WO2003093477A1 - Carbonyl reductase, gene de celle-ci et son utilisation - Google Patents

Carbonyl reductase, gene de celle-ci et son utilisation Download PDF

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WO2003093477A1
WO2003093477A1 PCT/JP2003/005500 JP0305500W WO03093477A1 WO 2003093477 A1 WO2003093477 A1 WO 2003093477A1 JP 0305500 W JP0305500 W JP 0305500W WO 03093477 A1 WO03093477 A1 WO 03093477A1
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polypeptide
chloro
optically active
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PCT/JP2003/005500
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Noriyuki Kizaki
Miho Horikawa
Yoshihiko Yasohara
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Kaneka Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01184—Carbonyl reductase (NADPH) (1.1.1.184)

Definitions

  • the present invention provides the following formula (1)
  • the asymmetric reduction is performed by the asymmetric reduction of the 1- (3,1-chlorophenyl) represented by the formula (2)
  • the present invention also relates to a method for producing an optically active alcohol, particularly an optically active 1-phenylethanol derivative or an optically active 3-hydroxyestenole derivative, using the transformant.
  • Optically active 1-phenylethanol derivatives and optically active 3-hydroxyester derivatives are useful compounds as raw materials for synthesis of pharmaceuticals, agricultural chemicals and the like. Background art
  • the method for producing the optically active 1-fuunylethanol derivative includes:
  • 2-Halo1-1 (substituted phenyl) Ethanone is treated with a microorganism belonging to the genus Asibia or Pogatataea or a processed product thereof to obtain an optically active 2-halo1-1 (substituted phenyl).
  • a method for obtaining ethanol JP-A-4-218384, JP-A-111-215995
  • the present invention provides a polypeptide useful for producing an optically active 1-phenylethanol derivative or an optically active 3-hydroxyester derivative, a polynucleotide encoding the polypeptide, the polynucleotide It is an object of the present invention to provide an expression vector comprising: and a transformant transformed by the expression vector. Another object of the present invention is to provide a method for efficiently producing an optically active 1-funilethanol derivative or an optically active 3-hydroxyxester derivative using the transformant.
  • the present inventors asymmetrically reduced 2-chloro-1- (3'-chlorophenyl) ethanone to give (R) _2-chloro-1- (3'-chlorophenyl) ethanol.
  • (R) _2-chloro-1- (3'-chlorophenyl) ethanol By isolating a polypeptide having the activity from a microorganism having the activity to be produced, and utilizing the polypeptide, not only (R) _2_chloro_1- (3,1-chlorophene) ethanol but also ethanol can be obtained.
  • optically active alcohols such as optically active 1-phenylethanol derivatives such as toluene, and optically active 3-hydroxyester derivatives represented by (R) —4-chloro-3-hydroxybutyrate, etc. It has been found that it can be manufactured.
  • optically active 1-phenylethanol derivatives such as toluene
  • optically active 3-hydroxyester derivatives represented by (R) —4-chloro-3-hydroxybutyrate, etc. It has been found that it can be manufactured.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide was isolated, and an expression vector and a transformant were successfully created. Thus, the present invention was completed.
  • the present invention provides an asymmetric reduction of 2-cyclo-1- (3'-chlorophenyl) ethanone to give (R) _2-chloro-1- (3'-chlorophenyl) It is a polypeptide that can produce ethanol.
  • the present invention is also a polynucleotide encoding the above polypeptide. Further, the present invention is an expression vector containing the polynucleotide. Further, the present invention is a transformant which highly produces the polypeptide.
  • the present invention provides a method for producing a (R) -2-chloro-11- (3′-chlorophenyl) ethanol and (S) -1- (2,1-fluorophenyl) ethanol using the transformant. It is also a practical method for producing an optically active 1-phenylethanol derivative or an optically active 3-hydroxyester derivative represented by (R) -4 monochloro-3-ethylhydroxybutyrate.
  • polypeptide of the present invention has the following formula (1)
  • Such a polypeptide can be isolated from a microorganism having the activity.
  • the microorganism used as the origin of the polypeptide is not particularly limited, and examples thereof include yeast of the genus Rhodotorula, and particularly preferred are Rhodotorula goninitinis. Bar direnensis IFO 0 415 strains can be mentioned.
  • the microorganism producing the polypeptide of the present invention may be either a wild type or a mutant type. Alternatively, a microorganism derived by a genetic technique such as cell fusion or genetic manipulation can also be used.
  • a microorganism producing the genetically engineered polypeptide of the present invention may be, for example, a step of isolating and / or purifying these polypeptides to determine a part or all of the amino acid sequence thereof, To determine the base sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide, and to introduce the polynucleotide into another microorganism to obtain a recombinant microorganism.
  • Purification of the polypeptide from the microorganism having the polypeptide of the present invention can be performed by a conventional method.
  • the cells of the microorganism are cultured in an appropriate medium, and the cells are collected from the culture solution by centrifugation.
  • the obtained cells are disrupted by, for example, an ultrasonic disrupter, and the cell residue is removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • salting out ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.
  • solvent precipitation protein fraction precipitation with acetone or ethanol, etc.
  • dialysis gel filtration, ion exchange, reverse phase, etc.
  • Polypeptides can be purified using techniques such as column chromatography and ultrafiltration alone or in combination.
  • the enzyme activity was measured by adding the substrate 2-chloro-1-1 (3, -chlorofuran) to 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.3% (v / v) dimethyl sulfoxide.
  • Enyl) Ethanone lmM, 0.25 mM coenzyme NADPH and enzyme are added, and the decrease in absorbance at 340 nm at 30 ° C can be measured.
  • polypeptide of the present invention examples include polypeptides having the following physicochemical properties (1) to (4).
  • polypeptide of the present invention for example, (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing contains an amino acid sequence having at least one amino acid substitution, insertion, deletion, or addition, and the amino acid sequence has at least one amino acid sequence.
  • (Phenyl phenyl) Polypeptides having the activity of asymmetrically reducing ethanone to produce (R) -2-chloro-1- (3,1-chlorophenyl) ethanol.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least one amino acid substitution, insertion, deletion or addition in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is obtained by Curent Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1989), etc. t can be prepared according to a known method described in this publication, and the asymmetric reduction of 2- (1,1-chlorophenyl) ethanone to (R ) — 2_cloguchi 1— (3, chlorophenyl) As long as it has an activity of producing ethanol, it is included in the polypeptide of the present invention.
  • any polynucleotide can be used as long as it encodes the above polypeptide.
  • a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and a polynucleotide hybridizing under stringent conditions are complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 has a sequence identity of 60% or more, preferably 80 ° / 0 or more, more preferably 90% or more, More preferably, 95% or more, and most preferably, 99% or more of the polynucleotide can be mentioned. As long as it has the activity of reducing to (R) -2-chloro-1- (3,1-chlorophenyl) ethanol.
  • sequence identity refers to the optimal alignment of two contrasted polynucleotides and the presence of a nucleobase (eg, A, T, C, G, U, or I) in both sequences. The number of matching positions in the column is divided by the total number of comparison bases, and the result is multiplied by 100. Sequence identity can be calculated, for example, using the following sequence analysis tools: Unix-based GCG Wisconsin Package (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group 575 Science Drive Madison Rice, P.
  • the polynucleotide of the present invention is obtained by asymmetrically reducing 2- (1-, 3-chloro-2-phenyl) ethanone to give (R) —2-cyclo-1,1- (3,1-chloro).
  • Mouth phenyl) can be obtained from a microorganism having an activity of producing ethanol. Examples of such microorganisms include yeast belonging to the genus Rhodotorula, and particularly preferred is Rhodotorula glutinis var. Dairenensis IFO0415 strain.
  • a partial amino acid sequence of the purified polypeptide and a peptide fragment obtained by digesting the polypeptide with an appropriate endopeptidase is determined by the Edman method. Then, nucleotide primers are synthesized based on the amino acid sequence information.
  • the polynucleotide of the present invention is isolated from the microorganism as the origin of the polynucleotide by a conventional DNA isolation method, for example, the method described in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1989). Prepare the chromosomal DNA of the microorganism.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the nucleotide sequence of the amplified polynucleotide is determined by the dideoxy sequence method, the dideoxy chain method, etc. Can be determined by For example, it can be carried out using ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer) and ABI 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer).
  • the entire nucleotide sequence can be determined by, for example, the i-PCR method (Nucl. Acids Res. 16, 8186 (1988)). Can be determined.
  • the polynucleotide on the chromosome DNA contains an intron, for example, the nucleotide sequence of a mature polynucleotide containing no intron can be determined by the following method.
  • a conventional nucleotide isolation method for example, a method described in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1989), is used from a microorganism which is a source of the polynucleotide.
  • the RT-PCR method Proc. Nati. Acad. Acad., Ltd.
  • the vector used to introduce the polynucleotide of the present invention into a host microorganism and express it in the host microorganism into which the polynucleotide has been introduced is a vector capable of expressing the gene in the polynucleotide in an appropriate host microorganism. If so, any can be used. Examples of such a vector include those selected from a plasmid vector, a phage vector, and a cosmid vector. Further, the shuttle vector may be a shuttle vector capable of gene exchange with another host strain.
  • Such vectors usually contain regulatory elements such as the 1 ac UV5 promoter, the trp promoter, the trc promoter, the tac promoter, the lpp promoter, the tuf B promoter, the rec A promoter, the p L promoter, and the like. It can be suitably used as an expression vector containing an expression unit operably linked to a nucleotide.
  • the term “regulator” refers to a base sequence having a functional promoter and any associated transcription elements (eg, enhancers, CCAAT boxes, TATA bottus, SPI sites, etc.).
  • the term “operably linked” refers to a polynucleotide that, when expressed in a host cell, contains various regulatory elements such as promoters, enhancers, etc., that regulate its expression such that the gene in the polynucleotide is expressed. It is connected in a state where it can be operated by. It is well known to those skilled in the art that the type and type of the regulatory element may vary depending on the host cell.
  • Examples of host cells into which the expression vector containing the polynucleotide of the present invention is introduced include bacteria, yeast, filamentous fungi, plant cells, animal cells, etc., and Escherichia coli is particularly preferred.
  • An expression vector containing the polynucleotide of the present invention can be introduced into a host cell by a conventional method.
  • Escherichia coli is used as a host cell, an expression vector containing the polynucleotide of the present invention can be introduced by, for example, a calcium chloride method.
  • the 2- (1-, 3-chlorophenyl) ethanone can be asymmetrically reduced using the polypeptide of the present invention to give the (R) -2-cyclo-1,1- (3,1-chlorophenyl) ethanone.
  • coenzymes such as NADPH and NADH are required.
  • a coenzyme regenerating ability an enzyme having an ability to convert the oxidized coenzyme to a reduced form
  • enzymes having a coenzyme regeneration ability include, for example, hydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and glucose dehydrogenase. I can do it. Preferably, glucose dehydrogenase is used.
  • the reaction can also be performed by separately adding the enzyme having the coenzyme regenerating ability to the asymmetric reduction reaction system, but the polynucleotide of the present invention and the polypeptide having the coenzyme regenerating ability can be used.
  • the reaction can be carried out efficiently without separately preparing an enzyme having a coenzyme regeneration ability and adding it to the reaction system. I can do it.
  • Such a transformant is a polynucleotide encoding the polynucleotide of the present invention and a polypeptide (eg, glucose dehydrogenase) capable of regenerating a capture enzyme.
  • a polypeptide eg, glucose dehydrogenase
  • these two polynucleotides are incorporated into two vectors having different incompatibility groups, respectively, and the two vectors are used. Can also be introduced into the same host cell.
  • the expression vector of the present invention contains the above-mentioned polynucleotide.
  • An expression vector that is preferably plasmid p NTRG is mentioned.
  • the expression vector further include a polynucleotide encoding a polypeptide having the glucose dehydrogenase activity.
  • the polypeptide having glucose dehydrogenase activity is glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium.
  • an expression vector which is plasmid p NTRGG1 is mentioned.
  • the transformant of the present invention is obtained by transforming a host cell using the above expression vector. Escherichia coli is preferred as the host cell.
  • E.coli HB101 (p NTRG) is the accession number of FERM BP-7857, effective January 22, 2002,
  • E.coli HB101 (pNTRGG 1) is the accession number of FERM BP-7858, as of January 22, 2002,
  • the activity of an enzyme capable of regenerating a coenzyme in a transformant can be measured by a conventional method. For example, to measure glucose dehydrogenase activity, add 0.1 M substrate glucose, 2 mM coenzyme NADP and enzyme to 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), and absorb at 340 nm at 25 ° C. This can be done by measuring the increase in
  • the culture of the above-mentioned transformant or its processed product was An optically active alcohol is produced by reacting with a compound having a group.
  • a compound having a carbonyl group serving as a substrate first, in a suitable solvent, a compound having a carbonyl group serving as a substrate,
  • a coenzyme such as NADP, a culture of the transformant or a processed product thereof is added, and the mixture is stirred and reacted under pH adjustment.
  • Culture of the transformant can be carried out using a liquid nutrient medium containing a usual carbon source, nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients and the like as long as the microorganism grows.
  • the culture temperature is preferably 4 to 50 ° C.
  • the processed product of the transformant means, for example, a crude extract, a cultured cell, a freeze-dried organism, an acetone-dried organism, or a ground product thereof. Further, they can be used by immobilizing the polypeptide itself or the cells as they are by known means.
  • the transformant When performing this reaction, when a transformant that produces both the polypeptide of the present invention and an enzyme having coenzyme-reproducing ability (for example, glucose dehydrogenase) is used, the transformant is added to the reaction system.
  • an enzyme having coenzyme-reproducing ability for example, glucose dehydrogenase
  • the transformant is added to the reaction system.
  • a substrate for enzyme regeneration eg, glucose
  • RR 2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an alkoxy group, or a nitro group, and may be the same or different.
  • R 3 has a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, or a substituent.
  • R 4 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an azide, a benzyloxy group, or an alkyl group which may have a substituent
  • R 5 represents an alkyl group or a phenyl group.
  • 2-chloro-1- monochloropheninole
  • 1- (2, one-funolelophenyl) ethanone or 4-chloroacetate.
  • Ethyl acetate and the like can be mentioned.
  • Examples of the optically active alcohol obtained by the above method include, for example, the formula (4)
  • R 4 and R 5 are the same as described above). Examples thereof include: (R) —2-chloro-1- (3, Ethanol, (S) —1— (2′—funolelophenyl) ethanol, or (R) —4—cloth — 3-ethylethyl butyrate.
  • Examples of the halogen atom in R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • the alkoxy group in R ⁇ R 2 Ri alkoxy groups der of 1 to 3 carbon atoms, for example, main butoxy group, an ethoxy group, a propoxy group. Preferably, it is a methoxy group.
  • the alkyl group for R 3 and RR 5 is an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a hexyl group, an octyl group and the like. Preferably, it is an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms.
  • the alkyl group in R 3 and R 4 may have a substituent, and examples of the substituent include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, a hydroxyl group, an amino group and the like.
  • an aqueous solvent may be used as the solvent, or an aqueous solvent and an organic solvent may be mixed and used.
  • the organic solvent include toluene, hexane, diisopropyl ether, n-butyl acetate, ethyl acetate and the like.
  • the reaction temperature is 10 ° C to 70 ° C, preferably 20 to 40 ° C, and the reaction time is 1 to 100 hours, preferably 10 to 50 hours.
  • the pH of the reaction solution is maintained at 4 to 10, preferably 5 to 8, using, for example, an aqueous solution of sodium hydroxide or an aqueous solution of sodium carbonate.
  • the reaction can be performed in a batch or continuous mode.
  • the reaction substrate is added at a feed concentration of 0.1% to 70% (w / v).
  • the optically active alcohol generated by the reaction can be purified by a conventional method.
  • the optically active alcohol produced by the reaction is (R) —2_chloro-1- (3,1-chlorophenyl) ethanol, (S) -1- (2'-fluorophenyl) ethanol, or (R) If it is 3-ethyl ethyl 3-butyrate, centrifugation, filtration, etc. are performed as necessary to remove suspended cells such as bacterial cells from the reaction product, and then ethyl acetate, toluene, etc. Extract with organic solvent and remove the organic solvent under reduced pressure.
  • purification can be performed by a treatment such as distillation or chromatography.
  • the polypeptide of the present invention can be efficiently produced, and by utilizing the same, an excellent method for producing various useful optically active alcohols is provided. .
  • FIG. 1 is a diagram showing a polynucleotide sequence of the present invention and a deduced amino acid sequence.
  • FIG. 2 is a diagram showing a method and a structure of a recombinant plasmid pNTRGG1. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • glutamine variniensis Rhodotorula glutinis var. Dairenensis
  • An enzyme having the activity of reducing and producing (R) -2-chloro-11- (3'-chlorophenyl) ethanol was purified solely. Unless otherwise noted, purification procedures were performed at 4 ° C.
  • the culture was performed while adjusting the lower limit pH to 5.5. After 18 hours, 22 hours, and 26 hours from the start of the culture, 655 g of a 55% (w / w) aqueous glucose solution was added, and the cells were cultured for 30 hours.
  • Ammonium sulfate was added to the cell-free extract obtained above to make 45% saturation, dissolved, and the resulting precipitate was removed by centrifugation. (At this time, the pH of the cell-free extract was adjusted to pH 7. 5 while maintaining). While maintaining the pH at 7.5 as before, ammonium sulfate was further added to the centrifuged supernatant to 60% saturation, dissolved, and the resulting precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was dissolved in 1 OmM phosphate buffer (pH 7.5) and dialyzed against the same buffer overnight.
  • the crude enzyme solution obtained above is applied to a DEAE-TOYOPEARL 65 OM (manufactured by Tosoichi Co., Ltd.) column (250 ml) pre-equilibrated with 1 OmM phosphate buffer (pH 7.5). Adsorbed. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear gradient of NaCl (from OM to 0.3M). Active fractions were collected and dialyzed against 1 OmM phosphate buffer (pH 7.5) overnight.
  • DEAE-TOYOPEARL 65 OM manufactured by Tosoichi Co., Ltd.
  • Ammonium sulfate was dissolved in the crude enzyme solution obtained above to a final concentration of 1 M (this was performed while maintaining the pH of the crude enzyme solution at pH 7.5 with aqueous ammonia), and 1 M ammonium sulfate was added.
  • Phenyl-TOYOPEARL 65 OM (Tosoichi Co., Ltd.) column pre-equilibrated with 1 OmM phosphate buffer (pH 7.5) (100 ml) to adsorb the enzyme. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear gradient of ammonium sulfate (from 1M to 0M). The active fractions were collected and analyzed overnight with 1 OmM phosphate buffer (pH 7.5).
  • the crude enzyme solution obtained above was previously equilibrated with 1 OmM phosphate buffer (pH 7.5), and then applied to a column (20 ml) of Blusepharose CL TM (manufactured by Bharmacia Biotech). The enzyme was adsorbed. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear gradient of NaCl (from 0M to 1M). The active fractions were collected and dialyzed against 1 OmM phosphate buffer (pH 7.5) overnight to obtain a single purified enzyme sample by electrophoresis. From now on, this enzyme will be called RRG.
  • Example 2 Measurement of enzyme properties
  • the enzyme activity was measured in a 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.3% (v_ / v) dimethyl sulfoxide, and the substrate 2_chloro-1-1 (3, (Phenyl) Ethanone lmM, 0.25 mM coenzyme NADPH and enzyme were added, reacted at 30 ° C for 1 minute, and the decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm was measured.
  • NAD PH is used as a coenzyme to act on 2- (1-, 3-chlorophenyl) ethanone and has an optical purity of 99.9% ee or more.
  • '—Chlorophenyl) Ethanol was produced.
  • the enzyme activity was measured according to the above method using NADH as a coenzyme, it showed about 7% of the activity when NADPH was used as a coenzyme.
  • the buffer was 10 OmM phosphate buffer containing dimethyl sulfoxide and 10 OmM acetate buffer, and the pH was in the range of 4.0 to 8.0. Enzyme activity was measured in the same manner as in the enzyme activity measurement method described above. As a result, the optimal pH acting on 2-chloro-1,1 (3,1-chlorophenol) ethanone was 5.0 to 6.0.
  • the enzyme activity was measured in the same manner as the above-mentioned method for measuring the enzyme activity, except that the temperature was 20 ° C to 60 ° C.
  • the optimal temperature acting on 2-chloro-1- (3'-chlorophenyl) ethanone was 40 ° C to 50 ° C.
  • the purified RRG obtained in Example 1 was denatured in the presence of 8M urea, and then digested with achromobacter-derived lysyl endopeptidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The sequence was determined using an ABI type 492 protein sequencer (Perkin Elmer). Based on this amino acid sequence, two DNA primers (primer 1, SEQ ID NO: 3; primer 2, SEQ ID NO: 4) were synthesized according to a conventional method.
  • an N-terminal DNA primer (primer 3, SEQ ID NO: 5) having an NdeI site added to the start codon of the RRG gene
  • a C-terminal DNA primer (primer 4, SEQ ID NO: 6) was added with a stop codon (TAA) and an EcoRI site immediately after the 3 'end of the gene.
  • TAA stop codon
  • EcoRI EcoRI site
  • Example 6 Preparation of Recombinant Plasmid Containing Both RRG Gene and Glucose Dehydrogenase Gene
  • the Bacillus megaterium I AMI030 strain-derived glucose dehydrogenase (hereinafter referred to as GDH) contains the E. coli Shaine-Dalgarno sequence (9 bases) 5 bases upstream from the start codon of the gene, and immediately before that. Then, a SacI cleavage point was obtained, and a double-stranded DNA having a BamHI cleavage point added immediately after the stop codon was obtained by the following method. Based on the base sequence information of the GDH gene, a Shaine-Dalgarno sequence (9 bases) of E. coli was added 5 bases upstream from the start codon of the GDH structural gene, and an N-terminal DN with an Eco RI cleavage point added immediately before it.
  • GDH Bacillus megaterium I AMI030 strain-derived glucose dehydrogenase
  • a primer (Primer 5, SEQ ID NO: 7) and a C-terminal DNA primer (Primer 6, SEQ ID NO: 8) having a Sal1 site added immediately after the termination codon of the structural gene of GDH were synthesized by a conventional method.
  • plasmid pG Double-stranded DNA was synthesized by PCR using DK1 (Eur. J. Biom em. 186, 389 (1899)) as a template.
  • the resulting DNA fragment was digested with EcoRI and Sa1I, and inserted into the EcoRI and Sa1I sites (present downstream of the RRG gene) of the pNTRG constructed in Example 5 for recombination.
  • the plasmid pN TRGG1 was obtained.
  • FIG. 2 shows a method for preparing p NT RGG1 and its structure.
  • Example 7 Preparation of recombinant E. coli
  • E. coli HB101 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant plasmids pNTRG and pNTRGGl obtained in Examples 5 and 6, and recombinant E. coli HB101 (pNTRG) and HB101 (pNTRGGl) were transformed. Obtained.
  • the thus obtained transformants E. coli HB101 (pNTRG) and E. coli HB101 (NTRGGl) were respectively obtained as Accession Nos.
  • the recombinant Escherichia coli HB101 (pNTRG) obtained in Example 7 was cultured in 2 XYT medium containing lZO / ig / ml ampicillin, and after collecting the cells, lO OmM phosphate buffer (pH 6.5) , And crushed using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT) to obtain a cell-free extract.
  • the RRG activity of this cell-free extract was measured as follows.
  • the measurement of RRG activity was performed by adding 10% OmM phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.3% (vZv) dimethyl sulfoxide to the substrate 2—cloth—11 (3′—clohenyl) ethanone lmM, The coenzyme NADPH 0.25 mM and the enzyme were added, and the measurement was performed by measuring the decrease in absorbance at 340 nm at 30 ° C. Under these reaction conditions, the enzyme activity that oxidizes ⁇ 1 of NAD ⁇ to NAD ⁇ per minute was defined as 1 unit. The RRG activity in the cell-free extract measured in this way was expressed as specific activity, and compared with the transformant carrying vector plasmid.
  • a mouth dotorula prepared in the same manner as in Example 1 RRG activity in the cell-free extract of Rhodotorula glutinis var. Dairenensis I FO041 5 strain was similarly compared.
  • Table 1 shows the results.
  • Escherichia coli HB101 (pNTRG) showed a marked increase in RRG activity as compared to Escherichia coli HB101 (pUCNT), which is a transformant containing only vector plasmid, indicating that Rhodotorella gonoretinis nodilelenensis (Rhodotorula g) lutinis var. dairenensis)
  • Rhodotorella gonoretinis nodilelenensis Rhodotorula g
  • the specific activity was about 150 times higher than that of the IFO0415 strain.
  • the GDH activity of the cell-free extract obtained by treating the recombinant Escherichia coli HB101 (pNTRGG1) obtained in Example 7 in the same manner as in Example 8 was measured as follows. GDH activity was measured by adding substrate glucose 0-1 M, coenzyme NADP 2 mM and enzyme to 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), and measuring the absorbance at 340 nm at 25 ° C. This was done by measuring the increase. Under these reaction conditions, the enzyme activity of reducing 1 ⁇ mo 1 of NADP to NADPH per minute was defined as 1 unit. Also, the RRG activity was measured in the same manner as in Example 8.
  • E. coli HB101 pNTRG
  • pUCNT the transformant containing only vector plasmid
  • the culture solution of the recombinant Escherichia coli HB101 (pNTRG) obtained in Example 8 was sonicated using SONIFIRE 250 (manufactured by BRANSON).
  • Glucose dehydrogenase manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd. 2000U, 2 g of glucose dehydrogenase, 2 g of NADP 2 mg, 2 g of 1- (3, 1 g of feninole) and 2 g of ethanone was added.
  • the reaction solution was stirred at 30 ° C. for 18 hours while adjusting the pH to 6.5 by adding 5 M sodium hydroxide.
  • the culture solution of the recombinant E. coli HB101 (pNTRGG1) obtained in Example 9 was sonicated using SON IFI RE 250 (manufactured by BRAN SON). 3 g of glucose, 2 mg of NADP, and 2 g of 2- (3'-chlorophenyl) ethanone were added to 2 Om 1 of the cell lysate. The reaction solution was stirred at 30 ° C. for 24 hours while adjusting the pH to 6.5 by dropwise addition of 5 M sodium hydroxide. After the completion of the reaction, the reaction solution was extracted with toluene, and the solvent was removed. The extract was analyzed in the same manner as in Example 10. Black mouth Feuer) Ethanol was obtained.
  • the culture solution of the recombinant E. coli HB101 (pNTRGG1) obtained in Example 9 was sonicated using SON I FIRE 250 (manufactured by BRAN SON). 4 g of glucose and 3 mg of NADP were added to 20 ml of the cell lysate. The reaction solution was stirred at 30 ° C and adjusted to pH 6.5 by dropwise addition of 5 M sodium hydroxide, and a total of 2 g of 4-ethyl chloroacetoacetate was continuously added at a rate of 0.2 g per hour. Was added. After the addition was completed, the reaction was continued for another 12 hours. After the completion of the reaction, the reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the solvent was removed.
  • the culture solution of the recombinant Escherichia coli HB101 (pNTRGG1) obtained in Example 9 was sonicated using SON IFI RE250 (manufactured by BRAN SON). 15 g of glucose, 5 g of 1- (2'-fluorophenyl) ethanone and 5 mg of NADP were added to 10 Om1 of the cell lysate. The reaction solution was stirred at 30 ° C. for 24 hours while adjusting the pH to 6.5 with 5 M sodium hydroxide. After completion of the reaction, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate, and the solvent was removed.
  • the reducing activity of RRG on various carbonyl compounds was investigated. Under the basic reaction conditions for the measurement of RRG activity in Example 2, the activity was measured using various carbonyl compounds shown in Table 3 as substrates instead of 2-chloro-1- (3, -chlorophenyl) ethanone. The measurement results are shown in Table 3 as relative values when the reduction activity was 100% when 2-chloro-1- (3,1-chlorophenyl) ethanone was used as the substrate.

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Description

明細書
新規カルボニル還元酵素、 その遺伝子、 およびその利用法 技術分野
本発明は、 式 （1 )
Figure imgf000002_0001
で表される 2—クロ口一 1 _ ( 3， 一クロ口フエニル） ェ 不斉的に還元 して、 式 （2 )
Figure imgf000002_0002
で表される （R ) — 2—クロ口一 1一 （3 ' —クロ口フエニル） エタノールを生 成する活性を有する微生物より単離された、 該活性を有するポリペプチド、 該ポ リぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを含む発現べク ター、 および該発現べクタ一で形質転換された形質転換体に関する。
本発明はまた、 該形質転換体を用いた光学活性アルコール、 とりわけ光学活性 1 _フエニルエタノール誘導体または光学活性 3—ヒ ドロキシエステノレ誘導体の 製造法に関する。 光学活性 1一フエニルエタノール誘導体、 および光学活性 3— ヒ ドロキシエステル誘導体は、 医薬、 農薬等の合成原料として有用な化合物であ る。 背景技術
光学活性 1—フユニルエタノール誘導体の製造方法としては、
1 ) 2—ハロー 1一 （置換フエニル） エタノンに、 ァシビア属ゃォガタエァ属等 に属する微生物またはその処理物を作用させ、 光学活性 2—ハロー 1一 （置換フ ェニル) エタノールを得る方法 （特開平 4— 21 8384号公報、 特開平 1 1一 2 1 5 99 5号公報） 、
2) 1— (置換フエニル） エタノンにゲォトリカム 'キャンディダム （Ge o t r i c h um c a n d i d um) の乾燥菌体を作用させ、 光学活性 1— (置換 フエニル） エタノールを得る方法 （J. O r g. Ch em. 63, 8957 (1 998) ) 、
が開示されている。
また、 光学活性 3—ヒ ドロキシエステル誘導体の製造方法としては、
3) 4—置換ァセト酢酸エステルに、 スポロボロマイセス 'サルモニカラー （S p o r o b o 1 omy c e s s a l mo n i c o l o r) 由来のァノレテヒ トレ ダクタ一ゼの遺伝子を導入した遺伝子組換え大腸菌を作用させ、 （R) — 4一置 換— 3—ヒ ドロキシ酪酸エステルを得る方法 （特開平 8— 103269号公報） 、 が開示されている。
しかしながら、 これらの方法はいずれも、 その基質仕込み濃度または基質から 生成物への転換率が低く、 より効率の良い製造方法が望まれていた。 発明の要約
本発明は、 上記現状に鑑み、 光学活性 1一フエニルエタノール誘導体または光 学活性 3—ヒ ドロキシエステル誘導体の製造に有用なポリペプチド、 該ポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、 および該発現べクタ一で形質転換された形質転換体を提供することを課題とする。 また、 本発明は、 該形質転換体を用いて光学活性 1一フユニルエタノール誘導 体または光学活性 3—ヒ ドロキシェステル誘導体を効率よく製造する方法を提供 することを課題とする。
本発明者らは、 2—クロ口一 1一 （3' —クロ口フエニル） エタノンを不斉的 に還元し、 （R) _2—クロ口一 1— (3' —クロ口フエニル） エタノールを生 成する活性を有する微生物より、 該活性を有するポリペプチドを単離し、 該ポリ ペプチドを利用することにより （R) _2_クロロ_ 1— (3， 一クロ口フエ二 ノレ） エタノールのみならず、 （S) — 1— (2 ' —フルオロフェニル） エタノー ル等の光学活性 1一フエニルエタノール誘導体、 および、 （R ) — 4—クロロー 3—ヒ ドロキシ酪酸ェチルに代表される光学活性 3—ヒ ドロキシエステル誘導体 等の有用な光学活性アルコールを効率良く製造することが可能であることを見出 した。 また、 該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離し、 さらには、 発現ベクター並びに形質転換体を創製することにも成功し、 本発明を完成するに 至った。
即ち、 本発明は、 2—クロ口一 1— ( 3 ' —クロ口フエニル） エタノンを不斉 的に還元して、 （R) _ 2—クロ口一 1— ( 3 ' —クロ口フエニル） エタノール を生成し得るポリべプチドである。
また、 本発明は、 上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。 また、 本発明は、 上記ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターである。 また、 本発明は、 上記ポリペプチドを高生産する形質転換体である。
さらに、 本発明は、 該形質転換体を用いた、 （R ) —2—クロ口— 1一 （3 ' —クロ口フエニル） エタノール、 ( S ) — 1— ( 2， 一フルオロフェニル） エタ ノール、 および （R) — 4一クロ口 _ 3—ヒ ドロキシ酪酸ェチルに代表される、 光学活性 1一フエニルエタノール誘導体または光学活性 3—ヒ ドロキシエステル 誘導体の実用的な製造方法でもある。 発明の詳細な開示
以下、 詳細に本発明を説明する。
本発明のポリペプチドとしては、 式（1 )
Figure imgf000004_0001
で表される 2—クロ口一 1一 （3， 一クロ口フエニル） エタノンを不斉的に還元 して、 式（2 )
Figure imgf000005_0001
で表される （R ) — 2—クロロー 1一 （3， 一クロ口フエニル） エタノールを生 成する活性を有するポリぺプチドであればいずれも用いることができる。
このようなポリべプチドは、 当該活性を有する微生物から単離することができ る。 ポリペプチドの起源として用いられる微生物は、 特に限定されないが、 例え ばロドトルーラ （Rhodotorula) 属酵母が挙げられ、 特に好ましいものとしては 口 ドトルーラ · グノレチニス . バー ·ダイレネンシス （Rhodotorula glutinis va r. dairenensis) I F O 0 4 1 5株を挙げることができる。
本発明のポリぺプチドを生産する微生物は、 野生株または変異株のいずれでも あり得る。 あるいは、 細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導 された微生物も用いられ得る。 遺伝子操作された本発明のポリぺプチドを生産す る微生物は、 例えば、 これらのポリペプチドを単離およびノまたは精製してその アミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、 このアミノ酸配列に基づいてポ リぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列を決定する工程、 およびこ のポリヌクレオチドを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程を包含する 方法により得られ得る。
本発明のポリペプチドを有する微生物からの該ポリペプチドの精製は、 常法に より行い得る。 例えば、 該微生物の菌体を適当な培地で培養し、 培養液から遠心 分離により菌体を集める。 得られた菌体を例えば、 超音波破砕機などで破砕し、 遠心分離にて菌体残さを除き、 無細胞抽出液を得る。 この無細胞抽出液から、 例 えば、 塩析 （硫酸アンモニゥム沈殿、 リン酸ナトリウム沈殿など） 、 溶媒沈殿 （ アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法） 、 透析、 ゲル濾過、 ィ オン交換、 逆相等のカラムクロマトグラフィー、 限外濾過等の手法を単独で、 ま たは組み合わせて用いて、 ポリべプチドが精製され得る。
該酵素活性の測定は、 0 . 3 % ( v / v ) のジメチルスルホキシドを含む 1 0 O mMリン酸緩衝液 （p H 6 . 5 ) に、 基質 2—クロロー 1一 （3， —クロロフ ェニル） エタノン lmM、 補酵素 NADPH0. 25 mMおよび酵素を添加し、 30°Cで波長 340 nmの吸光度の減少を測定することにより行い得る。
本発明のポリペプチドとしては、 例えば、 以下の （1) から （4) の理化学的 性質を有するポリぺプチドを挙げることができる。
(1) 作用： NADPHまたは NADHを補酵素として、 2—クロ口一 1 _ (3 ' 一クロ口フエニル） エタノンに作用し、 （R) — 2—クロ口一 1一 （3， 一ク ロロフエニル） エタノーノレを生成する、
(2) 作用至適 pH : 5. 0から 6. 0、
(3) 作用至適温度： 40°Cから 50°C、
(4) 分子量：ゲル濾過分析において約 40000、 SDSポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動分析において約 30000。
また、 本発明のポリぺプチドとして、 例えば、 （ a ) 配列表の配列番号 1に示 したアミノ酸配列からなるポリペプチド、 または、 （b) 配列表の配列番号 1に 示したアミノ酸配列、 または、 配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列中に少 なくとも 1つのアミノ酸の置換、 揷入、 欠失または付加を有するアミノ酸配列を 含み、 かつ、 2—クロ口一 1一 （3， 一クロ口フエニル） エタノンを不斉的に還 元して （R) — 2—クロ口一 1— (3， 一クロ口フエニル） エタノールを生成す る活性を有するポリぺプチドを挙げることができる。
配列表の配列番号 1に示したァミノ酸配列中に少なくとも 1つのァミノ酸の置 換、 揷入、 欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、 Curren t Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. , 1989) 等 tこ 記載の公知の方法に準じて調製することができ、 2—クロ口一 1一 （3， 一クロ 口フエニル） エタノンを不斉的に還元して （R) — 2_クロ口一 1— (3， ーク ロロフエニル） エタノールを生成する活性を有する限り、 本発明のポリペプチド に包含される。
本発明のポリヌクレオチドとしては、 上記ポリペプチドをコードするポリヌク レオチドであればいずれも用いることができるが、 例えば、 （c) 配列表の配列 番号 2に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド、 または、 （d) 配列表の配 列番号 2に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス ト リンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ、 2—クロロー 1— ( 3， ーク ロロフエニル） エタノンを不斉的に還元して （R ) — 2—クロ口一 1— ( 3， 一 クロロフエニル） エタノールを生成する活性を有するポリべプチドをコ一ドする ポリヌクレオチドを挙げることができる。
配列表の配列番号 2に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレ ォチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドとは、 配列表の配列番号 2に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオ チドをプローブとして、 コロニー 'ハイブリダィゼーシヨン法、 プラーク 'ハイ ブリダィゼーション法、 あるいはサザンハイブリダィゼーシヨン法等を用いるこ とにより得られるポリヌクレオチドを意味する。 具体的には、 コロニーあるいは プラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、 0 . 7〜1 . O MのN a C l存在下、 6 5 °Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0 . 1 ~ 2倍濃度の S S C溶液 （1倍濃度の S S C溶液の組成は、 1 5 0 mM塩化ナトリ ゥム、 1 5 mMクェン酸ナトリウムよりなる） を用い、 6 5 °Cの条件下でフィル ターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。 なお、 ノヽイブリタィゼ一ンヨンは、 Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 等に 己載さ れている方法に準じて行うことができる。
ハイプリダイズ可能なポリヌクレオチドとして、 具体的には、 配列番号 2に示 されるポリヌクレオチドと、 配列同一性が 6 0 %以上、 好ましくは 8 0 °/0以上、 より好ましくは 9 0 %以上、 さらに好ましくは 9 5 %以上、 最も好ましくは 9 9 %以上のポリヌクレオチドをあげることができ、 コードされるポリペプチドが 2 一クロ口一 1一 （3， 一クロ口フエニル） エタノンを不斉的に還元して （R ) ― 2 _クロロ一 1ー （3， 一クロ口フエニル） エタノールを生成する活性を有する 限り、 本発明のポリヌクレオチドに包含される。
ここで、 「配列の同一性 （％) 」 とは、 対比される 2つのポリヌクレオチドを 最適に整列させ、 核酸塩基 (例えば、 A、 T、 C、 G、 U、 または I )が両方の配 列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、 そして、 この結果に 1 0 0を乗じ た数値で表される。 配列同一性は、 例えば、 以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る ： Unix ベースの GCG Wisconsin Package (Program Manual for the Wisconsin Packag e、 Version8、 1994年 9月、 Genetics Computer Group 575 Science Drive M adison, Wisconsin, USA53711 ； Rice, P. ( 1996) Program Manual for EGCG Pa ckage、 Peter Rice、 The Sanger Centre^ Hinxton Hal l、 Cambridge^ CB10 1R Q、 England) 、 および、 the ExPASy World Wide Web 分子生物学用サーバ一 （G eneva University Hospital and University of Geneva^ Geneva^ Switzerlan a) 。
本発明のポリヌクレオチドは、 2—クロ口一 1— ( 3 ， 一クロ口フエ二ノレ） ェ タノンを不斉的に還元して （R ) — 2—クロ口一 1— ( 3， 一クロ口フエニル） エタノールを生成する活性を有する微生物より取得することができる。 該微生物 として、 例えばロドトルーラ （Rhodotorula) 属酵母が挙げられ、 特に好ましい ものとしては口 ドトノレーラ · グノレチニス · ノ ー · ダイレネンシス （Rhodotorula glutinis var. dairenensis) I F O 0 4 1 5株を挙けること力 Sできる。
以下に、 2—クロ口一 1一 （3， 一クロ口フエニル） エタノンを不斉的に還元 して （R ) — 2—クロロー 1 一 （ 3 ， 一クロ口フエニル） エタノールを生成する 活性を有する微生物より、 本発明のポリヌクレオチドを取得する方法の例を記載 するが、 本発明はこれに限定されない。
まず、 精製した前記ポリペプチド、 および該ポリペプチドを適当なエンドぺプ チダーゼで消化することにより得られるペプチド断片の部分アミノ酸配列を、 ェ ドマン法により決定する。 そして、 このアミノ酸配列情報をもとにヌクレオチド プライマーを合成する。 次に、 本発明のポリヌクレオチドの起源となる微生物よ り、 通常の D N A単離法、 例えば、 Current Protocols in Molecular Biology (John Wi ley and Sons, Inc. , 1989) 等に記載の方法により、 該微生物の染色 体 D N Aを調製する。
この染色体 D N Aを铸型として、 先述のヌクレオチドプライマーを用いて P C R (polymerase chain reaction) を行い、 該ポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドの一部を増幅する。 ここで増幅されたポリヌクレオチドの塩基配列は、 ジデォキシ■シークェンス法、 ジデォキシ ·チェイン 'タ一ミネイション法など により決定することができる。 例えば、 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequ encing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer社製） および ABI 373A DNA Seqen cer (Perkin Elmer社製） を用いて行われ得る。
該ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの一部の塩基配列が明らかにな れば、 例えば、 i—PCR法 （Nucl. Acids Res.16， 8186 (1988)) によりその 全体の塩基配列を決定することができる。 また、 染色体 DN A上の該ポリヌクレ ォチドがイントロンを含むものであった場合は、 例えば、 以下の方法によりイン ト口ンを含まない成熟型のポリヌクレオチドの塩基配列を決定する事ができる。 即ち、 まず、 該ポリヌクレオチドの起源となる微生物より、 通常のヌクレオチド 単離法、 例 ：は、 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley an d Sons, Inc. , 1989) 等に記載の方法により、 該微生物の mR N Aを調製する。 次に、 この mRNAを铸型とし、 先に判明している該ポリヌクレオチドの 5 ' 末 端および 3' 末端付近の配列を有するヌクレオチドプライマーを用いて、 RT— P CR法 （Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85， 8998 (1988)) により成熟型のポ リヌクレオチドを増幅し、 その塩基配列を先と同様に決定する。
本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物内に導入し、 それをその導入された宿 主微生物内で発現させるために用いられるベクターとしては、 適当な宿主微生物 内で該ポリヌクレオチド中の遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いら れ得る。 このようなベクターとしては、 例えば、 プラスミ ドベクター、 ファージ ベクター、 コスミ ドベクターから選ばれるものが挙げられる。 また、 他の宿主株 との間で遺伝子交換が可能なシャ トルべクタ一であってもよい。
このようなベクターは、 通常、 1 a c UV 5プロモーター、 t r pプロモータ 一、 t r cプロモーター、 t a cプロモーター、 l p pプロモータ一、 t u f B プロモーター、 r e c Aプロモーター、 p Lプロモーター等の制御因子を含み、 本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクター として好適に用いられ得る。
本願明細書で用いる用語 「制御因子」 は、 機能的プロモーター、 および、 任意 の関連する転写要素（例えば、 ェンハンサー、 CCAATボックス、 TATAボ ッタス、 S P I部位など）を有する塩基配列をいう。 本願明細書で用いる用語 「作動可能に連結」 は、 該ポリヌクレオチド中の遺伝 子が発現するように、 ポリヌクレオチドが、 その発現を調節するプロモーター、 ェンハンサ一等の種々の調節エレメントと宿主細胞中で作動し得る状態で連結さ れることをいう。 制御因子のタイプおよび種類が、 宿主細胞に応じて変わり得る ことは、 当業者に周知の事項である。
本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入する宿主細胞として は、 細菌、 酵母、 糸状菌、 植物細胞、 動物細胞などがあげられるが、 大腸菌が特 に好ましい。 本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、 常法により 宿主細胞に導入され得る。 宿主細胞として大腸菌を用いる場合、 例えば塩化カル シゥム法により、 本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入する ことができる。
本発明のポリペプチドを用いて 2—クロ口一 1— ( 3， 一クロ口フエニル） ェ タノンを不斉的に還元して （R ) —2—クロ口一 1— ( 3， 一クロ口フエニル） エタノールを生産する場合、 N AD P H、 N A D H等の補酵素が必要となる。 し かし、 酸化された該補酵素を還元型に変換する能力 （以後、 補酵素再生能と呼ぶ ) を有する酵素をその基質とともに反応系に添加することにより、 つまり補酵素 再生系を本発明のポリべプチドと組み合わせて反応を行うことにより、 高価な補 酵素の使用量を大幅に削減することができる。
補酵素再生能を有する酵素としては、 例えば、 ヒ ドロゲナ一ゼ、 ギ酸脱水素酵 素、 アルコール脱水素酵素、 アルデヒド脱水素酵素、 グルコース— 6 —リン酸脱 水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを用いることが出来る。 好適には、 グ ルコース脱水素酵素が用いられる。
上記の補酵素再生能を有する酵素を、 不斉還元反応系に別途添加することによ つても当該反応が行われ得るが、 本発明のポリヌクレオチド、 および補酵素再生 能を有するポリべプチドをコードするポリヌクレオチドの両者により形質転換せ しめられた形質転換体を触媒として用いた場合、 補酵素再生能を有する酵素を別 に調製し反応系に添加することなしに、 該反応を効率良く実施し得る。
このような形質転換体は、 本発明のポリヌクレオチド、 および捕酵素再生能を 有するポリペプチド （例えば、 グルコース脱水素酵素） をコードするポリヌクレ ォチドを、 同一のベクターに組み込み、 これを宿主細胞に導入することにより得 られる他、 これら 2種のポリヌクレオチドを不和合性グループの異なる 2種のベ クタ一にそれぞれ組み込み、 それら 2種のベクターを同一の宿主細胞に導入する ことによっても得られる。
なお、 上述のように、 本発明の発現ベクターは、 上記ポリヌクレオチドを含む ものである。 好ましくはプラスミ ド p NTRGである発現ベクターが挙げられる。 また、 当該発現ベクターは、 上記グルコース脱水素酵素活性を有するポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むものも挙げられる。 なお、 上記 グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドが、 バシラス 'メガテリゥム （ Bacillus megaterium) 由来のグルコース脱水素酵素であることが好ましい。 よ り好ましくは、 プラスミ ド p NTRGG 1である発現ベクターが挙げられる。 本発明の形質転換体は、 上記発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得 られたものである。 宿主細胞としては、 大腸菌が好ましい。
また、 本発明の形質転換体として、
E. c o l i HB 101 (p NTRG) は、 FERM B P— 7857の受託 番号で、 平成 14年 1月 22日付で、
E. c o l i HB 101 (pNTRGG 1) は、 FERM BP— 7858の 受託番号で、 平成 14年 1月 22日付で、
それぞれ、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、 ブダペスト条約に基づいて国際寄 託されている。
形質転換体中の補酵素再生能を有する酵素の活性は、 常法により測定すること ができる。 例えば、 グルコース脱水素酵素活性の測定は、 1Mトリス塩酸緩衝液 (pH8. 0) に、 基質グルコース 0. 1M、 補酵素 NAD P 2 mMおよび酵素 を添加し、 25°Cで波長 340 nmの吸光度の増加を測定することにより行い得 る。
本発明の形質転換体を用いた光学活性 1—フエニルエタノール誘導体または 3 ーヒ ドロキシエステル誘導体等の光学活性アルコールの生産は、 以下のように実 施され得る。 つまり、 上記形質転換体の培養物またはその処理物を、 カルボニル 基を有する化合物と反応させることにより光学活性アルコールを製造する。
具体的には、 まず、 適当な溶媒中に、 基質となるカルボ二ル基を有する化合物、
N A D P等の補酵素、 および、 該形質転換体の培養物またはその処理物等を添加 し、 p H調整下、 攪拌して反応させる。
形質転換体の培養は、 その微生物が増殖する限り、 通常の、 炭素源、 窒素源、 無機塩類、 有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて行い得る。 また、 培養温 度は好ましくは 4〜5 0 °Cである。
ここで形質転換体の処理物等とは、 例えば、 粗抽出液、 培養菌体、 凍結乾燥生 物体、 アセトン乾燥生物体、 あるいはそれらの磨砕物等を意味する。 さらにそれ らは、 ポリペプチド自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ 得る。
また、 本反応を行う際、 形質転換体として、 本発明のポリペプチドと補酵素再 生能を有する酵素 （例えば、 グルコース脱水素酵素） の両者を生産するものを用 いる場合、 反応系に補酵素再生のための基質 （例えば、 グルコース） を添加する ことにより、 補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能である。
基質となるカルボ二ル基を有する化合物としては、 例えば、 式 （3 )
Figure imgf000012_0001
(式中、 R R 2は水素原子、 ハロゲン原子、 アルコキシ基、 ニトロ基を示し、 それぞれ同一でも異なってもよい。 また、 R 3は水素原子、 ハロゲン原子、 水酸 基、 置換基を有してもよいアルキル基を示す。 ） で表される 1—フエニルェタノ ン誘導体、 または、 一般式 （7 )
Figure imgf000012_0002
(式中、 R 4は水素原子、 ハロゲン原子、 アジド、 ベンジロキシ基、 置換基を有 してもよいアルキル基を示し、 R 5はアルキル基、 フエ二ル基を示す。 ） で表さ れる 3 _ォキソエステル誘導体を挙げることができ、 より詳しくは、 例えば、 2 —クロロー 1— (3， 一クロ口フエ二ノレ） エタノン、 1— (2， 一フノレオロフェ ニル） エタノン、 または、 4—クロロアセト酢酸ェチル等を挙げることができる。 また、 上記方法により得られる光学活性アルコールとしては、 例えば式 （4)
Figure imgf000013_0001
(式中、 R R2、 および、 R3は前記と同じ） で表される光学活性 1一フエ二 ルエタノール誘導体、 または、 式 （8)
OH
Figure imgf000013_0002
(式中、 R4および R5は前記と同じ） で表される光学活性 3—ヒ ドロキシエス テル誘導体を挙げることができ、 より詳しくは、 例えば、 （R) — 2—クロロー 1— (3， 一クロ口フエ二ノレ） エタノーノレ、 (S) — 1— ( 2 ' —フノレオロフェ ニル） エタノール、 または、 （R) — 4—クロ口 _ 3—ヒ ドロキシ酪酸ェチル等 を挙げることができる。
R1, R2、 R3、 R4におけるハロゲン原子としては、 例えば、 フッ素原子、 塩素原子、 臭素原子、 ヨウ素原子が挙げられる。
R\ R2におけるアルコキシ基としては、 炭素数 1〜3のアルコキシ基であ り、 例えば、 メ トキシ基、 エトキシ基、 プロポキシ基等が挙げられる。 好ましく はメ トキシ基である。
R3、 R R 5におけるアルキル基としては、 炭素数 1 ~8のアルキル基であ り、 例えば、 メチル基、 ェチル基、 プロピル基、 へキシル基、 ォクチル基等が挙 げられる。 好ましくは炭素数 1〜 2のアルキル基である。
なお、 R3、 R4におけるアルキル基は、 置換基を有してもよく、 置換基とし ては、 例えば、 フッ素原子、 塩素原子、 臭素原子、 水酸基、 アミノ基等が挙げら れる。 反応には、 溶媒として、 水系溶媒を用いてもよいし、 水系溶媒と有機系溶媒を 混合して用いてもよい。 有機系溶媒としては、 例えば、 トルエン、 へキサン、 ジ イソプロピルエーテル、 酢酸 n—ブチル、 酢酸ェチル等が挙げられる。
反応温度は、 10°C〜70°C、 好ましくは 20〜40°Cであり、 反応時間は、 1〜100時間、 好ましくは 10〜50時間である。 また、 反応中、 反応液の p Hは、 例えば水酸化ナトリゥム水溶液、 炭酸ナトリゥム水溶液等を用いて、 4〜 10、 好ましくは 5〜 8に維持する。
さらに、 反応は、 バッチ方式あるいは連続方式で行われ得る。 バッチ方式の場 合、 反応基質は 0. 1%から 70% (w/v) の仕込み濃度で添加される。 反応で生じた光学活性アルコールは常法により精製し得る。 例えば、 反応で生 じた光学活性アルコールが （R) — 2_クロ口一 1_ (3， 一クロ口フエニル） エタノール、 （S) - 1 - (2 ' —フルオロフェニル） エタノーノレ、 または （R ) —4一クロ口一 3—ヒドロキシ酪酸ェチルである場合、 必要に応じて遠心分離、 濾過などの処理を施して反応物から菌体等の懸濁物を除去した後、 酢酸ェチル、 トルエン等の有機溶媒で抽出し、 有機溶媒を減圧下で除去する。 さらに蒸留また はクロマトグラフィ一等の処理を行うことにより、 精製され得る。
2—クロ口一 1— (3， 一クロ口フエ二ノレ） エタノン、 2_クロ口一 1— (3 ' —クロ口フエ二ノレ） エタノーノレの定量および 2—クロロー 1一 （3， 一クロ口 フエニル） エタノールの光学純度の測定は、 高速液体カラムクロマトグラフィー (カラム ：ダイセル化学工業株式会社製 C h i r a 1 c e 1 O J ( I D4. 6 mmX 25 Omm) 、 溶離液： n—へキサン/ィソプロパノール = 39/1、 流 速： 1 m 1 /m i n、 検出： 2 10 nm、 カラム温度：室温） で行い得る。
1— (2， 一フノレオロフェニル） エタノンおよび 1— (2， 一フノレオロフェニ ル） エタノールの定量は、 高速液体カラムクロマトグラフィー （カラム：ナカラ ィテスク株式会社製 CO SMO S I L 5 C 8 -MS ( I D4. 6mmX 250 mm) 、 溶離液：水/ァセトニトリル = 1 / 1、 流速： 1 m 1ノ m i n、 検出： 2 1 0 nm、 カラム温度：室温） で行い得る。
また、 1— (2， 一フルオロフェニル） エタノールの光学純度の測定は、 高速 液体カラムクロマトグラフィー （カラム ： ダイセル化学工業株式会社製 C h i r a 1 c e 1 OB ( I D 4. 6mmX 25 Omm) 、 溶離液： n—へキサンノィ ソプロパノール = 9ノ 1、 流速： 0. 5m l /m i n、 検出： 254 nm、 カラ ム温度：室温） で行い得る。
4—クロロアセト酢酸ェチルおよび 4—クロ口— 3—ヒ ドロキシ酪酸ェチルの 定量は、 ガスクロマトグラフィー （カラム：ジーエルサイエンス株式会社製 P E G- 20M Ch r omo s o r b WAW DMC S 10% 80/100 me s h ( I D 3 mmX 1 m) 、 カラム温度： 1 50°C、 検出： F I D) で行い 得る。
また、 4一クロ口一 3—ヒ ドロキシ酪酸ェチルの光学純度の測定は、 高速液体 カラムクロマトグラフィー （カラム：ダイセル化学工業株式会社製 C h i r a 1 e e l OB ( I D 4. 6 mmX 25 Omm) 、 溶離液： n—へキサン Zィソプ ロパノール =9Zl、 流速： 0. 8m 1 /m i n、 検出： 215 nm、 カラム温 度：室温） で行い得る。
以上のように、 本発明に従えば、 本発明のポリぺフチドの効率的生産が可能で あり、 それを利用することにより、 種々の有用な光学活性アルコールの優れた製 造法が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のポリヌクレオチド配列および推定ァミノ酸配列を示す図であ る。
図 2は、 組換えプラスミ ド p NTRGG 1の作製方法および構造を示す図であ る。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例で本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらにより限定される ものではない。
なお、 以下の実施例において用いた組換え D N A技術に関する詳細な操作方法 などは、 次の成書に記載されている。 Molecular Cloning 2nd Edition (Cold S pring Harbor Laboratory Press, 1989) 、 Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience) 実施例 1 酵素の精製
以下の方法に従って、 口ドトル—ラ ■グルチニス ·バー ·ダイレネンシス （Rh odotorula glutinis var. dairenensis) I FO04 1 5株より 2—クロロー 1 ― (3 ' —クロ口フエ-ル） エタノンを不斉的に還元して （R) —2—クロロー 1一 （3' —クロ口フエニル） エタノールを生成する活性を有する酵素を単一に 精製した。 特に断りのない限り、 精製操作は 4°Cで行った。
(口 ドトノレーラ · グノレチニス · ノくー ·ダイレネンシス （Rhodotorula glutinis var. dairenensis) I F O 04 1 5株の培養）
30 Lジャーフアーメンター （丸菱バイオェンジ社製） に下記の組成からなる 液体培地 18 Lを調製し、 1 20°Cで 20分間蒸気殺菌をおこなった。
培地組成 （％は （w/v) で表示） ：
グノレコース 4. 0%
ィース トエキス 0. 3%
KH2 P O4 0. 7%
(NH4) 2HP04 1. 3 %
N a C 1 0. 1 %
Mg S04 · 7 H2O 0. 08 %
Z n S O4 · 7 H20 0. 006 %
F e S 04 · 7 H2O 0. 009 %
C u S 04 · 5 H2O 0. 0005 %
Mn S 04 · 4〜 6 H20 0. 001 %
アデ力ノール LG— 1 09 (日本油脂製） 0. 0 1%
水道水 pH7. 0
この培地に、予め同培地にて前培養しておいた口ドトルーラ .グルチニス ·バ 一 ·ダイレネンシス (Rhodotorula glutinis var. dairenensis) I FO04 1 5株の培養液を 180m lずつ接種し、攪拌回転数 250 r p m、 通気量 5. 0 NL/m i n, 30°Cで、 30% (w/w) 水酸化ナトリウム水溶液の滴下によ り下限 pHを 5. 5に調整しながら培養した。 培養開始から 18時間後、 22時 間後、 26時間後に 55% (w/w) グルコース水溶液 655 gを添加し、 30 時間培養を行った。
(無細胞抽出液の調整）
上記の培養液 5600m lから遠心分離により菌体を集め、 1 00 Om 1の 1 O OmMリン酸緩衝液 （pH8. 2) にて菌体を洗浄した。 このようにして， 該 菌株の湿菌体 1 599 gを得た。 この湿菌体を 100 mMリン酸緩衝液 （ p H 8. 2) に懸濁し、 2000m lの菌体懸濁液を得た。 この菌体懸濁液をダイノミル (Willy A. Bachofen社製） で破砕した後、 破砕物から遠心分離にて菌体残渣を 除き、無細胞抽出液 147 Om 1を得た。
(硫酸アンモニゥム分画）
上記で得た無細胞抽出液に 45%飽和となるように硫酸アンモニゥムを添加、 溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除去した （この際、 無細胞抽出液の pHを アンモニア水で pH 7. 5に維持しながら行った） 。 先と同様 pH7. 5を維持 しながら、 この遠心上清に 60%飽和となるようさらに硫酸アンモニゥムを添加、 溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。 この沈殿を 1 OmMリン酸緩衝液 (pH 7. 5) に溶解し、 同一緩衝液で 1夜透析した。
(DEAE— TOYOPEARLカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、 1 OmMリン酸緩衝液 （pH7. 5) で予め平衡 化した DEAE— TOYOPEARL 65 OM (東ソ一株式会社製） カラム （ 2 50m l ) に供し、酵素を吸着させた。 同一緩衝液でカラムを洗净した後、 N a C 1のリニアグラジェント （OMから 0. 3Mまで） により活性画分を溶出 させた。 活性画分を集め、 1 OmMリン酸緩衝液 （pH7. 5) にて 1夜透析を 行った。
(P h e n y 1—TOYOPEARLカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液に終濃度 1Mとなるよう硫酸アンモニゥムを溶解し （ この際粗酵素液の pHをアンモニア水で pH 7. 5に維持しながら行った） 、 1 Mの硫酸アンモニゥムを含む 1 OmMリン酸緩衝液 （pH7. 5) で予め平衡化 した Ph e n y l— TOYOPEARL 65 OM (東ソ一株式会社製） カラム (100m l ) に供し、酵素を吸着させた。 同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 硫酸アンモニゥムのリニアグラジェント （1Mから 0Mまで） により活性画分を 溶出させた。 活性画分を集め、 1 OmMリン酸緩衝液 （pH 7. 5) にて 1夜透 析を行った。
(B l u e s e p h a r o s eカラムクロマトグラフィー)
上記で得られた粗酵素液を、 1 OmMリン酸緩衝液 （pH7. 5) で予め平衡 ィ匕し 7こ B l u e s e p h a r o s e CL—り B h a rma c i a B i o t e c h社製） カラム （20m l ) に供し、酵素を吸着させた。 同一緩衝液で力 ラムを洗浄した後、 N a C 1のリニアグラジェント （0Mから 1Mまで） により 活性画分を溶出させた。 活性画分を集め、 1 OmMリン酸緩衝液 （p H 7. 5) にて 1夜透析を行い、 電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。 以後、 この酵素 を RRGと呼ぶことにする。 実施例 2 酵素の性質の測定
得られた酵素の酵素学的性質について検討した。
酵素活性の測定は、 基本的には、 0. 3% (v_/v) のジメチルスルホキシド を含む 100 mMリン酸緩衝液 （pH6. 5) に、 基質 2 _クロロー 1一 （3， —クロ口フエニル） エタノン lmM、 補酵素 NADPH0. 25 mMおよび酵素 を添加し、 30°Cで 1分間反応させ、 波長 340 nmの吸光度の減少を測定する ことにより行った。
( 1 ) 作用 ：
NAD PHを補酵素として、 2—クロ口一 1— (3， 一クロ口フエニル） エタ ノンに作用し、光学純度 99. 9%e e以上の （R) — 2_クロ口一 1— (3 ' —クロ口フエニル） エタノールを生成した。 NAD Hを補酵素として上記方法に 準じて酵素活性を測定した場合、 NAD PHを補酵素とした場合の約 7%の活性 を示した。
(2) 作用至適 pH：
緩衝液として、 ジメチルスルホキシドを含む 10 OmMリン酸緩衝液、 および 10 OmM酢酸緩衝液を用いて、 pHを 4. 0〜8. 0の範囲とした以外は、 上 記酵素活性の測定方法と同様にして、 酵素活性を測定した。 その結果、 2—クロ 口一 1一 （3， 一クロ口フエ-ル） エタノンに作用する至適 pHは 5. 0〜6. 0であった。
(3) 作用至適温度：
20°C〜 60°Cの温度とした以外は、 上記酵素活性の測定方法と同様にして、 酵素活性を測定した。 その結果、 2—クロ口一 1 _ (3' —クロロフヱ-ル） ェ タノンに作用する至適温度は 40°C〜 50°Cであった。
(4) 分子量：
溶離液として 1 50 mMの塩化ナトリウムを含む 50 mMリン酸緩衝液 （ p H 7. 0) を用い、 Su p e r d e x 200 HR 10/30 (アマシャム フアルマシア バイオテク社製） による精製酵素のゲル濾過クロマトグラフィー 分析を行った結果、 標準タンパク質との相対保持時間から算出した本酵素の分子 量は約 40000であった。 また、 酵素のサブユニットの分子量は、 SDS—ポ リアクリルアミ ドゲル電気泳動分析により、標準タンパク質との相対移動度から 算出した。 本酵素のサブユニッ トの分子量は約 30000であった。 実施例 3 RRG遺伝子のクローユング
(P CRプライマーの作成）
実施例 1で得られた精製 R R Gを 8 M尿素存在下で変性した後、 ァクロモバク ター由来のリシルエンドぺプチダ一ゼ （和光純薬工業株式会社製） で消化し、 得 られたぺプチド断片のアミノ酸配列を A B I 492型プロテインシーケンサー （ パーキンエルマ一社製） により決定した。 このアミノ酸配列をもとに、 DNAプ ライマー 2種 （プライマー 1、 配列番号 3 ；プライマー 2、 配列番号 4) を常法 に従って合成した。
(PCRによる RRG遺伝子の増幅）
口 ドトノレーラ · グノレチニス · ノく— ·ダイレネンシス (Rhodotorula glutinis var. dairenensis) I FO041 5株の培養菌体から V i s s e r等の方法 （A ppl. Microbiol. Biotechnol. , 53, 415(2000)) に従って染色体 DNAを抽出 した。 次に、 上記で調製した DNAプライマーを用い、 得られた染色体 DN Aを 铸型として PCRを行ったところ、 RRG遺伝子の一部と考えられる約 600 b pの DNA断片が増幅された （PCRは、 DNAポリメラーゼとして T a K a R a E x T a q (宝酒造株式会社製） を用いて行い、 反応条件はその取り扱い 説明書に従った。 ） 。 この DNA断片を、 プラスミ ド p T 7 B 1 u e T— Ve c t o r (No v a g e n社製） にクローニングし、 AB I PR I SM Dy e T e rm i n a t o r Cy c l e s e q u e n c i n g Re a d y R e a c t i o n K i t (P e r k i n E 1 m e r社製） および A B I 3 73 A DNA S e q u e n c e r (P e r k i n E l me r社製） を用レヽ てその塩基配列を確認した。
( i一 PCR法による RRG遺伝子の全長配列の決定）
口 ドトルーラ ·グルチニス ·ノ ー ·ダイレネンシス （Rhodotorula glutinis var. dairenensis) I F O 04 1 5株の染色体 D N Aを制限酵素 S p h Iで完 全消化し、 得られた DNA断片の混合物を T 4リガーゼにより分子内環化させた。 これを铸型として用い、 前項で判明した RRG遺伝子の部分塩基配列情報をもと に、 i—PCR法 （Nucl. Acids Res.16， 8186 (1988) ) により、 染色体 DNA上 の RRG遺伝子の全塩基配列を決定した （PCRは、 T a Ka Ra LA PC R K i t V e r . 2 (宝酒造株式会社製） を用いて行い、 反応条件はその取 り扱い説明書に従った。 また、 塩基配列の決定は先と同様に行った。 ） 。 その塩 基配列を、 配列表の配列番号 9および図 1に示した。 なお、 図 1において、 塩基 配列中で RRG遺伝子をコードしているのは下線を付した部分と考えられ、 それ 以外の部分はィントロンと考えられた。 下線を付した塩基配列がコードするアミ ノ酸配列を塩基配列の下段に示した。 このアミノ酸配列と、 精製 RRGのリジル ェンドぺプチダーゼ消化断片の部分ァミノ酸配列を比較した結果、 精製 R R Gの 部分アミノ酸配列は全て、 このアミノ酸配列中に存在した。 図 1中のアミノ酸配 列において、 精製 RRGの部分アミノ酸配列と一致した部分には下線を付した。 実施例 4 イントロンを含まない RRG遺伝子の取得
実施例 3で決定された塩基配列を基に、 RRG遺伝子の開始コドン部分に Nd e I部位を付加した N末端 DNAプライマー （プライマー 3、 配列番号 5) 、 お よび同遺伝子の 3， 末端の直後に終止コドン （T AA) と E c o R I部位を付加 した C末端 DNAプライマー （プライマー 4、 配列番号 6) を合成した。 次に、 口 卜ノレーラ · ク、-ノレチニス · ノくー ·タ、、ィレネンシス (Rhodotorula glutinis va r. dairenensis) I F O 04 15株の培養菌体から、 同菌株の総 RNAを RNe a s y Ma x i K i t (Q I AGEN社製） を用いて抽出、 精製した。 この RNAを踌型として、 先に調製した 2種の DNAをプライマーとして用い、 RT — PCR法 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85， 8998 (1988)) により、 開始 コ ドン部分に N d e I部位を付加し 3 ' 末端の直後に終止コ ドン （TAA) と E c o R I切断点を付加したイントロンを含まない成熟型の RRG遺伝子を増幅し た （RT— P CRは H i g h F i d e l i t y RNA PCR K i t (宝 酒造株式会社製） を用いて行い、 反応条件はその取り扱い説明書に従った。 ） 。 実施例 5 RRG遺伝子を含む組換えプラスミ ドの作製
実施例 4で得られた DNA断片を N d e Iおよび E c o R Iで消化し、 プラス ミ ド p UCNT (WO 94 0361 3) の l a cプロモーターの下流の N d e I、 E c o R I部位に挿入することにより、 組換えプラスミ ド pNTRGを得た。 実施例 6 RR G遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を含む組換え プラスミ ドの作製
バシラス .メガテリゥム （Bacillus megaterium) I AMI 030株由来のグ ルコース脱水素酵素 （以後、 GDHと称する） の遺伝子の開始コドンから 5塩基 上流に大腸菌の Shaine- Dalgarno配列 （9塩基） を、 さらにその直前に S a c I 切断点を、 また、 終止コドンの直後に B a mH I切断点を付加した二本鎖 D N A を、 以下の方法により取得した。 GDH遺伝子の塩基配列情報を基に、 GDHの 構造遺伝子の開始コドンから 5塩基上流に大腸菌の Shaine-Dalgarno配列 （ 9塩 基） を、 さらにその直前に E c o R I切断点を付加した N末端 DN Aプライマー (プライマー 5、 配列番号 7) と、 GDHの構造遺伝子の終始コドンの直後に S a 1 I部位を付加した C末端 DNAプライマー （プライマー 6、 配列番号 8) を 常法に従って合成した。 これら 2つの DNAプライマーを用い、 プラスミ ド pG DK 1 (Eu r. J . B i o c h em. 1 86, 389 (1 989) ) を铸型と して P CRにより二本鎖 DNAを合成した。 得られた DNA断片を E c o R Iお よび S a 1 Iで消化し、 実施例 5において構築した pNTRGの E c o R I、 S a 1 I部位 （RRG遺伝子の下流に存在する） に挿入した組換えプラスミ ド pN TRGG 1を得た。 p NT RGG 1の作製方法および構造を図 2に示す。 実施例 7 組換え大腸菌の作製
実施例 5および 6で得た組換えプラスミ ド pNTRGおよび pNTRGG lを 用いて、 大腸菌 HB 101 (宝酒造株式会社製） を形質転換し、 組換え大腸菌 H B 101 (pNTRG) および HB 101 (pNTRGG l) を得た。 こうして 得られた形質転換体 E. c o l i HB 101 (pNTRG) および E. c o l i HB 101 ( NTRGG l) は、 それぞれ、 受託番号 FERM BP— 7 857ぉょびFERM BP— 7858として、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター に、 平成 14年 1月 22日付で寄託した。 実施例 8 組換え大腸菌における RRGの発現
実施例 7で得た組換え大腸菌 HB 10 1 (p NTRG) を l Z O/i g/m lの アンピシリンを含む 2 XYT 培地で培養し、 集菌後、 l O OmMリン酸緩衝液 （ pH6. 5) に懸濁し、 UH— 50型超音波ホモゲナイザー （SMT社製） を用 いて破砕し、 無細胞抽出液を得た。 この無細胞抽出液の RRG活性を以下のよう に測定した。 RRG活性の測定は、 0. 3% (vZv) のジメチルスルホキシド を含む 10 OmMリン酸緩衝液 （pH6. 5) に、 基質 2—クロ口— 1一 （3' —クロ口フエニル） エタノン lmM、 補酵素 NADPH0. 25mMおよび酵素 を添加し、 30°Cで波長 340 nmの吸光度の減少を測定することにより行った。 この反応条件において、 1分間に Ι μπιο 1の NAD ΡΗを NAD Ρに酸化する 酵素活性を 1 u n i tと定義した。 この様に測定した無細胞抽出液中の RRG活 性を比活性として表し、 ベクタープラスミ ドを保持する形質転換体と比較した。 また、 実施例 1と同様の方法で調製した口ドトルーラ ■ グルチニス ·バー ·ダイ レネンシス (Rhodotorula glutinis var. dairenensis) I FO041 5株の無 細胞抽出液中の RRG活性についても同様に比較した。 それらの結果を表 1に示 す。 大腸菌 HB 101 (pNTRG) では、 ベクタープラスミ ドのみの形質転換 体である大腸菌 HB 10 1 (pUCNT) と比較して明らかな RRG活性の増加 が見られ、 ロドトメレーラ ·グノレチニス · ノ ー ·ダイレネンシス （Rhodotorula g lutinis var. dairenensis) I FO 04 1 5株と比較して、 比活性は約 1 50倍 に達した。
Figure imgf000023_0001
実施例 9 組換え大腸菌における RRGおよび GDHの同時発現
実施例 7で得た組換え大腸菌 HB 10 1 (pNTRGG 1) を、 実施例 8と同 様に処理して得られる無細胞抽出液の GDH活性を、 以下のように測定した。 G D H活性の測定は、 1 Mトリス塩酸緩衝液 （ p H 8. 0) に、 基質グルコース 0 - 1M、 補酵素 NAD P 2 mMおよび酵素を添加し、 25 °Cで波長 340 n mの吸 光度の増加を測定することにより行った。 この反応条件において、 1分間に 1 μ mo 1の NADPを NADPHに還元する酵素活性を 1 u n i tと定義した。 ま た、 RRG活性についても実施例 8と同様に測定した。 このように測定した無細 胞抽出液中の RRGおよび GDH活性を比活性として表し、 大腸菌 HB 101 ( p NTRG) およびベクタープラスミ ドのみの形質転換体 HB 101 (pUC NT) と比較した結果を表 2に示す。 大腸菌 HB 101 (pNTRGG 1) では、 ベクタープラスミ ドのみの形質転換体である大腸菌 HB 101 (pUCNT) と 比較して、 明らかな RRGおよび GDH活性の増加が見られた。
表 2
困 RRG比活性 （U/mg) ! GDH比活性 （U/mg)
£ coli HB101 (pUCNT) <0.01 ！ ぐ 0.01
£ coli HB101 (pNTRG) 12.4 i <0.01
£ coli HB101 (pNTRGG!) 7.56 ！ 128 実施例 10 RRG遺伝子を導入した組換え大腸菌による 2—クロロー 1_ (3 ' —クロ口フエ二ノレ） エタノン力 らの （R) _2_クロ口一 1一 （3， 一クロ口 フエ二ノレ） エタノーノレの合成
実施例 8で得られた組換え大腸菌 HB 101 (pNTRG) の培養液を、 SO N I F I RE 250 (BR AN SON社製） を用いて超音波破砕した。 この菌体 破砕液 2 Om 1にグルコース脱水素酵素 （天野製薬株式会社製） 2000U、 グ ノレコース 3 g、 NADP 2mg、 2—クロ口一 1 _ (3， 一クロ口フエ二ノレ） エタノン 2 gを添加した。 この反応液を、 5Mの水酸化ナトリウムの添加により pH6. 5に調整しつつ、 30°Cで 18時間攪拌した。 反応終了後、 この反応液 をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、 抽出物の分析を行ったところ、収率 96%で 2—クロロー 1— (3， 一クロ口フエニル） エタノールが得られた。 この際、 生 成した 2—クロ口一 1— (3， 一クロ口フエニル） エタノールは光学純度 99. 9 % e eの R体であった。
2—クロ口一 1— (3， 一クロ口フエ二ノレ） エタノン、 2—クロ口一 1一 （3 ' —クロ口フエ二ノレ） エタノーノレの定量、 および 2—クロ口一 1— (3' —クロ 口フエニル） エタノールの光学純度の測定は、 高速液体カラムクロマトグラフィ 一 （カラム：ダイセル化学工業株式会社製 C h i r a 1 c e 1 O J ( I D4. 6mmX 25 Omm) 、 溶離液： n—へキサン/ィソプロパノール = 39/1、 流速： 1m l /m i n、 検出： 2 10 nm、 カラム温度：室温 ） で行った。 実施例 1 1 RRGおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌 による 2—クロ口一 1— (3， 一クロ口フエニル） エタノンからの （R) - 2 - クロ口一 1— (3， 一クロ口フエ二ノレ） エタノーノレの合成
実施例 9で得られた組換え大腸菌 HB 101 (p NTRGG 1) の培養液を、 SON I F I RE 250 (BRAN SON社製） を用いて超音波破砕した。 この 菌体破砕液 2 Om 1にグルコース 3 g、 NADP 2mg、 2—クロ口一 1一 （ 3 ' ークロロフヱニル） エタノン 2 gを添加した。 この反応液を、 5 Mの水酸化 ナトリウムの滴下により PH6. 5に調整しつつ、 30°Cで 24時間攪拌した。 反応終了後、 この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、 抽出物の分析を実 施例 10と同様に行ったところ、収率 93%で 2—クロ口一 1— (3' —クロ口 フエエル） エタノールが得られた。 この際、 生成した 2—クロ口一 1— (3， 一 クロ口フエニル） エタノールは光学純度 99. 9%e eの R体であった。 実施例 1 2 RRGおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌 による 4一クロロアセト酢酸ェチルからの （R) —4—クロロー 3—ヒ ドロキシ 酪酸ェチルの合成
実施例 9で得られた組換え大腸菌 H B 101 (pNTRGG 1) の培養液を、 SON I F I RE 250 (BR AN SON社製） を用いて超音波破砕した。 この 菌体破砕液 20m 1にグルコース 4 g、 NAD P 3 m gを添加した。 この反応液 を 30°Cで攪拌し、 5 Mの水酸化ナトリウムの滴下により pH6. 5に調整しつ つ、 4—クロロアセト酢酸ェチル合計 2 gを 1時間に 0. 2 gの割合で連続的に 添加した。 そして、 添加終了後さらに 12時間反応を継続した。 反応終了後、 こ の反応液を酢酸ェチルで抽出し、脱溶剤した後、 抽出物を分析したところ、収率 9 8%で 4一クロ口一 3—ヒ ドロキシ酪酸ェチルが得られた。 この際、 生成した 4 一クロロー 3—ヒ ドロキシ酪酸ェチルは光学純度 99%e e以上の R体であった。
4—クロロアセト齚酸ェチノレおよび 4—クロ口一 3—ヒ ドロキシ酪酸ェチルの 定量は、 ガスクロマトグラフィー （カラム：ジーエルサイエンス株式会社製 PE G— 20M Ch r omo s o r b WAW DMC S 10% 80/100 me s h ( I D 3 mm X 1 m) 、 カラム温度： 1 50 °C、 検出： F I D ) で行 つた。 また、 4—クロ口一 3—ヒドロキシ酪酸ェチルの光学純度の測定は、 高速 液体カラムクロマトグラフィー （カラム：ダイセル化学工業株式会社製 Ch i r a 1 c e 1 OB ( I D 4. 6 mmX 250mm) 、 溶離液： n—へキサン/ィ ソプロパノール = 9/1、 流速： 0. 8m 1 /m i n、 検出： 21 5 nm、 カラ ム温度：室温 ） で行った。 実施例 1 3 RRGおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌 による 1— (2' —フルオロフェニル） _エタノンからの （S) —1— (2 ' ーフ /レオ口フエニル） エタノールの合成
実施例 9で得られた組換え大腸菌 HB 101 (pNTRGG 1) の培養液を、 SON I F I RE250 (BRAN SON社製） を用いて超音波破砕した。 この 菌体破砕液 10 Om 1にグルコース 1 5 g、 1 - ( 2 ' —フルオロフェニル） ェ タノン 5 g、 NADP 1 5mgを添加した。 この反応液を、 5 Mの水酸化ナトリ ゥムで pH6. 5に調整しつつ、 30°Cで 24時間攪拌した。 反応終了後、 この 反応液を酢酸ェチルで抽出し、脱溶剤した後、 抽出物を蒸留 （54°C/lmmH g) し、 無色オイル状の 1— (2' —フルオロフェニル） エタノール 4. l gを 得た。 その比旋光度は [α] (25、 D) -45. 3 (c =0. 794, メタノ ール） を示し、 光学純度 99. 9%e eの S体であった。
1 H-NMR (CDC 1 3) δ p p m 1. 52 (d， 3 H) ， 1. 97 (b r， 1 H) , 5. 20 ( q , 1 H) , 6. 9 9〜7. 5 1 (m, 4 H)
1 - (2 ' —フルオロフェニル） エタノンおよび 1— (2' —フノレオロフェニ ル） エタノールの定量は、 高速液体カラムクロマトグラフィー （カラム：ナカラ ィテスタ株式会社製 CO SMO S I L 5 C 8 -MS ( I D 4. 6mmX 250 mm) 、 溶離液：水/ァセトニトリル = 1 1、 流速： 1 m 1 Zm i n、 検出： 2 10 nm、 カラム温度：室温 ） で行った。 また、 1ー （2， 一フルオロフェ ニル） エタノールの光学純度の測定は、 高速液体カラムクロマトグラフィー （力 ラム：ダイセル化学工業株式会社製 C h i r a 1 c e 1 OB ( I D4. 6mm X 250mm) 、 溶離液： n—へキサン ィソプロパノール = 9/1、 流速： 0. 5m 1 /m i n、 検出： 254 nm、 カラム温度：室温） で行った。 実施例 14 RRGの基質特異性
R R Gの種々のカルボニル化合物に対する還元活性を調べた。 実施例 2の R R G活性測定の基本反応条件において、 2—クロロー 1— (3， —クロ口フエニル ) エタノンのかわりに、 表 3に示す各種カルボニル化合物を基質として活性測定 を行った。 測定結果は、 2—クロロー 1— (3， 一クロ口フエニル） エタノンを 基質としたときの還元活性を 100%とした時の相対値で表し、 表 3に示した。 3
Figure imgf000027_0001
産業上の利用可能性
2—クロロー 1一 （3 ' —クロ口フエニル） エタノンを不斉的に還元して （R ) — 2—クロ口 _ 1一 （3 ' —クロ口フエニル） エタノールを生成する活性を有 するポリべプチド遺伝子のクローニング、 およびそのヌクレオチド配列の解析に より、 該ポリペプチド産生能の高い形質転換体を得ることが可能になった。 また、 該ポリべプチドおよびグルコース脱水素酵素を同時に高生産する能力を有する形 質転換体をも得ることが可能になった。 さらに、 これらの形質転換体を用いるこ とにより、 種々のカルボニル化合物から光学活性アルコールを効率良く合成する ことが可能となった。

Claims

請求の範囲
1. 以下の （1) から （4) の理化学的性質を有するポリペプチド
(1) 作用 ： NAD PHまたは NADHを補酵素として、 式（1)
Figure imgf000029_0001
で表される 2—クロ口一 1— (3， 一クロ口フエニル） エタノンに作用し、 式（ 2)
Figure imgf000029_0002
で表される （R) — 2_クロ口一 1— (3， 一クロ口フエニル） エタノールを生 成する、
(2) 作用至適 pH ： 5. 0から 6. 0、
(3) 作用至適温度： 40°Cから 50°C、
(4) 分子量：ゲル濾過分析において約 40000、 SDSポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動分析において約 30000。
2. 以下の （a) または （b) のポリペプチド：
( a ) 配列表の配列番号 1に示したァミノ酸配列からなるポリぺプチド、
( b ) 配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列、 または、 配列表の配列番号 1 に示したアミノ酸配列中に少なくとも 1つのアミノ酸の置換、 挿入、 欠失または 付加を有するアミノ酸配列を含み、 かつ、 式（1)
Figure imgf000030_0001
で表される 2 _クロロー 1— (3' —クロ口フエニル） エタノンを不斉的に還元 して、 式（2)
Figure imgf000030_0002
で表される （R) _2—クロ口一： _ (3， 一クロ口フエニル） エタノールを生 成する活性を有するポリべプチド,
3. ポリペプチドがロドトルーラ （Rhodotorula) 属に属する微生物に由来す る請求の範囲第 1または 2項に記載のポリべプチド。
4. ロ ドトルーラ属に属する微生物が、 口 ドトルーラ ·グルチニス · バー■ダ イ レ ンシス (Rhodotorula glutinis var. dairenensis) I FO04 1 5株で ある請求の範囲第 3項記載のポリべプチド。
5. 請求の範囲第 1から 4項のいずれかに記載のポリぺプチドをコ一ドするポ リヌクレオチド。
6. 以下の （c) または （d) のポリヌクレオチド：
(c) 配列表の配列番号 2に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
( d ) 配列表の配列番号 2に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌ クレオチドと、 ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ、 式（1)
Figure imgf000031_0001
で表される 2 _クロ口一 1— (3， 一クロ口フエ-ル） エタノンを不斉的に還元 して、 式（2)
Figure imgf000031_0002
で表される （R) —2—クロロー 1— (3' —クロ口フエニル） エタノールを生 成する活性を有するポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド。
7. 請求の範囲第 5または 6項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
8. プラスミ ド p NT RGである請求の範囲第 7項記載の発現ベクター。
9. グルコース脱水素酵素活性を有するポリべプチドをコードするポリヌクレ ォチドをさらに含む、 請求の範囲第 7項に記載の発現ベクター。
10. 前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドが、 バシラス ·メ ガテリゥム （Bacillus megaterium) 由来のグルコース脱水素酵素である、 請求 の範囲第 9項に記載の発現べクタ一。 1 1. プラスミ ド p NT RGG 1である請求の範囲第 10項に記載の発現べク ター。
1 2. 請求の範囲第 7から 1 1項のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿 主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
1 3. 前記宿主細胞が大腸菌である請求の範囲第 12項に記載の形質転換体。
14. E. c o 1 i HB 101 (p NTRG) (F E RM B P- 7857 ) である請求の範囲第 1 3項に記載の形質転換体。
15. E. c o 1 i HB 101 (p NTRGG 1 ) (FERM BP— 78 58) である請求の範囲第 1 3項に記載の形質転換体。 16. 請求の範囲第 12から 1 5項のいずれかに記載の形質転換体の培養物ま たはその処理物を、 カルボ二ル基を有する化合物と反応させることを特徴とする 光学活性アルコールの製造方法。
7. 前記カルボ二ル基を有する化合物が、 一般式 （3)
Figure imgf000032_0001
(式中、 R1 R 2は水素原子、 ハロゲン原子、 アルコキシ基、 ニトロ基を示し、 それぞれ同一でも異なってもよい。 また、 R 3は水素原子、 ハロゲン原子、 水酸 基、 置換基を有してもよいアルキル基を示す。 ） で表される光学活性 1—フエ二 ルエタノン誘導体であり、 前記光学活性アルコールが、 一般式 （4)
Figure imgf000032_0002
(式中、 R R2、 および、 R3は前記と同じ） で表される光学活性 一フエ二 ルエタノール誘導体である請求の範囲第 16項に記載の方法。
8. 前記カルボ二ル基を有する化合物が、 式 （1)
Figure imgf000033_0001
で表される 2—クロロー 1 _ (3' —クロ口フエニル） エタノンであり、 前記光 学活性アルコールが、 式 （2)
Figure imgf000033_0002
で表される （R) —2—クロ口一 1— (3' —クロ口フエニル） エタノールであ る、 請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。 1 9. 前記カルボ二ル基を有する化合物が、 式 （5)
Figure imgf000033_0003
で表される 1— (2 一フルオロフェニル） エタノンであり、 前記光学活性アル コールが、 式 （6)
Figure imgf000033_0004
で表される （S) — 1— (2， 一フルオロフェニル） エタノールである、 請求の 範囲第 16項に記載の製造方法。
20. 前記カルボ二ル基を有する化合物が、 一般式 （7) C〇OR5
(7)
(式中、 R 4は水素原子、 ハロゲン原子、 アジド、 ベンジロキシ基、 置換基を有 してもよいアルキル基を示し、 R 5はアルキル基、 フエ二ル基を示す。 ） で表さ れる 3—ォキソエステル誘導体であり、 前記光学活性アルコールが一般式 （8)
OH
R4 COOR5
(8)
(式中、 R4および R5は前記と同じ） で表される光学活性 3—ヒ ドロキシエス テル誘導体である請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。 21. 前記カルボ二ル基を有する化合物が、 式 （9)
Figure imgf000034_0001
で表される 4—クロロアセト酢酸ェチルであり、 前記光学活性アルコールが、 式 （10)
OH
Figure imgf000034_0002
で表される （R) —4—クロロー 3—ヒ ドロキシ酪酸ェチルである請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。
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