィ トールを含むトリス—塩酸あるいは HEP E S緩衝液 ( H 7. 0〜8. 0) を 用いることができる。
この反応液に、 AT Pおよびそれぞれに適した基質を加えた後、 精製した本発 明のタンパク質を添加し、 室温〜 3 7 °Cで 2 4時間程度反応後、 該タンパク質が 有するキナーゼ反応により消費した A T P量、 或いは該タンパク質により行われ るキナーゼ反応による生成物を測定する。
ここで、 受容体型キナーゼと予想されるタンパク質のキナーゼ活性を測定する 場合には、 該タンパク質の細胞内部分、 あるいはキナーゼ活性中心部分のみを組 み換えタンパク質として発現させて上記の反応に用いることが好ましい。
キナーゼ反応に関して、 S e r /T h rプロテインキナーゼである環状ヌクレ ォチド依存性プロティンキナーゼの場合、 各キナーゼに対応する環状ヌクレオチ ドを反応液中に添加することが必要である。 例えば、 A—キナーゼの場合は環状 AM P ( c AM P ) を、 G—キナーゼの場合は環状 GM P ( c GM P ) を添加し、 基質としてヒストンを用いる。
リン脂質依存性プロティンキナーゼの場合は、 リン脂質を反応液中に添加する。 例えば、 C一キナーゼの場合、 ホスファチジルセリンを添加し、 基質としてヒス トンを用いる。 カルシウム依存性プロテインキナーゼの場合には、 カルモジユリ ンを反応液に添加し、 基質としてミオシン L鎖を用いる。 ここには、 ミオシン L 鎖キナーゼ、 カルモジュリンキナーゼが含まれる。 T y rプロティンキナーゼの 場合は、 基質としてチューブリン、 ヒストン、 カゼイン、 ミオシン L鎖、 ガスト リン、 アンギオテンシン、 チロシン一グルタミン酸 (1 : 4 ) 重合物等を用いる。 キナーゼ活性測定において、 基質へのリン酸基の転移に先立ち、 キナーゼによ る A T Pの AD Pへの加水分解反応が起こる。 ここで加水分解された A T P量を 測定することで、 キナーゼ活性を定義づけることも可能である。 この場合、 基質 非存在下で行つた反応液中の A T P量を測定し、 消費 A T P量をキナーゼ活性と する (Whitehoouse, S. et al. , J. Biol. Chem. , 258: 3693-3701 (1983) ) 。
キナーゼ反応により消費した A T P量を測定する場合、 上記キナーゼ反応液に ルシフェリン、 ルシフェラーゼを加え、 一定時間反応後、 添加したルシフェリン 特有の蛍光波長で蛍光強度を測定し、 残存 AT Pによる蛍光量とする。 プロティ
ンキナーゼおよぴ基質非存在下で測定した、 反応液中に存在する全 A T P蛍光強 度から上記蛍光強度を差し引いた値を、 キナーゼ活性により消費した AT P量と し、 酵素のキナーゼ活性とする。
キナーゼ反応による生成物を測定する場合は、 反応液に添加する A T Pとして 放射性同位元素である3 2 Pを AT Pの γ位に含んだ [ V— 3 2 P ] A T Pを用い る。 キナーゼ反応終了後、 反応液を S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動に より分離し、 泳動後のゲルを X線フィルムによりオートラジオグラフィーを行い 3 2 Pの取り込まれたタンパク質バンドを検出する。 また、 反応液に 1 0 %トリ クロ口酢酸、 或いは終濃度 9 0 %となるようにエタノールまたはアセトンを加え、 タンパク質を ¾fc殿させる。 その後遠心或いはフィルター濾過により上清を除き、 さらに同溶液で数回洗浄した後乾燥し、 基質タンパク質がリン酸化されたために 不溶ィヒ画分に移行した3 2 Pを液体シンチレーションカウンターで測定する。 放 射性同位元素を用いない方法としては、 キナーゼ反応終了後の反応液を、 クロマ トグラフィ一により分離し、 リン酸ィ匕された基質の溶出位置の変化および変化量 で活性を測定することも可能である。 この場合、 クロマトグラフィーとしては、 イオン交換クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィーを用いることができる。 また、 基質のリン酸ィヒによる質量変化を質量分析装置で測定することにより、 活 性測定することも可能である。 この場合、 前述のクロマトグラフィー分離と併用 することで、 測定精度がさらに上昇する。
このようなキナーゼ活性の解析系は、 本発明のキナーゼ活性を有するタンパク 質のァゴニストやアンタゴニストの評価にも用いることができる。 なお、 本発明 のタンパク質が有する活性の確認は、 上記した方法に限定されるものではない。
( 4 ) 本発明のタンパク質の機能解析
かくして得られたスプライシングバリアントとして同定されたものを含む新規 タンパク質であって、 かつキナーゼ活性を有する本発明のタンパク質は、 上記
( 3 ) で確認されたキナーゼ活性以外の機能を解析することによりその新規の利 用法が提供される (このキナーゼ活性以外の機能をさらに解析する対象となるタ
ンパク質を、 以下 「解析対象タンパク質」 と称することがある) 。 特に、 本発明 のタンパク質には、 公知のタンパク質のスプライシングバリアントが含まれるた め、 このバリアントが公知のパリアントとどのような異なる機能があるかを同定 することは重要である。
具体的な機能の解析方法としては、 例えば、 (i) 各組織、 疾患、 あるいは発 生段階における発現状態を比較解析する方法、 (ii) 他のタンパク質、 D NAと の相互作用を解析する方法、 (iii) 適当な細胞あるいは個体へ導入し、 表現型 の変化を解析する方法、 (iv) 適当な細胞あるいは個体において該タンパク質の 発現を阻害して表現型の変化を解析する方法などが挙げられる。
(i) の方法においては、 本発明のタンパク質の発現を、 mRNAレベルあるいは タンパク質レベルで解析することができる。 mR Aレベルで発現量を解析する場 合は、 例えば、、 in situハイブリグイゼーション法 (In situ hybridization: Application to Developmental Biology & Medicine (Ed. by Harris, N. and Wilkinson, D. G. ) , Cambridge University Press (1990) ) 、 DNAチップを禾 lj 用したハイブリダィゼーシヨン法、 定量 P C R法等が用いられる。 ここで、 解析 の対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントであ る場合には、 解析対象タンパク質をコードする cDNAにのみ存在し、 公知のバリ アントをコ一ドする cDNAとはハイブリダィズしないプローブを用いることが好 ましい。 定量 P C R法の場合には、 対象バリアントと公知バリアント間で異なる 長さの増幅断片ができるプライマーを選択して行う方法 (Wong, Y. W. ,
Neuroscience Let. , 320, 141-145 (2002) ) 等が挙げられる。 また、 タンパク質 レベルで解析する場合には、 後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗 体を用いた糸且織染色法などが挙げられる。 この場合、 対象タンパク質にのみ反応 し、 公知のバリアントには反応しない抗体を用いることが好ましい。
(ii) の相互作用の解析法としては、 それ自体既知の常法を用いることができ るが、 具体的には、 例えば、 酵母ツーハイブリッド法、 蛍光偏光解消法、 表面プ ラズモン法、 ファージディスプレイ法、 リポソ一マルディスプレイ法等が挙げら
れる。 該方法においても、 解析対象タンパク質が公知のバリアントが存在するス プライシングバリアントの場合には、 公知のバリアントも同様にして相互作用す る物質を解析し、 対象タンパク質特異的に相互作用する物質を同定することが好 ましい。
(iii) の方法では、 本発明の cDNAを導入する細胞は特に制限はないが、 ヒ ト 培養細胞等が特に好ましく用いられる。 DNAの細胞への導入法としては、 上記
( 2 ) に記載のものが挙げられる。 さらに導入細胞の表現型としては、 細胞の生 死、 細胞の増殖速度、 細胞の分化、 細胞が神経細胞の場合には神経突起の伸長度、 細胞内タンパク質の局在や移行など顕微鏡等で観察可能なものや、 細胞内の特定 タンパク質の発現変化など生化学的実験により解析可能なものも含む。 これらの 表現型は、 公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、 公知のものも同様に細胞へ導入し、 比較解析することにより解析対象バリアント に関連する表現型を同定することができる。 また、 本発明のタンパク質はキナー ゼ活性を有するものであることがわかっているので、 キナーゼが関連する疾患に 見られる表現型等に注目して解析することも好ましい。
(iv) の方法では、 後述するオリゴヌクレオチドを用いた方法や、 RNAインタ 一フェアレンス法により効率的に行うことができる。 この方法においても、 解析 する対象タンパク質が、 公知のバリアントが存在するスプライシングバリアント である場合には、 公知のバリアントやその他のバリアントについても同様の解析 を行い、 比較解析することにより対象タンパク質特異的な機能を同定することが できる。
( 5 ) オリゴヌクレオチドの調製
上記 (1 ) に記載の方法で取得した本発明の D NAまたはその断片を用いて、 D NA合成機などを用いる常法により、 本発明の D NAの一部の配列を有するァ ンチセンス ·オリゴヌクレオチド、 センス ·オリゴヌクレオチド等のォリゴヌク レオチドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、 上記 DNAの有する塩基配列中の連続した 5 〜100塩基と同じ配列を有する DN Aまたは該 DN Aと相補的な配列を有する DN Aを挙げることができる。 具体例としては、 配列番号 1〜 5で表される塩基 配列中の連続した 5〜100塩基と同じ配列を有する DNAまたは該 DNAと相 補的な配列を有する DN Aを挙げることができる。 ここで、 対象タンパク質が、 公知のバリアント DNAが存在するスプライシングバリ'アントの場合には、 公知 のバリアントと異なる部分の塩基配列を選択することが好ましい。 センスプライ マーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、 両者の融解温度 (T m) および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好まし レ、。 また、 配列の長さは、 一般的には 5〜100塩基であり、 好ましくは 10〜 60塩基であり、 より好ましくは 15〜 50塩基である。
また、 これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとし て利用することができる。 該オリゴヌクレオチド誘導体としては、 オリゴヌタレ ォチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換されたオリゴ ヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3,一 P 5'ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴ ヌクレオチド中のリポースとリン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換さ れたォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5プロ ピニルゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中 のゥラシルが C— 5チアゾールゥラシルで置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンが c一 5プロピニルシトシンで置換されたォリ ゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾 シトシン ^ e n o x a z i n e— mo d i f l e d c y t o s i n eノ で 置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリボースが2, —0—プロピルリポースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 あるいはオリ ゴヌクレオチド中のリポースが 2,ーメ トキシェトキシリボースで置換されたォ リゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる。
また、 本発明のオリゴヌクレオチドは、 これを 2本鎖 RNAとして調製するこ とにより、 RNAインターフェアレンス法に適用することができる。 2本鎖 RN Aの作製方法、 及ぴ RNAインターフェアレンス法については、 例えば、
Elbashir, S. , et al. , Nature, 411, 494- 498(2001)に記載の方法等を用いるこ とができる。 上記 2本鎖 RNAは、 そのすべてが RN Aである必要はない。 具体 的には、 その一部が DN Aであるものとして、 WOO 2/10374号公報に記 載のものを用いることができる。
この RNAインターフェアランス法において標的となる遺伝子 (以下これを 「標的遺伝子」 と称することがある) は、 本発明の DNAであれば、 如何なるも のであってもよい。 また、 該遺伝子 DN Aのオルソログと予想される遺伝子も標 的遺伝子とすることができる。 これらの DNAの少なくとも一部の塩基配列と実 質的に同一な配列を有する RN Aからなる 2本鎖ポリヌクレオチド (以下、 これ を 「2本鎖ポリヌクレオチド」 と称することがある) とは、 標的遺伝子の塩基配 列のうち、 いずれの部分でもよい 15 b p以上の配列と実質的に同一な配列から なるものである。 ここで、 実質的に同一とは、 標的遺伝子の配列と' 80%以上の 相同性を有することを意味する。
また、 解析対象タンパク質が公知タンパク質と比較して、 挿入型あるいは置換 型バリアントである場合は、 2本鎖ポリヌクレオチド配列は挿入あるいは置換部 位に設定することができる。 また、 解析対象タンパク質が公知タンパク質の欠失 型バリアントである場合は、 欠失部を跨ぐ配列を 2本鎖ポリヌクレオチド配列と することにより、 該タンパク質特異的に効果のある配列を選定することができる。 さらに、 解析対象タンパク質と公知タンパク質のそれぞれをコードする DNAの 塩基配列と比較して、 解析対象タンパク質をコードする D N Aに特異的な塩基配 列を選定することによれば、 解析対象タンパク質特異的にその発現を阻害するこ とができる。
ヌクレオチドの鎖長は 15 b pから標的遺伝子のオープンリーディングフレー ム (ORF) の全長までの如何なる長さでもよいが、 15〜500 b p程度のも
のが好ましく用いられる。 ただし、 哺乳類動物由来の細胞においては、 30 b p 以上の長い 2本鎖 RN Aに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られて いる。 これはインターフェロン反応と呼ばれており (Ma r e u s, P. I . , e t a 1. , I n t e r f e r o n, 5, 115— 180 (1983) ) 、 該 2本鎖 RN Aが細胞内に侵入すると、 PKR (d s RNA- r e s p o n s i v e r o t e i n k i n a s e : B a s s, B . L . , Na t u r e, 41 1, 428-429 (2001) ) を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的 に阻害され、 それと同日寺に 2 ' -5' -o l i g o a d e ny l a t e s yn t h e t a s e (B a s s, B. L. , Na t u r e, 41 1, 428— 429 (2001) ) を介して RNa s e Lの活性化が起こり、 細胞内の RNAの非特 異的な分解が惹起される。 これらの非特異的な反応のために、 標的遺伝子の特異 的反応が隠蔽されてしまう。 従って哺乳類動物または該動物由来の細胞あるいは 組織を被導入体として用いる場合には 15〜30 b p、 好ましくは 19〜 24b p、 さらに好ましくは 21 b pの 2本鎖ポリヌクレオチドを用いることが好まし い。 2本鎖ポリヌクレオチドはその全体が 2本鎖である必要はなく、 5' または 3, 末端が一部突出したものも含むが、 3, 末端が 2塩基突出したものを用いる ことが好ましい。 2本鎖ポリヌクレオチドは相補性を有する 2本鎖のポリヌタレ ォチドを意味するが、 自己相補性を有する 1本鎖ポリヌクレオチドが自己ァニー リングしたものでもよい。 自己相ネ 性を有する 1本鎖ポリヌクレオチドとしては、 例えば、 逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
2本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては特に制限はないが、 それ自体既知 の化学合成方法を用いることが好ましい。 化学合成は相補性を有する 1本鎖ポリ ヌクレオチドを別個に合成し、 これを適当な方法で会合させることにより 2本鎖 とすることができる。 会合の方法としては上記ポリヌクレオチドを混合し、 2本 鎖が解離する温度にまで加熱し、 その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。 会 合した 2本鎖ポリヌクレオチドは、 ァガロースゲル等を用いて確認し、 残存する 1本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する。
このようにして調製した 2本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、 標的遺伝子がその細胞内で R NAに転写、 またはタンパク質に翻訳を受け得るも のであれば如何なるものであってもよいが、 具体的には、 植物、 動物に属するも のが挙げられる。 植物は単子葉植物、 双子葉植物または裸子植物であってよく、 動物は、 脊椎動物または無脊椎動物であってよい。 脊椎動物の例には、 魚類、 ゥ シ、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 ハムスター、 マウス、 ラット、 及ぴヒトを含む哺乳動 物が含まれ、 無脊椎動物には、 線虫、 キイ口ショウジョゥバエ (D r o s o p h i 1 a ) 、 及ぴ他の昆虫が含まれる。 好ましくは、 細胞は脊椎動物細胞である。 被導入体は、 細胞、 糸且織あるいは個体を意味する。 ここで細胞とは、 生殖系列 または体性、 分化全能または多分化能、 分割または非分割、 実質組織または上皮、 不滅化したものまたは形質転換したもの等であってよレ、。 細胞は、 配偶子または 胚であってよく、 胚の場合、 単一細胞胚または構成性細胞、 または多重細胞胚か らの細胞であり、 胎児組織を含む。 さらには、 幹細胞のような未分化細胞、 また は胎児組織を含む器官または組織の細胞のような分ィヒ細胞、 または生物内に存在 する任意の他の細胞であってよい。 分化している細胞型には、 脂肪細胞、 繊維芽 細胞、 筋細胞、 心筋細胞、 内皮細胞、 神経細胞、 グリア、 血液細胞、 巨核球、 リ ンパ球、 マクロファージ、 好中球、 好酸球、 好塩基球、 マスト細胞、 白血球、 顆 粒球、 ケラチン生成細胞、 軟骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 肝細胞及び内分泌腺 または外分泌腺の細胞が含まれる。
被導入体への 2本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、 被導入体が細胞、 あ るいは組織の場合は、 カルシウムフォスフェート法、 エレクトロポレーシヨン法、 リポフエクシヨン法、 ウィルス感染、 2本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、 あ るいは形質転換法等が用いられる。 また、 胚に導入する方法としては、 マイクロ インジェクション、 エレクト口ポレーシヨン法、 あるいはウィルス感染等が挙げ られる。 被導入体が植物の場合には、 植物体の体腔または間質細胞等への注入ま たは灌流、 あるいは噴霧による方法が用いられる。 また、 動物個体の場合には、 経口、 局所、 非経口 (皮下、 筋肉内及び静脈内投与を含む) 、 経膣、 経直腸、 経
鼻、 経眼、 腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、 あるいはエレクトロボ レーシヨン法やウィルス感染等が用いられる。 経口導入のための方法には、 2本 鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。 さらに、 個体に 導入する場合には、 例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、 2本 鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。 導入する 2本鎖ポリヌクレオチドの量は、 導入体や、 標的遺伝子によって適宜 選択することができるが、 細胞あたり少なくとも 1コピー導入されるに充分量を 導入することが好ましい。 具体的には、 例えば、 被導入体がヒト培養細胞で、 力 ルシゥムフォスフェート法により 2本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、 0 . 1〜: L 0 0 0 nMが好ましレヽ。
R N Aインターフェアレンスによる本発明の遺伝子の導入体内での発現抑制に より、 本発明の遺伝子がコードするタンパク質の機能の確認、 あるいは新たな機 能の解析等を行うことができる。
( 6 ) 本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、 通常用いら れる公知の方法を用いることができ、 抗原として用いられるポリペプチドについ ても、 公知の方法に従って抗原性が高くェピトープ (抗原決定基) として適した 配列を選択して用いることができる。 ェピトープの選択方法としては、 例えば E p i t o p e A d v i s e r (富士通九州システムエンジニアリング社製) 等 の市販のソフトウェアを用いることができる。 また、 対象タンパク質が、 公知の バリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、 対象タンパク 質にのみ反応し、 公知の、 またはそれ以外のバリアントには反応しない抗体を用 いることにより、 対象タンパク質に特異的な機能を同定することができる。 この ような抗体のェピトープとしては、 例えば、 対象タンパク質が公知のバリアント と比較して欠失しているアミノ酸配列がある場合、 欠失部分の前後のアミノ酸配 列 (ジャンクション部分) 等が好ましい。 また、 対象タンパク質が公知のバリア ントの N末または C末が添加されているアミノ酸配列を有する場合、 添カ卩されて
いるアミノ酸配列をェピトープとすることも好ましい。 上記以外の方法として、 対象タンパク質に対して取得したポリクローナル抗体から、 公知の、 またはそれ 以外のバリアントに反応する抗体を除去することにより、 対象タンパク質にのみ 反応する抗体を取得することができる。 除去する方法としては、 公知の、 または それ以外のバリアントをリガンドとして固定したァフィ二ティーク口マトグラフ ィー、 或いは、 公知の、 またはそれ以外のバリアントによる免疫沈降法等が用い られる。
上記の抗原として用いるポリべプチドは、 公知の方法に従って合成した合成ぺ プチドでも、 また本発明のタンパク質そのものを用いることもできる。 抗原とな るポリペプチドは、 公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、 哺乳動物、 例 えばゥサギ、 マウス、 ラット等に免疫を行えばよいが、 安定的な免疫を行ったり 抗体価を高めるために抗原ぺプチドを適当なキャリアタンパク質とのコンジュゲ ートにして用いたり、 アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、 例えば皮下、 腹腔内、 静脈 内、 あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。 具体的には、 例えば B A L B / cマウスに抗原ポリぺプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が 用いられる。 また、 抗原の摂取量としては、 抗原がポリペプチドの場合 0 . 3〜 0 . 5 m g Z l回程度が好ましいが、 ポリペプチドの種類、 また免疫する動物種 によっては適宜調節される。
免疫後、 適宜試験的に採血を行ってオクタローニ一法、 固相酵素免疫検定法 (以下、 これを 「E L I S A法」 と称することがある) やウェスタンプロッティ ング等の方法で抗体価の上昇を確認し、 十分に抗体価の上昇した動物から採血を 行う。 これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を 得ることができる。 具体的には、 例えば、 公知の方法に従い血清から抗体成分を 精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。 抗体成分の精製は、 塩析、 ィ オン交換クロマトグラフィー、 アブイ-ティークロマトグラフィ一等の方法を用 いることができる。
2 また、 該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合 させたハイプリ ドーマを用いる (Mi l s t e i n, e t a 1. , N a t u r e, 256, 495 (1975) ) ことによりモノクローナル抗体を作製するこ ともできる。 モノクローナル抗体は、 例えば以下の方法により取得することがで きる。
まず、 上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取 得する。 抗体産生細胞は、 形質細胞、 及ぴその前駆細胞であるリンパ球であり、 これは個体の何れから取得してもよいが、 好ましくは脾臓、 リンパ節、 末梢血等 から取得する。 これらの細胞と融合させるミエローマとしては、 一般的にはマウ スから得られた株化細胞、 例えば 8—ァザグァ二ン耐性マウス (BALBZc由 来等) ミエローマ細胞株である P 3X63— Ag 8. 653 (ATCC : CRL -1580) 、 P 3 -NS 1/1 Ag 4. 1 (理研セルバンク : RCB 009 5) 等が好ましく用いられる。 細胞の融合は、 抗体産生細胞とミエローマ細胞を 適当な割合で混合し、 適当な細胞融合培地、 例えば RPMI 1640やイスコフ 改変ダルベッコ培地 (IMDM) 、 あるいはダルベッコ改変イーグル培地 (DM EM) 等に、 50%ポリエチレングリコール (PEG) を溶解したもの等を用い ることにより行うことができる。 また電気融合法 (U. Z imme rma nn. e t a 1. , Na t u rw i s s e n s c h a f t e n, 68, 577 (1 981) ) によっても行うことができる。
ハイブリ ドーマは、 用いたミエローマ細胞株が 8—ァザグァニン耐性株である ことを利用して適量のヒポキサンチン'アミノプテリン ·チミジン (HAT) 液 を含む正常培地 (HAT培地) 中で 5%C02、 37 °Cで適当時間培養すること により選択することができる。 この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって 適宜選択して用いることができる。 選択されたハイプリ ドーマが産生する抗体の 抗体価を上記した方法により解析し、 抗体価の高い抗体を産生するハイプリ ドー マを限界希釈法等により分離し、 分離した融合細胞を適当な培地で培養して得ら れる培養上清から硫安分画、 ァフィ二テイクロマトググラフィ一等の適当な方法
により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。 また精製には市販のモ ノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。 さらには、 免疫した動物と 同系統の動物、 またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブ リ ドーマを増殖させることにより、 本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹 水を得ることもできる。
また、 本発明のタンパク質としてヒト由来のものを取得した場合には、 かかる ポリペプチド、 あるいはその部分ペプチドを抗原として、 ヒ ト末梢血リンパ球を 移植し 7こ S e v e r e c om i n e d i mm u n e d e f i c i e n c y (SC I D) マウスに上記した方法と同様にして免疫し、 該免疫動物の抗体産 生細胞とヒ トのミエ口一マ細胞とのハイブリ ドーマを作製することによってもヒ ト型抗体を作製することができる (Mo s i e r, D. E. , e t a 1. Na t u r e , 335, 256-259 (1988) ; Du c h o s a l , M. A. , e t a 1. , Na t u r e, 355, 258— 262 (1992) ) 。
また、 取得したヒト型抗体を産生するハイプリ ドーマから RNAを抽出し、 目 的のヒト型抗体をコードする遺伝子をクローニングして、 この遺伝子を適当なベ クタ一に挿入し、 これを適当な宿主に導入して発現させることにより、 さらに大 量にヒト型抗体を作製することができる。 ここで、 抗原との結合性の低い抗体は、 それ自体既知の進化工学的手法を用'いることによりさらに結合性の高い抗体とし て取得することもできる。 一過性抗体等の部分フラグメントは、 例えばパパイン 等を用いて F a b部分と F c部分を切断し、 ァフィ二ティカラム等を用いて F a b部分を回収することによつて作製することができる。
力くして得られる本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体は、 本発明のタ ンパク質に特異的に結合することによって該タンパク質が有するキナーゼ活性等 を阻害する中和抗体として用いることもできる。 タンパク質が有する活性を阻害 するものの選択方法としては特に制限はないが、 例えば、 上記 (2) で作製した DNA導入体に抗体を接触または導入し、 導入体中の目的タンパク質の機能が阻 害されるか否かを解析する方法等が挙げられる。
かかる中和抗体は、 臨床へ応用するに際し、 上記有効成分を単独で用いること も可能であるが、 薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用い ることもできる。 この時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜9 0重量%の間 で変動され得る。 また、 力かる薬剤は種々の形態で投与することができ、 それら の投与形態としては、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 あるいはシロップ剤等 による経口投与、 または注射剤、 点滴剤、 リボソーム剤、 坐薬剤等による非経口 投与を挙げることができる。 また、 その投与量は、 症状、 年齢、 体重等によって 適宜選択することができる。
( 7 ) 本発明のタンパク質が有する活性を調節する分子のスクリーニング 本発明のタンパク質に特異的に結合し、 かつ本発明のタンパク質の機能 (活 性) を阻害、 拮抗または増強する作用を有する物質をスクリーニングすることに より本発明のタンパク質の機能調節物質 (以下、 これを 「調節物質」 と称するこ とがある) を得ることができる。
この調節物質のスクリーニング方法は、 本発明のタンパク質に特異的に結合し、 且つ該タンパク質の活性を阻害、 拮抗または増強する作用を有する物質が得られ る方法であれば如何なるものであってもよい。 例えば、 先ずはじめに本発明のタ ンパク質とスクリーニングに供する物質 (以下、 これを 「被検物質」 と称するこ とがある) とを接触させ、 該タンパク質との結合性を指標として選抜した後に、 本発明のタンパク質が有する活性の変化を指標として被検物質を選抜する方法を 用いることができる。
被検物質としては、 本発明のタンパク質と相互作用して、 該タンパク質が有す る活性に影響を及ぼす可能性のある物質であれば如何なるものであってもよレ、が、 具体的には、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 低分子化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 動物組織抽出液等が挙げられる。 こ れらの物質は新規な物質であってもよいし、 公知の物質であってもよい。
被検物質と本発明のタンパク質の相互作用の解析法としては、 それ自体既知の 常法を用いることができるが、 具体的には、 例えば、 酵母ツーハイブリッド法、
蛍光偏光解消法、 表面プラズモン法、 ファージディスプレイ法、 リポソ一マルデ イスプレイ法、 あるいは上記 (6 ) に記載した抗体との競合解析法等が挙げられ る。 このような方法により、 本発明のタンパク質に結合する活性を見いだされた 物質は、 次に該物質の存在下で本発明のタンパク質が有する活性がどのような影 響を受けるかを解析することによって、 調節物質として用いられる力否かが同定 される。
ここで、 対象タンパク質が、 公知のバリアントが存在するスプライシングバリ アントである場合には、 対象タンパク質にのみ結合し、 公知のまたは他のバリア ントには結合しない物質についてその影響を解析するカ または公知のあるいは 他のバリアントにおレ、ても同様に結合する力否かを同定し、 結合した場合にはそ の影響の相違を解析することによって、 対象タンパク質に対する該物質の影響を 解析することができる。 また、 該物質の個体内での分布を検討することにより、 対象タンパク質や公知のまたは他のバリアントに対する影響を解析することがで きる。
具体的な解析方法としては、 例えば、 キナーゼ活性を調節する物質を解析する 場合には、 (2 ) に記載した D NA導入体に基質となるタンパク質も同様の方法 で導入する。 この導入体について選択された物質の存在下/または非存在下で基 質となるタンパク質のリン酸ィヒをそれ自体既知の通常用いられる方法により解析 する。 具体的には、 上記 (3 ) に記載の方法等を用いて行うことができる。 基質 となるタンパク質のリン酸化が、 物質の非存在下の場合と比べて増加した場合に は、 該物質はキナーゼ活性物質として機能する可能性があり、 また低下、 または 阻害された場合には物質はキナーゼ阻害物質として機能する可能性があると同定 できる。
ここで、 医薬活 '性成分の取得を目的として調節物質をスクリーエングするため に用いる本発明の D NA、 あるいは組み換えタンパク質を用いる場合は、 ヒ トの D NAあるいはタンパク質を用いることが好ましい。 さらに上記方法によってで スクリーニングされた物質は、 さらに生体内でのスクリーニングによって医薬侯
補としての選択を行ってもよい。 なお、 本発明のタンパク質の機能調節物質の評 価は、 上記した方法に限定されるものではない。
本発明のタンパク質が有するキナーゼ活性としては、 例えば、 癌に関連するパ スウェイ上のシグナル伝達機能、 心筋発達に関連するパスウェイ上のシグナル伝 達機能、 精子の運動性を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、 生殖細胞分 化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、 細胞分化を制御するパスウェイ 上のシグナル伝達機能、 精子の分ィヒを制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、 アルツハイマー病発症を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、 グリセロー ル 3リン酸を生成する機能、 脳皮質発達、 神経細胞等遊走を制御するパスウェイ 上のシグナル伝達機能、 脂肪酸ゃステロールの合成に関連する機能、 細胞死に関 連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、 ィンシュリンシグナル伝達等である。 そこで、 本スクリーニング方法により同定できる化合物は、 制癌剤、 心疾患治療 剤、 不妊治療剤、 再生組織誘導剤、 アルツハイマー病治療剤、 神経変性疾患治療 剤、 糖尿病治療剤として用いられ得るものである。
また、 本発明のタンパク質は、 精巣、 気管、 脳ダリオ一マ細胞由来の培養細胞 等から構築された cDNAライブラリーよりクローユングされており、 取得された 本発明のタンパク質は、 上記組織おょぴ器官等において特有の機能を有している 可能性があるので、 該組織および器官に特有の疾患の治療剤として用いられ得る。 かかる調節物質は、 臨床へ応用するに際し、 上記有効成分を単独で用いること も可能であるが、 薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品糸且成物として用い ることもできる。 この時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜9 0重量%の間 で変動され得る。 また、 力かる薬剤は種々の形態で投与することができ、 それら の投与形態としては、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 あるいはシロップ剤等 による経口投与、 または注射剤、 点滴剤、 リボソーム剤、 坐薬剤等による非経口 投与を挙げることができる。 また、 その投与量は、 症状、 年齢、 体重等によって 適宜選択することができる。
( 8 ) 本発明の D N Aの発現調節物質のスクリーニング
スクリーニングの方法としては、 被検物質の存在下で本発明のタンパク質、 あ るいはそれをコードする mR N Aの発現量を解析する方法等が挙げられる。 具体 的には、 例えば、 (2 ) に記載した本発明のタンパク質を発現する細胞を被検物 質を含む適当な培地で培養し、 該細胞内に発現している本発明のタンパク質量を E L I S A等の常法を用いて解析するか、 あるいは該細胞内の本発明のタンパク 質をコードする mR NA量を、 定量的逆転写 P C R法や、 ノーザンブロット法等 により解析することにより行うことができる。
被検物質としては、 (7 ) に記載のものを用いることができる。 この解析によ り、 被検物質の非存在下で培養された当該細胞内で発現されたタンパク質、 ある いは mR NA量と比べてその量が増加すれば、 この被検物質は本発明の D N Aの 発現促進物質として機能する可能性があり、 逆に減少した場合には、 この被検物 質は本発明の D N Aの発現阻害物質として用いられ得ると判断することができる。 かかる発現調節物質は、 臨床へ応用するに際し、 上記有効成分を単独で用いる ことも可能であるが、 薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として 用いることもできる。 この時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜9 0重量% の間で変動され得る。 また、 かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、 そ れらの投与形態としては、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 あるいはシロップ 剤等による経口投与、 または注射剤、 点滴剤、 リボソーム剤、 坐薬剤等による非 経口投与を挙げることができる。 また、 その投与量は、 症状、 年齢、 体重等によ つて適宜選択することができる。
( 9 ) 本発明の D N A導入動物
上記 (1 ) に記載の、 本発明の D NAを含む導入 D NAを構築し、 ヒト以外の 哺乳動物の受精卵に導入して、 これを雌個体子宮に移植して発生させることによ り、 本発明の D NAが導入された非ヒト哺乳動物を作製することができる。 より 具体的には、 例えば、 雌個体をホルモン投与により過剰排卵させた後、 雄と交配 し、 交配後 1日目の卵管から受精卵を摘出し、 該受精卵に導入 D NAをマイクロ インジェクション等の方法により導入する。 この後、 適当な方法で培養した後、
生存している受精卵を、 偽妊娠させた雌個体 (仮親) の子宮に移植して出産させ る。 新生仔に目的の D N Aが導入されているか否かは、 該個体の細胞から抽出し た D N Aのサザンプロット解析を行うことにより同定することができる。 ヒト以 外の哺乳動物としては、 例えばマウス、 ラット、 モルモット、 ハムスター、 ゥサ ギ、 ャギ、 ブタ、 ィヌ、 ネコ等が挙げられる。
かくして得られた本発明の D N A導入動物は、 この個体を交配し、 導入された D N Aが安定的に保持されていることを確認しながら通常の飼育環境で継代飼育 することによりその子孫を得ることができる。 また、 体外受精を繰り返すことに よりその子孫を得て、 系統を維持することもできる。
本発明の D N Aが導入ざれた非ヒト哺 ¾動物は、 本発明の D N Aの生体内にお ける機能の解析や、 またこれを調節する物質のスクリーニング系等として用いる ことができる。
( 1 0 ) 本発明のタンパク質及ぴそれをコードする塩基配列を含む D NAの他の 利用
本発明のタンパク質は、 それを基盤上に結合させた担体として利用することが できる。 また、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列、 例えば、 配列番号 1 〜 5に記載の塩基配列を有する D N A及ぴその部分断片は、 それらを基板上に結 合させた担体として用いられ得る。 これらを、 以下、 「プロテインチップ」 、
「D NAチップ」 または 「D NAアレイ」 (D NAマイクロアレイ及び D NAマ クロアレイ) と称することがある。 これらのプロテインチップ、 又は D NAチッ プもしくはアレイには、 本発明のタンパク質や D NA以外に、 他のタンパク質や D N Aが含まれていてもよい。
ここで、 対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリァ ントである場合、 上記プロテインチップには対象タンパク質特異的なアミノ酸配 列部分断片を用いることもできるが、 他バリアントと異なる立体構造を有してい る可能性もあるためその全長を用いることもできる。 また、 D NAアレイには、
対象タンパク質をコードする DNA配列のうち、 他のバリアント DN Aと異なる 配列を選択することが好ましい。
また、 タンパク質や DNAを結合させる基盤としては、 ナイロン膜、 ポリプロ ピレン膜等の樹脂基板、 ニトロセルロース膜、 ガラスプレート、 シリコンプレー ト等が用いられるが、 ハイプリダイゼーシヨンの検出を非 R I的に、 例えば、 蛍 光物質等を用いて行う場合には、 蛍光物質を含まないガラスプレート、 シリコン プレート等が好適に用いられる。 また該基盤へのタンパク質、 あるいは DN Aの 結合は、 それ自体公知の通常用いられる方法により容易に行うことができる。 こ れらのプロテインチップ、 DNAチップ、 あるいは DNAアレイも、 本発明の範 囲に含まれる。
■ また、 本発明のタンパク質のアミノ酸配列及ぴ DN Aの塩基配列は、 配列情報 としても用いることができる。 この DN Aの塩基配列には、 対応する RN Aの塩 基配列も含まれる。 すなわち、 得られたアミノ酸配列や塩基配列をコンピュータ 一が読みとり可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することにより、 ァミノ 酸配列や塩基配列のデータベースが構築できる。 このデータべ一スには、 他の種 類のタンパク質やそれをコードする DN Aの塩基配列が含まれていてもよい。 ま た、 本発明においてデータベースとは、 上記配列を適当な記録媒体に書き込み、 所定のプログラムに従って検索を行うコンピューターシステムをも意味する。 こ こで適当な記録媒体としては、 例えば、 フレキシブルディスク、 ハードディスク、 磁気テープ等の磁気媒体、 CD— ROM、 MO、 CD-R, CD-RW, DVD 一 R、 DVD— RAM等の光ディスク、 半導体メモリ等を挙げることができる。 実施例
以下、 実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、 本発明の範囲はこれらの実 施例により限定されるものではない。 なお、 取得された各 cDNAクローンにつ いて以下の実験を行った結果は、 実施例 5に纏めて記載した。
実施例 1 オリゴキヤップ法による cDNAライブラリ一の作製
ヒト培養細胞 (ヒト脳グリオ一マ細胞由来の培養細胞である H 4細胞、 ATCC : HTB-148) より、 文献 ( J . S a mb r o o k, e t a 1. , Mo l e c u l a r C l o n i n g S e c o n d e d i t i o n, Co l d S p r i n g h a r b o r La b o r a t o r y P r e s s (1989) ) 載の方 法により niRNAを抽出した。 さらに、 オリゴ dTセルロースで p o 1 y (A) +RNAを精製した。
上記で取得した p o 1 y (A) +RNAと、 巿販のヒト各組織 mRNA (クロ ンテック社製:精巣 (#64027-1) 、 気管 (#64091-1) ) よりオリゴキャップ法
(Ma r uy ama, K. , e t a 1. , Ge n e, 138, 171-174
(1994) ) により cDNAライブラリーを作製した。
まず、 上記 RNAを B AP (B a c t e r i l A l k a l i n e P o s p h a t a s e) およぴ TAP (To b a c c o Ac i d P y r o p h o s p h a t a s e) で処理した後に、 オリゴキャップリンカー (配列番号 1 1) を RNAライゲースを用いて連結した。 この RNA鎖を鍚型としてオリゴ dTプ ライマー (配列番号 12) 用いた逆転写反応により第 1鎖 cDNAを合成し、 続 いて RNA鎖を分解除去した (鈴木ら、 タンパク質 核酸 酵素、 41、 603 -607 (1996) ; Su z uk i, Y. e t a 1. , Ge n e, 200, 149- 156 (1997) ) 。 次いで、 5, の PCRプライマー (配列番号 1 3) と 3' の PC Rプライマー (配列番号 14) を用い PC R (p o l yme r a s e c h a i n r e a c t i o n) により 2本鎖 c DNAを増幅し、 増幅 された DNA鎖を S f i Iにより切断した。
次いで、 発現用ベクターである pME 18 S F L 3 (G e n B a n k AB O 09864) の D r a I I Iサイトに上記で取得した S f i I切断断片をクロー ユングし、 c DNAライブラリーを作成した。 上記で用いた pME 18 S F L 3 ベクターは、 クローニング部位の上流に S R αプロモーターと SV40 s ma 1 1 tイントロンが組み込まれており、 またその下流には S V 40ポリ A付カロ シグナル配列が挿入されている。 pME 18 S F L 3のクローン化部位は非対称
性の D r a I I Iサイトとなっており、 c DN A断片の末端にはこれと相捕的な S f i I部位を付加しているので、 クローン化した c DNA断片はSRQ;プロモ 一ターの下流に一方向性に揷入される。 したがって、 全長 cDNAを含むクロー ンでは、 得られたプラスミドをそのまま COS細胞に導入することにより、 一過 的に遺伝子を発現させることが可能である。 すなわち、 非常に容易に、 遺伝子産 物であるタンパク質として、 あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析 することが可能となっている。
これらより得たクローンのプラスミド DNAについて、 cDNAの 5, 端また は 3 ' 端の塩基配列を DN Aシーケンシング試薬 (Dy e Te rmi n a t o r し y c l e S e q u e n c i n g P S Re a d y Re a c t i o n Ki t, dRh o d ami n e Te rm i n a t o r Cy c l e S e q u e n c i n g F S Re a dy Re a c t i o K i tまたは B i gD y e Te rm i n a t o r Cy c l e S e qu e n c i n g F S Re a d y Re a c t i o n K i t : P E B i o s y s t erns社製) を用レヽ、 マニュアルに従ってシーケンシング反応後、 DNAシーケンサー (AB I PR I SM 3700 : PE B i o s y s t ems社製) で DNA塩基配列を解析 した。 実施例 2 オリゴキヤップ法で作製した c D N Aライブラリ一からのクローンの 5' 末端の全長性の評価
実施例 1で作製したヒト c DNAライブラリーの 5 ' 末端の塩基配列は、 これ を公共データベース中のヒト既知 mRNAの配列と比較し、 5, 末端配列が一致 する全クローンについて、 公共データベース中の既知 mRNA配列より長く 5, 末端が伸びている場合、 または 5' 末端は短いが翻訳開始コドンは有している場 合を 「全長」 と判断し、 翻訳開始コドンを含んでいない場合を 「非全長」 と判断 した。
次に、 E ST iMa t e F Lによるクローンの評価を行った。 E ST iMa t e F Lは、 公共データベース中の E S Tの 5, 末端配列や 3 ' 末端配列との比較 によって全長 cDNAの可能性の高いクローンを選択するために、 ヘリックス研 究所の西川 ·太田らにより開発された方法である。 実施例 1で解析した c DNA クローンの 5, 末端や 3, 末端配列を ESTデータベースに登録されている塩基 配列と比較し、 取得された c D N Aクローンの配列よりも、 5, 側または 3 ' 側 へ伸長している E STが存在する場合には、 そのクローンは 「全長ではない可能 性が高い」 と判断した。 公共データベース中の EST配列より 5, 末端が伸長し ている場合、 あるいは 5, 末端が短いクローンでも、 その差が 50塩基以内の場 合を便宜的に全長とし、 それ以上短い場合を非全長とした。 実施例 3 c D N Aクローンの塩基配列、 ァミノ酸配列の解析
実施例 2で解析した cDNAクローンの全塩基配列について、 BLAST (B a s 1 c l o c a l a l i g nme n t s e a r c h t o o l ; A 1 t s c h u 1 , S. F. , e t a 1. , J . Mo 1. B i o l . , 2 15, 403-410 (1990) ) による相同性検索 (h omo l o g y s e a r c h) や、 HMMER (隠れ Ma r k o vモデルによる配列解析手法; Ed dy, S. R. , B i o i n f o rma t i c s 14, 755— 763
(1998) ) の機能群のひとつである HMMPF AMによるタンパク質特徴検 (p r o f i l e s e a r c h : h t t p : // p f am. wu s t l . e d u) を行い、 各 c DNAクローンがコードするタンパク質の機能を推定した。 また、 その塩基配列の一部が完全に一致する公知のクローンが存在するスプライ シングバリアントと推定されるクローンについては、 そのゲノム配列が解析可能 であればどのェクソンが欠失してスプライシングしたものであるかを解析した。 実施例 4 キナーゼ活性の測定
(1) タンパク質の調製
実施例 3でキナーゼ活性を有すると推定された c D NAクローンについて、 こ れがコードするタンパク質を無細胞タンパク質合成系を用いて合成し、 該タンパ ク質がキナーゼ活性を有するか否かを以下の生化学的実験により解析した。 実施例 3でキナーゼ活性を有すると推定された cDNAクローンのオープンリー デイングフレーム (0RF) 断片を、 5, 側のプライマーとして各クローンに特異 的な下記プライマー、 3, 側のプライマーとして下記の共通プライマーを使用し た PCR法によつて取得した。
5 ' 側のプライマー
( a ) c-bngh42005017 : ATGGGTCAAGAGCTGTGTG (配列番号 1 5 )
( b ) c-testi2025879: ATGTTCAAAGAAATCAATTCAACTGCT (配列番号 1 6 )
( c ) c-trach2020048 : ATGCAGTTTGGGAGAGCC (配列番号 1 7 )
( d ) c-testi2016663: ATGGTGAAGACAGGGGC (配列番号 1 8 )
( e ) c-testi2015335: ATGCAGCAGAAGCTGTACAT (配列番号 1 9 )
3 ' 側の共通プライマー
GGCCCTTATGGCCGGAGAAAGGCGGACAGGTAT (配列番号 2 0 )
これを、 SP6プロモーターを含む翻訳制御領域一グルタチオン一S _トランス フェラーセ遺伝子一 PreScission Protease (アマシャムファノレマシァ/ ィォテク 社製) 切断サイト一 DNAクローニングサイト (Smal, Sfil) 一ポリ Aシグナル配 列を有するベクター (p E U—S S 4 ) のクローニングサイトに挿入した。 上記で調製されたプラスミ ド D NAを铸型として、 SP6 R A Polymerase (Promega社製) を用いて転写を行 、、 得られた RNAをフエノール/クロ口ホル ム抽出、 エタノール沈殿の後、 Nick Column (Amersham Pharmacia Biotech社 製) によって精製した。
透析法によるコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成の方法は既報 (Endo, Y. et al. , (1992) J. Biotech. , 25, 221-230) の方法に従った。 反応 溶液は、 容量の 2 4 %のコムギ胚芽抽出液を含み、 上記 Ericksonらの方法に準 じた以下の成分組成である。 20 mM HEPES-K0H、 pH 7. 6、 80 mM酢酸カリゥム、
1.6 mM酢酸マグネシウム、 0.4 mMスペルミジン、 2 raMジチオスレィトール、 20 種類の L -ァミノ酸(各 0.24 mM)、 1.2 mM ATP、 0.26 πιΜ GTP、 16 raM
リン酸、 0.4 mg/mlクレアチンキナーゼ、 1000 units/ml ribonuclease
inhibitor (RNasin™)に、 上述した mRNA (1 rag/ml反応容量) を添加して用いた。 上記反応溶液をフロータ ·ライザ一 (Spectra / Float- A- Lyzer (Biotech RC)、 分画分子量: 10 kDa, 容量: 1 ml) に入れ、 反応液の 40倍容量の透析外液 (30 mM HEPES- K0H、 pH 7.6、 100 mM酢酸カリゥム、 2.7 raM酢酸マグネシウム、 0.4 スペルミジン、 2.5 raMジチオスレィトール、 20種類の L -アミノ酸(各 0.3 )、 1.2 mM ATP, 0.25 uM GTPN 16 raM クレアチンリン酸) に対しての透析系で、 反応は 26°Cで、 48時間行った。
反応終了後、 透析内液を 1 6, 000 r p mで 5分間遠心分離し、 上清を分離 した。 この上淸を、 1 5 0 mM塩化ナトリゥム、 1 0 mMジチォスレイトールを 含む 50 mMトリス '塩酸緩衝液 (p H8. 5) で 5倍希釈し、 同緩衝液で平衡 化したァフイエティ樹脂であるグルタチオンセファロース ' 4 B (アマシャムバ ィォサイエンス社製) を充填したァフィ二ティカラムに室温で添加し、 目的タン パク質を吸着した。 ここで、 上記カラムには、 取得した遠心上清の 1Z 2量のァ フィニティ樹脂を用いた。
さらに、 上記で用いたァフィ二ティ樹脂の 10倍容量の同緩衝液にてカラムを 洗浄した後、 2 u 11 i t s / μ 1濃度の P r e S c i s s i o n p r o t e a s e (アマシャムバイオサイエンス社製) の同緩衝液による 2 5倍希釈液を、 ァ フィニティ樹脂と等容量添加し、 4 で 40時間切断反応を行った後、 上記緩衝 液にて目的タンパク質を溶出した。
(2) 目的タンパク質の AT P消費量を指標とするキナーゼ活性の測定
上記 (1) で単離した目的タンパク質は、 ゥシ血清アルブミンを標準として定 量した。 0. 1 μ gの目的タンパク質を、 0. 2mg/m 1ゥシ血清アルブミン、 8 mM塩化マグネシゥムを含む 5 0 mMトリス '塩酸緩衝液 (pH 7. 4) 中で、 終濃度 1〜1 OmMとなるようにジチオスレィトールを添加後、 1 JuMのATP
と室温で 24時間インキュベートした後、 ルシフェラーゼ ·ルシフェリンキット (和光純薬工業社製) 1 00 μ 1を加え、 室温で 24時間反応した後、 560 η mの蛍光強度を測定した。 目的タンパク質を添加していない反応系をコントロー ルとして、 同様に 560 nmの蛍光強度を測定した。 このコントロールの値と目 的タンパク質を添加した系の値の差を目的タンパク質が消費した AT P量として、 目的タンパク質 1 mo 1あたりが 24時間に消費する ATP量 (m o 1 ) を目的 タンパク質のキナーゼ活·生として同定した。
(3) 目的タンパク質によるポリぺプチドのリン酸化を指標としたキナーゼ活性 の測定
上記 (1) で単離した目的タンパク質は、 ゥシ血清アルブミンを標準として定 量した。 0. 1 μ gの目的タンパク質を、 基質としての標準ポリペプチド (C d c 2、 Ar g 2— OH、 PKA、 PKC、 DNA_PK、 PTK1、 PTK 2 : P r ome g a社、 MLCKS、 C a MK I I : S i gma社、 S y n t i d e 2 : BACHEM FE I NCHEMI KAL I EN AG) 0. 2 μ gととも に、 0. 2mg /m 1ゥシ血清アルブミン、 1〜 1 0 mMジチォスレイトール、 8 mM塩化マグネシウムを含む 5 OmMトリス .塩酸緩衝液 ( H 7. 4) 、 1 μΜ ATPと室温で 2時間インキュベートした。 反応終了後、 反応液を、 2 0%ァセトニトリルを含む 0. 1%トリフルォロ酢酸で平衡化した B a k e r b o n d C 18 (J. T. B a k e r社製: 0. 46 X 25 c m) カラムに添カロ し、 0. 1 %トリフルォロ酢酸の存在下で、 20〜 80%のァセトニトリルの 6 0分間の直線濃度勾配により流速 1 m 1 Z分でぺプチドを分離した。 ぺプチドの 溶出は、 2 1 5 nmの吸光度により測定した。 コントロールとして目的タンパク 質を添加しない反応液についても同様に分離し 21 5 nmの吸光度を測定した。 ここで、 目的タンパク質を添加することによってピークの減少および溶出位置の 変動が検出されるポリぺプチドについては、 目的タンパク質の有するキナーゼ活 性の基質となると判断することができる。
実施例 5 各 cDNAクローンの解析結果
(1) c-b n gh4200501 7 (配列番号 1、 6 )
c-b n g h4200501 7 (以下、 これを 「本 DNA」 と称し、 該 DNA によりコードされるタンパク質を 「本タンパク質」 と称する) は、 配列番号 1に 示すように、 1828塩基から成り、 そのうち塩基番号 87から 1 124までが オープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。 オープンリーディ ングフレームから予測されるアミノ酸配列は、 345アミノ酸残基から成る (配. 列番号 6) 。 配列番号 6のアミノ酸配列について BLASTを用いて相同性検索 を行ったところ、 NRDBタンパク質データベース (SWI S S— PROT、 P I R、 TREMBLE, GENPEPT、 P D Bから作成された重複のないアミ ノ酸配列のデータベース) 中に、 データベース登録記号 AB 053308、 am y o t r o p i c l a t e r a l s c l e r o s i s 2 C R 7 ^ h ma n) (以下、 これを 「ALS 2CR7」 と称する) 力 e - v a 1 u e : 5 X I 0- i 48、 285アミノ酸残基に亘り 92%の一致度でヒットした。 ALS 2CR7は amy o t r o p h i c l a t e r a l s c l e r o s i sの原 因遺伝子 a 1 s 2 c r 6の近傍に存在する遺伝子がコードするタンパク質
(Nature Genetics, 29, 166-173, (2001)) で、 p r o t e i n k i n a s e d oma i nが見出される。
本タンパク質と A L S 2 CR 7のアミノ酸配列 (データベース登録記号: AB 053308) を C.LUSTALWでアラインメント比較すると ALS 2 CR 7 は 384アミノ酸残基から成り、 その 1〜130番が、 配列番号 6に記載のアミ ノ酸配列のアミノ酸番号 52〜181番と完全に一致し、 また 152〜285番 、 配列番号 6に記載のァミノ酸配列のァミノ酸番号 182〜 315番と完全に 一致する。 即ち、 本タンパク質は ALS 2 CR 7のアミノ酸配列のアミノ酸番号 131〜151番を欠失し、 N末端の 1〜51番、 および C末端の 316〜34 5番に新規配列を有する。
このことを遺伝子上で確認するために ALS 2 CR 7がコードされているヒト 染色体 2番のゲノム配列上で本タンパク質をコードする c DNAと上記 AB 05 3308の c DNAの比較を行った。 AB 053308は 14個のエタソンから 成り、 本 DNAではその第 1、 6、 1 1、 12、 13、 14ェクソンを欠失し、 第 2、 3、 4、 5、 7、 8、 9、 10ェクソンを共有していた。 上記の本タンパ ク質の AL S 2 CR 7に対する 21アミノ酸の欠失は、 第 6ェクソンのスキップ によるものである。 また上記の本タンパク質の N末の 51アミノ酸残基の付カ卩は、 本 DNAの 5, 末端に上記 AB 053308にない別のエタソンが 1つ存在する ことによるものであった。 更に上記の本タンパク質の C末の 30アミノ酸残基の 付カ卩は、 本 DNAの 3 ' 末端に上記 A B 053308にない別のエタソンが存在 することによるものであった。 これらのことより本タンパク質は、 amy o t r o p h i c l a t e r a l s c l e r o s i s 2 CR7 (huma n) とは異なる p r omo t e rから発現する mRN Aに由来するタンパク質であ り、 N末端および C末端の配列が異なり、 中央に欠失を持つバリアントであるこ とがわかった。
一方、 本タンパク質と AB 053308の HMMPFAM検索を行ったところ、 本タンパク質 (配列番号 6) のアミノ酸番号 103— 325番に、 また AB 05 3308のァミノ酸配列のァミノ酸番号 52〜 336番に、 P r o t e i n k i n a s e d oma i nの特徴を示す配列 (P f a mに p k i n a s eとして エントリーされるアミノ酸配列) を見出した。 このことから本タンパク質の AL S 2 CR 7に対するアミノ酸配列の欠失は protein kinase domainに存在するこ とがわかった。 しかし本タンパク質の AT P消費活性を指標としたキナーゼ活性 を、 実施例 4 (2) の系で測定したところ、 29. 1であり、 また、 基質として Sy n t i d e 2 (配列番号 21) を添カ卩したところ (実施例 4 (3) ) 、 基質 の、 逆相 HP LC上でのピークの減少、 新規ピークの溶出 (図 1矢印部分) が確 認されたことから、 少なくとも S y n t i d e 2を基質とするプロテインキナー ゼであることが確認、された。
以上のように、 本タンパク質は AL S 2 CR 7の、 N末端、 C末端ともに異な る配列をもち Protein kinase domainの一部を欠失するが、 プロテインキナー ゼ活性が見出されたことから、 ALS 2 CR 7とは異なる機能をもつタンパク質 であることが推定された。
さらに、 本タンパク質をコードする cDNAは、 脳ダリオ一マ細胞由来の培養 細胞からクローユングされたものであり、 該組織に特有の器官の発生、 機能およ ぴ疾患に関連することが予測された。
(2) c- t e s t i 2025879 (配列番号 2、 7)
c- t e s t i 2025879 (以下、 これを 「本 DNA」 と称し、 該 DNA によりコードされるタンパク質を 「本タンパク質」 と称する) は、 配列番号 2に 示すように、 2195塩基から成り、 そのうち塩基番号 1 15から 2094まで がオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) になっていた。 オープン リーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、 659アミノ酸残基から 成る (配列番号 7) 。 また、 配列番号 7のアミノ酸配列について、 HMMPFA Mによるタンパク質特徴検索を行つたところ配列番号 7のァミノ酸番号 413— 659番に示されるアミノ酸配列に P r o t e i n k i n a s e d oma i nの特徴を示す配列 (P f an^ p k i n a s eとしてェントリーされるァミノ 酸配列) を見出した。
配列番号 7のァミノ酸配列について B LASTを用いて相同性検索を行ったと ころ、 NRDBタンパク質データベース (SWI S S— PROT、 P I R、 TR EMBLE、 GENPEPT、 P D Bから作成された重複のないアミノ酸配列の データベース) あるいは特許データベース GENESEQ中に、 (i) データベース登 録記号 AX166558、 および WOO 1/38503号公報に記載されている アミノ酸配列が、 e— V a 1 u e : 5 X 10— 148、 257アミノ酸に亘り 9 9 %の一致度でヒットした。 AX166558は 278ァミノ酸から成り、 その ァミノ酸配列中のァミノ酸番号 1 ~ 257番が配列番号 7に記載のァミノ酸配列 のアミノ酸番号 403〜659番と上記のように 99%—致していた。 即ち本タ
ンパク質は AX 1 6 6 5 5 8より N末端が 40 2アミノ酸残基長く、 また、 C末 端が 2 1アミノ酸短いタンパク質である。 また、 上記特許公報には、 AX166558 タンパク質について novel mitogen- activated kinase (MAPK) との記載が あ 。
さらに、 ( i i ) データべース記号: AF 0 9 3 6 8 9 (Dictyostelium discoideum MEK kinase a) が 2 70アミノ酸残基にわたり 43 %の一致度で、 また、 ( i i i ) データベース登録記号: AB 0 0 0 7 9 7 (Arabidopsis thaliana NPK - related protein kinase)が 2 6 0ァミノ酸残基にわたって 4 8 % の一致度でヒットした。 これらはいずれも MAP kinase カスケ一ド (MAPKKK:、 MAPKK, MAPKが順次活性化することでシグナルを伝えていく系)における MAPKKK に位置付けられるプロテインキナーゼである。 従って、 本タンパク質は MAPKシ ダナルカスケードに属するタンパク質と推測される。
また AX 1 6 6 5 5 8と本タンパク質のアミノ酸配列の違いを明らかにするた め、 両 c DNAをヒ ト 2番染色体ゲノム配列上(データベース登録記号: emb|AC016725|AC016725)で比較した。 本 D N Aはェクソン 3個からなるが、 AX 1 6 6 5 5 8では本 DN Aの第 1ェクソンが無く、 第 2ェクソンの途中から開始 し、 第 3ェクソンを途中まで共有したあと、 別のェクソンを有していた。 AX 1 6 6 5 5 8のアミノ酸配列はメチォニンから始まっておらず、 不完全タンパク質 と推定されるが、 本タンパク質はメチォニンから始まっており、 AX 1 6 6 5 5 8よりも N末が 4 0 2アミノ酸残基長くなつていることが確認された。 このよう に N末に長レ、新規配列を有するタンパク質をコードする c DNAが単 ί隹されたの は、 実施例 1に記載のオリゴキャップ法を用いた優れた一例と考えられる。 上記 の新規 40 2アミノ酸配列を prosite検索すると、 6箇所の N—グリコシル化部 位、 1 3箇所の P K Cによるリン酸化部位、 1 2箇所の casein kinasellによる リン酸化部位、 1箇所のミリスチル化部位がみいだされ、 種々の翻訳後修飾およ び活性の調節を受ける可能性があることが分かった。 従って、 本タンパク質は A X 1 6 6 5 5 8にない活性調節部位を持つ protein kinaseと推定される。
本タンパク質の P f am検索を行うと、 配列番号 7のアミノ酸番号 413〜6 59番に protein kinase domainがみいだされた。 そこで本タンパク質の AT P 消費活性を、 実施例 4 (2) の系で測定したところ、 66. 6であり、 キナーゼ 活性があることが確認された。
これらのことより本タンパク質は、 上記 AX 166558および WOO 1/3 8503号公報に記載のタンパク質の N末端が伸長したバリアントであり、 キナ ーゼ活性を有することがわかった。 また、 本 DNAは、 精巣からクローニングさ れたものであり、 該,袓織に特有の器官の発生、 機能および疾患に関連するもので あることが推測された。
(3) c- t r a c h 2020048 (配列番号 3、 8)
c- t r a c h 2020048 (以下、 これを 「本 DNA」 と称し、 該 DNA によりコードされるタンパク質を 「本タンパク質」 と称する) は、 配列番号 3に 示すように、 3255塩基から成り、 そのうち塩基番号 1232から 2764ま でがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) になっていた。 オーブ ンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、 510アミノ酸残基か ら成る (配列番号 8) 。 配列番号 8のアミノ酸配列について BLASTを用いて 相同性検索を行ったところ、 NRDBタンパク質データベース (SWI S S— P ROT, P I R、 TREMBLE, GENPEPT, PDBから作成された重複 のないアミノ酸配列のデータベース) 中に、 データベース登録記号 AX4056 33ー1、 unn ame d ORFが、 e— v a l u e : 0、 527アミノ酸残 基に亘り 96%の一致度でヒットした。 また、 AX405633—1は、 WO 0 2Z22660号公報に SEQ I D NO. 492として記載されている Nek3 (a novel human protein kinase) に類似のタンパク質であった。 AX 40 5633—1は 527アミノ酸から成り、 該配列のアミノ酸番号 1〜 313番が 本タンパク質のアミノ酸配列 (配列番号 8) の 1〜313番と、 また 331〜5 27番が本タンパク質の 314〜510番と完全に一致していた。 また、 AX4
05633—1のアミノ酸番号 162番がグリシンであるのに対し、 本タンパク 質のそれに相当する部分のアミノ酸はバリンであった。
すなわち本タンパク質は AX405633—1のアミノ酸番号 314〜330 番のアミノ酸配列部分を欠失し、 1アミノ酸置換変異をもつバリアントである。 AX405633—1のアミノ酸番号 162番のパリン/グリシン置換は他の公 知のバリアントタンパク質 (例えば、 WO 00/0006728号公報に記載の タンパク質) にも認められていることから SNPによる変異であると考えられる。 従って、 本質的には中央部 (配列番号 8のアミノ酸番号 313番と 314番の 間) の 17アミノ酸の欠失 (AX405633— 1のアミノ酸配列のアミノ酸番 号 314〜330番) が本タンパク質の構造を特異にしている。 この欠失領域に は PKAでリン酸化される部位 1箇所、 casein kinase IIでリン酸化される部 位 1箇所、 ミリスチル化部位 1箇所があり、 種々の翻訳後修飾部位となっている。 本 DNAと AX405633— 1の c DNAを、 AX405633— 1がコー ドされているヒ ト染色体 13番のゲノム配列 (データベース登録記号: emne | AL6722271 AL672227) において比較したところ、 本 D N Aは AX405 633— 1の第 10ェクソンをスキップすることで 17アミノ酸残基の欠失を生 じていることがわかった。
また、 配列番号 8のアミノ酸配列について、 HMMP F AMによるタンパク質 特徴検索を行つたところ配列番号 8のァミノ酸番号 25〜 278のァミノ酸配列 に P r o t e i n k i n a s e d oma i nの特徴を示す酉己列 (P f a mに p k i n a s eとしてェントリーされるアミノ酸配列) を見出した。 本タンパク 質の ATP消費量は、 実施例 4 (2) の系で測定したところ、 59. 0であり、 キナーゼ活性があることが確認された。
これらのことから本タンパク質は、 AX405633— 1、 すなわち WO 02 /22660号公報に S EQ I D NO. 492として記載されている Nek3
(a novel human protein kinase )に類似のタンノヽク (
ントであり、 キナーゼ活性を有するタンパク質であることが推定された
また、 本 DNAは、 気管からクローユングされたものであり、 本タンパク質は 該組織に特有の器官の発生、 機能および疾患に関連することが推測された。
(4) c- t e s t i 201 6663 (配列番号 4、 9 )
c- t e s t i 2016663 (以下、 これを 「本 DNA」 と称し、 該 DNA によりコードされるタンパク質を 「本タンパク質」 と称する) は、 配列番号 4に 示すように、 2259塩基から成り、 そのうち塩基番号 316から 1947まで がオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) になっていた。 オープン リーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、 543アミノ酸残基から 成る (配列番号 9) 。 配列番号 9のアミノ酸配列について BLASTを用いて相 同性検索を行ったところ、 NRDBタンパク質データベース (SWI SS— PR OT、 P I R、 TREMBLE, GENPEPT、 P D Bから作成された重複の ないアミノ酸配列のデータベース) 中に、 データベース登録記号 AX 36220 7— 1、 unn ame d ORFが、 e— v a l u e : 0、 504ァミノ酸残基 に亘り 99%の一致度でヒッ トした。 AX362207一 1は 974アミノ酸か らなり、 そのアミノ酸配列のァミノ酸番号 470〜 973番が、 配列番号 9に記 載のアミノ酸配列のアミノ酸番号 1〜502番と下述の 4アミノ酸残基を除いて 一致している。 また、 上記 AX 362207—1は、 WO 02/08253号公 報に記載されており、 Hum a n E p hA f u l l l e n g t h k i n a s eであると記載されていた。
このアミノ酸配列と配列番号 9に記載のァミノ酸配列を詳細に比較したところ、 本タンパク質の配列番号 9に記載のァミノ酸配列は、 上記 AX 362207— 1 およぴ WO 02/08253号公報に記載のァミノ酸配列のァミノ酸番号 1〜 4 69および 682番、 683番が欠失しており、 アミノ酸番号 681番、 740 番、 893番に変異が認められた。
また、 配列番号 4に記載の塩基配列は、 上記 AX362207—1および WO 02/08253号公報に記載の塩基配列の塩基番号 1〜 1248番および 20 42〜2047番が欠失しており、 2040番、 2219番、 2677番に変異
が認められた。 これらのことより本タンパク質は、 膜 1回貫通受容体型 P r o t e i n k i n a s eでめる E p r i n r e c e p t o r f am i l yの N末端 469アミノ酸を欠失したバリアントであることがわかった。
また、 本 DNAと AX 362207—1の c DNA配列を AX 362207— 1がコードされているヒト染色体 1番のゲノム配列 (データベース登録記号: embl|AC104336|AC104336) 上で比較した。 AX362207— 1の cDNAはェ クソン 16個からなる。 一方、 本 DNAはその第 5〜15エタソンと第 16エタ ソンの途中までを共有し、 その後ェクソン 3個をもつことで C末端の 41ァミノ 酸の新規配列が付加された構造を有している。 AX 362207—1は第 16ェ クソンの中で終止コドンが現れ、 本タンパク質との非共有配列 1アミノ酸をもつ て終了する。 さらに本 DNAは AX362207— 1の第 5ェクソン相当の前に、 翻訳されない別のェクソン 1個をもつことから、 本 DNAは AX362207— 1とは a l t e r n a t i v e p r omo t e rにより生じ、 AX 36220 7—1の N末端を欠失したタンパク質をコードする。 このように本 DNAはその 構造から AX362207—1とは転写調節、 翻訳産物ともに異なることを示し ている。
また、 配列番号 9のアミノ酸配列について、 HMMPFAMによるタンパク質 特徵検索を行ったところ配列番号 9のァミノ酸番号 140〜395番に? ]: 0 e i n k i n a s e d oma i nの特 ί敷を示す酉 3歹 U (P f amに p k i n a s eとしてエントリーされるアミノ酸配列) を見出した。 更に本タンパク質は配 列番号 9のアミノ酸番号 60〜 83番に膜貫通領域を、 また、 468〜 497番 に L e u c i n e Z i p p e rモチーフを有することがわかった。
したがって本タンパク質は膜貫通受容体の N末端細胞外ドメィンを大きく欠失 し、 C末端寄りにタンパク質相互作用に関与する配列を持ち、 さらに C末端部分 に新規配列をもつタンパク質である。 すなわち本タンパク質は細胞外からの刺激 にかかわらず細胞内タンパク質と相互作用しシグナル伝達をおこすタンパク質で あると推定することができる。
本タンパク質の ATP消費活性は、 実施例 4 (2) の系で測定したところ、 4 3. 1であり、 キナーゼ活性があることが確認された。 また、 基質として S y n t i d e 2 (配列番号 21) 、 CaMK I I (配列番号 22) を添加したところ
(実施例 4 (3) ) 、 両基質の、 逆相 H PLC上での各々の溶出位置が変化した こと (図 2矢印部分) から、 これらのペプチドを基質とするプロテインキナーゼ であることが確認された。
また、 本 DNAは、 精巣からクローニングされたものであり、 本タンパク質は 該組織に特有の器官の発生、 機能および疾患に関連することが推測された。
(5) c- t e s t i 2015335 (配列番号 5、 10)
c- t e s t i 2015335 (以下、 これを 「本 DNA」 と称し、 該 DNA によりコードされるタンパク質を 「本タンパク質」 と称する) は、 配列番号 5に 示すように、 2028塩基から成り、 そのうち塩基番号 151から 1881まで がオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) になっていた。 オープン リーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、 576アミノ酸残基から 成る (配列番号 10) 。 配列番号 10のアミノ酸配列について BLASTを用い て相同性検索を行ったところ、 NRDBタンパク質データベース (SWI S S— PROT、 P I R、 TREMBLE、 GENPEPT、 PDBから作成された重 複のないアミノ酸配列のデータベース) 中に、 データベース登録記号 Q 9 BXU 1 I S T 31— HUMAN、 S e r i n e/t h r e o n i n e p r o t e i n k i n a s e 31力 e— v a l u e : 0、 576ァミノ酸残基に亘り 9 9%の一致度でヒットした。 Q9BXU1 I ST31— HUMANは 1019ァ ミノ酸力 ら成り、 そのアミノ酸配列のアミノ酸番号 444〜1019番が、 配列 番号 10に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号 1〜 576番と下述の 3残基を除 いて一致している。
Q9BXU1 I ST 31— HUMANのアミノ酸配列と配列番号 10に記載の ァミノ酸配列を詳細に比較したところ、 本タンパク質の配列番号 10に記載のァ ミノ酸配列は、 上記 Q9BXU1 I ST 31— HUMANのアミノ酸配列のアミ
ノ番号 1〜443番が欠失しており、 また 621番、 623番、 および 1010 番に変異が認められた。 また本 DNAと Q 9 BXU 1 I ST31— HUMANの アミノ酸配列をコードする塩基配列 (データベース登録番号: AF 28559 9) を比較したところ、 本 DNAは AF 285599の塩基番号 1〜1202が 欠失しており、 1244番、 1878番、 1883番、 3043番に変異が認め られた。
これらのことより本タンパク質は、 S e r i n eZ t h r e o n i n e p r o t e i n k i n a s e 31 (STPK31)の N末端 443アミノ酸を欠失したバ リアントであることがわかった。
Interproscan(EBI)によると、 Q9BXU1 | ST31— HUMAN (S TP K31) のアミノ酸番号 105〜242番に t h e rmo s t a b l e n u c l e a s e d oma i n力、 ¾7こ 78〜 137番に T u d o r d oma i n
(R i b o nu c l e o p r o t e i nとともに存在するタンパク質に見出され る領域) 、 さらに 710〜 1019番に p r o t e i n k i n a s e d o m a i n力 S存在する。
—方、 本タンパク質は P f am検索により配列番号 10のアミノ酸番号 296 〜 529番に p r o t e i n k i n a s e d oma i n力 1字在する力、 Q 9 BXU 1 I ST 31— HUMANの N末 443アミノ酸相当部分を欠くため、 S TPK31とは異なる機能をもつタンパク質と考えられる。
更に本 DNAと AF 285599の c D N A配列についてゲノム情報を A F 2
85599がコードされる染色体 7番のゲノム配列で比較すると、 AF 2855
99はェクソン 24個力、らなり、 本 DNAではその第 10ェクソンの後半を共有 した後、 第 1 1ェクソンから第 24ェクソンを共有する。 このことから、 本 DN Aは AF 285599とは異なるプロモータから転写された産物と推定される。 本タンパク質の AT P消費活性は、 実施例 4 (2) の系で測定したところ、 3 8. 0であり、 キナーゼ活性があることが確認された。 また、 基質として Syn t i d e 2 (配列番号 21) 、 C aMK I I (配列番号 22) を添加したところ
(実施例 4 (3) ) 、 両基質の、 逆相 HP LC上での各々の溶出位置が変化した こと (図 3矢印部分) から、 これらのペプチドを基質とするプロテインキナーゼ であることが確認された。
これらのこと力、ら、 本タン ク質は S e r i n e/t h r e o n i n e p r o t e i n k i n a s e 3 1と比較すると N末端を欠失したバリアントであ る。
また、 本タンパク質は、 データベース中の文献情報 (Nature Genetics, 27 (4), 422-426 (2001)) 力 ら精子形成に関わることが明らかとなった。 さらに、 本 DNAは、 精巣からクローニングされたものであり、 本タンパク質は該組織に 特有の器官の発生、 機能および疾患に関連することが推測された。 産業上の利用の可能性
本発明のタンパク質およびそれをコードする D N Aはキナーゼ活性等を有する こと力 ら、 該タンパク質あるいはそれをコードする DN Aを用いて該活性を調節 する物質をスクリーニングすることができ、 該タンパク質が関連する疾患等に作 用し得る医薬の開発に有用である。
本出願は、 2002年 9月 10日付けの日本特許出願 (特願 2002— 264 345) に基づくものであり、 その内容はここに参照として取り込まれる。 また、 本明細書にて引用した文献の内容もここに参照として取り込まれる。