WO2003100062A1

WO2003100062A1 - Gene ehd1 favorisant la floraison des vegetaux et son application

Info

Publication number: WO2003100062A1
Application number: PCT/JP2003/006273
Authority: WO
Inventors: Masahiro Yano; Takuichi Fuse; Utako Yamanouchi; Atsushi Yoshimura; Kazuyuki Doi
Original assignee: National Institute Of Agrobiological Sciences
Priority date: 2002-05-28
Filing date: 2003-05-20
Publication date: 2003-12-04
Also published as: JP2003339382A; AU2003242341A1; US7361805B2; US20050257292A1; EP1514935A4; CA2487290A1; JP3911202B2; CA2487290C; EP1514935A1; AU2003242341B2

Description

明細書植物の開花時期を促進する Ehdl遺伝子およびその利用技術分野

本発明は、植物の開花時期を促進する Ehdl遺伝子およびその利用に関する。背景技術

イネの出穂期（開花時期）は主に日長に依存する感光性とそれ以外の要因（基本栄養成長性あるいは感温性）によって決定されている。この出穂期に関する遺伝解析は古くから行われ、これまで Sel座（第 6染色体）、 E1座（第 7染色体）、 E2 座（不明）、 E3座（第 3染色体）、あるいは Efl座（第 10染色体）等の出穂期関連遺伝子が突然変異や品種に内在する変異を利用して見い出されている（Kinoshita,

Rice Genetics Newsletter 15 : 13 - 74， 1998； Nishida et al. , Ann. Bot. 88 : 52 7-536, 2001) 。近年、 DNAマーカーがイネの遺伝解析に利用されるようになって、出穂期のような複雑な遺伝に従う形質の遺伝解析（量的形質遺伝子座 (QTL) のマッビング）が進展した (Yano et al. , Plant Physiol. 127: 1425-1429， 2001) 。それらの背景のもと、イネの感光性に関与する遺伝子の単離が進められてきた（Y ano et al. , Plant Cell 12： 2473-2484, 2000； Takahashi et al. , PNAS 98: 792 2-7927, 2001 ; Kojima et al. , Plant Cell Physiol. 43 : 1096-1105， 2002； Yano,

Curr. Opin. Plant Biol. 4: 130-135, 2001) 。単離'同定されたイネの出穂期関連遺伝子を用いて、その遺伝的制御機構の解明にむけた試みも進められている

(Izawa et al. . Gene Dev. 16:2006—2020， 2002; Hayama et al. , Nature 422:7 19-722. 2003) 。一方、植物の開花に関与する遺伝子の単離 ·同定については、シロイヌナズナで多くの事例が報告されている（Simpson and Dean, Science 29 6：285-289； Mouradov et al. , Plant Cell (Suppl)： SI 11-130, 2002) 。さらにそれらの遺伝子を利用したシロイヌナズナ（植物）での開花時期制御方法が提案されている（特表 2002 - 511270 ;特許公表 2002 - 53206 9 ；特許公表 2002 - 537768 ;特許公表 2000 - 512845 ;特許公表平 11 - 512289 ;特許公表平 11 - 506001 ;特^表平 10 - 508481) 。一方、イネの遺伝子を利用して、シロイヌナズナ（植物）の開花時期を変更する方法も提案されている（特許公開 2002 - 335970) 。しかしながら、イネにおいては、依然として多くの出穂期関連遺伝子が単離 '同定されずに残されている。発明の開示

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の開花を調節する新規な遺伝子を提供することにある。また、本発明は、該遺伝子を利用して植物の開花時期を改変することを目的とする。

Ehdl遺伝子座は、ョ本型イネ品種「台中 65号」と西アフリカ地域の栽培種である 0. glaberrima Steud. (IRGC104038) との交雑後代を利用して検出された出穂期関連 QTLの一つであり、第 10染色体長腕に座乗することが明らかとなっていた。また「台中 65号」の遺伝的背景をもつ Ehdl領域（IRGC104038の対立遺伝子）の準同質遺伝子系銃を用いた解析から、 Ehdl遺伝子座は出穂促進に関与することが明らかとなつていた。また、これまでの遺伝学的な研究によって、 EM1遺伝子座は、単一の遺伝子座（旧名 Ef(t)) として RFLPマーカー C234と G37の間に位置づけられ、 C1369とは共分離することが判明していた。しかしながら、この連鎖解析の精度では、マップベースクローユングによる遺伝子の単離'同定は困難であった。本発明者らは、マップベースク口一ユングに不可欠な大規模分離集団による Ehd 1領域の詳細な連鎖解析を行った。連鎖解析用の集団は台中 65号と IRGC104038の戻し交雑後代世代を用いた。戻し交雑後代から Ehdl領域がヘテロ型となり、他のゲノム領域の大部分が台中 65号型に置換された個体を選抜した。選抜個体の自殖後代 2500個体（F2集団相当）から、 Ehdlを挟み込む CAPSマーカー C12S6および G37を利用して、 Ehdl近傍に生じた組み換え染色体をもつ個体を選抜した。 Ehdl遺伝子座の遺伝子型の決定は、 F3世代の後代検定によって行った。連鎖解析の結果、 Ehd 1は RFLPマーカ一 C814Aと C234の間に位置づけられ、それぞれのマーカ一と 8個体およぴ 2個体の組み換え個体が同定できた。

Ehdl遺伝子を挟み込む RFLPマーカーの塩基配列が公開されたゲノム塩基配列情報に含まれていることが判明し、 Ehdl侯補ゲノム領域の塩基配列を公開された塩基配列データから入手した。候補ゲノム領域の塩基配列情報を利用し、新たな CAP Sマーカーを作出して候補遺伝子領域の絞り込みを行った。その結果、 Ehdlの候補領域は CAPSマーカー 26-28と 12 - 14に挟み込まれる約 16kbであることが明らかとなつた。この候補領域の塩基配列に対して遺伝子予測ならびに類似性検索を行つたところ、 3種類の予測遺伝子の存在が明らかとなった。そのうちの一つはァラビドプシスの two— component response regulator (ARR) 逾伝子ど類似千生を示した。他の 2種類の予測遺伝子は、ィネの ESTと高い類似性を示したものの機能が判明した既知の遺伝子との類似性は見レヽ出されなかった。これらの予測遺伝子はレヽずれも E hdlの候補から除外することができなかったため、 3種類の予測遺伝子を Ehdlの候補として形質転換による機能の証明を行った。

形質転換には、機能のある Ehdl対立遺伝子を持っていると推定されるィンド型品種 Kasalath由来のゲノム DNAから作成された BACライブラリ一から Ehdl侯補遺伝子を含む BACクローン KBM128G10を選抜し、使用した。 BACクローン KBM128G10より A RR様候補遺伝子およびィネ ESTと高い類似性を示す予測遺伝子のひとつを含む 11. 5kb BamHI 断片および ARR様候補遺伝子以外の二つの予測遺伝子を含む 7. 6kb Kpnl 断片を切り出し、それぞれを Ti-プラスミドベクター ρΡΖΡ2Η - lacに組み込み、ァグ口パクテリゥムを介して台中 65号に導入した。再分化植物体は速やかに短 S条件のグロースチャンパ一に移して育成し、出穂までの所要日数を調査した。形質転換当代では、 11. 5kb Bajdil断片を導入した個体のほとんどがベクターのみよりも早く出穂した。一方、 7. 6kb Kpnl断片を導入した個体の到穂日数は、ベクタ一のみの個体と同程度であった。また 11. 5kb BamHI断片を導入したほとんどの個体において Kasalath由来の ARR様侯補遺伝子の転写が認められた。これらの結果から、 Ehdlの候補は 11. 5kb BamHI断片に含まれる ARR様候補遺伝子に絞り込むことができた。

さらに、導入遺伝子め出穂促進を確認するために、出穂が早くなつた形質転換当代のなかからコピー数の少ない個体を選抜し、その自殖後代を短日条件で栽培して、到穂日数を調査した。 3種類の後代集団において、それぞれ早生個体と晩生個体とが分離した。早生個体はすべて導入した Kasalath由来の R様侯補遺伝子を保持し、それらの到穂日数は台中 65号の遺伝的背景に 0. glaberrimaの Ehdl遺伝子を置換した準同質遺伝子系統 T65 (Ehdl)とほぼ同じであった。一方、台中 65号の到穂日数は晩生個体と同様であった。以上の結果から、 AR様候補遺伝子が Ehdl遺伝子であることが証明された。

イネ品種 O. glaberrima (IRGC104038)、 Kasalath, 日本晴およぴ台中 65号について、 Ehdl領域約 7. 6kbのゲノム塩基配列を解析し、それぞれの予測翻訳産物のァミノ酸配列を比較したところ、 IRGC104038と台中 65号間では 7個、 Kasalathと台中 65号間では 2個、日本晴と台中 65号間では 1個のアミノ酸が置換していることが判明した。そのうち、 219番目のアミノ酸であるグリシンからアルギニンへの置換が唯一、台中 65号のみに起っている変異であった。このグリシンは既知の ARR遺伝子ファミリ一間で高度に保存されていた。これらのことから、このアミノ酸変異が台中 65号由来の Ehdlの機能低下に関与していることが推測された。

以上のことから、新たに単離.同定された Ehdl遺伝子は、植物の開花の促進に利用でき、また、 Ehdl遺伝子の機能の低下を導く DNAは、植物の開花の遅延に利用できるものと考えられる。

即ち、本発明は、植物の開花時期を促進する Ehdl遺伝子およびその利用に関し、より具体的には、〔1〕植物の開花を促進する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（a) から（d) のいずれかに記載の DNA、

(a) 配列番号： 3、 6または 9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコ一ドする DNA、

(b) 配列番号： 1、 2、 4、 5、 7または 8に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA、

(c) 配列番号： 3、 6または 9に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNA、

(d) 配列番号： 1、 2、 4、 5、 7または 8に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA、

〔2〕イネ由来である、〔1〕に記載の DNA、

〔3〕下記 (a) から（d) のいずれかに記載の DNA、

(a) 〔1〕または〔2〕に記載の DNAの転写産物と相補的なアンチセンス RNAを 3—ドする隐、

(b) 〔1〕または〔2〕に記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリポザィム活性を有する RNAをコードする DNA、

(c) 植物細胞における発現時に、 RNAi効果により、〔1〕または〔2〕に記載の DNAの発現を抑制する R Aをコードする DNA、

(d) 植物細胞における発現時に、共抑制効果により、〔1〕または〔2〕に記載の DNAの発現を抑制する RNAをコードする DNA、

〔4〕植物の開花を促進するために用いる、〔1〕または〔2〕に記載の DNA、〔5〕植物の開花を遅延するために用いる、〔3〕に記載の DNA、

〔6〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の DNAを含むベクター、

〔7〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の DNAまたは〔6〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞、〔8〕〔7〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、

〔9〕〔8〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、

〔1 0〕〔 8〕または〔 9〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、

〔1 1〕〔8〕に記載の形質転赚物体の製造方法であって、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の DNAまたは〔6〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、

〔1 2〕〔1〕または〔2〕に記載の DNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の開花を促進する方法、

〔1 3〕植物体の細胞内における、内因性の〔1〕または〔2〕に記載の DNAの発現を抑制することを特徴とする、植物の開花を遅延する方法、

〔1 4〕〔3〕に記載の DNAを植物に導入することを特徴とする、〔1 3〕に記載の方法、

〔1 5〕植物がイネである、〔1 2〕から〔1 4〕のいずれかに記載の方法、を提供するものである。

本発明は、植物の開花を促進する機能を有する植物由来の Ehdlタンパク質をコードする DNAを提供する。

本発明において、 Ehdlタンパク質をコードする DNAが由来する植物としては、例えばイネ、シロイヌナズナ、ダイズ、トウモロコシ、才ォムギ、コムギ、アサガォなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。

また、上記 DNAが導入されることで開花が促進される植物としては、特に制限はなく、例えば、有用農作物や鑑賞用植物等を挙げることができる。具体的には、有用農作物としては、例えばイネなどの単子葉植物や、ダイズ等の双子葉植物が挙げられる。また、観賞用植物としては、例えばキク、アサガオ、ポインセチア、コスモス等の花卉植物が挙げられる。

本発明において開花とは通常、花が咲くことを指すが、イネを含むイネ科植物等においては出穂を意味する。本発明において開花の促進とは、開花時期を早めることを指す。また、開花の遅延とは、開花時期を遅らせることを指す。

また、本発明の DNAが上記植物の開花を促進する日長条件としては、自然日長条件、長日条件、短日条件などが例示できるが、好ましくは短日条件である。本発明において、長日条件とは、 1日の S照時間が 14時間以上になる条件である。本実施例では明期を 15時間、 B音期を 9時間に設定したが、この条件に限定されるものではない。また、短日条件とは、 1ョの日照時間が 11時間以下になる条件である。本実施例では明期を 10時間、喑期を 14時間に設定したが、これに制限されない。

また、本発明において、 Ehdlタンパク質をコードする DNAとしては、例えば配列番号： 1、 2、 4、 5、 7または 8に記載の塩基配列のコ一ド領域を含む DNAや配列番号： 3、 6または 9に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質をコ一ドする D NAが挙げられる。

また、本発明は、配列番号： 3、 6または 9に記載のアミノ酸配列からなる Ehd 1タンパク質と構造的に類似して.おり、植物の開花を促進する機能を有するタンパク質をコードする DNAを包含する。

ある DNAが植物の開花を促進する機能を有するタンパク質をコードする力否かは、例えば、該 DNAが導入された植物の開花が促進するか否か、または、該 DNAの発現を抑制する DNAが導入された植物の開花が遅延するか否かを観察することで検証することができる。

このような DNAには、例えば、配列番号： 3、 6または 9に記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zまたは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、ァリル、パリアントおよびホモログが含まれる。

アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードする DNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、 site- directed mutagenesis法 (Kramer W & Fritz H-J: Methods Enzymol 154： 350, 1987) が挙げられる。また、自然界においても、塩基酉 3列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。このように、 Ehdlタンパク質のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または揷入されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNAであっても、天然型の Ehdlタンパク質

(配列番号： 3、 6または 9 ) と同等の機能を有するタンパク質をコードする限りは、本発明の Ehdlタンパク質をコードする DNAに含まれる。また、たとえ塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わないこと

(縮重変異）があるが、このような縮重変異体も本発明の Ehdlタンパク質をコードする DNAに含まれる。

配列番号： 3、 6または 9に記載のアミノ酸配列からなる Ehdlタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術 (Southern EM: J Mol Biol 9 8： 503, 1975) やポリメラーゼ連鎖反応（PCR) 技術 (Saiki RK, et al : Science

230： 1350, 1985、 Saiki RK, et al: Science 239： 487， 1988) を利用する方法が挙げられる。すなわち、 Ehdl領域のゲノム塩基配列（配列番号： 1、 4もしくは 7 ) 、 Ehdl cDNAの塩基配列（配列番号： 2、 5もしくは 8 ) 、または、その一部をプローブとして、また、 Ehdl領域のゲノム塩基配列、 Ehdl cDNAの塩基配列に特異的にハイプリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物から Ehdlタンパク質をコードする DNAと高い相同性を有する DNAを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダィゼーション技術や PCR技術によつて単離し得る Ehdlタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする DNAもまた、本発明の Ehdlタンパク質をコードする DNAに含まれる。

このような DNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハィブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイプリダイゼーション条件とは、 6M尿素、 0. 4% SDS、 0. 5 X SSCの条件またはこれと同 6273

- 9 - 等のストリンジェンシ一のハイプリダイゼーション条件を指す。よりストリンジエンシーの高い条件、例えば、 6M尿素、 0. 4% SDS、 0. 1 XSSCの条件下では、より相同性の高い DNAを単離できると期待される。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも 50%以上、好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の配列の同一性を指す。

ァミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチユールによるァ/レゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268， 1990、 Proc Natl A cad Sci USA 90： 5873, 1993) を用いて決定できる。 BLASTのアルゴリズムに基づいた BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF， et a 1： J Mol Biol 215： 403， 1990) 。 BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば score=100、 wordlength=12とする。また、 BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば score=50、 wordle ngth=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知でめる (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/) ₀

本発明の DNAには、ゲノム DNA、 cDNAおよび化学合成 DNAが含まれる。ゲノム DNA および cDNAの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノム DNAは、例えば、 Ehdlタンパク質をコードする DNAを有するイネ品種からゲノム DNAを抽出し、ゲノミックライプラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、 BAC、 PACなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明の Ehdlタンパク質をコードする DNA (例えば、配列番号： 1、 2、 4、 5、 7または 8 ) を基に調製したプローブを用いてコ口-—ハイプリダイゼーションあるいはプラークハイプリダイゼーシヨンを行うことで調製できる。また、本明の Ehdlタンパク質をコードする DNA (例えば、配列番号： 1、 2、 4、 5、 7または 8 ) に特異的なプライマーを作製し、これを利用した PCRを行って調製することも可能である。 cDNAは、例えば、 Ehdlタンパク質をコードする DNAを有するイネ品種から抽出した mRNAを基に cDNAを合成し、これを I ZAPなどのベクターに揷入して cDNAライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイプリダイゼーションあるいはプラークハイプリダイゼーションを行うことで、また PCRを行うことにより調製できる。

本発明の Ehdlタンパク質をコードする DNAは、例えば、植物の開花を促進するために用いることができる。開花が促進された形質転■物体を作製するには、上記 DNAを適当なベクターに揷入して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転物細胞を再生させる。本発明は、このような植物の開花を促進させる方法をする。

本発明は植物の開花を遅延させる方法もまた提供する。開花が遅延した形質転換植物体は、例えば Ehdlタンパク質をコードする DNAの発現を抑制する DNAを適当なベクターに挿入して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転■物細胞を再生させることによって作製できる。「Ehdlタンパク質をコードする DNAの発現の抑制」には、これら DNAの転写の抑制おょぴタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、 DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。また、翻訳されたタンパク質が植物細胞内で本来の機能を発揮しないことも含まれる。

植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるァンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンス R Aが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ecker JR & Davis RW: Proc Natl Acad Sci USA 83： 5372, 1986) 。その後、タパコゃペチュニアにおいてもァンチセンス RNAの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（van der Krol AR， et al : Nature 333： 866, 1988) 、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイプリッド形成による転写阻害、合成の進みつつある R Aとのハイブリッド形成による転写阻害、イン. トロンとェクソンとの接合点におけるハイプリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイプリッド形成によるスプライシング阻害、 mRNAとのハイプリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キヤッビング部位やポリ（A)付加部位とのハイプリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイプリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、 mRNAの翻訳領域ゃポリソーム結合部位とのハイプリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイプリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上：新生化学実験講座 2核酸 IV遺伝子の複製と発現（日本生化学会編，東京化学同人） pp. 319-347, 1993) 。

本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5，端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む DNAも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。使用されるアンチセンス DNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3，側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された DNAは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンス DNAの配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス DNA の長さは少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さらに好ましくは 500塩基以上である。通常用いられるアンチセンス DNAの長さは 5kbよりも短く、好ましくは 2. 5kbよりも短い。

内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リポザィムをコードする DNAを利用して行うことも可能である。リポザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことを指す。リポザィムには種々の活性を有するものが存在するが、中でも RNAを切断する酵素としてのリボザィムに焦点を当てた研究により、 RNAを部位特異的に切断するリポザィムの設計が可能となつた。リボザィムには、グループ Iィントロン型ゃ RNase P に含まれる Ml RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマ一へッド型ゃヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメィンを有するものもある（小泉誠おょぴ大塚栄子：蛋白質核酸酵素， 35： 2191, 1990) 。

例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15という配列の C15の 3'側を切断するが、その活性には U14と A9との塩基対形成が重要とされ、 C15の代わりに A15または U15でも切断され得ることが示されている（Koizumi M， et al : FEBS Lett 228： 228, 1988) 。基質結合部位が標的部位近傍の匪配列と相補的なリポザィムを設計すれば、標的 RNA中の UC、 UUまたは UAという配列を認識する制限酵素的な R A切断リポザィムを作出することができる（Koizumi M, et al: FEBS Lett 239： 285, 1988、小泉誠おょぴ大塚栄子：蛋白質核酸酵素 35: 21 91， 1990、 Koizumi M, et al : Nucl Acids Res 17： 7059， 1989) 。例えば、 Ehd 1タンパク質をコードする DNA (配列番号： 2、 5または 8 ) 中には、標的となり得る部位が複数存在する。

また、ヘアピン型リポザィムも本発明の目的に有用である。このリボザィムは、例えばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出される (Buzayan J : Nature 323： 349, 1986) 。ヘアピン型リポザィムからも、標的特異的な R A切断リボザィムを作出できることが示されている（Kikuchi Y & Sasaki N: Nucl Acids Res 19： 6751， 1991、菊池洋：化学と生物 30： 112, 1992) 。標的を切断できるように設計されたリポザィムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーターなどのプロモーターおよぴ転写終結配列に連結される。このとき、転写された RNAの 5'端や 3'端に余分な配列が付カ卩されていると、リポザィムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザィムを含む匪からリポザィム部分だけを正確に切り出すために、リポザィム部分の 5，側や 3'側にシスに働く別のトリミングリポザィムを配置させることも可能である（Taira K, et al : Protein Eng 3： 733, 1990、 D zianott AM & Bujarski JJ: Proc Natl Acad Sci USA 86: 4823, 1989、 Grosshan s CA & Cech TR: Nucl Acids Res 19： 3875, 1991、 Taira K， et al : Nucl Acids Res 19 : 5125, 1991) 。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Yuyama N， et al : Biochem Biophys Res Commun 186： 1271, 1992) 。このように、リポザィムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。

内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖 RNAを用いた RNA interferance (RNAi) によっても行うことができる。 RNAiとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖 RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。 RNAiの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖腿が小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。脆 iは植物においても効果を奏することが知られている（Chuang CF & Meyerowitz EM: Proc Natl Ac ad Sci USA 97： 4985, 2000) 。例えば、植物体における Ehdlタンパク質をコードする DNAの発現を RNAiにより抑制するためには、 Ehdlタンパク質をコードする DNA (配列番号： 2、 5または 8 ) またはこれと類似した配列を有する二本鎖 R Aを目的の植物へ導入し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が遅延した植物を選択すればよい。 RNAiに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、最も好ましくは 95%以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。

内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する DNAの形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部は RNAiの機構と重複していると考えられている。共抑制は植物においても観察される（Smyth DR: Curr Biol 7： R793, 1997、 Marti ens sen R: Curr Biol 6: 810, 1996) 。例えば、 Ehdlタンパク質をコードする DNAが共抑制された植物体を得るためには、 Ehdlタンパク質をコ一ドする DNAまたはこれと類似した配列を有する DNAを発現できるように作製したべクタ一 DNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が遅延した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、最も好ましくは 95%以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。

本発明は、本発明の DNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む形質転,物体の製造方法を提供する。

本発明において、植物細胞が由来する植物としては、特に制限はない。また、植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、力リフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここで言う「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。

植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法 (エレクト口ポレーシヨン法）、ァグロパクテリゥムを介する方法、パーテイクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。ァグロバクテリウム（例えば、 EHA101) を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法（特許第 3141084号）を用いることが可能である。また、パーティクルガン法においては、例えば、バイオラッド社のものを用いることが可能である。形質転^ S物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki S， et al : Plant Physiol 100： 1503, 1995) _c 例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法 (Datta SK: In Gene Transfer To Plants

(Potrykus I and Spangenberg, Eds) pp. 66-74, 1995) 、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki S, et al : Plant Physiol 100： 1503, 1992) 、パーテイクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P, e t al : Biotechnology 9： 957, 1991) 、およぴァグロパクテリゥムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y, et al : Plant J 6： 271, 1994) など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。ゲノム内に本発明の DNAが導入された形質転物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。図面の簡単な説明

図 1は、 Ehdl遺伝子の染色体上での位置を示す図である。

図 2は、 0. glaberrimaの Ehdl遺伝子の準同質遣伝子系統 [T65 (Ehdl) ]とその繰り返し親（台中 65号）の短日、長日おょぴ自然条件下での到穂日数を示す図である。短日および長日条件は九州大学の屋外の日長調節装置内で移植を行わずに栽培した。自然条件は九州大学（福岡巿）での早期栽培（5月 2曰は種、 6月 14日移植）の結果を示す。

図 3は、 Ehdl領域の高精度連鎖地図おょぴ物理地図を示す図である。 Aは 2500個体の分離集団と RFLPマーカーを用いて作成した連鎖地図である。地図上の記号は R FLPマーカー、地図下の数値は各マーカー間で検出された組み換え数を示す。 Bは塩基配列情報に基づき作成した CAPSマーカーによる詳細な連鎖地図である。 Cは候補ゲノム領域内の予測遺伝子と形質転換に用いたゲノム DNA断片を示す。

図 4は、 Kasalathの 11. 5kb BamHI断片おょぴ 7. 6kb Kpnl断片を台中 65号に導入した形質転換当代 (TO)の短日条件（10時間日長）での到穂日数の頻度分布を示す図である。

図 5は、形質転換当代個体の Kasalath ARR様遺伝子の発現の有無を示す写真である。各個体から全 RNAを抽出し、逆転写後 PCR增幅した産物を Ddelで消化した。 K asalath, 台中 65号由来の mRNAに対応する産物のサイズを Kおよび Tで示した。

図 6は、 Ehdl遺伝子の構造と塩基配列多型を示す図である。

図 7は、 Ehdlタンパクのアミノ酸配列の比較を示す図である。台中 65号のみに見出された変異アミノ酸の位置を矢印で示した。台中 65号、日本晴、 Kasalat I RGC104038のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号： 1 2、 9、 6、 3に記載している。

図 8は、 Ehdl mRNAの蓄積量の日変ィ匕を示す写真おょぴ図である。播種後 4週間の台中 65号 (T)および 0. glaberrima Steud. (IRGC104038) の Ehdl遺伝子の準同質遺伝子系統 T65 (Ehdl) (N)の葉より全腿を抽出し、 RT- PCR解析を行つた。 PCR反応は 30サイクル行った。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[実施例 1 ] 短日条件下における Ehdl遺伝子の出穂促進作用

Ehdl遺伝子座は、日本型イネ品種「台中 65号」と西アフリカ地域の栽培種である 0. glaberrima Steud. (IRGC104038) との交雑後代を利用して検出された出穂期関連 QTLの一つであり、第 10染色体長腕に座乗することが明らかとなつていた (Doi et al. , Breeding Science 49： 395—399, 1999) (図 1 ) 。 0. glaberrima (IRGC104038) の Ehdl遺伝子は出穂促進作用をもち、台中 65号の対立遺伝子に対して優性に作用することが明らかとなっていた。本実施例においては、台中 65号の遺伝的背景に 0. glaberrimaの Ehdl遺伝子を置換した準同質遺伝子系統 [T65 (Eh dl) ] と台中 65号を異なる日長条件下で栽培し、それらの到穂日数を調査した。 T6 5 (Ehdl)は台中 65号と比較して自然条件では 7日、長日条件下で 14日、短日条件下では 33日出穂が早くなつた（図 2 ) 。これらの結果から、 Ehdl遺伝子は出穂を促進する機能を有し、その出穂促進作用は短日条件下でより顕著になることが明らかとなつた。

[実施例 2 ] 高精度連鎖解析

これまでの遺伝学的な研究によって、 Ehdl遺伝子座は、単一の遺伝子座（旧名 Ef (t) ) として RFLPマーカー C234と G37の間に位置づけられ、 C1369とは共分離することが判明していた（土井 '田口 '吉村日本育種学会第 94回講演会講演要旨 p 104、 1998) 。しかしながら、この連鎖解析の精度では、マップベースクローユングによる遺伝子の単離 '同定は困難であった。本実施例においては、マップべ一スクロー二ングに不可欠な大規模分離集団による Ehdl領域の詳細な連鎖解析を行つた。連鎖解析用の集団は台中 65号と IRGC104038の戻し交雑後代世代を用いた。戻し交雑後代から Ehdl領域がヘテロ型となり、他のゲノム領域の大部分が台中 65 号型に置換された個体を選抜した。選抜個体の自殖後代 2500個体（F2集団相当）力、ら、 Ehdlを挟み込む CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)マーカー C1286 (プライマー 5， - CCAATGAAGGGTAAGTATCG -3，（配列番号： 1 3 ) および 5， - TGTGCTTAAGATACACGGTAGTTCA -3' (配列番号： 1 4 ) 、制限酵素 Nrul)および G37 ( プライマー 5' - CTGCAGCTTCCACCATGGCA -3' (配列番号： 1 5 ) および 5' - CAAGG GTGCATTCATTGCACCTCCTCTAGCCATGGCCTAATGATGCA -3' (配列番号： 1 6 ) 、制限酵素 EcoT22I)を利用して、 Ehdl近傍に生じた組み換え染色体をもつ個体を選抜した。 Ehdl遺伝子座の遺伝子型の決定は、 F3世代の後代検定によって行った。すなわち選抜個体（F2) の自殖後代 48個体を九州大学の実験圃場において栽培し、各系統内の到穂日数の分離状況から Ehdlの遺伝子型を判定した。連鎖解析の結果、 Ehdl は RFLPマーカ一C814Aと C234の間に位置づけられ、それぞれのマーカ一と 8個体おょぴ 2個体の組み換え個体が同定できた（図 3 ) 。

[実施例 3 ] 候補遺伝子領域の特定

Ehdl遺伝子を挟み込む RFLPマーカーの塩基配列が公開されたゲノム塩基配列情報に含まれていることが判明し、 Ehdl候補ゲノム領域の塩基配列を公開された塩基配列データから入手した（GenBank ァクセッション番号 AC027038) 。候補ゲノム領域の塩基配列情報を利用し、新たな CAPSマーカーを作出して候補遺伝子領域の絞り込みを行つた。 Ehdlは CAPSマーカ一 26- 28 (プラィマー 5' - ACGCTGCAACAAAG AGCAGA -3' (配列番号： 1 7 ) および 5' - TTGTTGACGAAAGCCCATTG - 3' (配列番号： 1 8 ) 、制限酵素 Mspl) および 12 - 14 (プライマー 5， - GGAGATCATGCTCACGGATG -3' (配列番号： 1 9 ) および 5' - CAAGCAAACACGGAGCGACT -3' (配列番号： 2 0 ) 、制限酵素 BamHI) とそれぞれ 2および 1個の組み換えが検出され、マーカー 1 3-15 (プライマー 5， - CCTTGCATCCGTCTTGATTG -3' (配列番号： 2 1 ) および 5' - G GGCAAATTCCCTCCAGAGT -3' (配列番号： 2 2 ) 、制限酵素 Mspl) 、 19 - 21 (プライマー ₅，— TTTGGATACGTACCCCTGCAT—3，（配列番号： 2 3 ) および 5，一 GCGCAATCGCAT ACACAATAA -3' (配列番号： 2 4 ) 、制限酵素 Mspl) および 23- 25 (プライマー 5' - GAGCCCGAGCCCATGTATAG -3，（配列番号： 2 5 ) および 5，- TGGCTAAGATGGAGGGACGA - 3' (配列番号： 2 6 ) 、制限酵素 Mbol) とは共分離した。したがって Ehdlの候補領域は CAPSマーカー 26-28と 12 - 14に挟み込まれる約 16kbであることが明らかとなつた。'この候補領域の塩基配列に対して GENSCAN (http： //genes, mit. edu/GENSC AN. html) による遺伝子予測ならびに類似性検索を行ったところ、 3種類の予測遺伝子の存在が明らかとなった。そのうちの一つはァラビドプシスの two - component response regulator (ARR) 遺伝子と類似性を示した。他の 2種類の予測遺伝子は、ィネの ESTと高い類似性を示したものの機能が判明した既知の遺伝子との類似性は見い出されなかった。これらの予測遺伝子はいずれも Ehdlの候補から除外することができなかったため、 3種類の予測遺伝子を Ehdlの候補として形質転換による機能の証明を行った。

[実施例 4 ] Ehdl候補遺伝子の機能証明

形質転換には、機能のある Ehdl対立遺伝子を持っていると推定されるィンド型品種 Kasalath由来のゲノム DNA断片を用いた。すなわち、 Kasalathのゲノム DNAから作成された BACライプラリー（Baba et al. , Bulletin of the NIAR 14： 41-49,

2000) に対して、 Ehdl近傍の塩基配列を増幅するプライマー対 10 - 12 (5， - ATTGG GCCAAACTGCAAGAT -3，（配列番号： 2 7 ) および 5， - ACGAGCCTAATGGGGGAGAT - 3，

(配列番号： 2 8 ) ) によるスクリーニングを行い、 Ehdl候補遺伝子を含む BACクローン KBM128G10を選抜した。 BACクローン KBM128G10より ARR様候補遺伝子おょぴイネ ESTと高い類似性を示す予測遺伝子のひとつを含む 11. 5kb BamHI断片おょぴ ARR様候補遺伝子以外の二つの予測遺伝子を含む⁷. ⁶ kb Kpnl断片（図 3 ) を切り出し、それぞれを Ti-プラスミドベクター pPZP2H - lac (Fuse et al. Plant Biotechn ology 18： 219-222, 2001) に組み込み、ァグロパクテリゥムを介して台中 65号に導入した。再分化植物体は速やかに短日条件（10時間明）のグロースチャンパ一に移して育成し、出穂までの所要ョ数を調査した。形質転換当代（TO) では、 11. 5kb BamHI断片を導入した個体（18個体）のほとんどがベクターのみ（6個体）よりも早く出穂した（図 4 ) 。一方、 7. 6kb Kpnl断片を導入した個体（⁶個体）の到穂日数は、ベクタ一のみの個体（5個体）と同程度であった（図 4 ) 。また 11. 5kb BamHI断片を導入した個体については、 Kasalath由来の ARR様候補遺伝子の発現を、遺伝子特異的マーカー（プライマー 5' - GAGATCAACGGCCACCGAAG -3' (配列番号： 2 9 ) および 5' - GTCGAGAGCGGTGGATGACA -3' (配列番号： 3 0 ) 、制限酵素 Dde I) を用いて RT- PCRによって確認したところ、ほとんどの個体において Kasalath由来の ARR様候補遺伝子の転写が認められた（図 5 ) 。これらの結果から、 Ehdlの候補は 11. 5kb BamHI断片に含まれる ARR様候補遺伝子に絞り込むことができた。さらに、導入遺伝子の出穂促進を確認するために、出穂が早くなつた形質転換当代のなかからコピー数の少ない個体を選抜し、その自殖後代を短日条件で栽培して、到穂日数を調査した。 3種類の後代集団において、それぞれ早生個体（41〜70 S ) と晩生個体（81日以上）とが分離した。早生個体はすべて導入した Kasalath由来の ARR様候補遺伝子を保持し、それらの到穂日数は準同質遺伝子系統 T65 (Ehdl)とほぼ同じであった。一方、台中 65号の到穂 Θ数は晚生個体と同様に 81日以上となつた（表 1 ) 。以上の結果から、 ARR様候補遺伝子が短日条件で出穂を早める機能を有し、 Ehdlであることが証明された。到穂日数（日）

後代集団 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 71-75 76-80 81以上計集団 I 4 21 32 集団 2 27

2 17 25 台中 65号

T65(漏）

*は導入遺伝子を保有しないことを意味する。

[実施例 5 ] Ehdl候補遺伝子の塩基配列解析

イネ品種 0. glaberrima (IRGC104038)、 Kasalath, 日本晴およぴ台中 65号について、 Ehdl領域約 7. 6kbのゲノム塩基配列を解析した（台中 65号には 200bp以上の TAリピートが存在し、その正確な数は同定できていない）。この領域には、 Kasal athと比較して日本晴 ·台中 65号では 60箇所以上、 IRGC104038では 140箇所以上の塩基置換おょぴ揷入'欠失が見い出された（図 6 ) 。また、 IRGC104038の cDNAの全長を決定し、ゲノム塩基配列と比較したところ、 Ehdl は 6個のエタソンからなり、転写領域の全長は 1316bp、 341アミノ酸からなるタンパク質をコードしていることが予測された（図 7 ) 。予測転写領域内の塩基配列の違いを Kasalathと比較すると、日本晴では 4つの 1塩基置換おょぴ 2塩基揷入、台中 65号では 5つの 1塩基置換および 2塩基挿入、 IRGC104038では 14個の 1塩基置換と 4塩基欠失おょぴ 3塩基欠失が見い出された。 IRGC104038、 Kasalath、日本晴およぴ台中 65号の予測翻訳産物のァミノ酸配列を比較したところ、 IRGC104038と台中 65号間では 7個、 Kasalath と台中 65号間では 2個、日本晴と台中 65号間では 1個のアミノ酸が置換していることが判明した（図 7 ) 。そのうち、 219番目のアミノ酸であるグリシン（G : IRGC1 04038、 Kasalath, 日本晴）からアルギニン（R：台中 65号）への置換が唯一、台中 65号のみに起っている変異であった（図 7 ) 。このグリシンは既知の ARR遺伝子ファミリ一間で高度に保存されていた。これらのことから、このアミノ酸変異が台中 65号由来の EM1の機能低下に関与していることが推測された。

0. glaberrima (IRGC104038)、 Kasalath, 日本晴およぴ台中 65号の Ehdl領域のゲノム塩基配列をそれぞれ配列番号： 1、 4、 7および 1 0に、 cDNAの塩基配列をそれぞれ配列番号： 2、 5、 8および 1 1に、これら DNAがコードするタンパク質のァミノ酸配列をそれぞれ配列番号： 3、 6、 9および 1 2に示す。

[実施例 6 ] Ehdl候補遺伝子の発現解析

台中 65号の Ehdl領域を IRGC104038由来の染色体断片に置換した T65 (Ehdl)について、 Ehdl遺伝子の 1日の発現の変化を調べた。実験温室（茨城県つくば市）において 12月下旬（日出 6時 50分、日没 16時 30分、短日条件）に播種レ、 4週間育成した両系統から 3時間おきに 24時間にわたって葉を採取した。これらの材料より全 RNA を抽出し、 Ehdl遺伝子について、プライマー（センス鎖 5，- TGGATCACCGAGAGCTGTG G -3，（配列番号： 3 1 ) 、アンチセンス鎖 5' - ATTTCCTTGCATCCGTCTTG -3，（配列番号： 3 2 ) ) を用いて RT- PCR解析を行なった。その結果、この遺伝子の転写産物が明け方頃（3時、 6時）に多く蓄積し、 3没後真夜中まで（18時、 21時）は検出困難なレベルまで減少する傾向があることが判明した（図 8 ) 。このような遺伝子発現レベルの概日変動は感光性に関与している遺伝子にしばしば観察される現象であり、この Ehdl遺伝子が光シグナルの伝達になんらかの形で関与していることが推測された。以上の結果から、マツプベースク口一ユング法により同定した候補遺伝子がイネの出穂促進遺伝子 Ehdlであると判断した。産業上の利用の可能性

従来、イネの品種改良における開花時期（出穂期）の改変は（1) 交雑による早生 ·晩生系統の選抜、 (2) 放射線やィヒ学物質による突然変異誘起などによって行われてきた。これらの作業は長期間を要することや変異の程度や方向性を制御できないことなどの問題があった。本発明により、単離した Ehdl遺伝子の利用による植物の開花時期の新しい改変法を確立することができた。したがって、 Ehdl遺伝子の機能が消失した植物品種、例えばィネの台中 65号にこの遺伝子をセンス鎖で形質転換することにより、イネの短日での出穂（開花）の促進を図ることができる。一方、 Ehdl遺伝子の機能が保持されている植物品種、例えばイネの日本晴あるいは Kasalath、にアンチセンス方向に Ehdl遺伝子を導入すること等により、内因性の Ehdl遺伝子の発現を抑制することで開花を遅延させることができる。この変化は、短日条件だけでなく、長日条件あるいは自然 Θ長条件においても生じると予測されることから、栽培条件における開花時期の調節に有効である。形質転換に要する期間は交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、他の形質の変化を伴わないで開花時期の改変が可能となる。単離した開花促進遺伝子 E hdlを利用することにより、イネなどの植物の開花時期を容易に変化させることができ、異なる地域に適応した植物品種育成に貢献できると考えられる。

Claims

請求の範囲

1. 植物の開花を促進する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記 (a) から（d) のいずれかに記載の DNA。

( a ) 配列番号： 3、 6または 9に記载のァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA。

(b) 配列番号： 1、 2、 4、 5、 7または 8に記載の塩基配列のコード領域を含む D

(c) 配列番号： 3、 6または 9に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、揷入、および/ /または付カ卩したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNA。

(d) 配列番号： 1、 2、 4、 5、 7または 8に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNA。

2. イネ由来である、請求項 1に記載の DNA。

3. 下記（a) から（d) のいずれかに記載の DNA。

(a) 請求項 1または 2に記載の DNAの転写産物と相補的なアンチセンス RNAをコードする DNA。

(b) 請求項 1または 2に記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNAをコードする DNA。

(c) 植物細胞における発現時に、 RNAi効果により、請求項 1または 2に記載の DNAの発現を抑制する RNAをコードする DNA。

(d) 植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項 1または 2に記載の DNA の発現を抑制する RNAをコードする DNA。

4. 植物の開花を促進するために用いる、請求項 1または 2に記載の DNA。

5. 植物の開花を遅延するために用いる、請求項 3に記載の DNA。

6 · 請求項 1力ら 5のいずれかに記載の DNAを含むベクター。請求項 1力ら 5のいずれかに記載の DNAまたは請求項 6に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。

請求項 7に記載の形質転雖物細胞を含む形質転嫌物体。

請求項 8に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。

請求項 8または 9に記載の形質転換植物体の繁殖材料。

請求項 8に記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項 1から 5のいずれかに記載の DNAまたは請求項 6に記載のベタターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。

請求項 1または 2に記載の DNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の開花を促進する方法。

植物体の細胞内における、内因性の請求項 1または 2に記載の DNAの発現を抑制することを特徴とする、植物の開花を遅延する方法。

請求項 3に記載の DNAを植物に導入することを特徴とする、請求項 1 3に記載の方法。

植物がイネである、請求項 1 2から 1 4のいずれかに記載の方法。