WO2004014952A2 - Anticorps specifiques du probnp (1-108) pour le diagnostic de l'insuffisance cardiaque - Google Patents

Anticorps specifiques du probnp (1-108) pour le diagnostic de l'insuffisance cardiaque Download PDF

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WO2004014952A2
WO2004014952A2 PCT/FR2003/002483 FR0302483W WO2004014952A2 WO 2004014952 A2 WO2004014952 A2 WO 2004014952A2 FR 0302483 W FR0302483 W FR 0302483W WO 2004014952 A2 WO2004014952 A2 WO 2004014952A2
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probnp
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peptide
bnp
seq
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Isabelle Giuliani
François RIEUNIER
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Bio-Rad Pasteur
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Universite Montpellier I
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    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Definitions

  • the invention relates to the field of in vitro diagnosis of ventricular heart failure.
  • Congestive heart failure is a common clinical syndrome, especially in the elderly. It usually comes in the form of an insidious triggering of non-specific symptoms such as exercise cough, fatigue, and the appearance of peripheral edema.
  • the diagnosis is conventionally based on the study of various parameters such as clinical signs (classified into 4 stages: stages I to IV of the NYHA (that is to say of the Cardiology Association of New York), the echocardiography, scintigraphy, stress test, etc.
  • cardiomyocytes manufacture and secrete peptides with natriuretic activity: a peptide of atrial origin, ANP (Atrial Natriuretic Peptide) discovered in rats by de Bold et al. Life Science 1981, vol. 28 (1): 89-94, and a natriuretic peptide of atrioventricular origin called BNP (Brain Natriuretic Peptide) discovered by Sudoh et al., Nature 1988, vol. 332: 78-81 in pigs, then in humans.
  • ANP Atrial Natriuretic Peptide
  • BNP Brain Natriuretic Peptide
  • BNP preproBNP (1-134), a form of storage of the molecule inside cardiomyocytes. This is cleaved to release a signal peptide and proBNP (1-108).
  • ProBNP (1-108) consists of a 108 amino acid polypeptide, sequence: H ⁇ LGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGV WKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR 76 S 77 PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSG LGCKVLRRH 108 (SEQ ID NO.1).
  • BNP also designated BNP (77-108) or BNP-32, even BNP (1-32 ), and the N-terminal part of the prohormone, BNP (1-76), also known as the N-terminal fragment of proBNP or NT-proBNP.
  • BNP or BNP the vasoreactive form of the molecule, consists of a peptide of 32 amino acids, of sequence: S 77 PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH 108 (SEQ ID No. 2).
  • NT-proBNP or BNP (1-76) consists of the 76 N-terminal amino acids of proBNP (1-108) constituting the following sequence:
  • the half-life of BNP is very short and its plasma concentration is low. As a result, a number of false negative responses are seen in subjects at risk for heart failure.
  • the BNP assay (77-108) does not allow to correctly discriminate patients in stage I of the NYHA classification, healthy subjects (Clerico A. et al. J. Endocrinol. Invest. 1998; 21: 170-9 ) (Del Ry S. et al. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2000; 60: 81-90).
  • patent application WO 93/24531 describes a method of in vitro diagnosis of heart failure based on the detection of BNP (1-76) (N-terminal fragment of proBNP), an abundant compound which has a long half-life compared to that of the hormone BNP (77-108).
  • BNP (1-76) N-terminal fragment of proBNP
  • the method described in application WO 93/24531 does not seem simple to implement on BNP (1-76) in blood samples. Indeed, the only examples shown are made, not on real sera, but on standard ranges obtained using a synthetic peptide, the BNP peptide (47-64), BNP sub-sequence (1-76 ).
  • a highly sophisticated automated system has since proven necessary.
  • proBNP (1-108) does not appear to be recognized. Rather, it suggests that proBNP (1-108) could be secreted into the circulation from cardiac tissue but would then be rapidly degraded to a smaller peptide by cleavage of N-terminal acids. Or, according to the article, proBNP (1-108) would be presented in such a way that the anti proBNP (1-108) antiserum would be unable to bind to it. Finally, the authors suggest that BNP (1-76) (N-terminal fragment of proBNP) could even be a more specific marker of cardiac dysfunction than BNP (77-108) or than the N-terminal fragment of proANP.
  • proBNP (1-108) When studying the various circulating forms of proBNP (1-108), they hypothesized that proBNP (1-108) would circulate in the blood, both as an intact prohormone and as cleavage products, BNP (1-76) (N-terminal fragment of proBNP) and BNP (77-108). However, nothing is said or suggested in the article concerning a possible physiological activity of proBNP (1-108) or any diagnostic interest of proBNP (1-108) as a predictive or diagnostic marker of ventricular heart failure.
  • BNP-32 degradation product that has lost the N-terminal serine and praline (this is des-SerPro-BNP (BNP3-32)) of the hormonal form of BNP-32 (here called BNP (1-32)).
  • BNP (1-32) the hormonal form of BNP-32
  • ProBNP (1-108) and hormonal BNP are therefore secreted by the heart into the blood.
  • proBNP (1-108) in its oligomerized form (trimer) is present in a concentration close to that of circulating BNP (77-108), but they do not measure it. Consequently, the correlation of the concentration of proBNP (1-108) with the clinical condition of the patients is not studied. It follows that the diagnostic or prognostic benefit of serum proBNP (1-108) has not been demonstrated. It is also not suggested that it is possible to dose it routinely.
  • proBNP a number of epitopes present on proBNP (1-108) are known.
  • the epitope with sequence S 77 PKMVQGSGC 86 SEQ ID No. 105
  • the epitope with sequence R 65 KMVLYTLRAPR 76 SEQ ID No.
  • the authors of the present invention therefore set out to develop an alternative method for solving the problem posed.
  • At the heart of the present invention is the unexpected discovery, made by the inventors, of an epitope with unique properties located in the domain of the hinge sequence Y 70 TLRAPR 76 S 77 PKMVQGSG 85 (SEQ ID No. 4) or of the sequence Y 70 TLRAPR 76 S 77 PKMVQGS 84 (SEQ ID No. 108) of proBNP (1-108) and comprising at least the sequence RAPR 76 S 77 P (SEQ ID No. 5).
  • the authors of the present invention have demonstrated that the minimum epitope recognized by the antibodies according to the invention has the following sequence: RAPR 76 S 77 P. They have further shown that a good way of obtaining the antibodies object of the present invention is to immunize animals with a peptide of general formula: a 1 - X 1 - RAPRSP - X 2 - a 2 (I) where
  • a 1 can be H or represent a chemical function or group chosen from a thiol, alcohol, aminoxy, primary or secondary amine function, an amino-carboxyl group, a biotinyl group and an acetyl group,
  • X 1 represents a peptide sequence of 0 with 3 amino acids, whether from the natural sequence of proBNP (1-108) or not,
  • X 2 represents a peptide sequence of 0 to 8 amino acids, preferably 7 amino acids, derived from the natural sequence of proBNP (1-108) or not, a 2 can represent an OH, NH 2 function or an alkoxyl group.
  • the authors of the present invention have shown that it is possible to obtain the same specific antibodies by immunization of an animal with a peptide of formula:
  • X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III) where X can be H or represent either an acetyl group or 1 to 3 amino acids not belonging to the proBNP (1-108) sequence, and where Z can represent an OH function, or 1 to 3 amino acids not belonging to the proBNP sequence (1-108).
  • the authors of the present invention have also developed a simple and reliable method for the early diagnosis of heart failure based on the detection of proBNP (1-108) circulating in the blood and a kit allowing the implementation of this procedure. detection of circulating proBNP (1-108).
  • the present invention therefore relates to an anti proBNP antibody (1-
  • proBNP (1-108) characterized in that, on the one hand, it specifically recognizes the sequence Y 70 TLRAPR 76 S 77 PKMVQGSG 85 of proBNP (1-108) and does not substantially recognize BNP (1-76) nor BNP ( 77-108), and, on the other hand, has the ability to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in human serum or plasma samples.
  • the present invention further relates to an anti proBNP antibody (1- 108) characterized in that, on the one hand, it specifically recognizes the sequence Y 70 TLRAPR 76 S 77 PKMVQGS 84 of proBNP (1-108) and does not substantially recognize BNP (1-76) or BNP (77-108), and on the other hand, has the ability to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in human serum or plasma samples.
  • the present invention more particularly relates to an anti proBNP antibody (1-108) characterized in that, on the one hand, it specifically recognizes the RAPR 76 S 77 P sequence of proBNP (1-108) and does not substantially recognize not BNP (1-76) nor BNP (77-108), and, on the other hand, ability to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in human serum or plasma samples.
  • the present invention further relates to a process for obtaining anti proBNP (1-108) antibodies specifically recognizing the sequence Y 7 oTLRAPR 76 S 77 PKMVQGSG 85, the sequence Y 7 oTLRAPR 76 S 77 PKMVQGS 84 and / or the RAPR 76 S 77 P sequence of proBNP (1-108) with the substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108), and having the capacity to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in human serum or plasma samples characterized in that an animal is immunized with the whole molecule of proBNP (1-108), then in that it is exhausted, using the peptide BNP (77-108 ) and / or the BNP peptide (1-76), the antiserum obtained.
  • an antiserum obtained against a given specific antigen (the immunizing antigen)
  • the immunizing antigen is meant the elimination of non-specific antibodies, potentially present in this antiserum, by contacting and incubating said antiserum with "non-specific antigens", ie antigens different from the immunizing antigen, then separation
  • an antiserum recognizing the sequence Y 7 oTLRAPR 76 S77PKMVQGSG85, and / or the sequence
  • Y 7 oTLRAPR7 6 S77PKMVQGS 8 or the RAPR 76 S 7 7P sequence of proBNP (1-108) can be exhausted, i.e. made specific, by contacting BNP (77-108) and / or BNP (1-76) above-mentioned, the latter being able, for example, to be immobilized in the solid phase and to serve as a support for chromatography by immunoadsorption according to conventional techniques, known to those skilled in the art.
  • the antibody finally present in the exhausted antiserum is here a monospecific polyclonal antibody.
  • the present invention also relates to a peptide of formula: a ⁇ - X 1 - RAPRSP - X 2 - a 2 (I)
  • OR ai can be H or represent a chemical function or group chosen from a thiol, alcohol, aminoxy, primary or secondary amine function, an amino-carboxyl group, a biotinyl group and an acetyl group,
  • Xi represents a peptide sequence of 0 to 3 amino acids, originating from the natural sequence of proBNP (1-108) or not,
  • X 2 represents a peptide sequence of 0 to 8 amino acids, preferably 7 amino acids, derived from the natural sequence of proBNP (1-108) or not, a 2 can represent an OH, NH 2 function or an alkoxyl group.
  • the present invention also relates to a peptide of formula: XY 7 ⁇ TLRAPR7 6 S 7 7PKMVQGSG85-Z (ll) where X may be H, or represent either an acetyl group, or 1 to 3 amino acids not belonging to the sequence proBNP (1-108), and where Z can represent an OH function, or 1 to 3 amino acids not belonging to the proBNP (1-108) sequence.
  • the present invention further relates to a peptide of formula: X-Y7 ⁇ TLRAPR 76 S7 7 PKMVQGS 8 4-Z (III) where X may be H, or represent either an acetyl group, or 1 to 3 amino acids not belonging to the sequence of proBNP (1-108), and where Z can represent an OH function, or 1 to 3 amino acids not belonging to the sequence of proBNP (1-108).
  • X may be H, or represent either an acetyl group, or 1 to 3 amino acids not belonging to the sequence of proBNP (1-108), and where Z can represent an OH function, or 1 to 3 amino acids not belonging to the sequence of proBNP (1-108).
  • a peptide comprising a sequence derived from the sequence X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II) or from the sequence XY 7 oTLRAPR 76 S 77 PKMVQGS 84 -Z (III) by substitution of one or more of the amino acids Y70, T 71 , L 72 , K 79 , M 8 o, V 8 ⁇ , Qs2, G 8 3, S 84 and G 8 5, with X possibly being absent or representing either an NH 2 function or 1 to 3 amino acids not belonging to the proBNP sequence (1-108), and where Z may be absent or represent either an OH function, or 1 to 3 amino acids not belonging to the proBNP sequence (1-108 ).
  • the invention relates to the peptide of sequence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, and the peptide of sequence Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84.
  • a subject of the invention is also a process for obtaining anti proBNP (1-108) antibodies specifically recognizing the sequence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 and / or the RAPR 76 S 77 P sequence of proBNP (1-108).
  • the antibody thus obtained is a monospecific antibody.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining anti proBNP (1-108) antibodies specifically recognizing the sequence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, Y70TLRAPR76S77PKMVQGS 84 and / or the RAPR 76 S 77 P sequence of proBNP (1-108).
  • substantial exclusion of BNP (1- 76) and BNP (77-108), and having the ability to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in serum or plasma samples humans characterized in that an animal is immunized with a peptide of formula:
  • the subject of the invention is also a process for obtaining a hybridoma secreting anti proBNP antibodies (1-108) specifically recognizing the sequence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 Y7oTLRAPR 7 6S 77 PKIv1VQGS 8 4 and / or the sequence RAPR 76 S 77 P proBNP (1-108) with the substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108), and having the ability to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in human serum or plasma samples characterized in that an animal is immunized with a peptide of formula:
  • X-Y7 ⁇ TLRAPR7 6 S7 7 PKMVQGSG 8 5- Z (II) or with a peptide of formula XY 7 oTLRAPR 76 S7 7 PKMVQGS 84 -Z (III), in substituted form, conservatively or not, provided that it retains intact (in particular unsubstituted) the RAPR75S77P portion, where X and Z are as defined above and, optionally, in what is exhausted, using the BNP peptide (77-108) and / or the BNP peptide (1-76), the antiserum obtained.
  • Another subject of the invention is a process for obtaining anti proBNP antibodies (1-108) which specifically recognize the sequence
  • Another subject of the invention is a process for obtaining a hybridoma anti proBNP antibody secretor (1- 08) specifically recognizing the sequence Y 7 oTLRAPR7 6 S77 KMVQGSG 85l the sequence
  • an animal is immunized with a peptide chosen from the peptides of the following formulas: ai - Xi - RAPRSP - X 2 - a 2 (I) where ai, Xi, X 2 , and a 2 have the same meaning as above,
  • lymphocyte is fused with myeloma cells to obtain at least one immunoglobulin secreting hybridoma.
  • the subject of the invention is also such a hybridoma and the monoclonal anti proBNP (1-108) antibody secreted by said hybridoma.
  • the present invention further relates to a method of in vitro diagnosis of heart failure in a human comprising bringing a biological sample, preferably blood, plasma or serum, into contact with an anti proBNP antibody (1- 108) specifically recognizing the sequence Y 7 oTLRAPR76S77PKMVQGSG 85 , the sequence
  • the invention generally provides a method of in vitro diagnosis of heart failure in a human comprising: a) bringing a biological sample, preferably blood, plasma or serum, into contact with an anti proBNP antibody ( 1-108) specifically recognizing the sequence Y oTLRAPR7 6 S77PKMVQGSG 8 5, the sequence Y 7 oTLRAPR 7 6S77PKMVQGS 8 4 and / or the sequence RAPR 76 S 7 7P of proBNP (1- 108) with the substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108), and having the capacity to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in human serum or plasma samples, b) incubation of the mixture under conditions allowing the formation antigen-antibody complexes; and c) revealing the antigen-antibody complexes formed, optionally using a labeled detection antibody capable of specifically binding to proBNP (1-108) present in the first complex, or using '' a labeled detection antigen capable of binding to the directed antibody against said proBNP
  • the invention provides a method of diagnosing heart failure which comprises, in addition to steps a, b and c above, a step d) of correlating the amount of antigen-antibody complexes revealed in clinical state from subject.
  • the present invention further relates to a kit for the detection of proBNP (1-108) in a biological sample, in particular in a blood, plasma or serum sample, containing at least one anti proBNP antibody (1- 108) so recognizing specific the sequence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, the sequence Y7oTLRAPR7 6 S 7 7PKMVQGS 8 4 and / or the RAPR 76 S 77 P sequence of proBNP (1-108) with the substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108 ), and having the ability to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in human serum or plasma samples.
  • a kit for the detection of proBNP (1-108) in a biological sample in particular in a blood, plasma or serum sample
  • at least one anti proBNP antibody (1- 108) so recognizing specific the sequence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, the sequence Y7oTLRAPR7 6 S 7 7PKMVQGS 8 4 and / or the RAPR
  • the invention relates to a kit for detecting proBNP (1-108) in a biological sample, in particular in a blood, plasma or serum sample, containing, as standard and / or control, a compound containing at least one peptide chosen from the group of peptides of the following formulas:
  • a “biological sample” or even a “biological fluid sample” is preferably constituted by a biological fluid, such as blood, plasma, serum, urine, cerebrospinal fluid, saliva, etc.
  • heart failure is meant the medical condition in which an abnormality in cardiac function is responsible for the inability of the heart to pump blood sufficiently to meet the metabolic needs of the body and / or in which the heart provides for the needs but with abnormally high filling pressures. It may especially be a right and / or left ventricular failure.
  • antibody refers to any whole antibody or functional fragment of an antibody (obtained by genetic engineering or not), comprising, or consisting of, at least one antigenic combination site, allowing said antibody to bind to at least an antigenic determinant of an antigenic compound. Examples of antibody fragments that may be mentioned are the Fab, Fab ', F (ab') 2 fragments and also the variable single-chain fragments (scFv chains).
  • the anti proBNP (1-108) antibodies according to the invention can be of polyclonal or monoclonal type.
  • a polyclonal anti proBNP antibody (1-108) according to the invention can, inter alia, be obtained by immunization of an animal such as a rabbit, a mouse, etc. using proBNP (1 -108) whole, removal and then exhaustion of the antiserum obtained on, for example, an immunoadsorbent containing BNP (77-108) and / or BNP (1-76) according to methods known per se to those skilled in the art.
  • An anti proBNP monoclonal antibody (1-108) according to the invention can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kôhler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)).
  • capture antibody an antibody or a part of antibody, preferably fixed on a solid phase, which is capable of retaining the proBNP (1-108) antigen present in a biological sample, by affine binding.
  • the presence of the antigen in the biological sample is revealed by "detection means".
  • the invention provides in particular for detection using at least one “detection antibody”.
  • a detection antibody labeled, is capable of binding to the captured antigen, by affine bonding, by recognizing an epitopic site, different from that recognized by the capture antibody.
  • labeled refers both to direct labeling (by means of enzymes, radioisotopes, fluorochromes, luminescent compounds, etc.) and to indirect labeling (for example, by means of antibodies themselves labeled directly or using reagents of a labeled “affinity pair”, such as, but not exclusively, the labeled avidin-biotin pair, etc.).
  • antigenic fragment any part of proBNP (1-108) capable of inducing the synthesis of antibodies substantially specific for only proBNP (1-108) in an immunized animal.
  • an “antigenic fragment” contains at least the “epitopic site” or epitope RAPR75S77P.
  • An “epitopic site” or “epitope” is an amino acid sequence which is recognized by at least one antibody and allows the specific binding thereof.
  • the term “monospecific polyclonal antibody” applies to any polyclonal antibody having specificity for a single epitope. This means that the antibody is capable of binding an amino acid sequence of the sequence of proBNP (1-108) containing the amino acids comprising epitope, but is unable to link an amino acid sequence of the proBNP (1-108) sequence that does not contain the amino acids comprising the epitope.
  • amino acids with a polar side chain such as asparagine, glutamine, serine, threonine and tyrosine
  • amino acids with a non-polar side chain such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, methionine, tryptophan and cysteine
  • basic side chain amino acids such as lysine, arginine and histidine
  • amino acids with an acid side chain such as aspartic acid and glutamic acid.
  • non-conservative substitution is meant any other type of substitution, which does not significantly modify the immunoreactivity of the peptide obtained compared to that of the original peptide.
  • the determination of the percentage of the cross-reaction is done according to methods known per se to those skilled in the art, for example, that illustrated in Example 5.
  • the "substantial" non-recognition of the BNP (1-76) and BNP (77-108) peptides preferably corresponds to an absence or almost absence of reaction of the antibodies of the invention with these peptides.
  • the expression “with the substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108)” means that the antibody “does not substantially recognize BNP (1-76) or BNP (77 -108) ”in the sense seen above.
  • the antibodies used in the present invention are antibodies specific for the antigen, and, for this reason, are monoclonal antibodies or monospecific polyclonal antibodies, that is to say that they specifically recognize only one epitope.
  • the monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of lymphocyte fusion and culture of hybridomas described by Kôhler and Milstein, Nature, 1975, 256: 495-497. Other methods for preparing monoclonal antibodies are also known (Harlow et al, ed., 1988 "Antibodies: a laboratory manual”).
  • Monoclonal antibodies can be prepared by immunizing a mammal (for example a mouse, a rat, a rabbit, or even a human being, etc.) and using the lymphocyte fusion technique leading to hybridomas (Kôhler and Milstein, 1975) .
  • Monoclonal antibodies can, for example, be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages which have V gene libraries on the surface of the phage (e.g. fUSE5 for E. coli, Scott, JK and Smith, GP, Science, 1990, 249: 386-390). Protocols for the construction of these antibody libraries are described in Marks et al, 1991, J. Mol. Biol, 222 -.581-597).
  • Polyclonal antibodies can be obtained from the serum of an animal immunized against an antigen of peptide nature according to the usual procedures.
  • the polyclonal antibodies thus obtained may, if necessary, and by exhaustion with BNP (77-108) and BNP1-76, according to techniques known to those skilled in the art such as, for example, column immunoadsorption , be made monospecific of the sequence Y 7 oTLRAPR 7 6S 77 PKMVQGSG 8 5, of the sequence Y7oTLRAPR 7 6S 7 7PKMVQGS 84 and / or a peptide comprising the sequence RAPR76S77P, thus ensuring the specificity with respect to proBNP (1-108), with the substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108).
  • the capture antibody is chosen so that it specifically recognizes an epitope, on the patient's natural antigen, while the detection antibody is chosen, preferably, but not necessarily so as to what he specifically recognizes is another epitope, on the patient's natural antigen.
  • the biological sample can optionally be treated in a preliminary step, or placed directly in the presence of at least one capture antibody under conditions favoring exposure of the epitope to be detected.
  • the diagnostic method according to the invention can be carried out according to various formats well known to those skilled in the art: in solid phase or in homogeneous phase; in one or two steps; in the sandwich method or in the competitive method, by way of nonlimiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • Microplates in particular polystyrene microplates, such as those sold by the company Nunc, Denmark, may be used, by way of nonlimiting examples of solid phase. It is also possible to use particles or solid beads, paramagnetic beads, such as those supplied by Dynal or Merck-Eurolab (France) (under the brand name EstaporT) ⁇ 0 u or test tubes made of polystyrene or polypropylene, etc.
  • a sandwich type immunoassay format between two antibodies is particularly advantageous for the detection of antigens present in the biological sample.
  • Kits Kits and reagents useful for the detection of proBNP (1-108) in a biological fluid sample in accordance with the method of the invention, can be provided for easy practice of the invention and applicable to many samples organic.
  • ProBNP detection kits (1-108) in a biological sample can contain at least one antibody as defined above.
  • Other kits, containing as standard and / or control, at least one peptide of formula (I), (II) or a substituted peptide as defined above, can also be useful for the implementation of the invention.
  • kits for detecting proBNP (1-108) in a sample of biological fluid comprising:
  • At least one anti proBNP antibody (1-108) specifically recognizing the sequence Y70TLRAPR7 6 S 7 7PKMVQGSG 85 , the sequence Y7oTLRAPR 76 S77PKMVQGS 8 4 and / or the RAPR 76 S 7 7P sequence of proBNP (1- 108) to substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108), and having the ability to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in human serum or plasma samples, and which is preferably an antibody for capturing said proBNP (1-108) present in the biological sample, and - a labeled conjugate capable of specifically binding to the antibody antigen complexes formed.
  • the capture antibody can be advantageously presented in a form immobilized on a solid phase, such as a microplate, for example, but not exclusively.
  • a preferred kit includes at least:
  • an anti proBNP capture antibody specifically recognizing the sequence Y 7 oTLRAPR 76 S 77 PKMVQGSG 85 , the sequence Y 7 oTLRAPR 76 S 77 PKMVQGS 8 , and / or the sequence RAPR76S 77 P of proBNP (1 - 108) with the substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108), and having the capacity to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in human serum or plasma samples, said capture antibody being immobilized on a solid phase; and - a detection antibody, labeled, directed against another intact epitope, proBNP (1-108), or optionally,
  • a labeled detection antigen which is a peptide of proBNP (1-108) or proBNP (1-108) itself.
  • a kit for detecting proBNP (1-108) in a biological sample may contain:
  • At least one peptide as defined above useful in particular as a standard and / or control.
  • FIG. 1 represents the reactivity of the polyclonal rabbit antibodies # 046 805 purified on protein A-sepharose with proBNP (1-108), the BNP fragment (1-76), BNP (77-108), or GST ( Glutathione-S-transferase, used as a control protein) adsorbed on a microplate at 0.25 ⁇ g / ml.
  • FIG. 2 represents the reactivity of the polyclonal antibodies of the rabbit filtrate # 046 805 obtained after exhaustion on BNP-K 3 -NHS-sepharose resin.
  • the polyclonal antibodies are prepared in the form of dilution ranges from 2 to 20 ⁇ g / ml, then tested on wells coated with the proBNP (1-108), BNP (1-76) or BNP (77-108) polypeptide adsorbed at 0, 25 ⁇ g / ml.
  • FIG. 3 represents the reactivity of the polyclonal antibodies of the rabbit filtrate # 046 832 obtained after exhaustion on BNP-K 3 -NHS-sepharose resin.
  • the polyclonal antibodies are prepared in the form of dilution ranges from 5 to 20 ⁇ g / ml, then tested on wells coated with the proBNP (1-108), BNP (1-76) or BNP (77-108) polypeptide adsorbed at 0 , 25 ⁇ g / ml.
  • FIG. 4 represents the reactivity of the polyclonal serum eluate from the rabbit # 046 805 obtained after exhaustion on BNP-K 3 -NHS-sepharose resin.
  • the polyclonal antibodies are prepared in the form of dilution ranges from 2 to 20 ⁇ g / ml, then tested on wells coated with proBNP (1-108), BNP (1-76) or BNP (77-108) polypeptide adsorbed at 0 , 25 ⁇ g / ml.
  • FIG. 5 represents the reactivity of the eluate of the polyclonal rabbit serum # 046 832 obtained after exhaustion on BNP-K 3 -NHS-sepharose resin.
  • the polyclonal antibodies are prepared in the form of dilution ranges from 5 to 20 ⁇ g / ml, then tested on wells coated with the proBNP (1-108), BNP (1-76) or BNP (77-108) polypeptide adsorbed at 0 , 25 ⁇ g / ml.
  • FIG. 6 represents an epitopic analysis using the spot technique of the polyclonal rabbit serum # 046 805 before exhaustion. (For this example, the background noise is 30.4 ⁇ 5.93 relative intensity units.)
  • FIG. 7 represents an epitopic analysis using the spot technique of the polyclonal rabbit serum # 046 805 after exhaustion on BNP-K 3 -NHS-sepharose resin.
  • the background noise is 31.3 ⁇ 6.31 relative intensity units.
  • FIG. 8 represents the reactivity of the culture supernatant of the 3D4 hybridoma diluted to 1/2, tested on wells coated either with proBNP (1- 108), or BNP (1-76), or BNP (77- 108), or of peptide YTLRAPRSPKMVQGSG (C13P30), adsorbed at 1 ⁇ g / ml.
  • FIG. 9 shows a photograph of the 16% acrylamide gel into which each protein has been migrated (1 ⁇ g of protein per lane).
  • Lane 1 molecular weight marker
  • lane 2 proBNP (1-108) -GST
  • lane 3 GST (negative control protein)
  • lane 4 BNP (1-76) -GST
  • lane 5 BNP (77-108).
  • FIG. 10 shows the results of the westem-blot test of the antibody produced by the 3D4 hybridoma on proBNP (1-108) -GST (lane 2), GST
  • Figure 11 shows a calibration curve for the IRMA assay of proBNP (1-108).
  • Figure 12 shows the results in cpm (counts per minute of radioactivity) of the IRMA assay of proBNP (1-108) from samples from 14 healthy subjects and 15 patients suffering from heart failure.
  • FIG. 13 shows the correlation between the concentrations of proBNP (1-108) (in pg / ml) determined using the radioimmunometric assay according to the invention and the concentrations of BNP (1-76) (pg / ml) determined , using the assay on the Elecsys® automated device (Hoffmann La Roche brand), samples from 14 patients suffering from heart failure.
  • FIG. 14 represents a calibration curve for the ELISA assay of proBNP (1-108) according to the invention.
  • FIG. 15 represents an evaluation of the cross reaction, with respect to BNP (1-76) and BNP (77-108), of the polyclonal rabbit antibody # 046 805 coupled with biotin, used in sandwich in the proBNP ELISA assay (1-108) together with the anti-BNP polyclonal antibody (77-108).
  • FIG. 16 represents the evaluation of the cross reaction, with respect to the
  • Synthetic peptides are produced by standard techniques well known to those skilled in the art. We can cite, as an example, the Merrifield type synthesis which is advantageous given its ease of implementation (Merrifield, (1963); R.C. Sheppard (1971); Atherton et al. (1989)). As an automatic synthesizer, you can use the "9050 Plus Pep Synthesizer” from Millipore, the “Pioneer” from Perspective, or the "433A” from ABI. The peptides can also be obtained by synthesis in homogeneous phase.
  • the inventors have synthesized the following peptides containing the amino acid sequence of the hinge region R 76 S 77 :
  • NB ⁇ A means beta-alanine.
  • the invention therefore also relates to any peptide chosen from the group consisting of the above sequences.
  • the peptide is coupled to a carrier protein KLH (Keyhole Lympet Hemocyanin), Thyroglobulin, BSA (Bovine Serum Albumin, via different functions (thiol, amino, aldehyde ...) so as to make the peptide more immunogenic.
  • coupling agent used to bind the peptide to the protein can be hetero or homo-bifunctional.
  • the most commonly used reagents are BS 3, sSMCC, SPDP, glutaraldehyde ...
  • One of the coupling techniques used is that which uses glutaraldehyde as a coupling chemical agent and KLH as a carrier protein.
  • the coupling of KLH with the peptide is carried out on the basis of the amino functions of the peptide (mainly N-terminal group and amino group carried by lysine).
  • a solution of the peptide C13P30 of sequence YTLRAPRSPKMVQGSG-NH 2 (SEQ ID No. 16) or of peptide CN32 of sequence YTLRAPRSPKMVQGS- NH 2 (SEQ ID No. 109) at 5 mg / ml is prepared in PBS buffer Dulbecco NaCI 0.15M at pH 7.4.
  • a 20 mg vial of lyophilized KLH in PBS buffer (Pierce # 77600) is taken up in 2 ml of PPI water (water for injection), so as to obtain a solution of KLH at 10 mg / ml in PBS buffer.
  • 1 ml of the peptide solution i.e. 5 mg
  • 1.25 ml of the KLH solution i.e. 12.5 mg
  • 2.25 ml of a 2% glutaraldehyde solution prepared extamporarily from 25% glutaldehyde, Sigma # G-5882
  • the 2% glutaraldehyde solution is added dropwise and with stirring of the mixture.
  • the conjugation reaction is carried out for 2 hours 30 minutes of incubation at room temperature.
  • the coupling reaction is stopped by adding a 100 mg / ml sodium borohydride solution so as to reach a final concentration of 10 mg / ml.
  • the mixture is incubated overnight at 4 ° C.
  • the solution is dialyzed overnight at 4 ° C. against Dulbecco PBS buffer at pH 7.4.
  • the solution is finally aliquoted and stored at -80 ° C.
  • rabbits females of New Zealand strain
  • rabbits were immunized using the peptide Cys-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH 2 coupled to KLH according to Example 2.
  • an emulsion of 1.5 ml of peptide coupled to KLH with 1.5 ml of complete Freund's adjuvant (Sigma # F-5881) is produced, and 1 ml of this latter emulsion (i.e. 200 ⁇ g of peptide) is injected intradermally at each of the rabbits.
  • Two boosters are made 20 days apart by injecting intradermally 1 ml of a peptide emulsion coupled to KLH (ie 200 ⁇ g of peptide) with incomplete Freund's adjuvant (Sigma # F-5506). Twenty days after the second booster, a third booster is given in the same way as the previous booster but with subcutaneous injection. Twenty days after this last reminder, and after evaluation of the antibody titer obtained, the rabbits are bled. More particularly, the polyclonal antibodies of rabbits identified by the numbers # 046 805 and 046 832 obtained by immunization with the peptide C-YTLRAPRSPKMVQGS-NH2 (SEQ ID No.
  • the rabbit sera are centrifuged for 30 minutes at 4,500 rpm at 4 ° C. After decantation, the serum is diluted by half in 1.5M glycine buffer, pH 8.0 containing 1M NaCl.
  • polyclonal antibodies The purification of polyclonal antibodies is carried out by affinity chromatography on a protein A-sepharose gel (Amersham Biosciences # 17.1279.02). Protein A extracted from Staphylococcus aureus specifically combines with the Fc fragment of the IgG molecules. Then the IgGs, all subclasses combined, are eluted at pH 3.0.
  • All the buffers used are degassed for 15 minutes in an ultrasonic bath before passing through the column, in order to prevent the formation of bubbles.
  • a chromatography column is prepared using 12 ml of protein A-sepharose.
  • the gel column is equilibrated for 40 minutes with distilled and degassed water, then for 40 minutes with Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.5 M NaCl, and finally with 1.5 M glycine buffer. at pH 8.0 containing 1 M NaCl, until a correct baseline is obtained.
  • the reactivity of the polyclonal antibodies is tested by ELISA on wells coated either with proBNP (1-108), or BNP (1-76), or BNP (77-108) adsorbed at 0.25 mcg / ml.
  • the obtained results for the rabbit polyclonal antibodies # 046 805 are presented in FIG. 1.
  • the rabbit polyclonal antibodies # 046 832 gave identical results.
  • the polyclonal antibodies in rabbits # 046 805 and # 046 832 are relatively specific for proBNP (1-108).
  • Example 4.b Depletion of IgG on BNP-K 3 -NHS-Sepharose resin
  • the purpose of this operation is to eliminate the cross-reactivity observed with respect to BNP (77-108).
  • BNP (77-108) was synthesized with an extension of 3 lysine residues in the C-terminal position (BNP-K 3 ) in order to promote its coupling to the NHS-sepharose resin by its C-terminal end. .
  • BNP-K 3 SPKMVQGSGCFGRKMDRlSSS-SGLG-CKVLRRHKKK (SEQ ID No. 104) was synthesized on a Pioneer synthesizer, using the chemistry "Fmoc" (9-fluorenylmethyloxy carbonyl) cited above under Example 1.
  • BNP-K 3 5 mg are dissolved using the NaHC03 100mM buffer, at pH 8.3 added with 0.5M NaCl at a concentration of 10mg / ml.
  • 2ml of NHS-Sepharose resin NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, Amerscham Biosciences # 17.0906.01
  • NHS-Sepharose resin NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, Amerscham Biosciences # 17.0906.01
  • the resin is washed with 15 ml of a cold 1 mM HCl solution. After centrifugation and elimination of the HCl solution, the resin is mixed with the BNP-K3 ligand at 10 mg / ml. The mixture is incubated for 1 hour at room temperature with slow stirring.
  • the non-reactive groups of the resin are blocked using 5 ml of 0.1 M glycine buffer, at pH 8.0. The mixture is incubated for 1 hour at room temperature with slow stirring. After centrifugation and elimination of the blocking buffer, the resin is taken up in 5 ml of 100 mM NaHCO 3 buffer, at pH 8.3 added with 0.5 M NaCl. Four washes using this buffer are carried out. At the last wash, the mixture is deposited on a chromatography column. After preparation of the chromatography column, 10 mg of rabbit IgG
  • # 046 805 and # 046 832 is specific for proBNP (1-108): no reactivity is observed on BNP (1-76) or on BNP (77-108). The eluate retains a high reactivity towards proBNP (1-108), but also a reactivity towards BNP (77-108). These results confirm the efficacy of the depletion of the polyclonal rabbit serum on the BNP-K3-NHS-sepharose resin.
  • BNP (77-108) is from Sigma (# B-5900), while proBNP (1-108) and BNP (1-76) were produced as recombinant proteins expressed after cloning into the vector pGEX- 2T (Amersham Pharmacia Biotech) and transfection in E coli, by conventional techniques well known to those skilled in the art.
  • the original vector was supplied by the company Berlex Biosciences (Richmond, CA, USA) and its preparation is described by Yan et al. (PNAS, 2000, vol. 97, pp. 8525-8529).
  • the concentration of proBNP (1-108) and that of BNP (1-76) were determined by the Bradford method of colorimetric determination of proteins (Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-54).
  • EXAMPLE 5 Determination of the Percentage of Cross Reaction of Anti ProBNP Antibodies (1-108) in Rabbits # 046 805 and # L01235 with Respect to BNP (1-76) and BNP (77-108)
  • BNP (77-108) is from Sigma (# B-5900), while proBNP (1-108) and BNP (1-76) have been produced as recombinant proteins.
  • concentration of these protein solutions was determined by the Bradford method of colorimetric determination of proteins (Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-54).
  • the conjugate used is a polyclonal anti-rabbit IgG antibody coupled to peroxidase (Sigma # A-9169)
  • Saturation buffer Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 1% serum bovine albumin (BSA, Sigma # A-7888) 5) Dilution buffer: PBS Dulbecco buffer at pH 7.4
  • Washing solution Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.1% Tween 20.
  • Development solution is composed: 7a) of a substrate buffer: 0.01 M citric acid solution, and 0.04 M trisodium citrate containing H 2 0 2 at 0.33 %, final pH 5.6, and
  • the test consists in evaluating the immunoreactivity of polyclonal antibodies directly on the various proteins immobilized in the wells of a microtiter plate.
  • sensitization solutions in PBS buffer Dulbecco pH 7.4 are first prepared: a first containing BNP (77-108) at 0.25 ⁇ g / ml, a second containing proBNP (1-108) at 0.25 ⁇ g / ml, one third containing BNP (1-76) at 0.25 ⁇ g / ml, and a fourth containing GST (background noise control protein) at 0.25 ⁇ g / ml. 100 ⁇ l of each of these solutions are deposited separately in the wells of a microplate. S The microplate is incubated overnight at 4 ° C.
  • the microplate is washed using 300 ⁇ l of Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.1% Tween 20, then saturated by adding 250 ⁇ l of Dulbecco PBS buffer to pH 7.4 containing 1% BSA. The microplate is then incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • the microplate is then washed (3 times) using the washing solution.
  • 100 ⁇ l of polyclonal antibody solution previously diluted to 2 and 1 ⁇ g / ml for the polyclonal rabbit serum # 046 805 and at 1/2500 and 1/5000 for the polyclonal rabbit serum # L01235, are deposited .
  • the reaction medium is incubated for 2 hours at room temperature.
  • the microplate is then washed 3 times with 300 ⁇ l of the washing solution.
  • 100 ⁇ l of the anti-rabbit anti-IgG polyclonal antibody conjugate coupled to peroxidase diluted to 1/8000 in dilution buffer, are added to each well of the microplate.
  • the reaction medium is incubated for 1 hour at room temperature.
  • the plates are then washed (5 washes) with 300 ⁇ l of the washing solution. In each well, 100 ⁇ l of the developer solution are distributed. The reaction is allowed to develop in the dark for 20 minutes at room temperature (18-24 ° C). s Then 50 ⁇ l of the stop solution are distributed in each well.
  • Example 6 Identification of the epitope recognized by the polyclonal sera from rabbits # 046 805 and # 046 832 before and after exhaustion on BNP-K 3 -NHS-sepharose resin
  • the polyclonal sera from rabbits # 046 805 and # 046 832 before and after exhaustion on BNP-K 3 -NHS-sepharose resin were tested by the spot method in order to identify the epitope recognized by these polyclonal sera.
  • This method described by Frank (Tetrahedron, 1992; 48: 9217-32), allows rapid synthesis on the nitrocellulose membrane of a large number of peptides with predefined sequences.
  • the protocols used are those described by Molina et al. (Pept. Res., 1996; 9: 151-5).
  • On a sheet of paper are created circular areas (spots) of about 5 mm in diameter, with an amino function, which serve as anchors for the C-terminal amino acid of the synthetic peptide.
  • the peptide chain is extended by successive additions of activated Fmoc-amino acids.
  • the side chains of amino acids are blocked by suitable chemical groups. All peptides are synthesized with their N-terminal N-acetylated residue. At the end of the synthesis, the side chains are deprotected by the action of trifluoroacetic acid. This treatment does not affect the bond between the peptide and the cellulosic support, and the reactivity of the peptides can be evaluated by a colorimetric test.
  • the series of membrane-synthesized peptides consists of 32 pentadecapeptides shifted by 3 amino acid residues representing the entire sequence of proBNP (1-108).
  • Table 11 Spot membrane consisting of 32 pentadecapeptides shifted by 3 into 3 amino acid residues representing the entire sequence of proBNP (1-108)
  • TBS buffer Tris Buffer Saline
  • Blocking buffer Euromedex # SU-07-250
  • sucrose 5% sucrose
  • the spots are revealed by adding 30 ml of substrate solution (30 ml solution of CBS buffer (Citrate Buffer Saline) at pH 7.0 containing 120 ⁇ l of BCIP (5-bromo-4-chloro-3-lndolyl phosphate) 0.15M, 150 ⁇ l of MgCl 2 1M and 180 ⁇ l of MTT (Thiazolyl blue tetrazolium bromide) 0.1 M.
  • substrate solution 30 ml solution of CBS buffer (Citrate Buffer Saline) at pH 7.0 containing 120 ⁇ l of BCIP (5-bromo-4-chloro-3-lndolyl phosphate) 0.15M, 150 ⁇ l of MgCl 2 1M and 180 ⁇ l of MTT (Thiazolyl blue tetrazolium bromide) 0.1 M.
  • MTT Thiazolyl blue tetrazolium bromide
  • Example 7 Identification of the minimum epitope of polyclonal sera from rabbits # 046 805 and # 046 832 before and after exhaustion, by the Ala-scan method
  • polyclonal sera from rabbits # 046 805 and # 046 832, before and after exhaustion on BNP-K 3 -NHS-sepharose resin were tested by the spot method (described in example 6) in order to identify the epitope minimum, in the hinge peptide, allowing specific recognition of the only proBNP (1-108) by polyclonal sera.
  • YTLRAPRSPKMVQGS carrying a step-by-step substitution of each amino acid with an alanine or glycine residue. Reactivity of polyclonal sera from rabbits # 046 805 and # 046 832 before and after exhaustion on BNP-K 3 -NHS-sepharose resin.
  • NB the alanine or glycine residues substituted for the initial amino acids are underlined (A and G).
  • the amino acids critical in the recognition of the epitope recognized by the polyclonal rabbit serum # 046 805 before exhaustion are R 76 S 77 P, while after exhaustion of the polyclonal rabbit serum # 046 805 on BNP-K resin 3 - NHS-Sepharose, in addition to the motif R 76 S 77 P, the motif RA becomes a contributor.
  • Example 8 Identification of the minimum epitope of rabbit polyclonal serum # L01235, by the Ala-scan method
  • the polyclonal rabbit serum # L01235 specific from the start of proBNP (1-108) (unnecessary exhaustion), was tested by the spot method (described in example 6) in order to identify the minimum epitope, in the pivotal peptide, allowing specific recognition of the only proBNP (1-108) by polyclonal serum.
  • the membrane used is that described in Example 7.
  • the results of the Ala-scan analysis of the polyclonal rabbit serum # L01235 are presented in Table IV.
  • Table IV spot membrane with 16 pentadecapeptides YTLRAPRSPKMVQGS carrying a step-by-step substitution of each amino acid with an alanine or glycine residue. Reactivity of rabbit polyclonal serum # L01235.
  • NB the alanine or glycine residues substituted for the initial amino acids are underlined (A and G).
  • BALB / c strain mice (6 week old females) were immunized using the recombinant proBNP (1-108) described in Example 4.b, by standard techniques well known to those skilled in the art. .
  • an emulsion of 1 ml of proBNP (1-108) with 1 ml of complete Freund's adjuvant (Sigma # F-5881) is produced, and 300 ⁇ l of this emulsion (ie 100 ⁇ g of protein) are injected with subcutaneously to each of the mice.
  • Two boosters are performed 15 days apart by intraperitoneal injection of 300 ⁇ l of an emulsion of proBNP (1-108) (ie 100 ⁇ g of protein) with incomplete Freund's adjuvant (Sigma # F-5506).
  • mice 12 Fifteen days after the second reminder, a third reminder is carried out in the same way as the previous reminders but in injection subcutaneous. Finally, 15 days after this last reminder, blood samples are taken from the mice to analyze the immune response using the spot technique. The immune response of mouse 12 was found to be particularly interesting for the rest of the work.
  • the membrane-synthesized peptide series consists of 94 pentadecapeptides, each shifted by an amino acid residue, representing the entire sequence of proBNP (1-108).
  • the reactivity of the polyclonal serum of the mouse 12 diluted to 1 / 500th is tested on this membrane as described in Example 6. After scanning the membrane, the intensity of the spots of the membrane is evaluated (in units d relative intensity) using image processing software. The background noise, calculated from spots not detected by the antiserum, was 30 relative intensity units.
  • sequence H1PLGSPGSASDLETS15 SEQ ID No. 23
  • sequence L 17 QEQRNHLQGK 27 SEQ ID N ° 123
  • sequence L 38 EPLQESPRPTG 49 SEQ ID N ° 124) (spots 38 to 49).
  • the antiserum of mouse 12 also contains antibodies capable of recognizing spots whose peptide sequence comprises the motif RAPR7 6 S 7P: spots 64 to 68.
  • the peptide sequences of the spots are described in Table V.
  • Table V Epitopes of the hinge region recognized, using the spot technique, by the antiserum of the mouse 12.
  • Example 11 Obtaining monoclonal antibodies specifically recognizing proBNP (1-108), with the substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108) Mice (5 week female BALB / c ) selected for the production of monoclonal antibodies was immunized with the peptide SEQ ID No. 16 C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2 (C13P30) coupled to KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) according to the following protocol: 100 ⁇ g of the peptide coupled to KLH diluted volume to volume with complete Freund's adjuvant were injected subcutaneously. Four boosters were performed at an interval of 3 weeks with 100 ⁇ g of the peptide coupled to KLH diluted volume by volume with incomplete Freund's adjuvant, injected subcutaneously.
  • the mouse Three days before carrying out the lymphocyte fusion, the mouse underwent hyperimmunization according to the following protocol: the total dose of immunogen, here 100 ⁇ g of peptide C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2 coupled to KLH in sterile PBS buffer, is fractionated in 4 injections. The first and second injections each correspond to 1 / 10th of the total dose. These injections are given subcutaneously in different places and 45 minutes apart. The third injection, which corresponds to 2 / 10ths of the total dose, is given 45 minutes after the second injection, by subcutaneous route.
  • the total dose of immunogen here 100 ⁇ g of peptide C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2 coupled to KLH in sterile PBS buffer
  • the first and second injections each correspond to 1 / 10th of the total dose. These injections are given subcutaneously in different places and 45 minutes apart.
  • the third injection which corresponds to 2 / 10ths of the total dose, is given 45 minutes after
  • Lymphocyte hybridization is carried out according to the method described by Ko ⁇ hler and Milstein (Nature, 1975; 256: 495-97). It is carried out from lymphocyte cells extracted from the mouse spleen and myeloma cells (P3-X63-Ag8.653) previously cultured in RPMI 1640 medium (Bio-Whittaker # BE12-167F), supplemented with a mixture L-glutamine, penicillin and streptomycin (Sigma # G-6784), supplemented with 10% fetal calf serum previously decomplemented (Bio-Whittaker # BE02701E) and 8-azaguanine (Sigma # A-8526).
  • Lymphocyte cells and myeloma cells previously placed in RPMI 1640 medium (Bio-Whittaker # BE12-167F) supplemented with a mixture of L-glutamine, penicillin and streptomycin (Sigma # G-6784) without addition of fetal calf serum, are mixed at the rate of 5 lymphocyte cells for 1 myeloma cell. After centrifugation of the mixture 7 minutes at 900 r / min at room temperature, and resuspending the cell pellet, 1 ml of polyethylene glycol Hybri-Max ® (Sigma # P-7777) was added.
  • the cells After 1 minute of incubation in a water bath at 37 ° C, the cells are centrifuged for 1 minute and thirty seconds at 1000 rpm at room temperature. Finally after 2 minutes incubation in a water bath at 37 ° C, the pellet is resuspended and 6 ml of RPMI 1640 medium (Bio-Whittaker # BE12-167F) supplemented with a mixture of L-glutamine, penicillin and streptomycin (Sigma # G-6784) previously placed at 37 ° C, are added at the rate of 10O ⁇ l every 5 seconds, and 9ml of this same medium are added all at once.
  • RPMI 1640 medium Bio-Whittaker # BE12-167F
  • the pellet is taken up in RPMI 1640 medium (Bio-Whittaker # BE12-167F), supplemented with a mixture of L-glutamine, penicillin and streptomycin ( Sigma # G-6784), supplemented with 15% fetal calf serum previously decomplemented (Bio-Whittaker # BE02701 E) and HAT (Hypoxanthine, aminopterin, thymidine Sigma # H-0262) distribute, under 100 ⁇ l, 120,000 cells per well. The solution is deposited under 100 ⁇ l in the wells of the 96-well culture plates previously seeded with murine macrophages. The plates are then placed in a CO 2 incubator. Fifteen days after lymphocyte hybridization, the number of clones present in the fusion plates is estimated and expressed as a percentage of development of the hybridomas.
  • hybridomas The selection of hybridomas is carried out by ELISA on proBNP (1-108), BNP (1-76), BNP (77-108) and a peptide carrying the sequence RAPR 76 S 7 P (C13P30). Only hybridomas secreting antibodies capable of detecting proBNP (1-108) and the C13P30 peptide carrying the sequence RAPR 76 S 77 P and not substantially recognizing BNP (1- 76) nor BNP (77-108), are retained. The selected hybridomas are maintained in culture and clones in limiting dilution. The hybridomas thus cloned can then be used for the production of the monoclonal antibody in ascites fluid.
  • the inventors produced a murine hybridoma, the clone 3D4, secreting an immunoglobulin of isotype lgG- ⁇ having the characteristics of the antibodies according to the invention.
  • This hybridoma was deposited on July 31, 2003 at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25, rue du Dondel Roux, 75 724 Paris, Cedex 15, France) under the registration number CNCM I-3073.
  • the invention therefore also relates to the 3D4 hybridoma deposited at the CNCM under the registration number CNCM I-3073 and the monoclonal antibody which it secretes.
  • Example 12 Validation in ELISA of the Specificity of the Antibody Produced by the 3D4 Hybridoma
  • BNP (77-108) is from Sigma (# B-5900), while proBNP (1-108) and BNP (1-76) have been produced as recombinant proteins.
  • concentration of these protein solutions has been determined by the Bradford method of colorimetric determination of proteins (Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-54).
  • the conjugate used is a polyclonal donkey antibody anti-mouse IgG coupled to peroxidase (Jackson Immunoresearch # 715-035-150)
  • Saturation buffer PBS Dulbecco buffer at pH 7.4 containing 1% of serum bovine albumin (BSA, Sigma # A-7888)
  • Dilution buffer Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.1% BSA and 0.1% Tween 20.
  • Washing solution Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.1% Tween 20.
  • Development solution is composed: 7a) of a substrate buffer: 0.01 M citric acid solution, and 0.04 M trisodium citrate containing H 2 0 2 at 0.33 %, final pH 5.6, and
  • the test consists in evaluating the immunoreactivity of the culture supernatant of the 3D4 hybridoma directly on the various proteins immobilized in the wells of a microtiter plate.
  • the microplate is incubated overnight at 4 ° C. S After elimination of the sensitization solution, the microplate is washed using a Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.1% Tween 20, then saturated by adding 250 ⁇ l of Dulbecco PBS buffer at pH 7 , 4 containing 1% BSA. - / The microplate is then incubated for 1 hour at 37 ° C. The microplate is then washed (3 times) with 300 ⁇ l of the washing solution.
  • reaction medium is incubated for 2 hours at room temperature
  • microplate is then washed 3 times with 300 ⁇ l of the washing solution.
  • 100 ⁇ l of conjugate, polyclonal anti-mouse IgG antibody coupled to peroxidase diluted to 1/2000 in dilution buffer are added to each well of the microplate.
  • the reaction medium incubated for 1 hour at room temperature.
  • • / The plates are then washed (5 washes) with 300 ⁇ l of the washing solution.
  • 100 ⁇ l of the developer solution are distributed.
  • the reaction is allowed to develop in the dark for 20 minutes at room temperature (18-24 ° C).
  • 50 ⁇ l of the stop solution are distributed in each well. After stopping the reaction, the reading of the optical density is carried out with a spectrophotometer at 490/620 nm.
  • FIG. 8 illustrates the result of this test: the antibody produced in the supernatant of the 3D4 hybridoma is capable of detecting only proBNP (1 -108) and the immunization peptide C13P30, no reactivity is obtained on the BNP (1-76) and BNP (77-108).
  • These results validate the specificity of the antibody produced by the 3D4 hybridoma for proBNP (1-108) excluding BNP (1-76) and BNP (77-108).
  • the antibody according to the invention derived from the 3D4 hybridoma is therefore indeed an antibody specifically recognizing proBNP (1-108), with the substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108) .
  • EXAMPLE 13 Western Blot Validation of the Specificity of the Antibody Produced by the 3D4 Hybridoma
  • Electrophoretic transfer device 0.1 M Tris-tricin; 0.1% SDS 6) Sample buffer: Tris 0.5M, pH 6.8; 25% glycerol; 2% SDS; 14.4 mM beta-mercaptoethanol; 0.1% bromophenol blue 7) Electrophoretic transfer device
  • BNP (77-108) comes from Sigma (# B-5900), while proBNP (1- 108) -GST, BNP (1-76) -GST and GST ( used as a negative control) were produced as recombinant proteins. The concentration of these protein solutions was determined by the Bradford method of colorimetric determination of proteins (Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-54).
  • the conjugate used is a polyclonal donkey anti-mouse IgG antibody coupled with peroxidase (Jackson Immunoresearch # 715-035-150) 11) ECL kit for detection in western blot (Amersham Biosciences # RPN2106)
  • the implementation of this test comprises three main stages: the electrophoretic migration of the different proteins in a 16% acrylamide gel, then the transfer of these proteins onto a nitrocellulose membrane, and finally the western-blot.
  • Various solutions are prepared in sample buffer with a final volume of 35 ⁇ l: a first comprising 1 ⁇ g of proBNP (1-108) -GST, a second comprising 1 ⁇ g of GST, a third comprising 1 ⁇ g of BNP (1-76) -GST, and a fourth comprising 1 ⁇ g of BNP (77-108).
  • Each solution is incubated in a water bath for 5 minutes at 100 ° C., then deposited in a well of the gel.
  • the migration through the acrylamide gel is carried out at constant voltage at 120 V for 1 hour 30 minutes.
  • FIG. 9 corresponds to a photograph of the acrylamide gel obtained.
  • the proteins deposited are colored by coomassie blue. After migration, the proteins of the gel are transferred to a nitrocellulose membrane for 1 hour at 120 mA.
  • nitrocellulose membrane is then washed with 0.1% PBS + Tween buffer and saturated for 30 minutes at room temperature in 0.1% PBS + Tween buffer + 2% skimmed milk After 3 washes with 0.1% PBS + Tween buffer, the membrane is incubated for 1 hour at + 37 ° C., with stirring, with 5 ml of 3D4 hybridoma supernatant.
  • the membrane is incubated for 1 hour at room temperature with shaking with 10 ml of anti-mouse IgG conjugate coupled to peroxidase diluted to 1/2000 in 0.1% PBS + Tween buffer + 2% skimmed milk After 3 washes with 0.1% PBS + Tween buffer, the membrane is soaked in the ECL development reagent, before being exposed to a photographic film for 4 minutes.
  • the antibody produced in the supernatant of the 3D4 hybridoma is capable of detecting only the band corresponding to proBNP (1-108).
  • BNP (1-76), BNP (77-108), and GST are not detected by the 3D4 hybridoma antibody.
  • the antibody according to the invention derived from the 3D4 hybridoma is therefore indeed an antibody specifically recognizing proBNP (1-108), with the substantial exclusion of BNP (1-76) and BNP (77-108) .
  • the supernatant of the 3D4 hybridoma was tested by the spot method (described in example 6) in order to identify the epitope recognized by the antibody to the 3D4 hybridoma.
  • the results obtained indicate that the 3D4 antibody effectively recognizes peptide sequences comprising the motif RAPR7 6 S 7 7P.
  • the capture antibody used is the polyclonal antibody obtained from rabbit serum # 046 805 which is not exhausted.
  • the conjugate used is anti-BNP antibody (77-108) labeled N125 (anti-BNP-l 125). It is the tracer antibody of the BNP Shionoria kit marketed by the company Shionogi.
  • Saturation buffer Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 1% serum bovine albumin (BSA, Sigma # A-7888)
  • Dilution buffer Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.1% BSA and 0.1% tween 20 (Sigma, # P-1379).
  • Wash buffer Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing
  • Standard proBNP (1-108) produced in the form of a recombinant protein.
  • the principle of the test used is based on the radioimmuno logical method of the sandwich type, carried out in a microplate with a flat bottom and with breakable cups. he this is a one-time test where the sample (or standard solution of proBNP (1-108)) and tracer are added one after the other without intermediate washing.
  • An sensitization solution is firstly prepared with the polyclonal rabbit antibody # 046 805 diluted in PBS buffer Dulbecco at pH 7.4 at 40 ⁇ g / ml. 300 ⁇ l of this solution are deposited in each of the wells of the microplate.
  • microplate is incubated overnight at 4 ° C. After elimination of the sensitization solution, the microplate is washed using 300 ⁇ l of Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.1% Tween 20, then saturated by adding 300 ⁇ l of Dulbecco PBS buffer to pH 7.4 containing 1% BSA. The microplate is then incubated for 1 hour at 37 ° C. • f The microplate is then washed (3 times) using 300 ⁇ l of the washing solution (PBS buffer Dulbecco at pH 7.4 added with 0.1% Tween 20). In each well, 100 ⁇ l of standard solution of proBNP (1-108), serum or plasma are deposited.
  • ProBNP (1-108) if present, binds to the capture antibody retained on the solid phase.
  • 200 ⁇ l of the ready-to-use anti-BNP- 125 125 tracer solution (extracted from the Shionoria BNP Shionoria kit) are added to each of the wells.
  • the reaction medium is incubated overnight (18-22h) at 4 ° C.
  • the microplate is washed (3 times) using 300 ⁇ l of the washing solution. At the last washing and after aspiration of the washing solution, each well is transferred into a previously identified tube.
  • FIG. 12 presents the results in cpm (counts per minute) of the tests of these samples with the IRMA proBNP assay (1-108) according to the invention.
  • the results obtained on samples from patients suffering from heart failure are significantly higher than those obtained on samples from healthy subjects.
  • the coupling method uses an N-Hydroxy Succinimide derivative (NHS) of biotin which reacts with the primary amines of IgG to form an amide bond.
  • NHS N-Hydroxy Succinimide derivative
  • a 100mM solution of (+) - Biotin N-succinimidyl ester (Fluka # 14405) is prepared by dissolving Biotin in dimethylfomamide. Biotinylation is carried out in a glass bottle. 500 ⁇ g of the rabbit polyclonal antibody # 046 805 previously purified but not exhausted are deposited in the flask with 17 ⁇ l of the 100 mM biotin solution (the biotin / antibody molar ratio is 500). The reaction is carried out in PBS Dulbecco buffer at pH 7.4. The reaction mixture is incubated for 1 30 hours at room temperature with slow stirring. After coupling, the biotin is inactivated by adding a volume of 2M glycine buffer.
  • the mixture is incubated for 10 minutes at room temperature with slow shaking. Finally, the mixture is dialyzed overnight at 4 ° C. against Dulbecco PBS buffer at pH 7.4. The following day, a solution of sodium azide is added at 0.02% in final concentration. The conjugate is stored at 4 ° C.
  • An immunoenzymometric assay according to the invention has also been developed.
  • the capture antibody used is a polyclonal anti-BNP antibody (77-108) marketed by the company Stratrete Biosolution (# B9105RA00-A0).
  • the conjugate used is the polyclonal antibody of rabbit # 046 805 not exhausted coupled with biotin according to the method described in example 17.
  • Saturation buffer Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 1% serum bovine albumin (BSA, Sigma # A-7888)
  • Dilution buffer Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.1% BSA and 0.1% Tween 20.
  • Washing solution Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.1% of Tween 20.
  • proBNP standard (1-108) recombinant protein.
  • development solution is made up of:
  • the principle of the test used is based on the enzymoimmunological method of the sandwich type, produced in a microplate with a flat bottom. This is a two-step test where the sample (or the standard solution) is first incubated with the capture antibody, then after incubation and washing, the detection antibody is added.
  • An sensitization solution is firstly prepared with the anti-BNP polyclonal antibody (77-108) diluted in Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 at 10 ⁇ g / ml. 100 ⁇ l of this solution are deposited in each of the wells of the microplate. The microplate is incubated overnight at 4 ° C. After elimination of the sensitization solution, the microplate is washed using 300 ⁇ l of a Dulbecco PBS buffer at pH 7.4 containing 0.1% Tween 20, then saturated by adding 250 ⁇ l of Dulbecco PBS buffer to pH 7.4 containing 1% BSA. The microplate is then incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • the microplate is then washed (3 times) using the washing solution.
  • 100 ⁇ l of standard proBNP solution (1 -108), serum or plasma are deposited.
  • ProBNP (1-108) if present, binds to the capture antibody retained on the solid phase.
  • the reaction medium is incubated for 2 hours at room temperature.
  • the microplate is then washed (5 washes) with 300 ⁇ l of the washing solution.
  • 100 ⁇ l of rabbit polyclonal antibody # 046 805 biotinyl (concentrated to 6 ⁇ g / ml) are added to each well of the microplate.
  • the reaction medium incubated for 2 hours at room temperature.
  • microplate is then washed (5 washes) with 300 ⁇ l of the washing solution. Finally, 100 ⁇ l of streptavidin-POD conjugate diluted to 1 / 1000th are added to each of the wells of the microplate.
  • reaction medium is incubated for 1 hour 30 minutes at room temperature. • The plates are then washed (5 washes) with 300 ⁇ l of the washing solution. In each well, 100 ⁇ l of the developer solution are distributed. The reaction is allowed to develop in the dark for 20 minutes at room temperature (18-24 ° C). Then 50 ⁇ l of the stop solution are distributed in each well.
  • the optical density is read in a spectrophotometer at 490/620 nm.
  • Figure 14 shows the results obtained using a standard range of proBNP (1-108).
  • BNP (1-76) or BNP (77-108) No cross-reaction is observed with respect to BNP (1-76) or BNP (77-108): the signal obtained is equivalent to background noise, whatever the concentration tested.
  • the rabbit polyclonal antibody # 046 805 can be used in its non-exhausted version without causing the appearance of cross-reaction.
  • rabbit polyclonal antibody # 046 805 not exhausted coupled with biotin used in sandwich in the ELISA proBNP assay (1-108) together with the polyclonal anti-NT antibody -proBNP (1- 29).
  • ELISA assay of proBNP (1-108) using the protocol and the reagents described in Example 18, except that the anti-BNP polyclonal antibody (77-108) is here replaced by a anti-NT-proBNP polyclonal antibody (1-29), the cross-reaction of rabbit polyclonal antibody # 046 805, biotinyl with respect to BNP (1-76) and BNP (77-108) was evaluated ).
  • the anti-NT-proBNP (1-29) polyclonal antibody was produced according to the protocol described in Example 3, except that the peptide used as immunogen was the NT-proBNP (1-29) peptide coupled to the KLH. Concentration ranges from 5ng / ml to 100ng / ml were carried out with proBNP (1- 108), BNP (1-76) and BNP (77-108) and tested using the proBNP ELISA assay (1-108). The results of the variation of the optical density at 490nm as a function of the concentration are represented in FIG. 16 for each of the proteins.
  • the present invention has made it possible to discover a new epitope, RAPR 76 S 77 P, located on the hinge region of human proBNP (108), to derive immunogenic peptides therefrom. the container, and to obtain antibodies specific to proBNP (108), which do not substantially recognize BNP (1-76) and BNP (77-108), some of which have the ability to specifically recognize proBNP (1-108) circulating in human serum or plasma samples.
  • the present invention has made it possible to develop a dosage of circulating proBNP (1-108) thus allowing a diagnosis of heart failure in a simple manner, usable in routine and reliable.

Abstract

L'invention concerne le domaine du diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque. L'invention concerne plus particulièrement des anticorps spécifiques d'un domaine peptidique situé de part et d'autre de la zone charnière R76S77 du proBNP(1-108). L'invention concerne plus particulièrement un procédé d'obtention de ces anticorps et leur utilisation pour détecter le proBNP(1-108) sanguin à l'exclusion du BNP(1-76) et du BNP(77-108). L'invention concerne aussi un procédé de détection du proBNP(1-108) sanguin, des réactifs et une trousse pour le mettre en oeuvre.

Description

Anticorps spécifiques pour le diagnostic de l'insuffisance cardiaque
L'invention concerne le domaine du diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque ventriculaire. L'insuffisance cardiaque (Congestive heart failure) est un syndrome clinique fréquent, en particulier chez les personnes âgées. Il se présente habituellement sous la forme d'un déclenchement insidieux de symptômes non-spécifiques tels que la toux à l'effort, la fatigue, et l'apparition d'œdèmes périphériques. Le diagnostic repose classiquement sur l'étude de divers paramètres tels que les signes cliniques (classés en 4 stades: stades I à IV de la NYHA (c'est-à-dire de l'Association de Cardiologie de New York ), l'échocardiographie, la scintigraphie, le test d'effort, etc..
En raison de la gravité de la maladie cardiaque et, aussi, des coûts élevés de sa prise en charge, un diagnostic précoce de ce syndrome est, évidemment, très hautement souhaitable : il contribuerait à éviter la progression rapide du syndrome vers l'insuffisance cardiaque sévère. Identifier les personnes à risque d'insuffisance cardiaque est donc une nécessité. Cela permettrait aussi d'adapter un suivi thérapeutique plus rapide, plus facile et moins coûteux. Malheureusement, il n'existe pas de méthode diagnostique de l'insuffisance cardiaque totalement satisfaisante et totalement informative.
On a recherché depuis longtemps des marqueurs présymptomatiques prédictifs de l'insuffisance cardiaque. A cet égard, on a mis en évidence le fait que les cardiomyocytes fabriquent et sécrètent des peptides à activité natriurétique : un peptide d'origine auriculaire, l'ANP (Atrial Natriuretic Peptide) découvert chez le rat par de Bold et al. Life Science 1981, vol. 28(1) : 89-94, et un peptide natriurétique d'origine auriculo-ventriculaire dénommé BNP (Brain Natriuretic Peptide) découvert par Sudoh et al., Nature 1988, vol. 332 : 78-81 chez le porc, puis ensuite chez l'homme.
Le précurseur du BNP est le préproBNP(1-134), forme de stockage de la molécule à l'intérieur des cardiomyocytes. Celui-ci est clivé pour libérer un peptide signal et le proBNP(1-108). Le proBNP(1-108) consiste en un polypeptide de 108 acides aminés, de séquence: H^LGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGV WKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSG LGCKVLRRH108 (SEQ ID N° 1 ). Il est clivé, avant et/ou pendant sa sécrétion, entre les acides aminés Arg76 et Ser77 en, d'une part, le BNP, encore désigné BNP(77-108) ou BNP-32, voire BNP(1-32), et la partie N-terminale de la prohormone, le BNP(1-76), encore désigné fragment N-terminal du proBNP ou NT-proBNP.
Le BNP ou BNP(77-108), forme vasoréactive de la molécule, consiste en un peptide de 32 acides aminés, de séquence : S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH108 (SEQ ID N° 2).
Le NT-proBNP ou BNP(1-76) consiste en les 76 acides aminés N-terminaux du proBNP(1-108) constituant la séquence suivante :
H^LGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGV WKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76 (SEQ ID N° 3). Le taux plasmatique de BNP hormonal, le BNP(77-108), est élevé chez les patients présentant une dystrophie ventriculaire. On a d'ailleurs décrit des dosages plasmatiques du BNP(77-108) l'utilisant comme marqueur prédictif de l'insuffisance cardiaque ventriculaire. Cependant, il est bien connu que l'hormone BNP(77-108) est peu stable. Il en résulte que son dosage nécessite des précautions particulières (Davidson, N. C. et al. Circulation 1995; 91 :1276) (Gobinet-Georges et al. Clin. Chem. Lab. Med. 2000; 38:519-23). De plus, la demi-vie du BNP très courte et sa concentration plasmatique est peu élevée. Il en résulte qu'un certain nombre de réponses faussement négatives sont observées chez des sujets à risque d'insuffisance cardiaque. Ainsi, le dosage du BNP(77-108) ne permet pas de discriminer correctement les patients en stade I de la classification NYHA, des sujets sains (Clerico A. et al. J. Endocrinol. Invest. 1998; 21 :170-9) (Del Ry S. et al. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2000; 60:81-90).
Pour contourner cette difficulté, la demande de brevet WO 93/24531 décrit une méthode de diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque reposant sur la détection du BNP(1-76) (fragment N-terminal du proBNP), un composé abondant et qui a une longue demi-vie en comparaison de celle de l'hormone BNP(77-108). Toutefois, la méthode décrite dans la demande WO 93/24531 ne paraît pas simple à mettre en œuvre sur le BNP(1-76) en échantillons sanguins. En effet, les seuls exemples montrés sont réalisés, non sur des sérums réels, mais sur des gammes étalons obtenues à l'aide d'un peptide synthétique, le peptide BNP(47-64), sous-séquence du BNP(1-76). Pour pallier cet inconvénient, un système automatisé hautement sophistiqué s'est avéré, depuis, nécessaire.
L'article Hunt et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 214(3), 1995, pp. 1175-1183 décrit un dosage RIA de type compétitif du BNP(1-76) sur plasmas de patients souffrant d'insuffisance cardiaque, faisant intervenir un antisérum dirigé contre le fragment N-terminal du proBNP(1-13). L'article montre précisément que, chez des insuffisants cardiaques, le taux de BNP(1-76), très bien corrélé à celui du BNP(77-108), est considérablement élevé par rapport au taux observé chez des sujets témoins. Cependant, le protocole décrit pour extraire spécifiquement le seul BNP(1-76) plasmatique est complexe, puisqu'il nécessite une extraction du plasma sur cartouche Sep-pak C18™ (Millipore-Waters), suivie d'une chromatographie HPLC. Par ailleurs, cet article souligne que, dans le dosage RIA ainsi mis en œuvre, le proBNP(1-108) ne paraît pas reconnu. Il suggère plutôt que le proBNP(1-108) pourrait être sécrété dans la circulation à partir du tissu cardiaque mais serait ensuite rapidement dégradé en un peptide plus petit, par clivage des acides N-terminaux. Ou encore, selon l'article, le proBNP(1-108) serait présenté d'une façon telle que l'antisérum anti proBNP(1-108) serait incapable de se lier à lui. Enfin, les auteurs suggèrent que le BNP(1-76) (fragment N-terminal du proBNP) pourrait même être un marqueur plus spécifique du dysfonctionnement cardiaque que le BNP(77-108) ou que le fragment N-terminal du proANP.
L'article Karl et al. (Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1999 ; 59(suppl 230) : 177-181) décrit une méthode de détection du BNP(1-76) similaire à celle de la demande de brevet WO93/24531 , mais il ne fournit aucun résultat obtenu sur échantillons de patients.
L'article Schulz et al. Scand. J. Clin. Lab. Invest, 2001, vol. 61, pp. 33-42, décrit également un dosage radioimmunologique spécifique du BNP(1-76) (fragment N-terminal du proBNP), sans extraction, à l'aide d'un antisérum dirigé contre les acides aminés 1-21 de ce fragment. Les auteurs confirment l'intérêt du dosage du BNP(1-76) en diagnostic de l'insuffisance cardiaque ventriculaire ainsi que sa bonne corrélation avec le dosage du BNP(77-108). Lors d'une étude des différentes formes circulantes du proBNP(1-108), ils avancent l'hypothèse que le proBNP(1-108) circulerait dans le sang, à la fois sous forme de prohormone intacte et de produits de clivage, BNP(1-76) (fragment N-terminal du proBNP) et BNP(77-108). Cependant rien n'est dit ou suggéré dans l'article concernant une éventuelle activité physiologique du proBNP(1-108) ou un intérêt diagnostique quelconque du proBNP(1-108) en tant que marqueur prédictif ou diagnostique de l'insuffisance cardiaque ventriculaire.
L'article Shimizu et al. Clinica Chimica Acta, 2002, vol. 316, pp. 129-135, présente une étude sur la dégradation du BNP humain dans le sang et les formes moléculaires circulantes de BNP immunoréactif dans le plasma d'insuffisants cardiaques. Il observe dans le plasma de ces derniers la présence de deux formes de BNP immunoréactif : un BNP de haut poids moléculaire (de 36 KD, qui pourrait correspondre à un trimère du proBNP(1- 108)) et un BNP de bas poids moléculaire. Ce dernier correspond à la présence simultanée d'une forme de produit de dégradation du BNP-32 ayant perdu la serine et la praline N-terminales (c'est la des-SerPro-BNP (BNP3-32)) de la forme hormonale du BNP-32 (ici appelée BNP(1-32)). Le proBNP(1-108) et le BNP hormonal (BNP-32, BNP(1-32) ou encore BNP(77-108)) sont donc sécrétés par le cœur dans le sang. Néanmoins, les auteurs semblent suggérer que le proBNP(1-108) sous sa forme oligomérisée (trimère) est présent en concentration proche de celle du BNP(77-108) circulant, mais ils ne la mesurent pas. Par voie de conséquence, la corrélation de la concentration du proBNP(1-108) avec l'état clinique des patients n'est pas étudiée. Il s'ensuit que l'intérêt diagnostique ou pronostique du proBNP(1-108) sérique n'y est pas démontré. Il n'est pas non plus suggéré qu'il soit possible de doser ce dernier en routine.
Par ailleurs, un certain nombre d'épitopes présents sur le proBNP(1-108) sont connus. C'est ainsi que, dans le cadre de la détection du BNP(77-108), l'épitope de séquence S77PKMVQGSGC86 (SEQ ID N° 105) correspondant aux 10 acides aminés N-terminaux (AA 1-10) du BNP(77-108) est décrit dans la demande WO 97/32900. Similairement, dans le cadre de la détection du BNP(1-76) (fragment N-terminal du proBNP), l'épitope de séquence R65KMVLYTLRAPR76 (SEQ ID N° 106) correspondant aux 12 acides aminés C-terminaux du BNP(1-76) (fragment N-terminal du proBNP) est décrit dans la demande WO 00/35951 , et la séquence voisine H64RKMVLYTLRAPR76 (SEQ ID N° 107) est décrite dans la demande WO 00/45176 Toutefois, aucune de ces demandes de brevet ne décrit ou ne suggère l'existence d'un épitope intermédiaire ou hybride entre ces séquences. II existe donc toujours un besoin, dans le cadre du diagnostic précoce de l'insuffisance cardiaque, de disposer d'une méthode qui évite les inconvénients de l'art antérieur. En particulier, il existe un besoin de disposer d'une méthode simple, utilisable en routine et fiable, qui évite les inconvénients de la détection du BNP(77-108), molécule peu abondante et peu stable, tout en évitant les extractions complexes, occasionnées par le dosage d'autres formes moléculaires de BNP, , et qui peuvent aller éventuellement jusqu'à requérir une automatisation sophistiquée.
Les auteurs de la présente invention se sont donc attachés à mettre au point une méthode alternative pour résoudre le problème posé. Au cœur de la présente invention se trouve la découverte inattendue, faite par les inventeurs, d'un épitope aux propriétés uniques situé dans le domaine de la séquence charnière Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 (SEQ ID N° 4) ou de la séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 (SEQ ID N° 108) du proBNP(1-108) et comprenant au minimum la séquence RAPR76S77P (SEQ ID N° 5). En effet, lors d'une immunisation pratiquée chez le lapin avec un peptide de la région charnière du proBNP(1-108), de séquence CY70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 (SEQ ID N°16) ou encore avec le peptide de séquence CY70TLRAPR76S77PKMVQGS84 (SEQ ID N° 109), ils ont découvert de façon surprenante que l'antisérum obtenu non seulement contenait des anticorps qui reconnaissaient de façon spécifique ledit peptide de la région charnière sans substantiellement reconnaître les formes du BNP(1-76) et du BNP(77-108), mais en plus avait la capacité de reconnaître le proBNP(1-108) circulant. 0
Les auteurs de la présente invention ont, en outre, montré pour la première fois que le proBNP(1-108) circulant était effectivement un marqueur prédictif de l'insuffisance cardiaque et qu'il était présent en concentration significativement plus élevée chez les insuffisants cardiaques que chez des sujets témoins sains.
Les auteurs ont également découvert qu'une autre façon d'obtenir ce type d'anticorps est d'immuniser des animaux à l'aide de la molécule complète de proBNP(1-108). En effet, les auteurs ont trouvé que l'immunisation avec la molécule complète de proBNP(1-108) permettait d'induire l'apparition d'anticorps reconnaissant de façon spécifique une séquence de la région charnière.
De plus, les auteurs de la présente invention ont démontré que l'épitope minimum reconnu par les anticorps selon l'invention avait la séquence suivante : RAPR76S77P. Ils ont montré, en outre, qu'une bonne façon d'obtenir les anticorps objets de la présente invention est d'immuniser des animaux avec un peptide de formule générale: a1 - X1 - RAPRSP - X2- a2 (I) où
a1 peut être H ou représenter une fonction ou un groupement chimique choisi parmi une fonction thiol, alcool, aminoxy, aminé primaire ou secondaire, un groupement amino-carboxyle, un groupement biotinyle et un groupement acétyle, X1 représente une séquence peptidique de 0 à 3 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non,
X2 représente une séquence peptidique de 0 à 8 acides aminés, de préférence 7 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non, a2 peut représenter une fonction OH, NH2 ou un groupement alcoxyle.
De même, les auteurs de la présente invention ont montré qu'il était possible d'obtenir les mêmes anticorps spécifiques par immunisation d'un animal avec un peptide comprenant la séquence RAPR76S77P ou avec un peptide de formule :
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II) où X peut être H ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108). De plus, les auteurs de la présente invention ont montré qu'il était possible d'obtenir les mêmes anticorps spécifiques par immunisation d'un animal avec un peptide de formule :
X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III) où X peut être H ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108).
Les auteurs de la présente invention ont de plus mis au point une méthode simple et fiable de diagnostic précoce de l'insuffisance cardiaque reposant sur la détection du proBNP(1-108) circulant dans le sang et une trousse permettant la mise en œuvre de cette détection du proBNP(1-108) circulant.
La présente invention a donc pour objet un anticorps anti proBNP(1-
108) caractérisé en ce que, d'une part, il reconnaît de façon spécifique la séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 du proBNP(1-108) et ne reconnaît substantiellement pas le BNP(1-76) ni le BNP(77-108), et, d'autre part, a la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1 -108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains.
La présente invention a de plus pour objet un anticorps anti proBNP(1- 108) caractérisé en ce que, d'une part, il reconnaît de façon spécifique la séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 du proBNP(1-108) et ne reconnaît substantiellement pas le BNP(1-76) ni le BNP(77-108), et d'autre part, a la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1 -108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains. La présente invention a plus particulièrement pour objet un anticorps anti proBNP(1-108) caractérisé en ce que, d'une part, il reconnaît de façon spécifique la séquence RAPR76S77P du proBNP(1-108) et ne reconnaît substantiellement pas le BNP(1-76) ni le BNP(77-108), et, d'autre part, a la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains.
La présente invention a en outre pour objet un procédé d'obtention d'anticorps anti proBNP(1-108) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85, la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1-108) à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains caractérisé en ce que l'on immunise un animal avec la molécule entière de proBNP(1-108), puis en ce que l'on épuise, à l'aide du peptide BNP(77-108) et/ou du peptide BNP(1-76), l'antisérum obtenu.
Par « épuisement d'un antisérum » obtenu contre un antigène spécifique donné (l'antigène immunisant), on entend l'élimination d'anticorps non spécifiques, potentiellement présents dans cet antisérum, par la mise en contact et l'incubation dudit antisérum avec des « antigènes non spécifiques », c'est à dire des antigènes différents de l'antigène immunisant, puis séparation
• et élimination immunologiques des anticorps ayant réagi avec lesdits
« antigènes non spécifiques » et récupération de l'antisérum ainsi épuisé
(c'est-à-dire appauvri en anticorps non spécifiques). L'épuisement sert classiquement à rendre spécifique un antisérum dirigé contre un antigène donné.
Dans le présent cas, un antisérum reconnaissant la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85, et/ou la séquence
Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS8 ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1-108) peut être épuisé, c'est à dire rendu spécifique, par mise en contact avec le BNP(77-108) et/ou le BNP(1-76) susnommés, ces derniers pouvant, par exemple, être immobilisés en phase solide et servir de support à une chromatographie par immunoadsorption selon des techniques conventionnelles, connues de l'homme du métier. L'anticorps présent finalement dans l'antisérum épuisé est ici un anticorps polyclonal monospécifique.
La présente invention a encore pour objet un peptide de formule : aι - X1 - RAPRSP - X2- a2 (I) OU ai peut être H ou représenter une fonction ou un groupement chimique choisi parmi une fonction thiol, alcool, aminoxy, aminé primaire ou secondaire, un groupement amino-carboxyle, un groupement biotinyle et un groupement acétyle,
Xi représente une séquence peptidique de 0 à 3 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non,
X2 représente une séquence peptidique de 0 à 8 acides aminés, de préférence 7 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non, a2 peut représenter une fonction OH, NH2 ou un groupement alcoxyle.
La présente invention a encore pour objet un peptide de formule : X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (ll) où X peut être H, ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108).
La présente invention a de plus pour objet un peptide de formule : X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III) où X peut être H, ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108). A noter que dans les formules (II) et (III) ci-dessus, le numéro des acides aminés (Y70ι R76 S77; Sβ4 ou G85) a été maintenu simplement pour aider à la compréhension de l'invention et au repérage de cette séquence vis-à-vis de la séquence proBNP(1-108). Il en est de même des autres séquences présentées avec des numéros dans cette demande. L'invention concerne aussi tout peptide contenant la séquence
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II) ou la séquence
X-Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS8 -Z (III), ou l'une des séquences (II) ou (III) susdite sous forme substituée, de façon conservatrice ou non, en l'un quelconque des acides aminés de la position 70 à la position 85 ou 84, respectivement, à condition qu'elle garde intacte (en particulier non substituée) la portion RAPR76S77P.
Il s'agit donc d'un peptide comprenant une séquence dérivée de la séquence X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II) ou de la séquence X-Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III) par substitution d'un ou plusieurs parmi les acides aminés Y70, T71, L72, K79, M8o, V8ι, Qs2, G83, S84 et G85, avec X pouvant être absent ou représenter soit une fonction NH2, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z pouvant être absent ou représenter soit une fonction OH, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108).
L'invention concerne enfin le peptide de séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, et le peptide de séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84. L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'anticorps anti proBNP(1-108) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1-108) à l'exclusion substantielle du BNP(1- 76) et du BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains caractérisé en ce que l'on immunise un animal avec un peptide de formule : a1 - X1 - RAPRSP - X2- a2 (I) où a-], Xi, X2, et a2 ont la même signification que ci-dessus, et, éventuellement, en ce que l'on épuise, à l'aide du peptide BNP(77-108) et/ou du peptide BNP(1-76), l'antisérum obtenu. L'anticorps ainsi obtenu est un anticorps monospécifique.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'anticorps anti proBNP(1-108) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1-108) à l'exclusion substantielle du BNP(1- 76) et du BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains caractérisé en ce que l'on immunise un animal avec un peptide de formule :
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (ll) ou avec un peptide de formule X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III), où X et Z sont tels que définis ci-dessus et, éventuellement, en ce que l'on épuise, à l'aide du peptide BNP(77-108) et/ou du peptide BNP(1-76), l'antisérum obtenu.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'hybridome sécréteur d'anticorps anti proBNP(1-108) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 Y7oTLRAPR76S77PKIv1VQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1-108) à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains caractérisé en ce que l'on immunise un animal avec un peptide de formule :
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II) ou avec un peptide de formule X-Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III), sous forme substituée, de façon conservatrice ou non, à condition qu'elle garde intacte (en particulier non substituée) la portion RAPR75S77P, où X et Z sont tels que définis ci-dessus et, éventuellement, en ce que l'on épuise, à l'aide du peptide BNP(77-108) et/ou du peptide BNP(1-76), l'antisérum obtenu.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'anticorps anti proBNP(1-108) reconnaissant de façon spécifique la séquence
Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85, Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1-108) à l'exclusion substantielle des peptides BNP(1-76) et BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains caractérisé en ce que l'on immunise un animal avec le peptide de séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85, ou le peptide de séquence Y7oTLRAPR76S77PKIvlVQGS84 et, éventuellement, en ce que l'on épuise, à l'aide du peptide BNP(77-108) et/ou du peptide BNP(1-76), l'antisérum obtenu.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'hybridome sécréteur d'anticorps anti proBNP(1- 08) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y7oTLRAPR76S77 KMVQGSG85l la séquence
Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1- 108) à l'exclusion substantielle du BNP(1 -76) et du BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains caractérisé en ce que :
- on immunise un animal avec un peptide choisi parmi les peptides de formules suivantes : a-i - Xi - RAPRSP - X2 - a2 (I) où a-i, Xi, X2, et a2 ont la même signification que ci-dessus,
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II) où X et Z ont la même signification que ci-dessus,
X-Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (lll) où X et Z ont la même signification que ci-dessus,
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II) sous forme substituée, de façon conservatrice ou non, à condition qu'elle garde intacte (en particulier non substituée) la portion RAPR76S77P, où X et Z ont la même signification que ci-dessus,
X-Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)
sous forme substituée, de façon conservatrice ou non, à condition qu'elle garde intacte (en particulier non substituée) la portion RAPR75S77P, où X et Z ont la même signification que ci-dessus,
Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85, et
Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84
- on prélève des lymphocytes sécréteurs d'immunoglobulines de cet animal, et en ce que
- on procède à une fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome pour obtenir au moins un hybridome sécréteur d'immunoglobulines.
Ceci correspond à la technique classique d'obtention des hybridomes dont le principe est décrit dans Kôhler et Milstein, (1975) Nature (London), 256 :495-497.
L'invention a encore pour objet un tel hybridome et l'anticorps anti proBNP(1-108) monoclonal sécrété par ledit hybridome.
La présente invention a en outre pour objet une méthode de diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque chez un humain comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique, de préférence de sang, plasma ou sérum, avec un anticorps anti proBNP(1-108) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85, la séquence
Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1- 108) à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains, et la détection du proBNP(1-108) dans l'échantillon.
L'invention fournit de manière générale une méthode de diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque chez un humain comprenant : a) la mise en contact d'un échantillon biologique, de préférence de sang, plasma ou sérum, avec un anticorps anti proBNP(1-108) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y oTLRAPR76S77PKMVQGSG85, la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1- 108) à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains, b) l'incubation du mélange dans des conditions permettant la formation de complexes antigènes-anticorps ; et c) la révélation des complexes antigènes-anticorps formés, éventuellement à l'aide d'un anticorps de détection, marqué, capable de se lier spécifiquement au proBNP(1-108) présent dans le premier complexe, ou à l'aide d'un antigène de détection, marqué, capable de se lier à l'anticorps dirigé contre ledit proBNP(1-108) présent dans le premier complexe.
En particulier, l'invention fournit une méthode de diagnostic de l'insuffisance cardiaque qui comprend, en plus des étapes a, b et c susdites, une étape d) de corrélation de la quantité des complexes antigènes-anticorps révélés à l'état clinique du sujet.
La présente invention a de plus pour objet une trousse de détection du proBNP(1-108) dans un échantillon biologique, notamment dans un échantillon de sang, plasma ou sérum, contenant au moins un anticorps anti proBNP(1- 108) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1-108) à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains. L'invention vise enfin une trousse de détection du proBNP(1-108) dans un échantillon biologique, notamment dans un échantillon de sang, plasma ou sérum, contenant, comme étalon et/ou témoin, un composé contenant au moins un peptide choisi dans le groupe de peptides de formules suivantes :
a1 - X1 - RAPRSP - X2- a2 (I) où a-i, Xi, X2, et a2 ont la même signification que ci-dessus,
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II) où X et Z ont la même signification que ci-dessus,
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II) sous forme substituée, de façon conservatrice ou non, à condition qu'elle garde intacte (en particulier non substituée) la portion RAPR7QS77P, où X et Z ont la même signification que ci-dessus,
X-Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (lll)) où X et Z ont la même signification que ci-dessus, X- Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III) sous forme substituée, de façon conservatrice ou non, à condition qu'elle garde intacte (en particulier non substituée) la portion RAPR76S77P, où X et Z ont la même signification que ci-dessus,
Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85,
Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84.
Définitions Dans le contexte de l'invention, un « échantillon biologique » ou encore un « échantillon de fluide biologique » est de préférence constitué par un liquide biologique, tel que du sang, plasma, sérum, de l'urine, du liquide céphalorachidien, de la salive, etc..
Par « insuffisance cardiaque », on entend l'état pathologique dans lequel une anomalie de la fonction cardiaque est responsable de l'incapacité du cœur à pomper le sang de façon suffisante pour répondre aux besoins métaboliques de l'organisme et/ou dans lequel le cœur pourvoit aux besoins mais avec des pressions de remplissage anormalement élevées. Il peut notamment s'agir d'une insuffisance ventriculaire droite et/ou gauche. Le terme « anticorps » se réfère à tout anticorps entier ou fragment fonctionnel d'un anticorps (obtenu par génie génétique ou non), comprenant, ou consistant en, au moins un site de combinaison antigenique, permettant audit anticorps de se lier à au moins un déterminant antigenique d'un composé antigenique. A titre d'exemple de fragments d'anticorps on peut citer les fragments Fab, Fab', F(ab')2 ainsi que les fragments variables à simple chaîne (chaînes scFv).
Les anticorps anti proBNP(1-108) selon l'invention peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Un anticorps polyclonal anti proBNP(1-108) selon l'invention peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin, une souris, etc.. à l'aide du proBNP(1 -108) entier, prélèvement puis épuisement de l'antisérum obtenu sur, par exemple, un immunoadsorbant contenant du BNP(77-108) et/ou du BNP(1-76) selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal anti proBNP(1-108) selon l'invention peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256 : 495- 497 (1975)).
La production d'anticorps monoclonaux ou de sérums polyclonaux monospécifiques, ou d'anticorps obtenus par criblage de banques génomiques, utiles dans le cadre de l'invention relève de techniques conventionnelles, qui sont détaillées plus loin.
Par « anticorps de capture », on entend un anticorps ou une partie d'anticorps, de préférence fixé sur une phase solide, qui est capable de retenir l'antigène proBNP(1-108) présent dans un échantillon biologique, par liaison affine.
La présence de l'antigène dans l'échantillon biologique est révélée par des « moyens de détection ». S'agissant de la détection de l'antigène, l'invention prévoit notamment une détection à l'aide d'au moins un « anticorps de détection ». Un tel anticorps de détection, marqué, est capable de se lier à l'antigène capturé, par liaison affine, en reconnaissant un site epitopique, différent de celui reconnu par l'anticorps de capture.
Le terme « marqué » se réfère aussi bien à un marquage direct (par le biais d'enzymes, radioisotopes, fluorochromes, composés luminescents, etc) qu'à un marquage indirect (par exemple, par le biais d'anticorps eux-mêmes marqués de manière directe ou à l'aide de réactifs d'une « paire d'affinité » marquée, telle que, mais non exclusivement, la paire avidine marquée-biotine, etc.).
Par « fragment antigenique », on entend toute partie du proBNP(1-108) capable d'induire la synthèse d'anticorps substantiellement spécifique du seul proBNP(1-108) chez un animal immunisé.
Conformément à la présente invention, un « fragment antigenique » contient au moins le « site epitopique » ou épitope RAPR75S77P. Un « site epitopique » ou « épitope » est une séquence d'acides aminés qui est reconnue par au moins un anticorps et permet la liaison spécifique de celui-ci. Le terme «anticorps polyclonal monospécifique », s'applique à tout anticorps polyclonal présentant une spécificité pour un seul épitope. Ceci signifie que l'anticorps est capable de lier une séquence d'acides aminés de la séquence du proBNP(1-108) contenant les acides aminés comprenant l'épitope, mais est incapable de lier une séquence d'acides aminés de la séquence du proBNP(1-108) qui ne contient pas les acides aminés comprenant l'épitope.
Le terme « spécifiquement », quand il se réfère à une reconnaissance ou une liaison spécifique d'un anticorps pour un antigène, signifie que l'anticorps interagit avec l'antigène sans interaction substantielle avec d'autres antigènes, ou si l'on parle de reconnaissance « spécifique » avec un épitope, par reconnaissance quasi-exclusive de cet épitope. Des constantes d'association supérieures à 10^ L.mol-'' sont préférables. Par « substitution conservatrice », on entend notamment la substitution d'un acide aminé d'une classe par un acide aminé de la même classe, substitution qui ne modifie pas significativement l'immunoréactivité du peptide obtenu par rapport à celle du peptide d'origine. Parmi les différentes classes d'acides aminés on distingue généralement les acides aminés à chaîne latérale polaire (tel que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine et la tyrosine), les acides aminés à chaîne latérale non polaire (tel que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane et la cystéine), les acides aminés à chaîne latérale basique (tel que la lysine, l'arginine et l'histidine), et les acides aminés à chaîne latérale acide (tel que l'acide aspartique et l'acide glutamique).
Par « substitution non conservatrice », on entend tout autre type de substitution, qui ne modifie pas significativement l'immunoréactivité du peptide obtenu par rapport à celle du peptide d'origine.
Par l'expression « ne reconnaît substantiellement pas le BNP(1-76) ni le BNP(77-108) », on entend que l'anticorps visé par l'invention présente une réaction croisée avec le BNP(1-76) ou le BNP(77-108) inférieure à 20%, particulièrement inférieure à 10%, de façon préférée inférieure à 5%. La détermination du pourcentage de la réaction croisée se fait selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier, par exemple, celle illustrée dans l'exemple 5.
La non-reconnaissance « substantielle » des peptides BNP(1-76) et BNP(77-108) correspond de préférence à une absence ou quasi-absence de réaction des anticorps de l'invention avec ces peptides. Par l'expression « à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108) », on entend que l'anticorps « ne reconnaît substantiellement pas le BNP(1-76) ni le BNP(77-108) » au sens vu plus haut.
Production d'anticorps spécifiques
Les anticorps utilisés dans la présente invention sont des anticorps spécifiques de l'antigène, et, pour cette raison, sont des anticorps monoclonaux ou des anticorps polyclonaux monospécifiques, c'est à dire qu'ils ne reconnaissent spécifiquement qu'un épitope. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de fusion lymphocytaire et culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein, Nature, 1975, 256 : 495-497. D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues (Harlow et al, éd., 1988 « Antibodies : a laboratory manual »). Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés en immunisant un mammifère (par exemple une souris, un rat, un lapin, voire un être humain, etc..) et en utilisant la technique de fusion lymphocytaire conduisant à des hybridomes (Kôhler et Milstein, 1975).
Des techniques alternatives à cette technique usuelle existent. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage (« phage display »), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E. coli, Scott, J.K. et Smith, G. P., Science, 1990, 249 :386-390). Des protocoles de construction de ces banques d'anticorps sont décrits dans Marks et al, 1991 , J. Mol. Biol, 222 -.581-597).
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre un antigène de nature peptidique selon les modes opératoires usuels. Les anticorps polyclonaux ainsi obtenus pourront, si besoin est, et par épuisement avec du BNP(77-108) et du BNP1-76, selon des techniques en soit connues de l'homme du métier comme, par exemple, l'immunoadsorption sur colonne, être rendus monospécifiques de la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85, de la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou d'un peptide comprenant la séquence RAPR76S77P, assurant ainsi la spécificité vis à vis du proBNP(1-108), à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108).
Anticorps de capture et/ou de détection
En technique sandwich, l'anticorps de capture est choisi de manière à ce qu'il reconnaisse spécifiquement un épitope, sur l'antigène naturel du patient, tandis que l'anticorps de détection est choisi, de préférence, mais non obligatoirement de manière à ce qu'il reconnaisse spécifiquement un autre épitope, sur l'antigène naturel du patient.
L'échantillon biologique peut être éventuellement traité dans une étape préalable, ou mis directement en présence d'au moins un anticorps de capture dans des conditions favorisant l'exposition de l'épitope à détecter.
Le procédé de diagnostic selon l'invention peut être réalisé selon divers formats bien connus de l'homme du métier : en phase solide ou en phase homogène ; en un temps ou en deux temps ; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs.
Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, telles que celles commercialisées par la société Nunc, Danemark. On peut également utiliser des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques, telles que celles fournies par Dynal ou Merck-Eurolab (France) (sous la marque EstaporT )ι 0u encore des tubes à essai en polystyrène ou polypropylène, etc..
Un format d'immunoessai de type sandwich entre deux anticorps (de capture et de détection) est particulièrement avantageux pour la détection des antigènes présents dans l'échantillon biologique.
Un format d'immunoessai de détection des antigènes par compétition est également possible. D'autres modalités d'immunoessais sont encore envisageables et bien connues de l'homme du métier.
Dosages ELISA, radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en œuvre pour révéler la présence des complexes zυ
antigènes-anticorps formés.
Trousses Les trousses et réactifs utiles pour la détection du proBNP(1-108) dans un échantillon de fluide biologique, conformément au procédé de l'invention, peuvent être fournis pour une mise en pratique de l'invention facile et applicable à de nombreux échantillons biologiques.
Des trousses de détection du proBNP(1-108) dans un échantillon biologique peuvent contenir au moins un anticorps tel que défini précédemment. D'autres trousses, contenant comme étalon et/ou témoin, au moins un peptide de formule (I), (II) ou un peptide substitué tel que défini précédemment, peuvent également être utiles à la mise en œuvre de l'invention.
Un autre objet particulier de l'invention est donc une trousse de détection du proBNP(1-108) dans un échantillon de fluide biologique, comprenant :
- au moins un anticorps anti proBNP(1-108) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1- 108) à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains, et qui est de préférence un anticorps de capture dudit proBNP(1-108) présent dans l'échantillon biologique, et - un conjugué marqué capable de se lier spécifiquement aux complexes antigènes anticorps formés.
Comme cela est décrit ci-dessus, l'anticorps de capture peut être présenté de manière avantageuse sous une forme immobilisée sur une phase solide, telle qu'une microplaque, par exemple, mais non exclusivement.
Une trousse préférée comprend au moins :
- un anticorps de capture anti proBNP(1-108) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85, la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS8 , et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1- 108) à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains, ledit anticorps de capture étant immobilisé sur une phase solide ; et - un anticorps de détection, marqué, dirigé contre un autre épitope, intact, du proBNP(1-108), ou éventuellement,
- un antigène de détection, marqué, qui est un peptide du proBNP(1- 108) ou le proBNP(1-108) lui-même.
Selon un mode de réalisation particulier, une trousse de détection du proBNP(1-108) dans un échantillon biologique, peut contenir :
- dans un récipient, au moins un anticorps tel que défini précédemment ;
- dans un autre récipient au moins un peptide tel que défini précédemment, utile notamment comme étalon et/ou témoin.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
LEGENDE DES FIGURES :
La figure 1 représente la réactivité des anticorps polyclonaux du lapin # 046 805 purifiés sur protéine A-sépharose avec le proBNP (1-108), le fragment BNP(1-76), le BNP(77-108), ou la GST (Glutathion-S-transférase, utilisée comme protéine témoin) adsorbés sur microplaque à 0,25 μg/ml.
La figure 2 représente la réactivité des anticorps polyclonaux du filtrat du lapin # 046 805 obtenus après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose. Les anticorps polyclonaux sont préparés sous forme de gammes de dilutions de 2 à 20μg/ml, puis testés sur des cupules revêtues de polypeptide proBNP(1-108), BNP(1-76) ou BNP(77-108) adsorbé à 0,25 μg/ml.
La figure 3 représente la réactivité des anticorps polyclonaux du filtrat du lapin # 046 832 obtenus après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose. Les anticorps polyclonaux sont préparés sous forme de gammes de dilutions de 5 à 20 μg/ml, puis testés sur des cupules revêtues de polypeptide proBNP(1-108), BNP(1-76) ou BNP(77-108) adsorbé à 0,25 μg/ml.
La figure 4 représente la réactivité de l'éluat du sérum polyclonal du lapin # 046 805 obtenu après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose. Les anticorps polyclonaux sont préparés sous forme de gammes de dilutions de 2 à 20 μg/ml, puis testés sur des cupules revêtues de polypeptide proBNP(1-108), BNP(1-76) ou BNP(77-108) adsorbé à 0,25 μg/ml. La figure 5 représente la réactivité de l'éluat du sérum polyclonal du lapin # 046 832 obtenu après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose. Les anticorps polyclonaux sont préparés sous forme de gammes de dilutions de 5 à 20 μg/ml, puis testés sur des cupules revêtues de polypeptide proBNP(1-108), BNP(1-76) ou BNP(77-108) adsorbé à 0,25 μg/ml. La figure 6 représente une analyse epitopique à l'aide de la technique spot du sérum polyclonal du lapin # 046 805 avant épuisement. (Pour cet exemple, le bruit de fond est de 30,4 ± 5,93 unités d'intensité relatives.)
La figure 7 représente une analyse epitopique à l'aide de la technique spot du sérum polyclonal du lapin # 046 805 après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose. (Pour cet exemple, le bruit de fond est de 31 ,3 ± 6,31 unités d'intensité relatives.)
La figure 8 représente la réactivité du surnageant de culture de l'hybridome 3D4 dilué au 1/2, testé sur des cupules revêtues soit de proBNP(1- 108), soit de BNP(1-76), soit de BNP(77-108), soit de peptide YTLRAPRSPKMVQGSG (C13P30), adsorbé à 1 μg/ml.
La figure 9 montre une photographie du gel d'acrylamide à 16% dans lequel on a fait migrer chaque protéine (1 μg de protéine par piste). Piste 1 : marqueur de poids moléculaire ; piste 2 : proBNP(1-108)-GST ; piste 3 : GST (protéine témoin négatif); piste 4 : BNP(1-76)-GST ; piste 5 : BNP(77- 108).
La figure 10 montre les résultats du test en westem-blot de l'anticorps produit par l'hybridome 3D4 sur le proBNP(1-108)-GST (piste 2), la GST
(protéine témoin négatif) (piste 3), le BNP(1-76)-GST (piste 4), et le BNP(77-
108) (piste 5), déposés sur gel (1 μg de protéine par gel), puis transférés sur membrane de nitrocellulose.
La figure 11 représente une courbe d'étalonnage du dosage IRMA du proBNP(1-108).
La figure 12 montre les résultats en cpm (coups par minute de radioactivité) du dosage IRMA du proBNP(1-108) des prélèvements de 14 sujets sains et de 15 patients souffrant d'insuffisance cardiaque.
La figure 13 présente la corrélation entre les concentrations de proBNP(1-108) (en pg/ml) déterminées à l'aide du dosage radioimmunométrique selon l'invention et les concentrations de BNP(1-76) (pg/ml) déterminées, à l'aide du dosage sur l'automate Elecsys® (marque de la société Hoffmann La Roche), des prélèvements de 14 patients souffrant d'insuffisance cardiaque.
La figure 14 représente une courbe d'étalonnage du dosage ELISA du proBNP(1-108) selon l'invention.
La figure 15 représente une évaluation de la réaction croisée, vis à vis du BNP(1-76) et du BNP(77-108), de l'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 non épuisé couplé à la biotine, utilisé en sandwich dans le dosage ELISA proBNP(1-108) conjointement à l'anticorps polyclonal anti-BNP(77-108). La figure 16 représente l'évaluation de la réaction croisée, vis à vis du
BNP(1-76) et du BNP(77-108), de l'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 non épuisé couplé à la biotine, utilisé en sandwich dans le dosage ELISA proBNP(1-108) conjointement à l'anticorps polyclonal anti-NT-proBNP(1-29).
EXEMPLES
Exemple 1 : synthèse de peptides pour immunisation
Les peptides synthétiques sont produits par les techniques standards bien connues de l'homme du métier. On peut citer, comme exemple, la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse vu sa facilité de mise en œuvre (Merrifield, (1963); R.C.Sheppard (1971) ; Atherton et al. (1989)). Comme synthétiseur automatique, on peut utiliser le synthétiseur "9050 Plus Pep Synthesizer" de Millipore, le "Pioneer" de Perspective, ou le synthétiseur "433A" de ABI. Les peptides peuvent également être obtenus par synthèse en phase homogène.
Les synthèses ci-après ont été réalisées sur un synthétiseur Pioneer, en utilisant la chimie « Fmoc » (9-fluorénylméthyloxy carbonyl) : à chaque étape les réactifs (c'est à dire l'acide aminé protégé et les activateurs de couplage (TBTU(2-(1 H-benzotriazol-1-yl)-1 ,1 ,3,3-tétraméthyluronium tétrafluoroborate)/ HOBt (N-hydroxybenzotriazol)) sont ajoutés en excès (dans un rapport « moles de réactifs /moles de groupes substituables sur la résine » = 5). A la fin de la synthèse, le peptide est séparé de la résine par une solution à base d'acide trifluoroacétique (réactif K). Le peptide est ensuite précipité dans une solution d'éther refroidie, puis purifié par HPLC.
Les inventeurs ont procédé à la synthèse des peptides contenant la séquence d'acides aminés de la région charnière R76S77 suivants :
SEQ ID N° 6 C-G-R-A-P-R-S-P SEQ ID N° 7 Acetyl -C-G-R-A-P-R-S-P SEQ ID N° 8 C-G-R-A-P-R-S-P-K SEQ ID N° 9: Acetyl -C-G-R-A-P-R-S-P-K SEQIDN°10 C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V SEQIDN° 11 C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G SEQIDN°12 R-A-P-R-S-P-G-C SEQIDN° 13 Acetyl -R-A-P-R-S-P-G-C SEQIDN° 14 Acetyl -C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K SEQIDN° 15 C-H-R-K-M-V-L-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K SEQIDN° 16 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G (peptide
C13P30)
SEQIDN° 17 C-F-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G SEQIDN018 C-F-S-l-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G SEQIDN° 19 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-βA SEQ ID N° 20 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βA
SEQ ID N° 21 C-F-S-l-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βA
SEQ ID N° 22 C-F-S-l-R-A-P-R-S-P-A-L-A-S-G-T-A ainsi que
SEQIDN0109 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S (peptide
CN32)
SEQIDN0110 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K SEQIDN0111: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V SEQIDN°112 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q SEQ ID N° 113 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G
SEQ ID N° 114 Acétyl-C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q
SEQ ID N° 115 C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G
SEQ ID N° 116 C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S
SEQ ID N° 117 C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G
SEQ ID N0 118 C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V
SEQ ID N0 119 C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q
SEQ ID N0 120 L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-C
SEQ ID N° 121 C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S
SEQ ID N° 122 C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G
NB : βA signifie béta-alanine.
L'invention a donc aussi pour objet un peptide quelconque choisi dans le groupe constitué par les séquences ci-dessus.
Exemple 2 : Couplage d'un peptide à une protéine porteuse pour immunisation
On couple le peptide à une protéine porteuse la KLH (Keyhole Lympet Hemocyanin), La thyroglobuline, la BSA (Bovine Sérum Albumin, via différentes fonctions (thiol, aminé, aldéhyde...) de façon à rendre le peptide plus immunogène. L'agent de couplage utilisé pour lié le peptide à la protéine peut être hétéro- ou homo-bifonctionel. Les réactifs les plus couramment utilisés sont le BS 3, le sSMCC, le SPDP, le glutaraldéhyde... L'une des techniques de couplage utilisées est celle qui utilise comme agent chimique de couplage le glutaraldéhyde et comme protéine porteuse la KLH. Le couplage de la KLH sur le peptide est réalisé à partir des fonctions aminés du peptide (groupement N-terminal et groupement aminé porté par la lysine principalement).
Une solution du peptide C13P30 de séquence YTLRAPRSPKMVQGSG- NH2 (SEQ ID N° 16) ou de peptide CN32 de séquence YTLRAPRSPKMVQGS- NH2 (SEQ ID N° 109) à 5mg/ml est préparée en tampon PBS Dulbecco NaCI 0,15M à pH 7,4. Un flacon de 20mg de KLH lyophilisée en tampon PBS (Pierce # 77600) est repris par 2ml d'eau PPI (eau pour préparation injectable), de façon à obtenir une solution de KLH à 10mg/ml en tampon PBS.
1 ml de la solution de peptide (soit 5mg) est mélangée avec 1 ,25ml de la solution de KLH (soit 12,5mg). Sous hotte aspirante, 2,25ml d'une solution de glutaraldéhyde à 2% préparée extamporanément (à partir de glutaladéhyde à 25%, Sigma # G-5882) sont ajoutés au mélange. Afin d'éviter la formation de complexes de KLH, la solution de glutaraldéhyde à 2% est ajoutée goutte à goutte et sous agitation du mélange. La réaction de conjugaison se fait pendant 2 heures 30 d'incubation à température ambiante. La réaction de couplage est stoppée par ajout d'une solution de borohydrure de sodium à 100 mg/ml de façon à atteindre une concentration finale de 10mg/ml. Le mélange est mis à incuber une nuit à 4°C. Enfin la solution est dialysée sur une nuit à 4°C contre du tampon PBS Dulbecco à pH 7,4. La solution est enfin aliquotée et conservée à -80°C.
Exemple 3 : Immunisations avec des peptides
Pour la production d'anticorps polyclonaux, des lapins (femelles de souche New Zealand) ont été immunisés à l'aide du peptide Cys- YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2 couplé à la KLH selon l'exemple 2. A la première injection, une émulsion de 1 ,5 ml de peptide couplé à la KLH avec 1 ,5 ml d'adjuvant de Freund complet (Sigma # F-5881) est réalisée, et 1ml de cette dernière émulsion (soit 200 μg de peptide) est injecté par voie intradermique à chacun des lapins. Deux rappels sont réalisés à 20 jours d'intervalle en injectant par voie intradermique 1 ml d'une émulsion de peptide couplé à la KLH (soit 200μg de peptide) avec de l'adjuvant de Freund incomplet (Sigma # F-5506). Vingt jours après le second rappel, un troisième rappel est effectué de la même manière que les précédents rappels mais en injection sous- cutanée. Vingt jours après ce dernier rappel, et après évaluation du titre en anticorps obtenu, les lapins sont saignés. Plus particulièrement les anticorps polyclonaux des lapins identifiés par les numéros # 046 805 et 046 832 obtenus par immunisation avec le peptide C-YTLRAPRSPKMVQGS-NH2 (SEQ ID N° 16) couplé à la KLH, et du lapin identifié # L01235, obtenus par immunisation avec le peptide C-YTLRAPRSPKMVQGS-NH2 (SEQ ID N°109) couplé à la KLH, ont été utilisés pour la suite des travaux.
Exemple 4 : obtention et purification des anticorps
Avant purification, les sérums de lapins sont centrifugés 30 minutes à 4 500 tours/minute à 4°C. Après décantation, le sérum est dilué de moitié dans du tampon glycine 1 ,5M, à pH 8,0 contenant du NaCI 1M.
Exemple 4.a : purification des IgG sur protéine A-sépharose
La purification des anticorps polyclonaux est réalisée par chromatographie d'affinité sur un gel de protéine A-sépharose (Amersham Biosciences #17.1279.02). La protéine A extraite de Staphylococcus aureus se combine spécifiquement au fragment Fc des molécules d'IgG. Ensuite les IgG, toutes sous classes confondues, sont éluées à pH 3,0.
Tous les tampons utilisés sont dégazés pendant 15 minutes dans un bain à ultrasons avant passage dans la colonne, afin de prévenir la formation de bulles.
Une colonne de chromatographie est préparée à l'aide de 12 ml de protéine A-sépharose. La colonne de gel est équilibrée pendant 40 minutes avec de l'eau distillée et dégazée, puis pendant 40 minutes avec du tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant du NaCI 0,5 M, et enfin avec du tampon glycine 1 ,5 M à pH 8,0 contenant du NaCI 1 M, ceci jusqu'à obtention d'une ligne de base correcte.
Ensuite, 10ml de sérum de lapin dilué de moitié en tampon glycine 1 ,5 M à pH 8,0 contenant du NaCI 1 M, sont passés dans la colonne à un débit de 0,5ml/mn. Après apparition du pic d'albumine, les IgG du sérum sont éluées à l'aide d'une solution d'acide citrique 0,1 M amenée à pH 3,0 avec du tampon tris sodium de citrate 0,1 M. Le pic d'élution des IgG est récupéré et rapidement mis en dialyse en tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 une nuit à 4°C. La concentration des IgG est déterminée après dialyse par lecture de la densité optique à 280 nm contre du tampon PBS.
Après purification sur protéine A, la réactivité des anticorps polyclonaux est testée en ELISA sur des cupules revêtues soit de proBNP(1-108), soit de BNP(1-76), soit de BNP(77-108) adsorbé à 0,25 μg/ml. Les résultats obtenus pour les anticorps polyclonaux du lapin # 046 805 sont présentés dans la figure 1. Les anticorps polyclonaux du lapin # 046 832 ont donné des résultats identiques. Les anticorps polyclonaux des lapins # 046 805 et # 046 832 sont relativement spécifiques du proBNP(1-108). Nous avons cependant pu noter la présence d'une faible réactivité anti-BNP(77-108) à des concentrations élevées, réactivité que nous avons pu supprimer en rendant les anticorps polyclonaux de ces lapins monospécifiques par épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose, selon le procédé décrit dans l'exemple 4.b.
Exemple 4.b : Epuisement des IgG sur résine BNP-K3-NHS-sépharose
Le but de cette opération est d'éliminer la réactivité croisée observée vis à vis du BNP(77-108).
La réactivité croisée de l'anticorps polyclonal obtenue étant localisée en position N-terminale de la molécule de BNP(77-108), il était important de bien présenter cette région du BNP(77-108) aux immunoglobulines à éliminer. A ces fins, le BNP(77-108) a été synthétisé avec une extension de 3 résidus de lysine en position C-terminale (BNP-K3) afin de favoriser son couplage à la résine NHS-sépharose par son extrémité C-terminale.
Le BNP-K3 : S-P-K-M-V-Q-G-S-G-C-F-G-R-K-M-D-R-l-S-S-S-S-G-L-G- C-K-V-L-R-R-H-K-K-K (SEQ ID n° 104) a été synthétisé sur un synthétiseur Pioneer, en utilisant la chimie « Fmoc » (9-fluorénylméthyloxy carbonyl) citée ci-dessus sous l'exemple 1.
5 mg de BNP-K3 sont dissous à l'aide du tampon NaHC03 100mM, à pH 8,3 aditionné de NaCI 0,5M à une concentration de 10mg/ml. 2ml de résine NHS-sépharose (NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, Amerscham Biosciences # 17.0906.01) sont centrifugés 30 secondes à 1000 tours/mn à 4°C. La résine est lavée avec 15ml d'une solution d'HCI 1mM froid. Après centrifugation et élimination de la solution d'HCI, la résine est mélangée au ligand BNP-K3 à 10mg/ml. Le mélange est mis à incuber 1 heure à température ambiante sous agitation lente. Après centrifugation et élimination de la solution de ligand, les groupements non réactifs de la résine sont bloqués à l'aide de 5ml de tampon glycine 0,1 M, à pH 8,0. Le mélange est mis à incuber 1 heure à température ambiante sous agitation lente. Après centrifugation et élimination du tampon de blocage, la résine est reprise par 5 ml de tampon NaHC03 100mM, à pH 8,3 additionné de NaCI 0,5M. Quatre lavages à l'aide de ce tampon sont réalisés. Au dernier lavage, le mélange est déposé sur une colonne de chromatographie. Après préparation de la colonne de chromatographie, 10mg d'IgG du lapin
# 046 805 ou du lapin # 046 832 sont déposés sur la colonne. Une pompe péristaltique reliée à la colonne permet de faire circuler les IgG du sérum de lapin toute une nuit à 4°C. Le lendemain, la solution d'IgG est récupérée (= filtrat). La fraction d'IgG liée sur le BNP-K est éluée (= éluat) à l'aide du tampon Tris 20mM, à pH 8,0 contenant de l'urée 5M. On teste ensuite l'éluat et le filtrat afin de s'assurer de l'efficacité de l'épuisement. Les figures 2 et 3 montrent les résultats des tests réalisés en ELISA avec le filtrat des sérums polyclonaux des lapins # 046 805 et # 046 832, respectivement. Les figures 4 et 5 montrent les résultats des tests réalisés en ELISA avec l'éluat des sérums polyclonaux des lapins # 046 805 et # 046 832, respectivement.
Comme c'était attendu, le filtrat des sérums polyclonaux des lapins
# 046 805 et # 046 832 est spécifique du proBNP(1-108) : aucune réactivité n'est observée sur le BNP(1-76) ni sur le BNP(77-108). L'éluat conserve une réactivité vis à vis du proBNP(1-108) importante, mais également une réactivité vis à vis du BNP(77-108). Ces résultats confirment l'efficacité de l'épuisement du sérum polyclonal du lapin sur la résine BNP-K3-NHS-sépharose.
Le BNP(77-108) provient de Sigma (# B-5900), tandis que le proBNP(1-108) et le BNP(1-76) ont été produits sous forme de protéines recombinées exprimées après clonage dans le vecteur pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech) et transfection chez E coli, par les techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Le vecteur d'origine a été fourni par la société Berlex Biosciences (Richmond, CA, USA) et sa préparation est décrite par Yan et al. (PNAS, 2000, vol. 97, pp. 8525-8529). La concentration du proBNP(1-108) et celle du BNP(1-76) ont été déterminées par la méthode Bradford de dosage colorimétrique des protéines (Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72:248-54). Exemple 5 : Détermination du pourcentage de réaction croisée des anticorps anti proBNP(1-108) des lapins # 046 805 et # L01235 vis à vis du BNP(1-76) et du BNP(77-108)
Matériels : 1) Phase solide : microplaque Maxisorp à fond plat, Nunc (Danemark).
2) Le BNP(77-108) provient de Sigma (# B-5900), tandis que le proBNP(1-108) et le BNP(1-76) ont été produits sous forme de protéines recombinées. La concentration de ces solutions de protéines a été déterminée par la méthode Bradford de dosage colorimétrique des protéines (Bradford M. Anal. Biochem. 1976;72:248-54).
3) Le conjugué utilisé est un anticorps polyclonal anti-lgG de lapin couplé à la peroxidase (Sigma # A-9169)
4) Tampon de saturation : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 1 % d'albumine bovine sérique (BSA, Sigma #A-7888) 5) Tampon de dilution : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant
0,1 % de BSA et 0,1% de Tween 20.
6) Solution de lavage : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 0,1% de Tween 20.
7) Solution de révélation: la solution de révélation est composée : 7a) d'un tampon substrat : Solution d'acide citrique 0,01 M, et de citrate trisodique 0,04M contenant de l'H202 à 0,33%, de pH final 5,6, et
7b) d'un chromogène : comprimés d'OPD (orthophénylènediamine). 1 comprimé d'OPD à dissoudre dans 10ml de tampon substrat.
8) Solution d'arrêt : H2S04 4N.
Protocole :
Le test consiste à évaluer l'immunoréactivité des anticorps polyclonaux directement sur les différentes protéines immobilisées dans les cupules d'une plaque de microtitrage.
Plusieurs solutions de sensibilisation en tampon PBS Dulbecco pH 7,4 sont tout d'abord préparées : une première contenant du BNP(77-108) à 0,25μg/ml, une deuxième contenant du proBNP(1-108) à 0,25μg/ml, une troisième contenant du BNP(1-76) à 0,25μg/ml, et une quatrième contenant de la GST (protéine témoin bruit de fond) à 0,25μg/ml. 100μl de chacune de ces solutions sont déposés séparément dans les puits d'une microplaque. S La microplaque est mise à incuber pendant une nuit à 4°C. Après élimination de la solution de sensibilisation, la microplaque est lavée à l'aide de 300 μl d'un tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 0,1% de Tween 20, puis saturée par addition de 250μl du tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 1 % de BSA. La microplaque est alors mise à incuber pendant 1 heure à 37°C.
V La microplaque est ensuite lavée (3 fois) à l'aide de la solution de lavage. Dans chaque cupule, 100μl de solution d'anticorps polyclonal, préalablement dilué à 2 et 1 μg/ml pour le sérum polyclonal du lapin # 046 805 et au 1/2500 et 1/5000 pour le sérum polyclonal du lapin # L01235, sont déposés. Le milieu réactionnel est mis à incuber 2 heures à température ambiante La microplaque est ensuite lavée 3 fois avec 300μl de la solution de lavage. 100μl du conjugué anticorps polyclonal anti-lgG de lapin couplé à la peroxydase, dilué au 1/8000 en tampon de dilution, sont ajoutés dans chaque puits de la microplaque. Le milieu réactionnel est mis à incuber pendant 1 heure à température ambiante. Les plaques sont ensuite lavées (5 lavages) avec 300μl de la solution de lavage. Dans chaque cupule, 100 μl de la solution de révélation sont distribués. On laisse la réaction se développer à l'obscurité pendant 20 minutes à température ambiante (18-24°C). s Ensuite 50 μl de la solution d'arrêt sont distribués dans chaque cupule.
V Après arrêt de la réaction, la lecture de la densité optique est effectuée au spectrophotomètre à 490/620 nm. Tableau I : Résultats de la détermination du pourcentage de réaction croisée des anticorps polyclonaux des lapins #046 805, et #L01235 vis à vis du BNP(1-76) et du BNP(77-108)
Pour un anticorps anti proBNP(1-108) donné, testé sur le BNP(77-108) adsorbé à 0,25μg/ml, sur le proBNP(1-108) adsorbé à 0,25μg/ml et sur la GST adsorbée à 0,25μg/ml, on calcule le pourcentage de la réaction croisée de l'anticorps avec le BNP(77-108) à l'aide de la formule suivante:
DO (BNP77-108) - DO(QST)
% = x 100
DO (proBNP1-108) DO (GST)
Pour un anticorps anti proBNP(1-108) donné, testé sur le BNP(1-76) adsorbé à 0,25μg/ml, sur le proBNP(1-108) adsorbé à 0,25μg/ml et sur la GST adsorbée à 0,25μg/ml, on calcule le pourcentage de la réaction croisée de l'anticorps avec le BNP(1-76) à l'aide de la formule suivante :
DO (BNP1-76) " DO(GST)
% = x 100
DO (proBNPI-108) DO (GST)
Figure imgf000033_0001
Conclusion : La réaction croisée des anticorps polyclonaux de ces sérums est inférieure à 2% sur le BNP(1-76) et inférieure à 5% sur le BNP(77-108). La réactivité croisée vis à vis du BNP(77-108) peut être éliminée par le procédé d'épuisement décrit dans l'exemple 4.b. Cependant, comme c'est décrit dans les exemples 19 et 20, dans les conditions d'un dosage immunoenzymométrique du proBNP(1-108), et aux concentrations de BNP(77- 108) et de BNP(1-76) habituellement retrouvées chez les patients, ces anticorps polyclonaux peuvent être utilisés dans leur version non épuisée sans entraîner l'apparition de réaction croisée.
Exemple 6 : identification de l'épitope reconnu par les sérums polyclonaux des lapins #046 805 et #046 832 avant et après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose
Les sérums polyclonaux des lapins # 046 805 et # 046 832 avant et après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose ont été testés par la méthode spot afin d'identifier l'épitope reconnu par ces sérums polyclonaux. Cette méthode, décrite par Frank (Tetrahedron, 1992; 48:9217-32), permet la synthèse rapide sur membrane de nitrocellulose d'un grand nombre de peptides de séquences prédéfinies. Les protocoles utilisés sont ceux décrits par Molina et al. (Pept. Res., 1996; 9:151-5). Sur une feuille de papier sont créées des zones circulaires (spots) d'environ 5 mm de diamètre, comportant une fonction aminée, qui servent de point d'ancrage à l'acide aminé C-terminal du peptide synthétique. L'allongement de la chaîne peptidique s'effectue par additions successives de Fmoc-acides aminés activés. Les chaînes latérales des acides aminés sont bloquées par des groupements chimiques adéquats. Tous les peptides sont synthétisés avec leur résidu N-terminal N-acétylé. A l'issue de la synthèse, les chaînes latérales sont déprotégées par action de l'acide trifluoroacétique. Ce traitement n'affecte pas la liaison entre le peptide et le support cellulosique, et la réactivité des peptides peut être évaluée par un essai colorimétrique.
La série de peptides synthétisés sur membrane est constituée de 32 pentadécapeptides décalés de 3 résidus d'acides aminés représentant la totalité de la séquence du proBNP(1 -108). Tableau 11 : Membrane spot constituée de 32 pentadécapeptides décalés de 3 en 3 résidus d 'acides aminés représentant la totalité de la séquence du proBNP(1-108)
Figure imgf000035_0001
Après saturation de la membrane à l'aide de 30 ml du tampon TBS (Tris Buffer Saline) à pH 7,0 additionné de Tween 20 à 0,1%, de Blocking buffer à 5% (Euromedex # SU-07-250), et de saccharose à 5%, la réactivité de 20 ml du sérum polyclonal de lapin dilué à 10μg/ml est testée (sur une incubation de 1 heure 30 minutes à 37°C sous agitation). Après lavage avec le tampon TBS à pH 7,0 additionné de Tween 20 à 0,1%, 20 ml de conjugué anti-lgG de lapin couplé à la phosphatase alcaline (Sigma # A-8025) sont mis à incuber 1 heure à température ambiante sous agitation. Enfin, après une dernière série de lavages avec 30 ml de solution de lavage, la révélation des spots est réalisée par addition de 30 ml de solution de substrat (solution de 30ml de tampon CBS (Citrate Buffer Saline) à pH 7,0 contenant 120μl de BCIP (5-bromo-4-chloro-3-lndolyl phosphate) 0,15M, 150μl de MgCI2 1M et 180μl de MTT (Thiazolyl blue tetrazolium bromide) 0,1 M. Après scanérisation de la membrane, l'intensité des spots de la membrane est évaluée (en unités - d'intensité relatives) à l'aide d'un logiciel de traitement d'image. Le bruit de fond est calculé à partir des spots non détectés par l'antisérum. Les résultats de l'analyse epitopique du sérum polyclonal du lapin # 046 805 avant épuisement sont présentés dans la figure 6. Cinq peptides (spots 22 à 26) sont détectés par le sérum polyclonal, et la séquence commune à ces cinq peptides est R 6S77P- Cependant, la réactivité est nettement augmentée lorsque le motif RAP se rajoute en position N-terminale du motif R 6S77p. Les résultats de l'analyse epitopique du sérum polyclonal du lapin # 046 805 après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose sont présentés dans la figure 7. Quatre peptides (spots 22 à 25) sont détectés par le sérum polyclonal, et la séquence commune à ces 4 peptides est RAPR76S77P. Contrairement à ce qui est observé pour le sérum polyclonal avant épuisement, aucune réactivité sur le motif R76S77P seul n'est observé (spot 26). Ceci explique qu'après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose, le sérum polyclonal ne détecte plus le BNP(77-108) [pour rappel, le motif S77P correspond aux deux premiers acides aminés de la séquence du BNP(77-108)]. En conclusion l'épitope reconnu par le sérum polyclonal du lapin # 046 805 rendu monospécifique est RAPR76S77P.
Des résultats tout à fait identiques ont été obtenus à l'aide du sérum polyconal du lapin # 046 832 : l'épitope reconnu par le sérum polyclonal de ce lapin rendu monospécifique est également RAPR76S77P.
Exemple 7 : identification de l'épitope minimum des sérums polyclonaux des lapins # 046 805 et # 046 832 avant et après épuisement, par la méthode de l'Ala-scan
Les sérums polyclonaux des lapins # 046 805 et # 046 832, avant et après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose, ont été testés par la méthode spot (décrite dans l'exemple 6) afin d'identifier l'épitope minimum, dans le peptide charnière, permettant la reconnaissance spécifique du seul proBNP(1-108) par les sérums polyclonaux. On a synthétisé une membrane constituée de 16 pentadécapeptides reprenant la séquence du peptide charnière YTLRAPRSPKMVQGS et porteurs d'une substitution de proche en proche d'un acide aminé par un résidu alanine (Alanine-scanning ou « Ala- scan ») ou glycine, substitution à chaque fois décalée vers la droite d'un résidu d'acide aminé (tableau III). Les résultats de l'analyse Ala-scan des sérums polyclonaux des lapins # 046 805 et # 046 832 avant et après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose sont présentés dans le tableau III.
Tableau III membrane spot à 16 pentadécapeptides
YTLRAPRSPKMVQGS porteurs d'une substitution de proche en proche de chaque acide aminé par un résidu alanine ou glycine. Réactivité des sérums polyclonaux des lapins # 046 805 et # 046 832 avant et après épuisement sur résine BNP-K3-NHS-sépharose.
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
NB : les résidus alanine ou glycine substitués aux acides aminés initiaux sont soulignés (A et G). Les acides aminés critiques dans la reconnaissance de l'épitope reconnu par le sérum polyclonal du lapin # 046 805 avant épuisement sont R76S77P, tandis qu'après épuisement du sérum polyclonal du lapin # 046 805 sur résine BNP-K3-NHS-sépharose, outre le motif R76S77P, le motif RA devient contributeur. Pour le sérum polyclonal du lapin # 046 832 avant épuisement, seule la praline P78 est contributrice, tandis qu'après épuisement du sérum polyclonal du lapin # 046 832 sur résine BNP-K3-NHS-sépharose, le motif contributeur est R-PR76S77P. Ces résultats montrent donc que l'épitope minimum obligatoire dans la reconnaissance spécifique du proBNP(1-108) par les anticorps polyclonaux des lapins # 046 805 et #046 832 est RAPR76S77P.
Exemple 8 : identification de l'épitope minimum du sérum polyclonal du lapin #L01235, par la méthode de l'Ala-scan
Le sérum polyclonal du lapin # L01235, spécifique d'emblée du proBNP(1-108) (épuisement inutile), a été testé par la méthode spot (décrite dans l'exemple 6) afin d'identifier l'épitope minimum, dans le peptide charnière, permettant la reconnaissance spécifique du seul proBNP(1-108) par le sérum polyclonal. La membrane utilisée est celle décrite dans l'exemple 7. Les résultats de l'analyse Ala-scan du sérum polyclonal du lapin # L01235 sont présentés dans le tableau IV.
Tableau IV : membrane spot à 16 pentadécapeptides YTLRAPRSPKMVQGS porteurs d'une substitution de proche en proche de chaque acide aminé par un résidu alanine ou glycine. Réactivité du sérum polyclonal du lapin # L01235.
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
NB : les résidus alanine ou glycine substitués aux acides aminés initiaux sont soulignés (A et G).
Comme pour les sérums polyclonaux des lapins # 046 805 et # 046 832 (exemple 7), ces résultats montrent que l'épitope minimum obligatoire dans la reconnaissance spécifique du proBNP(1-108) par les anticorps polyclonaux du lapin # L01235 est RAPR76S77P.
Exemple 9 : Immunisation de souris avec la protéine recombinée proBNP(1-108)
On a immunisé des souris de souche BALB/c (femelles âgées de 6 semaines) à l'aide du proBNP(1-108) recombiné décrit dans l'exemple 4.b, par les techniques classiques bien connues de l'homme du métier. A la première injection, une émulsion de 1 ml de proBNP(1-108) avec 1 ml d'adjuvant de Freund complet (Sigma # F-5881 ) est réalisée, et 300μl de cette émulsion (soit 100μg de protéine) sont injectés par voie sous-cutanée à chacune des souris. Deux rappels sont réalisés à 15 jours d'intervalle par injection par voie intrapéritonéale de 300μl d'une émulsion de proBNP(1-108) (soit 100μg de protéine) avec de l'adjuvant de Freund incomplet (Sigma # F-5506). Quinze jours après le second rappel, un troisième rappel est effectué de la même manière que les précédents rappels mais en injection sous-cutanée. Enfin, 15 jours après ce dernier rappel, on réalise des prélèvements sanguins sur les souris pour analyser la réponse immunitaire par la technique spot. La réponse immunitaire de la souris 12 s'est avérée particulièrement intéressante pour la suite des travaux.
Exemple 10 : Identification des épitopes reconnus par les anticorps polyclonaux de la souris 12 sur la séquence du proBNP(1-108)
La méthode spot utilisée pour identifier les épitopes reconnus par les anticorps polyclonaux de la souris 12 sur la séquence du proBNP(1-108) est décrite dans l'exemple 6.
La série de peptides synthétisés sur membrane est constituée de 94 pentadécapeptides, décalés chacun d'un résidu d'acide aminé, représentant la totalité de la séquence du proBNP(1-108). La réactivité du sérum polyclonal de la souris 12 dilué au 1/500ème est testée sur cette membrane comme c'est décrit dans l'exemple 6. Après scanérisation de la membrane, l'intensité des spots de la membrane est évaluée (en unités d'intensité relatives) à l'aide d'un logiciel de traitement d'image. Le bruit de fond, calculé à partir des spots non détectés par l'antisérum, était de 30 unités d'intensité relatives.
Trois régions situées en position N-terminale de la séquence du proBNP(1-108) sont ainsi particulièrement bien détectées par les anticorps de l'antisérum de la souris 12 : séquence H1PLGSPGSASDLETS15 (SEQ ID N° 23) (spots 1 à 12), séquence L17QEQRNHLQGK27 (SEQ ID N° 123) (spots 17 à 27) et séquence L38EPLQESPRPTG49 (SEQ ID N° 124) (spots 38 à 49).
De façon surprenante, l'antisérum de la souris 12 contient également des anticorps capables de reconnaître des spots dont la séquence peptidique comprend le motif RAPR76S 7P : spots 64 à 68. Les séquences peptidiques des spots sont décrites dans le tableau V.
Tableau V : Epitopes de la région charnière reconnus, à l'aide de la technique spot, par l'antisérum de la souris 12.
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Exemple 11 : Obtention d'anticorps monoclonaux reconnaissant de façon spécifique le proBNP(1-108), à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108) La souris (femelle BALB/c de 5 semaines) sélectionnée pour la production d'anticorps monoclonaux a été immunisée avec le peptide SEQ ID N° 16 C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2 (C13P30) couplé à la KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) selon le protocole suivant : 100μg du peptide couplé à la KLH dilué volume à volume avec de l'adjuvant complet de Freund ont été injectés par voie sous-cutanée. Quatre rappels ont été effectués à un intervalle de 3 semaines avec 100μg du peptide couplé à la KLH dilué volume à volume avec de l'adjuvant incomplet de Freund, injectés par voie sous-cutanée.
Trois jours avant la réalisation de la fusion lymphocytaire, la souris a subi une hyper-immunisation selon le protocole suivant : la dose totale d'immunogene, ici 100μg de peptide C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2 couplé à la KLH en tampon PBS stérile, est fractionnée en 4 injections. La première et la seconde injections correspondent chacune à 1/10ème de la dose totale. Ces injections sont réalisées par voie sous-cutanée en différents endroits et à 45 minutes d'intervalle. La troisième injection, qui correspond aux 2/10èmes de la dose totale, est réalisée 45 minutes après la seconde injection, par voie sous- cutanée. Trente minutes après la troisième injection, une injection par voie intrapéritonéale de 100μl d'une solution de prométhazine à 1 mg/ml en PBS stérile (Phénergan à 2,5%, Laboratoires Medeva Parma) est réalisée afin de prévenir tout choc anaphylactique. Enfin 15 minutes après, la dernière injection correspondant aux 6/10èmes de la dose totale est effectuée par voie intrapéritonéale.
L'hybridation lymphocytaire est réalisée selon la méthode décrite par Koëhler et Milstein (Nature, 1975; 256:495-97). Elle est réalisée à partir des cellules lymphocytaires extraites de la rate de la souris et des cellules myélomateuses (P3-X63-Ag8.653) préalablement mises en culture en milieu RPMI 1640 (Bio-Whittaker # BE12-167F), complémenté avec un mélange de L-glutamine, pénicilline et streptomycine (Sigma # G-6784), additionné de 10% de sérum de veau fœtal préalablement décomplémenté (Bio-Whittaker #BE02701E) et de 8-azaguanine (Sigma # A-8526). Les cellules lymphocytaires et les cellules myélomateuses, préalablement placées en milieu RPMI 1640 (Bio-Whittaker # BE12-167F) complémenté avec un mélange de L-glutamine, pénicilline et streptomycine (Sigma # G-6784) sans addition de sérum de veau fœtal, sont mélangées à raison de 5 cellules lymphocytaires pour 1 cellule myélomateuse. Après centrifugation du mélange 7 minutes à 900 tr/mn à température ambiante, et remise en suspension du culot cellulaire, 1ml de polyéthylène glycol Hybri-Max® (Sigma # P-7777) est ajouté. Après 1 minute d'incubation au bain marie à 37°C, les cellules sont centrifugées pendant 1 minute et trente secondes à 1000 tr/mn à température ambiante. Enfin après incubation de 2 minutes au bain marie à 37°C, le culot est remis en suspension et 6 ml de milieu RPMI 1640 (Bio-Whittaker # BE12-167F) complémenté avec un mélange de L-glutamine, pénicilline et streptomycine (Sigma # G-6784) préalablement placé à 37°C, sont ajoutés à raison de 10Oμl toutes les 5 secondes, et 9ml de ce même milieu sont ajoutés en une fois. Après centrifugation pendant 10 minutes à 900 tr/mn à TA, et élimination du surnageant, le culot est repris par du milieu RPMI 1640 (Bio- Whittaker # BE12-167F), complémenté avec un mélange de L-glutamine, pénicilline et streptomycine (Sigma # G-6784), additionné de 15% de sérum de veau fœtal préalablement décomplémenté (Bio-Whittaker # BE02701 E) et de HAT (Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine Sigma # H-0262), de façon à distribuer, sous 100μl, 120 000 cellules par puits. La solution est déposée sous 100μl dans les puits des plaques de culture à 96 puits préalablement ensemencés de macrophages murins. Les plaques sont ensuite placées dans un incubateur à C02. Quinze jours après l'hybridation lymphocytaire, le nombre de clones présents dans les plaques de fusion est estimé et exprimé en pourcentage de développement des hybridomes.
La sélection des hybridomes est effectuée en ELISA sur proBNP(1- 108), BNP(1-76), BNP(77-108) et un peptide porteur de la séquence RAPR76S7 P (C13P30). Seuls les hybridomes sécrétant des anticorps capables de détecter le proBNP(1-108) et le peptide C13P30 porteur de la séquence RAPR76S77P et ne reconnaissant substantiellement pas le BNP(1- 76) ni le BNP(77-108), sont retenus. Les hybridomes sélectionnés sont maintenus en culture et clones en dilution limite. Les hybridomes ainsi clones peuvent ensuite être utilisés pour la production de l'anticorps monoclonal en liquide d'ascite.
C'est ainsi que les inventeurs ont produit un hybridome murin, le clone 3D4, sécrétant une immunoglobuline d'isotype lgG-ικ présentant les caractéristiques des anticorps selon l'invention. Cet hybridome a été déposé le 31 juillet 2003 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris, Cedex 15, France) sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3073.
L'invention a donc encore pour objets l'hybridome 3D4 déposé à la CNCM sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3073 et l'anticorps monoclonal qu'il sécrète.
Exemple 12 : Validation en ELISA de la spécificité de l'anticorps produit par l'hybridome 3D4
Matériels :
1 ) Phase solide : microplaque Maxisorp à fond plat, Nunc (Danemark).
2) Le BNP(77-108) provient de Sigma (# B-5900), tandis que le proBNP(1-108) et le BNP(1-76) ont été produits sous forme de protéines recombinées. La concentration de ces solutions de protéines a été déterminée par la méthode Bradford de dosage colorimétrique des protéines (Bradford M. Anal. Biochem. 1976;72:248-54).
3) Le conjugué utilisé est un anticorps polyclonal d'âne anti-lgG de souris couplé à la peroxydase (Jackson Immunoresearch # 715-035-150) 4) Tampon de saturation : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 1 % d'albumine bovine sérique (BSA, Sigma # A-7888)
5) Tampon de dilution : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 0,1 % de BSA et 0,1% de Tween 20.
6) Solution de lavage : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 0,1 % de Tween 20.
7) Solution de révélation: la solution de révélation est composée : 7a) d'un tampon substrat : Solution d'acide citrique 0,01 M, et de citrate trisodique 0,04M contenant de l'H202 à 0,33%, de pH final 5,6, et
7b) d'un chromogène : comprimés d'OPD (orthophénylènediamine). 1 comprimé d'OPD à dissoudre dans 10ml de tampon substrat. 8) Solution d'arrêt : H2S04 4N.
Protocole :
Le test consiste à évaluer l'immunoréactivité du surnageant de culture de l'hybridome 3D4 directement sur les différentes protéines immobilisées dans les cupules d'une plaque de microtitration.
Plusieurs solutions de sensibilisation en tampon PBS Dulbecco pH 7,4 sont tout d'abord préparées : une première contenant du BNP(77-108) à 1 μg/ml, une deuxième contenant du proBNP(1-108) à 1 μg/ml, et une troisième contenant du BNP(1-76) à 1 μg/ml.
Φ 100μl de chacune de ces solutions sont déposés séparément dans les puits d'une microplaque.
• La microplaque est mise à incuber pendant une nuit à 4°C. S Après élimination de la solution de sensibilisation, la microplaque est lavée à l'aide d'un tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 0,1 % de Tween 20, puis saturée par addition de 250μl du tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 1 % de BSA. -/ La microplaque est alors mise à incuber pendant 1 heure à 37°C. La microplaque est ensuite lavée (3 fois) avec 300 μl de la solution de lavage.
•S Dans chaque cupule, 100μl de surnageant de l'hybridome 3D4, préalablement dilué au 1/2 dans le tampon de dilution, sont déposés.
-/ Le milieu réactionnel est mis à incuber 2 heures à température ambiante
• La microplaque est ensuite lavée 3 fois avec 300μl de la solution de lavage. 100 μl de conjugué, anticorps polyclonal anti-lgG de souris couplé à la peroxydase dilué au 1/2000 en tampon de dilution, sont ajoutés à chaque puits de la microplaque. • Le milieu réactionnel mis à incuber pendant 1 heure à température ambiante. •/ Les plaques sont ensuite lavées (5 lavages) avec 300μl de la solution de lavage. Dans chaque cupule, 100 μl de la solution de révélation sont distribués. On laisse la réaction se développer à l'obscurité pendant 20 minutes à température ambiante (18-24°C). Ensuite 50 μl de la solution d'arrêt sont distribués dans chaque cupule. Après arrêt de la réaction, la lecture de la densité optique est effectuée au spectrophotomètre à 490/620 nm.
La figure 8 illustre le résultat de ce test : l'anticorps produit dans le surnageant de l'hybridome 3D4 est capable de détecter uniquement le proBNP(1 -108) et le peptide d'immunisation C13P30, aucune réactivité n'est obtenue sur le BNP(1-76) et le BNP(77-108). Ces résultats valident la spécificité de l'anticorps produit par l'hybridome 3D4 pour le proBNP(1-108) à l'exclusion du BNP(1-76) et du BNP(77-108). L'anticorps selon l'invention issu de l'hybridome 3D4 est donc bien un anticorps reconnaissant de façon spécifique le proBNP(1-108), à l'exclusion substantielle du BNP(1-76) et du BNP(77-108). Exemple 13 : Validation en western-blot de la spécificité de l'anticorps produit par l'hybridome 3D4
Matériels : 1 ) Appareillage d'électrophorèse SDS-PAGE classique
2) Gel de concentration : acrylamide à 5%
3) Gel de séparation : acrylamide à 16%
4) Tampon anode : Tris 0,2M, pH 8,9
5) Tampon cathode : Tris-tricine 0,1 M ; SDS à 0,1 % 6) Tampon de l'échantillon : Tris 0,5M, pH 6,8 ; glycérol à 25% ; SDS à 2% ; béta-mercaptoéthanol 14,4mM ; bleu de bromophénol à 0,1% 7) Appareil de transfert électrophorétique
8) Tampon de transfert : Tris base 25 mM ; glycine 190 mM ; méthanol à 20% ; SDS à 0,05% 9) Le BNP(77-108) provient de Sigma (# B-5900), tandis que le proBNP(1- 108)-GST, le BNP(1-76)-GST et la GST (utilisée comme témoin négatif) ont été produits sous forme de protéines recombinées. La concentration de ces solutions de protéines a été déterminée par la méthode Bradford de dosage colorimétrique des protéines (Bradford M. Anal. Biochem. 1976;72:248-54). 10) Le conjugué utilisé est un anticorps polyclonal d'âne anti-lgG de souris couplé à la peroxydase (Jackson Immunoresearch # 715-035-150) 11 ) Trousse ECL de détection en western-blot (Amersham Biosciences # RPN2106)
Protocole :
La mise œuvre de ce test comprend trois grandes étapes : la migration électrophorétique des différentes protéines dans un gel d'acrylamide à 16%, ensuite le transfert de ces protéines sur une membrane de nitrocellulose, et enfin le western-blot.
Diverses solutions sont préparées en tampon d'échantillon sous un volume final de 35 μl : une première comprenant 1 μg de proBNP(1-108)-GST, une deuxième comprenant 1 μg de GST, une troisième comprenant 1 μg de BNP(1-76)-GST, et une quatrième comprenant 1μg de BNP(77-108). Chaque solution est mise à incuber au bain-marie pendant 5 minutes à 100°C, puis déposée dans un puits du gel. La migration au travers le gel d'acrylamide est réalisée sous voltage constant à 120 V pendant 1 heure 30. La figure 9 correspond à une photographie du gel d'acrylamide obtenu. Les protéines déposées sont colorées par le bleu de coomassie. Après migration, les protéines du gel sont mises à transférer sur une membrane de nitrocellulose durant 1 heure sous 120 mA.
• La membrane de nitrocellulose est ensuite lavée avec du tampon PBS + Tween à 0,1 %, et mise à saturer pendant 30 minutes à température ambiante en tampon PBS + Tween à 0,1% + lait écrémé à 2% Après 3 lavages avec du tampon PBS + Tween 0,1%, la membrane est mise à incuber pendant 1 heure à +37°C, sous agitation, avec 5 ml de surnageant de l'hybridome 3D4. • Après 3 lavages avec le tampon PBS + Tween à 0,1%, la membrane est mise à incuber pendant 1 heure à température ambiante sous agitation avec 10 ml de conjugué anti-lgG de souris couplé à la peroxydase dilué au 1/2000 en tampon PBS + Tween 0,1% + lait écrémé à 2% Après 3 lavages avec le tampon PBS + Tween 0,1 %, la membrane est trempée dans le réactif de révélation ECL, avant d'être exposée à un film photographique pendant 4 minutes.
Comme le montre la figure 10 qui correspond à l'image scannée de la photographie obtenue, l'anticorps produit dans le surnageant de l'hybridome 3D4 est capable de détecter uniquement la bande correspondant au proBNP(1-108). Le BNP(1-76), le BNP(77-108), ainsi que la GST ne sont pas détectées par l'anticorps de l'hybridome 3D4. Ces résultats valident également la spécificité l'anticorps produit par l'hybridome 3D4 pour le proBNP(1-108).
L'anticorps selon l'invention issu de l'hybridome 3D4 est donc bien un anticorps reconnaissant de façon spécifique le proBNP(1-108), à l'exclusion substantielle du BNP(1 -76) et du BNP(77-108). Exemple 14 : Identification de l'épitope reconnu par l'anticorps produit par l'hybridome 3D4 par la méthode spot
Le surnageant de l'hybridome 3D4 a été testé par la méthode spot (décrite dans l'exemple 6) afin d'identifier l'épitope reconnu par l'anticorps de l'hybridome 3D4. Les résultats obtenus indiquent que l'anticorps 3D4 reconnaît effectivement des séquences peptidiques comprenant le motif RAPR76S77P.
Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus en ELISA (exemple 12) et western-blot (exemple 13) validant la spécificité de l'anticorps 3D4 pour le proBNP(1-108).
Exemple 15 : dosage radioimmunométrique du proBNP(1-108)
Matériels :
1 ) Phase solide : microplaque Maxisorp à fond plat et puits sécables, Nunc (Danemark).
2) L'anticorps de capture utilisé est l'anticorps polyclonal obtenu à partir du sérum du lapin # 046 805 non épuisé.
3) Le conjugué utilisé est un anticorps anti-BNP(77-108) marqué à N125 (anti-BNP-l125). Il s'agit de l'anticorps traceur du kit BNP Shionoria commercialisé par la société Shionogi.
4) Tampon de saturation : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 1 % d'albumine bovine sérique (BSA, Sigma # A-7888)
5) Tampon de dilution : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 0,1 % de BSA et 0,1 % de tween 20 (Sigma, # P-1379). 4) Tampon de lavage : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant
0,1 % de Tween 20.
5) Etalon proBNP(1-108) : produit sous forme de protéine recombinée.
Protocole :
Le principe du test utilisé est basé sur la méthode radioimmunoiogique de type sandwich , réalisé en microplaque à fond plat et à cupules sécables. Il s'agit d'un test en un temps où échantillon (ou solution étalon de proBNP(1- 108)) et traceur sont ajoutés l'un après l'autre sans lavage intermédiaire.
Une solution de sensibilisation est tout d'abord préparée avec l'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 dilué en tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 à 40μg/ml. 300μl de cette solution sont déposés dans chacun des puits de la microplaque.
•s La microplaque est mise à incuber pendant une nuit à 4°C. Après élimination de la solution de sensibilisation, la microplaque est lavée à l'aide de 300 μl d'un tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 0,1% de Tween 20, puis saturée par addition de 300μl du tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 1 % de BSA. La microplaque est alors mise à incuber pendant 1 heure à 37°C. •f La microplaque est ensuite lavée (3 fois) à l'aide de 300 μl de la solution de lavage (tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 additionné de Tween 20 à 0,1 %). Dans chaque cupule, 100μl de solution étalon de proBNP(1-108), de sérum ou de plasma sont déposés. Le proBNP(1-108), s'il est présent, se lie à l'anticorps de capture retenu sur la phase solide. 200μl de la solution de traceur anti-BNP-l125 prête à l'emploi (extraite du kit BNP Shionoria de Shionogi) sont ajoutés dans chacun des puits. Le milieu réactionnel est mis à incuber pendant une nuit (18-22h) à 4°C. Le lendemain, la microplaque est lavée (3 fois) à l'aide de 300μl de la solution de lavage. Au dernier lavage et après aspiration de la solution de lavage, chaque cupule est transférée dans un tube préalablement identifié.
V La radioactivité présente dans chaque cupule et proportionnelle à la quantité de traceur fixée, donc à la quantité de proBNP(1-108) présente dans l'échantillon, est mesurée à l'aide d'un compteur gamma. La figure 11 présente les résultats obtenus à l'aide d'une gamme étalon de proBNP(1-108). Exemple 16 : résultats du dosage d'échantillons humains
A l'aide du dosage IRMA proBNP(1-108) selon l'invention décrit dans l'exemple 15 et du dosage BNP(1-76) commercialisé par la société Roche et réalisé sur l'automate Elecsys®, 14 prélèvements de sujets sains et 15 prélèvements de patients souffrant d'insuffisance cardiaque ont été testés. Les échantillons sanguins ont tous été prélevés sur tube contenant de l'EDTA. La figure 12 présente les résultats en cpm (coups par minute) des tests de ces échantillons avec le dosage IRMA proBNP(1-108) selon l'invention. Les résultats obtenus sur les prélèvements de patients souffrant d'insuffisance cardiaque sont significativement plus élevés que ceux obtenus sur les prélèvements de sujets sains. Ces résultats mettent en évidence la présence de proBNP(1-108) circulant dans les prélèvements de patients souffrant d'insuffisance cardiaque et constituent la première démonstration que le proBNP(1-108) sérique est un marqueur prédictif de l'insuffisance cardiaque. La figue 13 présente la corrélation entre les concentrations de proBNP(1-108) (en pg/ml) déterminées à l'aide du dosage IRMA proBNP selon l'invention et les concentrations de BNP(1-76) (pg/ml) déterminées à l'aide du dosage Roche sur l'automate Elecsys®, des prélèvements de 14 patients souffrant d'insuffisance cardiaque. La corrélation observée est significative avec un coefficient R2 = 0,85.
Exemple 17 : couplage de l'anticorps polyclonal du lapin #046 805 à la biotine
La méthode de couplage utilise un dérivé N-Hydroxy Succinimide (NHS) de la biotine qui réagit avec les aminés primaires des IgG pour former une liaison amide.
Une solution de (+)-Biotine N-succinimidyl ester (Fluka # 14405) à 100mM est préparée par dissolution de la Biotine dans de la diméthylfomamide. La biotinylation est réalisée dans un flacon en verre. 500 μg de l'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 préalablement purifié mais non épuisé sont déposés dans le flacon avec 17μl de la solution de biotine 100mM (le rapport molaire biotine/anticorps est de 500). La réaction se fait en tampon PBS Dulbecco à pH 7,4. Le mélange réactionnel est mis à incuber pendant 1 heure 30 à température ambiante sous agitation lente. Après couplage, la biotine est inactivée par ajout d'un volume de tampon glycine 2M. Le mélange est mis incuber pendant 10 minutes à température ambiante sous agitation lente. Enfin le mélange est mis à dialyser une nuit à 4°C contre du tampon PBS Dulbecco à pH 7,4. Le lendemain, une solution d'azoture de sodium est ajoutée à 0,02% en concentration finale. Le conjugué est conservé à 4°C.
Exemple 18 : Dosage immunoenzymométrique du proBNP(1-108)
Un dosage immunoenzymométrique selon l'invention a également été mis au point.
Matériels :
1 ) Phase solide : microplaque Maxisorp à fond plat, Nunc (Danemark).
2) L'anticorps de capture utilisé est un anticorps polyclonal anti- BNP(77-108) commercialisé par la société Stratégie Biosolution (# B9105RA00-A0).
3) Le conjugué utilisé est l'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 non épuisé couplé à la biotine selon le procédé décrit dans l'exemple 17.
4) Conjugué streptavidine-peroxydase (Amersham Pharmacia Biotech # RPN1231V)
5) Tampon de saturation : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 1 % d'albumine bovine sérique (BSA, Sigma # A-7888)
6) Tampon de dilution : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 0,1 % de BSA et 0,1% de Tween 20. 7) Solution de lavage : tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 0,1 % de Tween 20.
8) Etalon proBNP(1-108) : protéine recombinée.
9) Solution de révélation: la solution de révélation est composée :
9a) d'un tampon substrat : Solution d'acide citrique 0,01 M, et de citrate trisodique 0,04M contenant de l'H202 à 0,33%, de pH final 5,6, et
9b) d'un chromogène : comprimés d'OPD (orthophénylènediamine). 1 comprimé d'OPD à dissoudre dans 10ml de tampon substrat.
10) Solution d'arrêt : H2S04 4N. Protocole :
Le principe du test utilisé est basé sur la méthode enzymoimmunologique de type sandwich, réalisé en microplaque à fond plat. Il s'agit d'un test en deux temps où l'échantillon (ou la solution étalon) est tout d'abord mis à incuber avec l'anticorps de capture, puis après incubation et lavages, l'anticorps de détection est ajouté.
Une solution de sensibilisation est tout d'abord préparée avec l'anticorps polyclonal anti-BNP(77-108) dilué en tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 à 10μg/ml. 100μl de cette solution sont déposés dans chacun des puits de la microplaque. La microplaque est mise à incuber pendant une nuit à 4°C. Après élimination de la solution de sensibilisation, la microplaque est lavée à l'aide de 300 μl d'un tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 0,1 % de Tween 20, puis saturée par addition de 250μl du tampon PBS Dulbecco à pH 7,4 contenant 1 % de BSA. La microplaque est alors mise à incuber pendant 1 heure à 37°C.
V La microplaque est ensuite lavée (3 fois) à l'aide de la solution de lavage. Dans chaque cupule, 100μl de solution étalon de proBNP(1 -108), de sérum ou de plasma sont déposés. Le proBNP(1 -108), s'il est présent, se lie à l'anticorps de capture retenu sur la phase solide. Le milieu réactionnel est mis à incuber 2 heures à température ambiante La microplaque est ensuite lavée (5 lavages) avec 300μl de la solution de lavage. 100 μl d'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 biotinyle (concentré à 6μg/ml), sont ajoutés dans chaque puits de la microplaque. Le milieu réactionnel mis à incuber pendant 2 heures à température ambiante.
•/ La microplaque est ensuite lavée (5 lavages) avec 300μl de la solution de lavage. Enfin 100μl de conjugué streptavidine-POD dilué au 1/1000ème sont ajoutés dans chacun des puits de la microplaque.
• Le milieu réactionnel est mis à incuber pendant 1 heure 30 à température ambiante. • Les plaques sont ensuite lavées (5 lavages) avec 300μl de la solution de lavage Dans chaque cupule, 100 μl de la solution de révélation sont distribués. On laisse la réaction se développer à l'obscurité pendant 20 minutes à température ambiante (18-24°C). Ensuite 50 μl de la solution d'arrêt sont distribués dans chaque cupule.
V Après arrêt de la réaction, la lecture de la densité optique est effectuée au spectrophotomètre à 490/620 nm.
La figure 14 présente les résultats obtenus à l'aide d'une gamme étalon de proBNP(1-108).
Exemple 19: Evaluation de la réaction croisée, vis à vis du BNP(1 - 76) et du BNP(77-108), de l'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 non épuisé couplé à la biotine, utilisé en sandwich dans le dosage ELISA proBNP(1 -108) conjointement à l'anticorps polyclonal anti-BNP(77-108).
A l'aide du dosage ELISA du proBNP(1-108) décrit dans l'exemple 18, on a évalué la réaction croisée de l'anticorps anti proBNP(1-108) selon l'invention (lapin # 046 805), non épuisé, biotinyle, vis à vis du BNP(1-76) et du BNP(77-108). Des gammes de concentrations de 5ng/ml à 100ng/ml ont été réalisées avec du proBNP(1-108), du BNP(1-76) et du BNP(77-108) et testées à l'aide du dosage ELISA ProBNP(1-108) décrit dans l'exemple 18. Les résultats de la variation de la densité optique à 490nm en fonction de la concentration sont représentés dans la figure 15 pour chacune des protéines. Aucune réaction croisée n'est observée vis à vis du BNP(1-76) ou du BNP(77- 108) : le signal obtenu est équivalent au bruit de fond, quelle que soit la concentration testée. Aux concentrations de BNP(1-76) et de BNP(77-108) habituellement retrouvées chez les patients (de l'ordre du ng/ml pour les concentrations les plus élevées), l'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 peut être utilisé dans sa version non épuisée sans entraîner l'apparition de réaction croisée.
Exemple 20 : Evaluation de la réaction croisée, vis à vis du BNP(1-
76) et du BNP(77-108), de l'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 non épuisé couplé à la biotine, utilisé en sandwich dans le dosage ELISA proBNP(1-108) conjointement à l'anticorps polyclonal anti-NT-proBNP(1- 29). A l'aide d'un dosage ELISA du proBNP(1-108) utilisant le protocole et les réactifs décrits dans l'exemple 18, mis à part que l'anticorps polyclonal anti- BNP(77-108) est ici remplacé par un anticorps polyclonal anti-NT-proBNP(1- 29), on a évalué la réaction croisée de l'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 non épuisé, biotinyle vis à vis du BNP(1-76) et du BNP(77-108). L'anticorps polyclonal anti-NT-proBNP(1-29) a été produit selon le protocole décrit dans l'exemple 3, mis à part que le peptide utilisé comme immunogène était le peptide NT-proBNP(1-29) couplé à la KLH. Des gammes de concentrations de 5ng/ml à 100ng/ml ont été réalisées avec du proBNP(1- 108), du BNP(1-76) et du BNP(77-108) et testées à l'aide du dosage ELISA du proBNP(1-108). Les résultats de la variation de la densité optique à 490nm en fonction de la concentration sont représentés dans la figure 16 pour chacune des protéines. Aucune réaction croisée de l'anticorps polyclonal du lapin #046 805 selon l'invention n'est observée vis à vis du BNP(1-76) ou du BNP(77- 108), le signal obtenu est équivalent au bruit de fond, quelle que soit la concentration testée. Aux concentrations de BNP(1-76) et de BNP(77-108) habituellement retrouvées chez les patients (de l'ordre du ng/ml), l'anticorps polyclonal du lapin # 046 805 peut être utilisé dans sa version non épuisé sans entraîner l'apparition d'une réaction croisée.
En résumé, il ressort clairement de tout l'exposé qui précède que la présente invention a permis de découvrir un nouvel épitope, RAPR76S77P, situé sur la région charnière du proBNP(108) humain, d'en dériver des peptides immunogéniques le contenant, et d'obtenir des anticorps spécifiques du proBNP(108), qui ne reconnaissent substantiellement pas le BNP(1-76) et le BNP(77-108), et dont certains d'entre eux ont la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains.
Il apparaît aussi clairement que la présente invention a permis la mise au point d'un dosage du proBNP(1-108) circulant permettant ainsi un diagnostic de l'insuffisance cardiaque de façon simple, utilisable en routine et fiable.

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps anti proBNP(1-108) caractérisé en ce que, d'une part, il reconnaît de façon spécifique la séquence RAPR76S 7P (SEQ ID N° 5) du proBNP(1-108) et ne reconnaît substantiellement pas les peptides BNP(1-76) ni le BNP(77-108), et, d'autre part, a la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains.
2. Anticorps anti proBNP(1-108) selon la revendication 1 qui reconnaît de façon spécifique la séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 (SEQ ID N° 4) du proBNP(1-108).
3. Anticorps anti proBNP(1-108) selon la revendication 1 qui reconnaît de façon spécifique la séquence Y7oTLRAPR76S77 KMVQGS8 (SEQ ID N° 108) du proBNP(1-108).
4. Procédé d'obtention d'un anticorps anti proBNP(1-108) tel que défini à l'une des revendications 1 , 2 et 3 dans lequel on immunise un animal avec la molécule entière de proBNP(1-108), puis on épuise, à l'aide du peptide BNP(77-108) et/ou du peptide BNP(1-76), l'antisérum obtenu.
5. Procédé d'obtention d'un anticorps anti proBNP(1 -108), tel que défini à l'une des revendications 1 , 2 et 3, dans lequel on immunise un animal avec un peptide choisi parmi
- un peptide de formule aι - Xι - RAPRSP - X2- a2 (I) OÙ a-i peut être H ou représenter une fonction ou un groupement chimique choisi parmi une fonction thiol, alcool, aminoxy, aminé primaire ou secondaire, un groupement amino-carboxyle, un groupement biotinyle et un groupement acétyle,
Xi représente une séquence peptidique de 0 à 3 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non,
X2 représente une séquence peptidique de 0 à 7 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non, a2 peut représenter une fonction OH, NH2 ou un groupement alcoxyle ;
- un peptide de formule
X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II) où X peut être H, ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108) ;
- un peptide de formule
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (lll) où X peut être H, ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108) ;
- un peptide comprenant une séquence dérivée de la séquence X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II) ou de la séquence
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III) par substitution d'un ou plusieurs parmi les acides aminés Y70, T71, L72, K79, M8o, V8ι, Q82, G83, S8 et G85, avec X pouvant être ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut être une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108) ;
- le peptide ayant la séquence C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G (C13P30 : SEQ ID N° 16);
- le peptide ayant la séquence C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S (CN32 : SEQ ID N0 109); et, éventuellement, on épuise, à l'aide du peptide BNP(77-108) et/ou du peptide BNP(1-76), l'antisérum obtenu.
6. Procédé d'obtention d'hybridome sécréteur d'un anticorps anti proBNP(1-108), tel que défini à l'une des revendications 1 , 2 et 3, dans lequel on immunise un animal avec un peptide choisi parmi
- un peptide de formule aι - Xι - RAPRSP - X2- a2 (I) où ai peut être H ou représenter une fonction ou un groupement chimique choisi parmi une fonction thiol, alcool, aminoxy, aminé primaire ou secondaire, un groupement amino-carboxyle, un groupement biotinyle et un groupement acétyle,
Xi représente une séquence peptidique de 0 à 3 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non,
X2 représente une séquence peptidique de 0 à 7 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non, a2 peut représenter une fonction OH, NH2 ou un groupement alcoxyle ;
- un peptide de formule
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (ll) où X peut être H, ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108) ;
- un peptide de formule
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (lll) où X peut être H, ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108) ;
- un peptide comprenant une séquence dérivée de la séquence X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II) ou de la séquence X-Y7oTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III) par substitution d'un ou plusieurs parmi les acides aminés Y70, T71, L72, K79, M8o, V8ι, Q82, G83, S8 et G85, avec X pouvant être ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut être une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108) ;
- le peptide ayant la séquence C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G
(C13P30 : SEQ ID N0 16); - le peptide ayant la séquence C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S
(CN32 : SEQ ID N0 109); on prélève des lymphocytes sécréteurs d'immunoglobulines de cet animal, et on procède à une fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome pour obtenir au moins un hybridome sécréteur d'immunoglobuline.
7. Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, dans lequel le peptide de formule (II) a la séquence Y7QTLRAPR76S77PKMVQGSG85 (SEQ ID N° 4).
8. Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, dans lequel le peptide de formule (III) a la séquence Y7oTLRAPR7gS77PKMVQGS84 (SEQ ID N° 108)
9. Hybridome susceptible d'être produit par le procédé selon l'une des revendications 6, 7 et 8.
10. Anticorps monoclonal anti proBNP(1-108) sécrété par un hybridome selon la revendication 9.
11. Méthode de diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque chez un humain comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps anti proBNP(1-108) tel que défini dans l'une des revendications 1 , 2, 3, et 10, et la détection du proBNP(1-108) dans l'échantillon.
12. Méthode de diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque chez un humain comprenant : a) la mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps anti proBNP(1-108) tel que défini à l'une des revendications 1 , 2, 3, et 10, b) l'incubation du mélange dans des conditions permettant la formation de complexes antigènes-anticorps ; et c) la révélation des complexes antigènes-anticorps formés, éventuellement à l'aide d'un anticorps de détection, marqué, capable de se lier spécifiquement au proBNP(1-108) présent dans le premier complexe, ou à l'aide d'un antigène de détection, marqué, capable de se lier à l'anticorps dirigé contre ledit proBNP(1-108) présent dans le premier complexe.
13. Méthode de diagnostic selon la revendication 12 qui comprend en plus une étape d) de corrélation de la quantité des complexes antigènes- anticorps révélés à l'état clinique du sujet.
14. Trousse de détection du proBNP(1-108) dans un échantillon biologique, contenant au moins un anticorps tel que défini dans l'une des revendications 1 , 2, 3, et 10.
15. Trousse de détection du proBNP(1-108) dans un échantillon biologique selon la revendication 14, contenant : (i) dans un récipient, au moins un anticorps tel que défini dans l'une des revendications 1 , 2, 3, et 10;
(ii) dans un autre récipent au moins un peptide choisi parmi - un peptide de formule aι - X1 - RAPRSP - X2- a2 (I) OÙ a peut être H ou représenter une fonction ou un groupement chimique choisi parmi une fonction thiol, alcool, aminoxy, aminé primaire ou secondaire, un groupement amino-carboxyle, un groupement biotinyle et un groupement acétyle, Xi représente une séquence peptidique de 0 à 3 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non,
X2 représente une séquence peptidique de 0 à 7 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non, a2 peut représenter une fonction OH, NH2 ou un groupement alcoxyle ;
- un peptide de formule
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (ll) où X peut être H, ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108) ;
- un peptide de formule
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (lll) où X peut être H, ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à
3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108) ;
- un peptide comprenant une séquence dérivée de la séquence X-Y7QTLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II) ou de la séquence
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III) par substitution d'un ou plusieurs parmi les acides aminés Y7o, T7-1, L72, K79, M8o, V8ι, Q82, G83, S8 et G85, avec X pouvant être ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108) ;
- le peptide ayant la séquence Y7oTLRAPR7βS77PKMVQGSG85 (SEQ
ID N° 4) ;
- le peptide ayant la séquence Y7QTLRAPR76S77PKMVQGS84 (SEQ ID N° 109);
- le peptide ayant la séquence C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G (C13P30 : SEQ ID N° 16);
- le peptide ayant la séquence C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S (CN32 : SEQ ID N° 108).
16. Peptide de formule : a1 - Xι - RAPRSP - X2- a2 (I) où ai peut être H ou représenter une fonction ou un groupement chimique choisi parmi une fonction thiol, alcool, aminoxy, aminé primaire ou secondaire, un groupement amino-carboxyle, un groupement biotinyle et un groupement acétyle,
Xi représente une séquence peptidique de 0 à 3 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non,
X2 représente une séquence peptidique de 0 à 7 acides aminés, issue de la séquence naturelle du proBNP(1-108) ou non, a2 peut représenter une fonction OH, NH2 ou un groupement alcoxyle.
17. Peptide de formule :
X-Y7θTLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (ll) où X peut être H, ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108).
18. Peptide selon la revendication 17, ayant la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85 (SEQ ID N° 4).
19. Peptide de formule :
X-Y70TLRAPR76S77PKM VQGS84-Z (III) où X peut être H, ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut représenter une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108).
20. Peptide selon la revendication 19, ayant la séquence Y7θTLRAPR76S77PKMVQGS84 (SEQ ID N° 108).
21. Peptide comprenant une séquence dérivée de la séquence X-Y7QTLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (11) ou de la séquence X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III) par substitution d'un ou plusieurs parmi les acides aminés Y70, T71, L72, K79> M80, V8ι, Q82, G83, S8 et G85, avec X pouvant être ou représenter soit un groupement acétyle, soit 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108), et où Z peut être une fonction OH, ou 1 à 3 acides aminés n'appartenant pas à la séquence du proBNP(1-108).
22. Peptide selon la revendication 16, ayant une séquence choisie dans le groupe constitué par les séquences suivantes
SEQ ID N° 16 : C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G (peptide C13P30) S SEEQQ IIDD NN°0 1 10099 : C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S (peptide CN32)
SEQ ID N0 6 : C-G-R-A-P-R-S-P
SEQ ID N0 7 : Acetyl -C-G-R-A-P-R-S-P
SEQ ID N° 8: C-G-R-A-P-R-S-P-K
SEQ ID N° 9: Acetyl -C-G-R-A-P-R-S-P-K S SEEQQ I IDD N N°° 1 100:: C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V
SEQ ID N° 11 : C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G
SEQ ID N° 12 : R-A-P-R-S-P-G-C
SEQ ID N° 13 : Acetyl -R-A-P-R-S-P-G-C
SEQ ID N° 110 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K
SEQ ID N° 111 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V
SEQ ID N0 112 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q
SEQ ID N0 113 C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G
SEQ ID N0 19 : C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-βA
SEQ ID N° 20 : C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βA
SEQ ID N° 114 Acétyl-C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q
SEQ ID N° 115 C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G
SEQ ID N0 116 C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S
SEQ ID N° 117 C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G
SEQ ID N° 118 C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V S SEEQQ IIDD NN°° 1 11199 : C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q
SEQ ID N° 120 L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-C
SEQ ID N° 121 C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S
SEQ ID N° 122 C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G
23. Procédé d'obtention d'anticorps anti proBNP(1-108) reconnaissant de façon spécifique la séquence Y70TLRAPR76S77PKMVQGSGS5, la séquence Y7QTLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1- 108) à l'exclusion substantielle des peptides BNP(1-76) et BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains, procédé dans lequel on immunise un animal avec un peptide tel que défini dans l'une des revendications 16 à 22, et, éventuellement, on épuise, à l'aide du peptide BNP(77-108) et/ou du peptide BNP(1-76), l'antisérum obtenu.
24. Procédé d'obtention d'hybridome sécréteur d'un anticorps anti proBNP(1-108), reconnaissant de façon spécifique la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85, la séquence Y7QTLRAPR76S77PKMVQGS84 et/ou la séquence RAPR76S77P du proBNP(1-108) à l'exclusion substantielle des peptides BNP(1-76) et BNP(77-108), et ayant la capacité de reconnaître spécifiquement le proBNP(1-108) circulant dans des échantillons sériques ou plasmatiques humains, procédé dans lequel on immunise un animal avec un peptide tel que défini dans l'une des revendications 16 à 22, on prélève des lymphocytes sécréteurs d'immunoglobulines de cet animal, et on procède à une fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome pour obtenir au moins un hybridome sécréteur d'immunoglobuline.
25. Anticorps anti proBNP(1-108), caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé selon la revendication 23.
26. Anticorps anti proBNP(1-108) selon la revendication 25, qui reconnaît de façon spécifique la séquence Y7oTLRAPR76S77PKMVQGSG85 ou la séquence Y oTLRAPR76S77PKMVQGS84 du proBNP(1-108).
27. Hybridome susceptible d'être produit par le procédé selon la revendication 24.
28. Anticorps monoclonal anti proBNP(1-108) sécrété par un hybridome selon la revendication 27.
29. Anticorps monoclonal anti proBNP(1-108) selon la revendication 28 sécrété par l'hybridome 3D4 déposé à la CNCM sous le N°CNCM I-3073.
30. Méthode de diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque chez un humain comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps anti proBNP(1-108) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 25, 26, 28, et 29, et la détection du proBNP(1-108) dans l'échantillon.
31. Méthode de diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque chez un humain comprenant : a) la mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps anti proBNP(1-108) tel que défini à l'une des revendications 25, 26, 28, et 29, b) l'incubation du mélange dans des conditions permettant la formation de complexes antigènes-anticorps ; et c) la révélation des complexes antigènes-anticorps formés, éventuellement à l'aide d'un anticorps de détection, marqué, capable de se lier spécifiquement au proBNP(1-108) présent dans le premier complexe, ou à l'aide d'un antigène de détection, marqué, capable de se lier à l'anticorps dirigé contre ledit proBNP(1-108) présent dans le premier complexe.
32. Méthode de diagnostic selon la revendication 31 qui comprend en plus une étape d) de corrélation de la quantité des complexes antigènes- anticorps révélés à l'état clinique du sujet.
33. Trousse de détection du proBNP(1-108) dans un échantillon biologique, contenant au moins un anticorps tel que défini dans l'une des revendications 25, 26, 28, et 29.
34. Trousse de détection du proBNP(1-108) dans un échantillon biologique, contenant, comme étalon et/ou témoin, au moins un peptide tel que défini dans l'une des revendications 16 à 22.
35. Trousse de détection du proBNP(1-108) dans un échantillon biologique, contenant :
- dans un récipient, au moins un anticorps tel que défini dans l'une des revendications 25, 26, 28, et 29;
- dans un autre récipent au moins un peptide tel que défini dans l'une des revendications 16 à 22.
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