WO2004020617A1

WO2004020617A1 - フェノールオキシダーゼ様活性を有する培養物

Info

Publication number: WO2004020617A1
Application number: PCT/JP2003/010897
Authority: WO
Inventors: Yoshio Tsujino; Katsunori Endo; Abul Khaer Mohamad Quamrul Hasan
Original assignee: Mandom Corporation
Priority date: 2002-08-29
Filing date: 2003-08-28
Publication date: 2004-03-11
Also published as: US7135184B2; CN100448988C; US20050170485A1; EP1533371A4; EP1533371A1; JPWO2004020617A1; JP4116620B2; AU2003268634A1; CN1723279A

Abstract

繊維や毛髪の染色、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフェノール化合物の除去、内分泌攪乱物質の分解、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、木質の改善等を、効率よく、安価に、かつ簡便に行なう手段を提供すること。フラムリナ属菌類の培養物、該菌類を、pH7を超えるpH条件下で培養して得られ、かつフェノールオキシダーゼ様活性を有する、該菌類由来の培養物、該培養物の製造法、該培養物の存在下に、染色対象物と染料とを接触させる、染色方法、並びに該培養物を含有した染色用組成物。

Description

フエノールォキシダーゼ様活性を有する培養物技術分野

本発明は、フエノールォキシダーゼ様活性を有する培養物及びその製造方法、染色方法並びに染色用組成物に関する。より詳しくは、繊維や毛髪の染色、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフエノール化合物等の除去、内分泌攪乱物質の分解、フエノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、木質の改善等に有用な培養物、簡便、安価で、かつ大量に該培養物を得ることができる製造方法、種々の染料による染色が可能な、繊維や毛髪等の染色方法、並びに該染色に有用な染色用組成物に関する。背景技術

フエノール化合物、ポリフエノール化合物等の種々の基質に対して酸化作用を示す酸化酵素は、主に、ペルォキシダーゼ類とフエノールォキシダーゼ類との 2 つのグループに分類されうる。

前記ペルォキシダ一ゼ類は、種々の基質の酸化を触媒し、共通の基質として、反応系中に過酸化水素の存在を必要とする。一方、フエノールォキシダーゼ類は、種々の基質の酸化を触媒し、共通の基質として、分子状酸素の存在を必要とする。したがって、既知の酸化酵素類の中でも、前記フエノールォキシダーゼ類は、大気中の酸素の存在下で種々の基質の酸化を触媒することができるため、酸素存在下で中間体としてのラジカル種の生成に起因する発色、脱色、重合、分解等の多様な化学反応に適する。

前記フエノールォキシダ一ゼ類は、反応中間体として生成するラジカル種の作用に基づく多様な触媒能を有する。例えば、メデイエ一夕一としてフエノチアジン— 1 0—プロピオン酸を用いた場合、フエノールォキシダーゼ類であるラッカーゼによるィンジコの分解反応を効率よく行なうことができることが開示されている（平成 13 年度福井大学地域共同研究センター高度技術研修資料集、第 5 5頁）。

前記酸化酵素は、従来から種々の植物、細菌類及び真菌類等に見出されている。例えば、植物では、ウルシ科 (Anacardiaceae)の分泌性導管、桃類、栗類、マキ科 (Podocarpaceae)等において、前記酸化酵素が見出されている。真菌類では、不完全菌亜門（Deuteromycotina)に属する、ァスペルギルス (Aspergillus) , ポトリティス（Botrytis)、ミロセシウム（Myrothecium)、ぺニシリウム (Penicillium), ぺス夕口チア（Pestalotia)、リゾクトニア (Rhizoctonia)等；担子菌亜門 (Basidiomycotina)に属する、プロィロータス（Pleurotus)、レンティナス (Lentinus)、ポリポラス（Polyporus)、トラメテス（Trametes)、コリオラス (Coriolus)等；子嚢菌亜門 (Ascomycotina)に属するポドスポラ（Podospora)、ノイロスポラ（Neurospora)、モノシリウム (Monocillium)等において、前記酸化酵素が見出されている。細菌では、バチルス（Bacillus)、ァゾスピリゥム (Azospirillum)、ストレプトミセス (Streptomyces、ァェロノクタ (Aerobacter) 等において、前記酸化酵素が見出されている。また、担子菌 (Basidiomysetes) である食用キノコでは、例えば、スェヒロタケ (Schizophyllum commune) , 力ヮフタケ (Coriolus versicolor)、ヒっ口タケ (Pycnoporus coccineus)、ヒフ夕ケ (Pleurotus octreatus) , ベッコゥタケ（Fomitella fraxinea)等に、前記酸化酵素が見出されている。

しかしながら、多くのフエノ一ルォキシダ一ゼは至適 p Hを酸性付近に有することから、使用用途が限定されるという欠点がある。また、中性やアルカリ性に至適 p Hを有するフエノールォキシダーゼでは、用いる基質によって至適 p Hが大きく変動し、中性付近で種々の基質に効率よく作用しない場合があるという欠点がある。一方、エノキダケ（Flammulina velutipes)は、 pH6. 0の培地で培養することにより、ラッカ一ゼ活性を発現することが見出されている（特開昭 60— 1 56385号公報）。

しかしながら、前記ラッカ一ゼは、酸性側に至適 pHを有する酵素であり、中性やアル力リ性領域の pHでは、活性が低下するという欠点がある。発明の開示

本発明は、種々の化合物、特に、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物及びジァミノフエノール化合物を基質とする反応に用いることができ、繊維や毛髪の効率的な染色、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフエノール化合物の除去、内分泌攪乱物質の分解、フエノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、木質の改善等への応用性に優れる、 Flammulina 属に属する菌類由来の培養物を提供することを目的とする。また、本発明は、前記培養物を、簡便に、安価に、かつ大量に得ることができる、培養物の製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、種々の染料、具体的には、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物、ジァミノフエノール化合物、天然物（フラポノイド等）、動植物の黒色色素構成物等により、効率よく、簡便に染色することができる染色方法を提供することを目的とする。また、本発明は、種々の染料、具体的には、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物、ジァミノフエノール化合物、天然物（フラボノイド等）、動植物の黒色色素構成物等による染色を可能にし、取扱いが簡便である染色用組成物を提供することを目的とする。すなわち、本発明の要旨は、

[13 フエノールォキシダーゼ様活性を有し、かつ下記①〜⑤：

① 式（ I ) ：

に示されるエバンスブルー、式（II)

に示されるアシッドブル一 80、式（III)

に示されるレマゾールブリリアントブルー R、及び式（IV)

に示されるァシッドバイオレツト 1 7のそれぞれに対する酸化的脱色反応を触媒する〔脱色活性〕、

② リグニンに対する酸化的分解反応を触媒する〔酸化的分解活性〕、

③ 式（V ) ：

に示されるインディゴカルミン、及び式（VI)

に示されるナチュラルオレンジ 6の酸化的重合反応を触媒する〔酸化的重合活性〕

④ 4ーァミノアンチピリンと、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物、ジアミノフエノール化合物及び複素環化合物からなる群より選ばれた 1種の化合物との酸化的カップリング反応を触媒する〔酸化的カップリング活性〕、

、並びに

⑤ フエノール化合物、ァミノフエノール化合物、ジァミノフエノール化合物及び複素環化合物からなる群より選ばれた 1種の化合物に対する直接的酸化反応を触媒する〔直接的酸化活性〕、

からなる群より選ばれた少なくとも 1つの基質特異性を有する、フラムリナ (Flammulina)属に属する菌類由来の培養物、

〔2〕フラムリナ（Fla匪 ulina)属に属する菌類が、エノキダケ（F 誦 ul ina velutipes)である、前記〔1〕記載の培養物、

〔 3〕エノキタケ（Flammul ina velut ipes)力 Flammulina velutipes IFO 30601株である、前記〔2〕記載の培養物、

〔4〕フラムリナ（Flammul ina)属に属する菌類を pH 7を超える pH条件下で培養して、得られた培養液から菌糸体を除去して得られる、前記〔 1〕〜

〔3〕いずれか 1項に記載の培養物、

〔5〕フラムリナ（F 匪 ulina)属に属する菌類を pH 7を超える pH条件下で培養して、得られた培養液から菌糸体を除去して得られ、かつフエノールォキシダ一ゼ搽活性を有する、フラムリナ（Flammul ina)属に属する菌類由来の培養物、

〔6〕フラムリナ（Flammulina)属に属する菌類を培養し、得られた培養液から菌糸体を除去して、培養物を得ることを特徴とする、前記〔1〕〜〔5〕いずれか 1項に記載のフラムリナ（Fla画 ulina)属に属する菌類由来の培養物の製造方法、

〔7〕フラムリナ（Flammul ina)属に属する菌類が、エノキダケ（Flammul ina velutipes)である、前記〔6〕記載の製造方法、

〔8〕エノキダケ（Flammul ina velut ipes)力、 Flammul ina velut ipes IFO 30601株である、前記〔7〕記載の製造方法、

〔9〕前記〔1〕〜〔5〕いずれか 1項に記載の培養物の存在下に、染色対象物と染料とを接触させることを特徴とする、染色方法、並びに

〔10〕前記〔1〕〜〔5〕いずれか 1項に記載の培養物を含有してなる染色用組成物、

に関する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の培養物の至適温度を調べた結果を示す図である。図のパネル Aは、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合を示し、パネル Bは、 o—ァミノフエノールを基質とする場合を示す。

図 2は、本発明の培養物の熱安定性を調べた結果を示す図である。図のパネル Aは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合を示し、パネル Bは、 o—ァミノフエノールを基質とする場合を示す。

図 3は、本発明の培養物の至適 pHを調べた結果を示す図である。図 3中、図のパネル Aは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合を示し、パネル Bは、 o—ァミノフエノールを基質とする場合を示し、パネル Cは、 p_ フエ二レンジアミンを基質とする場合を示す。

図 4は、本発明の培養物の pH安定性を調べた結果を示す図である。図 4中、パネル A及び Bは、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合を示し、パネル C及び Dは、 o—ァミノフエノールを基質とする場合を示す。また、パネル A及び Cは、 1時間後の pH安定性を示し、パネル B及び Dは、 20時間後の pH安定性を示す。

図 5は、本発明の培養物により、ャク毛束及び羊毛布を染色した結果を示す図である。図 5中、パネル Aは、ャク毛束を用いた結果、パネル Bは、羊毛布を用いた場合の結果を示す。

図 6は、培養 pH条件による活性誘導の変化を調べた結果を示す図である。図 7は、本発明の培養物及び pH 6. 0で培養して得られた培養物それぞれのフエノールォキシダーゼ様活性の至適 pHを比較した結果を示す図である。パネル A及びパネル Bは、 pH6. 0で培養して得られた培養物の至適 pH、パネル C及び Dは、本発明の培養物の至適 pHを示す。また、パネル A及びパネル Cは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質として用いた場合、パネル B及び Dは、 p —フエ二レンジアミンを基質として用いた場合を示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明の培養物は、フ^:ノールォキシダーゼ様活性を有するので、酸素存在下で反応中間体としてのラジカル種の生成に起因する多様な化学反応を触媒的に行なうことができ、また、用いられる基質による至適 PHの変動が小さく、中性付近で高い活性を有する。したがって、本発明の培養物によれば、繊維や毛髪の染色、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフエノール化合物の除去、内分泌攪乱物質の分解、フエノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、接着剤の製造等に応用することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の培養物は、食用である後述のエノキダケ（Flammulina velut ipes)に代表される Fla mmulina属に属する菌類由来のものであるため、菌糸体外に放出される培養生成物から容易に供給することができるという優れた効果を発揮する。

前記 Flammulina属に属する菌類としては、具体的には、エノキダケ（Fla画 u 1 ina velut ipes)が挙げられ、より具体的には、 Flammulina velut ipes IFO 30601株が挙げられる。

本明細書において、フエノールォキシダーゼ様活性とは、酸素存在下で、フェノール化合物、ァミノフエノール化合物、フエ二レンジァミン化合物等を触媒的に酸化することをいう。かかるフエノールォキシダーゼ様活性は、例えば、フエノール、ァニリン誘導体等を水素供与体として用い、酸素分子を還元する反応による発色反応で測定されうる。前記水素供与体としては、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物、ジァミノフエノール化合物、複素環化合物等が挙げられる。

本発明の培養物は、下記①〜⑤：

① 式（ I ) ：

に示されるエバンスブルー、式（II)

に示されるアシッドブルー 8 0、式（III)

S0₂CHフ CH₂OS0₃ Na

(III)

に示されるレマゾールブリリアントブルー R、及び式（I V)

に示されるアシッドバイオレツ卜 1 7のそれぞれに対する酸化的脱色反応を触媒する〔脱色活性〕、

③ 式（V ) ：

に示されるインディゴカルミン、及び式（V I )

④ 4一ァミノアンチピリンと、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物, ジアミノフエノ一ル化合物及び複素環化合物からなる群より選ばれた 1種の化合物との酸化的カップリング反応を触媒する〔酸化的カップリング活性〕、、並びに

からなる群より選ばれた少なくとも 1つの基質特異性を有する。

前記フエノール化合物としては、例えば、フエノール、 2—メトキシフエノール、 2 , 6—ジメトキシフエノール、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、ピロガロール、没食子酸、没食子酸プロピル、 1—ナフトール、カテキン等が挙げられる。また、前記アミノフエノール化合物としては、例えば、 o—ァミノフエノール、 m—ァミノフエノール、 p —ァミノフエノール等が挙げられる。さらに、前記ジァミノフエノール化合物としては、例えば、 o —フェニレンジァミン、 m—フエ二レンジァミン、 p —フエ二レンジァミン等が挙げられる。前記複素環化合物としては、 5—ヒドロキシインドール、 2 , 6— ジァミノピリジン等が挙げられる。

なお、前記基質特異性に関し、前記①の脱色活性、前記②の酸化的分解活性及び前記③の酸化的重合活性は、

a ) 基質（染料、リグニン等）を含有した 1 0 5 . 3 mM リン酸ナトリウム緩衝液（P H 7 . 0 ) 9 5 0 1 を 2 5でで、 5 分間プレインキュペートして、基質溶液を得るステップ、

b ) 前記ステップ a ) で得られた基質溶液と、本発明の培養物を含有した培養物溶液 5 0 w 1 とを混合して、 2 5でで、 6 0分間インキュベートするステツプ、及び

c ) 前記ステップ b ) で得られた産物について、基質に応じた波長における吸光度を測定するステツプ

により決定されたものである。ここで、前記染料として、エバンスブル一、ァシッドブルー 8 0、レマゾールブリリアントブル一 R及びァシッドバイォレツト 1 7について、前記ステップ c ) において、それぞれ、 600 nm、 600 nm、 600 nm及び 5 50 nmの吸光度を測定することにより、各染料に対する脱色活性を評価することができる。また、前記リグニンに関して、前記ステツプ c) において、 450 nmの吸光度を測定することにより、各染料に対する酸化的分解活性を評価することができる。さらに、前記染料として、インディゴカルミン及びナチュラルオレンジ 6について、前記ステップ c) において、それぞれ、 600 nm及び 450 nmの吸光度を測定することにより、各染料に対する酸化的重合活性を評価することができる。

また、前記④の酸化的カップリング活性は、

a) 0. 4 mo 1の水素供与体と 4. O ^mo lの 4ーァミノアンチピリンとを含有した 1 0 5. 3mM リン酸緩衝液（pH 7. 0) 1 90 1を, 2 5°Cで、 1分間プレインキュべ一卜して、基質溶液を得るステップ、 b) 前記ステップ a) で得られた基質溶液と、本発明の培養物を含有した培養物溶液 1 0 1とを混合して、 2 5 で、 60分間インキュベートするステツプ、及び

c ) 前記ステップ b) で得られた産物について、水素供与体に応じた波長で吸光度を測定するステップ、ここで、フエノール化合物、ジァミノフエノール化合物及び複素環化合物を基質とする場合、 490 nmにおける吸光度の変化、ァミノフエノール化合物を基質とする場合、 450 nmにおける吸光度の変化を測定する

により決定されたものである。

さらに、前記⑤の直接的酸化活性は、

a) 0. 1 mmo 1の基質を含有した 0. 89mM リン酸ナトリウム緩衝液（PH7. 0) 1 80 /i lを、 25°Cで、 1分間プレインキュベ一卜して、基質溶液を得るステップ、

b) 前記ステップ a) で得られた基質溶液と、本発明の培養物を含有した培養物溶液 20 1とを混合して、 2 5°Cで、 60分間インキュベートするステツプ、及び、 c) 前記ステップ b) で得られた産物について、基質に応じて、 490 nm、 450 nm又は 405 nmの吸光度の変化を測定するステツプ

により決定されたものである。

本発明の培養物は、 pH6. 0〜8. 0の範囲で、優れたフエノールォキシダーゼ様活性を示す。本発明の培養物は、前記 pHの範囲において種々のフエノール化合物に対して優れたフエノールォキシダーゼ様活性を示すため、特別な PH調整を行なうことなく、効率よく反応を行なうことができるという優れた性質を発現する。

また、本発明の培養物は、 20〜60°Cの範囲で、優れたフエノールォキシダーゼ様活性を示す。本発明の培養物は、前記温度の範囲において優れたフエノールォキシダーゼ様活性を示すため、特別な温度条件に調節することなく、日常の生活温度（室温、水温、体温、気温等）で高い活性を示す。したがって、染色、廃液処理、高分子合成等を簡便に行なうことができる。

また、本発明の培養物は、 pH 5. 0〜9. 5において、 30°Cで 1時間ィンキュベ一卜したとき、インキュベート前の活性と比較して、約 7 5 %以上の相対残存活性を保持し、 PH4. 0〜 1 0. 5において、 30でで 1時間インキュベー卜したとき、インキュベート前の活性と比較して、約 40 %以上の相対残存活性を保持する。なお、本発明のフエノールォキシダーゼ化合物の pH 安定性は、 30°Cで 20時間インキュベートしたとき、インキュベート前の活性と比較して、 pH7. 0〜9. 0において、約 7 5 %以上の相対残存活性を保持する。本発明の培養物は、前記 pHの範囲において優れた pH安定性を呈するため、特別な pH条件に調節することなく、水ベースの反応溶液を用いることができるという優れた性質を発現する。

さらに、本発明の培養物は、 0〜40°Cにおいて、 pH6. 0で 1時間インキュペートしたとき、インキュベート前の活性と比較して、約 75 %以上の相対残存活性を保持する。本発明の培養物は、前記温度の範囲において優れた熱安定性を呈するため、特別な温度条件に調節することなく、日常温度での使用、及び保存が可能であるという優れた効果を発揮する。したがって、染色、廃水処理、高分子合成等を安価にかつ簡便に行なうことができるという優れた効果を発揮する。

本発明の培養物は、 p H 7を超える P H条件下で、フラムリナ（Flammul in _a)属に属する菌類を培養して、得られた培養液から菌糸体を除去して得られた培養物である点にも 1つの大きな特徴がある。

本発明の培養物は、 p H 7を超える pH条件下で、フラムリナ（Flammulin a)属に属する菌類から培養されて得られたものであり、 ΡΗ6· 0〜8. 0の範囲で、安定で高いフエノールォキシダ一ゼ様活性を示すという優れた性質を発現する。

なお、本明細書において、「ρΗ7を超える pH条件」とは、 ρΗ 7を超える値以上であり、 ρΗ 1 3. 0以下である条件、好ましくは、 ρΗ7. 5〜 1 1. 0、より好ましくは、 ρΗ8. 0〜 10. 0である条件をいう。

本発明の培養物は、 Flammul ina属に属する菌類を培養して得られた培養液であってもよく、該培養液から菌糸体を除去して得られた産物であってもよい。したがって、 Flammul ina属に属する菌類を適切な培地で培養し、菌糸体外の培養生成物から簡便に供給することができる。また、除去された菌糸体を、新たな培地で培養することにより、本発明の培養物を得ることができるので、該菌糸体を、リサイクルすることができる。本発明には、本発明の培養物の製造方法も含まれる。

本発明の製造方法は、 Flammul ina属に属する菌類を培養し、得られた培養液から菌糸体を除去して、培養物を得ることを 1つの大きな特徴とする。

本発明の製造方法によれば、前記 Flammul ina属に属する菌類を培養することにより、フエノールォキシダーゼ様活性を有する培養物を簡便、かつ大量に得ることができるという優れた効果を発揮する。また、除去された菌糸体を、新たな培地で培養することにより、本発明の培養物を得ることができ、リサイクルすることができるため、安価に、かつ簡便に本発明の培養物を簡便に得ることができるという優れた効果を発揮する。

Flammul ina属に属する菌類の培養には、液体培地、又は固体培地のいずれを用いてもよい。

本発明の製造方法に用いられる培地の炭素源としては、例えば、 Flammulina 属に属する菌類が同化しうるものであればよく、グルコース、ショ糖、糖蜜、でんぷん等の糖類、ふすま、みかんパルプ等が挙げられ、前記炭素源は、単独で、又は 2種以上を組み合わせて用いられうる。また、窒素源としては、おから、ペプトン、卜リプトン、カザミノ酸、酵母エキス、麦芽エキス、脱脂大豆粉、コーンスティープリカ一、尿素等の有機窒素源；硝酸カリウム、硫酸アンモニゥム等の無機窒素等が挙げられ、前記窒素源は、単独で、又は 2種以上を組み合わせて用いられうる。また、本発明の製造方法に用いられる培地には、必要に応じて、リン酸塩、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリゥム、カリウム、カルシウム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト等の無機塩類、ビタミン類等を添加してもよい。培地中における前記炭素源、窒素源等の濃度は、本発明の培養物を生産する担子菌、特に、 F mmulina属に属する菌類を十分に生育させ、フエノールォキシダーゼ様活性を発現させるに適した濃度であればよく、具体的には、炭素源は、 0. 1〜20重量％、好ましくは、 1 〜 1 0重量％であることが望ましく、窒素源は、 0. 1〜 1 0重量％、好ましくは、 1〜 5重量％であることが望ましい。

前記培地の pHは、 FUmmulina属に属する菌類を十分に生育させ、フエノールォキシダーゼ様活性、特に、前記基質特異性を伴なうフエノールォキシダーゼ様活性、さらに、前記反応至適 pHを伴なうフエノールォキシダ一ゼ様活性を発現させるに適した pHであればよく、前記性質（例えば、基質特異性、反応至適 pH等）を伴なうフエノールォキシダ一ゼ様活性を十分発現させる観点から、 pH 7. 0を超える pH (初期 pH) 、好ましくは、 ρΗ 7. 5〜 1 1· 0、より好ましくは、 ρΗ8. 0〜 1 0. 0であることが好ましい。したがつて、培地を、かかる pHに調整し、滅菌して使用することが望ましい。

培養温度は、糸状株が生育する温度であればよく、実用上、 1 0〜40 、好ましくは、 20〜 3 5 であることが望ましい。

なお、 F mmulina属に属する菌類を液体培養する場合、好ましくは、通気培養又は振盪培養が望ましい。

培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通気培養の場合は、通常、

2〜 1 0日間であることが望ましい。また、前記培養時間は、培養液の活性値が最大となることを指標として、設定することもできる。

本発明の培養物は、菌体外に分泌生産され、培養液中に蓄積される。したがつて、前記培養液をそのまま用いることもできるが、培養後、菌体等の不要物を遠心分離、濾紙又は濾布等による濾過等により除去し、培養上清として得ることもできる。

また、本発明においては、前記培養液として得られた培養物及び培養上清として得られた培養物について、フエノールォキシダーゼ様活性をより高めてもよく、また、化粧品、医薬部外品等の製品に配合する観点から、脱色、濃縮、凍結乾燥、透析、塩析等に供してもよい。

また、本発明の培養物によれば、種々の染料、色素等とともに用いることにより、ケラチン繊維の染色を行なうことができる。したがって、本発明により、染色方法が提供される。

本発明の染色方法は、培養物の存在下に、染色対象物と染料とを接触させることを 1つの大きな特徴とする。本発明の染色方法によれば、本発明の培養物を用いるため、種々の染料により、染色対象物を、安価に、かつ簡便に染色することができる。また、本発明の染色方法によれば、本発明の培養物を用いるため、特別な温度条件、 p H条件の調節をすることなく、外界環境条件下において行なうことができる。

前記染色対象物としては、例えば、綿、ジアセテート、亜麻、リンネル、リォセル、ポリアクリル、ポリアミド、ポリエステル、ラミー、レーエン、テンセル、トリアセテート、毛皮、獣皮、皮革、絹又はウール製の布帛、糸、繊維、衣料、木材、毛髪、フィルム等が挙げられる。

前記染料としては、例えば、インドリン及びインドリン化合物、インドール化合物、医薬部外品原料規格に収載されている酸化染料等を基質として酸化することができ、カツプリング剤を用いることもできる。インドリン及びインドリン化合物としては、具体的には、インドリン、 5， 6—ジヒドロキシインドリン、 N—メチル一 5 , 6—ジヒドロキシインドリン, N—ェチルー 5 , 6—ジヒドロキシインドリン、 N—ブチル— 5 , 6—ジヒドキシインドリン、 4—ヒドロキシー 5—メトキシインドリン、 6—ヒドロキシ — 7—メトキシインドリン、 6 , 7—ジヒドロキシインドリン、 4， 5—ジヒドキシインドリン、 4ーメトキシ— 6—ヒドロキシインドリン、 N—へキシル — 5， 6—ジヒドロキシインドリン、 2 _メチル— 5 , 6—ジヒドロキシインドリン、 3—メチルー 5 , 6—ジヒドロキシインドリン、 4ーヒドロキシインドリン、 2 , 3—ジメチルー 5， 6 —ジヒドロキシインドリン、 2—メチルー 5ーェチル一 6 —ヒドロキシインドリン、 2 —メチル _ 5—ヒドロキシ一 6— /3 —ヒドロキシェチルインドリン、 4 —ヒドロキシプロピルインドリン、 2— ヒドロキシ一 3—メトキシインドリン、 6—ヒドロキシ一 5—メトキシインドリン、 6—ヒドロキシインドリン、 5—ヒドロキシインドリン、 7—ヒドロキシインドリン、 7—ァミノインドリン、 5—ァミノインドリン、 4—アミノィンドリン、 5， 6—ジヒドロキシインドリンカルボン酸、 1—メチル— 5 , 6 ージヒドキシィンドリン、並びにこれらの塩類等を例示されうる。

インドール化合物として、具体的には、 4—ヒドロキシインドール、 5—ヒドロキシインドール、 5 , 6—ジヒドロキシインドール、 5， 6—ジヒドロキシインド一ルー 2—力ルボン酸、 5， 6 —トリ（ t 一ブトキシカルポ二ルォキシ）インドール、 5 , 6—ジ（ t —ブトキシカルポニルォキシ）インドール、 5 - t—ブトキシカルポニルォキシ— 6—ヒドロキシィンドール、 6— t—ブトキシカルボニルォキシ一 5—ヒドロキシインドール、 5， 6—ジ（エトキシカルボニルォキシ）インドール、 5 , 6 _ジ（ェチルカルバモイルォキシ）ィンドール、 1—ピバロイル— 5— （ビバロイルォキシメトキシ） — 6—ピバロィルォキシィンドール、 1 一ビバロイルー 5 -ビバロイルォキシメトキシ— 6 —ヒドロキシインドール、 5 , 6 - (ォキシカルボニルメトキシ）インドール等が挙げられる。

医薬部外品原料規格に収載されている酸化染料としては、具体的に、 5—ァミノー o—クレゾール、 0—ァミノフエノール、 m—ァミノフエノール、 ρ_ ァミノフエノール、 2， 6—ジァミノピリジン、 5— （2—ヒドロキシェチルァミノ）一 2—メチルフエノール、 N， N—ビス（]3—ヒドロキシ）一 p—フェニレンジァミン '硫酸塩、 p—二トロ— o—フエ二レンジァミン、 p—二ト口— 2 ' , 4 ' ージアミノアゾベンゼン '硫酸ナトリウム、トルエン— 2, 5 —ジァミン、 5—アミノー 0—クレゾ一ル '硫酸塩、 p—ァミノフエノール ' 硫酸塩、 o—クロロー p—フエ二レンジァミン '硫酸塩、 4， 4 ' ージァミノジフエニルァミン '硫酸塩、 p—メチルァミノフエノール '硫酸塩、 p—フエ二レンジアミン '硫酸塩、 m—フエ二レンジァミン '硫酸塩、トルエン— 2, 5—ジァミン '硫酸塩、 2, 4—ジァミノフエノキシエタノール '塩酸塩、トルェン— 2, 5—ジァミン '塩酸塩、 m—フエ二レンジァミン '塩酸塩、 2, 4ージァミノフエノール '塩酸塩、 3, 3 ' —イミノジフエノール、 p—フエ二レンジアミン ·塩酸塩、 N—フエニル _p—フエ二レンジアミン '塩酸塩、 N—フエニル一 p—フエ二レンジアミン ·酢酸塩、 1， 5—ジヒドキシナフ夕レン、トルエン一 3, 4—ジァミン、 p—メチルアミノフエノ一ル、 N, N' —ビス（4—ァミノフエニル）一 2, 5—ジァミノ一 1 , 4—キノンジィミン、 o—ァミノフエノール '硫酸塩、 2， 4—ジァミノフエノール '硫酸塩、 m— ァミノフエノール ·硫酸塩等を例示されうる。

また、本発明においては、 2—アミノー 4—ニトロフエノール、 2—ァミノ — 5—ニトロフエノール、 1—ァミノ一 4—メチルァミノアントラキノン、二トロ一 p—フエ二レンジァミン '塩酸塩、 1， 4—ジァミノアントラキノン、ニトロ一 P—フエ二レンジァミン、ピクラミン酸、ピクラミン酸ナトリウム、 2—ァミノ— 5—二トロフエノール '硫酸塩、レゾルシノール、ニトロ— p— フエ二レンジァミン '硫酸塩、 p—ニトロ— 0—フエ二レンジァミン，硫酸塩、 p—ニトロ— m—フエ二レンジァミン ·硫酸塩等の直接染料も用いられうる。培養物の存在下における染色対象物と染料との接触は、例えば、染料と培養物を使用時に混合して染色対象物と接触するか、或いは嫌気性条件下で保存した染料と培養物の混合物を使用時に大気中で染色対象物と接触することにより行なわれうる。

また、本発明の培養物によれば、染色用組成物が提供される。

本発明の染色用組成物は、本発明の培養物を含有することに 1つの大きな特徴がある。したがって、本発明の染色用組成物によれば、酸素の存在下、外界環境条件下おいて、種々の染料、特に、フエノール化合物と、アミノフエノ一ル化合物と、フエ二レンジァミン化合物とのいずれに対しても至適 p Hに大きな変動がなく、中性付近の p Hで効率よく染色を行なうことができるという優れた効果を発揮する。

本発明の染色用組成物において、本発明の培養物の含有量は、実用的な染色時間とする観点から、例えば、毛髪染色用組成物 1 0 0 gに対して、フエノールォキシダーゼ様活性として 0 . 0 5〜： L 0 0 K Uとされ、 0 . 5〜 2 5 K U であることが望ましい。なお、前記フエノールォキシダーゼ様活性は、 3 0 m Mの p —フエ二レンジアミンを基質として用い、 2 5 °Cの条件下、 p H 7 . 0 で 1分間に 4 9 0 n mにおける吸光度を 1増加させる量を 1単位（U ：ュニット）として定義される値である。

本発明の染色用組成物は、染料若しくは色素、具体的には、前記したインドリン及びインドリン化合物、インドール化合物、医薬部外品原料規格に収載されている酸化染料等を用いることができ、力ップリング剤を用いることもできる。また、前記した直接染料も用いることもできる。

本発明の染色用組成物において、染料若しくは色素の含有量は、実用的な染色時間とする観点から、染色用組成物中 0 . 0 0 0 5〜 1 2重量％であり、好ましくは、 0 . 0 0 5〜 6重量％であることが望ましい。

また、本発明の染色用組成物は、本発明の培養物の生理活性を発現させ、染色を行なうに適した酸、アルカリ、それらの緩衝液等により、 p Hを調整してもよい。具体的には、例えば、塩酸、硫酸等の無機酸；リン酸、酢酸、酒石酸、クェン酸、乳酸、スルホン酸等の有機酸；アンモニア；モノイソプロパノールァミン、モノエタノールァミン等のアミン類；炭酸アンモニゥム等の炭酸塩類；水酸化ナトリゥム、水酸化力リゥム等の水酸化物塩等を挙げることができる。

本発明の染色用組成物には、フエノールォキシダーゼ様活性を阻害しない範囲で、チォ乳酸、亜硫酸ナトリウム、 N_ァセチルー L—システィン等の還元剤を配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲で上記した成分の他、界面活性剤、油性成分、シリコーン類、増粘剤、溶剤、水、キレート剤、香料等を適宜配合することもできる。

また、本発明の染色用組成物を毛髪用の染色用組成物とする場合、例えば、嫌気性条件下で、染料と培養物とを含有した一剤式の染色用組成物とし、使用時に毛髪上に塗布して空気と接触させることで毛髪を染色することができる。さらに、培養物を含有した組成物と、染料を含有した組成物との多剤式の染色用組成物とし、使用時に両組成物を混合して毛髪上に塗布して毛髪を染色することもできる。なお、本発明の染色用組成物は、液剤、クリーム剤、ゲル剤等の種々の染色に適した剤型として用いることができる。

本発明の培養物は、フエノールォキシダ一ゼ様活性を有することから、上記した繊維や毛髪の染色の他、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフエノール化合物の除去、内分泌攪乱物質の分解、フエノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、木質の改善等への利用に有用である。以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により、何ら限定されるものではない。実施例 1 エノキダケ [F 誦 ulina velutipes (IF0306(H株）]の培養物の調製 ( 1) 培養物の調製 1

以下の操作をクリーンベンチ内で行なった。

固体培養用寒天培地〔組成： 2. 4重量％ポテトデキストロースブロス〔ディフコ（D i f c o) 社製〕、 2. 0重量％寒天、残部水〕 10m 1を含む滅菌シャーレに、 Flammulina velutipes (IFO30601株）を 1白金耳相当量播種し、 2 5°Cで 1 0日間培養した。その後、寒天培地全体に成長した菌糸体を、滅菌した白金耳で 5 mm四方の小片に切り分けた。

前記小片 10片を、液体培養用培地 1 〔組成： 2. 4重量％ポテトデキストロースブロス〔ディフコ（D i f c 0 ) 社製〕、残部水（pH 5. 2) ； 12 1 °Cで 1 5分間滅菌したもの〕に播種し、 25 °Cで 7日間、往復振盪培養（1 50往復分）を行なった。

得られた培養液全量を、 2 Lの三角フラスコ中 500m lの前記液体培養用培地に添加し、 25 °Cで 3週間、往復振盪培養（ 1 00往復分）を行なった c その後、成長したペレット状の菌糸体を静置沈殿させ、培養液を取り去り、残部の菌糸体に、液体培養用培地 2 〔組成： 1. 0重量％グルコース、 0. 1重量％酵母エキス、 0. 14重量％ (NH₄) ₂S〇₄、 0. 3 6重量％

K₂ ΗΡ〇₄、 0. 02重量％ Mg S0₄ ' 7 H₂〇、 0. 1 % ミネラル混合液（組成： 1. 0重量％ C u S〇₄ ' 5H₂0、 1. 0重量％ Z n C 1 ₂、 0. 7重量％ F e C l ₃ ' 6H₂〇、 0. 5重量％ C o S〇₄ ' 7H₂0、 0. 5重量％ Mn C l ₂ ' 4H₂0) 、 p H 9. 2 ; 1 2 1°C、 1 5分間滅菌〕 500 m lを添加し、さらに 25 °Cで 3日間培養した。

その後、成長したペレット状の菌糸体を静置沈澱させ、デカンテーシヨンにより培養物を回収した。得られた培養物は、淡黄色、又は黄褐色の清澄又は濁つた液体であった。

(2) 培養物の調製 2

前記（1) で得られた Flammul ina velutipes IFO 306(H株の培養物を、減圧濾過して、濾液を得た。

前記濾液の pHを 1 M 水酸化ナトリウム水溶液により 7. 5に調整した。得られた混合物 1 Lに対して、 5 gの D E AE— c e 1 1 u 1 0 s e 〔シグマ（S i gma) 社製〕担体を添加し、 4 で 30分間振盪攪拌した。その後、 1 0分間静置し、上清を除去した。

得られた DE AE— e e l 1 u 1 o s e担体に、該担体の 3倍容量の 1 M 塩化ナトリウムを含有した 0. 1 M リン酸ナトリウム緩衝液（pH6. 5) を添加した。得られた混合物を 5分間振盪攪拌して、 D EAE— c e l l u l o s e担体に吸着したタンパク質を溶出した。得られた溶出液を、減圧濾過にて回収し、 4°Cで脱イオン水に対して透析し、得られた産物を凍結乾燥し、凍結乾燥産物として、培養物を得た。実施例 2 本発明の培養物の反応至適温度

前記実施例 1の（2) で得られた培養物（凍結乾燥産物） 1 0 2mg (タンパク質量： 2 3mg、比活性 1 5 UZmg タンパク質）を、 0. 0 2mg タンパク質ノ m l となるように溶解させて、培養物を得た。

得られた培養物について、フエノールォキシダーゼ様活性を、種々の温度条件（0、 2 0、 3 0、 4 0、 5 0、 6 0、 7 0及び 8 0V) 下にて測定した。具体的には、 0—ァミノフエノールを基質とする場合、マイクロセントリフユージチューブ〔ポレックスバイオプロダクツィンコーポレティッド（P o r e x B i o P r o d u c t s I n c . ) 社製〕中、 1 0 OmM リン酸ナトリゥム緩衝液（PH 6. 0) 0. 8 9m l と、 5 0mM o—ァミノフエノールのジメチルスルホキシド溶液 0. 1 m l と、培養物溶液 0. 0 1 m l とを混合し、得られた混合物について、各反応温度にて 1 0分間反応を行なったその後、反応液に、 2 M グリシン塩酸緩衝液（pH 3. 0) 0. 1 m l添加することにより、反応を停止させた。また、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合、前記 0—ァミノフエノールの場合において、 0—アミノフェノールの代わりに、 5 0mM 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液を用いて同様に操作を行なった。

ついで、得られた各反応産物について、分光光度計〔ジャスコ（ J a s c o) 社製、商品名： V— 5 3 0〕により、 o—ァミノフエノールを基質とする場合、 4 2 0 nmにおける吸光度を測定し、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合、 4 7 0 nmにおける吸光度を測定することにより、活性を評価した。なお、前記活性は、 1分間に、吸光度を 1増加させる量を 1単位 (U ; ユニット）とした。その結果を図 1に示す。なお、図 1において、最大活性を 1 0 0として、相対活性で示す。また、図のパネル Aは、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合を示し、パネル Bは、 o—ァミノフエノールを基質とする場合を示す。

図 1に示されるように、本発明の培養物の反応至適温度は 20〜60°Cであることがわかった。実施例 3 本発明の培養物の熱安定性 ·

前記実施例 2と同様の培養物溶液 0. 02m lを、種々の温度条件（0、 20、 30、 40、 50、 60、 70及び 80 °C) 下にて、 0. 1 8 m 1の 1 0 OmM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 6. 0) 中で 60分間インキュべ一卜することにより、前処理を行なった。

o—ァミノフエノールを基質とする場合、得られた産物 0. 0 5m l と、 1 0 OmM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 6. 0) 0. 8 5m l、 50m M o—ァミノフエノールのジメチルスルホキシド溶液 0. 1m l とを、マイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、 420 nmにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（ J a s c o) 社製、商品名： V — 530〕で測定することにより、活性を評価した。また、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合、前記 o_アミノフエノールを基質とする場合において、 5 OmM 0—ァミノフエノールのジメチルスルホキシド溶液の代わりに、 5 OmM 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液を用い、同様の操作を行ない、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、活性を評価した。なお、前記活性は、 1分間に、吸光度を 1増加させる量を 1単位 (U ;ユニット）とした。その結果を図 2に示す。なお、図 2において、最大活性を 1 00として、相対残存活性で示す。また、図のパネル Aは、 2， 6— ジメトキシフエノールを基質とする場合を示し、パネル Bは、 o—ァミノフエノールを基質とする場合を示す。

図 2に示されるように、本発明の培養物は、 2, 6—ジメトキシフエノ一ルの場合、 40°Cまでで、 84%の相対残存活性、 50°Cで、 45 %の相対残存活性、 60°Cで 22 %の相対残存活性を示した。また、 o—ァミノフエノールの場合、本発明の培養物は、 40°Cまでで、 9 1 %の相対残存活性、 50°Cで、 62 %の相対残存活性、 60 で 40 %の相対残存活性を示した。実施例 4 本発明の培養物の至適 p H

本発明の培養物と各基質との反応に際して、緩衝液として、 pHに応じて、 0. 2M ダリシン水酸化ナトリゥム緩衝液（pH l l . 5， ρΗ Ι Ο. 5, pH9. 5) 、 0. 2M トリス塩酸緩衝液（ρΗ Ι Ο. 0， pH 9. 0, p H 8. 0， p H 7. 0) 、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 5, pH 7. 0, pH 6. 5, pH 6. 0, pH 5. 5) 、 0. 2 M 酢酸ナトリゥム緩衝液（pH 5. 5, p H 5. 0, p H 4. 5， p H 4. 0， p H 3. 5 ) 並びに 0. 2 M グリシン塩酸緩衝液（pH4. 0, p H 3. 5, pH 3. 0, pH 2. 0) を用いた。

o—ァミノフエノールを基質とする場合、前記実施例 2と同様の培養物溶液 0. 02m 1 と、前記各種緩衝液 0. 88m lと、 50mM o—アミノフェノールのジメチルスルホキシド溶液 0. 1 m 1 とをマイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、 420 nmにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（J a s c o) 社製、商品名： V— 530〕で測定することにより、活性を評価した。また、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合、前記 o—ァミノフエノールを基質とする場合において、 50mM o—ァミノフエノールのジメチルスルホキシド溶液の代わりに、 5 OmM 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液を用い、同様の操作を行ない、 470 η mにおける吸光度の変化を測定することにより、活性を評価した。

p—フエ二レンジアミンを基質とする場合、反応に際して、緩衝液として、 pHに応じて、 0. 1M トリス塩酸緩衝液（pH9. 0, pH 8. 5， p H 8. 0， pH 7. 5， pH7. 0) 、 0. 1 M リン酸ナトリウム緩衝液（p H 9. 0, 8. 5, 8. 0, p H 7. 5， p H 7. 0, pH 6. 5, p H 6. 0) 、 0. 1 M クェン酸ナトリウム緩衝液（pH8. 0, pH 7. 5, p H 7. 0， pH 6. 5， p H 6. 0, pH 5. 0 pH4. 0, pH 3. 0) を用いた。前記培養物溶液 5 ^ 1と、前記各種緩衝液 0. 895 m l と、 1 0 OmM p—フエ二レンジァミンの水溶液とをマイクロキュべッ卜中にて十分混合し、得られた混合物について、 490 nmにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（ J a s c o) 社製、商品名： V— 5 30〕で測定することにより、活性を評価した。

なお、前記活性は、 1分間に、吸光度を 1増加させる量を 1単位（U ;ュニット）とした。その結果を図 3に示す。なお、図 3において、最大活性を 10 0として、相対活性で示す。また、図のパネル Aは、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合を示し、パネル Bは、 o—ァミノフエノールを基質とする場合を示し、パネル Cは、 p _フエ二レンジアミンを基質とする場合を示す。

図 3に示されるように、本発明の培養物は、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 6. 0、 0—ァミノフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 6. 0、 p—フエ二レンジアミンを基質として用いた場合、至適 pHは、 6. 5〜8. 0であることがわかった。実施例 5 本発明の培養物の p H安定性

前記実施例 2と同様の培養物溶液 0. 02m lと、 pH2〜 l l . 5の各種緩衝液 0. 1 8m l とを混合して、 30°Cで 1時間又は 20時間インキュペートすることにより、前処理を行なった。前処理に際して、緩衝液として、 pHに応じて、 0. 2M グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH 1 1. 5， ρΗ Ι Ο. 5 , ρ Η 9. 5) 、 0. 2 Μ トリス塩酸緩衝液（ ρ Η 9. 0， ρ Η 8. 0) 、 0. 2Μ リン酸ナトリウム緩衝液（ρΗ 7. 0, pH 6. 0) 、 0. 2 Μ

酢酸ナトリウム緩衝液（Ρ Η 5. 0, ρΗ4. 0) 並びに 0. 2Μ グリシン塩酸緩衝液（ρΗ 3. 0, ρΗ2. 0) を用いた。

ついで、前処理後の培養物溶液 0. 02m l と、前記緩衝液 0. 88m 1 と、 50mM o—ァミノフエノールのジメチルスルホキシド溶液 0. 1 m lとを、マイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、 420 nmにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（ J a s c o) 社製、商品名： V— 530〕で測定することにより、活性を評価した。また、 2， 6 —ジメトキシフエノールを基質とする場合、前記 o—ァミノフエノールを基質とする場合において、 50mM o—ァミノフエノールのジメチルスルホキシド溶液の代わりに、 50mM 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液を用い、同様の操作を行ない、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより, 活性を評価した。なお、前記活性は、 1分間に、吸光度を 1増加させる量を 1 単位（U ;ユニット）とした。その結果を図 4に示す。なお、図 4において、最大活性を 1 00として、相対残存活性で示す。また、パネル A及び Bは、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質とする場合を示し、パネル C及び Dは、 o— ァミノフエノールを基質とする場合を示す。さらに、パネル A及び Cは、 1時間後の pH安定性を示し、パネル B及び Dは、 20時間後の pH安定性を示す図 4に示されるように、本発明の培養物は、 1時間処理の場合、 pH6. 0 〜 1 0. 0で安定であり、 75 %の相対残存活性が保持されていた。また、 2 0時間処理の場合、 pH7. 0〜9. 0の範囲で安定であり、 7 5 %の相対残存活性が保持されていた。実施例 6 本発明の培養物の基質特異性

培養物溶液の基質特異性を調べるために、 p—フエ二レンジァミン、 4ーヒドロキシインド一ル、 2—メトキシフエノール、 2, 6—ジメトキシフエノール、カテコール、 p—アミノフエノール、 0—ァミノフエノール、 ABTS、シリンガルダジン及び L一夕イロシンを基質として用い、基質特異性を調べた具体的には、前記培養物溶液 0. 05m l と、 0. 1 M リン酸ナトリウム緩衝液（PH7.0) 0. 8 5m 1 と、基質溶液（L一夕イロシンは、 1. lm M、シリンガルダジンは、 ImMの濃度で使用し、その他は、 50mMの濃度で使用した） 0. lm 1 とをマイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、 4 2 0 n mにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ ( J a s c o ) 社製、商品名： V— 5 3 0〕で測定することにより、活性を評価した。なお、前記活性は、 1分間に、吸光度を 1増加させる量を 1単位 ( U ;ユニット）とした。その結果を表 1に示す。測定波長

U

(nm)

p —フエ二レンジァミン 4 7 0 0 · 1 0 1

4ーヒドロキシィンドール 4 7 0 0 . 0 7 8

2 —メトキシフエノール 4 7 0 0 . 1 1 7

2 , 6—ジメトキシフエノール 4 7 0 0 . 8 3 0 カテコール 4 0 0 0 . 0 2 9

P—ァミノフエノール 4 0 0 0 . 0 7 2 o—ァミノフエノール 4 2 0 0 . 2 6 2

A B T S 4 2 0 0 · 6 8 3 シリンガルダジン 5 3 0 0 . 1 4 1

L—夕イロシン 4 9 0 0 . 0 1 8 表 1の結果より、本発明の培養物は、フエノールォキシダーゼ様活性を有することがわかった。

次に、実施例 1の（2 ) で得られた培養物の基質特異性について、培養物の作用により生じた種々の基質の化学的変化を、各基質を含有した緩衝液の吸光度の変化を測定することにより調べた。

基質として、市販の色素（エバンスブルー、アシッドブルー 8 0、レマゾールブリリアントブルー R、インディゴカルミン、アシッドバイオレット 1 7 、ナチュラルオレンジ）、並びにリグニン（商品名：リグニンアルカリ、東京化成社製）を用いた。なお、各基質についての終濃度及び測定波長を、表 2に示す。仑タ '、' rtF

測疋牧 R 纖 (g/ml) (ηπι) ァゾ系色素エバンスブルー 0.007 600

ァシッドブル一 80 0.03 600 アントラキノン系色素

レマゾールブリリアントブル一 R 0.23 600 ィンディゴカルミン 0.005 600 その他の色素ァシッドバイオレツト 1 7 0.01 550

ナチュラルオレンジ 6 0.03 450 リグニン 1.00 450 具体的には、表 2に記した終濃度となるよう調整した基質を含有した 1 0 5. 3mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) 9 5 0 1 を 2 5 °Cで、 5 分間プレインキュペートし、ついで、得られた産物に、培養物溶液 5 0 1 を添加して、キュベット内で反応させ、各基質についての測定波長での吸光度を分光光度計（島津製作所社製、商品名： UV- 2450 ) を用いて測定した。比較のために、ミロセシウム属菌類由来のピリルビンォキシダーゼについても、上記の緩衝液を、 1 0 5. 3mM トリス塩酸緩衝液（pH 8. 0) に置き換えて, 同様に調べた。

なお、活性の 1単位〔U (ユニット）〕は、 1分間に吸光度を 1減少させる量とした。培養物による活性について、各基質の比活性（UZmg タンパク質）を表 3に示す。なお、表 3中、符号なしで表記された比活性は、分解活性又は脱色活性であることを示し、一（マイナス）により表記された比活性は、重合活性であることを示す。表 3

某 ® 測定波長比活性（UZm gタンパク質）

(nm) 培養物ミ Dセシウム属菌類由来

f リル!:'ン才キシタ' -セ' 反応 p H o 0 . U

7 . 0

ァゾ系色素

エバンスブルー 6 0 0 0 . 3 2 1 . 2 2 アントラキノン系色素

ァシッドブルー 8 0 6 0 0 0 . 3 0 0 . 3 9 レマソ' -ルフ'リリアントフ'ル - R. 6 0 0 0 . 9 7 - 0 . 1 8 その他の色素

ィンディゴカルミン 6 0 0 一 0 . 2 2 0 . 4 6 ァシッドバイオレツト 1 7 5 5 0 0 . 1 2 - 0 . 4 0 ナチュラルオレンジ 6 4 5 0 一 0 . 1 8 一 0 . 1 1 リグニン 4 5 0 0 . 7 3 一 1 . 6 3 表 3に示されるように、本発明の培養物は、中性条件下でァゾ系色素、アントラキノン系色素及びアシッドバイオレット 1 7の酸化的脱色反応、リグニンの酸化的分解反応、ィンディゴカルミン及びナチュラルオレンジ 6の酸化的重合反応を触媒することがわかった。特に、レマゾ一ルブリリアントブルー尺の酸化的脱色反応及びリグニンの酸化的分解反応を強く触媒した。また、本発明の培養物は、比較のために用いたミロセシウム属菌類由来ピリルビンォキシダ —ゼとは、レマゾ一ルブリリアントブルー R、インディゴカルミン、アシッドバイオレット 1 7、リグニンに対する特異性が大きく異なる。

次に、前記実施例 1の（2 ) で得られた培養物の酸化的カップリング反応について、本発明の培養物が触媒する、基質（水素供与体）と 4ーァミノアンチピリンとの酸化縮合による発色を指標として測定した。

水素供与体として、フエノール化合物（フエノール、 2—メトキシフエノール、 2 , 6—ジメトキシフエノ一ル、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、ピロガロール、没食子酸、没食子酸プロピル、 1 _ナフトール、力テキン）、ァミノフエノール化合物（o—ァミノフエノール、 m—ァミノフエノール、 p—ァミノフエノール）、ジァミノフエノール化合物（o _フエ二レンジァミン、 m—フエ二レンジァミン、 p —フエ二レンジァミン）、及び複素環化合物（ 5 —ヒドロキシインドール、 2 , 6—ジァミノピリジン）を用いた。

4 _アミノアンチピリンと、任意の水素供与体とを含む反応系に、前記培養物溶液を添加した後、フエノール化合物、ジァミノフエノール化合物及び複素環化合物については、 4 9 0 n mにおける吸光度の変化、ァミノフエノール化合物については、 4 5 0 n mにおける吸光度の変化を測定することにより、本発明の培養物の活性を測定した。また、水に対して難溶な基質に対しては、該基質を、少量のジメチルスルホキシドに溶解させ、目的とする濃度まで脱ィォン蒸留水で希釈したものを用いた。各基質の測定波長と終濃度を表 4に示す。なお、表 4中、 D M S Oは、ジメチルスルホキシドの略称である。

表 4

測定波長終濃度（mM)

( n m)

フエノール系化合物

フエノール 490 2 0

2—メトキシフエノール 490 2 0

2, 6—シ 'メトキシフエノ-ル 490 2 0

カテコール 490 2 0

レゾルシノール 490 2 0

ヒドロキノン 490 2 0

ピロガロール 490 2 0

没食子酸 490 2 0

没食子酸プロピル 490 2 0

(DMS 01 %) 1一ナフトール 490 2. 0

(DMS 01 %) カテキン 490 2. 0

(DMSO 1 %) ァミノフエノール系化合物類

o—ァミノフエノール 450 2. 0

(DMSO 1 %) m—ァミノフエノール 450 2. 0

(DMSO 1 %)

P—ァミノフエノール 450 2. 0

(DMSO 1 %) ジァミン系化合物類

o—フエ二レンジァミン 490 2. 0

m—フエ二レンジァミン 490 2. 0

p—フエ二レンジァミン 490 2. 0

複素環化合物

5—ヒドロキシインドール 490 2. 0

(DMSO 1 %)

2, 6—ジァミノピリジン 490 2. 0

(DMSO 1 ) 表中、「％」は、体積/体積％を示す。

具体的には、 96穴のマイクロプレート〔コ一二ング（C o r n i n g) 社製、 C o s t o r (登録商標） 3368〕のゥエル内で、 0. 4 ^mo 1の基質と 4. 0 mo 1の 4ーァミノアンチピリンとを含有した 1 05. 3mM リン酸緩衝液（pH7. 0) 1 90 / lを、 25°Cにて、 1 分間プレインキュペートした。ついで、得られた混合物に、前記培養物溶液 1 0 ^ 1を添加し、 1時間インキュベートした。得られた産物について、 490 nm又は 45 0 nmの吸光度の変化を測定した。なお、酸化カップリング反応に関する活性は、 1分間に吸光度を 1増加させる量を 1単位（U；ユニット）とした。

また、比較のために、ミロセシウム属菌類由来ピリルビンォキシダ一ゼについても、前記緩衝液を、 10 5. 3mM トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) に置き換えて、同様に調べた。各基質に対する比活性（U/mg タンパク質）を表 5に示す。

表 5

比活性（UZmgタンパク質）

培養物ミロセシウム属菌類由来

ヒ'リルビン才キシダ -セ'

ノエノノ―ノしレ玄¾ル1u口

. 一ノ Jし

レ o Q · 1丄 0リ · Q

乙 9—— k土十 " ノ iノ /一ノ Iしレ 1 A o ϋ

2， 6-ジ卜キシフエノ一リレ 1丄 R o · 丄丄 1 乙 * リ

千つ― ]|

ノ J ノ "^ ノレ Q · π

レ、ノ /Ίノし、ノノーノ Jしレ 7

し π ± ノ z、ノ 9

ド \ _ dノガ D—ノル · 9 — 27

没食子酸 o Q 14. 9

奇子酸プロル一 0 2 一 0 1

—十フ卜一ル 1 s 1 0

カテキン 14. o 4. 6

アミノフ Iノ-ル系化合物類

0—ァミノフエノール 22. 4 1 5. 1

m—ァミノフエノール 8. 8 1. 3

p_アミノフエノール 12. 7 7. 0

ジァミン系化合物類

0—フエ二レンジァミン 1 5. 1 4. 5

m—フエ二レンジァミン 29. 7 1. 7

p—フエ二レンジァミン 20. 9 1 1. 1

複素環化合物

5—ヒドロキシィンドール 4. 7 1. 9

2, 6—ジァミノピリジン 37. 7 2. 3 表 5に示されるように、本発明の培養物は、中性条件（pH 7. 0) 下で種々のフエノール化合物、ァミノフエノール化合物、ジァミノフエノール化合物と、ァニリン化合物の 4ーァミノアンチピリンとの酸化的カツプリング反応を触媒した。フエノール化合物に関しては、没食子酸及び没食子酸プロピル以外の化合物に対して高い活性が見られた。なかでも、 2—メトキシフエノール， 2 6—ジメトキシフエノール、カテコール、 1—ナフトール、カテキンに対して、特に高い活性が見られた。ァミノフエノール化合物に関しては、すべての化合物に対して高い活性が見られた。なかでも、 O—ァミノフエノール及び P—ァミノフエノールに対して、特に高い活性が見られた。ジァミノフエノール化合物に関しては、すべての化合物に対して高い活性が見られた。複素環化合物に関しては、すべての化合物に対して高い活性が見られた。なかでも、 2 , 6—ジァミノピリジンに対して、特に高い活性が見られた。

また、表 5に示されるように、本発明の培養物は、ミロセシウム属菌類由来ピリルビンォキシダーゼとは、基質特異性が大きく異なっており、比活性も高いことがわかった。

さらに、前記実施例で得られた培養物の直接的酸化反応について、本発明の培養物が基質に直接作用することによって生じる、基質の酸化重合による発色を指標として測定した。

基質として、ジァミノフエノール化合物（2 —クロ口 1 , 4—フエ二レンジァミン、 p —フエ二レンジァミン、 2 , 5—ジァミノトルエン、 N—フエニル一 P—フエ二レンジァミン、トルィレン一 3 , 4—ジァミン、 m—フエ二レンジァミン）、ァミノフエノール化合物（o—ァミノフエノール、 m—アミノフエノ一ル、 5—ァミノ _ o—クレゾール、 p—ァミノフエノール、 p—メチルアミノフエノール）、及びフエノール化合物（2 , 6 —ジメトキシフエノール、力テコ一ル、レゾルシノール、ヒドロキノン、ピロガロール、没食子酸、没食子酸プロピル、 1—ナフトール、 1 , 5—ジヒドロナフ夕レン、 2 , 3， 4—トリヒドロキシベンゾフエノン、 2 , 3 , 4 , 4 —テトラヒドロキシベンゾフエノン）を用いた。水に対して難溶な基質に対しては、該基質を、少量のジメチルスルホキシドに溶解させ、目的とする濃度まで脱イオン蒸留水で希釈したものを用いた。各基質の測定波長と終濃度とを、表 6に示す。なお、表 6中、「％」は、体積/体積％を示す。基質測定波長（ n 終濃度（mM) m)

ジァミン系化合物類

2—クロ口 1， 4一フエ二レンジァミン 490 0. 50 mM

(DMS O 1 %) p—フエ二レンジアミン 490 0. 50 mM

(DMS〇 1 %)

2， 5—ジァミノトルエン 490 0. 50 mM

(DMS O 1 %)

N—フエ二ルー p—フエ二レンジァミン 490 0. 50 mM

(DMS O 1 %) 卜ルイレン _ 3， 4—ジァミン 490 0. 25mM

(DMS O 1 %) m—フエ二レンジァミン 405 0. 50 mM

(DMS O 1 %) ァミノフエノール系化合物類

o—ァミノフエノール 450 0. 5 OmM

(DMS O 1 %) m—ァミノフエノール 405 0. 50 mM

(DMS O 1 )

5—アミノー o—クレゾール 450 0. 50 mM

(DMS O 1 %)

P—ァミノフエノール 450 0. 50 mM

(DMS O 1 %)

P—メチルァミノフエノール 450 0. 50 mM

(DMS O 1 %) フエノール系化合物類

2， 6—ジメ卜キシフエノール 450 0. 50 mM

(DMS O 1 %) カテコール 405 0. 50 mM

(DMS O 1 %) レゾルシノール 405 0. 50 mM

(DMS O 1 %) ヒドロキノン 405 0. 50 mM

(DMS O 1 %) ピロガロール 405 0. 50 mM

(DMS O 1 %) 没食子酸 405 0. 50 mM

(DMS O 1 %) 没食子酸プロピル 405 0. 50 mM

(DMS O 1 %)

1—ナフトール 405 0. 50 mM

(DMS O 1 %)

1, 5—ジヒドロナフタレン 405 0. 50 mM

(DMS O 1 %)

2,3,4-トリヒドロキシベンゾフエノン 450 0. 25 mM

(DMS O 1 %)

2,3,4，4-テトラヒドロキシベンゾフエノン 450 0. 25 mM

(DMS O 1 %) 具体的には、 96穴のマイクロプレート〔コ一ニング（C o r n i n g) 社製、 C o s t 0 r (登録商標） 3368〕のゥエル内で、 0. 1 mm o 1の基質を含有した 0. 89mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) 1 80 1を、 25°Cで、 1分間プレインキュべ一卜した。ついで、得られた混合物に、前記培養物溶液 20 1を添加した。得られた産物について、基質に応じて、 490 nm、 450 n m又は 405 n mの吸光度の変化を測定した。なお、直接的酸化反応に関する活性は、 1分間に吸光度を 1増加させる量を 1単位（U；ユニット）とした。

また、比較のために、ウルシ由来ラッカ一ゼ及びミロセシウム属菌類由来ビリルビンォキシダーゼについても、同様に pH7. 0における基質特異性を調ベた。

代表的な化学染料である 2—クロ口 1， 4_フエ二レンジアミンを基質とした場合の測定値を 1 00とした、各基質についての相対活性（％) を表 7に示す。

表 7

相対活性（％)

基質培養物ウルシ由来ミロセシウム属菌類由来ラッカ-セ' ヒ'リルビン才キシダ -セ' KJ ' a ( . U 7 ( 7 n ン, ノ糸物類

uu 一 1· ~ \ ^ J -^. i n n u u u u 1 δ

P ノノン R

ノ o 1 49 « 9 乙 9 、 0 ς _ 5 J ^ ノノ kノ 1しレ J Τ "* 44 24

N—フ一レー D—フーレン 1 7 4 q 4 1 0 2 トルィレン— 3, 4 —ジァミン 1 2 0 6 1 4 5 m—フエ二レンジァミン 2 6 4 1 4 ノフエノール系化合物類

o—ァミノフエノーリレ 6 5 0 1 0 3 8 6 m—アミノフエノーリレ 4 0 3 3

5—アミノー 0—クレゾ一ル 1 1 7 1 1 9

D—ァミ— ~»ノフエノ一リレ 2 3 5 1 0 9 7 0

P—メチリレアノフエノール 3 0 4 3 0 8 1 2 2 フエノール系化合物頻

2 , 6—ジメトキシフエノール 2 5 0 2 1 6 9 カテコール 2 1 2 5 レゾルシノール 7 5 2 5 9 1 ヒドロキノン 2 0 2 4 ピロガロール 1 8 4 1 8 7 1 0 4 没食子酸 6 5 9 8 8 没食子酸プロピル 3 4 1 4 8 5

1—ナフトール 1 7 1 7 5 0

1 , 5 —ジヒドロナフ夕レン 6 3 4 7 6 9

2, 3, 4-トリヒドロキシベンゾフエノン 5 3 7 1 7 5 6 2

2 3, 4,4-テトラヒドロキシベンゾフエノン 5 7 1 1 7 9 5 2

表 7に示されるように、本発明の培養物は、中性条件（p H 7 . 0 ) 下で、種々のジァミノフエノール化合物、ァミノフエノール化合物及びフエノール化合物の直接酸化反応を触媒した。ジァミノフエノール化合物に関しては、 m— フエ二レンジァミン以外の化合物に対して高い活性が見られた。なかでも、 P —フエ二レンジァミン及び N—フエ二ルー p —フエ二レンジァミンに対して、特に高い活性が見られた。ァミノフエノール化合物に関しては、 m—アミノフェノール以外の化合物に対して高い活性が見られた。なかでも、 o—アミノフェノール、 p —ァミノフエノール及び P —メチルァミノフエノールに対して、特に高い活性が見られた。フエノール化合物に関しては、 2， 6—ジメトキシフエノール、ピロガロール、 2 , 3 , 4 —トリヒドロキシベンゾフエノン、及び 2 , 3， 4， 4 —テトラヒドロキシベンゾフエノンに対して高い活性が見られた。なかでも、 2， 3， 4—トリヒドロキシベンゾフエノン及び 2 , 3 , 4， 4—テトラヒドロキシベンゾフエノンに対して、特に高い活性が見られた。

また、本発明の培養物は、ウルシ由来ラッカ一ゼと比べて、 p —フエ二レンジァミン、 m—フエ二レンジァミン、 o—ァミノフエノール、 m—ァミノフエノール、 5—ァミノ一 0—クレゾ一ル、 p —ァミノフエノール、 2， 6—ジメトキシフエノール、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、没食子酸、没食子酸プロピル、 2 , 3， 4—トリヒドロキシベンゾフエノン及び 2 , 3 , 4 , 4ーテトラヒドロキシベンゾフエノンに対する活性がより高く、なかでも, m—フエ二レンジァミン、 o —ァミノフエノール、 m—ァミノフエノール、 5 一アミノー o —クレゾール、 2， 6 —ジメトキシフエノール、カテコール、ヒドロキノン及び没食子酸に対する活性がより高い。

また、ミロセシウム属菌類由来ピリルビンォキシダーゼと比べて、 p —フエ二レンジァミン、 2 , 5—ジァミノトルエン、トルィレン一 3 , 4—ジァミン, o—ァミノフエノール、 m—ァミノフエノール、 5—ァミノ一 0—クレゾール， P—ァミノフエノール、 p —メチルァミノフエノール、 2， 6—ジメトキシフェノール、カテコール、ヒドロキノン、没食子酸プロピル、 1 一ナフトール、 2 , 3， 4 —トリヒドロキシベンゾフエノン及び 2 , 3 , 4 , 4—テトラヒドロキシベンゾフエノンに対する活性がより高く、なかでも、 0—アミノフエノール、 m—ァミノフエノール、 5—ァミノ一 0—クレゾール、 2, 6—ジメトキシフエノール、ヒドロキノン、 1一ナフトル、 2， 3， 4—トリヒドロキシベンゾフエノン及び 2, 3， 4, 4—テトラヒドロキシベンゾフエノンに対する活性がより高い。 - 実施例 7 本発明の培養物による染色

(1) 本発明の培養物による染色性

前記実施例 1で得られた培養物による染色試験を行なった。前記培養物により、酸化重合によって、ャク毛束及び羊毛布を染料（p—フエ二レンジァミン及び o—ァミノフエノール）で染色した。すなわち、染料 0. 5 g (2種類の染料を用いる場合は、合計 1. O g) と、増粘剤として、ヒドロキシェチルセルロース（HE C) 0. 75 gと、界面活性剤として、ポリオキシェチレン（20) 硬化ヒマシ油（HC— 20) 1. O gと、乳酸 0. 5 gとを混合し、モノエタノールァミンで pHを 7. 0に調整し、イオン交換水で重量を 50 gにし、基材を得た。

前記基材 2 gと前記培養物溶液（3. 5U相当量）とを混合し、得られた混合物を、ャク毛束 1 gと羊毛布 1枚（2 X 3 c m) とに対して、塗布した。塗布後のャク毛束及び羊毛布のそれぞれを、 30°Cで 1時間保持した。なお、前記培養物溶液における活性は、 30mM p—フエ二レンジアミンを基質として用い、 pH7. 0、 25 の条件下での活性である。

染色されたャク毛束及び羊毛布について、色差計（ミノル夕社製、商品名： Chromometer CM-3610d) を用いて、 L値、 a値、 b値を測定した。ついで、前記 L値、 a値、 b値に基づき、式 1 : £= ( ²+( 3)²+(/^)² にょり、厶 E値を算出し、かかる ΔΕ値により、染色性を評価した。なお、前記 ΔΕ値は、染色前のャク毛束及び羊毛布の色調と、染色後のャク毛束及び羊毛布の色調色差を示している。なお、比較のために、ウルシ由来ラッカーゼについても, 同様に染色試験を行なった。各基質に対する Δ E値を表 8に示す。表 8 ャク毛束羊毛布

酵素なし 9. 39 8. 02

ウルシ由ラッカ-セ' 43. 66 49. 58

P-フエ二レンシ'ァミン (34. 27) (41 . 56)

培養物 42. 22 44. 53

(32. 83) (36 . 51)

酵素なし 1 6. 84 14. 74

ウルシ由ラッカ-セ' 43. 9 1 38. 27

0—ァミノフエハル (27. 07) (23. 53)

培饕物 45. 63 48. 20

(28. 79) (33. 46)

酵素なし 20. 23 14. 0 1

0-アミノフエノ-ル + ウルシ由来ラッカ-セ' 33. 26 41. 35

P -フエ二レンシ'ァミン (13. 03) (27. 34)

培養物 33. 23 39. 17

(13. 00) (25. 16)

酵素なし 20. 52 10. 59

0—アミノフエノ-ル + ウルシ由来ラッカ-セ' 32. 66 26. 30

m-フ 1こレンシ'ァミン (12. 14) (1 5. 7 1)

培養物 38. 38 45. 54

(17. 86) (34. 95) 表 8に示すように、本発明の培養物によれば、ャク毛束及び羊毛布に対して，いずれの染料の組み合わせでも明らかな染色性が認められた。また、本発明の培養物によれば、比較のために用いたウルシ由来ラッカーゼとは、 P—フエ二レンジァミン単独、 O—ァミノフエノール + P-フエ二レンジァミンにおいて、染色性はやや劣るが、 O _アミノフエノール単独及び O—ァミノフエノール + m—フエ二レンジァミンにおいては、明らかに染色性に優れることがわかった _c

(2) 本発明の培養物の使用量の検討

前記実施例 1で得られた培養物の使用量を変化させ、本発明の培養物による染色試験を行なった。本発明の培養物により酸化される染料（0—ァミノフエノール）を用いて、ャク毛束及び羊毛布を酸化重合によって染色し、色差計を用いて、 L値、 a値、 b値を測定した。具体的には、染料（基質）として、 0—ァミノフエノール 0. 5 gと、力ップラーとして、 m—フエ二レンジァミン 0. 5 gと、増粘剤として、ヒドロキシェチルセルロース（HEC) 0. 7 5 gと、界面活性剤として、ポリォキシエチレン（20) ヒマシ油（HC— 20) 1. 0 gと、乳酸 0. 5 gとを混合を混合し、モノエタノールァミンで pHを 7. 0に調整し、イオン交換水で重量を 50 gにし、基材を得た。

また、ャク毛束 l gと羊毛布 1枚（2 X 3 cm) に対して、前記基材 2 g と、タンパク質量として、 0から 0. 8mgになるように調整した培養物溶液とを混合し、得られた混合物を、ャク毛束 l gと羊毛布 1枚（2 X 3 cm) とに対して、塗布した。塗布後のャク毛束及び羊毛布のそれぞれを、 30°Cで 1 時間保持した。

染色されたャク毛束及び羊毛布について、色差計（ミノルタ社製、商品名： Chromometer CM-3610d) を用いて、 L値、 a値、 b値を測定し、 ΔΕを算出した。染色性は、 ΔΕ値により評価した。本発明の培養物の使用量による ΔΕ 値の変化を図 5に示す。図 5のパネル Aは、ャク毛束を用いた結果、パネル B は、羊毛布を用いた場合の結果を示す。

図 5に示されるように、ャク毛束及び羊毛布において、本発明の培養物の使用量を増加させることにより、 ΔΕ値は増加し、ャク毛束における ΔΕ値は、 0. 2mg タンパク質相当量の本発明の培養物によって一定値に達し、羊毛布における ΔΕ値は、 0. 5mg タンパク質相当量の本発明の培養物によつて一定値に達した。実施例 8 フエノールォキシダーゼ様活性の誘導条件の検討

(1) 菌体の培養

前記実施例 1 (1) で得られた培養物（液体培養物）を、弱酸性から弱アル力リ性までの範囲の 5つの培養 pH条件（初期 pH： pH 5. 0、 pH 6. 0、 p H7. 0、 pH8. 0、 pH9. 0) の液体培養用培地 2 (実施例 1記載の培地）で培養し、酸化活性（フエノールォキシダ一ゼ様活性誘導）の差異を調べた。前記液体培養物をよく撹拌し、得られた培養物 0. 5m lを、 100m lの活性誘導培地に添加し、 28°Cの恒温槽内で、振盪培養（振盪速度 1 30回転ノ分）を 10日間行なった。

毎日、 lm 1ずつ培養物を採取し、 4°C、 12, 000 r pmで 5分間遠心分離し、上清を D I SM I C— 25 c s (0. 20 /x m) で濾過することにより、菌体を除去した。

得られた試料を 4 °Cで保存した。

(2) 培養 pH条件による活性誘導の変化の検討

前記（1) で得られた各試料のフエノールォキシダーゼ様活性を測定することにより、培養 pH条件による活性誘導の変化を調べた。

フエノールォキシダ一ゼ様活性の測定は、基質として、 2, 6—ジメトキシフェノールを用い、 PH6. 0の反応 pH条件下に、フエノールォキシダーゼ様活性を測定した。

50 OmM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 6. 0) 0. 2 Om lと、脱ィオン蒸留水 0. 65m lと、 50mM 前記基質溶液 0. 10m lと、培養物 0. 05m lとを、セミマイクロキュベットに添加し、撹拌し、室温下、商品名： UV— 2400 (島津製作所製）で、 0〜30秒の 470 nmにおける吸光度の変化を測定した。培養 pH条件による活性誘導の変化を図 6に示す。その結果、図 6に示されるように、用いた培地の pHが高くなるほど、 2, 6 ージメトキシフエノールの反応至適 pHである pH 6. 0における酵素活性が高くなることがわかる。特に、用いた培地の pHが、 pH7. 0 (培養時 pH7. 3前後）を超える値である場合、 2， 6—ジメトキシフエノールの反応至適 pH である p H 6. 0における酵素活性が高くなることがわかる。

一方、用いた培地の pHが、 pH5. 0である場合、菌体を 10日間培養しても、 2, 6—ジメトキシフエノールに対する酵素活性は認められなかった。また、図 6に示されるように、用いた培地の pHが、 pH9. 0である場合、培養 10日目における活性は、用いた培地の PHが、 pH6. 0である場合の培養 10日目における活性に比べて、約 10倍（0. 283/0. 027) 活性が高いことがわかる。

したがって、培養物におけるフエノールォキシダ一ゼ様活性は、 PH7. 0を超える pHの培地を用いることにより、より誘導されることがわかる。試験例

(1) 菌体の培養

大豆 250 gをミキサーで破砕し、得られた破砕物を、 1 L容ナス型フラスコに入れ、さらに、へキサン 750m lを添加した。得られた混合物を、へキサンが淡黄色に変化するまでガラス棒で撹拌した後、オイルバスで 85 で加熱した。加熱開始から 1時間後、加熱を終了させ、得られた産物を、アドバンテツク（ADVANTEC) 社製、 No. 2ろ紙で濾過した。

その後、得られた濾物をさらに吸引濾過した。ドラフト内で 24時間放置して、へキサンを蒸発させ、得られた大豆粕を乾燥させた。

ついで、培地（組成： 2. 0重量％グルコース、 1. 0重量％スクロース、

2. 0重量％大豆粕、 0. 5重量％コーンスチ—プリカ一、 0. 1重量％ K₂HP〇₄、 0. 05重量％ Mg S〇₄ ' 7H₂〇、 10 τノ m 1、 F e C 1 , · 6H₂0、 pH 6. 0) を調製した。なお、かかる培地は、特開昭 60— 1 56

385号公報に記載の培地である。

前記実施例 1 (1) で得られた培養物（液体培養物） 0. 2m lを、前記培地 30m 1が入った 300m 1容三角フラスコに添加し、 28 °Cの恒温槽内で、振盪培養（振盪速度 1 30回転分）を 4 日間行なった。ついで、得られた培養液を、前記培地 30 Om 1が入った 2 L容三角フラスコに添加し、 20〜2 5°Cの室温条件下で、振盪培養（振盪速度 130回転分）を 4日間行なった。培養終了後、培養液を、アドバンテック（ADVANTEC) 社製、 No. 2 ろ紙を用いて、吸引濾過し、菌体を除去した。その後、得られた濾液を 4 、 1 4, 800 r pm (30, 000 X g ) で 30分間遠心分離し、上清を培養物として得た。得られた培養物は、 4T:で保存した。

(2) 反応 pH条件による酵素活性の変化

フエノールォキシダーゼ様活性の測定には、基質として、 2， 6—ジメトキシフエノール及び P—フエ二レンジァミンのそれぞれを用いた。また、フエノールォキシダーゼ様活性の測定において、 pH2. 5〜4. 0ではグリシン塩酸緩衝液、 pH4. 0〜5. 5では酢酸ナトリウム緩衝液、 pH5. 5〜7. 5ではリン酸ナトリウム緩衝液、 pH7. 5〜8. 5ではトリス塩酸緩衝液、 pH8. 5 〜1 1. 0ではグリシン水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。なお、 p—フエニレンジァミンを基質として用いる場合、フエノールォキシダーゼ様活性の測定の際、 PH3. 0〜7. 0において、クェン酸ナトリウム緩衝液を用いた測定も行なつた。

50 OmM 前記緩衝液 0. 2 Om 1と、脱イオン蒸留水 0. 65m lと、 5 OmM 前記基質溶液 0. 10m lと、培養物 0. 05m lとを、セミマイクロキュベットに添加し、撹拌し、室温下、商品名： UV— 2400 (島津製作所製）で、 0〜30秒の 470 nmにおける吸光度の変化を測定した。なお、前記実施例 1で得られた本発明の培養物についても同様にフエノールォキシダーゼ様活性を測定した。これらの結果を図 7に示す。

その結果、実施例 1で得られた本発明の培養物（図 7のパネル C及びパネル D) の場合に比べ、前記（1) で得られた培養物（図 7のパネル A及び B) の場合は、いずれの基質を用いた場合にも、酸性側に至適 pHを有することが示された。

したがって、本発明の培養物におけるフエノールォキシダーゼ様活性と、 pH 6. 0の条件下に培養して得られた培養物のフェノールォキシダーゼ様活性とは、明らかに異なることがわかる。処方例

以下に、本発明に係る染色用組成物の処方例を示す。以下の組成物を白髪の毛髪に適用すると、白髪を目立たなく染色することができる。なお、配合量は重量％である。処方例 1 (ジエルタイプ）

p—フエ二レンジァミン 5

0 3

m—メ夕ァミノフエノール 0 1

実施例 1 (2) の培養物 0 1

ァスコルビン酸ナトリウム 0

ヒドロキシェチルセルロース 0

クェン酸

モノエタノールァミン H 7に調整

精製水残部

合計 1 00. 0 処方例 2 (クリームタイプ）

P—フエ二レンジァミン 0

P—ァミノフエノール 0. 8

m—ァミノフエノール 0. 1

セ夕ノール 6. 0

実施例 1 (2) の培養物 0. 0 5 ポリオキシエチレン（20) セチルエーテル 4. 0 塩化ステアリルトリメチルアンモニゥム 1. 0

L一システィン塩酸塩 0. 2 クェン酸適量モノエタノールァミン pH7に調整精製水残部合計 100. 0 処方例 3 (クリームタイプ）

5, 6—ジヒドロキシインドリン 1. 0

5， 6—ジヒドロキシインドール— 2—カルボン酸

0. 5 o—ァミノフエノール 0 エタノール 5 ステアリルアルコール 1 実施例 1 (2) の培養物 0 ポリオキシエチレン（40) 硬化ヒマシ油 3 ポリグリセリン脂肪酸エステル 4 N—ァセチルシスティン 0 キサンタンガム 0 アキユリン（登録商標） 22 0 ヒドロキシェチルセルロース 0 モノイソプロパノールァミン

モノエタノールァミン

精製水残部合計 100. 0 処方例 4 (エアゾールタイプ）

トルエン— 2 , 5—ジァミン 1 5

P—アミノフエノール 0 2

0 1

m—ァミノフエノール 0

ポリオキシエチレン（ 1 5 ) セチルエーテル 2 0

プロピレングリコール 5 0

亜硫酸ナトリウム 0 3

モノエタノールァミン

クェン酸

実施例 1 ( 2 ) の培養物 0 . 3

液化石油ガス 4 . 0

精製水残部

合計 1 0 0 . 0 産業上の利用可能性

本発明の培養物によれば、繊維や毛髪の染色、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフエノール化合物の除去、内分泌攪乱物質の分解、フエノール樹脂の製造、人ェ漆塗料の製造、木質の改善等に利用でき、しかも、安価に、かつ簡便に行なうことができる。また、本発明の培養物の製造方法によれば、簡便に、安価に、かつ大量に前記培養物を得ることができる。さらに、本発明の染色方法及び染色用組成物によれば、外界環境条件下おいて種々の染料、特に、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物、フエ二レンジァミン化合物のいずれに対しても至適 p Hに大きな変動がなく、中性付近の p Hで効率よく染色対象物を、安価に、かつ簡便に染色することができ、繊維や毛髪の染色に有用である。

Claims

請求の範囲

1. フエノールォキシダーゼ様活性を有し、かつ下記①〜⑤ ① 式（ I ) ：

に示されるエバンスブルー、式（Π)

に示されるアシッドブル一 8 0、式（III)

S0₂CH₂CH₂OS0₃Na

(in)

に示されるレマゾ一ルブリリアントブルー R、及び式（IV)

③ 式（V ) ：

に示されるインディゴカルミン、及び式（V I )

④ 4ーァミノアンチピリンと、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物、ジアミノフエノール化合物及び複素環化合物からなる群より選ばれた 1種の化合物との酸化的カツプリング反応を触媒する〔酸化的カツプリング活性〕、

、並びに

からなる群より選ばれた少なくとも 1つの基質特異性を有する、フラムリナ^1&11111111111^)属に属する菌類由来の培養物。

2. フラムリナ（Flammulina)属に属する菌類が、エノキダケ（Flam mulina velut ipes)である、請求項 1記載の培養物。

3. エノキダケ (Flammul ina ve 1 ut ipes)力 Flammulina velut ip es IFO 30601株である、請求項 2記載の培養物。

4. p H 7を超える p H条件下で、フラムリナ（F 匪 ul ina)属に属する菌類を培養して、得られた培養液から菌糸体を除去して得られる、請求項 1〜3いずれか 1項に記載の培養物。

5. フラムリナ（Flammul ina)属に属する菌類を pH 7を超える p H条件下で培養して、得られた培養液から菌糸体を除去して得られ、かつフエノールォキシダ一ゼ様活性を有する、フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a)属に属する菌類由来の培養物。

6. フラムリナ（Flammul ina)属に属する菌類を培養し、得られた培養液から菌糸体を除去して、培養物を得ることを特徴とする、請求項 1〜 5いずれか 1項に記載のフラムリナ（Flammul ina)属に属する菌類由来の培養物の製造方法。

7. フラムリナ（Flammulina)属に属する菌類が、エノキダケ（Flam mulina velut ipes)である、請求項 6記載の製造方法。

8. エノキダケ (Flammul ina velut ipes)力 F 1 ammul ina velut ip es IFO 30601株である、請求項 7記載の製造方法。

9. 請求項 1〜5いずれか 1項に記載の培養物の存在下に、染色対象物と染料とを接触させることを特徴とする、染色方法。

1 0. 請求項 1〜 5いずれか 1項に記載の培養物を含有してなる染色用組成物。