WO2004006663A1 - 肝硬変モデル動物およびその作製方法 - Google Patents

肝硬変モデル動物およびその作製方法 Download PDF

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Shunichi Kuroda
Katsuyuki Tanizawa
Akihiko Kondo
Masakazu Ueda
Masaharu Seno
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Definitions

  • the present invention relates to a model animal for cirrhosis and a method for producing the same, and more particularly to a cirrhosis model animal having human liver tissue that has developed cirrhosis and a method for producing the same.
  • Cirrhosis is a diffuse disease of the liver that leads to increased fiber production and nodular regeneration of residual hepatocytes in the liver due to persistent hepatocyte death.
  • causes include infection (hepatitis virus, parasites), alcohol, biliary depression, hepatic depression, nutritional disorders, poisoning, metabolic abnormalities, autoimmunity, etc. These cause chronic hepatitis to cirrhosis. There are many things.
  • Cirrhosis is an irreversible liver degenerative disease that causes various liver dysfunctions. In addition, cirrhosis often develops into liver cancer and can be fatal, so effective treatment is awaited. However, at present, it has been experimentally demonstrated that administration of liver regeneration factor HGF (also referred to as “hepatocyte growth factor”) by gene therapy, despite the large number of patients that are said to be national disease, has been experimentally improved. There is no definitive cure, only as indicated.
  • HGF also referred to as “hepatocyte growth factor”
  • liver tissue has been destroyed by oral administration of carbon tetrachloride to mice and rats. Although this model animal is suitable for the follow-up of liver regeneration, it does not have true cirrhosis tissue, and thus is an obstacle to developing therapeutic methods and therapeutic agents.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a cirrhosis model animal having liver tissue that actually developed cirrhosis and a method for producing the same. Disclosure of the invention
  • the present inventors have intensively studied a model animal having cirrhosis and a method for producing the same.
  • natural killer cell-dependent rejection was effectively suppressed by preliminarily treating an immunodeficient mouse (skid mouse: scidmouse) with an anti-asialo GM 1. antibody.
  • skid mouse skid mouse: scidmouse
  • anti-asialo GM 1. antibody an immunodeficient mouse
  • they have found that human liver tissue derived from a cirrhosis patient can be transplanted under the kidney capsule of the above-described immunodeficient mouse and maintained for a long period of time, and have completed the present invention.
  • the cirrhosis model animal of the present invention is characterized in that liver tissue of a human who has developed cirrhosis is transplanted into a tissue of an animal.
  • liver tissue that has developed cirrhosis is engrafted in the animal.
  • engraft liver tissue means that the transplanted liver tissue functions in the body without necrosis, and that the liver tissue is transplanted into a liver cirrhosis model. It means that things survive.
  • the cirrhosis model animal obtained in this way is a new model animal that has never been produced. Therefore, the cirrhosis model animal according to the present invention has a liver tissue of a human who actually developed cirrhosis, unlike a conventional liver tissue in which the liver tissue was destroyed, so that the pathological analysis of cirrhosis was performed. And the development of remedies for it, and the improvement of treatment methods. It can prevent the progression of cirrhosis to liver cancer, and plays an important role in preventing these diseases.
  • the tissue of the animal into which the liver tissue is transplanted is not particularly limited, but is preferably a tissue having a high blood flow so that the liver tissue is not necrotic due to ischemia.
  • Such tissues include, for example, kidney, liver, spleen, muscle and the like.
  • the liver tissue be transplanted into the kidney of the animal, more specifically, under the kidney capsule.
  • engraftment into the kidney can achieve engraftment in a relatively short time (about one week).
  • the animal is preferably an immunodeficient animal.
  • immunodeficient animal refers to a part of the cellular elements that make up the immune system, and that a certain state is in an immunodeficient state in which the normal immune system is damaged due to some defect or dysfunction. means. In other words, it means that innate immunity and / or acquired immunity are suppressed so that the transplanted liver tissue will survive in the animal.
  • the above-described immunodeficient animals are immunodeficient. It can be paraphrased as an animal.
  • the immunodeficient animal preferably lacks some or all of the immunocompetent cells and factors involved in the immune response.
  • the above-described immunodeficient animal preferably lacks an immune response ability dependent on T cells and Z or B cells, and further has an immune response ability dependent on natural killer cells (NK cells). More preferably (or the immune response ability is suppressed). It is thought that deficiency of immunocompetent cells and many factors involved in the immune response would suppress the immune response depending on the cells or factors and reduce rejection when transplanting liver tissue.
  • NK cells natural killer cells
  • the above-mentioned immunodeficient animals include, for example, nude animals lacking the thymus and lacking ⁇ cell-dependent immune response ability, and B cells in addition to lacking immune response ability in nude animals.
  • examples thereof include a skid animal lacking a dependent immune response ability and an animal lacking a NK cell-dependent immune response ability in addition to a lack of immune response ability in a skid animal.
  • One of the above-mentioned immunodeficient animals a mouse deficient in the immune response ability depending on T cells, B cells and NK cells, can be prepared by administering an anti-asialo GM1 antibody to a commonly used skid mouse. Can be made. Gash mouth G M1 is a protein specifically expressed in mouse NK cells. Therefore, administration of an anti-Asialo GM1 antibody to a skid mouse can result in a loss of NK cell-dependent immune response in addition to a loss of T-cell and B-cell dependent immune response.
  • the above-mentioned animal is not particularly limited.
  • mice, rats, and egrets are more preferable for use as experimental animals, and mice can be obtained in a relatively short period of time (about one week) and can be obtained at low cost.
  • mice can be obtained in a relatively short period of time (about one week) and can be obtained at low cost. Particularly preferred.
  • the liver tissue of a human who has developed cirrhosis is preferably classified as Child A in the Child classification, which is a classification of the severity of cirrhosis.
  • the liver tissue of a human transplanted to obtain the above cirrhosis model animal preferably has a mild degree of cirrhosis, and for severe cirrhosis tissue classified as C, It is difficult to transplant.
  • the cirrhosis tissue is mild enough to be classified as Child A, the survival rate of liver tissue in a cirrhosis model animal can be increased.
  • the cirrhosis model animal according to the present invention as described above is obtained by transplanting the liver tissue having cirrhosis into the tissue of an immunodeficient animal in which the immune response ability of the animal has been lost, preferably under the renal capsule. It can be produced by engraftment. '
  • cirrhosis tissue can be engrafted in the model animal body with a high probability and can be maintained for a long period of time. Therefore, it is possible to easily produce a cirrhosis model animal useful for the development of a treatment method and a therapeutic drug for cirrhosis.
  • Cirrhosis model animal of the present invention and method for producing the same
  • the cirrhosis model animal according to the present invention is obtained by transplanting the liver tissue of a human with cirrhosis into the body of the animal and engrafting the liver tissue in the body. That is, the cirrhosis model animal is obtained by transplanting a human liver tissue excised from a patient who has developed cirrhosis into another animal and engrafting the human liver tissue in the animal body. .
  • human liver tissue which is a sample, can be easily obtained because hepatectomies are performed as treatment for hepatocellular carcinoma even in general hospitals and the number of patients is large.
  • the above-mentioned “human liver tissue” is preferably one in which the degree of development of cirrhosis is mild.
  • the “human liver tissue” is preferably a child A cirrhosis tissue. Transplantation of severe cirrhosis tissue classified as Child C seems to be difficult.
  • the liver tissue to be transplanted may be normal liver tissue derived from a patient without cirrhosis, and in this case, the normal liver tissue is transplanted into an animal tissue described below to be a model animal, and Cirrhosis may be caused in normal liver tissue transplanted into a model animal.
  • the “human liver tissue” described above may be transplanted with a piece of tissue from which liver tissue that has developed cirrhosis is removed, or the tissue piece may be cultured in the same individual or another organism in vivo. (vi vo), or may be a culture in vitro.
  • the above-mentioned ⁇ human liver tissue '' was extracted from a liver cirrhosis patient. Afterwards, it is stored in ice-cooled culture medium (eg cell culture medium, physiological saline, etc.) Is preferred.
  • the liver tissue to be transplanted varies depending on the size of the transplanted individual.For example, when transplanting into mice and rats, it is preferable that the liver tissue be resected to an appropriate size of about 2 mm square. .
  • the tissue of the animal into which the sample is transplanted is not particularly limited as long as the sample can survive, but is preferably a tissue with a high blood flow so that the transplanted liver tissue is not necrotic due to ischemia.
  • tissue include kidney, liver, spleen, and muscle.
  • the liver tissue be transplanted into the kidney of the animal, more specifically, under the kidney capsule. “Transplanting under the kidney capsule” means that the capsule of the kidney to be transplanted is incised, and liver tissue is inserted into the incision.
  • tissue of the animal may be a tissue that is unlikely to cause a rejection reaction with the sample, such as the conjunctiva of the eye.
  • the sample and the tissue of the animal can be obtained by a technique using an immunodeficient animal in which the immune response function of the animal has been lost. Rejection reaction can be suppressed.
  • ⁇ '' The above-described immunodeficient animals are in an immunodeficient state due to abnormalities of immunocompetent cells, abnormalities of genes such as immune response genes, administration of drugs such as immunosuppressants or physicochemical factors such as X-ray irradiation. Means an animal. Such an immunodeficient animal can be obtained by mutation or artificial creation.
  • the method for artificially producing an immunosuppressed animal is not particularly limited, but the immunity can be controlled by genetic engineering techniques or drug administration.
  • Part or all of one or more of cells or factors involved in the immune response (specifically, phagocytes such as B cells, T cells, NK cells, macrophages, complement, etc.) It can be manufactured by causing anomalies in the surface. If the number of immunocompetent cells or immune response factors that cause an abnormality is large, the immune response ability depending on them can be lost, and rejection when liver tissue is transplanted into an animal can be further reduced. Therefore, even a liver tissue derived from a human can be efficiently engrafted to the above-described immunodeficient animal.
  • Examples of the immunodeficient animal include a nude animal lacking a T cell-dependent immune response ability, a skid animal lacking a T cell and B cell-dependent immune response ability, and a skid animal as described in Examples below. Examples of such animals include those that have lost NK cell-dependent immune response by administering an anti-asia GM1 antibody to the animals.
  • the anti-Asialo GM1 antibody is an antibody that uses the asia GM1 protein specifically expressed in mouse NK cells as an antigen, and binds to NK cells by specifically binding to the protein. It lacks the dependent immune response ability. ⁇ 'In addition, in order to impair the immune response ability involving NK cells in animals other than mice, irradiation or a large amount of an immunosuppressant may be administered.
  • the transplantation of the sample depends on the animal to be transplanted and its tissue, but can be performed by a conventionally known general method. For example, when implanting under the kidney capsule of a mouse as in the examples described below, the mouse is anesthetized, the laparotomy is performed, the kidney is exposed, and the liver tissue of the sample is introduced under the kidney capsule.
  • the transplant may be performed by suturing the muscular layer and the skin in one layer.
  • whether the transplanted human liver tissue has survived can be determined by HE staining the transplanted liver tissue. If HE staining confirms that it is alive, it can be determined that the transplanted human liver tissue has survived. On the other hand, in the tissue where engraftment has not been obtained, the cell structure is completely muddy, so that it can be easily determined.
  • a determination method other than the above there is a method of measuring proteins synthesized in human hepatocytes, such as human albumin, human prealbumin, and ProteneC, by the ELISA method, the Western blot method, and the like.
  • a liver-derived cirrhosis tissue can be transplanted to produce a cirrhosis model animal showing the pathology of cirrhosis.
  • This cirrhosis model animal is a model animal having a disease state closer to that of a cirrhosis patient than a conventional model animal in which liver tissue has been ruptured, and thus can greatly contribute to the development of a treatment method and a therapeutic drug for cirrhosis. High.
  • disease model animals with a certain disease state are closer to actual clinical symptoms than healthy animals. Therefore, it is preferable from the viewpoint of efficacy evaluation to conduct a test using a disease model animal having a certain disease state instead of a healthy animal. Therefore, such cirrhosis model animals play an important role as experimental animals in elucidating the causes of human diseases, and in developing techniques for diagnosis, prevention and treatment.
  • the cirrhosis model animal obtained by the preparation method described in (1) above is as follows. 8939
  • Liver tissue from humans with cirrhosis can be passaged in animals (especially mice that are easy to use as experimental animals), and a model animal showing the pathology of human cirrhosis can be obtained. -One-.
  • liver tissue from a patient into the kidney of a cirrhosis model animal By transplanting liver tissue from a patient into the kidney of a cirrhosis model animal, a) the kidney of the cirrhosis model animal can be easily distinguished from the transplanted tissue. B) The left, right, or upper part of the kidney of the same individual It can be transplanted separately in the middle, lower, etc. Therefore, the effects of drugs under the same conditions are compared it can.
  • a cirrhosis model animal was prepared using a skid mouse (scidmouse) deficient in T cells and B cells. The procedure is shown below.
  • BALB mice were used as the above-mentioned skid mice.
  • the above-mentioned skid mouse was pretreated with an anti-asialo GM1 antibody (manufactured by Cedarlane, model number: CL8955, name: Ranbbit Ant i-Mouse / Rat AsialoGMl Polyclonal Ant ibody) 20 days before transplantation. ⁇ g and then 20 ⁇ g intraperitoneally prior to laparotomy on the day of transplantation. For comparison, some skid mice were not administered the anti-Assaro GM1 antibody.
  • Liver tissue removed from a cirrhosis patient was used as the liver tissue of a human with cirrhosis.
  • the liver tissue was excised to a size of several centimeters after extraction and stored in an ice-cooled culture solution.
  • the above-mentioned skid mouse was injected with an anesthetic (100 cc of physiological saline plus 4 cc of nembutal) containing Nembutal (manufactured by Banyu Pharmaceutical). 1 cc was administered intraperitoneally using a device (2.5 cc, needle 27 G) and anesthetized. With a 27 G needle, the intestinal tract escapes even if the mouse is stabbed vertically into the abdominal wall of the mouse, allowing injection without damaging the intestinal tract.
  • the animated skid mouse had its limbs fixed with vinyl tape and a midline incision in the abdomen with scissors. At this time, the skin and fascia (fascia) were separately incised so as not to damage the intestinal tract and the like.
  • the skid mouse was set with a mouse retractor and the intestinal tract was separated using a cotton swab or a sessile to expose the kidney.
  • bleeding is responded by pressing with a cotton swab.
  • a cotton swab was inserted into the back of the kidney, and the kidney was prolapsed.
  • the kidney capsule was grasped with a microscopic sessile and a small incision was made.
  • the liver tissue stored in the culture solution was excised into small pieces of about 2 mm square, and a small piece of the liver tissue was inserted under the incised kidney capsule while holding the kidney capsule of the skid mouse with a sessie.
  • the intestinal tract is returned to the abdominal cavity.
  • the incision in the abdomen was sutured using sutures (3-0 silk).
  • the suture was performed on each of the two layers of skin and fascia. After that, the above-mentioned skid mouse was transferred to another gauge and awakened from anesthesia in about 2 hours.
  • the survival rate of the cirrhosis model animal prepared in Example 1 was 100%. That is, all mice awakened from anesthesia survived.
  • the above-mentioned anti-Asialo GM1 antibody was further administered on the 5th and 10th days after the transplantation.
  • a cirrhosis model animal having a liver tissue of a human with cirrhosis can be obtained with a high probability.
  • This cirrhosis model animal differs from a conventional experimental animal for cirrhosis and is actually a transplanted human cirrhosis tissue. Therefore, it can be suitably used for a screening test of a drug for diagnosing cirrhosis and a drug for preventing and / or treating cirrhosis, and is expected to greatly facilitate the development of a drug for treating cirrhosis.

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Abstract

　本発明は、肝硬変を発症したヒトの肝臓組織を有する肝硬変モデル動物を提供する。免疫欠損動物であるスキッドマウスに、抗アシアロＧＭ１抗体を投与し、ナチュラルキラー細胞に依存する免疫応答能を欠損させた後、肝硬変患者由来の肝臓組織をスキッドマウスの腎臓皮下に移植することによって、肝硬変モデル動物を作製する。この肝硬変モデル動物は、肝硬変を発症したヒトの肝臓組織を有しているため、肝硬変の治療方法及び治療薬剤の開発に有効に利用することができる。

Description

明 細 書 肝硬変モデル動物おょぴその作製方法 技術分野
本発明は、 肝硬変用のモデル動物、 およびその作製方法に関し、 特に 肝硬変を発症したヒ ト肝臓組織を保有する肝硬変モデル動物、 およびそ の作製方法に関するものである。 背景技術
肝硬変は、 持続する肝細胞の壌死によつて、 肝臓に繊維の増生と残存 肝細胞の結節状再生とを招来する肝臓のびまん性疾患である。 その原因 としては、 感染 （肝炎ウィルス、 寄生虫） 、 アルコール、 胆汁うつ帯、 肝うつ血、 栄養障害、 中毒、 代謝異常、 自己免疫などがあり、 これらを 起因と して慢性肝炎から肝硬変へ至るものが多い。
肝硬変は、 不可逆の肝変性疾患であり、 種々の肝機能障害を引き起こ す。 さらに、 肝硬変は肝臓癌へと発展することも多く、 死に至る可能性 もあるため効果的な治療方法が待たれている。 しかし、 現時点では、 国 民病とも言われるほど患者数が多いのにもかかわらず、 肝再生因子 H G F (「肝細胞成長因子」ともいう） を遺伝子治療で投与すると改善される ことが実験的に示されただけで、 確実な治療法は存在しない。
ところで、 ヒ ト疾患の発症機構を解明し、 その治療方法及ぴ治療薬剤 を開発するにあたって、 そのヒ ト疾患と酷似した病態を示すモデル動物 を利用した動物実験が重要な役割を果たす。 肝硬変についても、 上記モ デル動物を使用した肝硬変の発症機構の解明、 さらにその治療方法及び 治療薬剤の開発が進められている。
現在使用されている肝硬変用のモデル動物は、 マウス、 ラッ トなどに 四塩化炭素を経口投与し、 肝組織を破壊したものである。 このモデル動 物は、 肝再生の経過観察には適しているが、 本当の肝硬変組織を有する ものではないため、 治療方法及び治療薬剤の開発を行う上で一つの障害 となっている。
本発明は、 上記の課題に鑑みてなされたものであり、 その目的は実際 に肝硬変を発症した肝臓組織を有する肝硬変モデル動物及びその作製方 法を提供することにある。 発明の開示
本発明者等は、 上記の課題に鑑み、 肝硬変組織を有するモデル動物お よびその作製方法について鋭意検討した。 その結果、 免疫欠損マウス （ スキッ ドマウス ： s c i d m o u s e ) を予め抗ァシァロ G M 1 .抗体 投与処理することによ り、 ナチュラルキラー細胞依存性拒絶反応を効率 的に抑-制するこ-どに成功した。 そして、 肝硬変患者由来のヒ ト肝臓組織 を上記免疫欠損マウスの腎臓皮膜下に移植して長期に維持できることを 見出し、 本発明を完成させるに至った。
本発明の肝硬変モデル動物は、 肝硬変を発症したヒ トの肝臓組織が動 物の組織に移植されていることを特徴と している。
これにより、 動物に肝硬変を発症した肝臓組織が生着される。 ここで 、 「肝臓組織が生着する」 とは、 移植された肝臓組織が壊死することな く、 体内において機能し、 且つ、 肝臓組織が移植された肝硬変モデル動 物が生存することを意味する。
このよ うにして得られる肝硬変モデル動物は、 'これまで作製されたこ とのない新規モデル動物である。 したがって、 本発明にかかる肝硬変モ デル動物は、 従来の肝臓組織が破壊されたものとは異なり、 実際に肝硬 変を発症したヒ トの肝臓組織を有するものであるため、 肝硬変の病態解 析やその治療薬の開発、 治療法の改善に好適に利用することができる。 そして、 肝硬変から肝臓癌への進展を防ぐことができ、 これらの疾患の 予防のために重要な役割を果たす。
上記肝臓組織が移植される動物の組織は、 特に限定されるものではな いが、 虚血によって肝臓組織が壊死しないよ うに、 血流の多い組織であ ることが好ましい。 このような組織と しては、 例えば、 腎臓、 肝臓、 脾 臓、 筋肉などが挙げられる。 このうち、 上記肝臓組織は、 上記動物の腎 臓、 より詳細には腎臓皮膜下に移植することが特に好ましい。 このよ う に、 腎臓に移植すれば、 比較的短期間 （ 1週間程度） で生着が得られる 。 また、 移植元である腎臓と、 移植される組織との識別が容易である。 さらに、 同一個体の腎臓の左右、 または、 上部、 中部、 下部などに分け て移植するこどが可能である。 それゆえ、 同一条件での薬剤の効果が比 較できるなどの利点がある。
本発明に.おいて、 上記動物は、 免疫欠損動物であることが好ましい。 ここで、 「免疫欠損」 とは、 免疫系を構成する細胞要素の一部、 ある レヽはいくつかの欠損または機能不全によって、 正常免疫機構に障害を生 じた免疫不全の状態にあることを意味する。 換言すれば、 移植される肝 臓組織が動物に生着するように、 先天性免疫および/または後天性免疫 が抑制されていることを意味する。 なお、 上記免疫欠損動物は免疫不全 動物と言い換えることもできる。
• すなわち、 上記免疫欠損動物は、 免疫担当細胞や免疫応答に関与する 因子の一部または全てを欠損していることが好ましい。
具体的には、 上記免疫欠損動物は、 T細胞おょぴ Zまたは B細胞に依 存する免疫応答能を欠損していることが好ましく、 さらに、 ナチュラル キラー細胞 （N K細胞） に依存する免疫応答能を欠損している （あるい は、 免疫応答能が抑制されている） ことがより好ましい。 免疫担当細胞 や免疫応答に関与する因子の多く を欠損していれば、 当該細胞や因子に 依存する免疫応答を抑制し、 肝臓組織を移植する時の拒絶反応を低減で きると考えられる。
それゆえ、 上記免疫欠損動物と しては、 例えば、 胸腺を持たないため に τ細胞に依存する免疫応答能を欠損しているヌード動物、 ヌード動物 における免疫応答能の欠損に加えて B細胞に依存する免疫応答能を欠損 しているスキッ ド動物、 スキッ ド動物における免疫応答能の欠損に加え て N K細胞に依存する免疫応答能を欠損している動物を挙げることがで きる。
上記免疫欠損動物の一つで'ある、 T細胞、 B細胞および N K細胞に依 存する免疫応答能を欠損したマウスは、 一般的に用いられるスキッ ドマ ゥスに抗ァシァロ G M 1抗体を投与して作製することができる。 ァシァ 口 G M 1はマウスの N K細胞に特異的に表現されるタンパク質である。 それゆえ、 抗ァシァロ G M 1抗体をスキッ ドマウスに投与すれば、 T細 胞および B細胞に依存する免疫応答能の欠損に加えて、 N K細胞に依存 する免疫応答能を欠損させることができる。
本発明において、 上記動物は特に限定されるものではないが、 マウス 、 ラッ ト、 モルモッ ト、 ハムスター、 ゥサギ、 ィヌなどが挙げられる。 これらのうち、 実験動物と して用いるには、 マウス、 ラッ ト、 ゥサギが より好ましく、 比較的短期間 （ 1週間程度） で生着が得られ、 安価に入 手できることからマウスであることが特に好ましい。
また、 本発明の肝硬変モデル動物において、 上記肝硬変を発症したヒ トの肝臓組織は、 肝硬変の重症度分類であるチヤィルド分類において、 チャイルド Aに分類されるものであることが好ましい。
つまり、 上記肝硬変モデル動物を得るために移植されるヒ トの肝臓組 織は、 肝硬変の発症の程度が軽度のものであることが好ましく、 チヤィ ルド Cに分類される重度の肝硬変組織については、 移植することは困難 である。 上記チャイルド分類において、 チャイルド Aに分類される程度 の軽度の肝硬変組織であれば、 肝硬変モデル動物における肝臓組織の生 着率を高めることができる。
以上のよ うな本発明にかかる肝硬変モデル動物は、 動物の免疫応答能 を欠損させた免疫欠損動物の組織、 好ましくは腎皮膜下に、 肝硬変を発 症した肝臓組織を移植して上記肝臓組織を生着させることによって作製 することができる。 '
これによ り、 上記モデル動物の体内に肝硬変組織を高確率で生着さ せ、 長期に渡って維持することができる。 そのため、 肝硬変の治療法 及び治療薬の開発に有用な肝硬変モデル動物を、 容易に作製すること ができる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の一形態について説明する。 ( 1 ) 本発明の肝硬変モデル動物およびその作製方法
本発明に係る肝硬変モデル動物は、 肝硬変を起こしたヒ トの肝臓組織 が動物の体内に移植され、 上記肝臓組織を体内に生着させたものである 。 即ち、 上記肝硬変モデル動物とは、 肝硬変を発症した患者から摘出さ れたヒ ト肝臓組織を、 他の動物に移植し、 動物の体内において上記ヒ ト 肝臓組織を生着させてなるものである。
試料となる上記 「ヒ トの肝臓組織」 は、 一般的な病院においても肝細 胞癌に対する治療と して肝切除術を行っており、 患者数も多いので容易 に得ることができる。 上記 「ヒ トの肝臓組織」 としては、 肝硬変の発症 の程度が軽度のものであることが好ましい。 肝硬変の重症度分類である チャイルド分類に基づけば、 上記 「ヒ トの肝臓組織」 はチャイルド Aの 肝硬変組織であることが好ましい。 なお、 チャイルド Cに分類される重 度の肝硬変組織については、 移植することは困難であると思われる。 ま た、 移植される肝臓組織は、 肝硬変未発症者由来の正常な肝臓組織であ つてもよく、 この場合、 後述する動物の組織に正常の肝臓組織を移植し てモデル動物と した後、 当該モデル動物に移植された正常の肝臓組織に 肝硬変を発症させればよい。 ―
また、 上記 「ヒ トの肝臓組織」 は、 肝硬変を発症している肝臓組織を 取り出した組織片を移植してもよいし、 当該組織片を同一個体または他 の生物で生体内培養 （culture in vi vo) して継代したものであっても よいし、 ガラス器内培養 ( culture i n vitro) したものであってもよい なお、 上記 「ヒ トの肝臓組織」 は、 肝硬変患者より摘出された後、 氷 冷された培養液 （例えば細胞培養液、 生理食塩水など） 中に保存される ことが好ましい。 また、 移植される肝組織は、 移植先の個体の大きさに よって異なるが、 例えば、 マウス及びラッ トに移植を行う場合は、 2 m m角程度の適当な大きさに切除されることが好ましい。
試料が移植される上記動物の組織は、 上記試料が生着できれば特に限 定されるものではないが、 移植した肝臓組織が虚血によって壊死しない ように、 血流の多い組織であることが好ましい。 こ'：のような組織と して は、 例えば、 腎臓、 肝臓、 脾臓、 筋肉などが挙げられる。 これらのうち 、 上記肝臓組織は、 上記動物の腎臓、 より詳細には腎臓皮膜下に移植す ることが特に好ましい。 この「腎臓皮膜下に移植する」とは、 移植先の腎 臓の皮膜が切開され、 その切開部へ肝臓組織が挿入されることを意味す る。
また、 上記動物の組織は、 例えば、 眼球結膜のように、 上記試料と拒 絶反応が起こり にくい組織であってもよい。
このよ うに、 試料を拒絶反応が起こ りにくい動物の組織に移植すると いう手法の他にも、 上記動物の免疫応答機能を欠損させた免疫欠損動物 を用いる手法によっても、 試料と動物の組織.との拒絶反応を抑制するこ とができる。 ― ' 上記免疫欠損動物は、 例えば、 免疫担当細胞の異常、 免疫応答遺伝子 などの遺伝子の異常、 免疫抑制剤などの薬剤の投与または X線照射など の物理化学的因子などによって免疫不全の状態にある動物を意味する。 このよ うな免疫欠損動物は、 突然変異または人為的に作製するこ とによ つて得ることができる。
人為的に免疫抑制動物を作製する方法としては、 特に限定されるもの ではないが、 遺伝子工学的手法または薬剤の投与などによつて免疫担当 細胞や免疫応答に関与する因子 （具体的には、 B細胞、 T細胞、 N K細 胞、 マク ロファージなどの食細胞、 補体など） のうち、 1つ以上の細胞 あるいは因子の一部または全てに異常を生じさせることにより作製でき る。 異常を生じさせる免疫担当細胞または免疫応答因子が多ければ、 そ れらに依存する免疫応答能を欠損させることができ、 肝臓組織を動物に 移植するときの拒絶反応を一層低減することができる。 それゆえ、 ヒ ト 由来の肝臓組織であっても、 上記免疫欠損動物に効率よく生着させるこ とができる。
上記免疫欠損動物としては、 例えば、 T細胞に依存する免疫応答能を 欠損したヌード動物、 T細胞および B細胞に依存する免疫応答能を欠損 したスキッ ド動物、 後述の実施例のようにスキッ ド動物に抗ァシァ口 G M l抗体を投与することによ り さらに N K細胞に依存する免疫応答能を 欠損した動物などが挙げられる。
なお、 上記抗ァシァロ G M 1抗体は、 マウスの N K細胞に特異的に表 現されるァシァ口 G M 1 タンパク質を抗原とする抗体であり、 当該タン パク質と特異的に結合することによって N K細胞に依存する免疫応答能 を欠損させている。 ― ' また、 マウス以外の動物において N K細胞が関与する免疫応答能を欠 損させるためには、 放射線照射もしくは免疫抑制剤を大量に投与すれば よい。
なお、 試料の移植は、 移植する動物およびその組織によって異なるが 、 従来公知の一般的な方法で移植することができる。 例えば、 後述の実 施例のようにマウスの腎臓皮膜下に移植する場合、 マウスを麻酔して開 腹した後、 腎臓を露出させて、 腎臓皮膜下に試料の肝臓組織を揷入し、 筋層および皮膚を一層にて縫合して移植を行えばよい。
なお、 上記'肝硬変モデル動物において、 移植されたヒ ト肝組織が生着 したか否かの判定は、 移植した肝組織を H E染色することによって実施 することができる。 H E染色によつて生きていることが確認されれば、 移植されたヒ ト肝組織は生着していると判断することができる。 一方、 生着が得られなかった組織については細胞構造が全く壌れてしま うこと から、 容易に判定することができる。 また、 上記以外の判定方法として 、 ヒ ト肝細胞で合成されるヒ トアルブミ ン、 ヒ トプレアルブミ ン、 P r o t e i n Cなどのタンパク質を E L I S A法やウェスタンブロッ ト法 などで測定する方法などがある。
以上のよ うにして、 ヒ ト由来の肝硬変組織を移植し、 肝硬変の病態を 示した肝硬変モデル動物を作製することができる。 この肝硬変モデル動 物は、 従来の肝組織を破壌したモデル動物と比較して、 より肝硬変患者 に近い病態を有するモデル動物であるため、 肝硬変の治療方法及び治療 薬剤の開発に大きく貢献できる可能性が高い。
各種物質の薬理作用、 特に医薬品開発を目的とする薬効スク リーニン グ試験などにおいては、 健常動物より も一定の病態状態にある疾患モデ ル動物の方が、 より実際の臨床症状に近い。 そのため、 健常動物ではな く一定の病態状態にある疾患モデル動物を用いた試験を行うことが、 薬 効評価上も好ましい。 それゆえ、 このよ うな肝硬変モデル動物は、 ヒ ト 疾患の原因解明、 診断、 予防、 治療技術の開発にあたって、 実験用動物 と して重要な役割を果たす。
( 2 ) 本発明の肝硬変モデル動物の有用性
上記 （ 1 ) で説明した作製方法により得られる肝硬変モデル動物は以 8939
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下のような有用性がある。
① ： スタンフォード大学医学部などの肝細胞をマウスの尻尾から注射 する従来の方法 (K, Marion PL, Nakai H, Meuse L, Cullen JM, Bordier BB , Schwall R, Greenberg HB, Glenn JS, Kay MA. Sustained survival of h uraanhepatocytes in mice： A model for in vivo infection with human hepatitis B and hepatitis delta viruses. Nat. Med. 2000 Mar； 6 (3) :327-331 参照） では、 マウス肝臓内にモザイク状にヒ ト肝臓細胞が埋 め込まれているため、 組織と してヒ ト肝臓組織を保持することは不可能 である。 また、 肝硬変を発症した肝組織を分散させ肝細胞として注入す ることは、 細胞がもともとダメージを受けているのに更にダメージを受 けることになり、 生着率は極めて低いと思われる。 一方、 本発明は上記 の従来法とは異なり、 ヒ ト肝臓組織を移植しているため、 薬物や種々の 物質を肝細胞で検討するより も生体によ り近く、 臨床的にみても意義の あるモデル動物を提供できる。
② ： 肝硬変を発症したヒ ト由来の肝臓組織を動物 （特に実験動物と し て使いやすいマウス） で継代でき、 ヒ ト肝硬変の病態を示したモデル動 物が得られる。 - 一- .
③ ： 比較的短期間 （ 1週間程度） で肝硬変組織の生着した肝硬変モデ ル動物を作製することが可能である。
④ ： 肝硬変モデル動物の腎臓に、 患者由来の肝臓組織を移植すれば、 a ) 肝硬変モデル動物の腎臓と移植された組織との識別が容易に行える b ) 同一個体の腎臓の左右、 または、 上部、 中部、 下部などに分けて移 植することが可能である。 それゆえ、 同一条件での薬剤の効果等が比較 できる。
⑤ ： 肝硬変の診断のための医薬品、 肝硬変の予防および/または治療 のための医薬品のスク リーニング試験などに好適に用いることができる 。 その結果、 肝硬変治療薬の開発が著しく容易になる。
⑥ ： 肝硬変の治療法が見出されれば、 肝硬変から肝臓癌への進行を防 ぐことができ、 肝臓癌の予防にも貢献できる。
以下、 本発明を実施例により詳細に説明する。 なお、 本発明は、 以下 の実施例の記載に限定されるものではなく、 本発明の範囲内で種々の変 更が可能である。
〔実施例 1〕 （肝硬変モデル動物の作製）
本実施例においては、 T細胞、 B細胞不全のスキッ ドマウス （ s c i d m o u s e ) を用いて肝硬変モデル動物の作製を行った。 以下にそ の手順を示す。
上記スキッ ドマウスとして、 本実施例では B A L B種のものを用いた 。 上記スキッ ドマウスには、 前処理と して抗ァシァロ G M 1抗体 （Ceda rlane 製、 型番 ： CL8955 , 名称 ： Ranbbit Ant i-Mouse/Rat As i aloGMl P olyclonal Ant ibody) が移植の 3 日前に 2 0 μ g、 さらに移植日の開腹 前に 2 0 μ g腹腔内に投与された。 なお、 比較のために、 一部のスキッ ドマウスには抗ァシァロ G M 1抗体の投与を行わなかった。
肝硬変を起こしたヒ トの肝臓組織と して、 肝硬変患者より摘出された 肝臓組織を使用した。 上記肝臓組織は、 摘出した後数センチ角に切除さ れ、 氷冷した培養液の中に保存された。
上記スキッ ドマウスには、 ネンブタール （萬有製薬製） を含む麻酔薬 (生理食塩水 1 0 0 c cにネンブタール 4 c cを加えたもの） が、 注射 器 （ 2. 5 c c、 針 2 7 G) を用いて腹腔内に 1 c c投与され、 麻酔が かけられた。 2 7 Gの注射針を用いれば、 マウスの腹壁に垂直に刺して も腸管が逃げるため、 腸管を損傷させずに注射を行う ことができる。 麻 酔がかけられたスキッ ドマウスは、 手足をビニールテープで固定され、 はさみにて腹部が正中切開された。 このとき、 腸管などを損傷しないよ うに、 皮膚、 筋膜 （ f a s c i a ) をそれぞれ別々に切開した。
続いて、 スキッ ドマウスにマウス用の開創器をかけ、 綿棒またはセッ シを用いて腸管を分けていき、 腎臓を露出させた。 このとき、 出血に対 しては、 綿棒にて圧迫することで対応する。 その後、 腎臓の背側に綿棒 を揷入し、 腎臓を脱転させた。 そして、 実体顕微鏡にて腎臓を観察しな がら、 腎被膜をマイク ロセッシにて把持し、 小切開を入れた。 培養液中 に保存されていた肝臓組織は、 約 2 mm角の小片に切除され、 セッシで スキッ ドマウスの腎皮膜を把持しつつ、 肝臓組織の小片を切開した腎被 膜下に挿入した。
このようにして、 肝臓組織の挿入が行われた後、 腸管を腹腔内に戻し
、 腹部の切開部分は、 縫合糸 （ 3— 0 s i l k ) を用いて縫合された。 この縫合は、 皮膚 ' 筋膜の 2層にてそれぞれ行われた。 その後 '、 上記ス キッ ドマウスは、 別のゲージに移され、 約 2時間程度で麻酔から覚醒し た。
〔実施例 2〕 (移植された肝臓組織の生着の有無の判定）
実施例 1 において作製された肝硬変モデル動物の生存率は 1 0 0 %で あった。 即ち、 麻酔から覚めた全てのマウスが生存した。 移植前に抗ァ シァロ GM 1抗体が投与されたマウスについては、 移植後 5 日 目と 1 0 日 目 とに上記抗ァシァロ GM 1抗体がさらに投与された。 08939
1 3
また、 移植後 2週間経過後に、 上記マウスの腎被膜においてヒ ト肝組 織の生着の有無が確認された。 この確認実験は、 実施の形態に説明する H E染色法に基づいて行われた。 その結果、 抗ァシァロ G M 1抗体を投 与しなかった場合は、 ヒ ト肝臓組織の生着率は 1 5 %であり、 抗ァシァ 口 G M 1抗体を投与した場合は、 ヒ ト肝臓組織の生着率は 3 5 %であつ た。
〔実施例 3〕 （抗ァシァロ G M 1抗体投与の有無による生着率の比較
)
続いて、 実施例 1 と同様の方法によって、 ヒ トの正常な肝臓組織をス キッ ドマウスに移植したモデル動物における、 抗ァシァロ G M 1抗体投 与の有無による生着率の差について調査した結果を以下に示す。
抗ァシァロ G M 1抗体を投与しなかった場合は、 上記モデル動物 1 9 匹中 5匹において、 ヒ ト肝組織の生着が確認された。 抗ァシァロ G M 1 抗体を投与した場合は、 上記モデル動物 1 2匹中 7匹において、 ヒ ト肝 組織の生着が確認された。 この結果より、 抗ァシァロ G M 1抗体を投与 することによって、 ヒ ト肝組織の生着率を高めることができることが確 認された。 これは、 抗ァ'シァロ G M 1抗体の投与によって、 モデル動物 内のナチュラルキラー細胞が関与する免疫応答能を欠損させ、 上記ナチ ュラルキラー細胞に依存する拒絶反応を抑制することができたためであ ると考えられる。
上記の結果によって、 肝硬変を発症したヒ ト肝組織の移植の場合にも 抗ァシァロ G M 1抗体の投与によって、 生着率を高めることができると 推測される。
尚、 発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実 施態様または実施例は、 あくまでも、 本発明の技術内容を明らかにする ものであって、 そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべき ものではなく、 本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、 いろ いろと変更して実施することができるものである。 産業上の利用の可能性
以上のように、 本発明によれば、 肝硬変を発症したヒ トの肝臓組織を 有する肝硬変モデル動物を高い確率で得ることができる。 この肝硬変モ デル動物は、 従来の肝硬変用の実験動物とは異なり、 実際にヒ トの肝硬 変組織が移植されたものである。 それゆえ、 肝硬変の診断のための医薬 品、 肝硬変の予防および/または治療のための医薬品のスク リ一ユング 試験などに好適に用いることができ、 肝硬変治療薬の開発が著しく容易 になると期待される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 動物の組織に肝硬変を発症したヒ トの肝臓組織が移植されているこ とを特徴とする肝硬変モデル動物。
2 . 前記肝臓組織は、 動物の腎臓に移植されていることを特徴とする請 求の範囲 1に記載の肝硬変モデル動物。
3 . 前記動物は、 免疫欠損動物であることを特徴とする請求の範囲 1ま たは 2に記載の肝硬変モデル動物。
4 . 前記免疫欠損動物は、 T細胞おょぴ または B細胞に依存する免疫 応答能を欠損していることを特徴とする請求の範囲 3に記載の肝硬変モ デル動物。
5 . 前記免疫欠損動物は、 ヌード動物あるいはスキッ ド動物であること を特徴とする請求の範囲 4に記載の肝硬変モデル動物。
6 . 前記免疫欠損動物は、 ナチュラルキラー細胞に依存する免疫応答能 を欠損していることを特徴とする請求の範囲 3ないし 5の何れか 1項に 記載の肝硬変モデル動物。
7 . 抗ァシァ口 G M 1抗体を投与することによりナチュラルキラー細胞 に依存する免疫応答能を欠損させることを特徴とする請求の範囲 6に記 載の肝硬変モデル動物。
8 . 前記動物は、 マウスであることを特徴とする請求の範囲 1ないし 7 の何れか 1項に記載の肝硬変モデル動物。
9 . 上記肝硬変を発症したヒ トの肝臓組織は、 肝硬変の重症度分類であ るチヤィルド分類において、 チャイルド Aに分類されるものであること を特徴とする請求の範囲 1ないし 8の何れか 1項に記載の肝硬変モデル 動物。
1 0 . 動物の免疫応答能を欠損させた免疫欠損動物の組織に、 肝硬変を 発症した肝臓組織を移植して前記肝臓組織を生着させることを特徴とす る肝硬変モデル動物の作製方法。
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