WO2004020624A1 - 癌抗原及びその利用 - Google Patents

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WO2004020624A1
WO2004020624A1 PCT/JP2003/011049 JP0311049W WO2004020624A1 WO 2004020624 A1 WO2004020624 A1 WO 2004020624A1 JP 0311049 W JP0311049 W JP 0311049W WO 2004020624 A1 WO2004020624 A1 WO 2004020624A1
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cancer
cell
peptide
protein
dna
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PCT/JP2003/011049
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Tetsuya Nakatsura
Yasuharu Nishimura
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Kumamoto Technology & Industry Foundation
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Definitions

  • the present invention relates to a novel human cancer antigen useful for diagnosis and immunotherapy of various cancers such as knee cancer and colon cancer, and uses thereof.
  • Background art
  • Immunotherapy has long been expected as a treatment for cancer, and various attempts have been made, but it has not yet been shown to have a sufficient antitumor effect.
  • immunotherapy for cancer has been focused on non-specific immunotherapy, but in recent years it has been revealed that ⁇ cells play an important role in tumor rejection in vivo, and cytotoxic T cells Efforts are being made to isolate T cell-recognizing tumor antigens that can induce (CTL: cytotoxic T lymphocyte) and to determine MHC class I-restricted epitopes.
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • a cancer antigen comprising any of the following proteins (A) and (B).
  • an agent for inducing immunity against cancer comprising the above-mentioned cancer antigen of the present invention.
  • a peptide comprising a part of the above-described cancer antigen of the present invention and having immunity-inducing activity.
  • the peptide of the present invention is preferably a peptide capable of activating cytotoxic T cells recognizing a cancer antigen protein.
  • the peptide of the present invention is preferably a peptide having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 22.
  • the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 3 to 22 comprises an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, Z or addition of one or several amino acids.
  • a peptide having immunity-inducing activity is preferably a peptide capable of activating a cytotoxic T cell that recognizes a cancer antigen protein.
  • an agent for inducing immunity against cancer comprising the peptide described above.
  • an antibody against the above-mentioned cancer antigen or peptide of the present invention is provided.
  • helper T cell a cytotoxic T cell induced by in vitro stimulation using the above-described cancer antigen or peptide of the present invention, or a mixture thereof, or A population of immune cells is provided.
  • helper T cells cytotoxicity induced by in vitro stimulation using the above-mentioned cancer antigen or peptide of the present invention or a mixture thereof and an immunostimulant
  • T cells or a population of immune cells comprising them.
  • the immunostimulant is a cell growth factor or cytokine.
  • a method for suppressing a tumor which comprises transferring the above-mentioned helper T cell, cytotoxic T cell, or an immune cell population containing the same into a body.
  • a law is provided.
  • the above method can be preferably performed for preventing and / or treating cancer.
  • a helper T cell comprising the above-described cancer antigen or peptide of the present invention, or a mixture thereof.
  • a cell culture for making is provided.
  • a helper T cell, a cytotoxic T cell of the present invention, or an immune cell population containing the same, comprising the above-described cell culture solution and cell culture container, is produced.
  • a cell culture kit is provided.
  • a cancer vaccine comprising the above-mentioned cancer antigen of the present invention and Z or at least one or more peptides.
  • the cancer vaccine preferably further comprises an adjuvant.
  • a cancer vaccine comprising the above-described DNA of the present invention, or a recombinant virus or recombinant bacterium containing the DNA.
  • the cancer vaccine preferably further comprises an adjuvant.
  • a probe for diagnosing cancer comprising the above-described DNA of the present invention.
  • a cancer diagnostic agent comprising the above-described cancer diagnostic probe of the present invention and Z or an antibody.
  • a cancer antigen a peptide, an antibody, and a Z or helper T cell, a cytotoxic T cell, or an immune cell population containing the above-described cancer antigen of the present invention.
  • Prophylactic and therapeutic drugs are provided.
  • the cancer is rucinoma, colon cancer, brain tumor, malignant melanoma, chronic myelogenous leukemia, acute myeloid leukemia, lymphoma, esophageal cancer, kidney cancer, prostate cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, liver cancer, It is gallbladder cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, bladder cancer or sarcoma.
  • FIG. 1 is a micrograph showing the results of immunohistochemical analysis of hsp105 in ⁇ cancer.
  • A ⁇ Hematoxylin 'eosin staining of cancer and surrounding non-cancerous areas
  • C A cancer area
  • NP non-cancer area.
  • FIG. 2 is a micrograph showing the results of immunohistochemical analysis of hsp105 in colorectal cancer.
  • A Hematoxylin and eosin staining of colorectal cancer and surrounding non-cancerous areas
  • CA cancerous area
  • NP non-cancerous area.
  • FIG. 3 is a graph showing the anticancer effects of the hs105 DNA vaccine, the hsp105 peptide vaccine, and the control product on mouse colon cancer cells Colon-26.
  • A shows the area of the cancer
  • B shows the percentage of mice that survived the cancer
  • C shows the percentage of surviving mice.
  • Figure 4 is a graph showing the results of measurement by hsp 1 0 5 protein derived from various peptidases de vaccine or hs 1 0 5 cytotoxic activity against Colon 2 6 of DNA vaccines encoding a protein 5 1 C r release assay .
  • FIG. 5 shows the results of immunohistochemical analysis of hspl05 in tissues.
  • FIG. 6 shows the results of analyzing the in vivo antitumor activity of a mouse CD4-positive helper T cell line induced by hspl05.
  • FIG. 7 shows the results of inducing a CD4-positive helper T cell line of colorectal cancer patients with hspl05.
  • Figure 8 is a result of investigation whether to reduce colon cancer cell lines Colon26 tumor mass with high expression of cytotoxic T cells (C TL) I hspl05 of BALB / c mice induced hs P 105 from peptide Is shown.
  • C TL cytotoxic T cells
  • FIG. 9 shows the results of examining whether the cytotoxic T cell (CTL) 1S hspl05-high-expressing colon cancer cell line sw620 tumor mass is highly expressed in colon cancer patients induced by the hspl05-derived peptide.
  • CTL cytotoxic T cell
  • Cancer antigen, peptide and immunity inducing agent for cancer of the present invention (1) Cancer antigen, peptide and immunity inducing agent for cancer of the present invention
  • the cancer antigen collected from knee cancer and colorectal cancer of the present invention is any one of the following proteins (A) and (B).
  • (A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (hereinafter, also referred to as “hsp105”).
  • protein having immunity-inducing activity refers to a protein having an activity of inducing an immune response such as antibody production and cellular immunity.
  • Proteins having T cell inducing activity that stimulate are particularly preferred.
  • hspl 05 is a high-molecular-weight heat shock protein belonging to the hspll O / 105 family, consisting of hsp 105 ⁇ and 105] 3.
  • 105 is a protein smaller in molecular weight than 105 produced by splicing of 105 ⁇ mRNA.
  • Hs 105 which is the cancer / colorectal cancer antigen of the present invention, can be detected, for example, by the SEREX method as described in the Examples below.
  • the range of ⁇ one or several '' in ⁇ the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 including substitution, deletion, insertion and Z or addition of one or several amino acids '' is not particularly limited.
  • the method for obtaining and producing the cancer antigen protein of the present invention is not particularly limited, and may be any of a naturally-derived protein, a chemically synthesized protein, and a recombinant protein produced by a genetic recombination technique. Recombinant proteins are preferred in that they can be produced in large quantities with relatively easy operation.
  • a naturally-occurring protein When a naturally-occurring protein is obtained, it can be isolated from cells or tissues expressing the protein by an appropriate combination of methods for isolating and purifying the protein.
  • a chemically synthesized protein for example, the protein of the present invention can be obtained according to a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Can be synthesized.
  • the protein of the present invention can also be synthesized using various commercially available peptide synthesizers.
  • the cancer antigen protein of the present invention as a recombinant protein, a DNA having a nucleotide sequence encoding the protein (for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2) or a mutant or homologue thereof is obtained. By introducing this into a suitable expression system, the cancer antigen of the present invention can be produced.
  • the expression vector is preferably one that can replicate autonomously in the host cell or that can be integrated into the chromosome of the host cell, and contains a promoter at a position capable of expressing the gene of the present invention. Is used.
  • a transformant having a gene encoding the protein of the present invention can be prepared by introducing the above expression vector into a host.
  • the host may be any of bacteria, yeast, animal cells, and insect cells, and the expression vector may be introduced into the host by a known method appropriate for each host.
  • the transformant having the gene of the present invention prepared as described above is used.
  • the recombinant protein can be isolated by culturing the transformant, producing and accumulating the protein of the present invention in the culture, and collecting the protein of the present invention from the culture.
  • the culture medium for culturing these microorganisms contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be utilized by the microorganism.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the transformant.
  • the culture conditions may be the same as those usually used for culturing the microorganism.
  • the protein of the present invention can be isolated and purified from the culture of the transformant by a conventional protein isolation and purification method.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 a protein having an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion and Z or addition of one or several amino acids encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a person skilled in the art can appropriately produce or obtain the DNA sequence based on the information on the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 showing an example of the DNA sequence to be prepared.
  • mutant gene in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a gene having a base sequence encoding a protein having an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion and / or addition of one or several amino acids (mutant gene) can be produced by any method known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques or mutagenesis. Specifically, mutant DNAs can be obtained by using DNAs having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and introducing mutations into these DNAs.
  • the method can be carried out using a method of bringing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 into contact with a drug serving as a mutagen, a method of irradiating ultraviolet rays, a genetic engineering technique, or the like.
  • Site-directed mutagenesis method which is one of genetic engineering technique is useful because it is a method capable of introducing a specific mutation into a specific position, Molecular Cloning:.
  • the present invention further relates to a peptide comprising a part of the above-mentioned protein of the present invention and having immunity-inducing activity.
  • the peptide of the present invention is preferably one that can activate a cytotoxic ⁇ cell that recognizes a cancer antigen protein.
  • Specific examples of such peptides include those having any of the following amino acid sequences.
  • Lys-Tyr-Asn His-lie-Asp-Glu_Ser Glu—Met (SEQ ID NO: 11
  • Trp-Leu- Tyr- Glu- Glu- Gly- Glu- Asp- Gin-Ala SEQ ID NO: 20
  • amino acid sequence in the amino acid sequence according to any one of the above SEQ ID NOs: 3 to 22, an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion and / or addition of one or several amino acids.
  • peptides having immunity-inducing activity are also within the scope of the present invention.
  • Preferred examples of such peptides include peptides that can activate cytotoxic ⁇ cells that recognize cancer antigen proteins.
  • the amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions and / or additions the amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions and / or additions.
  • the range of ⁇ number '' is not particularly limited, but means, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2, and particularly preferably 1. .
  • the peptide of the present invention can be synthesized according to a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the peptide of the present invention can also be synthesized using various commercially available peptide synthesizers.
  • an agent for inducing immunity against cancer comprising the cancer antigen protein or peptide of the present invention.
  • the agent for inducing immunity against cancer of the present invention can induce helper T cells, cytotoxic T cells, or an immune cell population containing these by using in vitro or in vivo, preferably in vitro. It can confer immunity against cancer.
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the cancer antigen protein of the present invention described in (1) above, and is preferably any one of the following DNAs (a), (b) and (c): .
  • (b) a DNA that hybridizes with a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and encodes a protein having immunity-inducing activity.
  • (c) DNA having a partial sequence of the DNA of (a) or (b) and encoding a protein having immunity-inducing activity.
  • hybridize under stringent conditions refers to the use of DNA as a probe, colony hybridization, plaque hybridization, Southern blot hybridization, or the like. Means a DNA sequence obtained by using a filter having immobilized DNA derived from colonies or plaques or a fragment of the DNA, in the presence of 0.7 to 1.0 M NaC1. After hybridization at 65 ° C, the filter was washed at 65 ° C using 0.1 to 2 XSSC solution (1 XSSC solution is 15 OmM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). And the like can be identified. Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning, Second Edition and the like.
  • DNAs having a certain degree of homology with the nucleotide sequence of the DNA used as the probe such as 70% or more, preferably 80% or more, and more.
  • DNAs having a homology of preferably 90% or more, more preferably 93% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more are mentioned.
  • the method for obtaining DNA of the present invention is not particularly limited. Proper probes and primers are prepared based on the amino acid sequence and nucleotide sequence information shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing in this specification, and cDNA libraries of humans and the like are prepared using them.
  • the DNA of the present invention can be isolated by screening.
  • the cDNA library is preferably prepared from cells, organs or tissues expressing the DNA of the present invention.
  • DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 2 can also be obtained by PCR.
  • PCR reaction conditions can be appropriately set, for example, 94 ° C for 30 seconds (denaturation), 55 at 30 seconds to 1 minute (annealing), 72.
  • the reaction step consisting of 2 minutes (extension) at C is defined as one cycle, for example, 30 cycles, followed by a reaction at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the amplified DNA fragment can be cloned into an appropriate vector that can be amplified in a host such as E. coli.
  • the present invention relates to an antibody that recognizes part or all of the protein or peptide of the present invention as an epitope (antigen), and a cytotoxicity (killer) induced by in vitro stimulation using the protein or peptide. ) Also related to T cells (CTL). In general, CTLs show stronger anti-tumor activity than antibodies.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and its production can be performed by a conventional method.
  • a polyclonal antibody can be obtained by immunizing a mammal with the protein of the present invention as an antigen, collecting blood from the mammal, and separating and purifying the antibody from the collected blood.
  • mammals such as mice, hamsters, guinea pigs, chickens, rats, rabbits, rabbits, dogs, goats, sheep, and horses can be immunized. Methods for immunization are known to those skilled in the art.
  • the antigen may be administered two to three times, for example, at an interval of 7 to 30 days.
  • the dose can be, for example, about 0.05 to 2 mg of the antigen per dose.
  • the administration route is also not particularly limited, and subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, and the like can be appropriately selected.
  • the antigen can be used by dissolving it in an appropriate buffer, for example, an appropriate buffer containing a commonly used adjuvant such as complete Freund's adjuvant or hydroxylamine.
  • a polyclonal antibody recognizing the protein of the present invention can be obtained as a polyclonal antiserum by separating and purifying by a conventional method such as chromatography, affinity chromatography and the like.
  • a monoclonal antibody can be obtained by preparing a hybridoma.
  • a hybridoma can be obtained by cell fusion between an antibody-producing cell and a myeloma cell line.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by the following cell fusion method.
  • spleen cells As antibody-producing cells, spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes and the like from immunized animals are used.
  • the antigen the protein of the present invention or its partial peptide is used. Mice, rats, and the like can be used as immunized animals, and administration of the antigen to these animals is performed by a conventional method. For example, a suspension or emulsion of an adjuvant such as complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant and the protein of the present invention, which is an antigen, is administered several times to the vein, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, etc. of an animal. To immunize animals.
  • an adjuvant such as complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant
  • the protein of the present invention which is an antigen
  • a spleen cell is obtained as an antibody-producing cell from an immunized animal, and this is fused with a myeloma cell by a known method (G. Kohler et al., Nature, 256 495 (1975)) to produce a hybridoma. be able to.
  • myeloma cell lines used for cell fusion include P3X63Ag8, P3U1, and Sp2Z0 strains in mice.
  • fusion promoters such as polyethylene glycol and Sendai virus are used.
  • hypoxanthine 'aminopterin' thymidine (HAT) medium is used according to standard methods.
  • Hybridomas obtained by cell fusion are cloned by a limiting dilution method or the like. Further, if necessary, screening can be performed by an enzyme immunoassay using the protein of the present invention to obtain a cell line that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes the protein of the present invention. .
  • the hybridoma is cultured by a usual cell culture method or ascites formation method, and the monoclonal antibody is purified from the culture supernatant or ascites. Just fine. Purification of the monoclonal antibody from the culture supernatant or ascites can be performed by a conventional method. For example, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like can be used in appropriate combination.
  • Antibody fragments include F (ab ') 2 fragments, Fab' fragments and the like.
  • labeled antibodies of the above-mentioned antibodies are also within the scope of the present invention. That is, the antibody of the present invention prepared as described above can be labeled and used.
  • the types and methods of labeling antibodies are known to those skilled in the art. For example, enzyme labeling such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, fluorescent labeling such as FITC (fluorescein isothiocyanate) or TRITC (tetramethylrhodamine B isothiocyanate), colloidal metal staining labeling with color substances such as latex, Afi two tea labels such Biochin, or 1 2 5 I and isotopic labels, such as can ani gel.
  • enzyme labeling such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase
  • fluorescent labeling such as FITC (fluorescein isothiocyanate) or TRITC (tetramethylrhodamine B isothiocyanate)
  • the analysis or measurement of the protein of the present invention (that is, cancer antigen) using the labeled antibody of the present invention can be performed by enzyme antibody method, immunohistochemical staining method, immunoplot method, direct fluorescent antibody method or indirect fluorescent antibody method. It can be carried out according to a method known to a trader.
  • the present invention also relates to the use of the cancer antigens, peptides, or mixtures thereof of the present invention.
  • the present invention relates to a helper T cell, a cytotoxic ⁇ cell induced by in vitro stimulation, or an immune cell population containing the same.
  • a helper T cell a helper T cell, a cytotoxic ⁇ cell induced by in vitro stimulation, or an immune cell population containing the same.
  • tumor-reactive activated ⁇ cells are induced, and the activated ⁇ cells are used effectively for adoptive immunotherapy. be able to.
  • the cancer antigens or peptides of the present invention can be expressed in vivo or in vitro in dendritic cells that are powerful antigen-presenting cells, and immunity can be induced by administering the antigen-expressing dendritic cells.
  • helper ⁇ cell a helper ⁇ cell, a cytotoxic ⁇ cell, or an immune cell population containing the same by in vitro stimulation using the cancer antigen, peptide or mixture thereof of the present invention and an immunostimulant.
  • immunostimulant examples include cell growth factors and cytokines.
  • helper ⁇ cells By transferring the helper ⁇ cells, cytotoxic ⁇ cells obtained as described above, or an immune cell population containing them into the body, tumors can be suppressed and cancer can be prevented and / or treated. It is possible.
  • a helper ⁇ cell, a cytotoxic ⁇ ⁇ ⁇ cell, or an immune cell population containing the same, which can suppress a tumor as described above is prepared.
  • a cell culture solution containing the cancer antigen or peptide of the present invention, or a mixture thereof By using this cell culture solution, it is possible to prepare a helper ⁇ cell, a cytotoxic ⁇ cell, or an immune cell population containing the same, which can suppress a tumor.
  • a cell culture kit for producing a helper ⁇ cell, a cytotoxic ⁇ cell, or an immune cell population containing the same comprising the above-described cell culture solution and cell culture container. Is done.
  • the DNA, cancer antigen and peptide of the present invention can induce cancer cell-specific cytotoxic T cells, they can be expected as therapeutic or preventive agents for cancer.
  • the present invention BCG bacteria transformed with this recombinant DNA or a virus such as vaccinia virus having the DNA of the present invention integrated in its genome are used as live vaccines for the treatment and prevention of human cancer. Can be used effectively.
  • the dose and administration method of cancer pectin are the same as those for ordinary vaccination and BCG vaccine.
  • the DNA of the present invention (as it is or in the form of a plasmid DNA incorporated in an expression vector), a recombinant virus or a recombinant bacterium containing the DNA as it is or in a state dispersed in an adjuvant contains human cancer vaccines. It can be administered to mammals.
  • the peptide of the present invention can be similarly administered as a cancer vaccine in a state of being dispersed with an adjuvant.
  • adjuvant examples include incomplete Freund's adjuvant, BCG, trehalose dimycolate (TDM), lipopolysaccharide (LPS), myovan adjuvant, and silica adjuvant. It is preferable to use Freund's incomplete adjuvant (FIA) from the viewpoint of inducibility and the like.
  • the DNA of the present invention can be used as a diagnostic probe by extracting the DNA of various human cancers and examining their homology.
  • the probe and the antibody can be used as a cancer diagnostic agent.
  • the present invention relates to a cancer diagnostic probe containing all or a part of the antisense chain of DNA or RNA encoding the protein of the present invention.
  • the present invention further relates to a cancer diagnostic comprising the above-mentioned probe for cancer diagnosis or an antibody against the protein of the present invention.
  • the cancer diagnostic probe of the present invention includes all or a part of the antisense strand of DNA (cDNA) or RNA (cRNA) encoding the protein of the present invention, and has a length sufficient to be established as a probe ( (At least 20 bases or more) are preferred.
  • cancer can be diagnosed by detecting the mRNA of the protein (cancer antigen) of the present invention obtained from a specimen using the antisense strand.
  • the specimen used for detection examples of the specimen include, but are not limited to, genomic DNA obtained from a biopsy of a subject's cells, such as blood, urine, saliva, and tissue, and RNA or cDNA. Not something.
  • genomic DNA obtained from a biopsy of a subject's cells, such as blood, urine, saliva, and tissue
  • RNA or cDNA not something.
  • a sample amplified by PCR or the like may be used.
  • the type of cancer referred to in this specification is not particularly limited, and specific examples include knee cancer, colon cancer, brain tumor, malignant melanoma, chronic myelogenous leukemia, acute myeloid leukemia, lymphoma, esophageal cancer, kidney cancer, prostate Examples include cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, liver cancer, gallbladder cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, bladder cancer or sarcoma.
  • Hsp105 which is an antigenic protein of the present invention, is specific to ⁇ cancer, colorectal cancer, breast cancer, esophageal cancer, malignant lymphoma, pheochromocytoma, thyroid cancer, bladder cancer, and seminomas as described in Examples below. Highly expressed. Since the protein or peptide of the present invention can induce cancer cell-specific cytotoxic T cells as T cell epitopes, it is useful as an agent for preventing or treating human cancer.
  • the antibody of the present invention is also useful as a prophylactic / therapeutic agent for human cancer as long as it can inhibit the activity of the protein of the present invention, which is a cancer antigen.
  • the protein, peptide or antibody of the present invention may be used as an injection as it is, or together with a pharmaceutically acceptable carrier and / or diluent and, if necessary, the following auxiliary agents. It can be administered or it can be administered by percutaneous absorption through the mucous membrane, such as by spraying.
  • the carrier mentioned here is, for example, human serum albumin, and the diluent includes, for example, PBS, distilled water and the like.
  • the dose of the cancer antigen, peptide or antibody of the present invention can be administered per adult, for example, in the range of O. Olmg to! OOmg per dose, but is limited to this range. is not.
  • the form of the preparation is not particularly limited either, and may be freeze-dried or granulated with an excipient such as sugar.
  • Auxiliary agents that can be added to the agent of the present invention to enhance cytotoxic T cell-inducing activity include cell components such as BCG bacteria, Nature, vol. 344, p873 (1990). And the saponin QS-21, ribosome, aluminum hydroxide and the like described in ISCOM described in J. Immunol, vol. 148, pl438 (1992).
  • immunostimulants such as lentinan, schizophyllan, and picibanil can also be used as scavengers.
  • cytokines such as IL-2, IL_4, IL-11, IL-1, IL-6, and TNF that enhance the proliferation and differentiation of ⁇ cells can also be used as adjuvants.
  • the antigen peptide is added in vitro to cells collected from a patient or cells having the same HLA pap type, and the antigen is presented. Toxicity ⁇ Can also induce cells.
  • Toxicity ⁇ Can also induce cells.
  • cytotoxic ⁇ cells can be induced in the test tube and then returned to the blood vessel of the patient.
  • Such treatment by cell transfer has already been performed as a cancer treatment method, and is a method well known to those skilled in the art.
  • Targeted antigens for specific anti-tumor immunotherapy require that the antigen be a recognition antigen for cytotoxic ⁇ cells (killer ⁇ cells / CTL).
  • the antigen of the present invention increased the activity of inducing killer T cells in vitro in HLA-A24, which is common in Japanese, or HLA-A2, which is common worldwide.
  • injection of the antigen of the present invention into the body induces and activates CTL, and as a result, an antitumor effect can be expected.
  • lymphocytes are stimulated in vitro with the antigen of the present invention, activated T cells are induced, and the activated T cells can be effectively used for adoptive immunotherapy by injecting the cells into the affected area.
  • Example 1 Coldlection of serum ⁇
  • ⁇ Serum was collected from cancer patients. Serum after blood collection was stored at _80 ° C. After removing the antibody against E. coli and L phage from the serum sample using a column packed with a lysate of E. coli and phage and Sepharose 4B, the mixture was diluted 100-800 times before use.
  • a cDNA of a knee cancer cell line CFPAC-1 was purchased from Stratagene, La Jolla, CA; a phage cDNA library inserted into an LZAP express vector was purchased. After infecting Escherichia coli with this phage cDNA library, the cells were cultured on NZY plate medium at 42 ° C for 6 hours to form plaques. The plate was covered with nitrocellulose membrane impregnated with isopropyl ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG) at 37 for 3 hours to produce a protein encoded by cDNA incorporated into phage ⁇ in the plaque.
  • IPTG isopropyl ⁇ -D-thiogalactoside
  • the protein produced by the above method was transferred to a nitrocellulose membrane. After the blotting, the nitrocellulose was washed, and reacted with the serum at 4 ° C for 15 hours. After washing, a horseradish Oeroxidase (HRP) -labeled mouse anti-human IgG antibody was reacted with the membrane as a secondary antibody. After washing, chemiluminescence was detected on X-ray film, checked against a photographic plate, and positive plaques were picked up with surrounding negative plaques.
  • HRP horseradish Oeroxidase
  • KM-PA-1 apg-2 heat shock protein 110 family NGO-St-81, NY-CO-40, NY-CO-32
  • VLCAD very-long-chain-acyl-CoA-dehydrogenase
  • hsp105 was found to be expressed in knee cancer tissues and colorectal cancer tissues.
  • HLA peptide binding prediction (http: //bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla—bind/)
  • ii LA Human / mouse predicted to bind to both A24 and Kd
  • a peptide common to sp105 was selected from the sequence of hsp105, and nine types of peptides consisting of 9 or 10 amino acids were synthesized by the Fmoc / PyBOP method.
  • Table 2 shows the peptide sequences and predicted binding to Kd .
  • Table 2 Hspl05-derived peptides
  • Plasmid DNA obtained by incorporating mouse hs105c DNA into the expression vector pCAGGS was adjusted to an appropriate concentration as it was and used as a vaccine in the following performance evaluation tests.
  • the mouse hsp105-pCAGGS DNA vaccine was produced in large quantities by culturing E. coli and then extracting and purifying plasmid DNA from E. coli.
  • BALBZc mouse muscle is injected with (1) saline, (2) vector only, (3) hsp105 cDNA vector, (4) adjuvant only, and (4) adjuvant + peptide, and colon cancer cell line colon- 26 was implanted subcutaneously in the back, and the onset of cancer in the mice was evaluated by (1) the area of the cancer site, (2) the percentage of mice that survived the cancer, and (3) the percentage of surviving mice.
  • the results are shown in FIGS. 3A, B and C.
  • mice immunized only with saline or pCAGGS alone had tumors in all 5 animals by day 13.
  • peptide vaccine and DNA vaccine are effective as anticancer agents.
  • the DNA vaccine group was significantly different from all other four groups.
  • the peptide vaccine group showed a significant difference in survival time from the raw food 'vector' adjuvant group (Fig. 3C).
  • the pathology of the mice that rejected the tumor was observed pathologically, and no damage to normal organs was observed. It was confirmed that a large number of infiltrated cells were infiltrated.
  • cancer colon cancer
  • brain tumor malignant melanoma
  • chronic myeloid leukemia acute myeloid leukemia
  • lymphoma esophageal cancer
  • kidney cancer prostate cancer
  • lung cancer breast cancer
  • stomach cancer Pathological diagnosis of cancer such as liver cancer, gallbladder cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, bladder cancer or sarcoma can be performed.
  • hsp105 may be used as a therapeutic or prophylactic agent for cancer, which has low side effects in high expression of human knee cancer and colorectal cancer.
  • Example 4 Identification of HLA-A24 CTL Epitope Peptides in Spl05 Humans To determine the HLA-A24 CTL epitope peptides in hspl05 humans, the periphery of two HLA-A24 colorectal cancer patients was determined.
  • mononuclear cells were separated from peripheral blood, and 2 million mononuclear cells per 1 ⁇ l of a 24-well plate were included in 10% of their own serum, IL-2 (100IU / ml), and each peptide Culture the cells for 1 week in 2 ml of a culture medium containing 10 ⁇ , and irradiate 200,000 dendritic cells (DCs) induced every week for 1 week by pulsing the peptide at 10 M to 200,000 dendritic cells (DC). Stimulation using the irradiated cells was repeated three more times, and six days later the cytotoxic activity was examined.
  • DCs dendritic cells
  • GM-CSF 100ng / ml
  • IL-4 100U / ml
  • TNF-a 20ng / ml
  • Table 3 Peptides capable of inducing ribeptide-specific and cancer cytotoxic killer T cells by stimulating human peripheral blood lymphocytes of HLA-A24;
  • each pepti de-induced CT s each pepti de-induced CTLs from Pt 1 (HLA-A2402 /) from Pt 2 (HLA-A2402 /)
  • Example 5 Identification of CTL epitope peptide of HLA-A2 in humans of hspl05 To determine the CTL peptide of HLA-A2 in humans of hspl05, one HLA-A2 colorectal cancer patient and 1 A human colon cancer cell line that stimulates peripheral blood lymphocytes of healthy humans four times with 30 kinds of peptides shown in Table 4 and that expresses hspl05 at high levels by 51 Cr release assay and expresses HLA-A2 The cytotoxic activity against sw620 was examined. The specific experimental method was the same as in Example 4.
  • sw620 hspl05-RA cells were used to reduce the expression of hspl05 in sw620 cells using RNAi. By not damaging the sw620 hspl05-RA cells, it was determined that hspl05 had cytotoxic activity specific to hspl05. Furthermore, those that injured the sw620 hspl05-RNAi cells more than those that did not carry the peptide were determined to be peptide specific positive. Table 4 shows the results. The bold numbers in Table 4 indicate that peptide-specific and cancer cytotoxic CTLs could be induced.
  • Lipid-specific and cancer-cytotoxic killer T cells can be induced by stimulating human peripheral blood lymphocytes with HLA_A2
  • hspl05 The expression of hspl05 in various tissues was analyzed by immunohistochemistry. Specifically, 3 mm thin sections were prepared using formalin-fixed, paraffin-embedded blocks of various tissues, and used with the VECTOR stain ABC-P0 (rabbit IgG) kit (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA). Then, immunohistochemical analysis was performed by ABC method (avidin-biotin complex immuneoperoxidase technique). As a primary antibody, rabbit polyclonal anti-human HSP105 Ab (SA TACRUZ, Santa Cruz, CA) was purchased and diluted 200-fold.
  • FIG. 5 A micrograph showing the results is shown in FIG. In Fig. 5, A: colorectal cancer, B: colorectal cancer in colorectal adenomas, C: liver metastasis of colorectal cancer, D: knee cancer, E: islet cell tumor, F: breast cancer, head L ductal carcinoma G: breast cancer, H: esophageal cancer, I: thyroid cancer, J: gastric malignant lymphoma, K: pheochromocytoma, L: bladder cancer, M: testis, and N: seminoma.
  • A colorectal cancer
  • B colorectal cancer in colorectal adenomas
  • C liver metastasis of colorectal cancer
  • D knee cancer
  • E islet cell tumor
  • F breast cancer
  • G breast cancer
  • H esophageal cancer
  • I thyroid cancer
  • J gastric malignant lymphoma
  • K pheochromocytoma
  • L bladder cancer
  • Example 7 In vivo antitumor activity of hspl05-induced mouse CD4-positive helper T cell line
  • the spleen of a BALB / c mouse is collected and ground to separate spleen cells, and 200,000 spleen cells per 1-well of a 96-well flat bottom plate, IL-2 (lOOIU / ml), and 2 ⁇ g of recombinant hspl05 protein / ml were cultured for 1 week in culture 200 mu 1 containing, every week, with those irradiated with pulsed with 2 / g / ml recombinant hs P 105 protein in each 200,000 splenocytes The stimulation was repeated a number of times to establish multiple CM-positive helper T cell lines (Th).
  • CD4 and CD8 on the cell surface were confirmed by immunofluorescence staining using the monoclonal antibody MOUSE CD4-FITC, CD8-FITC (IMMUNOTECH, Marseille, France) and analyzed by FACS (A in FIG. 6). Whether Th proliferated in response to hspl05 protein was examined by [3 ⁇ 4] thymidine incorporation. Specifically, putting 150,000 spleen cells per 96-well flat bottom plate 1 Ueru, over the hs P 105 protein ⁇ pulse Prepared and untreated ones, each containing 30,000 Ths and reacted for 72 hours (the last 16 hours contained [th] thymidine per milliliter).
  • Example 8 s CD 4-positive helper T cell line of colon cancer patient induced by P 105
  • Mononuclear cells were isolated from peripheral blood, and 200,000 mononuclear cells per 1-well of a 96-well flat-bottom plate were cultured in a culture medium containing IL-2 (100 IU / ml) and 2 ⁇ g / ml of recombinant hspl05 protein 200 / Culture for 1 week in il, and irradiate 200,000 mononuclear cells with recombinant hspl05 protein at 2 ⁇ g / ml and irradiate every week, irradiating the cells several times.
  • a plurality of CD4-positive helper T cell lines (Th) were established.
  • Thl induces CTL and ⁇ ⁇ It is known that it works in an advantageous way to antitumor immunity, and it was shown that such Thl can be induced in humans by stimulating peripheral blood lymphocyte cells with hspl05 protein.
  • Example 9 Anti-tumor ⁇ properties in in vivo of stimulated cytotoxic T cells hs P 105 peptide
  • CTL cytotoxic T cell
  • the cancer antigen protein and antigen peptide of the present invention, or the DNA encoding the protein or peptide of the present invention can be used as an excellent anticancer vaccine with few side effects such as self-damage.
  • antibodies can be used as diagnostics.

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Abstract

　本発明の目的は、膵癌・大腸癌をはじめとする各種癌や腫瘍の診断・治療に応用することができるヒト膵癌・大腸癌抗原や、それをコードする遺伝子、それを用いた抗癌ワクチン等を提供することである。本発明によれば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白からな癌抗原；上記の蛋白の一部からなり、かつ免疫誘導活性を有するペプチド；該ペプチドを含む抗癌ワクチン；配列番号２に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ；該ＤＮＡを含む抗癌ワクチン；並びにこれらの利用が提供される。

Description

明細書
癌抗原及びその利用 技術分野
本発明は、 膝癌又は大腸癌等の各種癌の診断や免疫療法などに有用な新規なヒ ト癌抗原、 及びその利用等に関する。 背景技術
現在、 死亡原因の第一位となっている癌においては、 その発生機序、 診断法、 治療法が進歩したにもかかわらず、 未だに多くの進行癌を治療できないのが現状 である。 これを改善するためには、 新しい早期診断法と治療法の開発が必要とさ れている。
癌の治療法として免疫療法は古くから期待され、様々な試みがなされてきたが、 まだ十分な抗腫瘍効果を示すには至っていない。 従来、 癌の免疫療法は非特異的 免疫療法を中心として行われてきたが、 近年、 τ細胞が生体内での腫瘍拒絶に重 要な役割を果たすことが明らかになり、 細胞傷害性 T細胞 （C T L： cytotoxic T lymphocyte) を誘導しうる T細胞認識腫瘍抗原の単離と MH Cクラス I拘束性ェ ピトープの決定に努力がそそがれている。
従来、 多くの腫瘍抗原の単離として C T Lを用いた c D N A発現クローニング 法で行われてきたが、 腫瘍の細胞株化と C T Lの樹立が必要であることから、 メ ラノーマ以外の癌腫からの腫瘍抗原の単離は困難である。 また、 免疫治療法の効 果を上げるために、 多くのぺプチドをミックスした治療法が有効と考えられてい るが、 それを確立するためには、 数多くの抗原の単離が必要であり、 従来の c D NA発現クローニング法は、 1つの抗原の単離に多くの労力と時間を費やすとい う問題があった。
1 9 9 5年にドィッの Pfreundschuhや米国の Oldらのグループにより、癌患者 血清中の抗体が認識する癌抗原タンパクを検出する S E R E X法（serological identification of reconbinant cDNA expression cloning； Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810-11813, 1995)が報告されている。 この方法によって多くの腫瘍抗 原が単離されているが、 本方法を用いて単離された抗原の中には C T Lを誘導す る MA G E— 1やチロシナーゼなどの抗原がみられることから、 細胞性免疫が認 識する抗原を検出する方法としても有用であることが指摘されている。 また、 上 記方法を用いて患者 I g G抗体が認識する癌抗原を単離した報告もなされている (Int. J. Cancer 72, 965 - 971, 1997、 Cancer Res. 58, 1034-1041, 1998、 Int. J. Cancer 29, 652 - 658， 1998、 Int. J. Oncol. 14, 703 - 708, 1999、 Cancer Res. 56， 4766-4772, 1996、 Hum. Mol. Genet 6， 33-39， 1997)。 発明の開示
本発明の課題は、 腌癌 ·大腸癌をはじめとする各種癌や腫瘍の診断 ·治療に応 用することができるヒト膝癌 ·大腸癌抗原や、 それをコードする遺伝子、 それを 用いた抗癌ワクチン等を提供することにある。
すなわち本発明によれば、 下記 （A) 又は （B ) の何れかの蛋白質から成る癌 抗原が提供される。
(A) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
( B ) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の 置換、 欠失、 挿入及び/又は付加を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 免疫誘導活 性を有する蛋白質。
本発明の別の側面によれば、 上記した本発明の癌抗原を含む、 癌に対する免疫 誘導剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の癌抗原の一部からなり、 かつ免疫誘導活性を有するペプチドが提供される。 本発明のペプチドは、 好まし くは、癌抗原蛋白質を認識する細胞傷害性 T細胞を活性化しうるぺプチドである。 本発明のぺプチドは、 好ましくは、 配列番号 3〜 2 2の何れかに記載のァミノ酸 配列を有するぺプチドである。 本発明のさらに別の側面によれば、 配列番号 3〜2 2の何れかに記載のァミノ 酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入及び Z又は付加 を含むアミノ酸配列を有し、かつ、免疫誘導活性を有するぺプチドが提供される。 上記のペプチドは、 好ましくは、 癌抗原蛋白質を認識する細胞傷害性 T細胞を活 '【生化しうるぺプチドである。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記の何れかのペプチドを含む、 癌に対す る免疫誘導剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記の本発明の癌抗原をコードする D NA が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 下記 （a )、 ( b ) 又は （c ) の何れかの D N Aが提供される。
( a ) 配列番号 2に記載の塩基配列を有する D NA。
( b ) 配列番号 2に記載の塩基配列を有する D N Aとストリンジェントな条件下 でハイプリダイズし、 かつ、 免疫誘導活性を有する蛋白質をコードする D N A。
( c ) 上記 （a ) 又は （b ) の D N Aの部分配列を有し、 かつ、 免疫誘導活性を 有する蛋白質をコードする D N A。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記の本発明の癌抗原又はべプチドに対す る抗体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記の本発明の癌抗原、 又はペプチド、 又 はそれらの混合物を用いてインビトロ刺激により誘導されたヘルパー T細胞、 細 胞傷害性 T細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記の本発明の癌抗原、 又はペプチド、 又 はそれらの混合物と、 免疫賦活剤とを用いてインビトロ刺激により誘導されたへ ルパー T細胞、細胞傷害性 T細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団が提供される。 好ましくは、 免疫賦活剤は細胞増殖因子又はサイトカインである。
本発明のさらに別の側面によれば、上記のヘルパー T細胞、細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団を体内に移入することを含む、 腫瘍を抑制する方 法が提供される。 上記方法は、 好ましくは、 癌を予防及び/又は治療するために 行うことができる。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の癌抗原、 又はペプチド、 又はそれらの混合物を含む、 本発明のヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又は これらを含む免疫細胞集団を作製するための細胞培養液が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記の細胞培養液、 及ぴ細胞培養容器を含 む、 本発明のヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集 団を作製するための細胞培養キットが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の癌抗原及ぴ Z又は少なく とも 1種類以上のペプチドを含む癌ワクチンが提供される。 上記癌ワクチンは、 好ましくは、 アジュバンドをさらに含む。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の D N A、 又は該 D N Aを 含む組換えウィルス若しくは組換え細菌を含む、 癌ワクチンが提供される。 上記 癌ワクチンは、 好ましくは、 アジュバンドをさらに含む。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の D N Aを含む、 癌診断用 プローブが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の癌診断用プローブ及ぴ Z 又は抗体を含む、 癌診断薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の癌抗原、ぺプチド、抗体、 及ぴ Z又はヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団 を含む、 癌の予防 ·治療薬が提供される。
本発明において好ましくは、 癌は臈癌 ·大腸癌、 脳腫瘍、 悪性黒色腫、 慢性骨 髄性白血病、 急性骨髄性白血病、 リンパ腫、 食道癌、 腎臓癌、 前立腺癌、 肺癌、 乳癌、 胃癌、 肝癌、 胆嚢癌、 精巣癌、 子宮癌、 卵巣癌、 甲状腺癌、 膀胱癌又は肉 腫である。 図面の簡単な説明 図 1は脖癌における h s p 1 0 5の免疫組織化学的解析結果を示した顕微鏡写 真である。
A：腌癌と周囲の非癌部のへマトキシリン 'ェォジン染色、 C A：癌部、 N P ： 非癌部を示す。
B :癌細胞に h s p 1 0 5蛋白の高発現を認める。非癌部にも弱い発現を認める。
C：非癌部の強拡大。 細胞質に弱い h s p 1 0 5蛋白の発現を認める。
D：癌部の強拡大。 癌細胞の主に細胞質に h s p 1 0 5蛋白の高発現を認める。 図 2は大腸癌における h s p 1 0 5の免疫組織化学的解析結果を示した顕微鏡 写真である。
A：大腸癌と周囲の非癌部のへマトキシリン ·ェォジン染色、 C A :癌部、 N P ： 非癌部を示す。
B :癌細胞に h s p 1 0 5蛋白の高発現を認める。非癌部にも弱い発現を認める。 C：非癌部の強拡大。 細胞質に弱い h s p 1 0 5蛋白の発現を認める。
D：癌部の強拡大。 癌細胞の主に細胞質に h s p 1 0 5蛋白の高発現を認める。 核にも弱い発現を認める。
図 3はマウス大腸癌細胞 Colon- 26に対する h s 1 0 5の D N Aワクチン、お ょぴ h s p 1 0 5ペプチドワクチン、 及び対照品の抗癌効果を示したグラフであ る。 Aは癌部の面積を、 Bは癌が生着したマウスの割合、 Cは生存マウスの割合 を示す。
図 4は h s p 1 0 5蛋白由来の各種ぺプチドワクチンまたは h s 1 0 5蛋白 をコードする D N Aワクチンの Colon- 2 6に対する細胞傷害活性を5 1 C r release assayにより測定した結果を示すグラフである。
図 5は、 組織における hspl05の免疫組織化学的解析の結果を示す。
図 6は、 hspl05で誘導したマウスの C D 4陽性ヘルパー T細胞株の in vivoに おける抗腫瘍活性を解析した結果を示す。
図 7は、大腸癌患者の C D 4陽性ヘルパー T細胞株を hspl05で誘導した結果を 示す。 図 8は、 hsP105由来ぺプチドで誘導した BALB/cマウスの細胞傷害性 T細胞（C TL) I hspl05を高発現する大腸癌細胞株 Colon26腫瘍塊を縮小させるかどう かを調べた結果を示す。
図 9は、 hspl05由来ペプチドで誘導した大腸癌患者の細胞傷害性 T細胞 （CT L) 1S hspl05を高発現する大腸癌細胞株 sw620腫瘍塊を縮小させるかどうかを 調べた結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳しく説明する。
(1) 本発明の癌抗原、 ペプチド及び癌に対する免疫誘導剤
本発明の膝癌 ·大腸癌から採取された癌抗原は、 下記 （A) 又は （B) の何れ かの蛋白質である。
(A) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質 （以下 「h s p 105」 とも言う）。
(B) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の 置換、 欠失、 挿入及び Z又は付加を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 免疫誘導活 性を有する蛋白質。
本明細書で言う免疫誘導活性を有する蛋白質とは、 抗体産生、 細胞性免疫等の 免疫反応を誘導する活性を有する蛋白質を言うが、 なかでも、 細胞傷害性 τ細胞
(キラー T細胞 ZCTL) を刺激する T細胞誘導活性を有する蛋白質が特に好ま しい。
h s p l 05は h s p l l O/105ファミリ一に属する高分子量の熱ショッ ク蛋白で、 h s p 105 αと 1 05 ]3からなつている。 105 cdil 05 kDa の熱ショック蛋白で、 様々なストレスで誘導される。 105 は 105 αの mR NAがスプライシングにより産生される 105 より分子量の小さい蛋白である。 本発明の腠癌 ·大腸癌抗原である h s 105は例えば、 本明細書の下記実施例 のような SEREX法で検出することができる。 本発明において 「配列番号 1に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個 のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び Z又は付加を含むアミノ酸配列」における「1 若しくは数個」 の範囲は特には限定されないが、 例えば、 1から 2 0個、 好まし くは 1から 1 0個、 より好ましくは 1から 7個、 さらに好ましくは 1から 5個、 特に好ましくは 1から 3個程度を意味する。
本発明の癌抗原蛋白質の入手 ·製造方法は特に限定されず、 天然由来の蛋白質 でも、 化学合成した蛋白質でも、 遺伝子組み換え技術により作製した組み換え蛋 白質の何れでもよレ、。 比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、 組み換え蛋白質が好ましい。
天然由来の蛋白質を入手する場合には、 該蛋白質を発現している細胞又は組織 から蛋白質の単離 ·精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。 化学合 成蛋白質を入手する場合には、 例えば、 Fmoc 法（フルォレニルメチルォキシカル ボニル法）、 tBoc法（t一ブチルォキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発 明の蛋白質を合成することができる。 また、 各種の市販のペプチド合成機を利用 して本発明の蛋白質を合成することもできる。
本発明の癌抗原蛋白質を組み換え蛋白質として産生するには、 該蛋白質をコー ドする塩基配列 （例えば、 配列番号 2に記載の塩基配列） を有する D N A又はそ の変異体又は相同体を入手し、 これを好適な発現系に導入することにより本発明 の癌抗原を製造することができる。
発現べクターとしては、 好ましくは宿主細胞において自立複製可能であるか、 あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものであればよく、 本発明の遺 伝子を発現できる位置にプロモーターを含有しているものが使用される。 また、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子を有する形質転換体は、上記の発現ベクターを 宿主に導入することにより作製することができる。宿主は、細菌、酵母、動物細胞、 昆虫細胞のいずれでもよく、 また宿主への発現ベクターの導入は、 各宿主に応じ た公知の手法により行えばよい。
本発明においては、 上記のようにして作製した本発明の遺伝子を有する形質転 換体を培養し、 培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積させ、 該培養物より本発明 の蛋白質を採取することにより組み換え蛋白質を単離することができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、 酵母菌等の真核生物である場合、 これら微生物を培養する培地は、 該微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩 類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成 培地のいずれでもよい。 また培養条件も該微生物を培養するのに通常用いられる 条件にて行えばよい。 培養後、 形質転換体の培養物から本発明の蛋白質を単離精 製するには、 通常の蛋白質の単離、 精製法を用いればよい。
なお、 配列番号 1に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、 欠失、 挿入及ぴ Z又は付加を含むアミノ酸配列を有する蛋白質は、 配列 番号 1に記載のァミノ酸配列をコードする D N A配列の一例示す配列番号 2に記 載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができ る。
即ち、 配列番号 1に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、 欠失、 挿入及ぴ 又は付カ卩を含むアミノ酸配列を有する蛋白質をコード する塩基配列を有する遺伝子 （変異遺伝子） は、 化学合成、 遺伝子工学的手法又 は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。 具体 的には、 配列番号 2に記載の塩基配列を有する D N Aを利用し、 これら D N Aに 変異を導入することにより変異 D N Aを取得することができる。
例えば、 配列番号 2に記載の塩基配列を有する D NAに対し、 変異原となる薬 剤と接触作用させる方法、 紫外線を照射する方法、 遺伝子工学的手法等を用いて 行うことができる。 遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定 の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed. , Co丄 d bprmg Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989 (以下、 モレキュラークローニング第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wi丄 ey & Sons (1987 - 1997) (以下、 カレント .プロ トコーノレズ 'イン 'モレキュラー .バイオ ロジ一と略す） 等に記載の方法に準じて行うことができる。
本発明はさらに、 上記した本発明の蛋白質の一部からなり、 かつ免疫誘導活性 を有するペプチドにも関する。 本発明のペプチドは、 癌抗原蛋白質を認識する細 胞傷害性 τ細胞を活性化しうるものが好ましい。 このようなぺプチドの具体例と しては、 下記の何れかのアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
Asn— Tyr— Gly— lie— Tyr—し ys_Gln— Asp—し eu (配列番号 3 )
Ala - Phe- Asn~Lys - Gly - LysHLeu-し ys - Val—teu (配列番号 4 )
Lys— Tyr— Lys— Leu— Asp— Ala—し ys— Ser— Lys— I丄 e (配列番号 5 )
Gln-Phe-Glu-Glu-Leu-Cys-Ala-Glu-Leu (配列番号 6 )
Met-Tyr- lie- Glu- Thr- Glu- Gly- Lys- Met- lie (配列番号 7 )
Thr— Phe— Leu - Arg— Arg-Gly— Pro- Phe - Glu - Leu (配列番号 8 )
Glu-Tyr-Val-Tyr-Glu-Phe-Arg-Asp-Lys-Leu (配列番号 9 )
His-Tyr- Ala - Lys - lie— Ala- Ala - Asp- Phe (配列番号 1 0
Lys - Tyr- Asn— His- lie - Asp - Glu_Ser Glu— Met (配列番号 1 1
Ser—Leu— Asp - Glu— Lys— Pro— Arg lie - Val Va丄 (配列番号 1 2
Arg— Leu— Tyr - Gin - Glu - Cys- Glu - Lys - Leu (配列番号 1 3
Lys— Leu - Met— Ser— Ser - Asn— Ser - Thr— Asp - Leu (配列番号 1 4
Leu— Met - Ser - Ser— Asn - Ser - Thr— AspHLeu (配列番号 1 5
Ser- Gin- Phe- Glu- Glu- Leu- Cys- Ala- Glu- Leu (配列番号 1 6
Lys-Ile-Gly-Arg-Phe-Val-Val-Gln-Asn-Val (配列番号 1 7
Tyr— Val - Tyr- Glu— Phe - Arg- Asp Lys- Leu (配列番号 1 8
Leu— Leu - Thr - Glu— Thr - Glu - Asp - Trp - Leu (配列番号 1 9
Trp - Leu- Tyr- Glu- Glu- Gly- Glu- Asp- Gin-Ala (配列番号 2 0
Glu- Leu- Met-Lys- lie- Gly- Thr- Pro- Val (配列番号 2 1
Val— Met一 Asn一 Ala—Gln—Ala—Lys— ys—Ser—Leu (配列番号 2 2
さらに、 上記の配列番号 3〜 2 2の何れかに記載のァミノ酸配列において、 1 若しくは数個のァミノ酸の置換、 欠失、 揷入及び /又は付加を含むァミノ酸配列 を有し、 かつ、 免疫誘導活性を有するペプチドも本発明の範囲内である。 このよ うなぺプチドの好ましい例としては、 癌抗原蛋白質を認識する細胞傷害性 τ細胞 を活性化しうるべプチドが挙げられる。
本発明において、 「配列番号 3〜2 2の何れかに記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入及ぴノ又は付加を含むアミノ酸配 列」 における 「1若しくは数個」 の範囲は特には限定されないが、 例えば、 1か ら 5個、 好ましくは 1から 4個、 より好ましくは 1から 3個、 さらに好ましくは 1又は 2個、 特に好ましくは 1個を意味する。
本発明のペプチドは、 Fmoc法（フルォレニルメチルォキシカルボニル法）、 tBoc 法 (t一ブチルォキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができ る。 また、 各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のペプチドを合成する こともできる。
上記した本発明の癌抗原蛋白質及びペプチドは、 後記実施例にも示す通り、 癌 に対する免疫を誘導することができる。 従って、 本発明によれば、 本発明の癌抗 原蛋白質又はぺプチドを含む、 癌に対する免疫誘導剤が提供される。
本発明の癌に対する免疫誘導剤は、 インビトロ又はインビボ、 好ましくはィン ビトロで用いることにより、 ヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを 含む免疫細胞集団を誘導することができ、 これにより癌に対する免疫を付与する ことができる。
( 2 ) 本発明の D NA
本発明の D N Aは、 上記 （1 ) に記載した本発明の癌抗原蛋白質をコードする D N Aであり、 好ましくは、 下記 （a )、 ( b ) 又は （c ) の何れかの D NAであ る。
( a ) 配列番号 2に記載の塩基配列を有する D N A。
( b ) 配列番号 2に記載の塩基配列を有する D N Aとストリンジェントな条件下 でハイブリダィズし、 かつ、 免疫誘導活性を有する蛋白質をコードする D NA。 (c) 上記 （a) 又は （b) の DNAの部分配列を有し、 かつ、 免疫誘導活性を 有する蛋白質をコードする DNA。
上記した 「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする」 とは、 DNAをプ ローブとして使用し、 コロニー .ハイブリダィゼーシヨン法、 プラークハイプリ ダイゼーション法、 あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用い ることにより得られる DNAの塩基配列を意味し、 例えば、 コロニーあるいはプ ラーク由来の DNA又は該 DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0M の N a C 1存在下、 65 °Cでハイブリダイゼーションを行った後、 0. 1〜2 XS SC溶液 （1 XS SC溶液は、 15 OmM塩化ナトリウム、 15 mMクェン酸ナトリウム） を用い、 65 °C条件下でフィルターを洗浄することに より同定できる DN A等を挙げることができる。 ハイブリダィゼーションは、 モ レキユラ一クローニング第 2版等に記載されている方法に準じて行うことができ る。
ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DN Aとしては、 プローブと して使用する DN Aの塩基配列と一定以上の相同性を有する DN Aが挙げられ、 例えば 70%以上、 好ましくは 80%以上、 より好ましくは 90%以上、 さらに 好ましくは 93 %以上、 特に好ましくは 95 %以上、 最も好ましくは 98 %以上 の相同性を有する DN Aが挙げられる。
本発明の D N Aの取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号 1および配列番号 2に記載したァミノ酸配列及ぴ塩基配列の情報に基づいて適当 なプローブやプライマーを調製し、 それらを用いてヒトなどの cDNAライブラ リーをスクリーニングすることにより本発明の DNAを単離することができる。 cDNAライブラリ一は、 本発明の DNAを発現している細胞、 器官又は組織か ら作製することが好ましい。
P C R法により配列番号 2に記載した塩基配列を有する D N Aを取得すること もできる。 ヒト染色体 DNA又は cDNAライブラリーを铸型として使用し、 配 列番号 2に記載した塩基配列を増幅できるように設計した 1対のプライマーを用 いて PCRを行う。 PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、 94°C で 30秒間 （変性）、 55 で 30秒〜 1分間 （アニーリング）、 72。Cで 2分間 (伸長） からなる反応工程を 1サイクルとして、 例えば 30サイクル行った後、 72°Cで 7分間反応させる条件などを挙げることができる。 次いで、 増幅された DNA断片を、 大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングする ことができる。
上記したプローブ又はプライマーの調製、 cDNAライブラリーの構築、 cD NAライブラリーのスクリーユング、 並びに目的遺伝子のクローニングなどの操 作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローユング第 2版、カレント . プロトコールズ 'イン .モレキュラー .バイオロジー等に記載された方法に準じ て行うことができる。 (3)本発明の抗体
本発明は、 上記した本発明の蛋白質またはぺプチドの一部もしくは全部をェピ トープ （抗原） として認識する抗体、 並びに該蛋白質又はペプチドを用いてイン ビトロ刺激により誘導された細胞傷害性（キラー） T細胞（CTL)にも関する。 一般的には、 CTLのほうが抗体よりも強い抗腫瘍活性を示す。
本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナノレ抗体でもよく、 その作 製は定法により行なうことができる。
例えば、 ポリクローナル抗体は、 本発明の蛋白質を抗原として哺轧動物を免疫 感作し、 該哺乳動物から血液を採取し、 採取した血液から抗体を分離 '精製する ことにより得ることができる。 例えば、 マウス、 ハムスター、 モルモッ ト、 ニヮ トリ、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥシ等の哺乳動物を免疫すること ができる。 免疫感作の方法は当業者に公知であり、 例えば抗原を、 例えば 7〜3 0日間隔で 2〜 3回投与すればよい。 投与量は 1回につき、 例えば抗原約 0. 0 5〜2mg程度とすることができる。 投与経路も特に限定されず、 皮下投与、 皮 内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができる。 また、 抗原は適当な緩衝液、 例えば完全フロイントアジュバント又は水酸化ァル ミニゥム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用 いることができる。
免疫感作した哺乳動物を一定期間飼育した後、 抗体価が上昇してきたら、 例え ば 1 0 0 μ §〜1 0 0. 0 μ gの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。 最 後の投与から 1〜2ヶ月後に免疫感作した哺乳動物から血液を採取して、 該血液 を、 例えば遠心分離、 硫酸アンモニゥム又はポリエチレングリコールを用いた沈 澱、 ゲルろ過クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィニテ ィークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって分離 ·精製す ることにより、 ポリクローナル抗血清として、 本発明の蛋白質を認識するポリク ローナル抗体を得ることができる。
一方、 モノクローナル抗体はハイプリ ドーマを調製して得ることができる。 例 えば、 抗体産生細胞とミエ口一マ細胞株との細胞融合によりハイプリ ドーマを得 ることができる。 本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマは、 以 下のような細胞融合法によって得ることができる。
抗体産生細胞としては、 免疫された動物からの脾細胞、 リンパ節細胞、 Bリン パ球等を使用する。 抗原としては、 本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを使用 する。 免疫動物としてはマウス、 ラット等を使用でき、 これらの動物への抗原の 投与は常法により行う。 例えば完全フロインドアジュパント、 不完全フロインド アジュバントなどのアジュバントと抗原である本発明の蛋白質との懸濁液もしく は乳化液を動物の静脈、 皮下、 皮内、 腹腔内等に数回投与することによって動物 を免疫化する。 免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、 これとミエローマ細胞とを公知の方法 (G. Kohler et al . , Nature, 256 495 (1975) ) により融合してハイプリ ドーマを作製することができる。
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、 例えばマウスでは P 3 X 6 3 A g 8、 P 3 U 1株、 S p 2 Z 0株などが挙げられる。 細胞融合を行なうに際し ては、 ポリエチレングリコール、 センダイウィルスなどの融合促進剤を用い、 細 胞融合後のハイプリ ドーマの選択にはヒポキサンチン 'アミノプテリン 'チミジ ン （HA T) 培地を常法に従って使用する。 細胞融合により得られるハイプリ ド 一マは限界希釈法等によりクローユングする。 さらに必要に応じて、 本発明の蛋 白質を用いた酵素免疫測定法によりスクリ一ユングを行うことにより、 本発明の 蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることがで きる。
このようにして得られたハイプリ ドーマから目的とするモノクローナル抗体を 製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイプリ ドーマを培養し、 培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。 培養上清も しくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。 例えば、 硫安分画、 ゲルろ過、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティー クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
また、 上記した抗体の断片も本発明の範囲内である。 抗体の断片としては、 F ( a b ' ) 2フラグメント、 F a b ' フラグメント等が挙げられる。
さらに、 上記した抗体の標識抗体も本発明の範囲内である。 即ち、 上記のよう にして作製した本発明の抗体は標識して使用することができる。 抗体の標識の種 類及び標識方法は当業者に公知である。 例えば、 西洋ヮサビペルォキシダーゼ又 はアルカリホスファターゼなどの酵素標識、 F I T C (フルォレセインイソチォ シァネート） 又は T R I T C (テトラメチルローダミン Bイソチオシァネート） 等の蛍光標識、 コロイド金属おょぴ着色ラテックスなどの呈色物質による標識、 ビォチンなどのァフィ二ティー標識、 あるいは1 2 5 Iなどの同位体標識などを挙 げることができる。 本発明の標識抗体を用いた本発明の蛋白質 （即ち、 癌抗原） の分析又は測定は、 酵素抗体法、 免疫組織染色法、 免疫プロット法、 直接蛍光抗 体法又は間接蛍光抗体法等の当業者に周知の方法に従って行うことができる。
( 4 ) ヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団 本発明はまた、 本発明の癌抗原、 ペプチド、 又はそれらの混合物を用いてイン ビトロ刺激により誘導されたヘルパー T細胞、 細胞傷害性 Τ細胞、 又はこれらを 含む免疫細胞集団に関する。 例えば、 末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球を本発 明の蛋白質又はべプチドでインビトロ刺激すると腫瘍反応性活性化 Τ細胞が誘導 され、 この活性化された Τ細胞は養子免疫療法に有効に用いることができる。 ま た本発明の癌抗原又はぺプチドを強力な抗原提示細胞である樹状細胞にインビボ あるいはインビトロで発現させて、 その抗原発現樹状細胞投与により免疫誘導を 行うことができる。
好ましくは、 本発明の癌抗原、 ペプチド又はそれらの混合物と、 免疫賦活剤と を用いてインビトロ刺激により、 ヘルパー Τ細胞、 細胞傷害性 Τ細胞、 又はこれ らを含む免疫細胞集団を誘導することができる。 ここで用いる免疫賦活剤として は細胞増殖因子又はサイトカインなどが挙げられる。
上記のようにして得られたヘルパー Τ細胞、 細胞傷害性 Τ細胞、 又はこれらを 含む免疫細胞集団を体内に移入することにより、 腫瘍を抑制することができ、 癌 を予防及ぴ Ζ又は治療することが可能である。
また、本発明の癌抗原又はべプチド、又はそれらの混合物を用いることにより、 上記した通り腫瘍を抑制することができるヘルパー Τ細胞、 細胞傷害性 Τ細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団を作製することができる。 従って、 本発明によれ ば、 本発明の癌抗原又はペプチド、 又はそれらの混合物を含む細胞培養液が提供 される。 この細胞培養液を用いることにより、 腫瘍を抑制することができるヘル パー Τ細胞、 細胞傷害性 Τ細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団を作製すること ができる。 さらに、 本発明によれば、 上記の細胞培養液、 及ぴ細胞培養容器を含 む、 ヘルパー Τ細胞、 細胞傷害性 Τ細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団を作製 するための細胞培養キットも提供される。
( 5 ) 本発明の癌ワクチン
本発明の D NA、 癌抗原及びペプチドは、 癌細胞特異的細胞傷害性 T細胞を誘 導することができるので、 癌の治療、 予防剤として期待できる。 例えば、 本発明 の DNAを適当なベクターに組み込み、 この組換え DNAで形質転換された BCG 菌の細菌、 または本発明の DNAをゲノムに組み込まれたワクシニアウィルス等 のウィルスは、ヒト癌の治療 ·予防用生ワクチンとして有効に利用できる。なお、 癌ヮクチンの投与量及ぴ投与法は通常の種痘や BCGワクチンと同様である。 即ち、 本発明の DNA (そのまま、 あるいは発現ベクターに組み込んだプラス ミド DNAの形） 、 該 DNAを含む組換えウィルス若しくは組換え細菌はそのま まあるいはアジュパントに分散した状態で癌ワクチンとしてヒトを含む哺乳動物 に投与することができる。 本発明のぺプチドも同様にアジュバンドと分散した状 態で癌ワクチンとして投与することができる。
本発明で用いることができるアジュバントとしては、 フロイントの不完全アジ ュバント、 BCG、 トレハロースダイマイコレート （TDM) 、 リポ多糖 （LP S) 、 ミョゥバンアジュバント、 シリカアジュバント等が挙げられるが、 抗体の 誘導能等の関係から、 フロイントの不完全アジュバント （F I A) を使用するこ とが好ましい。
(6) 本発明の癌診断用プローブ、 癌診断薬、 癌の予防 ·治療薬
本発明の DN Aは各種ヒト癌の DN Aを取り出してその相同性を調べることで 診断用プローブとして使用することができる。 また、 このプローブや前記抗体を 使用して癌診断薬として使用することができる。
即ち、 本発明は、 本発明の蛋白質をコードする DNA又は RNAのアンチセン ス鎖の全部又は一部を含む癌診断用プローブに関する。 さらに本発明は、 上記の 癌診断用プローブ又は本発明の蛋白質に対する抗体を含む、 癌診断薬に関する。 本発明の癌診断用プローブとしては、 本発明の蛋白質をコードする DNA (cD NA) 又は RNA (cRNA) のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、 プロ一 ブとして成立する程度の長さ （少なくとも 20ベース以上） を有するものが好ま しレ、。例えば、上記アンチセンス鎖を用いて検体から得られた本発明の蛋白質（癌 抗原） の mRNAを検出することにより、 癌の診断が可能となる。 検出に用いら れる検体としては、 被験者の細胞、 例えば血液、 尿、 唾液、 組織等の生検から得 ることができるゲノム D N Aや、 R NA又は c D NAを挙げることができるがこ れらに限定されるものではない。 かかる検体を使用する場合、 P C R等により増 幅したものを用いてもよい。
本明細書で言う癌の種類は特に限定されず、 具体例としては、 膝癌 ·大腸癌、 脳腫瘍、悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、 リンパ腫、食道癌、 腎臓癌、 前立腺癌、肺癌、乳癌、 胃癌、肝癌、 胆嚢癌、精巣癌、子宮癌、 卵巣癌、 甲状腺癌、 膀胱癌又は肉腫などが挙げられる。
癌患者の癌細胞に対する免疫応答は予想以上に活発であり、 多種多様な蛋白に 対して I g G抗体が産生されていることを見出している。 本発明の抗原蛋白であ る h s p 1 0 5は後述の実施例に示すように脖癌、 大腸癌、 乳癌、 食道癌、 悪性 リンパ腫、 褐色細胞腫、 甲状腺癌、 膀胱癌、 精上皮腫で特異的に高発現する。 本発明の蛋白質又はべプチドは、 T細胞ェピトープとして癌細胞特異的細胞傷 害性 T細胞を誘導することができるので、 ヒト癌の予防'治療剤として有用であ る。 また、 本発明の抗体も、 癌抗原である本発明の蛋白質の活性を阻害すること ができるものであれば、 ヒ ト癌の予防 ·治療剤として有用である。 実際の使用法 としては、 本発明の蛋白質、 ペプチド又は抗体をそのまま、 又は医薬的に許容さ れる担体及び/又は希釈剤ととともに、 必要に応じて下記の補助剤も加えて、 注 射剤として投与することもできるし、 噴霧などの方法で粘膜からの経皮吸収など で投与してもょレ、。尚、ここで言う担体とは例えば、ヒト血清アルブミンであり、 また希釈剤としては、 例えば P B S、 蒸留水等を挙げることができる。
投与量は成人 1人当たり、 本努明の癌抗原、 ペプチド又は抗体を例えば、 1回 当たり O. Olmg〜： !OOmgの範囲になるように投与することができるが、 この範囲に 限定されるものではない。 製剤の形態も特に限定されず、 凍結乾燥したものや、 糖などの賦形剤を加えて顆粒にしたものでもよい。
本発明の薬剤に添加することができる細胞傷害性 T細胞誘導活性を高めるため の補助剤としては、 B C G菌などの菌体成分、 Nature, vol. 344, p873 (1990) に記載される ISC0M、 J. Immunol, vol. 148, pl438 (1992)に記載されるサポニン 系の QS- 21、 リボソーム、 水酸化アルミニウムなどが挙げられる。 また、 レンチ ナン、 シゾフィラン、 ピシバーニールなどの免疫賦活剤を捕助剤として用いるこ ともできる。 また、 I L— 2、 I L _ 4、 I L一 1 2、 I L—1、 I L—6、 T N Fなどの Τ細胞の増殖、 分化を増強するサイトカイン等も補助剤として用いる ことができる。
また、 患者から採取した細胞または、 同一の HLAパプ口タイプを持つ細胞に試 験管内で当該抗原ペプチドを加え、 抗原提示させた後、 患者血管内に投与し、 患 者体内で効果的に細胞傷害性 Τ細胞を誘導することもできる。 また、 患者末梢血 リンパ球に当該べプチドを加えて試験管内で培養することにより試験管内で細胞 傷害性 Τ細胞を誘導した後に患者血管内に戻すこともできる。 このような細胞移 入による治療は既に癌治療法として実施されており、 当業者間ではよく知られた 方法である。
特異的抗腫瘍免疫療法の標的抗原となるものは、 その抗原が細胞傷害性 Τ細胞 (キラー Τ細胞/ C T L) の認識抗原であることが必要である。 本発明の抗原は 日本人に多い H L Α— A 2 4あるいは世界的に多い H L A— A 2において、 イン ビトロにおけるキラ一 T細胞誘導活性を増大させた。 このことから本発明の抗原 を体内に注入することにより、 C T Lを誘導活性化し、 その結果、 抗腫瘍効果が 期待できる。 また、 リンパ球をインビトロで本発明の抗原で刺激すると活性化 T 細胞が誘導され、 この活性化された T細胞を患部に注入することによる養子免疫 療法に有効に用いることができる。 実施例
次に本発明の抗原、 その製造方法、 効果について実施例を挙げて説明するが、 本発明はこれらの実施例に何ら制約されるのもではなレ、。 実施例 1 《血清の採取》
脖癌患者から血清を採取した。 採血後の血清は _ 80°Cで保存した。 この血清 サンプルから、大腸菌とファージの溶解物とセファロース 4Bが充填されたカラム を用いて大腸菌と； Lファージに対する抗体を除去した後、 100〜800倍に希 釈し、 使用した。
《cDN Aライブラリー/蛋白の作製》
Stratagene、 La Jolla、 CAより膝癌細胞株 CFPAC— 1の cDNAを； L ZA Pエクスプレスベクターに揷入してあるファージ c DNAライブラリーを購入し た。 この . ファージ c DNAライブラリーを大腸菌に感染させた後、 NZYプレ ート培地上で 42°C、 6時間培養し溶菌斑（プラーク） を作らせた。 isopropyl β -D-thiogalactoside (IPTG) を浸透させたニトロセルロースメンブレンでプレー トを 37でで 3時間覆うことにより、 プラーク中でぇファージに組み込んだ cD N Aがコードする蛋白を作らせた。
《ィムノスクリーニング》
上記方法で産生した蛋白をニトロセルロースメンブレンに転写した。 ブロツキ ング後のニトロセルロースを洗浄し、 前記血清と 4 °Cで 15時間反応させた。 洗 浄後 2次抗体として Horseradish Oeroxidase(HRP)標識マウス抗ヒト I g G抗体 をメンブレンと反応させた。洗浄した後に、化学発光を X線フィルム上で検出し、 写真のプレートと照らし合わせ、 陽性プラークを周囲の陰性プラークとともにピ ックアップした。 発色反応陽性部位に一致するプラークを 15 cmNZYァガロ ースプレート上から採取し、 SM緩衝液 （ 10 OmMの N a C 1、 10 mMの M g SO4、 5 OmMの T r i s— HC 1、 0. 01%のゼラチン； pH7. 5) に 溶解させた。 発色反応陽性プラークが単一化するまで上記と同様の方法で 2次、 3次スクリーニングを繰り返し、 血清中の I g G抗体が反応する単一のファージ クローンを得た。 以上の方法により膝癌細胞株由来の c DNAから 63個の陽性 クローンを単離した。
《単離抗原遺伝子の相同性検索》 P C R法によりインサート D NAを増幅し、 以後の解析に用いた。 得られた P C R産物を Big Dye DNA シーケンシングキット （PE Biosystems, CA) Aシーケ ンシングを行い、 塩基配列を決定した。 上記決定された 6 3種類の遺伝子の塩基 配列を、 それぞれ相同性検索プログラム B L A S T (Basic Local Alignment Search Tool) を用いて、 N C B Iデータバンクに登録されている遺伝子情報と比 較した。
《h s p 1 0 5》
その結果、 表 1の 1 8個の陽性クローンを認めた。 その 1個が h s p 1 0 5で あった。
表 1
塍管腺癌細胞株の sERExによ y単離された遺伝子 j這 te子名 遺伝子 配列同一性 ' . . SEREXデータベースサーチ a
KM-PA-1 apg-2 (heat shock protein 110 family) NGO-St-81, NY-CO-40, NY-CO-32
KM-PA-2 EST (KIAA0124) 一
KM-PA-3 β-actin 一
KM-PA-4 coactosin-like protein (CLP) ―
KM-PA-5 HALPHA44 (alpha-tubulin) ―
KM-PA-6 unknown —
KM-PA-7 CDC-like kinase (CLK3) —
KM-PA-8 cytokeratin 18 ―
KM-PA-9 polyA binding protein 一
KM-PA-10 very-long-chain-acyl-CoA-dehydrogenase (VLCAD) ―
KM-PA-11 unknown —
KM-PA-12 HLA-Cw heavy chain (MHC Class I) LONY-BR-26
KM-PA-13 unknown 一
KM-PA-14 CGI 55 protein 一
KM-PA-15 glycosylation-inhibiting factor (GIF) Mzl9-16a, Hom-HDl-21
KM-PA-16 unknown NGO-St-95, NGO-St-103 M-PA-17 DNA binding protein A (dbpA) ―
KM-PA-18 heat shock protein 105 (KIAA0201) NY-CO-25 a ：横線は強いホモロジ一がないことを示す
《h s p 1 0 5発現の確認》
各種癌組織おょぴ正常組織における、 h s p 1 0 5蛋白の発現の有無を免疫組 織化学的に解析した。 その結果、 図 1および図 2に示したように h s p 1 0 5は 膝癌組織及び大腸癌組織に発現することがわかった。 実施例 2
《h s p 1 0 5を構成するぺプチド》
日本人の 6 0 %が陽性の11 1^ ー八2 4に結合するモチーフと B A L B / cマ ウスの K dの結合するモチーフはほとんど同じである。 H L A— peptide binding prediction (http： //bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla—bind/) ¾■用レヽて ii L A— A 2 4と K dの両方に結合すると予測されるヒト ·マウス s p 1 0 5共通のぺプ チドを h s p 1 0 5のシークェンスより選び出し、 9または 1 0のアミノ酸から なる 9種類のぺプチドを Fmoc/PyBOP法で合成した。ぺプチドのシークェンスと K dへの結合予測値を表 2に示す。 表 2 hspl05由来べプチド
hsp105-derived peptides
No. Position Sequence Binding Score
1 hsp105 180-188 NYGIYKQDL 2400
2 hsp105 214-223 AFNKGKLKVL 960
3 hsp105 251 -260 KYKLDAKSKI 2880
4 hsp105 305-313 QFEELCAEL 1382
5 hsp105 433-442 TFLRRGPFEL 1920
6 hsp105 570-579 MYIETEGKMI 4800
7 hsp105 597-606 ECVYEFRDKL 80
8 hsp105 682-690 HYAKIAADF 60
9 hsp105 696-705 KYNHIDESEM 432 実施例 3
《DNAワクチン》
マウス h s 105 c DNAを発現ベクター p CAGGSに組み込んだプラス ミド DNAをそのまま適当な濃度に調整してワクチンとして以下の性能評価試験 に使用した。 なお、 このマウス h s p 105— p CAGGSDNAワクチンは大 腸菌を培養し、 その後大腸菌からプラスミ ド DNAを取り出し、 精製することに より大量に産生したものを用いた。
《ぺプチドワクチンおよび DN Aワクチンの抗癌効果》
BALBZcマウスの筋肉に①生理食塩水、 ②ベクターのみ、 ③ h s p 105 c DNAベクター、 ④アジュバントのみ、 及び⑤アジュバント +ペプチドを注射 し、同系マウス由来の h s p 105を高発現する大腸癌細胞株 Colon- 26を背部 皮下に移植して、マウスの癌の発症を （1) 癌部の面積、 （2)癌が生着したマウ スの割合、 （3) 生存マウスの割合で評価した。 結果を図 3A、 B、 Cに示す。 図 3A、 B、 Cに示すように、 3 x 104個の Colon26を植えた場合、 生食のみあ るいは、 pCAGGS のみを免疫したマウスには 13日目までにそれぞれ 5匹全例腫 瘍が生着したが、 h s p 105— DNAエアクチンを免疫した 5匹のうち、 20日 目に 1匹、 24日目に 1匹腫瘍が生着したものの、 残りの 3匹は腫瘍を完全に拒 絶した。 アジュバント群は、 24日目までに 5匹全例腫瘍が生着した。 DNA ワク チン ·ペプチドワクチン ·アジュバント群と生食 ·ベクター群間に有意差を認め た （図 3B)。 腫瘍面積の平均においても同様の結果であった （図 3A)。
これらの結果からぺプチドワクチンおよび DNAワクチンの抗癌剤としての効 果は明らかである。 全体の生存曲線でみると、 生食 ·ベクター ·アジュバント群 は 45日目でも 5匹中 2匹が生存しており、 DNAワクチン群に至っては、 5匹 全例とも生存していた。 DN Aワクチン群は他の 4群全てとの間に有意差を認め た。 ペプチドワクチン群は生食 'ベクター 'アジュバント群との間に有意差をも つて生存期間の延長を認めた （図 3C)。 更に、 腫瘍を拒絶したマウスを病理学的 に観察し、 正常臓器への傷害がおこっていないことと、 腫瘍を拒絶した局所に炎 症細胞が多数浸潤していることを確認した。
《h s p 1 0 5の C T Lェピトープぺプチドの決定》
C T Lェピトープぺプチドを同定するため、 D NAワクチン一ぺプチドヮクチ ンが有効であったマウスより勝臓細胞を回収し、 表 2に示す 9種類のぺプチドで 1回刺激し、 5 1 C r release assayによって Colon- 2 6に対する細胞傷害活性を 検討した。 その結果、 上記 9種のペプチドの中では、 下記 5種類のペプチド 1、 2、 3 . 4、 6が有用であることを認めた （図 4 )。
Asn— Tyr— Gly— lie— Tyr— Lys— Gin— Asp—し eu
Ala-Phe-Asn-Lys-Gly-Lys-Leu-Lys-Val-Leu
Lys-Tyr-Lys-Leu-Asp-Ala-Lys-Ser-Lys-Ile
Gln-Phe-Glu-Glu-Leu-Cys-Ala-Glu-Leu
Met-Tyr-Ile-Glu-Thr-Glu-Gly-Lys-Met-I 1 e
《癌診断薬》
h s 1 0 5の抗体を用いて、 勝癌 ·大腸癌、 脳腫瘍、 悪性黒色腫、 慢性骨髄 性白血病、 急性骨髄性白血病、 リンパ腫、 食道癌、 腎臓癌、 前立腺癌、 肺癌、 乳 癌、 胃癌、 肝癌、 胆嚢癌、 精巣癌、 子宮癌、 卵巣癌、 甲状腺癌、 膀胱癌又は肉腫 等の癌の病理診断をすることができる。
《C T L癌治療薬》
マウスにおいて h s 1 0 5および Z又は h s 1 0 5を構成するぺプチドを 抗原として認識するキラー T細胞は正常細胞を傷付けず、 マウス大腸癌にのみ細 胞傷害活性を有することがわかった。 h s p 1 0 5は高発現するヒト膝癌 ·大腸 癌における、 副作用の少なレ、癌治療薬あるいは予防薬として使用することが出来 る可能性がある。 実施例 4 ： spl05のヒ トにおける HLA- A24の CTLェピトープぺプチドの同定 hspl05 のヒトにおける HLA- A24 の CTLェピトープペプチドを決定するため、 HLA-A24 の 2人の大腸癌患者さんの末梢血リンパ球を表 3に示す 9種類のぺプチ ドで 4回刺激し、 51Cr release assayによって、 hspl05を高発現し、 かつ HLA- A24 を発現するヒト大腸癌細胞株 sw620に対する細胞傷害活性を検討した。
具体的には、 末梢血より単核球を分離し、 24穴プレート 1ゥエルあたり 200万 個の単核球を、 自己の血清を 10%含み、 IL- 2 (lOOIU/ml)さらには各ペプチド 10 μ Μを含む培養液 2ml中で 1週間培養し、 1週間毎に、毎回 1週間かけて誘導した 樹状細胞 （Dendritic cell ; DC) 20万個に該ペプチドを 10 Mでパルスして放射 線照射したものを用いて刺激することをさらに 3回繰り返し、 その 6日後に細胞 傷害活性を検討した。なお、 DCとして、 200万個の単核球を、 GM-CSF (lOOng/ml) , IL-4 (100U/ml) 存在下で 5 日間培養し、 さらに TNF- a (20ng/ml)を加え 2 日間 培養したものを用いた。
また、 C1RA2402細胞に該ぺプチドをのせたものをのせないものより傷害するも のを、ぺプチド特異性陽性と判定した。結果を表 3に示す。表 3の太字の数字が、 ぺプチド特異的かつ癌細胞傷害性の CTLが誘導できていることを示す。
表 3HLA- A24のヒト末梢血リンパ球を刺激することによリベプチド特異的かつ癌細胞傷害性キラー T細胞を誘導できるぺプチド ；
each pepti de- i nduced CTし s each pepti de— i nduced CTLs from Pt 1 (HLA-A2402/) from Pt 2 (HLA-A2402/)
% Lysis to % Lysis to
sw620 C1 RA2402 C1 RA2402 sw620 C1 RA2402 C1 RA2402 hsp105- HLA-A2402- (HLA-A (HLA-A0201)
derived peptide Pos iti on Sequence binding score 0201/2402) peptide 10μΜ peptide 10μΜ
A24-1 180-188 NYGIYKQDL 240 16 42 31 32 13 25
A24-2 214-223 AFNKGKLKVL 30 0 42 49 40 28 54
A24-3 251-260 KYKLDAKSKI 110 50 29 46 21 33 44
A24-4 305-313 QFEELCAEL 48 48 22 43 16 40 38
A24-5 433-442 TFLRRGPFEL 33 53 33 33 26 33 46
A24-6 613-622 MYIETEGKWll 90 49 22 47 29 28 52
A24-7 640-649 EYVYEFRDKL 330 40 22 45 8 26 31
A24-8 725-733 HYAKIAADF 140 41 25 37 66 28 43
A24-9 739-748 KYNHIDESEM 83 19 36 43 33 24 45
実施例 5 ： hspl05のヒ トにおける HLA- A2の CTLェピトープぺプチドの同定 hspl05 のヒトにおける HLA- A2 の CTL ェピトープペプチドを決定するため、 HLA-A2 の 1人の大腸癌患者さんと 1人の健常人の末梢血リンパ球を表 4に示す 3 0種類のぺプチドで 4回刺激し、 51Cr release assayによって、 hspl05を高発 現し、かつ HLA - A2を発現するヒト大腸癌細胞株 sw620に対する細胞傷害活性を検 討した。 具体的実験方法は、 実施例 4と同様に行った。
また、 sw620 細胞の hspl05 の発現を RNAi を用いて落としたものを sw620 hspl05-R Ai細胞とし、 これを傷害しないことで、 hspl05に特異的な細胞傷害活 性であることを判定した。 さらに、 sw620 hspl05-RNAi 細胞に該ペプチドをのせ たものをのせないものより傷害するものを、 ペプチド特異性陽性と判定した。 結 果を表 4に示す。 表 4の太字の数字が、 ペプチド特異的かつ癌細胞傷害性の CTL が誘導できていることを示す。
表 4 HLA_A2のヒト末梢血リンパ球を刺激することによリぺプチド特異的かつ癌細胞傷害性キラ一 T細胞を誘導できるぺプチド
each pept i de- induced GTし s each pepti de— i nduced. CTし s from Pt 1 (HLA-A0207/3301) from HD 1 (HLA-A0201 /0207) ― % Lysis to % lysis to ― sw620 sw620 sw620 sw620 s 620 sw620 hsp105- HLA-A0201- ： HLA-A0201: hsp105-RNAi hsp105-RNAi (HLA-A0201) hsp105-RNAi hsp105-RNAi derived peptide Pos iti on Sequence binding score peptide 10μΜ peptide 10μΜ
A2-1 86-94 NLSYDLVPし 49 5 68 56 - - -
A2-2 103-111 V YMGEEHL 41 20 41 36 - - -
A2-3 105-114 YMGEEHLFSV 12637 5 0 0 - - -
A2-4 120-128 LLTKLKET 107 0 0 1 6 35 3
A2-5 141-149 VISVPSFFT 55 4 0 5 - - 一
A2-6 155-163 SVLDAAQIV 37 5 7 18 4 0 13
A2-7 169-177 RLMNDMTAV 591 4 0 8 2 29 32
A2-8 19,0-199 SLDEKPRIW 46 30 18 0 26 9 40
A2-9 202-210 DMGHSAFQV 21 26 0 3 - - -
A2-10 222-231 VLGTAFDPFL 759 0 29 20 2 0 0
A2-11 265-273 RLYQECEKL 33 18 0 28 15 0 17
A2-12 275-284 Kし MSSNSTDし 276 10 1 13 10 28 58
A2-13 276-284 LMSSNSTDL 26 11 0 21 11 0 14
A2-14 300-309 K NRSQFEEL 50 11 0 0 44 61 9
A2-15 304-313 SQFEELCAEL 32 12 0 4 21 0 9
A2-16 313-321 LLQ IEVPL 36 10 21 8 - - 一
A2-17 323-332 SLLEQTHLKV 1055 1 76 34 32 0 0
A2-18 381-389 AILSPAF V 205 50 0 0 22 28 9
A2-19 434-422 FLRRGPFEL 43 8 39 3 - - 一
A2-20 458-467 KIGRFWQNV 76 24 0 g 32 9 4
A2-21 601-610 NLVWQLGKDL 21 7 0 4 5 0 4
A2-22 602-610 LVWQLGKDL 26 19 0 3 - - 一
A2-23 641-649 YVYEFRDKL 210 26 2 13 0 9 23
A2-24 648-657 KLCGPYEKFI 200 9 0 0 42 0 9
A2-25 668-676 しし TETEDWし 401 32 0 27 23 42 27
A2-26 675-684 WLYEEGEDQA 146 18 0 41 11 21 3
A2-27 694-702 ELMKIGTPV 19 14 0 13 22 0 0
A2-28 714-723 K FEELGQRL 819 11 2 0 5 0 0
A2-29 757-765 EVMEWMNNV 15 1 0 0 - - -
A2-30 765-774 VMNAQAKKSL 26 0 0 11 26 0 12
実施例 6 ：組織における hspl05の免疫組織化学的解析結果
様々な組織における hspl05の発現を免疫組織化学的に解析した。 具体的には、 様々な組織のホルマリン固定、 パラフィン包埋ブロックを用いて 3mmの薄切切片 を作成し、 VECTOR stain ABC - P0 (rabbit IgG) kit (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) を用レヽて、 ABC法 (avidin-biotin complex immuneoperoxidase technique) で免疫組織化学的解析を行った。 一次抗体には、 rabbit polyclonal anti-human HSP105 Ab (SA TACRUZ, Santa Cruz, CA) を購入して 200倍に希釈し て用いた。
結果を示した顕微鏡写真を図 5に示す。 図 5においては、 A：大腸癌、 B：大腸 腺腫の中の大腸癌、 C：大腸癌の肝転移、 D：膝癌、 E：腠島細胞腫、 F：乳癌の孚 L 頭腺管癌、 G：乳癌の硬癌、 H：食道癌、 I：甲状腺癌、 J：胃悪性リンパ腫、 K：褐 色細胞腫、 L：膀胱癌、 M：精巣、 及び N：精上皮腫を示す。 図 5の結果から分か るように、 A， B， C, D， E, F, H, I, J, K, L, M, N、 すなわち G以外の腫瘍なら ぴに精巣で hspl05の高発現が認められた。 実施例 7 ： hspl05で誘導したマウスの C D 4陽性ヘルパー T細胞株の in vivoに おける抗腫瘍活性
BALB/cマウスの脾臓を採取し、すりつぶして脾細胞を分離し、 96穴平底プレー ト 1ゥエルあたり 20万個の脾細胞を、 IL- 2 (lOOIU/ml)さらにはリコンビナント hspl05蛋白 2 μ g/mlを含む培養液 200 μ 1中で 1週間培養し、 1週間毎に、毎回脾 細胞 20万個にリコンビナント hsP105蛋白を 2 / g/mlでパルスして放射線照射し たものを用いて刺激することをさらに何回も繰り返し、複数の CM陽性ヘルパー T 細胞株（Th)を樹立した。細胞表面の CD4、CD8の発現の確認は、 Monoclonal Antibody MOUSE CD4-FITC, CD8-FITC (IMMUNOTECH, Marseille, France) を用いて免疫蛍光 染色を行い、 FACSにて解析した（図 6の A)。 Thが hspl05蛋白に特異的に反応し て増殖するかどうかを [¾] thymidine の取り込みで調べた。 具体的には、 96穴 平底プレート 1ゥエルあたり 15万個の脾細胞を入れ、 hsP105蛋白をー晚パルス したものとしないものを用意し、それぞれに対し、 3万個の Thを入れ、 72時間反 応させた（最後の 16時間に 1ゥエルあたり の [¾] thymidineを入れた）。 そして、 [¾] thymidineの取り込みを液体シンチレーシヨンカウンターで測定し た。 その Thは hspl 05蛋白に特異的に反応して増殖した （図 6の B )。 また、 こ の際、 Th を入れて 24 時間後の上清をとつておき、 Mouse IFN- y , IL- 4 ELISA Ready - SET- Go ! (eBioscience) を用いて、 Th が反応して分泌した IFN - yと IL - 4 を測定した。その Thは hspl05蛋白に特異的に反応して IFN- γを大量に産生する Thlタイプであった。（図 6の C )。BALBんマウスの背部皮下に Colon 26を移植し、 3mm大の腫瘍を形成した後に、その Thを局注して経過を観察した結果、治療後は、 明らかに Colon 26腫瘍塊の増殖を遅らせた （図 6の] 3)。
以上の結果から、 hspl05蛋白で誘導した BALBんマウスの C D 4陽性ヘルパー T細胞株は、 hspl05 蛋白特異的に増殖し、 hspl05 を高発現する大腸癌細胞株 Colon26腫瘍塊の増殖を遅らせることが示された。 実施例 8 ： sP105で誘導した大腸癌患者の C D 4陽性ヘルパー T細胞株
末梢血より単核球を分離し、 96穴平底プレート 1ゥエルあたり 20万個の単核 球を、 IL-2 (100IU/ml)さらにはリコンビナント hspl05蛋白 2 μ g/mlを含む培養 液 200 /i l中で 1週間培養し、 1週間毎に、 毎回単核球 20万個にリコンビナント hspl05蛋白を 2 μ g/mlでパルスして放射線照射したものを用いて刺激することを さらに何回も繰り返し、 複数の CD4陽性ヘルパー T細胞株 (Th)を樹立した。 細胞 表面の CD4、 CD8の発現の確認は、 ファーミンジェン抗ヒト CD4, CD8- FITC を用 いて免疫蛍光染色を行い、 FACSにて解析した。 Thが hsP105蛋白に特異的に反応 して増殖するかどうかは実施例 7と同様に行った。 その Thは hspl05蛋白に特異 的に反応して増殖した。（図 7の A)。また、実施例 7と同様に、 Human lFN- y , IL - 4 US ELISA Kit (BIOSOURCE, Camarillo, CA)を用いて、 Thが反応して分泌した IFN- yと IL-4を測定した。 その Thは hspl05蛋白に特異的に反応して IFN - γを大量 に産生する ΤΜタイプであった。 （図 7の Β )。 一般的に、 Thlは CTLの誘導およ ぴ抗腫瘍免疫に有利な方に働くことが知られており、 ヒ トにおいても、 末梢血リ ンパ球を hspl05蛋白で刺激することで、このような Thlが誘導できることが示さ れた。 実施例 9 ： hsP105ぺプチドで刺激した細胞傷害性 T細胞の in vivoにおける抗腫 瘍活性
hspl05 由来ペプチド Asn- Tyr- Gly- lie- Tyr- Lys- Gin- Asp- Leu (配列番号 3 ) で誘導した BALBんマウスの細胞傷害性 T細胞 （C T L) 力 hsP105を高発現す る大腸癌細胞株 Colon26腫瘍塊を縮小させるかどうかを調べた。 具体的には、 BALB/cマウスの背部皮下に Colon26を移植し、 5mm大の腫瘍を形成した後、 C T Lを局注して 1週間後に解剖して、 H E染色により病理学的に観察した。 結果を 図 8に示す。 図 8の結果から分かるように、 hsP105由来ペプチドで誘導した C T Lの投与により、 腫瘍は明らかに縮小した。
らに、 hspl05由来へプチド Lys— Leu— Met— Ser-Ser - Asn— Ser— Thr— Asp— Leu (目己 列番号 1 4 ) で誘導した大腸癌患者の細胞傷害性 T細胞 （C T L ) 力 hspl05を 高発現する大腸癌細胞株 sw620腫瘍塊を縮小させるかどうかを調べた。 具体的に は、 ヌードマウスの背部皮下に sw620を移植し、 5讓大の腫瘍を形成した後、 C T Lを局注した。
C T Lの局注から 1週間後には、腫瘍は縮小した。治療して 2週間後に解剖して、 H E染色により病理学的に観察した。 結果を図 9に示す。 図 9の結果から分かる ように、 C T Lの投与により、 腫瘍の増大を明らかに遅らせることができた。 産業上の利用の可能性
本発明の癌抗原蛋白、 および抗原ペプチド、 あるいは本発明の蛋白またはぺプ チドをコードする DNAは自己傷害性等の副作用が少なく優れた抗癌ワクチンとし て使用することが出来る。 また、 抗体は診断薬として使用することができる。 ま た本発明の抗原により刺激、 活性化されたヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団は抗癌剤として使用できる。

Claims

請求の範囲
1. 下記 （A) 又は （B) の何れかの蛋白質から成る癌抗原。
(A) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
(B) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の 置換、 欠失、 挿入及び/又は付加を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 免疫誘導活 性を有する蛋白質。
2. 請求項 1に記載の癌抗原を含む、 癌に対する免疫誘導剤。
3. 請求項 1に記載の癌抗原の一部からなり、 かつ免疫誘導活性を有するぺ プチド。
4. 癌抗原蛋白質を認識する細胞傷害性 T細胞を活性化しうる、 請求項 3に 記載のぺプチド。
5. 配列番号 3〜 22の何れかに記載のァミノ酸配列を有する、
請求項 3又は 4に記載のぺプチド。
6. 配列番号 3〜22の何れかに記載のアミノ酸配列において、 1若しくは 数個のァミノ酸の置換、 欠失、 挿入及ぴ Z又は付加を含むァミノ酸配列を有し、 かつ、 免疫誘導活性を有するペプチド。
7. 癌抗原蛋白質を認識する細胞傷害性 T細胞を活性化しうる、 請求項 6に 記載のぺプチド。
8. 請求項 3から 7の何れかに記載のペプチドを含む、 癌に対する免疫誘導 剤。
9. 請求項 1に記載の癌抗原をコードする DNA。
10. 下記 （a)、 (b) 又は （c) の何れかの DNA。
(a) 配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNA。
( b ) 配列番号 2に記載の塩基配列を有する D N Aとストリンジ工ントな条件下 でハイプリダイズし、 かつ、 免疫誘導活性を有する蛋白質をコードする DNA。 (c) 上記 （a) 又は （b) の DNAの部分配列を有し、 かつ、 免疫誘導活性を 有する蛋白質をコードする D N A。
1 1 . 請求項 1記載の癌抗原又は請求項 3から 7の何れかに記載のぺプチド に対する抗体。
1 2 . 請求項 1記載の癌抗原、 又は請求項 3カゝら 7の何れかに記載のぺプチ ド、 又はそれらの混合物を用いてインビトロ刺激により誘導されたヘルパー T細 胞、 細胞傷害性 τ細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団。
1 3 . 請求項 1記載の癌抗原、 又は請求項 3から 7の何れかに記載のぺプチ ド、 又はそれらの混合物と、 免疫賦活剤とを用いてインビトロ刺激により誘導さ れたヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団。
1 4 . 免疫賦活剤が細胞増殖因子又はサイトカインである、 請求項 1 3に記 載のヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団。
1 5 . 請求項 1 2から 1 4の何れかに記載のヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T 細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団を体内に移入することを含む、 腫瘍を抑制 する方法。
1 6 . 癌を予防及び Z又は治療するための、 請求項 1 5に記載の方法。
1 7 . 請求項 1記載の癌抗原、 又は請求項 3から 7の何れかに記載のぺプチ ド、 又はそれらの混合物を含む、 請求項 1 2から 1 4の何れかに記載のヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団を作製するための細 胞培養液。
1 8 . 請求項 1 7に記載の細胞培養液、 及び細胞培養容器を含む、 請求項 1 2から 1 4の何れかに記載のヘルパー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを 含む免疫細胞集団を作製するための細胞培養キット。
1 9 . 請求項 1記載の癌抗原、 及ぴ Z又は請求項 3から 7の何れかに記載の 少なくとも 1種類以上のぺプチドを含む癌ワクチン。
2 0 . アジュバンドをさらに含む請求項 1 9に記載の癌ワクチン。
2 1 . 請求項 9又は 1 0に記載の D N A、 又は該 D NAを含む組換えウィル ス若しくは組換え細菌を含む、 癌ワクチン。
2 2 . アジュバンドをさらに含む請求項 2 1に記載の癌ワクチン。
2 3 . 請求項 9又は 1 0に記載の D NAを含む、 癌診断用プローブ。
2 4 . 請求項 2 3に記載の癌診断用プローブ及び/又は請求項 1 1に記載の 抗体を含む、 癌診断薬。
2 5 . 請求項 1に記載の癌抗原、請求項 3カゝら 7の何れかに記載のぺプチド、 請求項 1 1に記載の抗体、 及ぴ 又は請求項 1 2から 1 4の何れかに記載のヘル パー T細胞、 細胞傷害性 T細胞、 又はこれらを含む免疫細胞集団を含む、 癌の予 防 ·治療薬。
2 6 . 癌が膝癌 ·大腸癌、 脳腫瘍、 悪性黒色腫、 慢性骨髄性白血病、 急性骨 髄性白血病、 リンパ腫、 食道癌、 腎臓癌、 前立腺癌、 肺癌、 乳癌、 胃癌、 肝癌、 胆嚢癌、 精巣癌、 子宮癌、 卵巣癌、 甲状腺癌、 膀胱癌又は肉腫である、 請求項 2 3力 ら 2 5の何れかに記載のプローブ又は薬剤。
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