WO2003099003A1 - Animal a invalidation de l'adiponectine - Google Patents

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WO2003099003A1
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adiponectin
gene
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wild
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Takashi Kadowaki
Naoto Kubota
Yasuo Terauchi
Toshimasa Yamauchi
Tetsuo Noda
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Japan Science And Technology Agency
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    • A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases

Definitions

  • the present invention relates to a model animal of obesity and z or diabetes, and a non-human animal useful as a model animal of arteriosclerosis.
  • the number of diabetic and obese patients in Japan is estimated to be 7 million in diabetic patients alone, and the number is still increasing.
  • General type 2 diabetes and obesity which account for the majority of diabetes, are multifactorial diseases that are caused by a combination of multiple causative genes and environmental factors such as lifestyle. Diabetes ⁇
  • the greatest cause of the increase in obesity is thought to be the westernization of dietary habits, especially the increase in insulin resistance due to lifestyle habits such as a decrease in high fat diet and physical activity. Therefore, together with identification of the genes responsible for type 2 diabetes and obesity, elucidation of the molecular mechanisms by which European and American lifestyles cause insulin resistance, as well as syndrome X and arteriosclerosis, fundamental prevention and treatment of lifestyle-related diseases There is an urgent need to establish a law.
  • arteriosclerosis is also a type of lifestyle-related disease, and is important as a cause of cerebral hemorrhage, cerebral infarction, myocardial infarction, and renal sclerosis.
  • the main symptom of arteriosclerosis is thickening of the intima of the artery, and the development of a drug that directly prevents this is desired.
  • an object of the present invention is to provide a model animal for these adult diseases.
  • the present inventor focused on adiponectin isolated from human adipose tissue.
  • adiponectin isolated from human adipose tissue.
  • non-human animals deficient in the adiponectin gene not only show remarkable insulin resistance, but also exhibit remarkable intimal thickening of the arteries, which is useful as a model animal for obesity, diabetes and arteriosclerosis.
  • the inventors have found that the present invention has been completed.
  • the present invention provides a non-human animal deficient in adiponectin function.
  • the present invention also provides an animal model for obesity, diabetes and / or arteriosclerosis comprising a non-human animal deficient in adiponectin function.
  • the present invention provides a method for screening a preventive or therapeutic agent for obesity, diabetes, Z or arteriosclerosis, which comprises administering a test drug to a non-human animal deficient in adiponectin function.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of gene targeting for adiponectin gene deficiency. Top: Restriction enzyme map of mouse adiponectin gene, Middle: Adiponectin gene targeting vector, Bottom: Expected target targeting.
  • FIG. 2 shows Southern blot results of DM derived from ES cells digested by Spel and EoRV. The 17 kb band indicates wild-type aryl and the 10.5 kb band indicates mutant aryl.
  • Figure 3 shows Southern blots of DNA from wild-type (wild-type), hetero-deficient (adipo +/-), and homo-deficient (adipo-/-) mice digested with Spel and EoRV. .
  • the 17 kb band indicates the wild type aryl, and the 10.5 kb band indicates the mutant aryl.
  • FIG. 4 shows the Northern plot results of white adipose tissue of wild-type (wild-type), hetero-deficient (adipo +/ ⁇ ), and homo-deficient (adipo ⁇ / ⁇ ) mice.
  • Figure 5 shows wild-type (wild-type), hetero-defective (adipo +/-), and homo-deficient (adipo-/-) Shows the concentration of adiponectin in mouse blood. ** K0.01.
  • FIG. 6 shows blood leptin concentrations of wild-type, hetero-deficient (adipo +/ ⁇ ), and homo-deficient (adipo ⁇ / ⁇ ) mice.
  • FIG. 7 shows the weight of wild-type, hetero-deficient (adipo +/ ⁇ ) and homo-deficient (adipo ⁇ / ⁇ ) mice at 6 weeks.
  • FIG. 8 shows the results of an insulin tolerance test at 6 weeks for wild-type and hetero-deficient (adipo +/ ⁇ ) mice. * P 0.05.
  • FIG. 9 shows the results of a 6-week glucose tolerance test on wild-type and hetero-deficient (adipo +/ ⁇ ) mice [(1): blood glucose level, (2): insulin level].
  • Figure 10 shows the results of a glucose tolerance test at 10 weeks on a high-fat diet in wild-type and hetero-deficient (adipo + / _) mice [(1): blood glucose level, (2): insulin Value] * P * 0.05, ** P * 0.01.
  • FIG. 11 shows the results of an insulin tolerance test at 6 weeks of wild-type and homo-deficient (adipo ⁇ / ⁇ ) mice. * P * 0.05, P * 0.01.
  • FIG. 12 shows the results of a glucose tolerance test at 6 weeks of wild-type and hetero-deficient (adipo +/ ⁇ ) mice [00: blood glucose level, (2): insulin level]. * P ⁇ 0.05, «P ⁇ 0.0L
  • FIG. 13 shows the free fatty acid (FFA), neutral fat (TG), and total cholesterol (TC) levels in blood of wild-type and hetero-deficient (adipo +/ ⁇ ) mice.
  • FIG. 14 shows blood free fatty acids (FFA), triglycerides (TG), and total cholesterol (TC) of wild-type and homo-deficient (adipo ⁇ / ⁇ ) mice.
  • FFA blood free fatty acids
  • TG triglycerides
  • TC total cholesterol
  • FIG. 15 shows the inner diameter of blood vessels 2 weeks after cuff injury in wild-type and hetero-deficient (adipo +/ ⁇ ) mice.
  • FIG. 16 shows the degree of intimal hyperplasia two weeks after cuff injury in wild-type and hetero-deficient (adipo +/ ⁇ ) mice.
  • FIG. 17 shows the degree of medial hyperplasia two weeks after cuff injury in wild-type (wild-type) and hetero-deficient (adipo +/-) mice.
  • FIG. 18 shows the intima-media ratio of wild-type (wild-type) and hetero-deficient (adipo +/ ⁇ ) mice two weeks after cuff injury.
  • the non-human animal deficient in adibonectin function of the present invention is specifically a non-human animal deficient in adiponectin gene function.
  • adiponectin has already been cloned [Maeda, K et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 221, 286-296 (1996), Nakano, Y. et al, J. Biochem. ) 120, 802-812 (1996)], available by known means.
  • SEQ ID NOs: 1 and 2 show the nucleotide sequence and amino acid sequence of mouse adiponectin.
  • the expression “function of a gene is deficient” means that adiponectin, which is a gene product of the gene, is not normally produced, and that adiponectin itself expresses its function by not being produced or partially deficient. It involves the production of adiponectin-like proteins that cannot be achieved.
  • these genes are cloned, the function of the gene is deleted in vitro, and the deficient gene is returned to the animal to replace the adiponectin gene on the chromosome.
  • a method is used in which homologous recombination is caused between the cells, the adiponectin gene on the chromosome is broken, and the function of the gene in the animal itself or its progeny is lost.
  • Examples of a method for deficient gene function include a method for artificially mutating a gene to destroy the gene. And inserting or replacing other genes.
  • the non-human animal as referred to in the present invention only needs to be one in which the function of the adiponectin gene is deficient. Any injured animals are included.
  • the animals used are not particularly limited, and include all animals except humans, and are preferably mammals such as guinea pigs, hamsters, mice, rats, magpies, and bush, and are easy to treat as disease models. Rodents with a relatively short biological cycle, particularly mice, are preferred.
  • Examples of a method for introducing a gene into an animal and expressing the gene in an individual or progeny of the animal include known methods conventionally used in the preparation of transgenic animals. Injection into the pronucleus embryo of the fertilized egg, infection of the early stage embryo with the recombinant retrovirus, injection of homologous recombination embryonic stem cells (ES cells) into the blastocyst or 8-cell stage embryo
  • ES cells homologous recombination embryonic stem cells
  • a method of preparing a F1 heterozygous mutant animal, and furthermore, an F2 homozygous or hemizygous mutant animal is obtained by transplanting a host embryo obtained by the method, etc.
  • the method of gene transfer using ES cells is suitable for disrupting (knock-out) the gene by homologous recombination, and separates the step of introducing the gene into ES cells and the step of producing chimeric animals. This is preferable because it has the advantage of being able to be performed.
  • the method of gene transfer using ES cells may be performed according to a known method.
  • Deletion of the mouse adiponectin gene function can be achieved by deleting at least a part of the promoter region and the Z or code region, or inserting another gene into any site.
  • the site where the deletion or other gene is inserted may be an intron.
  • a DNA (targeting vector) having a DM sequence constructed so as to disrupt the gene is prepared.
  • the gene to be inserted it is preferable to use a gene that functions as a primary gene for detecting the adiponectin gene deficiency.
  • a marker gene used for positive selection for example, neomycin
  • neo Resistance gene strength
  • tk thymidine kinase
  • DT-A diphtheria toxin A fragment
  • the neomycin resistance gene enables selection of the target gene by using the neomycin analog G418.
  • Preferable gene targeting is a method using a substitution type vector in which a positive selection marker is substituted on the target gene as a targeting vector, and a method using a vector containing a selection marker upstream of the target gene.
  • a method using an insertion vector that suppresses the expression of the gene by inserting a corresponding heterologous region can be used.
  • insertion of these genes can be performed by a conventional DNA recombination technique in the mouth.
  • homologous recombination is performed between the thus obtained targeting vector and the adiponectin gene in ES cells.
  • Introduction of the DNA for homologous recombination into ES cells can be carried out, for example, by conventional electroporation.
  • recombination occurs between the DNA of the adiponectin gene in the ES cell and the corresponding region of the DNA for homologous recombination, and the marker gene inserted in the DNA for homologous recombination is restored to the ES cell. Inserted into the adiponectin gene of the genome.
  • ES cells lack the function of the adiponectin gene and at the same time contain a marker gene.
  • ES cells lacking the function of the CBP gene can be selected based on the selection function of the marker gene.
  • the ES cells are injected into a host embryo such as a mouse blastocyst, and the obtained embryo is transplanted into the uterine horn of a pseudopregnant mouse to obtain a chimeric mouse.
  • a F1 heterozygous offspring is obtained.
  • the germ cell of the chimeric mouse is derived from a homologous recombinant, that is, an ES cell in which the adiponectin gene is disrupted, a mouse deficient in the function of the adiponectin gene can be obtained.
  • the obtained hetero-deficient animals are bred with each other, and homozygous Deficient animals can be obtained.
  • adiponectin gene is deficient or whether the gene is hetero or homo deficient can be confirmed by pouring DNA from the tail after weaning and then performing Southern plot or PCR.
  • the animal breeding method of the present invention does not require a special method, and can be bred by the same method as a normal animal.
  • the thus-produced animal deficient in adiponectin function particularly an adiponectin hetero-deficient animal has the following properties.
  • Adiponectin-deficient animals show remarkable insulin resistance as compared to the wild type, despite an increase in blood glucose due to glucose load. In addition, they have impaired glucose tolerance because their glucose level increases their blood glucose levels both on an empty stomach and after fasting.
  • Adiponectin-deficient animals have no difference in blood free fatty acids and total cholesterol from the wild type, but have a high neutral fat content in the homodeficient type.
  • Adiponectin-deficient animals have extremely high intimal hyperplasia due to cuff damage to the arteries, and exhibit clear arteriosclerotic symptoms.
  • the adiponectin-deficient animal of the present invention is useful as a model animal for obesity and / or diabetes, particularly a model animal for obesity and Z or type 2 diabetes. It is also useful as a model animal for arteriosclerosis.
  • a test drug is administered to an adiponectin deficient animal, Observe the properties or observe the change in the expression level of the gene specific to the adiponectin deficient animal.
  • the change in the gene expression level is conveniently performed by analysis using a DNA chip or the like.
  • the 129 / Sv mouse genomic library was screened using the adiponectin cDNA as a probe, and a plurality of clones containing the adiponectin gene were cloned.
  • a targeting vector was constructed by substituting the neomycin resistance gene from immediately below the translation start point to the translation end point, and this targeting vector was transfected into ES cells. Screening was performed by Southern blotting, and homologous recombinants of 5 clones were confirmed. Chimeric mice were prepared by microinjection and Fl and F2 were prepared by crossing with BI / 6.
  • mice lacking the adiponectin gene were created by homologous recombination as shown in FIG. Since the mouse adiponectin gene was deleted, a targeting vector was prepared in which exons 2 and 3 encoding adiponectin were replaced with a neo resistance gene. Five independent homologous recombination clones were identified by Southern blot ( Figure 2). Chimeric mice were prepared from ES cells having 129 / Sv in the background and crossed with BI / 6 to create hetero-deficient mice. The genotype was confirmed by Southern blot (Fig. 3).
  • Blood free fatty acids, neutral fats, and total cholesterol were measured using NEFAC-test, TGL-type, and Tchol E-type (manufactured by Kocosha) after a 16-hour fast.
  • a 2.0-tube polyethylene tube (PE-50) was placed in the femoral artery. Two weeks later, the blood vessel was pressure-fixed with formalin, and then removed together with a contralateral uncuffed control blood vessel. Serial annular sections were prepared with a thickness of 10 bands from the extracted blood vessels, and 10 of these sections were stained with HE, and the inner diameter of the blood vessel, the thickness of the intima, the thickness of the media, and the ratio of the intima to media were measured. .
  • adiponectin blood free fatty acids
  • TG triglycerides
  • TC total cholesterol

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Description

遺伝子欠損非ヒト動物
技術分野
本発明は、 肥満及び z又は糖尿病のモデル動物、 並びに動脈硬化症のモデル動 物として有用な非ヒト動物に関する。
明 冃景： 技術 書
日本人の糖尿病 ·肥満患者は、 糖尿病患者だけで推定 700万人でその数はなお 増加の一途をたどっている。 糖尿病の大部分を占める一般の 2型糖尿病及び肥満 は、 複数の原因遺伝子が組合わさり、 更に生活習慣などの環境因子が重なって発 症する多因子病である。 糖尿病 ·肥満の増加の最大の原因は食生活の欧米化、 特 に高脂肪食と身体活動の減少など生活習慣に起因したィンスリン抵抗性の増大と 考えられる。 したがって、 2型糖尿病 ·肥満の原因遺伝子の同定と共に、 欧米型 の生活習慣がインスリン抵抗性、 更にはシンドローム Xや動脈硬化を引き起こす 分子機構を解明して、 生活習慣病の根本的予防法や治療法を確立することが急務 となっている。
一方、 動脈硬化症もまた生活習慣病の一種であり、 脳出血、 脳梗塞、 心筋梗塞、 腎硬化症などの原因として重要である。 動脈硬化の主症状は動脈内膜の肥厚であ り、 これを直接防止する医薬の開発が望まれている。
これらの医薬の開発には、 優れたモデル動物の存在が不可欠である。
従って、 本発明の目的は、 これら成人病のモデル動物を提供することにある。
発明の開示
そこで本発明者は、 ヒト脂肪組織から単離されたアディポネクチンに着目して 研究してきたところ、 アディポネクチン遺伝子を欠損させた非ヒト動物が顕著な インスリン抵抗性を示すだけでなく、 顕著な動脈内膜肥厚を呈し、 肥満、 糖尿病 及び動脈硬ィ匕症のモデル動物として有用であることを見出し、 本発明を完成する に至った。
すなわち、 本発明は、 アディポネクチンの機能が欠損した非ヒト動物を提供す るものである。
また本発明は、 アディポネクチンの機能が欠損した非ヒ卜動物からなる肥満、 糖尿病及び/又は動脈硬化症モデル動物を提供するものである。
さらに本発明は、 アディポネクチンの機能が欠損した非ヒト動物に被験薬物を 投与することを特徴とする肥満、 糖尿病及び Z又は動脈硬化症の予防治療剤のス クリーニング方法を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 アディポネクチン遺伝子欠損についてのジーンターゲティングの模式 図を示す。 上：マウスアディポネクチン遺伝子の制限酵素地図、 中：アディポネ クチン遺伝子夕ーゲティングベクター、 下：予想されるタ一ゲティングァリール。 図 2は、 Spelと EoRVによって消化された ES細胞由来の DMのサザンブロット結 果を示す。 17kbのバンドは野生型ァリールを、 10. 5kbのパンドは変異ァリールを 示す。
図 3は、 Spelと EoRVによって消化された野生型 （wi ld- type) 、 ヘテロ欠損型 (adipo +/-) 、 ホモ欠損型 （adipo - /-) マウス由来の DNAのサザンブロット結 果を示す。 17kbのバンドは野生型ァリ一ルを、 10. 5kbのバンドは変異ァリールを 示す。
図 4は、 野生型 （wi ld-type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/-) 、 ホモ欠損型 (adipo -/-) マウスの白色脂肪組織のノーザンプロット結果を示す。
図 5は、 野生型 （wi ld-type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/-) 、 ホモ欠損型 (adipo -/-) マウス血中アディポネクチン濃度を示す。 **K0.01。
図 6は、 野生型 （wild- type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/-) 、 ホモ欠損型 (adipo -/-) マウスの血中レプチン濃度を示す。
図 7は、 野生型 （wild- type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/-) 、 ホモ欠損型 (adipo -/-) マウスの 6週における体重を示す。
図 8は、 野生型 （wild- type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/-) マウスの 6週にお けるインスリン負荷試験結果を示す。 *Pく 0.05。
図 9は、 野生型 （wild- type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/- ) マウスの 6週にお けるグルコース負荷試験結果を示す 〔（1):血糖値、 （2):インスリン値〕 。 図 10は、 野生型 （wild-type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/_) マウスの高脂肪 食負荷 10週におけるグルコース負荷試験結果を示す 〔（1):血糖値、 （2):インスリ ン値〕 *Pく 0.05、 **Pく 0.01。
図 11は、 野生型 （wild-type) 、 ホモ欠損型 （adipo - /-) マウスの 6週にお けるインスリン負荷試験結果を示す。 *Pく 0.05、 Pく 0.01。
図 12は、 野生型 （wild- type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/-) マウスの 6週に おけるグルコース負荷試験結果を示す 〔00:血糖値、 （2):インスリン値〕 。 *Pく 0.05、 «P<0.0L
図 13は、 野生型 （wild- type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/- ) マウスの血中遊 離脂肪酸 (FFA)、 中性脂肪 (TG)、 総コレステロール値 (TC)を示す。
図 14は、 野生型 （wild-type) 、 ホモ欠損型 （adipo -/-) マウスの血中遊離 脂肪酸 (FFA)、 中性脂肪 (TG)、 総コレステロール値 (TC)を示す。
図 15は、 野生型 （wild-type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/- ) マウスのカフ損 傷 2週間後における血管の内径を示す。
図 16は、 野生型 （wild-type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/-) マウスのカフ損 傷 2週間後における内膜肥厚の程度を示す。 図 1 7は、 野生型 （wi ld- type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/-) マウスのカフ損 傷 2週間後における中膜肥厚の程度を示す。
図 1 8は、 野生型 （wi ld- type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/-) マウスのカフ損 傷 2週間後における内膜中膜比を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明のアディボネクチンの機能が欠損した非ヒ卜動物としては、 具体的には アディポネクチン遺伝子の機能が欠損した非ヒ卜動物である。
ここでアディポネクチンは、 既にクローニングされており [Maeda，K et al, Bi o chem. Biophys. Res. Commun. 221, 286-296 (1996) , Nakano, Y. et al , J. Biochem. (Toky 0) 120, 802-812 (1996) ] , 既知の手段により入手できる。 配列番号 1及び 2にマウス アディポネクチンの塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
本発明において、 「遺伝子の機能が欠損した」 とは、 該遺伝子の遺伝子産物で あるアディポネクチンが正常に産生されないことをいい、 アディポネクチン自体 が産生されないこと及び一部を欠損するなどして機能を発現し得ないアディポネ クチン様夕ンパク質を産生することが含まれる。
本発明のアディポネクチン遺伝子の機能欠損動物を得るためには、 これらの遺 伝子をクローニングし、 インビトロで該遺伝子の機能を欠損させた後に、 該欠損 遺伝子を動物に戻して染色体上のアディポネクチン遺伝子との間で相同組換えを 起こさせ、 染色体上のアディポネクチン遺伝子を破壌し、 その動物自体又はその 子孫の該遺伝子の機能を欠損させるという方法が一般的に用いられる。
遺伝子の機能を欠損させる方法としては、 遺伝子に人為的に変異を加えて該遺 伝子を破壊する方法が挙げられ、 例えばプロモー夕一領域及び Z又はコ一ド領域 の少なくとも一部の欠失や、 他の遺伝子を挿入又は置換することが挙げられる。 本発明でいう非ヒト動物は、 アディポネクチン遺伝子の機能が欠損したもので あればよく、 アディポネクチン遺伝子がヘテロに欠損している動物及びホモに欠 損している動物のいずれもが含まれる。 また、 使用される動物は特に限定されず、 ヒトを除く全ての動物が挙げられ、 好ましくはモルモット、 ハムスター、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ブ夕等の哺乳動物であり、 病態モデルとしての扱いが容易で且 つ生物サイクルが比較的短い齧歯動物、 特にマウスが好ましい。
動物に遺伝子を導入してその動物の個体又は子孫にその遺伝子を発現させる手 法としては、 従来からトランスジエニック動物の作成に常用されている公知の手 法を挙げることができ、 例えば遺伝子 DNAを受精卵の前核期胚に注入する方法、 組換えレトロウイルスを初期胚に感染させる方法、 相同組換えを起こさせた胚性 幹細胞 (ES細胞）を胚盤胞又は 8細胞期胚に注入する方法等によって得られた宿主 胚を動物に移植して産仔を得、 これを他の個体と交配し、 F1ヘテロ変異動物、 更 には F2ホモ又はへミ変異動物を作成する方法が挙げられる。
このうち、 ES細胞を用いる遺伝子導入の方法は、 相同組換えにより遺伝子を破 壌 （ノックアウト） するのに適しており、 ES細胞に遺伝子を導入する工程とキメ ラ動物を作出する工程とを分けて行えるという利点を有しているので好ましい。 ES細胞を用いる遺伝子導入の方法は、 公知の方法に準じて行えばよい。
以下、 ES細胞を用いた遺伝子の導入の方法について、 マウスを例にして具体的 に説明する。
マウスのアディポネクチン遺伝子機能の欠損には、 プロモーター領域及び Z又 はコ一ド領域の少なくとも一部を欠失させるか、 いずれかの部位に他の遺伝子を 挿入すればよい。 また、 これらの遺伝子の機能を欠損させることができる限り、 欠失又は他の遺伝子を挿入する部位は、 イントロンであってもよい。
そして、 アディポネクチン遺伝子との間で相同組換えを行うにあたり、 このよ うに遺伝子を破壊するように構築した DM配列を有する DNA (ターゲティングべク タ一） を作製する。
挿入する遺伝子としては、 アディポネクチン遺伝子の欠損を検出するためのマ 一力一遺伝子として機能する遺伝子を用いることが好ましく、 そのような遺伝子 としては、 ポジティブ選別に用いるマーカー遺伝子として、 例えばネオマイシン
(neo)耐性遺伝子力 ネガティブ選別に用いるマーカ一遺伝子として、 例えばチ ミジンキナーゼ (tk)遺伝子ゃジフテリァトキシン Aフラグメント（DT- A)遺伝子等 が用いられる。 尚、 ネオマイシン耐性遺伝子は、 ネオマイシン類似体である G418 を用いることにより目的遺伝子の選別を可能にする。
好ましい遺伝子タ一ゲティングとしては、 ターゲティングベクターとして、 ポ ジティブ選別マーカ一が標的遺伝子の上に置換されている置換型ベクターを用い る方法と、 標的遺伝子の上流に選別マーカーを含むべクターのバックボーンにあ たる非相同領域を挿入することによって、 その遺伝子の発現を抑制する挿入型べ クタ一を用いる方法などが挙げられる。 尚、 これらの遺伝子の挿入は、 インビト 口で常用の DNA組換え技術により行うことができる。 '
次に、 こうして得られたターゲティングベクターと、 ES細胞中のアディポネク チン遺伝子との間で相同組換えを行う。 相同組換え用 DNAの ES細胞への導入は、 例えば常用のエレクトロボレ一シヨンにより行うことができる。 この相同組換え においては、 ES細胞中のアディポネクチン遺伝子の DNAと相同組換え用 DNAの対応 する領域との間で組換えが生じ、 相同組換え用 DNA中に挿入されていたマーカー 遺伝子が ES細胞のゲノムのアディポネクチン遺伝子に挿入される。 この結果、 ES 細胞は、 アディポネクチン遺伝子の機能を欠損し、 同時にマーカー遺伝子を含む ことになる。 このマーカ一遺伝子の選別機能に基づいて、 CBP遺伝子の機能を欠 損した ES細胞を選別することができる。
次に、 この ES細胞をマウスの胚盤胞等の宿主胚に注入し、 得られた胚を偽妊娠 マウスの子宮角に移植してキメラマウスを得る。 このキメラマウスを適当な系統 のマウスと交配することにより F1ヘテロ型の産仔を得る。 キメラマウスの生殖細 胞が相同組換え体、 すなわちアディポネクチン遺伝子が破壊されている ES細胞に 由来していれば、 アディポネクチン遺伝子の機能が欠損したマウスを得ることが できる。 また、 得られたヘテロ欠損動物同士を交配させ、 その産仔の中からホモ 欠損動物を得ることができる。
アディポネクチン遺伝子の欠損や、 該遺伝子がヘテロ又はホモに欠損したもの であるかは、 離乳に至った後に尾から DNAを注出後、 サザンプロット又は PCRを行 つて、 確認することができる。
尚、 本発明の動物の飼育方法は、 特別な方法を用いる必要はなく、 正常な動物 と同様な方法により飼育することができる。
こうして作製されるアディポネクチン機能が欠損した動物、 特にアディポネク チンへテロ欠損動物は次のような性質を有する。
( 1 ) アディポネクチン欠損動物は、 野生型に比べて、 糖負荷により血糖値が上 昇するにもかかわらず、 顕著なインスリン抵抗性を示す。 また、 糖負荷により空 腹時、 負荷後ともに血糖値が高くなることから、 耐糖能障害も有している。
( 2 ) アディポネクチン欠損動物は、 血中遊離脂肪酸及び総コレステロール値に おいて野生型と差がないが、 中性脂肪がホモ欠損型で高い。
( 3 ) アディポネクチン欠損動物は、 動脈のカフ損傷に対する内膜肥厚が極めて 高く、 明らかな動脈硬化の症状を呈する。
従って、 本発明のアディポネクチン欠損動物は、 肥満及び/又は糖尿病のモデ ル動物、 特に肥満及び Z又は 2型糖尿病のモデル動物として有用である。 さらに 動脈硬化症のモデル動物としても有用である。
本発明のアディポネクチン機能欠損動物を用いて肥満及び/又は糖尿病予防治 療剤、 動脈硬化症予防治療剤をスクリーニングするには、 アディボネクチン機能 欠損動物に被験薬物を投与し、 前記のアディポネクチン機能欠損動物特有の性質 を観察するか、 アディポネクチン機能欠損動物特有の遺伝子の発現量の変化を観 察すればよい。 ここで遺伝子発現量の変化は、 DNAチップ等を用いた解析による のが簡便である。 実施例 次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、 本発明は何らこれに限定 されるものではない。
A. 方法
( 1 ) ノックアウトマウスの作成
アディポネクチン cDNAをプローブを用いて 129/Svマウスゲノミックライブラリ 一をスクリ一ニングし、 アディポネクチン遺伝子を含むクローンを複数クローニ ングした。 翻訳開始点直下から翻訳終止点までを neomyc in耐性遺伝子で置換した タ一ゲティングベクタ一を構築し、 このタ一ゲティングベクターを ES細胞にトラ ンスフエクシヨンした。 サザンブロッティングによりスクリーニングを行い、 5 クローンの相同組換え体を確認した。 顕微注入法にてキメラマウスを作成し、 BI/6との交配により Fl、 さらに F2を作成した。
すなわち、 アディポネクチン遺伝子の欠損マウスは、 図 1に示すような相同組 換えによって作成した。 マウスアディポネクチン遺伝子を欠損のため、 アディポ ネクチンをコードしているェクソン 2と 3を neo耐性遺伝子に置き換えたターゲテ ィングベクターを作成した。 独立した 5つの相同句組換えを起こしたクローンが サザンブロットによって確認された （図 2) 。 129/Svをパックグランドにもつ ES 細胞よりキメラマウスを作成し、 ヘテロ欠損マウス作成のため BI/6と交配した。 その遺伝子型をサザンブロットにて確認した （図 3) 。
( 2 ) インスリン負荷試験
負荷試験中のみ絶食をかけ、 腹腔内にマウス体重 lgあたり 0. 7mUのヒトインス リンを投与した。 採血は尾静脈から行い血糖値はダルテストエース （登録商標、 三和化学研究所製） にて測定した。
( 3 ) グルコース負荷試験
試験開始前に少なくとも 16時間以上絶食をかけた後、 マウス体重 lgあたり 1. 5mgのグルコースを経口投与した。 採血は眼底静脈より行い血糖値はグルテス トエース （登録商標、 三和化学研究所製） にて測定、 リン RIAキット （アマシャム ·フアルマシア ·バイオテク社製） を用いて測定し た。
( 4 ) 血中脂質レベルの測定
血中の遊離脂肪酸、 中性脂肪、 総コレステロールは 16時間の絶食の後、 それぞ れ NEFAC - tes t，TGL - type, Tcho l E-type (ヮコ一社製） を用いて測定した。
( 5 ) 血中レプチン、 アディポネクチンの測定
血中のレブチン、 アディボネクチンの測定は 16時間の絶食の後、 それぞれ Quint ikine M ki t (R&D社製） 、 アディポネクチン RIAキット （LINC0社製） を用 いて測定した。
( 6 ) カフによる血管内膜肥厚モデルの作製
大腿動脈に 2. 0讓のポリエチレンチューブ (PE- 50)を留置し、 2週間後に血管を ホルマリンにて圧固定後、 対側のカフを巻いていない対照血管とともに摘出した。 摘出した血管に対して 10匪の厚さで連続輪状切片を作製しそのうち 10切片を HE染 色し、 血管内径、 内膜の厚さ、 中膜の厚さ、 内膜中膜比を測定した。
B . 結果
( 1 ) マウスアディポネクチン遺伝子欠損マウス
白色脂肪組織のノーザンブロットではへテロ欠損型マウスではアディポネクチ ンの発現が約 60%減少し、 ホモ欠損マウスではその発現が完全に消失しているこ とが確認された （図 4) 。 実際血中のアディポネクチン濃度を測定するとへテロ 欠損型マウスではその血中レベルが約 60%低下しホモ欠損マウスでは検出限界以 下であった （図 5) 。 なお血中レブチン濃度には差が認められなかった （図 6) 。
( 2 ) マウスアディポネクチン遺伝子欠損マウスのィンスリン抵抗性
6週の野生型 （wi l d-type) 、 ヘテロ欠損型 （adipo +/_) 、 ホモ欠損型 （adipo -/-) マウスの 3群において体重差は認められなかった （図 7) 。 6週の野生型とへ テロ型欠損マウスに対してィンスリン感受性を調べる目的でィンスリン負荷試験 を行ったところ、 外来性のィンスリンに対する血糖値の降下の程度はへテロ欠損 型で有意に低く、 ヘテロ欠損型マウスがィンスリン抵抗性を有していることが明 らかとなつた （図 8) 。
次にグルコース負荷試験を行ったが、 血糖値、 インスリン値において野生型と ヘテロ欠損型マウスにおいて差は認められなかった （図 9) 。 しかし 10週間の高 脂肪食を負荷したヘテロ欠損マウスでは野生型に比し体重は同じであったにもか かわらず糖負荷前後の血糖値が有意に上昇していた （図 10) 。
次にはホモ欠損マウスの解析を行った。
6週の野生型とホモ欠損型マウスに対してィンスリン負荷試験を行ったところ、 外来性のィンスリンに対する血糖値の降下の程度は野生型やへテロ欠損型より有 意に低く、 インスリン抵抗性が野生型やへテロ欠損型マウスに比し高いことが明 らかとなつた （図 11) 。
次にグルコース負荷試験を行ったところ空腹時、 負荷後ともに血糖値が野生型 に比し高く、 このことからホモ欠損型マウスはインスリン抵抗性に加え軽度の耐 糖能障害も有していることが明らかとなった （図 12) 。 糖負荷前後のインスリン 値は投与前と投与 30分後では違いはなかったが 15分値ではホモ欠損型マウスでは 低い傾向にあった （図 12) 。
( 3 ) アディポネクチンホモ欠損型マウスでの血中中性脂肪
アディポネクチンの脂質代謝に対する影響を調べるために野生型、 ヘテロ欠損 型、 ホモ欠損型マウスの血中遊離脂肪酸 (FFA)、 中性脂肪 (TG)、 総コレステロ一 ル値 (TC)を測定した （図 13, 14) 。 ヘテロ欠損型では 3項目全てにおいて野生型と の違いは認められなかった （図 13) が、 ホモ欠損型では血中の中性脂肪値が野生 型に比し有意に高値であった （図 14) 。
( 4 ) マウスアディポネクチンへテロ欠損型マウスのカフ損傷モデルにおける内 膜肥厚
アディポネクチンの動脈硬化に対する影響を見るためにカフ損傷に対する内膜 肥厚の程度を野生型とヘテロ型欠損マウスにおいて比較した。 両群においてカフ 損傷後の血管の内径に差は認められなかった （図 15) 。 しかしカフ損傷 2週間後 においてヘテロ欠損型では野生型に比し内膜肥厚の程度が約 1. 8倍高かった （図 16) 。 しかし中膜の厚さに差は認められなかった （図 17) 。 野生型とヘテロ欠損 型マウスにおいて内膜中膜比をとつてみるとヘテロ欠損型では野生型に比し約 2 倍であった （図 18) 。 産業上の利用可能性
本発明の動物を用いれば、 肥満、 糖尿病、 動脈硬化の発生メカニズムの解明が できる。 また、 これらの疾患の予防治療薬をスクリーニングできる。

Claims

請求の範囲
1 . アディポネクチンの機能が欠損した非ヒト動物。
2 . 非ヒ卜動物が、 マウスである請求項 1記載の動物。
3 . 請求項 1又は 2記載の非ヒト動物からなる肥満及び Z又は糖尿病のモデル 動物。
4. 請求項 1又は 2記載の非ヒト動物からなる動脈硬化症モデル動物。
5 . アディポネクチンの機能が欠損した非ヒト動物に被験薬物を投与すること を特徴とする肥満及び/又は糖尿病の予防及び Z又は治療剤のスクリーニング方 法。
6 . アディポネクチンの機能が欠損した非ヒト動物に被験薬物を投与すること を特徴とする動脈硬化予防及び/又は治療剤のスクリーニング方法。
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