WO2004020397A1 - ダイオキシン類の免疫測定用標準品及びダイオキシン類の免疫測定法 - Google Patents

ダイオキシン類の免疫測定用標準品及びダイオキシン類の免疫測定法 Download PDF

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WO2004020397A1
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WO
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immunoassay
dioxin
dioxins
standard
antibody
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PCT/JP2003/010394
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeaki Nishii
Kazuhiro Matsui
Takuya Ishibashi
Masanori Oka
Hiroki Fujihira
Hirotsugu Mishima
Shizuo Kataoka
Original Assignee
Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
Takuma Co., Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06191—Dipeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C235/18—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having at least one of the singly-bound oxygen atoms further bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring, e.g. phenoxyacetamides
    • C07C235/20—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having at least one of the singly-bound oxygen atoms further bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring, e.g. phenoxyacetamides having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites

Definitions

  • the present invention relates to a standard used for immunoassay of dioxins.
  • the present invention also provides a method for immunoassay of dioxins using this standard product, and more specifically, the concentration or toxic equivalent (T EQ) of dioxins in air, exhaust gas, soil, rivers, combustion ash, etc. It relates to a method of calculating by using a dioxin analog as a standard.
  • Dioxins are polychlorinated dibenzo-_-dioxins (po 1 ych 1 orinateddibe nz o-p-di ox ins: PCDD s) and polychlorinated dibenzofurans (pol yc hlorinateddibe nz ofurans: PCDF s) ), And coplanar PCB (Co-PCB s).
  • PCDDs and PCDFs the isomers with chlorine substitution at positions 2, 3, 7, and 8 are highly toxic, and include dermatitis due to chlorine, polyneuropathy, and oculomotor dystrophy. It is known to cause symptoms such as liver dysfunction.
  • endocrine disrupters which have the effect of disrupting endocrine functions of humans and wild animals, have been highlighted as global environmental problems.
  • dioxins are also endocrine disruptors with estrogenic activity Is also known.
  • Dioxins with various toxicities are contained in chemical products such as herbicides and pesticides, exhaust gas and fly ash from garbage incineration plants, and wastewater discharged from paper mills. It is clear. For this reason, dioxins have been detected in biological samples such as food, blood, breast milk, and urine, as well as in environmental samples such as water and sediment, air, and soil in rivers and ports around large cities. Since the widespread contamination of the environment has become a major social problem, it is urgently necessary to ascertain the amount of dioxin exposure in the environment.
  • An immunoassay is a method for detecting or quantifying a small amount of an antigen using the ability of the antibody to specifically recognize the antigen.
  • the antigen is measured with high sensitivity by the high affinity and high specificity of the antibody for the antigen can do. For this reason, sample pretreatment is simple, and the measurement of multiple samples can be performed easily and quickly, and it has various advantages such as low cost for measurement. It has many advantages such as medicine, biochemistry, pharmacy, agriculture, etc. It is used in a wide range of fields.
  • it is necessary to label an antibody or an antigen, and various labeling methods have been developed.
  • EIA enzyme immunoassay
  • EIA the same compound as the object to be measured is used as a standard, measured in the same manner as the specimen, and the compound concentration in the sample is calculated from the obtained standard curve.
  • dioxins are a generic term for isomers with three different chlorine substitutions in a group of compounds having three basic skeletons, so it is problematic which compound is used as a standard.
  • dioxins Since the toxicity of dioxins varies depending on the homologue and isomer, the toxicity of dioxins, which is a mixture of homologues and isomers with different toxicity, depends on the abundance of individual isomers. Simply summing up the amounts of each isomer does not correctly represent the toxicity of dioxins.
  • TEF Toxic Equivalency Factor
  • TEQ Toxic Equivalent
  • the EIA measurement system that mainly measures 2,3,7,8_TeCDD can accurately measure the toxicity of dioxins.
  • the dioxins toxic equivalents (TEQ) in the gas emitted from waste incinerators, which are the major source of dioxins are lower than the 2,3,7,8-Te CDD in the concentration of pentachlorinated dibenzofuran.
  • TEQ toxic equivalents
  • the correlation is high with the concentration of hexachlorinated dibenzofuran.
  • the conventional EIA measurement system may be significantly different from the instrumental analysis values. Thus, the use of the EIA measurement system may be restricted.
  • An object of the present invention is to provide a standard product for immunoassay of dioxins, which does not have a toxic equivalent coefficient (TEF), and a method for measuring the concentration or toxicity of dioxins in environmental samples using this standard product.
  • An object of the present invention is to provide an immunoassay method capable of measuring an equivalent amount simply and with high sensitivity.
  • the present inventor has made the following findings as a result of intensive studies in view of the above circumstances.
  • RR 2 , R 3 , and R 4 are the same or different and each represents a chlorine atom or a hydrogen atom; n represents an integer of 1 to 10; and Z represents an amino acid residue or a peptide.
  • this Cloguchi phenol derivative does not have a Toxicity Equivalent Factor (TEF), it can be safely used as a standard for the measurement of dioxins by using this compound to safely determine the concentration of dioxins in environmental samples and the toxic equivalents. Can be calculated. -The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following compounds.
  • RR 2 R 3 R 4 are the same or different and represent a chlorine atom or a hydrogen atom, n represents an integer of 110, and Z represents an amino acid residue or a peptide.
  • a standard product for immunoassay of dioxins represented by the general formula (1).
  • RR 2 R 3 R 4 are the same or different and represent a chlorine atom or a hydrogen atom, n represents an integer of 110, and Z represents an amino acid residue or a peptide.
  • An immunoassay kit for dioxins comprising the compound according to item 1.
  • kit according to item 3 further comprising an anti-dioxin antibody.
  • kit according to item 3 or 4 further comprising a competitive antigen.
  • the immunoassay is a method selected from an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, and a fluorescence immunoassay.
  • the immunoassay is a method selected from an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, and a fluorescence immunoassay.
  • the amount of the antigen-antibody reaction in the step (1) is determined by combining the compound according to claim 1 with a known concentration with the compound. Calculating the concentration of dioxins contained in the test sample by comparing the amount of dioxins contained in the test sample with the amount of antigen-antibody reaction obtained by reacting the dioxins with the dioxin antibody.
  • the antigen-antibody reaction amount is measured by a method selected from an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, and a fluorescence immunoassay.
  • a standard product for immunoassay of dioxins which does not have a toxic equivalent coefficient (TEF), and a dioxin concentration or a toxic equivalent in an environmental sample which is easily and easily determined using this standard product.
  • TEZ toxic equivalent coefficient
  • An immunoassay that can be measured with high sensitivity has been provided. More specifically, the concentration of dioxins in a sample quantified using the immunoassay standard represented by the general formula (1) of the present invention and the toxic equivalent calculated from this are determined by instrumental analysis to determine the toxic equivalent coefficient. It shows good correlation with the toxic equivalent obtained by the official method for measuring the concentration of dioxin compounds.
  • the toxic equivalent of a test sample can be measured accurately and with high sensitivity. From this, the toxic amount of dioxins in the test sample can be accurately evaluated as compared with the conventional EIA.
  • the toxicity equivalent can be evaluated in a relatively short time.
  • the standard product of the present invention is considered to be a non-toxic compound because WHO has not determined its toxic equivalent coefficient.
  • the compound of the present invention is a derivative obtained by adding a methylene chain and a peptide to a commercially available compound, cloguchi phenol (for example, 2,4,5-trichloromouth phenol), and it is clear from this point that it has no toxicity. Therefore, the use of the compound of the present invention can greatly improve the safety of immunoassay for dioxins.
  • the compounds and methods of the present invention can be widely applied to environmental analysis and the like, and are also useful in analyzing biological samples such as food, breast milk, blood, and urine. Detailed description of the invention Hereinafter, the present invention will be described in detail.
  • the compound represented by the following general formula (1) is a novel compound not described in the literature.
  • RR 2 , R 3 , and R 4 are the same or different and each represents a chlorine atom or a hydrogen atom, n represents an integer of 1 to 10, and Z represents an amino acid residue or a peptide.
  • the number and position of chlorine substitution are not particularly limited, but from the viewpoint of reactivity with an anti-dioxin antibody, a compound having a total substituted chlorine number of 3 or more is preferable. Compounds having a number of 3 are more preferred.
  • the amino acid residue or peptide of Z is not particularly limited as long as the number of constituent amino acid residues is within 100 residues according to the definition of ordinary peptide, but is usually about 1 to 50 residues, particularly about 1 to 10 residues. , More particularly about 1 to 4 residues, and more particularly about 1 to 3 residues. Amino acids or peptides are preferred. If the peptide is too long, its solubility in water will increase, and it will be difficult to dissolve it in an organic solvent during measurement, and precipitation may occur in the reaction solution. However, such a problem does not occur in the above range.
  • R 1 R 2 represents a chlorine atom
  • R 3 and R 4 represent a hydrogen atom
  • n is 2 to 6, and Z is a peptide having about 1 to 4 amino acid residues
  • R 2 and R 3 are chlorine atoms
  • R 2 and R 4 represent a chlorine atom
  • a compound in which 1 and R 3 represent a hydrogen atom, n is 2 to 6, and Z is a peptide having about 1 to 4 amino acid residues
  • R 3 and R 4 represent a chlorine atom
  • R 1 and R 2 represent Compounds which represent a hydrogen atom, n is 2 to 6, and Z is a peptide having about 1 to 4
  • R 1 and R 4 R 2 represents a chlorine atom represent a hydrogen atom, n is 2-6, compound Z is an amino acid residues about 1 to 4 peptide;
  • R 2 Compounds in which R 4 represents a chlorine atom, R 1 and R 3 represent a hydrogen atom, n is 2 to 6, and Z is a peptide having about 1 to 4 amino acid residues are preferred.
  • R 2 R 1 and R 3 R 4 represents a chlorine atom represent a hydrogen atom, n is 5, compound Z is an amino acid residue numbers 1-3 of about amino acid or peptide;
  • R 2 Compounds in which R 3 represents a chlorine atom, R 1 and R 4 represent a hydrogen atom, n is 2, and Z is an amino acid or a peptide having about 1 to 3 amino acid residues are preferred.
  • the compound represented by the general formula (1) can be used as a standard for immunoassay of dioxins because it reacts with an anti-dioxin antibody. Furthermore, since this compound has no toxic equivalent coefficient (TEF), a dioxin immunoassay system that can be safely measured by a measurer can be constructed by using this compound as a standard product.
  • TEZ toxic equivalent coefficient
  • the standard product for measuring dioxins of the present invention is not limited thereto. It can be synthesized by the following method.
  • R 1 R 2 , R 3 , and R 4 are the same or different and represent a chlorine atom or a hydrogen atom, and n represents an integer of 1 to 10.
  • R 1 R 2 R 3 and R 4 are the same or different and each represents a chlorine atom or a hydrogen atom, and n represents an integer of 110.
  • the compound represented by the general formula (1) is obtained by reacting the compound represented by the general formula (3) with a compound having an amino group such as an amino acid or a peptide according to a conventional method.
  • the starting phenol derivative of the general formula (2) which is a starting material, can be synthesized, for example, by the following method. Chlorophenol, potassium carbonate and 6-bromohexanoic acid ester are heated and stirred at 60 ° C. for 16 hours. After completion of the reaction, the mixture is extracted with ethyl acetate and the solvent is concentrated under reduced pressure. The residue is dissolved in ethanol, an aqueous sodium hydroxide solution is added, and the mixture is stirred at room temperature for 3 hours. After completion of the reaction, neutralize with concentrated hydrochloric acid, concentrate the reaction mixture under reduced pressure, add concentrated hydrochloric acid to make it acidic, extract with ethyl acetate, and reconstitute. By carrying out the crystallization, a cloguchi phenol derivative represented by the above general formula (2) is obtained.
  • the kit for immunoassay of dioxins of the present invention contains the compound represented by the general formula (1) of the present invention as a standard for quantifying dioxins.
  • the anti-dioxin antibody may be prepared by the user or included in this kit, but it is convenient to include it in this kit. The anti-dioxin antibody will be described later.
  • the sample when it is to be subjected to a competitive assay method, it may contain a competitive antigen. Competitive antigens are also described below.
  • it may contain a reaction container, a blocking agent for covering the surplus surface of the container, a buffer, and in the case of a kit used for the indirect competition method, a secondary antibody and the like.
  • the method of the present invention is an immunoassay for quantifying dioxins, and uses the compound represented by the general formula (1) as a standard. More specifically, the method of the present invention is an immunoassay for calculating the concentration of dioxins or a toxic equivalent in a test sample, wherein the compound represented by the general formula (1) is used as a standard. It is a method used.
  • the immunoassay for dioxins of the present invention comprises the steps of: (1) measuring the amount of antigen-antibody reaction by reacting a test sample with an anti-dioxin antibody; The amount of the dioxin contained in the test sample was determined by comparing the amount of the dioxin contained in the test sample with the amount of the antigen-antibody reaction obtained by reacting the compound represented by the general formula (1) with a known concentration. And calculating (2).
  • the dioxin immunoassay of the present invention is characterized in that the chlorophenol derivative represented by the above general formula (1) is used as a standard product for dioxins measurement. Can be implemented.
  • the compounds of the present invention can be applied to any known immunoassay.
  • known immunoassays include, for example, enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (R IA), fluorescence immunoassay (FIA) and the like. EIA is preferred for ease of measurement.
  • EIA includes a competitive assay, a non-competitive assay, a homogenous assay, and the like.
  • dioxins are low-molecular-weight compounds, and thus may be generally determined by a competitive assay.
  • the competitive method mainly includes an indirect competitive method in which an antigen is immobilized in a microplate well or a tube, and a direct competitive method in which an antibody is immobilized in a well tube or the like.
  • dioxins or a complex thereof with a carrier-protein is used as a competition antigen immobilized on a well.
  • a complex with a carrier protein When using an untreated reaction vessel made of resin or glass, it is difficult to immobilize dioxins alone in the vessel, so it is preferable to use a complex with a carrier protein.
  • dioxins alone When using a reaction vessel whose surface is activated with a highly reactive functional group such as an amino group or a hydroxyl group, dioxins alone may be immobilized on the vessel via these functional groups. Can be. Regardless of the presence or absence of a carrier protein, it is preferable to bind a linker to dioxins. This alleviates steric hindrance, improves the reactivity between the competitor antigen and the anti-dioxin antibody, and improves the measurement sensitivity of dioxins in the test sample.
  • dioxins for example, polysalt dibenzo-para-dioxin (PCDD), polychlorinated dibenzofuran (PCDF), coplanar polybiphenyl chloride (Cobraner PCB) and the like can be used.
  • PCDD polysalt dibenzo-para-dioxin
  • PCDF polychlorinated dibenzofuran
  • Cobraner PCB coplanar polybiphenyl chloride
  • the carrier protein is not particularly limited, and a known carrier protein can be used without limitation.
  • a carrier protein include KLM (Keyhole impet Hemocyanin) and serum albumin (BSA: Bovine Serum Albumin).
  • a linker that does not cause steric hindrance to antibody binding For example, a polymethylene chain which does not hinder resolvability can be used.
  • the linker is located between the dioxins or dioxin-like compounds or these, the carrier protein and the container.
  • dioxins can be quantified with high sensitivity by using the chlorophenol derivative represented by the general formula (1) of the present invention as a competitive reaction antigen.
  • the amino acid or peptide moiety bound to the terminal of the alternative standard compound represented by the general formula (1) of the present invention is changed to carrier protein such as BSA for solid phase immobilization.
  • An antigen can be made.
  • Antibodies used in EIA are haptenized to dioxins such as polychlorinated dibenzo-paradioxin (PCDD), polychlorinated dibenzofuran (PCDF), and coplanar polychlorinated biphenyl (cobraner PCB) according to known methods
  • PCDD polychlorinated dibenzo-paradioxin
  • PCDF polychlorinated dibenzofuran
  • coplanar polychlorinated biphenyl cobraner PCB
  • a conjugate conjugated to a carrier protein such as E. coli can be prepared as an immunizing antigen by immunizing a mammal (Kun Cae, eta 1., J. Agric Food., 25, 1207). 11209 (1977); Simona G. Merica, eta 1., Can. J. Chem., 73, 826-834 (1995)).
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and is not particularly limited.
  • Monoclonal antibodies are desirable because of the uniformity of the antibodies themselves and the difficulty in producing lot differences during antibody production.
  • Monoclonal antibodies are antibodies obtained from single antibody-producing cells obtained by cloning a hybridoma obtained by fusing spleen cells and tumor cells of mice immunized with haptenized dioxins, but recognize dioxins. Anything should do.
  • the indirect competition method may be performed, for example, as follows. First, the antigen for competition is immobilized in a well of a reaction vessel such as a microplate. Next, the portion of the well surface to which no antigen is bound is blocked with a commercially available blocking agent such as bovine serum albumin or casein. A test sample and an anti-dioxin antibody as a primary antibody are added to this well, and a test sample and a solid-phased antigen are allowed to compete with the antibody.
  • a commercially available blocking agent such as bovine serum albumin or casein.
  • a secondary antibody such as a goat anti-mouse immunoglobulin antibody
  • an enzyme-labeled antibody labeled with an enzyme such as peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase (ALP).
  • HRP peroxidase
  • ALP alkaline phosphatase
  • the ratio of the decrease in the absorbance of the reaction solution due to the addition of the test sample to the absorbance of the reaction solution to which the test sample is not added is measured as the inhibition rate by the sample.
  • the compound represented by the general formula (1) of the present invention was used as a standard for dioxins, and competition was conducted in the same manner except that a plurality of solutions of this standard were used in place of the test sample. Perform the reaction. By preparing a calibration curve showing the relationship between the concentration of the standard and the inhibition rate, and comparing the obtained calibration curve with the inhibition rate of the test sample, the concentration of dioxins in the test sample was converted to the standard equivalent concentration. It can be calculated as
  • an anti-dioxin antibody is immobilized in a well of a container, and a portion of the well to which no antibody is bound is blocked in the same manner as described above.
  • the test sample and the enzyme-labeled antigen are allowed to compete with the solid-phase antibody by adding a competitively labeled enzyme-labeled antigen and a specimen to the well.
  • the enzyme-labeled antigen that has not bound to the antibody is removed by washing, and the substrate of the enzyme used for labeling is added, and the absorbance of the reaction product is measured.
  • Enzyme-labeled antigens can be prepared by binding an enzyme such as peroxidase or alkylophosphatase to the same dioxins or dioxin-like compounds as the competitive antigens used in the indirect competition method.
  • an enzyme such as peroxidase or alkylophosphatase
  • the compound represented by the general formula (1) of the present invention in which the amino acid or peptide moiety present at the terminal is replaced with an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase is used, the sensitivity is low. improves.
  • labeled antigens can be obtained by labeling these compounds with isotopes.
  • a labeled antigen can be obtained by binding a fluorescent substance such as rhodamine or a chemiluminescent substance to these compounds.
  • test sample is not particularly limited, and may be an environmental sample collected from the environment, a biological sample, various products such as food, or a dioxin solution prepared for an experiment.
  • the present invention is a method particularly suitable when an environmental sample is used as a test sample.
  • Environmental samples include, for example, air; exhaust gases from automobiles, equipment, factories, etc .; soil; water from rivers, lakes, and harbors; combustion ash, fly ash, and the like.
  • Biological samples include breast milk, blood, urine, and the like.
  • test sample may be directly subjected to immunoassay, or a dioxin-rich fraction may be extracted from the test sample by pretreatment, but pretreatment is preferably performed.
  • pretreatment methods are exemplified below, but the pretreatment methods are not limited to these.
  • test gas of A (N m 3 )
  • extract the substance in the gas with toluene make the volume to 20 ml, and use it as a crude extract.
  • clean-up was carried out by flowing 200 ml of hexane through a multi-layered sily gel ram containing 1 g of sodium sulfate, 10 g of silver nitrate sily gel and 3 g of sily gel. Then, the solution quantified in 1 ml of DMSO is finally used for immunoassay.
  • TEQ in (ng- TEQ / Nm 3) 0. 0922 X standard terms dioxins concentration (g / N m 3) ° ⁇ 8474 above formula, the value of 0.0922 and 0.8474, the exhaust gas in Examples Concentration of dioxins obtained by the method of the present invention and dioxins obtained by the official method It is a coefficient in the correlation formula between the toxic equivalent and a value determined for each test sample.
  • the conversion of the unit of the dioxin concentration in terms of the standard product may be performed according to the following formula. Standard terms dioxins concentration (g / N m 3)
  • Collect fly ash of B (g), extract the contained compounds with toluene, quantify to 20 ml, and use as crude extract. A 1 ml portion of the crude extract is collected, cleaned up, and finally a solution quantified in 2 ml of DMSO is provided for immunoassay. Toxic equivalents (TEQ) are calculated by substituting the obtained standard-converted dioxin concentrations into the following formula.
  • TEQ (ng-TEQ / g) 0.0038X [Concentration of dioxins converted to standard (g / g)] 796
  • the values of 0.0038 and 0.9796 are the dioxins obtained by the method of the present invention for fly ash in the examples. This is a coefficient in the correlation equation between the class concentration and the equivalent amount of dioxins obtained by the official method, and is a value determined for each test sample.
  • the conversion of the standard dioxin concentration unit may be performed according to the following formula. Standard Dioxin Concentration (/ ig / g)
  • TEQ (ng-TEQ / g) 9.4553X [standard terms dioxins concentration ( ⁇ g / g)] ° - 9352 in the above formula, resulting in the onset bright method for fly ash in the embodiment the value of 9.4553 and 0.9352
  • This is a coefficient in the correlation equation between the obtained dioxin concentration and the dioxin toxicity equivalent obtained by the official method, and is a value determined for each test sample.
  • the conversion of dioxin concentration units in terms of standard products may be performed in the same manner as for fly ash.
  • 2,4,5-trichloromouth phenol (1) (commercially available) 15.0 g (76. Ommo 1), 6-bromohexanoic acid ethyl ester 18.6 g (83.6 mmo 1 ), Potassium carbonate (12.60 g, 91.2 mmol) and anhydrous dimethylformamide (150 ml) were mixed and heated and stirred at 60 ° C overnight. After completion of the reaction, the mixture was cooled to room temperature, the reaction solution was added to 45 Oml of water, and extracted twice with 225 ml of ethyl acetate.
  • Ethyl 6- (2,4,5-trichlorophenoxy) hexanoate (2) was dissolved in 20 mL of ethanol, and 200 mL of a 2N aqueous sodium hydroxide solution was dropped under ice-cooling, The mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After completion of the reaction, neutralize with 7 Oml of concentrated hydrochloric acid, and wash the reaction mixture. Concentrated to half. The concentrated reaction solution was acidified by adding 5 ml of concentrated hydrochloric acid, and extracted once with 100 ml of ethyl acetate and twice with 150 ml.
  • the organic layer was washed with 20 Om of water and 20 Oml of a saturated aqueous sodium chloride solution in that order, and dried over magnesium sulfate.
  • the drying agent was filtered off, and the organic layer was concentrated to obtain 23.3 g of a crude product as a white solid.
  • the crude product was recrystallized by adding 25m1 of isopropyl ether and 5Om1 of n-hexane, and the precipitated crystals were collected by filtration, washed with 1/3 of isopropyl ether Zn-hexane, and then washed with 6- (2, 4,5-Trichlorophenoxy) hexanoic acid (3) was obtained as 21.4 g of white crystals (yield 88.0%).
  • Succinimidyl-6- (2,4,5-trichlorophenoxy) hexanoate hexanoate (4) 2 Omg was dissolved in 10 Om1 of dimethylsulfoxide. Thereafter, 100 ml of a 50 mM aqueous solution of daricyldaricin was gradually added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours to obtain a dioxin standard solution.
  • An antigen for competition measurement was prepared using succinimidyl-6- (2,4,5-trichlorophenoxy) hexanoate hexanoate (4) prepared in Example 1 and bovine serum albumin.
  • First 5 Omm phosphate buffer pH 8. 0
  • BSA bovine serum albumin
  • dimethyl sulfoxide 545.51 was added, followed by a solution of succinimidyl-16 (2,4,5-trichlorophenoxy) hexanoate (BB2-4) in 2OmM ditylsulfoxide 455.51 (40 equivalents (9 . 0 9X 10- 6 mo 1) ) was added dropwise and reacted for 1 hour at room temperature.
  • 4? Dialysis was performed on 83 to obtain an antigen for competition measurement.
  • Exhaust gas from waste incineration plants was collected according to the official method (JIS K0311), and the dioxin concentration in the sample was measured using a high-resolution gas chromatograph mass spectrometer (GC-MS). Approximately 3 Nm 3 of exhaust gas is drawn from the flue of the municipal solid waste incineration facility by suction into a gas sampling device, and the collected sample is collected in a filter paper, resin, absorbent, and other forms such as toluene and dichloromethane. Extracted using an organic solvent. These extracts were combined and concentrated to 2 Om1 to obtain a crude extract.
  • JIS K0311 high-resolution gas chromatograph mass spectrometer
  • the concentration of each dioxin isomer was multiplied by its toxicity equivalency factor (TEF) to calculate the dioxin toxicity equivalent (TEQ) in the exhaust gas sample.
  • TEF toxicity equivalency factor
  • the crude extract lm 1 separately collected was treated with sulfuric acid and subjected to multilayer silica gel chromatography. After purification by graph processing, the organic solvent was evaporated to dryness and transferred to 2 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO) to obtain a sample for EIA evaluation.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the antigen for competition assay prepared in Example 2 was dissolved in PBS to 1 ⁇ g Zm1, and this solution was added to each well of a 96-well Atsey plate (Costar, Cat No. 3590). The plate was dispensed by 10 O 1 each, the plate was sealed with a seal, and the plate was allowed to stand at 4 ° C for 18 hours for solid phase immobilization. After removing the antigen solution, the plate was washed three times with PBS containing 0.05% Tween 20, and a blocking solution (manufactured by Nacalai Tesque) diluted 5 times was dispensed in 300 1 each, and the plate was sealed with a sealer. Blocking was performed by allowing the mixture to stand at CC to prepare a plate for measuring dioxins. Using this plate, immunoassay for dioxins was performed as follows.
  • Example 2 With respect to the dioxin standard prepared in Example 1, a dilution series ranging from 0 to 0.2 gZm1 was prepared with 50% DMS containing 0.01% of Triton X100.
  • the exhaust gas sample prepared in Example 3 was trans-dissolved in DMSO, and then diluted with 50% DMSO containing 0.01% of Triton XI 00 to prepare a measurement sample.
  • a hybridoma producing an anti-dioxin monoclonal antibody was cultured in a carbon dioxide gas culture vessel at 37 ° C for 1 week or more in a serum-free medium, and a culture supernatant was obtained. After purification by affinity chromatography using column A, the mixture was dialyzed in PBS to prepare anti-dioxin monoclonal antibodies.
  • Dioxin standard dilution series and exhaust gas samples were added to the dioxin measurement plate in a quantity of 50 1 each, and 0.2% contained 838?
  • An anti-dioxin monoclonal solution diluted to 0.8 lg / 1 with 83 was added in 50 z portions, and reacted at 4 ° C for 1 hour. After the reaction, the solution added to the well was removed, and the plate was washed three times with PBS containing 0.005% Tween 20, and then diluted to 1: 2000 with PBS containing 0.2% BSA.
  • IgG (H + L) HR P-labeled antibody (affinity-purified, DAKO) 100 1 was. After allowing the plate to stand for 1 hour at room temperature, contains 0.05% of Tween 20?
  • the plate was washed three times with 8 S, and HRP substrate TMB (manufactured by BioFX) was dispensed in 1001 portions to each well, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • a 0.5 M sulfuric acid solution was added to each well in a quantity of 100 M, and the absorbance at a wavelength of 255 nm (control: 65 nm) was measured using a microtiter spectrophotometer.
  • a standard curve (calibration curve) was created from the absorbance data obtained by using the dioxin standard, and the absorbance data for the exhaust gas sample was applied to the standard curve to determine the amount of dioxin in the sample as a standard. It was calculated by converting to substance concentration.
  • B is the absorbance in the presence of the standard
  • B. Is the absorbance in the absence of the standard.
  • the dioxin toxicity equivalent obtained by quantification using GC-MS in Example 3 shows the correlation.
  • the difference between the measured value of the exhaust gas sample using the immunoassay standard of the present invention by the immunoassay method and the toxic equivalent of dioxins calculated by the instrumental analysis method, which is the official method. Good correlation (R 2 0.985) was observed.
  • the dioxin toxic equivalent obtained by quantification using GC-MS in Example 5 and the dioxin concentration in the sample obtained by performing an immunoassay using the standard product of the present invention in Example 6 Figure 4 shows the correlation.
  • R 2 and R 4 represent a chlorine atom and RR 3 represents a hydrogen atom, and the correlation with the official method was examined.
  • R 2, RR 4 R 3 represents a chlorine atom represent a hydrogen atom at 1
  • RR 4 in the general formula (1) for compounds in which R 2, R 3 represents a chlorine atom represent a hydrogen atom When the same operations as those of Examples 2 to 8 were performed, a high correlation was found between the toxic equivalents of dioxins and the official method.
  • FIG. 1 is a diagram showing a synthesis scheme of a standard product for immunoassay of dioxins according to Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing a standard curve obtained using a standard product for immunoassay of dioxins which is one example of the present invention.
  • Figure 3 shows the correlation between the measured amount of dioxin toxic equivalent in exhaust gas by gas chromatography mass spectrometry and the concentration of dioxin in exhaust gas by an immunoassay using the standard product for immunoassay of dioxins of the present invention.
  • Figure 4 shows the correlation between the measured amount of dioxin toxicity equivalent in fly ash by gas chromatography mass spectrometry and the concentration of dioxin in fly ash by the immunoassay using the dioxin immunoassay standard of the present invention.
  • Fig. 5 is a graph showing the correlation between the measured amount of dioxin toxicity in soil by gas chromatography mass spectrometry and the concentration of dioxin in soil by an immunoassay using the dioxin immunoassay standard of the present invention. It is.

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Description

明 細 書 ダイォキシン類の免疫測定用標準品及びダイォキシン類の免疫測定法 技術分野 本発明は、 ダイォキシン類の免疫測定に供される標準品に関する。 また本発明 は、 この標準品を用いたダイォキシン類の免疫測定法、 さらに詳しくは、 大気、 排ガス、土壌、河川、燃焼灰などの中のダイォキシン類の濃度または毒性等量（T EQ) を、 ダイォキシンアナログを標準品として用いることにより算出する方法 に関する。 景技術 ダイォキシン類とは、 ポリ塩素化ジベンゾ— _ —ダイォキシン類 （po 1 y c h 1 o r i n a t e d d i b e nz o— p— d i ox i n s : PCDD s)、ポ リ塩素化ジベンゾフラン類 （p o l yc h l o r i n a t e d d i b e nz o f u r a n s ： PCDF s)、及びコプラナ一 PCB (c op l ana r p o 1 y c h l o r i n a t e d b i ph eny l : Co-PCB s)の総称である。 これら 3種類の骨格構造について、 塩素置換位置の異なる多数の異性体群が存在 する。 このうち、 PCDD s及び PCDF sでは、 2、 3、 7及び 8位に塩素置 換がある異性体は強い毒性を有しており、 塩素による皮膚炎、 多発性神経症、 眼 球振とう症、 肝機能不全などの症状を引き起こすことが知られている。
また、 低濃度のダイォキシンであっても長期間曝露することにより、 晚発性皮 膚ポルフィリン症などの慢性的な症状を引き起こす他、 催奇形性、 発ガン性、 助 ガン性といつた多種多様な毒性を示すことも知られている。
更に、 近年、 人や野生動物の内分泌機能を撹乱する作用を持つ、 いわゆる 「内 分泌撹乱物質」 が世界的な環境問題としてクローズアップされている。 ダイォキ シン類もエストロゲン活性を有する内分泌撹乱物質の一つである疑いがあること も判明している。
このように様々な毒性を持つダイォキシン類が、 除草剤や殺虫剤などの化学製 品、 ゴミ焼却場から出る排ガスやフライアッシュ、 製紙工場から排出される廃水 の中などに含まれていることが明らかとされている。 このため、 大都市周辺の河 川や港湾の水質や底質、 大気、 土壌といった環境試料のみならず、 食品、 血液、 母乳、尿といった生体試料からもダイォキシン類が検出されている。 このように、 汚染が環境中に広範囲に広がっていることが大きな社会問題になっていることか ら、 環境中のダイォキシン類暴露量を把握することが急務である。
ダイォキシン類の測定は精度の高い分析値が要求される。 このため、 各種のク 口マトグラフィ一により、 ダイォキシン類を抽出、 濃縮、 精製した後、 高分解能 ガスクロマトグラフ質量分析計などの高価な分析装置等の機器を用いる公定分析 法が採用されている。 これらの分析法は高感度であるとともに、 複数の化合物を 一度に同定、 定量できる多成分分析が可能である。 その反面、 高価で特殊な機器 ゃクリーンルーム等の設備投資が必要であること、 分析にも熟練した技術者が求 めらること、 前処理の煩雑さのために結果を得るまでに時間がかかること等の難 点があるのが現状である。
このため、 精度が高くかつ簡便なダイォキシン類の測定方法の開発が望まれて いる。 このような問題を解決すべく、 抗体を用いた免疫測定法による環境汚染物 質の検出技術が注目されている。
免疫測定法とは、 抗体が抗原を特異的に認識する能力を用いて微量の抗原を検 出又は定量する方法であり、 抗体の抗原に対する高い親和性と高い特異性により 抗原を高感度に測定することができる。 このため、 試料の前処理も簡便であり、 多検体の測定を簡易かつ迅速に行なうことができ、 測定に要するコストが低いと いった種々のメリットを持ち、 医学、 生化学、 薬学、 農学など広い分野で利用さ れている。 免疫測定法において測定対象物質を検出又は定量するには、 抗体また は抗原を標識する必要があり種々の標識法が開発されてい。 中でも酵素を用いた 酵素免疫測定法 （E I A) は、 その簡便性から臨床検査や生化学分野での生体試 料中の目的成分の定量に広く応用されている。 E I Aは、 抗原抗体反応の形式に より、 競合法と非競合法に大別できるが、 ダイォキシン類のような低分子化合物 は通常競合法によつて測定される。
E I Aにおいては、 測定対象と同じ化合物を標準品に用いて検体と同様に測定 し、 得られた標準曲線から試料中の化合物濃度を算出する。 しかしながら、 ダイ ォキシン類は 3種の基本骨格を有する化合物群についての塩素置換数の異なった 異性体類の総称であるため、 どの化合物を標準品にするかが問題となる。
ダイォキシン類の毒性は各同族体及び異性体により異なるため、 毒性の異なる 同族体及び異性体の混合物であるダイォキシン類の毒性の強さは、 個々の異性体 の存在比率に依存することになり、 単純に各異性体量を合計しても、 ダイォキシ ン類の毒性を正しく表現したことにはならない。
これまでに開発されたダイォキシン E I A測定系の多くは、最も毒性が高い 2， 3， 7, 8—テトラクロロジベンゾ—_p—ダイォキシン （2， 3, 7, 8 -T e CDD) を標準試料として用いている （An a l . Ch em. 70， 1092 - 1099)。 各異性体の毒性は、 2， 3, 7, 8— T e CDDの毒性を 1としこれ に対する相対値である毒性等価係数 （TEF ： Toxic Equivalency Factor) で表 される。 さらに、 個々の異性体ごとにその存在量に TEFを乗じて得られる毒性 量を算出する。 これが、 測定対象に含まれる全ての異性体の全毒性量である毒性 等量 （TEQ： Toxic Equivalent) である。
したがって、 2， 3, 7, 8_TeCDDを主に測定する E I A測定系では、 ダイォキシン類の毒性を正確に測定できる系とは言い難い。 特にダイォキシン類 の主要な発生源である廃棄物焼却炉から排出されるガス中のダイォキシン類毒性 等量 （TEQ) は、 2， 3, 7, 8— Te CDDよりも、 五塩素化ジベンゾフラ ン濃度又は六塩素化ジベンゾフラン濃度と相関が高いことが知られている。また、 排ガス試料を分析対象とした場合、 これまでの E I A測定系では、 機器分析値と 大きくかけ離れる場合がある。 このように、 E IA測定系は、 使用に制限が生じ る可能性がある。
また、 E IAにおいて、 2, 3, 7, 8— T e CDDやその他のダイォキシン 類異性体を標準品に用いる場合は、 標準品調製時に毒性の高い化合物を取り扱う ことになるため、 測定者側の安全性確保及び作業時の精神的な負担等の問題が生 じる。 従って、 被験試料中のダイォキシンの定量のための標準品として毒性を有さな い化合物が求められていることろ、 例えば特開 2002-128731、 特開 2002-131316 及び特開 2002-155023には標準品としてクロ口フエノール誘導体を使用すること が記載されている。 発明の開示 本発明の目的は、ダイォキシン類の免疫測定用標準品であって毒性等価係数（T E F)を有さない標準品、及び、 この標準品を用いて環境試料中のダイォキシン類 濃度または毒性等量を簡便かつ高感度に測定できる免疫測定法を提供することで ある。
本発明者は、 上記事情に鑑み、 鋭意検討した結果、 以下の知見を得た。
(i) 下記一般式 （1 ) で表されるクロ口フエノール誘導体
Figure imgf000006_0001
(式中、 R R 2、 R 3、 R 4は、 同一又は互いに異なって、 塩素原子又は水素原 子を表し、 nは 1〜1 0の整数を表し、 Zはアミノ酸残基又はペプチドを表す。） をダイォキシン類の標準品として使用して、 免疫測定法により被験試料中のダイ ォキシン濃度を測定し算出した毒性等量は、 試料中に含まれる各ダイォキシン化 合物の濃度を測定する公定法により求めた毒性等量と高い相関性が認められる。
(i i) このクロ口フエノール誘導体は毒性等価係数（T E F)を有さないため、 こ の化合物をダイォキシン類測定用標準品として用いることにより、 安全に環境試 料中のダイォキシン類濃度及び毒性等量を算出できる。 - 本発明は前記知見に基づき完成されたものであり、 以下の化合物などを提供す る。
1 . 以下の一般式 （1 ) で表される化合物。 0— (CH2)nCONH-Z
(式中、 R R2 R3 R4は、 同一又は互いに異なって、 塩素原子又は水素原 子を表し、 nは 1 10の整数を表し、 Zはアミノ酸残基又はペプチドを表す。） 2. 以下の一般式 （1) で表されるダイォキシン類の免疫測定用標準品。
Figure imgf000007_0001
(式中、 R R2 R3 R4は、 同一又は互いに異なって、 塩素原子又は水素原 子を表し、 nは 1 10の整数を表し、 Zはアミノ酸残基又はペプチドを表す。）
3. 項 1に記載の化合物を含むダイォキシン類の免疫測定用キット。
4. さらに、 抗ダイォキシン抗体を含む項 3に記載のキット。
5. さらに、 競合用抗原を含む項 3又は 4に記載のキット。
6. ダイォキシン類を定量するための免疫測定法であって、 項 1に記載の化合 物を標準品として用いる方法。
7. 免疫測定法が、 酵素免疫測定法、 放射性免疫測定法及び蛍光免疫測定法か ら選ばれる方法である項 6に記載の方法。
8. 被験試料中のダイォキシン類の濃度又はさらに毒性等量を算出するための 免疫測定法であって、 項 1に記載の化合物を標準品として用いる方法。
9. 免疫測定法が、 酵素免疫測定法、 放射性免疫測定法及び蛍光免疫測定法か ら選ばれる方法である項 8に記載の方法。
10. 被験試料と抗ダイォキシン抗体とを反応させることにより、 抗原抗体反 応量を測定する工程（1)と、
工程（1)における抗原抗体反応量を、濃度既知の請求項 1に記載の化合物と抗ダ ィォキシン抗体とを反応させることにより得られた抗原抗体反応量と比較するこ とにより被験試料中に含まれるダイォキシン類濃度を算出する工程（2)と を含むダイォキシン類の免疫測定法。
1 1 . 抗原抗体反応量を、 酵素免疫測定法、 放射性免疫測定法及び蛍光免疫測 定法から選ばれる方法で測定する項 1 0に記載の方法。
本発明により、 ダイォキシン類の免疫測定用標準品であって毒性等価係数 （T E F ) を有さない標準品、 及び、 この標準品を用いて環境試料中のダイォキシン 類濃度または毒性等量を簡便かつ高感度に測定できる免疫測定法が提供された。 詳述すれば、 本発明の一般式 （1 ) で表される免疫測定用標準品を用いて定量 した試料中ダイォキシン類濃度及びこれから算出した毒性等量は、 機器分析によ り毒性等価係数を有するダイォキシン類化合物濃度を測定する公定法により得ら れる毒性当量と良好な相関性を示す。 このように、 ダイォキシン類定量用の標準 品として本発明化合物を用いれば、 被験試料の毒性等量を正確かつ高感度に測定 できる。 このことから、 従来の E I Aに較べて、 被験試料中のダイォキシン類の 毒性量を正確に評価することができる。
また従来の公定法では、毒性等量を有する 29種類のダイォキシン類濃度を測定 し TEQ値を算出する必要があり毒性等量の評価に長時間を要する。 これに対して 本願化合物を用いた免疫測定法では比較的短時間で毒性等量を評価できる。 また、 本発明の標準品は WHOがその毒性等価係数を定めていないため、 毒性の ない化合物であると考えられる。 また、 本願の化合物は市販化合物であるクロ口 フエノール (例えば 2， 4, 5-トリクロ口フエノール） にメチレン鎖及びペプチドを 付加した誘導体であり、 この点からも毒性がないことは明らかである。 このこと から、 本願化合物を用いることによりダイォキシン類の免疫測定作業時の安全性 を大幅に向上させることができる。
以上のことから本発明の化合物及び方法は環境分析等に広く応用することがで き、 食品、 母乳、 血液、 尿のような生体試料の分析においても有用である。 発明の詳細な記述 以下、 本発明を詳細に説明する。
(I)本発明の化合物
基本的構成
以下の一般式 （1) で表される化合物は、 文献未記載の新規化合物である。
Figure imgf000009_0001
(式中、 R R2、 R3、 R4は、 同一又は互いに異なって、 塩素原子又は水素原 子を表し、 nは 1〜10の整数を表し、 Zはアミノ酸残基又はペプチドを表す。） 好ましい化合物
上記一般式 （1) で表される化合物について、 塩素置換数及び置換位置は特に 限定されないが、 抗ダイォキシン抗体との反応性から、 全置換塩素数が 3以上で ある化合物が好ましく、 全置換塩素数が 3である化合物がより好ましい。
全置換塩素数が 3である化合物の中でも、 R R 2が塩素原子を表し R 3及び R 4が水素原子を表す化合物； R R3が塩素原子を表し R2及び R4が水素原子 を表す化合物； R2、 R3が塩素原子を表し R1及び R4が水素原子を表す化合物； R2、 R4が塩素原子を表し R1及び R3が水素原子を表す化合物； R3、 R4が塩 素原子を表し R1及び R2が水素原子を表す化合物が好ましく、 R2、 R3が塩素原 子を表し R1及び R4が水素原子を表す化合物； R2、 R4が塩素原子を表し R1及 び R3が水素原子を表す化合物がより好ましく、 R2、 R4が塩素原子を表し R1 及び R 3が水素原子を表す化合物が最も好ましい。
nは 0〜20程度の整数、 特に 2〜 6程度の整数であることが好ましい。 最も好 ましいのは n=2である。 ポリメチレン鎖の長さ即ち nが上記範囲であれば合成 を容易に行える。
Z のアミノ酸残基又はペプチドは、 通常のペプチドの定義に従い構成アミノ酸 残基数が 100残基以内のものであれば特に限定されないが、通常 1〜50残基程度、 特に 1〜10残基程度、 さらに特に 1〜4残基程度、 さらに特に 1〜3残基程度の アミノ酸又はべプチドが好ましい。 ペプチドが余りに長いと水溶性が増大するた め測定時に有機溶媒に溶解させることが困難になり反応液中で沈殿が生じる場合 があるが、 上記範囲であればこのような問題は生じない。
具体的には、 R1 R2が塩素原子を表し R3及び R4が水素原子を表し、 nが 2 〜6であり、 Zがアミノ酸残基数 1〜 4程度のペプチドである化合物； R R3 が塩素原子を表し R2及び R4が水素原子を表し、 nが 2〜6であり、 Zがァミノ 酸残基数 1〜4程度のペプチドである化合物； R2、 R3が塩素原子を表し R1及 び R4が水素原子を表し、 nが 2〜6であり、 Zがアミノ酸残基数 1〜4程度のぺ プチドである化合物； R2、 R4が塩素原子を表し R1及び R3が水素原子を表し、 nが 2〜 6であり、 Zがアミノ酸残基数 1〜4程度のペプチドである化合物； R3、 R4が塩素原子を表し R1及び R 2が水素原子を表し、 nが 2〜 6であり、 Zがアミ ノ酸残基数 1〜 4程度のぺプチドである化合物が好ましい化合物として例示でき る。
中でも、 R2、 R3が塩素原子を表し R1及び R4が水素原子を表し、 nが 2〜6 であり、 Zがアミノ酸残基数 1〜4程度のペプチドである化合物； R2、 R4が塩 素原子を表し R1及び R 3が水素原子を表し、 nが 2〜 6であり、 Zがアミノ酸残基 数 1〜 4程度のペプチドである化合物が好ましい。
特に、 R2、 R4が塩素原子を表し R1及び R3が水素原子を表し、 nが 5であり、 Zがアミノ酸残基数 1〜3程度のアミノ酸又はペプチドである化合物； R2、 R3 が塩素原子を表し R1及び R4が水素原子を表し、 nが 2であり、 Zがアミノ酸残 基数 1〜 3程度のアミノ酸又はべプチドである化合物が好ましい。
用途
上記一般式 （1) で表される化合物は、 抗ダイォキシン抗体と反応することか ら、 ダイォキシン類の免疫測定用標準品として使用できる。 さらに、 この化合物 は毒性等価係数（TEF)を有さないため、 この化合物を標準品として用いること により、 測定者が安全に測定できるダイォキシン類免疫測定系を構築することが できる。
製造方法
本発明のダイォキシン類測定用標準品は、 それには限定されないが、 例えば以 下の方法で合成できる。
以下の一般式 （2) で表される化合物
Figure imgf000011_0001
3
(式中、 R1 R2、 R3、 R4は、 同一又は互いに異なって、 塩素原子又は水素原 子を表し、 nは 1〜10の整数を表す。）
を、 N -ヒドロキシスクシンイミドと反応させる活性化エステル法により活性化す ることにより、 以下の一般式 （3) で表される活性化エステル化合物
1
Figure imgf000011_0002
(式中、 式中、 R1 R2 R3、 R4は、 同一又は互いに異なって、 塩素原子又は 水素原子を表し、 nは 1 10の整数を表す。）
を得る。
次いで、 一般式 （3) で表される化合物をアミノ酸またはペプチド等のアミノ 基を含有する化合物と常法に従い反応させることにより、 上記の一般式 （1) で 表される化合物が得られる。
出発原料である上記一般式 （2) のクロ口フエノール誘導体は、 例えば以下の 方法により合成することができる。クロロフエノ一ル、炭酸カリウム及び 6 -プロ モへキサン酸ェチルエステルを 60°Cで 16時間加熱攪拌し、 反応終了後、 酢酸 ェチルで抽出し減圧下で溶媒を濃縮する。 残渣をエタノールで溶解し、 水酸化ナ トリウム水溶液を加え、 室温で 3時間攪拌する。 反応終了後、 濃塩酸で中和し、 反応液を減圧濃縮後、 濃塩酸を加えて酸性にし、 酢酸ェチルで抽出した後、 再結 晶を行うことにより、 上記一般式 （2 ) で表されるクロ口フエノール誘導体が得 られる。
(I I)ダイォキシン類の免疫測定用キット
本発明のダイォキシン類の免疫測定用キットは本発明の一般式 （1 ) で表され る化合物をダイォキシン類定量用の標準品として含む。 また、 抗ダイォキシン抗 体は使用者が作成してもよくこのキットに含まれていてもよいが、 このキットに 含まれていると便利である。 抗ダイォキシン抗体については後述する。 さらに、 競合型測定法に供するものである場合は、 競合用抗原を含んでいればよい。 競合 用抗原についても後述する。
その他、反応容器、容器の余剰表面を覆うためのブロッキング剤、バッファー、 間接競合法に供するキットの場合は 2次抗体などを含んでいてもよい。
(I I I)ダイォキシン類の免疫測定法
基本的構成
本発明方法は、 ダイォキシン類を定量するための免疫測定法であって、 上記一 般式 （1 ) で表される化合物を標準品として用いる方法である。 より詳しくは、 本発明方法は、 被験試料中のダイォキシン類の濃度又はさらに毒性等量を算出す るための免疫測定法であって、 上記一般式 （1 ) で表される化合物を標準品とし て用いる方法である。
具体的には、 本発明のダイォキシン類の免疫測定法は、 被験試料と抗ダイォキ シン抗体とを反応させることにより抗原抗体反応量を測定する工程（1)と；工程 (1)における抗原抗体反応量を、 濃度既知の一般式（1 )で表される化合物と抗ダ ィォキシン抗体とを反応させることにより得られた抗原抗体反応量と比較するこ とにより被験試料中に含まれるダイォキシン類濃度を算出する工程（2)とを含む 方法である。
すなわち、 本発明のダイォキシン類免疫測定法は、 上記一般式 （1 ) で表され るクロロフエノール誘導体をダイォキシン類測定の標準品として用いることを特 徴とし、 それ以外は、 通常の免疫測定法に従って実施することができる。
本発明の化合物は公知のいずれの免疫測定法にも適用できる。 このような公知 の免疫測定法としては、 例えば酵素免疫測定法（E I A)、 放射性免疫測定法 （R I A)、 蛍光免疫測定（F I A)等が挙げられる。測定の簡便さから E I Aが好ま しい。
E I Aには競合型測定法、 非競合型測定法、 均質法等があるが、 ダイォキシン 類は低分子化合物であるため、 通常競合法により行なえばよい。 競合法には主に マイクロプレートのゥエル、 チューブ等に抗原を固定化する間接競合法と、 ゥェ ルゃチューブ等に抗体を固定化する直接競合法がある。
間接競合法
ω競合用抗原
間接競合法においては、 ゥエルに固定化する競合用抗原として、 ダイォキシン 類又はこれらとキャリア一タンパク質との複合体を用いる。 樹脂製又はガラス製 などの未処理の反応容器を用いる場合は、 ダイォキシン類単独では容器に固定化 するのが困難であるためキャリアタンパク質との複合体を用いることが好ましい。 また、 アミノ基又は力ルポキシル基のような反応性の高い官能基で表面が活性化 された反応容器を使用する場合は、 ダイォキシン類単独でもこれらの官能基を介 して容器に固定化することができる。 キャリアタンパク質の有無にかかわらず、 ダイォキシン類にはリンカ一を結合させることが好ましい。 これにより、 立体障 害が緩和されて競合用抗原と抗ダイォキシン抗体との反応性が良好になり、 ひい ては被験試料中のダイォキシン類の測定感度が向上する。
ダイォキシン類としては、例えばポリ塩ィヒジベンゾ一パラ—ジォキシン (PCDD)、 ポリ塩化ジベンゾフラン（PCDF)、コプラナ一ポリ塩化ビフエニル（コブラナー PCB) 等を使用できる。 毒性のあるダイォキシン類との共通性の低いダイォキシン類又 はダイォキシン様化合物を用いることにより、 競合用抗原の抗ダイォキシン抗体 との反応性が被験試料中のダイォキシン類との反応性より低くなり、 被験試料中 のダイォキシン濃度の検出感度が向上する。
キャリアタンパク質は特に限定されず公知のキャリアタンパク質を制限なく使 用できる。 このようなキャリアタンパク質として、 KLM (Keyhol e l impet Hemocyanin) ゥシ血清アルブミン （BSA： Bovine Serum Albumin)などを例示でき る。
リンカ一は、 抗体との結合に立体障害を及ぼさないもの、 反応過程において溶 解性に支障をきたさないものが好ましぐ例えばポリメチレン鎖等を使用できる。 リンカ一はダイォキシン類若しくはダイォキシン様化合物又はこれらとキャリア タンパク質と容器との間に配置される。
さらに、 競合反応用抗原として本発明の一般式 （1) で表されるクロロフエノ ール誘導体を用いることにより高感度にダイォキシン類を定量できる。 特に検量 線作成用の標準品と同一の化合物を競合用抗原として使用することが好ましい。 この場合は、 本発明の一般式 （1) で表される標準品代替化合物の末端に結合し ているアミノ酸またはべプチド部分を BSA等のキヤリァ一夕ンパク質に変えるこ とにより固相化用抗原を作製することができる。
(U)抗ダイォキシン抗体
E I Aで使用する抗体は、 公知の方法に従ってポリ塩化ジベンゾーパラージォ キシン (PCDD)、 ポリ塩化ジベンゾフラン (PCDF)、 コプラナ一ポリ塩化ビフエ二ル (コブラナー PCB)などのダイォキシン類をハプテン化し、 BSA等のキャリア一タン パク質に結合させたコンジユゲートを免疫用抗原として哺乳動物に免疫すること により作製することができる （Kun C a e, e t a 1., J. Ag r i c. Food., 25, 1207〜 1209 ( 1977 ) ; S i m o n a G. Me r i c a, e t a 1., Can. J. Ch em. , 73, 826〜 834 (199 5))。
抗体はポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体のいずれでもよく特に限定さ れない。 抗体自身の均一性及び抗体製造時のロット差が生じ難い等の点で、 モノ クローナル抗体であることが望ましい。 モノクローナル抗体は、 ハプテン化した ダイォキシン類で免疫したマウスの脾臓細胞と腫瘍細胞とを細胞融合させたハイ プリドーマをクローン化した単一抗体産生細胞より得られる抗体であるが、 ダイ ォキシン類を認識するものであればよい。
間接競合法は例えば次のようにして行えばよい。 まず競合用抗原をマイクロプ レートのような反応容器のゥエル内に固相化する。 次いでゥエル表面の抗原が結 合していない部分を牛血清アルブミン、 カゼイン等の市販のブロッキング剤でブ ロックする。このゥエルに検体と一次抗体である抗ダイォキシン類抗体を加えて、 被験試料と固相化抗原を抗体に対して競合反応させる。 固相化抗原と結合しなか つた抗体を洗浄除去後、 同ゥエルに二次抗体として例えばャギ抗マウス免疫グロ プリン抗体をペルォキシダ一ゼ (H R P )やアルカリフォスファタ一ゼ (A L P ) 等の酵素で標識した酵素標識抗体を加えて、 固相化抗原と結合した一次抗体と結 合させる。 緩衝液で数回洗浄した後、 標識酵素の基質を加えて発色した酵素反応 生成物の吸光度を測定する。 酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合は、 基質 として過酸化水素、 発色剤として o—フエ二レンジアミンゃテトラメチルベンジ ジン等を使用すればよい。酵素としてアルカリフォスファタ一ゼを用いる場合は、 通常基質として p—ニトロフエニルリン酸を用いればよい。
上述の競合法において、 被験試料を添加しない反応溶液の吸光度に対する、 被 験試料を添加することによる反応溶液の吸光度の減少量の比率を検体による阻害 率として測定する。 その際、 本発明の一般式 （1 ) で表される化合物をダイォキ シン類標準品として用い、 被験試料に代えてこの標準品の複数の既知濃度の溶液 を用いた他は同様の操作で競合反応を行う。 標準品の濃度と阻害率との関係を示 す検量線を作成し、 得られた検量線と被験試料による阻害率とを比較することに より、 被験試料中のダイォキシン類濃度を標準品換算濃度として算出することが できる。
直接競合法
直接競合法においては、 容器のゥエル内に抗ダイォキシン抗体を固相化し、 ゥ エルの抗体が結合していない部分を上記と同様にしてブロッキングする。次いで、 このゥエルに競合用の酵素標識抗原及び検体を加えることにより、 被験試料及び 酵素標識抗原を固相抗体に対して競合反応させる。 次いで、 抗体と結合しなかつ た酵素標識抗原を洗浄除去し、 標識に使用した酵素の基質を加えて反応生成物の 吸光度を測定する。
酵素標識抗原は、 間接競合法で使用する競合用抗原と同様のダイォキシン類若 しくはダイォキシン様化合物に、 ペルォキダーゼ若しくはアル力リフォスファタ —ゼのような酵素を結合することにより調製できる。 また、本発明の一般式（1 ) で表される化合物の末端に存在しているアミノ酸またはペプチド部分をペルォキ ダーゼ若しくはアルカリフォスファタ一ゼのような酵素に変えたものを使用する 場合は感度が向上する。 なお、 E I Aではなく R I Aを行う場合はこれらの化合物をァイソトープで標 識することにより標識抗原が得られる。 また F I Aを行う場合はこれらの化合物 にローダミンのような蛍光物質若しくは化学発光物質を結合させることにより標 識抗原を得ることができる。
被験試料
被験試料の種類は特に限定されず、 環境から採取した環境試料、 生物試料、 食 品などの各種製品、 実験用に調製したダイォキシン類溶液であってもよい。 本発 明方法は、 特に被験試料として環境試料を用いる場合に好適な方法である。 環境 試料としては、 例えば大気；自動車、 機器、 工場などからの排気ガス；土壌；河 川、 湖、 港湾の水；燃焼灰、 飛灰などが挙げられる。 生物試料としては、 母乳、 血液、 尿などが挙げられる。
毒性等量の算出方法
被験試料はそのまま免疫測定に供してもよく、 前処理により被験試料からダイ ォキシンを多く含む画分を抽出してもよいが、 前処理を行うことが好ましい。 前 処理方法を以下に例示するが、 前処理方法はこれらに限定されるものではない。
(0排気ガス試料の場合
A(N m3)の被験ガスを採取し、 トルエンによりガス中物質を抽出し 20mlに定 量して粗抽出液とする。 この粗抽出液 10mlを分取し、 硫酸層の着色がなくなる まで硫酸で処理する。 この溶液をへキサンに転溶後、 硫酸ナトリウム lg、 10%摘 酸銀シリ力ゲル lgおよびシリ力ゲル 3gを積層した多層シリ力ゲル力ラムにへキ サン 200mlで流通させてクリーンアップを行い、最終的に 1mlの DMSOに定量 した溶液を免疫測定に供する。
得られた標準品換算ダイォキシン類濃度を下式に代入して毒性等量 (TEQ)を算 出する。
TEQ (ng- TEQ/Nm3) =0. 0922 X標準品換算ダイォキシン類濃度 （ g/ N m3) °·8474 上記式において、 0. 0922及び 0. 8474の値は、 実施例において排気ガスについ て本発明方法で得られたダイォキシン類濃度と公定法で得られたダイォキシン類 毒性等量との間の相関式における係数であり、被験試料毎に定められる値である。 なお、標準品換算ダイォキシン類濃度の単位の変換は以下の式に従い行えばよい。 標準品換算ダイォキシン類濃度 （ g/ N m3)
=標準品換算ダイォキシン類濃度 （ng/ ml) X1/10X20X1/AX1/1000
(U)飛灰の場合
B(g)の飛灰を採取し、 トルエンで含有化合物を抽出し、 20mlに定量して粗抽出 液とする。 この粗抽出液 lml を分取してクリーンアップを行い、 最終的に 2ml の DMSO に定量した溶液を免疫測定に供する。 得られた標準品換算ダイォキシ ン類濃度を下式に代入して毒性等量 (TEQ)を算出する。
TEQ(ng-TEQ/g)=0.0038X 〔標準品換算ダイォキシン類濃度 （ g/g)〕 796 上記式において、 0.0038及び 0.9796の値は、 実施例において飛灰について本 発明方法で得られたダイォキシン類濃度と公定法で得られたダイォキシン類毒性 等量との間の相関式における係数であり、 被験試料毎に定められる値である。 なお、 標準品換算ダイォキシン類濃度の単位の変換は以下の式に従い行えばよ い。 標準品換算ダイォキシン類濃度 （/ig/ g)
=標準品換算ダイォキシン類濃度 （ng/ ml) X2/1X20X1/BX1/1000 (i'ii)土壌の場合
B(g)の土壌を採取し、 トルエンで含有化合物を抽出し、 20mlに定量して粗抽出 液とする。 この粗抽出液 lml を分取してクリーンアップを行い、 最終的に 2ml の DMSO に定量した溶液を免疫測定に供する。 得られた標準品換算ダイォキシ ン類濃度を下式に代入して毒性等量 (TEQ)を算出する。 TEQ(ng-TEQ/g)=9.4553X 〔標準品換算ダイォキシン類濃度 （^g/g)〕 °-9352 上記式において、 9.4553及び 0.9352の値は実施例において飛灰について本発 明方法で得られたダイォキシン類濃度と公定法で得られたダイォキシン類毒性等 量との間の相関式における係数であり、被験試料毎に定められる値である。なお、 標準品換算ダイォキシン類濃度の単位の変換は飛灰の場合と同様にして行えばよ い。
実施例 以下、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。
実施例 1
ダイォキシン類免疫反応測定用標準品の作製
上記一般式 （1) で示される本発明の化合物のうち、 R2、 R4が塩素原子を表 し R1, R 3が水素原子を表す化合物を以下の方法により合成した。 合成手順を図 1を参照して説明する。
アルゴン気流下で、 2, 4, 5-トリクロ口フエノール （1) (市販品） 1 5. 0 g (76. Ommo 1 )、 6 -ブロモへキサン酸ェチルエステル 18. 6 g (8 3. 6mmo 1 )、 炭酸カリウム 1 2. 60 g (91. 2mmo l)、 無水ジメ チルホルムアミド 150mlを混合し、 60 °Cで一晩加熱攪拌した。 反応終了 後、 室温まで冷却し、 反応液を水 45 Om lに加え、 酢酸ェチル 225m 1で 2 回抽出した。 硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、 乾燥剤をろ別、 有機層を濃 縮し、 粗生成物 30. 7 gの淡黄色オイルを得た。 粗生成物をシリカゲルカラム クロマトグラフィー (シリカゲル 450 g、 展開溶媒 酢酸ェチル： n-へキサン = 1 : 1 5) で精製し、 6- (2, 4， 5 -トリクロロフエノキシ） へキサン酸ェ チル（2)を 26. 5 gの透明オイルとして得た （収率 100%)。
6- (2, 4, 5-トリクロロフエノキシ） へキサン酸ェチル（2)をエタノール 2 0 Om lに溶解し、 続いて 2 N水酸化ナトリゥム水溶液 200m lを氷冷下で滴 下し、 室温で 3時間攪捽した。 反応終了後、 濃塩酸 7 Om lで中和し、 反応液を 半分になるまで濃縮した。 濃縮した反応液に濃塩酸 5 mlを加えて酸性にし、 酢 酸ェチル 100mlで 1回、 150m 1で 2回抽出した。 次に水 20 Omし 飽 和塩化ナトリゥム水溶液 20 Omlの順で有機層を洗浄し、 硫酸マグネシウムで 乾燥した。 乾燥剤をろ別し、 有機層を濃縮して粗生成物 23. 3 gの白色固体を 得た。粗生成物にイソプロピルエーテル 25m 1、 n-へキサン 5 Om 1を加えて 再結晶し、析出結晶をろ取し、 イソプロピルエーテル Zn-へキサン = 1/3で洗 浄後、 6- (2, 4, 5-トリクロロフエノキシ） へキサン酸（3)を 21. 4 gの白 色結晶として得た （収率 88. 0%)。
6- (2, 4, 5-トリクロロフエノキシ） へキサン酸（3)18. 2 g (58. 4 mmo 1 ) を 18 Om 1の塩化メチレンに溶解し、 1-ェチル -3 -(3 '-ジェチル ァミノプロピル)カルポジイミド塩酸塩 12. 7 g (70. lmmo 1 ) と N-ヒ ドロキシスクシンイミド 8. 07 g (70. lmmo l) を加えた後、 室温で一 晚攪拌した。反応終了後、 THF 1250mlに反応液を加え、水 36 Omし 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 54 Oml、水 54 Omlの順に有機層を洗浄し、 硫酸ナトリウムで乾燥後、 乾燥剤をろ別し、 有機層を濃縮して粗生成物 21. 9 gの白色固体を得た。粗生成物をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィー（1回目： シリカゲル 400 g、 展開溶媒 塩化メチレン、 2回目：シリカゲル 330 g、 展開溶媒 塩ィ匕メチレン） で精製し、 スクシンィミジル- 6- (2, 4， 5-トリク ロロフエノキシ） へキサン酸へキサノエート （4) を 9. 73 gの白色固体とし て得た （収率 40. 7 %)。
スクシンィミジル -6- (2, 4, 5-トリクロロフエノキシ） へキサン酸へキサ ノエート （4) 2 Omgを 10 Om 1のジメチルスルホキシドに溶解した。 その 後、 50 mMのダリシルダリシン水溶液 100mlを徐々に添加し、 室温で 3時 間攪拌してダイォキシン類測定用標準品溶液を得た。
また、 上記操作において、 出発原料として 2， 4, 5-トリクロ口フエノールに 代えて 2， 4, 6·トリクロ口フエノール （市販品） を使用する他は同様にして、 一般式 （1) において R2、 R3が塩素原子を表し R R4が水素原子を表す化合 物を合成した。
また、 上記操作において、 出発原料として 2, 4, 5-トリクロ口フエノールに 代えて 3， 4， 5-トリクロ口フエノール （市販品） を使用する他は同様にして、 一般式 （1) において R R4が塩素原子を表し R2、 R3が水素原子を表す化合 物を合成した。
実施例 2
競合測定用抗原の作製実施例 2
実施例 1で作製したスクシンィミジル- 6- (2, 4, 5-トリクロロフエノキシ） へキサン酸へキサノエート （4) と牛血清アルブミンを用いて競合測定用抗原を 作製した。 まず 5 OmMリン酸緩衝液 （pH8. 0) に溶解した牛血清アルブミ ン （B S A) の溶液 lm 1 (B S A 15mg (2. 27X 10— 7mo l)相当分） を氷冷攪拌下、 ジメチルスルホキシド 545. 5 1を加え、 その後スクシン ィミジル一 6 (2， 4, 5—トリクロロフエノキシ） へキサノエ一ト （BB2— 4) の 2 OmMジ チルスルホキシド溶液 454. 5 1 (40等量 （9. 0 9X 10— 6mo 1)) を滴下し、 室温 1時間反応させた。 反応後、 4 の？83に 対して透析を行い、 競合測定用抗原を得た。
実施例 3
排ガス試料の調製及び公定法によるダイォキシン類 TEQ値測定
公定法（J I S K0311) に準じてごみ焼却場の排ガスを採取し、高分解能 ガスクロマトグラフ質量分析計 （GC— MS) により試料中のダイォキシン類濃 度を測定した。 また、 都市ごみ焼却場の煙道から、 排ガス約 3 Nm3をガス採取装 置に吸引して採取し、 採取した試料を、 ろ紙、 樹脂、 吸収液などの形態ごとにト ルェン、 ジクロロメタン等の有機溶媒を用いて抽出した。 これらの抽出液を合わ せて 2 Om 1まで濃縮し、 粗抽出液を得た。
粗抽出液から lml分取し、 それを硫酸処理、 多層シリカゲルクロマトグラフ 処理および活性炭力ラムクロマトグラフ処理を行って精製した後に、 ガスクロマ トグラフ質量分析計 （M i c r oma s s社製） によって各ダイォキシン類異性 体濃度を求めた。
次に各ダイォキシン類異性体濃度にその毒性等価係数 （TEF) を乗じて、 排 ガス試料中のダイォキシン類毒性等量 （TEQ) を算出した。
一方、 別に分取した粗抽出液 lm 1を硫酸処理および多層シリカゲルクロマト グラフ処理を行って精製した後、 有機溶剤を乾固してジメチルスルホキシド （D MSO) 2mlに転溶し、 E I A評価用試料とした。
実施例 4
間接競合法による抗ダイォキシンモノクロ一ナル抗体を用いた排ガス試料の毒性 等量の測定
実施例 2で作製した競合測定用抗原を P B Sで 1 ^ g Zm 1になるように溶解 し、 96穴アツセィプレート （Co s t a r社製， C a t No. 3590) の 各ゥエルに、 この溶液を 10 O 1ずつ分注し、 プレートをシールで密閉して、 4°Cで 18時間静置して固相化を行なった。抗原溶液を除去後、 0. 05% Tw e e n 20を含む P B Sにて 3回洗浄し、 5倍希釈したブロッキング溶液（ナカラ ィテスク製）を 300 1ずつ分注し、プレートをシールで密閉し、 4°Cでー晚静 置してブロッキングを行い、 ダイォキシン類測定用プレートを作製した。 このプ レートを用い次のようにしてダイォキシン類の免疫測定を行なった。
実施例 1で作製したダイォキシン類標準品は、 T r i t on X100を 0. 0 1 %含む 50 %DMS〇で、 0〜0. 2 gZm 1の範囲の希釈系列を作製し た。 実施例 3で調製した排ガス試料は DM SOに転溶後、 T r i t on XI 0 0を 0. 01 %含む 50%DM SOで希釈を行い測定用試料とした。
一方、 抗ダイォキシン類モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを無血 清培地中で炭酸ガス培養容器内において 37°Cで 1週間以上培養し、培養上清を取 得し、 得られた培養上清をプロテイン Aカラムを用いてァフィ二テイクロナトグ ラフィ一により精製した後、 PBS 中で透析し、 抗ダイォキシン類モノクローナル 抗体を調製した。
ダイォキシン類標準品の希釈系列及び排ガス試料をダイォキシン測定用プレー トにそれぞれ 50 1ずつ添加し、 0. 2% 83八を含む？83で0. l g / 1になるように希釈した抗ダイォキシンモノクローナル溶液を 50 z 1ずつ 添加し、 4°Cで 1時間反応させた。 反応後、 ゥエルに添加した溶液を除去し、 プ レートを Twe e n 20を 0. 005 %含む P B Sで 3回洗浄した後、 0. 2% BSAを含む PBSで 2000倍に希釈したャギ抗マウス I gG (H + L) HR P標識抗体 （ァフイエティ一精製したもの、 DAKO社製） 100 1を分注し た。 プレートを室温で 1時間静置した後、 Tw e e n 2 0を 0 . 0 5 %含む？8 Sで 3回洗浄し、 各ゥエルに H R P基質である TM B (B i o F X社製） を 1 0 0 1ずつ分注し、 3 0分間室温で静置した。 各ゥエルに 1 0 0 1ずつ 0 . 5 M硫酸溶液を添加し、 マイクロタイター用分光光度計で波長 4 5 5 nm (対照 6 5 5 n m) の吸光度を測定した。
ダイォキシン類標準品を用いることにより得られた吸光度デ一夕より標準曲線 (検量線） を作成し、 排ガス試料を用いた場合の吸光度データを標準曲線に当て はめて、 試料中のダイォキシン量を標準物質濃度に換算して算出した。
得られた標準曲線を図 2に示す。 図 2において、 Bは標準品存在下での吸光度 であり、 B。は標準品非存在下での吸光度である。
また実施例 3において GC- MSを用いた定量により得られたダイォキシン類毒性 等量と、 実施例 4において本発明の標準品を用いて免疫測定を行なうことにより 得られた試料中ダイォキシン類濃度との相関関係を図 3に示す。 図 3から明らか なように、 本発明の免疫測定用標準品を用いた排気ガス試料の免疫測定法による 測定値と、 公定法である機器分析法から算出されたダイォキシン類毒性等量との 間に良好な相関性 (R 2 =0. 985) が認められた。
実施例 5
飛灰試料の調製及び公定法によるダイォキシン類 T E Q値測定
飛灰について、 実施例 3と同様にして G C— M Sの結果から毒性当量を算出し た。
実施例 6
間接競合法による抗ダイォキシンモノクローナル抗体を用いた飛灰試料の毒性等 量の測定
実施例 4と同様にして、 E I Aにより飛灰試料中のダイォキシンの毒性等量を 測定した。
実施例 5において GC- MSを用いた定量により得られたダイォキシン類毒性等量 と、 実施例 6において本発明の標準品を用いて免疫測定を行なうことにより得ら れた試料中ダイォキシン類濃度との相関関係を図 4に示す。 図 4から明らかなよ うに、本発明の免疫測定用標準品を用いた飛灰試料の免疫測定法による測定値と、 公定法である機器分析法から算出されたダイォキシン類毒性等量との間に良好な 相関性 2 = 0. 990) が認められた。
実施例 7
土壌試料の調製及び公定法によるダイォキシン類 T E Q値測定
土壌について、 実施例 3と同様にして G C— M Sの結果から毒性当量を算出し た。
実施例 8
間接競合法による抗ダイォキシンモノクローナル抗体を用いた土壌試料の毒性等 量の測定
実施例 4と同様にして、 E I Aにより土壌試料中のダイォキシンの毒性等量を 測定した。
また実施例 7において GC- MSを用いた定量により得られたダイォキシン類毒性 等量と、 実施例 8において本発明の標準品を用いて免疫測定を行なうことにより 得られた試料中ダイォキシン類濃度との相関関係を図 5に示す。 図 5から明らか なように、 本発明の免疫測定用標準品を用いた土壌試料の免疫測定法による測定 値と、 公定法である機器分析法から算出されたダイォキシン類毒性等量との間に 良好な相関性 （R 2 = 0. 992) が認められた。
なお、 ここでは一般式 （1 ) において R 2、 R 4が塩素原子を表し R R 3が水 素原子を表す化合物について公定法との相関性を検討したが、 実施例 1において 合成した一般式 （1 ) において R 2、 R 3が塩素原子を表し R R 4が水素原子を 表す化合物、 及び、 一般式 （1 ) において R R 4が塩素原子を表し R 2、 R 3 が水素原子を表す化合物についても、実施例 2〜 8と同様の操作を行ったところ、 ダイォキシン類の毒性等量について公定法との間に高い相関性が認められた。 産業上の利用可能性 本発明の化合物及び方法は、 土壌、 大気、 排気ガス、 湖水又は河川のような 環境試料；母乳、 血液、 尿のような生物試料；食品のような製品などに含まれる ダイォキシン量の定量に好適に使用できる。 図面の簡単な説明 図 1は、 実施例 1によるダイォキシン類の免疫測定用標準品の合成スキームを 示す図である。
図 2は、 本発明の 1実施例であるダイォキシン類免疫測定用標準品を用いて得 られた標準曲線を示す図である。
図 3は、 ガスクロマトグラフ質量分析による排ガス中のダイォキシン毒性等量 の測定量と、 本発明のダイォキシン類免疫測定用標準品を用いた免疫測定法によ る排ガス中のダイォキシン類濃度との相関を示す図である。
図 4は、 ガスクロマトグラフ質量分析による飛灰中のダイォキシン毒性等量の 測定量と、 本発明のダイォキシン類免疫測定用標準品を用いた免疫測定法による 飛灰中のダイォキシン類濃度との相関を示す図である。
図 5は、 ガスクロマトグラフ質量分析による土壌中のダイォキシン毒性等量の 測定量と、 本発明のダイォキシン類免疫測定用標準品を用いた免疫測定法による 土壌中のダイォキシン類濃度との相関を示す図である。

Claims

以下の一般式 （1) で表される化合物。
請
Figure imgf000025_0001
(式中、 R R2、 R3、 R4は、 同一又は互いに異なって、 塩素原子又は水素原 子を表し、 nは 1〜10の整数を表し、 Zはアミノ酸残基又はペプチドを表す。） 2. 以下の一般式 （1) で表されるダイォキシン類の免疫測定用標準品。
囲
R1
Figure imgf000025_0002
(式中、 R1, R2、 R3、 R4は、 同一又は互いに異なって、 塩素原子又は水素原 子を表し、 nは 1〜10の整数を表し、 Zはアミノ酸残基又はペプチドを表す。）
3. 請求項 1に記載の化合物を含むダイォキシン類の免疫測定用キット。
4. さらに、 抗ダイォキシン抗体を含む請求項 3に記載のキット。
5. さらに、 競合用抗原を含む請求項 3又は 4に記載のキット。
6. ダイォキシン類を定量するための免疫測定法であって、 請求項 1に記載の 化合物を標準品として用いる方法。
7. 免疫測定法が、 酵素免疫測定法、 放射性免疫測定法及び蛍光免疫測定法か ら選ばれる方法である請求項 6に記載の方法。
8. 被験試料中のダイォキシン類の濃度又はさらに毒性等量を算出するための 免疫測定法であって、 請求項 1に記載の化合物を標準品として用いる方法。
9. 免疫測定法が、 酵素免疫測定法、 放射性免疫測定法及び蛍光免疫測定法か ら選ばれる方法である請求項 8に記載の方法。
1 0 . 被験試料と抗ダイォキシン抗体とを反応させることにより、 抗原抗体反 応量を測定する工程（1)と、
工程（1)における抗原抗体反応量を、濃度既知の請求項 1に記載の化合物と抗ダ ィォキシン抗体とを反応させることにより得られた抗原抗体反応量と比較するこ とにより被験試料中に含まれるダイォキシン類濃度を算出する工程 (2)と を含むダイォキシン類の免疫測定法。
1 1 . 抗原抗体反応量を、 酵素免疫測定法、 放射性免疫測定法及び蛍光免疫測 定法から選ばれる方法で測定する請求項 1 0に記載の方法。
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