WO2003104387A1 - 組織培養用装置 - Google Patents

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西川　茂道
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和研薬株式会社
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    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/02—Filters

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for tissue culture in which microbial contamination is further controlled, and more particularly to an improvement in humidification means and air circulation means. More specifically, the present invention relates to a tissue culture device ((CO 2 incubator)) that incorporates means for maintaining the humidity in a tissue culture device at supersaturation and means for controlling bacterial permeation of inflow air.
  • a tissue culture device ((CO 2 incubator)) that incorporates means for maintaining the humidity in a tissue culture device at supersaturation and means for controlling bacterial permeation of inflow air.
  • Tissue culture of human cells, mammalian cells, and the like has been actively performed using a tissue culture device (CO 2 incubator).
  • Tissue culture is a method of separating human animal tissues, organs, and lymph cells, and growing the cells in a culture vessel such as a flask or a petri dish. Normally, culture flasks and dishes contain human-derived cells, medium medium (medium), bovine serum, etc. to grow the cells.
  • the conditions for cultivation, temperature 37 ° C, C0 2 concentration of 5% humidity supersaturation is common.
  • a tissue culture device (CO 2 incubator) is a device that has been developed to maintain the culture conditions.
  • temperature is a growth condition that requires mammalian cells to be physiologically necessary.
  • the lid of the culture flasks so that without closing in order to supply the C0 2 gas in the culture apparatus in culture flask is out of air, it is necessary to loosen. At this time, evaporation of the medium from the culture flask changes the salt concentration of the medium, which has a significant effect on the cell culture environment. To prevent this drying, it is necessary to humidify the inside of the tissue culture device (CO 2 incubator).
  • tissue culture apparatus C0 2 incubator
  • water in the pat is usually contaminated with mold bacteria because the tissue culture temperature condition is 37 ° C.
  • Tissue culture flasks contain a large amount of nutrients necessary for cell growth, and there is a risk that these bacteria will enter the culture flask, causing serious contamination and killing animal cells.
  • tissue culture apparatus C0 2 incubator
  • a state of the culture flasks bacteria is required evaporation bat sterility that breed is living.
  • tissue culture apparatus to (C0 2 incubator), the air circulation is also required, it is a great burden in cost-supplying This special device. Therefore, means for controlling bacterial permeation in the inflow of air PC gurus 94
  • An object of the present invention is to provide a simple means for easily preventing microbial contamination due to humidification when humidifying an atmosphere in a culture device during tissue culture, and / or a method for preventing bacteria from entering air into the culture device. It is intended to provide a simple means of transmission control. (Means to solve)
  • the present invention is a.
  • a tissue culture device comprising at least one of the following:
  • a means for supplying humidity to the tissue culture device which is capable of spontaneous evaporation of water at a temperature of about 37 ° C in order to maintain the humidity inside the tissue culture device in a supersaturated state.
  • a humidifying device for tissue culture that can replenish water in the humidity supply means by separating the atmosphere in the humidity supply means from the water in the humidity supply means with a membrane that controls bacteria permeation.
  • tissue culture device according to the above item 1, wherein the membrane for controlling bacterial permeation has a diameter of 0.45 ⁇ m or less.
  • tissue culture device according to any one of the above items 1 to 3, wherein the tissue culture humidifier and the tissue culture device are separable.
  • the humidifying device for tissue culture and the tissue culture device are integrated into PC orchid back 994
  • Fig. 1 shows the outline of the humidifier.
  • Figure 2 shows a CO 2 incubator equipped with a sterilizing enzyme filter (labeled as filter in the figure) on which the lytic enzyme is immobilized.
  • Figure 3 shows a humidity recovery experiment using a humidifying container.
  • One means of the present invention is a method for humidifying the humidity in a tissue culture device (CO 2 incubator) without using an evaporating bat.
  • a tissue culture device CO 2 incubator
  • By providing a membrane it is possible to prevent contamination when humidifying the inside of the container, and at the same time it is possible to prevent bacterial and fungal infections in the culture flask.
  • tissue culture device that carries a humidity supply unit.
  • Tissue culture covers a wide range of human cells, mammalian cells, and the like, and is not particularly limited.
  • the tissue culture device a so-called C0 2 incubator - means, a device for culturing tissue 'cell under an atmosphere of CO 2.
  • tissue and cells are cultured on a medium using a culture flask.
  • the humidity in the culture device is maintained in a supersaturated state.
  • the temperature inside the culture vessel is generally maintained at about 37 ° C. chorusC
  • the atmosphere for tissue culture (the atmosphere in the culture flask and the culture apparatus) and the water in the humidity supply means of the present invention are separated by a membrane capable of controlling bacterial permeation.
  • water can be replenished in the humidity supply means, and can be gradually added according to evaporation.
  • the membrane having bacterial permeation control has a diameter that does not allow the passage of microorganisms such as bacteria and vices even if they are contaminated in water, humidity supply means, or a humidifier.
  • the passage of the evaporated water means a membrane that enables the passage.
  • the diameter of the membrane is 0.45, preferably 0.2 micron or less, which is the diameter of a general sterilization membrane. This caliber can be changed at any time depending on the efficiency of water supply and the efficiency of sterilization.
  • the means of the present invention is preferable because the humidifying device for tissue culture and the tissue culture device are easily separable, easy to handle, and inexpensive to manufacture. Separable means that the humidifying device according to the present invention is set in the tissue culture device in place of the hydration vat as before. Thus, a tissue culture method in which the humidifying device for tissue culture of the present invention is set in the tissue culture device becomes possible.
  • the humidifying device for tissue culture and the tissue culture device may be integrated.
  • a humidifier may be provided in advance in the tissue culture device, and an embodiment in which additional water can be supplied from outside the tissue culture device is extremely preferable.
  • a tissue culture method using an apparatus in which a tissue culture humidifier and a tissue culture apparatus are integrated can be realized.
  • a bacterium permeation-controlling membrane on which a lytic enzyme is immobilized is provided at an air suction port and an exhaust port of the apparatus.
  • Bacterial permeability control membranes have a diameter that allows microbes such as bacteria and mold to pass through them, but does not allow air to pass through. means.
  • the diameter of the membrane is preferably 0.45, preferably 0.2 microns or less, which is the diameter of a general sterilization membrane.
  • the lytic enzyme is designed, selected, and immobilized on microorganisms that normally exist in the air.
  • the immobilization means is performed by a general silane coupling agent that links inorganic and organic substances, but is not limited to this. Sterilization with commercially available bacteriolytic enzyme immobilized ⁇ Kondo Chemical Industry Co., Ltd. is available. If such a membrane is used, after the microorganisms are captured by the filter, the captured microorganisms are lysed by the action of an enzyme, so that contamination in the apparatus can be more reliably and simply prevented.
  • FIG. 1 shows an example of the humidification container of the present invention.
  • sterile water for humidification into a humidification container that has been sterilized by gamma ray or autoclaving in advance.
  • the sterilized water in the humidifying container is kept aseptic without contamination from the outside by a membrane filter attached to the humidifying container.
  • sterile water humidified container passes through the membrane filter become vapor diffuses into the C0 2 incubator, humidifying the culture device.
  • Figure 3 shows a humidity recovery experiment using this device. In about 10 minutes, it was confirmed that the humidity, which dropped to about 30%, returned to a constant value and was sufficiently practical.
  • PC leakage 994 shows an example of the humidification container of the present invention.
  • the present invention can provide a means capable of humidifying treatment and air circulation in a state of controlling microbial contamination extremely efficiently, and is extremely useful in practical use of tissue culture.

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Abstract

組織培養に際し、培養装置内の雰囲気を加湿するに際し、細菌透過制御を容易に確保するための簡便な手段とエアーの循環に際し細菌透過制御を容易に確保するための簡便な手段を提供することを課題とし、その解決手段は、組織培養装置であって、以下の少なくとも１の要素を備えた装置；１）組織培養装置への湿度供給手段であって、組織培養装置内の湿度を過飽和状態に保つために約３７℃の温度条件下で水の自然蒸発が可能であり、組織培養のための雰囲気と本湿度供給手段内の水とが細菌透過制御性の膜で隔てられ、本湿度供給手段内に水の補充が可能である組織培養用加湿装置の設置。２）クロスコンタミネーションの防止対策として、装置のエアー吸引口と排気口に、溶菌酵素を固定化した細菌透過制御性の膜の設置。

Description

明 細 書 組織培養用装置 本出願は、 参照によりここに援用されるところの、 日本特許出願番号 2002 - 165225号からの優先権を請求する。 技術分野
本発明は、 より一層の微生物汚染が制御された組織培養のための装置 に関し、 より詳細には、 加湿手段及び空気流通手段の改良に関する。 さ らに詳しくは、 組織培養装置内の湿度を過飽和に保っための手段と流入 空気の細菌透過制御を可能にする手段を導入した組織培養用装置（（CO2 インキュベーター） に関する。 背景技術
組織培養装置 (CO2インキュベータ一) を使用して、 ヒ ト細胞を始め 哺乳動物細胞等の組織培養がさかんに行われている。 組織培養とは、 ヒ トゃ動物の組織、 臓器、 リ ンパ細胞'を分離して、 フラスコやシャーレ等 の培養容器にて、 細胞を増殖させる方法である。 通常培養フラスコ、 シ ヤーレにはヒ ト由来細胞のほか、 メディウム液 （培地） と牛由来血清な どを入れて細胞の増殖を行う。 培養の条件としては、 温度 37°C、 C02 濃度 5%、 湿度過飽和が一般的である。
組織培養装置 （CO2インキュベーター） は、 培養条件環境を維持する ため開発された装置であり、 例えば温度は、 哺乳動物細胞が生理的に必 要な増殖条件である。
C02濃度は、 細胞が増殖に必要な培養液の pHを安定に維持すること PC劃裏 994
2 を目的にしている。 培養液中の水素イオン濃度を調整するため、 炭酸水 素ナ ト リ ウ ム （ NaHCO3 ) を添加する こ と で、 2NaHC03 ^ Na2C03+H2O+CO2となる。 C02が放出されると、 Na2CO3濃度が増し培 養液中の pHは 7.4以上となり、 細胞の培養にとって障害となる。 これ を防止するために組織培養装置 （C02インキュベーター） に CO2ガスを 供給することで Na2C03は NaHCOsに戻り、培養液中の pHは 7.1から 7.4にて平衡化することが可能となる。
培養フラスコの蓋は、培養装置内の C02ガスを培養フラスコに供給す るために閉めずに空気の出入りがあるよう、 緩めておく必要がある。 こ の時培養フラスコよりメディウムの水分が蒸発することで、 培地の塩濃 度が変わり細胞培養環境に著しい影響をおよぼす。 この乾燥を防ぐ目的 で、 組織培養装置 （CO2インキュベーター） の内部を加湿する必要があ る。
通常の加湿方法は、 組織培養装置 （C02インキュベーター） 内のバッ トに水を入れ自然蒸発にて培養装置内を過飽和状態にするのが一般的で ある。 しかし組織培養温度条件が 37°Cであるため、 パットに入っている 水は通常カビゃ細菌に汚染されている。 組織培養フラスコ中には、 細胞 の増殖に必要な栄養成分を多く含んでおり、 これら雑菌が培養フラスコ に混入することで重大な汚染を発生させ、 動物細胞を死滅させる危険が ある。
組織培養装置 （C02インキュベーター） の中は、 雑菌が繁殖している 蒸発バットと無菌性を要求されている培養フラスコとが同居している状 態である。
また、 組織培養装置 (C02インキュベーター) へは、 エアーの循環も 必要であり、 これを格別の装置によって供給することは費用面で大きな 負担となる。 そのため、 空気の流入において細菌透過制御を施した手段 PC蒙膽 94
3 を用いれば安価に目的を達成できる。 発明の開示
(解決しようとする課題）
本発明の課題は、 組織培養に際し、 培養装置内の雰囲気を加湿するに 際し、 加湿にともなう微生物汚染を容易に防止するための簡便な手段及 び/又は培養装置への空気の流入に細菌透過制御を施した簡便な手段を 提供しょうとするものである。 (解決する手段）
本発明は、
1 . 組織培養装置であって、 以下の少なく とも 1の要素を備えた装置；
1 ) 組織培養装置への湿度供給手段であって、 組織培養装置内の湿度を 過飽和状態に保っために約 3 7 °Cの温度条件下で水の自然蒸発が可能で あり、 組織培養のための雰囲気と本湿度供給手段内の水とが細菌透過制 御性の膜で隔てられ、 本湿度供給手段内に水の補充が可能である組織培 養用加湿装置の設置。
2 ) クロスコンタミネーシヨンの防止対策として、 装置のエアー吸引口 と排気口に、 溶菌酵素を固定化した細菌透過制御性の膜の設置。
2 . 細菌透過制御性の膜が、 口径 0.45 ミクロン以下である前項 1に記載 の組織培養用装置。
3 . 溶菌酵素が、 空気中に通常存在する微生物を対象として溶菌スぺク トルが設計される前項 1〜 2の何れか一に記載の装置。
4 . 組織培養用加湿装置と組織培養装置が、 分離可能である前項 1〜 3 の何れか一に記載の組織培養用装置。
5 . 組織培養用加湿装置と組織培養装置が、 一体化されている前項 1 ~ PC蘭裏 994
4
3の何れか一に記載の組織培養用装置。
6 . 前項 4の組織培養用加湿装置を、 組織培養装置内にセットする組織 培養方法。
7 . 前項 5の組織培養用加湿装置と組織培養装置が一体化した装置によ る組織培養方法。
からなる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 加湿装置概略を示す。
第 2図は、 溶菌酵素を固定化した殺菌 '酵素フィルター （図中へパフ ィルターと表示） を装着した、 CO2インキュベーターを示す。
第 3図は、 加湿容器による湿度復帰実験を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の一の手段は、 組織培養装置 （CO2インキュベーター） 内の湿 度を蒸発バッ トを使用せず加湿する方法として、 蒸発用の水の入った容 器の蓋に細菌透過制御性の膜 （メンプラン） を張ることで容器内への加 湿に際しての汚染防止が達成され、 同時に培養フラスコへの細菌、 カビ の感染を予防することを可能としたものである。
本発明の一は、 組織培養装置であって、 湿度供給手段を担持するもの である。 組織培養は、 広くヒ ト細胞、 哺乳動物細胞等が対象となり格別 限定されるものではない。 組織培養装置とは、 所謂 C02インキュベータ —を意味し、 CO2の雰囲気下で組織'細胞を培養するための装置である。 一般的に、組織 ·細胞の培養は、培養フラスコを使い培地上で行われる。 この培地の乾燥をふせぐために、 培養装置内の湿度は過飽和状態に保た れる。 培養容器内の温度は、 一般的に約 3 7 °Cの恒温状態が保持される „ハ
PCT/JP03/0699
5 ため、 この温度条件下で水が自然蒸発し、 組織培養装置内を過飽和状態 することが必要である。 そして、 組織培養のための雰囲気 （培養フラス コ及び培養装置内の雰囲気） と本発明の湿度供給手段内の水は、 細菌透 過制御性の膜で隔てられいる。 さらに、 本湿度供給手段内には、 水の補 充が可能であり、 蒸発に応じて漸次追加されることが可能である。
本発明において、細菌透過制御性の膜とは、細菌、力ビ等の微生物が、 例え水に、 湿度供給手段に、 又は加湿装置内に夾雑していても、 これら を通過させない口径であるが、 蒸発水分の通過は可能とする膜を意味す る。その膜の口径は一般的な除菌膜の口径である 0.45好ましくは 0.2 ミ クロン以下が好適である。 この口径は、 水分供給効果と除菌の完全性の 効率を判断して随時変更可能である。
本発明の手段は、 組織培養用加湿装置と組織培養装置が、 分離可能で あることが簡便で、 取り扱いも容易であり、 製造も安価に可能であり、 好ましい。 分離可能とは、 従前と同様に、 水分補給用バットの代わりに 本発明からなる加湿装置を組織培養装置内にセットすることを意味する。 このようにして、 本発明の組織培養用加湿装置を、 組織培養装置内にセ ットする組織培養方法が可能となる。
また、 本発明の別の手段は、 組織培養用加湿装置と組織培養装置が一 体化されていてもよい。 組織培養装置に予め加湿装置を備え付けておけ ばよく、 追加の水の補給も組織培養装置外部から可能にする態様は極め て好ましい。 かくして、 組織培養用加湿装置と組織培養装置が一体化し た装置による組織培養方法が可能となる。
本発明のその他の手段は、 クロスコンタミネーションの防止対策とし て、 装置のエアー吸引口と排気口に、 溶菌酵素を固定化した細菌透過制 御性の膜が設置される。 細菌透過制御性の膜とは、 細菌、 カビ等の微生 物が、 これらを通過しない口径であるが、 空気の通過は可能とする膜を 意味する。その膜の口径は一般的な除菌膜の口径である 0.45好ましくは 0.2 ミクロン以下が好適である。 本膜には、 溶菌酵素が、 空気中に通常 存在する微生物を対象として溶菌スぺク トルが設計され選択され、 固定 化される。 固定化手段は、 無機質と有機質を結びつける一般的なシラン カップリング剤でおこなわれるが、 これに限定されない。 市販の溶菌酵 素を固定化した殺菌 ·酵素フィルターとしては近藤化学工業株式会社の ものがある。 このような膜を使えば、 微生物がフィルターに捕捉された 後、 捕捉された微生物を酵素の作用で溶菌をしてしまうので装置内の汚 染がより確実に簡便に防止が可能となる。
(実施例）
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 下記の実施 例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、 本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
(実施例 1 ) 加湿容器
図 1は、 本発明の加湿容器の一例を示す。 加湿容器の上部に市販のメ ンブランフィルターを張る付け、 追加用の水取込み口を備えた加湿容器 である。 使用にあたっては、 事前にガンマ線やオートクレープ処理にて 無菌処置を行った加湿容器に加湿用の滅菌水を入れる。 加湿容器内の滅 菌水は、 加湿容器に張られたメンブランフィルタ一により外部よりの雑 菌の混入がなく無菌を維持した状態である。又、加湿容器内の無菌水は、 蒸気となってメンブランフィルターを通過して C02インキュベーター 内に拡散し、 培養装置内を加湿する。 図 3は、 本装置を使っての湿度復 帰実験を示す。 約 1 0分で、 30%程度までさがった湿度が一定値に復帰 し、 十分実用に供せることを確認した。 PC漏襄 994
7
(実施例 2 )落下菌のコロニー数による CO2インキュベーターの性能 試験
口径 0.2 ミクロンのメンブランフィルター（モデル NH5420 HEPA) を使い、 加湿装置を準備し、 無菌化処理後、 滅菌水を充填し、 C02イン キュベータ一内にセッ トした。 コント口ールとして別の C02ィンキュベ 一ターには、 メンブランフィルタ一無しの加湿装置をセットした。 イン キュベータ内に棚を上段、 中段、 下段設置し、 トリブトソーャ寒天培地
(二ッスィプレート、 9 c mシャーレ） をそれぞれ前後 2枚計 4枚づっ 配置した。 シャーレの蓋を 1時間解放後、 蓋を閉じ、 培養後のコローニ 一数を測定した。 培養開始後、 各 2、 3、 5、 7、 10週目すると、 本発明 のメンブランフィルーターを使用した群は 10週目でも無菌であつたが、 コントロール群は 2週目でも雑菌が認められ、 3 週目目にはさらに菌の 増殖が確認された。表 1は、その結果をコロユー数で示したものである。
(表 1 )
上段 中段 下段 シャーレ No. 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
HEPAフィルター設
期間
置の有無
¾aa、i間 有 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 後
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 間 有 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 後
0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0
¾S5 間 有 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 後
1 0 1 1 1 2 0 1 1 1 1 0
¾S7適間 有 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 後
無 3 3 2 3 2 1 3 2 1 3 1 1
»l。遏間 有 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 後
2 3 2 0 1 2 0 1 0 2 1 1
(実施例 3 )
図 2は、 加湿容器と溶菌酵素を固定化した殺菌 ·酵素フィルター (N1- 1EU- 110S) を装着した、 C02インキュベーターを示し、 図中へ パフィルターと表示した。 このフィルターを装着した装置を使い、 実施 例 2の実験を同様におこなったところ、 雑菌の増殖は有意に抑制されて いた。 産業上の利用の可能性
本発明は、 極めて効率的に微生物汚染制御状態で加湿処理 ·空気循環 可能な手段を提供でき、 組織培養の実用上に極めて有用である。

Claims

求 の 範 囲
1 . 組織培養装置であって、以下の少なく とも 1の要素を備えた装置；
1 ) 組織培養装置への湿度供給手段であって、 組織培養装置内の湿度を 過飽和状態に保っために約 3 7 °Gの温度条件下で水の自然蒸発が可能で あり、 組織培養のための雰囲気と本湿度供給手段内の水とが細菌透過制 言
御性の膜で隔てられ、 本湿度供給手段内に水の補充が可能である組織培 養用加湿装置の設置。
2 ) クロスコンタミネーシヨ ンの防止対策として、 装置のエアー吸引口 と排気口に、 溶菌酵素を固定化した細菌透過制御性の膜の設置。
2 . 細菌透過制御性の膜が、 口径 0.45 ミクロン以下である請求の範囲 第 1項記載の組織培養用装置。
3 . 溶菌酵素が、 空気中に通常存在する微生物を対象として溶菌スぺ ク トルが設計される請求の範囲第 1項〜第 2項の何れか一に記載の装置。
4 . 組織培養用加湿装置と組織培養装置が、 分離可能である請求の範 囲第 1項〜第 3項の何れか一に記載の組織培養用装置。
5 . 組織培養用加湿装置と組織培養装置が、一体化されている請求の 範囲第 1項〜第 3項の何れか一に記載の組織培養用装置。
6 . 請求の範囲第 4項の組織培養用加湿装置を、 組織培養装置内にセ ットする組織培養方法。
7 . 請求の範囲第 5項の組織培養用加湿装置と組織培養装置が一体化 した装置による組織培養方法。
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