WO2003090788A1 - Leurre destine au traitement et/ou a la prevention d'une maladie allergique associee a la cytokine th2, proteine mutante gata3 et compositions medicinales contenant celle-ci - Google Patents

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Ken-Ichi Arai
Shoichiro Miyatake
Naofumi Takemoto
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Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to decoys for treating and / or preventing Th2 cytokine-related allergic diseases, GATA3 mutant proteins, and pharmaceutical compositions containing them.
  • the present invention relates to a therapeutic and / or prophylactic agent for a Th2 cytokine-related allergic disease and a method for treating and / or preventing a Th2 cytokine-related allergic disease.
  • Th2 cytokine-related allergic diseases are one of the major health expenditures in developed countries. Globally, more than 150 million people suffer from asthma, and asthma treatments form a market of 230 billion yen per year in Japan and 760 billion yen in the United States. I have. Allergic asthma is a chronic inflammatory pulmonary disease, mainly due to airway irritability and airway obstruction due to respiratory tract inflammation.Patients are widely distributed from children to adults, and intussusception is a fatal disease. . It is thought that genetic predisposition in addition to environmental factors is involved in the form of this disease, but the detailed mechanism of the disease is still unknown.
  • the current treatments for asthma can be broadly classified into 1) xanthine derivatives that are mainly used for bronchodilation as a treatment for seizures,) 32 stimulants (including steroids), and 2) long-term management drugs.
  • Anti-allergic drugs with anti-inflammatory effects such as disodiumcromoglycate, chemical mediator release inhibitors, hissamine inhibitors, tropoxane inhibitors, leukotriene antagonists, etc.
  • a true asthma treatment should be an allergy control agent that controls the inflammatory response of the airway that is the main cause of the disease, not symptomatic treatment. There is a need to develop a new category of therapeutics that can prevent cancer.
  • GATA3 protein not only functions as a so-called transcription factor, but also plays an important role in differentiation and commitment to Th2 cells. It became clear that it was playing. Inhibitors of this process could represent a whole new class of therapeutics for all allergic diseases, including severe asthma, where steroid withdrawal is difficult.
  • Helper T cells are divided into at least two subsets, Thl and Th2, based on their pattern of cytoin production. This phenomenon was initially thought to be a special feature that was observed only on cloned T cells in //? However, it has been shown that sensitivity to parasites in mice depends on which subset is activated, and that in humans the prognosis of actual disease, such as Leprosy, can be affected. It was recognized that this is an important cell group that determines prognosis. Thl cells are It produces IFNT and Lymphotoxin and is said to be involved in cell-mediated immunity. It is important for the elimination of intracellular pathogens such as bacteria and viruses, and its inappropriate activation induces autoimmune diseases.
  • Th2 cells produce interleukin (IL) -4, 5, 13, etc., and are thought to be involved in humoral immunity and play a role in controlling parasites. These excessive activations are known to cause allergic diseases such as asthma and atopic dermatitis.
  • IL interleukin
  • Th2 cells are differentiated from naive T cells by antigen stimulation, and the cytokine IL-4 is a major cytokine for inducing differentiation of Th2 cells.
  • the binding of IL-4 to the receptor activates the downstream signaling pathway JAK / STAT, ultimately inducing the expression of the Th2 cell-specific transcription factor GATA3 protein.
  • the Th2 site force-in gene forms a cluster with human chromosome 5 (mouse chromosome 11), and the gene encoding IL-4, IL-13, and IL-5 is located in 160 kb of the q23-31 region.
  • Th2 cytokine genes has been turned “ON” simultaneously with the differentiation into existing Th2 cells, but the mechanism has not been elucidated until recently.
  • the present inventors have recently found a region in this gene cluster that controls the expression of the Th2 site force gene (Takemoto et al. Int. Immunol. 10, 1981-1985 (1998), Takemoto et al. J. Immunol. 6687-6691 (2000)).
  • This region shows good agreement with CNS-1, which is one of 15 regions (CN-1 to 15) whose nucleotide sequences are well conserved among various mammals. In animal experiments where the site was deleted, expression of IL_4,5,13 was impaired.
  • this region has a function similar to Locus Control Region (LCR), which is well studied in globin genes.
  • LCR Locus Control Region
  • the present inventors have shown that the recognition sequence of this region (CNS-1 / HSS1,2) fcGATA3 protein exists and that the GATA3 protein actually binds (Takemono et al. (2000) supra). Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a Th2 cytokine-related allergic disease, in particular, a GATA3 decoy and a GATA3 mutant protein. Further, the present invention provides a GATA3 decoy and a GATA3 mutant protein, which specifically inhibit chromatin remodeling at a site where a Th2 cytokine gene cluster required for production of a Th2 cytokine on a chromosome is present. . The present invention also provides a useful screening method for a therapeutic and / or prophylactic agent targeting the suppression of the above chromatin remodeling.
  • Th2 cells In order to induce Th2 cells in the Wro experimental system, naive T cells must be subjected to several times of antigen stimulation in the presence of IL-4. As a result of this repetitive stimulation, Th2 cells reach the final stage of differentiation, and do not change their phenotype thereafter.
  • the phenomenon called commitment of these cells is similar to the fact that leukocytes generated from the same blood stem cells never replace erythrocytes after they have differentiated.
  • Th2 cells activated in allergic diseases such as asthma are thought to have reached this final stage of differentiation, and it is impossible to change the phenotype including cytokine production of those cells. Had been.
  • the transcription factor GA TA3 protein can alter cell traits, which have been made impossible by altering the chromatin structure of the cell, produce different cytokins, and induce redifferentiation into TM.
  • the present inventors have found and reported that (Lee et al. (2000) J. Exp. Med.
  • the present inventors believe that the role of the GATA3 protein as a master regulatory regulator is involved in the structural change of chromatin associated with the commitment of naive T cells to Th2 cells. This revealed that a specific domain of the GATA3 protein was recognized by recognizing a base sequence different from the DNA sequence required for normal GATA3 protein function. I found that it could be.
  • a DNA sequence that binds when the GATA3 protein exerts its function as a master leggyle (SEQ ID NO: 3 is a mouse sense strand-side sequence, and SEQ ID NO: 6 is a human The sequence on the sense strand side is shown. For the mouse sequence, see the sequence of HSS2 in the upper part of Fig. 1). The binding of this sequence to the GATA3 protein was determined by the IL-5 gene and the TCRo! Gene. It was clarified that the GATA3 protein had a binding mode different from that of the GATA3 protein with other GATA3 binding sequences in the transcriptional control region.
  • a region in the GATA3 protein required for binding to the sequence and another GATA3-binding sequence in the transcription control region of a gene that is activated by GATA3 proteins such as the IL-5 gene and the TCRa gene differs from the region within the GATA3 protein required for binding to the GATA3 protein, and also has a different binding affinity.
  • the present invention provides the following first to thirtieth aspects that are useful for treating and / or preventing asthma;
  • GATA3 binding to the GATA3 binding sequence in the transcriptional regulatory region of the gene that is effective in inhibiting the binding of the GATA3 protein to the HS S2 sequence in the genome in T cells and that is activated by the GATA3 protein [1] to [1], characterized in that it can be administered at a concentration that inhibits the binding of the protein only to a lower extent than the binding of the GATA3 protein to the HSS2 sequence in the genome.
  • the GATA3 decoy according to any of [8] below:
  • amino acid sequence in the C-finger region in the wild-type GATA3 protein amino acid sequence contains an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and retains the ability to bind to the HSS2 sequence ,
  • a GATA3 mutant protein or a derivative thereof [9] one or more amino acids in the transactivation region of a wild-type GATA3 protein amino acid sequence,
  • a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a Th2 cytokine-related allergic disease wherein the agent is administered to a mammal by administering GATA to the mammal.
  • composition according to [24] comprising at least one nucleic acid encoding the GATA3 mutant protein according to [20].
  • a method for screening a drug for treating and / or preventing a Th2 cytokine-related 7-allergic disease which comprises:
  • the wild-type GAT Incubating the A3 protein or a GATA3 mutant protein capable of binding to the HSS2 sequence with dsDNA or a derivative thereof containing the HSS2 sequence in the presence or absence of the test compound,
  • d) Contains a GATA3 mutant protein capable of binding to the GATA3 binding sequence in the transcription control region of the wild-type GATA3 protein or gene, and a GATA3 binding sequence in the transcription control region of the gene that is transcriptionally activated by the GATA3 protein.
  • a dsDNA or a derivative thereof binds, a dsDNA or a derivative thereof containing a GATA3-binding sequence in the transcription control region of a gene and a GATA3-binding sequence in the transcription control region of a wild-type GATA3 protein or gene Incubate with the GATA3 mutant protein capable of binding in the presence or absence of the test compound,
  • a GATA3 mutant protein capable of binding to the GATA3 binding sequence in the transcription control region of the wild-type GATA3 protein or gene, and a GATA3 binding sequence in the transcription control region of the gene that is transcriptionally activated by the GATA3 protein. Detecting the binding to the contained dsDNA or its derivative, and
  • step f) inhibiting the binding detected in step e) to a lesser extent than inhibiting the binding detected in step b) above, further comprising identifying a test compound; ] Described method,
  • Th2 site force-in refers to interleukin (IL) -4, IL-13 and IL-5 produced by Th2 cells. The production of these cytokins is characteristic of Th2 cells and is absent in Thl cells.
  • Th2 site force-in-related allergic disease refers to an allergic monogenic disease in which the production of the Th2 cytokine is involved in the onset mechanism. That is, this includes asthma, atopic dermatitis, atopic asthma, hay fever, and the like.
  • GATA3 decoy refers to any compound that specifically antagonizes the DNA binding site of the GATA3 protein. Such compounds include, but are not limited to, nucleic acids and nucleic acid derivatives. Preferred examples of the GATA3 decoy include an oligonucleotide containing a GATA3-binding sequence in the transcription control region of the IL-5 gene (for example, a mouse-derived oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 4 or an oligonucleotide corresponding to the sequence in human).
  • an oligonucleotide containing a GATA3-binding sequence in the TCRa gene transcription control region for example, an oligonucleotide derived from a mouse shown in SEQ ID NO: 5 or an oligonucleotide corresponding to the sequence in humans
  • a 2SS2 sequence for example, an oligonucleotide containing a certain GATA3 binding sequence (for example, an oligonucleotide derived from a mouse shown in SEQ ID NO: 3 or an oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 6 corresponding to the sequence in humans) is exemplified.
  • an oligonucleotide containing a GATA3-binding sequence in the IL-5 gene transcription control region eg, the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 4
  • a TCR o! Gene transcription control region eg, the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 5
  • the oligonucleotide containing a GATA3 binding sequence eg, the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 5
  • an oligonucleotide containing a GATA3 binding sequence with high binding affinity or a derivative or modified product thereof is used as a decoy and administered to a patient, the inhibition of GATA3 protein binding to the HSS sequence with low binding affinity occurs.
  • high affinity binding of GATA3 protein to other GATA3 binding sequences is less susceptible to inhibition than low affinity HSS2 sequence-GATA3 protein binding due to its high affinity. Therefore, the HSS2 sequence required for chromatin remodeling and GATA3 protein
  • the binding is characterized by having a lower binding affinity than the binding between the GATA3 protein and other GATA3 binding sequences, so that the decoy concentration that can selectively inhibit the binding between the HSS2 sequence and the GATA3 protein is low.
  • Such a concentration can be easily estimated by those skilled in the art using in vitro techniques such as gel shift assay and general experimental techniques using cultured cells.
  • Oligonucleotides used as decoys may be DNA or RNA, may contain modified nucleotides, and may further contain other compounds. In addition, as long as the binding ability to the GATA3 protein is not lost, mutations such as deletion, substitution, and / or addition may be included in one or more positions in the above oligonucleotide sequence. Further, it may be single-stranded or double-stranded, and may be linear or cyclic. More preferred decoy oligonucleotides are double-stranded oligonucleotides, which contain one or more GATA3 binding sequences.
  • SEQ ID NOs: 3, 4, 5, and 6 represent the sense strands of the respective sequences, and when used in a double-stranded form, those in which each oligonucleotide and its complementary strand are bound shall be used.
  • the oligonucleotide may be modified to contain a thiophosphodiester bond in which the oxygen atom of the phosphate diester moiety has been replaced with a sulfur atom to prevent degradation before or after administration, or a phosphodiester The moiety may be substituted with uncharged methyl phosphate, or may be subjected to alkylation, acylation or other chemical modification.
  • the GATA3 decoy of the present invention can be synthesized by a conventional chemical or biochemical technique.
  • the decoy when the decoy is a nucleic acid, the decoy can be synthesized using any gene manipulation technique (including restriction enzyme cleavage, genetic recombination, etc.), PCR, or a nucleic acid synthesizer. These can be easily implemented by those skilled in the art.
  • the HSS2 sequence used in the present specification refers to a DNase I which is susceptible to cleavage by DNase I present in a region called CNS-1 existing between the IL-4 gene and the IL-13 gene on the genome.
  • a sequence containing a GATA3 binding sequence near the sensitive site (HSS2 site).
  • the sequence shown in the HSS2 column at the top of Fig. 1 is the mouse HSS2 sequence, and the human HSS2 sequence is shown in SEQ ID NO: 6 (only the sense strand is shown). ing. It has been found that the HSS2 sequence can bind to the GATA3 protein, and that the binding is necessary for chromatin remodeling required for production of Th2 cytokines in T cells.
  • GATA3 binding sequence means a DNA sequence to which the GATA3 protein specifically binds, and contains a (A / T) GATACA / G) GATA3 protein binding consensus sequence. is there.
  • the GATA3 protein is a transcription factor that acts on many genes, and a GATA3 binding sequence exists in the transcription control region of a gene that is activated by GATA3 honey matter, and the binding of the GATA3 protein to this sequence is It is known that it is required for gene transcriptional activation. Examples of such genes include, but are not limited to, for example, the IL-5 gene, TCRa gene and CD8.
  • the binding of the GATA3 protein to the HSS2 sequence required for the chromatin remodeling also involves the binding of the GATA3 protein to the GATA3 binding sequence in the HSS2 sequence, and the binding of the GATA3 protein to the HSS2 sequence is as described above.
  • GATA3 protein binding affinity is lower than GATA3 protein binding to the GATA3 binding sequence in the gene transcription control region of E. coli, and it is not responsible for transcriptional activation of specific genes, and changes in chromatin structure due to chromatin remodeling It is thought to be responsible only. Therefore, in this specification, the term “GATA3-binding sequence in the transcription control region of a gene” does not include the GATA3-binding sequence in the HSS2 sequence.
  • chromatin remodeling refers to the binding of the GATA3 protein to the chromosomal portion of the chromosome containing the Th2 cytokine gene cluster so that the structure of chromatin is This means that the gene is transformed into a structure that allows gene transcription by a transcription control mechanism unique to the gene. That is, if the binding between the GATA3 protein and the HSS2 sequence in the genome is inhibited or suppressed, no remodeling occurs, and Th2 cytokines are stably and sufficiently produced. Absent.
  • the amino acid sequence of the GATA3 protein is known for various animal species.
  • the amino acid sequence of the mouse wild-type GATA3 protein is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the human wild-type GATA3 protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • transactivation domain 1 amino acids 30 to 74 in humans and mouse 30 to 73 amino acids
  • transactivation domain containing transactivation domain II amino acids 131 to 214 in humans, amino acids 130 to 213 in mice
  • C-terminal regions It has a zinc finger area.
  • the one closer to the N-terminus is the N-finger region (amino acids 264 to 288 in humans and the amino acids 263 to 287 in mice), and the one closer to the C-terminus. It is called the C finger region (C finger: amino acids 305-326 in humans, amino acids 304-325 in mice).
  • Each of these zinc finger regions contains four cysteine residues, and even if any of these cysteine residues is deleted or substituted, its function can be lost. Binding to the GATA3-binding sequence in the gene transcription control region requires both the N-finger region and the C-finger region, and a transactivation region is required to induce transcriptional activation after binding. is there. On the other hand, binding of the GATA3 protein to the HSS2 sequence required for chromatin remodeling requires only the C finger region and not the N finger region.
  • the GATA3 mutant protein has the conserved amino acid sequence E in the C-finger region, or contains an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added, HSS2 Any deletion, substitution, or addition that can retain the binding ability of is capable of inducing chromatin remodeling and is included in the scope of the present invention. Therefore, one or more A GATA3 mutant protein having a deletion, substitution, or insertion of the following amino acid residue may lose the ability to bind to the GATA3-binding sequence in the gene transcription control region. The ability to bind to the sequence is not affected.
  • a preferred GATA3 mutant protein that can bind to the HSS2 sequence but has lost the ability to bind to the GATA3 binding sequence in the gene transcription control region is preferably at least one residue or more in the N-finger region. Or more preferably 5 or more residues, more preferably 8 or more residues, even more preferably 10 or more amino acid sequences having deletion, substitution or insertion.
  • the mouse delN GATA3 mutant protein used in the Examples lost the ability to bind to the GATA3 binding sequence in the IL-5 and TCRa gene transcription control regions, but retained the ability to bind to the HSS2 sequence. Can induce chromatin remodeling.
  • Induction of chromatin remodeling after binding requires a transactivation domain, which has an amino acid sequence in which one or more (preferably 10 or more) amino acids have been deleted, substituted or added.
  • Some GATA3 mutant proteins can bind to the GATA3 binding sequence, but may not be able to induce chromatin remodeling.
  • Preferred GATA3 mutant proteins capable of binding to the GATA3 binding sequence but not inducing chromatin remodeling include at least one residue, and preferably at least 10 residues of the amino acid sequence in the transactivation region. More preferably, it has a deletion, substitution or insertion in 50 or more residues, particularly preferably in 100 or more residues.
  • the mouse delTA GATA3 mutant protein used in the examples retains the ability to bind to the GATA3-binding sequence, but loses the ability to induce chromatin remodeling.
  • At least one or more residues preferably at least five residues, more preferably at least residues, even more preferably at least ten residues of the amino acid sequence in the N-finger region have deletions, substitutions or insertions. And has a deletion, substitution or insertion in at least one residue or more, preferably at least 10 residues, more preferably at least 50 residues, particularly preferably at least 100 residues of the amino acid sequence in the transactivation region.
  • GATA3 mutant protein White matter has lost its ability to bind to the GATA3 binding sequence in the gene transcription control region, and retains its ability to bind to the HSS2 sequence, but may lose its ability to induce chromatin remodeling.
  • GATA3 mutant protein When such a GATA3 mutant protein is exogenously introduced into the nucleus (either by genetic engineering or by protein injection), it binds to the HSS2 sequence and converts the endogenous GATA3 protein to the HSS2 sequence. Inhibits binding but does not induce chromatin remodeling and does not bind to the GATA3 binding sequence in the gene regulatory region including IL-5 and TCRa, thus inhibiting the binding of endogenous GATA3 protein to these Never do. That is, of the functions of the GATA3 protein, it can selectively inhibit only the induction of chromatin remodeling and suppress the production of Th2 site force-in.
  • Examples of such a GATA3 mutant protein include, in the amino acid sequence of the mouse wild-type GATA3 protein shown in SEQ ID NO: 1, amino acid residues from position 29 to position 168 and at least position 28 in the N finger region.
  • Mouse GATA3 mutant protein in which the amino acid residues up to the above are deleted.
  • the above-mentioned GATA3 mutant protein or its derivative capable of suppressing the production of Th2 cytokine can be used as a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a Th2 cytokine-related allergic disease. Therefore, a pharmaceutical composition containing the GATA3 mutant protein is also included in the scope of the present invention.
  • the “derivative of the GATA3 mutant protein” refers to the GATA3 mutant protein without changing any of the ability of the GATA3 mutant protein to bind to the HSS2 sequence, the ability to activate gene transcription ⁇ and the ability to induce chromatin remodeling. It refers to a mutant protein with any modification or alteration.
  • the GATA3 mutant protein of the present invention has the amino acid sequence of the previously reported GATA3 protein (SEQ ID NO: 1 for mouse GATA3 protein, and human GATA3 protein). (See SEQ ID NO: 2), a method of preparing the same can be easily conceived by those skilled in the art. It can be produced by a conventional technique for producing a nucleic acid encoding a specific amino acid sequence. For this technique, various gene manipulation techniques such as PCR, various mutagenesis methods, restriction enzyme cleavage, and ligation using MA ligase may be appropriately used. See, for example, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • the nucleic acid encoding the amino acid sequence of the wild-type GATA3 protein can be cloned from a cDNA library or the like derived from the relevant animal species by PCR or the hybridization method. It may be modified to encode a variant.
  • the nucleic acid encoding the desired mutant thus obtained is cloned into an appropriate expression vector and transformed into an appropriate host (eg, Escherichia coli or a mammalian cell), whereby the mutant is obtained. Can be expressed. Then, it is easy for those skilled in the art to obtain a mutant protein from the transformed cell. Therefore, vectors containing the nucleic acid (for example, a retroviral vector) and host cells containing the vector are also included in the scope of the present invention.
  • the mutant can be expressed in T cells.
  • the “pharmaceutical composition” of the present invention contains a pharmaceutically acceptable carrier, and may contain additives such as a thickener, a stabilizer and / or a solubilizer, if necessary.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a thickener, a stabilizer and / or a solubilizer, if necessary.
  • Such carriers or additives include, but are not limited to, lactose, cunic acid, stearic acid, magnesium stearate, sucrose, starch, talc, dieratin, agar, vegetable oil, ethylene glycol, and the like.
  • flavors, preservatives, coloring agents, sweetening agents and the like are also added as appropriate according to the method of administration.
  • cytokine-related diseases has been approved by a governmental authority, or refers to the animal, mammal, or mammal in the pharmacopoeia or publicly recognized pharmacopoeia of each country. Refers to those listed for use with animals, and especially humans, and is readily understood by those skilled in the art.
  • An effective amount for the treatment and / or prevention of cytokine-related diseases is administered orally, by inhalation or inhalation through the nares, orally, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, intradermally and subcutaneously, and is administered by continuous It can be administered by a variety of suitable routes, including, but not limited to, oral administration, topical administration including topical application.
  • Formulations containing the pharmaceutical composition of the present invention include various solutions, suspensions, emulsions, syrups, ribosomes, tablets, pills, powders, granules, capsules, aerosols, sprays, ointments, creams, and the like. It can be in a form suitable for the application.
  • the compositions may also be in the form of lyophilized powders or pellets, in one or more doses, sterile for injection so that the compositions may be mixed to the desired concentration prior to administration. It may be provided with an ampoule containing water, saline or buffer.
  • a therapeutically and / or prophylactically effective amount of a pharmaceutical composition of the present invention can be determined by a healthcare professional using standard clinical techniques.
  • inW / ro or zo / zW-assay using disease model animals or the like can optionally be used to help identify optimal dosage ranges.
  • the precise dose to be employed will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient's condition.
  • the term "patient” refers to any mammal, preferably a human.
  • a preferred dosage form includes liposomes generally used for gene therapy. 601 559 (1980)) or Brunner, J. et al. (Bioch im. Bi ophys. Acta, Vol. 455). 322 (1976)) and other methods described in a number of documents.
  • the present invention also includes a method for screening a drug for treating and / or preventing a Th2 cytokine-related allergic disease, targeting a compound capable of inhibiting the binding between a GATA3 protein and an HSS2 sequence.
  • the compounds to be screened include substances that exist in the living body such as nucleic acids and proteins, and include all substances of low molecular weight and high molecular weight. That is, the decoys and GA TA3 mutant proteins of the present invention and their derivatives can also be screened.
  • the conditions under which the wild-type GATA3 protein binds to dsDNA containing the HSS2 sequence or a derivative thereof this may be the condition used for general gel shift assay, etc. For example, Lee et al., (1998) J. I. 160: 2343).
  • wild-type GATA3 protein and dsDNA containing the HSS2 sequence or a derivative thereof were incubated with or without a test compound to obtain wild-type GATA3 protein.
  • a test compound capable of inhibiting the binding between the wild-type GATA3 protein and the HSS2 sequence can be identified.
  • a GATA3 mutant protein capable of binding to the HSS2 sequence for example, but not limited to the delTA or delN GATA3 mutant protein in the present specification. May not be used).
  • the method also includes a dsDNA containing a GATA3-binding sequence in a transcription control region of a gene that is transcriptionally activated by a wild-type GATA3 protein and a GATA3 protein such as, but not limited to, IL-5 and / or TCRa.
  • a dsDNA or a derivative thereof containing a GATA3-binding sequence in the gene transcription control region and a wild-type GATA3 protein are incubated under the conditions of binding to a derivative thereof in the presence or absence of a test compound.
  • test compound Does not inhibit the binding between the wild-type GATA3 protein and the GATA3-binding sequence in the gene transcription control region, or inhibits the binding between the wild-type GATA3 protein and the HSS2 sequence to a lesser degree than
  • the test compound can be further specified, and a compound that selectively inhibits only the binding of the GATA3 protein to the HSS2 sequence among the GATA3 binding sequences can be specified.
  • a GATA3 mutant protein capable of binding to a GATA3 binding sequence in the region (for example, but not limited to, delTA GATA3 mutant protein in the present specification) may be used.
  • dsDNA or its derivative used in the above method is labeled with various labeling compounds such as radioactive, fluorescent or chemiluminescent, detection and comparison of the degree of binding inhibition in the above method become easy.
  • labeling compounds such as radioactive, fluorescent or chemiluminescent
  • detection and comparison of the degree of binding inhibition in the above method become easy.
  • Those skilled in the art can easily carry out a method for selecting and labeling an appropriate labeling compound and comparing the degree of binding inhibition.
  • Various methods such as a conventional gel shift assay or a method using a GATA3 protein bound to a solid support are possible.
  • derivatives of dsDNA containing the HSS2 sequence include derivatives and modifications as described in the description of the decoy above. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a photograph and a diagram showing the results of gel shift assay.
  • the DNA used for each assay is shown above.
  • the delN mutant protein binds to the GATA3-binding sequence in IL-5 promoter and TCR, but cannot bind to the GATA3-binding sequence in HSS2. Furthermore, the delC variant protein does not bind to any GATA3-binding sequences.
  • the delTA mutant protein binds to any GATA3 binding sequence.
  • Fig. 2 is a photograph and diagram showing the results of DNase I hypersensitivity access to the region between the IL-13 gene and the IL-4 gene in transformed T cells expressing each GATA3 mutant protein. is there.
  • FIG. 3 is a photograph and a diagram showing the results of DNase I hypersensitivity assy for the coding region of the IL-4 gene in transformed T cells expressing each GATA3 mutant protein.
  • Figure 4 shows the expression of IFN ⁇ , IL-4 and IL-5 in the transformed Thl cells expressing each of the GATA3 mutant proteins by immunochemical flow cytometry. It is a figure showing a result.
  • the delTA and delC mutants showed a similar expression pattern in Thl cells for all the sites tested.
  • the expression of IFN ⁇ was suppressed, the expression of IL-4 was improved, and the tendency was similar to that of ⁇ 1 ⁇ 2, as compared to the cells expressing the wild-type GATA3 protein, compared to non-infected cells. I was seen.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of a competition experiment between the HSS2 sequence and the G ⁇ 3 binding sequence in the transcription control region of the gene in binding to the GATA3 protein.
  • the left side of the figure shows the results of EMSA (Electrop oretic Mobility Shift Assay) performed on a cell extract of CATA cells expressing GATA3 using a probe containing the HSS2 sequence (HSSGII sequence). is there.
  • HSSGII sequence HSS2 sequence
  • EMSA Electrometic Microbiological
  • Figure 6 compares the binding affinities of the GATA3 protein to the HSS2 sequence (CNS-1) and to the GATA3 binding sequence (TCR enhancer sequence) in the gene's transcriptional control region using gel shift assay. It is a photograph showing a result.
  • Mouse GATA3 protein cDNA, retroviral vector pMXI, and mammalian cell expression vector PME18S were provided by Professor Yamamoto of University of Tsukuba, Professor Kitamura of Institute of Medical Science, University of Tokyo, and Assistant Professor Maruyama of Tokyo Medical and Dental University, respectively.
  • pMEl8S was inserted into the same EcoRI and Notl sites.
  • the delTA mutant has a deletion in the transcriptional activation region (deleting the amino acids at positions 29 to 168).
  • Two PCR fragments containing this defect were prepared using GATA3 protein cDNA as a template.
  • Primer 1 5′-GGMGTGTTACTTCTGCTCTAAMGCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • Primer 2 5′-ACCCGGCGGATCCCGGGTGG TGCGTGTCTGGGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 8)
  • Primer 3 5′-AGACACGCACCACCCGGGA TCCGCCGGGTCGGCCAGG-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • I Primer 4: The combination of 5'-GTGGGAGGTTTTTTCTC TAGACTAGTCT-3' (SEQ ID NO: 10) was used.
  • the resulting two PCR fragments were joined by amplification using Primer 1 and Primer 4.
  • the nucleotide sequence of this PCR fragment was determined and confirmed, cut with EcoRI and Notl, and
  • the delN mutant has an N-finger deficiency (deleting amino acids 263-287).
  • Two PCR fragments containing this deletion were generated using GATA3 cDNA as type III.
  • primers use a combination of primer 1 / primer 5: 5'-GGTAGAGTCCCTCCC TGCCTTCTGTGCTG-3 * (SEQ ID NO: 11) and primer 6: 5'-GCAGGGAGGGACTCTACC ATAAAATGAATGGGCAG-3 '(SEQ ID NO: 12) I Primer 4 was.
  • the two PCR fragments were joined by amplification using Primer 1 and Primer 4.
  • the PCR fragment was confirmed by determining its nucleotide sequence, cut with EcoRI and Notl, and inserted into pMXI and PME18S.
  • the delC mutant has a deletion of the C finger (deleting amino acids 304-325).
  • Two PCR fragments containing this deletion were prepared using GATA3CDNA as type III.
  • Primers 1 / primer 7 5'-TTCATAGTCAG GGGTCGACAGCCTTCGCTTGGGCT-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • primer 8 5'-AAGCGAA GGCTGTCGACCCCTGACTATGAAGAAAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 14) / primer 4 Using.
  • these two PCR fragments are It was bound by amplification using a primer.
  • the PCR fragment was confirmed by determining the base sequence, cut with EcoRI and Notl, and inserted into pMXI and PME18S.
  • the vector containing the gene encoding the GATA3 protein and the GATA3 mutant protein prepared as described above was expressed in COS cells, and the cell extract was subjected to SDS-PAGE electrophoresis. The respective mutant GATA3 and wild-type GATA3 proteins were detected at the expected molecular weight positions (data not shown).
  • EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay
  • Example 3 Identification of a region of GATAS3 ⁇ 4 white matter required for binding to a GATA3 binding sequence A GATA3 mutant protein and a wild-type GATA3 protein expressed in COS cells obtained in Example 1 above and an HSS2 sequence (FIG. 1) The upper strand HSS2, the sense strand side is shown in SEQ ID NO: 3), and the IL-5 promoter sequence containing the GATA3 binding sequence (Fig. 1 Upper IL-5 promoter, A double-stranded oligonucleotide having a TCR o; enhancer sequence containing the GATA3 binding sequence (SEQ ID NO: 4 showing the sense strand side) and a GATA3 binding sequence (FIG.
  • the binding of GATA3 protein to the HSS2 sequence was found to have lower binding affinity compared to binding to other GATA3 binding sequences, based on the results of an affinity measurement experiment using gel shift assay. (Fig. 6).
  • no GATA3 binding sequence having binding affinity different from that of other GATA3 binding sequences has not been reported. That is, among the GATA3 binding sequences, only the HSS2 sequence that is responsible for the mechanism of chromatin remodeling is considered to be a low affinity binding sequence.
  • GATA3 binding sequences that exhibit high binding affinity are responsible for chromatin remodeling. It specifically inhibits the binding of GATA3 protein to HSS2 sequence with low binding affinity and does not inhibit the high affinity binding of GATA3 protein to GATA3-binding sequences other than HSS2 sequence. It can be used effectively.
  • the effects of the GATA3 protein and its mutants on chromatin remodeling were examined in DNase I hypersensitive Atsusei.
  • the DNase I hypersensitivity assay utilizes the fact that a specific fragment can be detected because the site of action in the genome is exposed to DNase I by causing chromatin remodeling.
  • the DNase I hypersensitivity assay was performed according to the method described by Takemoto, ⁇ ⁇ et al. ((1998) supra).
  • the Phoenix Eco packaging cell line was distributed by Dr. Kitamura, Institute of Medical Science, The University of Tokyo.
  • the plasmid was introduced into the Phoenix Eco packaging cell line using Lipofectamine Plus (Gibco BRL). .
  • DOI l. LOTCR o i3-transgenic mice (Murphy, KM, et al., Science 250: 1720 (1990)) were harvested at Celso overnight using CD4 expression as an index (Takemoto, N. et al. Int. Immunol. 10: 1981 (1998)).
  • the obtained naive T cells were stimulated with a peptide antigen derived from chicken ovalbumin and antigen-presenting cells (irradiated mouse spleen cells).
  • activated T cells were cultured in a culture supernatant containing the retrovirus to which polyprene (0.5 g / ml) was added.
  • the culture plate was centrifuged at 1800 rpm and 32 for 1 hour. The next day, it was repeated again. Culture was continued in the presence of IL-12 and an anti-IL-4 antibody that induce differentiation into Thl. Seven days after the antigen stimulation, cells expressing GFP were separated using Celso overnight. The cells were cultured for another 2 weeks in the presence of IL-12 and anti-IL-4 antibodies while applying antigen stimulation every other week.
  • the obtained infected naive T cells are suspended in RSB buffer (lOmM Tris, pH 7.4, 10 mM NaCK, 5 mM MgCl 2 ) containing 0.5% NP-40, and the cells are disrupted with a homogenizer. And the nucleus was extracted from it.
  • the obtained nuclei were prepared so that each IX was contained in 100 1 of RSB buffer, and DNase I (Worthington Biochemical, Freehold) was added to the nuclei at 0, 5, 10, 15, and 20 jtig / ml. , NJ) and add 37 After incubation for 12 minutes, DNase I was produced.
  • HSS3-cleaved fragments were detected in genomic DNA of uninfected cells, wild-type GAT A3 protein-expressing cells, and any GATA3 mutant protein-expressing cells, but were specific to chromatin-remodeled Th2 cells.
  • HSS2-cleaved fragments and SS1-cleaved fragments which are typical Th2-specific DNase I hypersensitive sequences, are not detected in the genomic DNA of uninfected cells, but are expressed in wild-type GATA3 was detected.
  • the HSS2-cleaved fragment and the HSS1-cleaved fragment were detected in the delN mutant-expressing cells as in the wild-type GATA3 protein-expressing cells, whereas the delTA GATA3 Neither of these fragments was detected in cells expressing the mutant protein and the delC GATA3 mutant protein.
  • the GATA3 protein site required for binding to the HSS2 sequence responsible for chromatin remodeling is a C finger site, as inferred from the results of the gel shift assay of Example 2 above.
  • the delTA mutant binds to the HSS2 sequence but lacks the site required for chromatin remodeling. It was suggested that they did. That is, it was found that the delTA mutant can function as a dominant negative mutant for chromatin remodeling by binding of the GATA3 protein to the HSS2 sequence. Further, a similar experiment was performed using a 32 P-labeled probe for the IL-4 coding region.
  • Detection of the DNase I hypersensitive region in the IL-4 coding region also showed that the delN GATA3 mutant protein produced similar results as the wild-type GATA3 protein, but the delTA GATA3 mutant protein and delC The GATA3 mutant protein did not show the effects observed with the wild-type GATA3 protein (Fig. 3).
  • the delTA GATA3 mutant protein binds to the HSS2 sequence but lacks a site necessary for chromatin remodeling. That is, the delTA mutant can function as a dominant negative mutant for chromatin remodeling by binding of the GATA3 protein to the HSS2 sequence, and the delC GATA3 mutant protein cannot bind to the HSS2 sequence. Therefore, the above speculation that chromatin remodeling cannot be induced is supported.
  • Naive T cells obtained in the same manner as in Example 3 above were differentiated into TM cells by IL-11 stimulation (see Takemoto, N. et al., Int. Immunol. 10: 1981 (1998)).
  • the differentiated Thl cells were infected with the above-mentioned virus encoding either the GATA3 mutant protein or the wild-type GATA3 protein in the same manner as in Example 3 above, and IFNa, IL-4 and IL-4 in each infected cell were infected. -5 was detected in the cells by flow cytometry. After collecting the above infected cells, PMA (50 ng / ml) and ionomycin (500 ng / m
  • FIG. 4 shows the results of treating and analyzing cells ′ differentiated into Th2 cells by IL-4 stimulation in the same manner as described above. Compared to the results of analysis of Thl-differentiated cells that have not been infected at all (left end), Th2 cells do not express IFNT, but show high levels of expression of IL-4 and IL-5. .
  • IFNr is expressed at a high level in Thl cells, indicating that IL-4 and IL-5 are hardly expressed.
  • IFN when wild-type GATA3 protein is expressed in Thl cells, IFN? "The expression was reduced and the expression of IL-4 and IL-5 was induced. That is, in Thl cells, the expression of the wild-type GATA3 protein induced the expression of the Th2 site force-in, and the phenotype was changed to Th2 cells. Phenotype.
  • the delN GATA3 mutant protein exhibited the same effect on IFNr and IL-4 as the wild-type GATA3 protein and changed to the Th2 cell phenotype. .
  • the mutant protein is not able to induce IL-5 because, as described above, the GATA3 protein binds to the GATA3 binding sequence in the promoter sequence for sufficient expression of IL-5. Therefore, it is considered that the mutant protein has lost the ability to bind to the GATA3 binding sequence in the motor sequence.
  • the GATA3 mutant protein partially lacking the N-finger region (a mutant protein lacking the amino acid residues 280 to 288) was identified. However, when tested in all of the above experiments, results similar to those of the delN mutant protein were obtained.
  • One amino acid residue in the N-finger region corresponding to FOG-1 (Cri spino, J.D., et al., Ol. Cell. 3: 219 (1999))
  • the mutant (V264G) which is essential for mediating contact, showed similar results to the wild-type GATA3 protein.
  • the delC GATA3 mutant protein lacks the ability to bind to the HSS2 sequence required for chromatin remodeling and also lacks the ability to bind to GATA3-binding sequences other than HSS2.
  • the C-finger region of the GATA3 protein is essential for binding to not only the HSS2 sequence but also any GATA3-binding sequence.
  • the delN GATA3 mutant protein has the ability to bind to the HSS2 sequence and can induce changes to the phenotype of Th2 cells, the N-finger region of the GATA3 protein binds to the HSS2 sequence and Although not involved in modeling, it is essential for binding to GATA3-binding sequences other than HSS2.
  • the delTA GATA3 mutant protein binds to all tested GATA3-binding sequences, including HSS2, but does not induce chromatin remodeling and does not induce a change to Th2 cell phenotype. That is, the delTA GATA3 mutant protein can be a minor negative mutant of the GATA3 protein in chromatin remodeling.
  • the delTA0ATA3 mutant protein lacks one-fifth of the transactivation region, and this deleted region contains a region necessary for chromatin remodeling after binding to the HSS2 sequence. This suggests that the GATA3 mutation has deletions in both the transactivation region and the N-finger region.
  • the body protein binds to the HSS2 sequence but does not induce chromatin remodeling, and cannot bind to GATA3-binding sequences other than HSS2. Therefore, intracellular mechanisms induced by GATA3 proteins other than chromatin remodeling ( It can be a GATA3 mutant protein that does not affect the transcriptional activation of IL-5, TCRa, etc.), and is a dominant negative mutant that specifically and effectively inhibits only Th2 cell differentiation. It is easy for the trader to think.
  • binding of the GATA3 protein to the HSS2 sequence requires only the C finger site in the GATA3 protein.
  • this binding has a relatively low affinity, and as a decoy that can specifically inhibit the binding between the low-affinity GATA3 protein involved in chromatin remodeling and the HSS2 sequence, Oligonucleotides containing a high GATA3 binding sequence were suggested to be very useful.
  • GATA3 wild-type GATA3 protein expressed in COS cells obtained in Example 1 above HSS 2 sequence ("HSS2" in the upper right of FIG. 6, the sense strand side is shown in SEQ ID NO: 3), and GAT A3 binding sequence
  • HSS 2 sequence HSS 2 sequence
  • GAT A3 binding sequence Using a double-stranded oligonucleotide having a TCR enhancer sequence containing "(TCR a enhancer), the sense strand side of which is shown in SEQ ID NO: 5 in the upper part of FIG. 6), a binding inhibition experiment by gel shift assay was performed. The gel shift assay was performed according to a standard method using a probe in which the above synthetic oligonucleotide was radioactively labeled with 32 P (FIG. 6).
  • the TCR enhancer sequence containing the GATA3-binding sequence obtained by radiolabeling the wild-type GATA3 protein with 32 P was used to form a complex with ffl and detected by electrophoresis (FIG. 6, upper left lane 1).
  • Unlabeled DM having a TCR enhancer sequence containing the same GATA3 binding sequence as the probe was added to the binding reaction at 50 times and 100 times the amount of the probe. In addition, 50 times, 100 times, 200 times, 400 times, 80 times 0 times added (Fig. 6, lower left).
  • gel shift assay was performed using a probe whose HSS2 sequence was radioactively labeled with 32 P, and unlabeled DNA having the TCR o!
  • Enhancer sequence was 5 times, 10 times, 20 times, 50 times, and 100 times (Figure 6). Unlabeled DNA having the 1ISS2 sequence and unlabeled DNA were also added at 5, 10, 20, 50, and 100 times (bottom right, Fig. 6) to inhibit binding competition.
  • a GATA3 decoy and a GATA3 mutant protein for treating and / or preventing a Th2 cytokine-related allergic disease are provided.
  • the decoy and GATA3 mutant proteins of the present invention can selectively suppress chromatin remodeling in the Th2 cytokine gene cluster, and do not affect the intracellular functions of GATA3 proteins other than Th2 cytokines. It can effectively suppress the expression of 3 ⁇ 42 cytokine. Therefore, a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a Th2-cytokine-related allergic disease containing these as an active ingredient, and a treatment and / or prevention of a Th2-cytokine-related allergic disease including administering the same. The method is extremely effective. '

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Description

Th2サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および/または予防するためのデコイ、 GATA3変異体蛋白質、 ならびにこれらを含む医薬組成物 技術分野
本発明は、 Th2サイトカイン関連アレルギー疾患の治療および/または予防薬な らびに Th2サイトカイン関連アレルギ一疾患を治療および/または予防するための 方法に関する。 背景技術
Th2サイトカイ.ン関連アレルギー疾患は、 先進国における保健費の支出の大き な部分を占める疾患の 1つである。 全世界においては、 1億 5千万人以上の人々が 喘息を患っており、 喘息治療薬は日本では 1年当たり 2, 300億円、 米国においては 7， 600億円の市場を形成している。 アレルギー性喘息は、 気道の過敏性、 気道炎 症による気道閉塞を主とする、 慢性炎症性肺疾患であり、 患者は小児から成人ま で幅広く分布し、 重積発作は致死を引き起こす病である。 この疾患の形態には環 境因子に加え、 遺伝的素因も関与すると考えられているが、 未だにその詳細な発 症機序は不明である。
現在の喘息治療薬は、 大別すると、 1) 発作の治療薬として気管支拡張を主目 的とするキサンチン誘導体や、 ）3 2刺激剤 （ステロイド剤を含む） と、 2) 長期管 理薬としての、 抗炎症作用を含む抗アレルギ一薬である、 クロモグリク酸ニナト リウム （di sodiumcromoglycate) をはじめとする、 化学伝達物質遊離抑制薬、 ヒ ス夕ミン拮抗薬、 トロンポキサン阻害剤、 ロイコトリェン拮抗薬などの、 二種類 が存在する。 真の意味での喘息治療薬は、 対症療法でなく、 疾患の主体となる気 道の炎症反応を制御する、 アレルギー制御薬であるべきであり、 アレルギー発症 を予防しうる新しいカテゴリーの治療薬の開発が必要である。 現在用いられてい る薬剤の中で最も有効かつ強力なのは、 吸入、 内服を主体としたステロイド剤で あり、 速効性の気道炎症の沈静化と、 免疫細胞の活性抑制による強力な抗喘息作 用を有するが、 その強い副作用から長期間の使用には適さない。 現在まで新たに 開発されてきた抗アレルギー薬は、 発作の引き金となる炎症細胞が産生する化学 伝達物質を種々のレベルで阻害するものがほとんどであつたが、 近年、 Th2細胞 とその産生するサイト力インが、 アレルギーの発症の鍵であることが発見 （O' Ga rra, A. (1998) Immuni ty 8 : 275、 Gl imcher, L. H.，および K. . Murphy. (2000) Genes Dev. 14 : 1693、 Murphy, K. M. , et al . (2000) Annu. Rev. Immunol . 1 8 : 451など参照のこと） されて以来、 かかる IL- 4, 5， 13といった Th2サイト力イン の作用を阻害する抗体等が、 治療薬として開発され臨床試験が進行中である。 し かし、 アレルギー疾患の多くは、 アレルゲンに繰り返し暴露された結果である場 合が多いことから Th2サイトカインそのものを標的としたァレルギ一反応の抑制 は有効な治療法にはならない可能性がある。
様々な研究グループによる Th2細胞への分化のメカニズム及びそれに関与する ファクタ一についての研究の結果、 GATA3蛋白質がいわゆる転写因子としての機 能のみならず、 Th2細胞への分化およびコミットメントに重要な役割を果たして いる事が明らかになった。 このプロセスの阻害剤は、 ステロイドの離脱が困難な 重度の喘息を含むすべてのアレルギー疾患に対する全く新しいタイプの治療薬に なりうると考えられる。
ヘルパー T細胞は、 そのサイト力イン産生のパターンから、 少なくとも二つの サブセット、 Thlおよび Th2に分けられる。 この現象は当初//? でクロ一ン化 T 細胞にのみ認められる特檄とも考えられていた。 しかしマウスではパラサイトに 対する感受性がどちらのサブセットが活性化するかによって決まること、 更にヒ トではライ病など実際の疾患の予後を左右しうることが示され、 これらのサブセ ットが感染症の予後を決める重要な細胞群であることが認識された。 Thl細胞は、 IFN Tやリンホトキシン (Lymphotoxin) を産生し、 細胞性免疫に関与するといわ れ、 細菌やウィルスなど細胞内病原体の除去に重要であり、 その不適切な活性化 は、 自己免疫疾患を誘発する。 これに対し、 Th2細胞は、 インターロイキン（IL) - 4， 5, 13等を産生し、 液性免疫に関与し、 寄生虫等の駆除の役割になっていると考 えられているが、 これらの過剰な活性化は、 喘息、 アトピー性皮膚炎といったァ レルギ一疾患を引き起こすことが知られている。
近年増加の一途をたどるアレルギー疾患の治療には、 新しいメカニズムに基づ く Th2細胞の制御が必須である。 Th2細胞は、 抗原刺激によって、 ナイーブ T細胞 から分化し、 サイトカイン IL - 4は Th2細胞の分化誘導の主要なサイトカインであ る。 IL- 4のレセプターへの結合は、 その下流のシグナル伝達経路 JAK/STATを活性 化し、 最終的に Th2細胞特異的転写因子である GATA3蛋白質の発現を誘導する。 Th 2サイト力イン遺伝子はヒト第 5染色体 （マウス第 11染色体） にクラスタ一を成 し、 q 23- 31領域の 160Kbの中に IL- 4, IL- 13, IL- 5をコードする遺伝子が存在する Th2細胞への分化に伴い、 Th2サイトカイン遺伝子群の転写が一斉に" ON"になるこ とは、 長い間観察されていたが、 メカニズムについては、 最近になるまで明らか にされなかった。 本発明者らは、 最近この遺伝子クラスターの中に Th2サイト力 イン遺伝子の発現を支配する領域を見出した （Takemoto et al . Int. Immunol . 10, 1981 - 1985 (1998) , Takemoto et al . J. Immunol . 6687-6691 (2000) ) 。 この領域 (HSS1 , 2, 3)は、 種々の哺乳動物間での塩基配列がよく保存されている 15領域 （CN- 1〜15) の一つである CNS- 1とよい一致を示し、 この部位を欠損させ た動物実験では、 IL_4，5, 13の発現が損なわれた。 従ってこの領域がグロビン遺 伝子でよく研究されている Locus Control Regi on (LCR)様の機能を持つことが明 らかになつた。 本発明者らは、 この領域 （CNS - 1/HSS1，2) fcGATA3蛋白質の認識 配列が存在し、 実際に GATA3蛋白質が結合することを示した （Takemono e t . al . (2000)前掲） 。 発明の開示
本発明は、 Th2サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および/または予防する ための医薬組成物、 特に GATA3デコイ、 GATA3変異体蛋白質に関する。 さらに、 本 発明は、 染色体上の Th2サイトカインの産生に必要な Th2サイトカイン遺伝子クラ スターの存在する部位のクロマチンリモデリングを特異的に抑制することを特徴 とする GATA3デコイおよび GATA3変異体蛋白質を提供する。 また、 上記クロマチン リモデリングの抑制をターゲットとする治療および/または予防薬の有用なスク リーニング方法も提供する。
Th2細胞を W roの実験系で、 誘導するためにはナイーブ T細胞を IL- 4の存在 下で数回の抗原刺激を繰り返す必要がある。 この繰り返し刺激の結果 Th2細胞は 分化の最終段階まで迪り着き、 以後、 その表現型を変えることはない。 これら細 胞のコミツトメントと呼ばれる現象は、 同じ血液系幹細胞から発生した白血球が、 分化を終えた後、 決して赤血球にかわることはないことに類似している。 喘息を 初めとするアレルギー疾患で活性化されている Th2細胞は、 この最終段階の分化 に行き着いているものと考えられ、 それら細胞のサイトカイン産生を含む表現型 を変えることは不可能であると考えられていた。 しかし、 前述した、 転写因子 GA TA3蛋白質は、 細胞のクロマチン構造を変えることによって、 不可能とされてい た細胞の形質を変え、 異なるサイト力インを産生させ、 TMへの再分化誘導が可 能であることを本発明者らは発見し報告した （Lee et al. (2000) J. Exp. Med.
192 : 105, Takeraoto et al，2000前掲） 。 従って、 転写因子 GATA3蛋白質のかかる 機能を特異的に阻害する低分子化合物や、 デコイヌクレオチドは、 アレルギーの 主体を担う、 Th2細胞の形質転換を可能にする。 これによつて、 従来の既にある 炎症に対する対症療法や、 ステロイドな の免疫細胞を全般的に抑制する薬剤と は異なる新たな治療薬となる可能性が考えられる。
本発明者らは、 ナイーブ T細胞の Th2細胞へのコミットメントに伴う、 クロマチ ンの構造変化には、 GATA3蛋白質のマスターレギユレ一タ一としての機能が関与 しており、 これは GATA3蛋白質の特定のドメインが通常の GATA3蛋白質の機能に必 要な DNA配列とは異なる塩基配列を認識することにより生じることを明らかにし、 GATA3蛋白質が新規喘息治療薬のターゲットとなりうる事を見出した。
上記知見に基づき、 本発明において、 GATA3蛋白質のマスターレギユレ一夕一 としての機能を発揮する際に結合する DNA配列 （配列番号 3にマウスのセンス鎖 側の配列を、 配列番号 6にヒトのセンス鎖側の配列を示している、 さらにマウス の配列については図 1上段 HSS2の配列を参照のこと） を特定し、 該配列と GATA3 蛋白質との結合は、 IL- 5遺伝子および TCR o!遺伝子の転写制御領域内にある他の G ATA3結合配列と GATA3蛋白質との結合とは異なる結合様式を有していることを明 らかにした。 即ち、 該配列との結合に必要な GATA3蛋白質内の領域と、 IL- 5遺伝 子および TCRa遺伝子等の GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制 御領域内にある他の GATA3結合配列と GATA3蛋白質との結合に必要な GATA3蛋白質 内の領域とは異なっており、 またこれらの結合親和性も異なっていることがわか つ 7こ。
以上のことから、 本発明は、 喘息の治療および/または予防のために有用であ る以下の第 1〜第 3 0までの態様；
[ 1 ] Th2サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および/または予防するための G ATA3デコイ、
[ 2 ] T細胞において GATA3蛋白質とゲノム内の HSS2配列との結合を阻害すること により Th2サイトカイン遺伝子クラスタ一を含有する部分におけるクロマチンリ モデリングを抑制して 1種以上の Th2サイトカインの産生を抑制することを特徴 とする、 上記 [ 1 ]記載の GATA3デコイ、
[ 3 ] GATA3蛋白質により^写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内の GATA3結 合配列への GATA3蛋白質の結合は阻害しないことを特徴とする、 上記 [ 2 ]記載の G ATA3デコイ、
[4] GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内の GATA3結 合配列への GATA3蛋白質の結合を、 GATA3蛋白質とゲノム内の HSS 2配列との結合を 阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しないことを特徴とする、 上記 [ 2 ]記 載の GATA3デコイ、
[ 5] GATA3蛋白質とゲノム内の HSS2配列との結合を特異的に阻害する、 上記 [ 1 ] 記載の GATA3デコイ、
[ 6 ] 配列番号 3、 4、 5もしくは 6に示す配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチ ドまたはその誘導体を含有する、 上記 [ 1 ]〜！: 5 ]のいずれかに記載の GATA3デコ ィ、
[ 7 ] T細胞において GATA3蛋白質とゲノム内の HS S 2配列との結合を阻害するのに 有効であり、 かつ GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域 内の GATA3結合配列への GATA3蛋白質の結合を、 GATA3蛋白質とゲノム内の HSS2配 列との結合を阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しないような濃度で投与 し得ることを特徴とする、 上記 [ 1：]〜 [ 6 ]のいずれかに記載の GATA3デコィ、 [ 8 ] 以下の：
a) 野生型の GATA3蛋白質のアミノ酸配列における Cフィンガー領域内のアミノ 酸配列は保存されている、 または、
b) 野生型の GATA3蛋白質アミノ酸配列における Cフィンガー領域内のアミノ酸 配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ 酸配列を含み、 かつ HSS2配列への結合能を保持している、
という特徴のいずれかを有している、 GATA3変異体蛋白質またはその誘導体、 [ 9 ] 野生型の GATA3蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内に 1若し くは複数のアミノ酸の欠失、 置換または挿入を有しており、 GATA3蛋白質のクロ マチンリモデリング誘導能を消失している、 上記 [ 8 ]記載の' GATA3変異体蛋白質 またはその誘導体、
[ 1 0 ] 野生型の GATA3蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内の少な くとも 10残基以上のァミノ酸を欠失している、 上記 [ 9 ]記載の GATA3変異体蛋白 質またはその誘導体、
[11] 野生型の GATA3蛋白質アミノ酸配列における Nフィンガー領域内に 1若し くは複数のアミノ酸の欠失、 置換または掙入をさらに有し、 GATA3蛋白質により 転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列を含む DNAへの結合 能を消失している、 上記 [8]〜[10]のいずれかに記載の GATA3変異体蛋白質ま たはその誘導体、
[12] 野生型の GATA3蛋白質アミノ酸配列における Nフィンガ一領域内の少なく とも 1残基以上のアミノ酸を欠失している、 上記 [8]〜[10]のいずれかに記載 の GATA3変異体蛋白質またはその誘導体、
[13] 野生型の GATA3蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内の少な くとも 10残基以上のアミノ酸と Nフィンガ一領域内の少なくとも 1残基以上のアミ ノ酸とを欠失している、 GATA3変異体蛋白質またはその誘導体、
[14] 配列番号 1に示すマウス野生型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列において第 29 位〜第 168位までのアミノ酸を欠失している、 マウス GATA3変異体蛋白質またはそ の誘導体、
[15] 配列番号 2に示すヒト野生型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列において第 29位 〜第 169位までのアミノ酸を欠失している、 ヒト GATA3変異体蛋白質またはその誘 導体、
[16] 配列番号 1に示すマウス野生型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列において Nフ ィンガー領域内の少なくとも第 280位〜第 287位までのアミノ酸をさらに欠失して いる、 上記 [14]記載の GATA3変異体蛋白質またはその誘導体、
[17] 配列番号 2に示すヒト野生型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列において Nフィ ンガ一領域内の少なくとも第 281位〜第 288位までのアミノ酸をさらに欠失してい る、 上記 [15]記載のヒト GATA3変異体蛋白質またはその誘導体、
[18] HSS2配列への結合能を有するが、 T細胞において Th2サイト力インの産生 を抑制し得る、 上記 [8]〜[17]のいずれかに記載の GATA3変異体蛋白質または その誘導体、
[19] GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内の GATA3 結合配列を含む DNAへの結合能を消失していることを特徴とする、 上記 [18]記 載の GATA3変異体蛋白質またはその誘導体、
[20] 上記 [8：!〜 [19]のいずれかに記載の GATA3変異体蛋白質をコードする核 酸、
[21] 上記 [20]記載の核酸を含有するベクター、
[22] 発現ベクターである、 上記 [21]記載のベクター、
[23] 上記 [21]または [22]記載のベクターを含有する宿主細胞、
[24] Th2サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および/または予防するため の医薬組成物であって、 哺乳動物に該薬剤を投与することにより、 該薬剤が GATA
3蛋白質とゲノム内の HSS2配列との結合を阻害することにより Th2サイトカイン遺 伝子クラスターを含有する部分におけるクロマチンリモデリングを抑制して 1種 以上の Th2サイトカインの産生を抑制することを特徴とする、 上記医薬組成物、
[25] 上記 [1：!〜 [7]のいずれかに記載の GATA3デコイのうち 1種以上を含有す る、 上記 [24]記載の医薬組成物、
[26] 上記 [8：！〜 [19]のいずれかに記載の GATA3変異体蛋白質のうち 1種以上 を含有する、 上記 [24]記載の医薬組成物、
[27] 上記 [20]記載の GATA3変異体蛋白質をコードする核酸のうち 1種以上を 含有する、 上記 [24]記載の医薬組成物、
[28] 上記 [21]または [22]に記載のベクターのうち 1種以上を含有する、 上 記 [24]記載の医薬組成物、
[29] Th2サイトカイン関連 7レルギ一疾患を治療および/または予防するた の薬剤をスクリーニングするための方法であって、
a) 野生型 GATA3蛋白質または HSS2配列への結合能を有する GATA3変異体蛋白質 と HSS2配列を含有する dsDNAまたはその誘導体とが結合する条件下で、 野生型 GAT A3蛋白質または HSS2配列への結合能を有する GATA3変異体蛋白質と HSS2配列を含 有する dsDNAまたはその誘導体とを、 試験化合物存在下または非存在下でィンキ ュベー卜し、
b) 野生型 GATA3蛋白質または HSS2配列への結合能を有する GATA3変異体蛋白質 と HSS2配列を含有する dsDNAまたはその誘導体との結合を検出し、 そして、 c) 上記結合を阻害し得る試験化合物を特定すること、
を含む、 上記方法、 ならびに、
[ 3 0 ] 以下のステップ；
d) 野生型 GATA3蛋白質または遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列への結 合能を有する GATA3変異体蛋白質と GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子 の転写制御領域内の GATA3結合配列を含有する dsDNAまたはその誘導体とが結合す る条件下で、 遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列を含有する dsDNAまたはそ の誘導体と、 野生型 GATA3蛋白質または遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列 への結合能を有する GATA3変異体蛋白質とを、 試験化合物存在下または非存在下 でインキュベートし、
e) 野生型 GATA3蛋白質または遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列への結 合能を有する GATA3変異体蛋白質と、 GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝 子の転写制御領域内の GATA3結合配列を含有する dsDNAまたはその誘導体との結合 を検出し、 そして、
f) ステップ e)で検出される結合を、 上記ステップ b)で検出される結合を阻害 する程度に比べて低い程度でしか阻害しない、 試験化合物を特定すること、 をさらに含む、 上記 [ 2 9 ]記載の方法、
を包含し得る。' '
本明細書中に用いる 「Th2サイト力イン」 とは、 Th2細胞により産生されるイン ターロイキン （IL) -4、 IL- 13および IL- 5を指す。 これらのサイト力インの産生 は、 Th2細胞に特徴的なものであり、 Thl細胞では認められない。 本明細書中に用いる 「Th2サイト力イン関連アレルギ 疾患」 とは上記 Th2サイ トカインの産生が発症メカニズムに関与するアレルギ一性疾患を指す。 即ち、 喘 息、 アトピー性皮膚炎、 アトピー性喘息、 花粉症などがこれに含まれる。
本明細書中に用いる 「GATA3デコイ」 という用語は、 GATA3蛋白質の DNA結合部 位を特異的にアンタゴナイズする化合物のあらゆるものを指す。 該化合物には核 酸およぴ核酸誘導体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。 GATA3デコ ィの好ましい例としては、 IL- 5遺伝子転写制御領域内の GATA3結合配列を含むォ リゴヌクレオチド （例えば配列番号 4に示すマウス由来のオリゴヌクレオチド、 またはヒトにおいて該配列に対応するオリゴヌクレオチド） 、 または TCR a遺伝 子転写制御領域内の GATA3結合配列を含むオリゴヌクレオチド （例えば、 配列番 号 5に示すマウス由来のオリゴヌクレオチド、 またはヒトにおいて該配列に対応 するオリゴヌクレオチド) 、 および ¾SS2配列中にある GATA3結合配列を含むオリ ゴヌクレオチド（例えば配列番号 3に示すマウス由来のオリゴヌクレオチド、 ま たはヒトにおいて該配列に対応する配列番号 6に示すオリゴヌクレオチド）が挙 げられる。 後述の実施例において示すように、 これらの配列のうち、 IL- 5遺伝子 転写制御領域内の GATA3結合配列を含むオリゴヌクレオチド （例えば配列番号 4 に示すオリゴヌクレオチド） 、 または TCR o!遺伝子転写制御領域内の GATA3結合配 列を含むオリゴヌクレオチド （例えば配列番号 5に示すオリゴヌクレオチド） は、 その GATA3蛋白質との結合特異性が HSS 2配列中にある GATA3蛋白質配列への GATA3 蛋白質の結合特異性より高いため、 HSS2配列への GATA3蛋白質の結合を阻害する ためには、 低濃度で有効であり得る。 即ち、 結合親和性の高い GATA3結合配列を 含むオリゴヌクレオチドまたはその誘導体もしくはその修飾物をデコイとして用 いて患者に投与した場合、 結合親和性の低い HSS配列への GATA3蛋白質の結合の 阻害は起こすが、 他の GATA3結合配列への GATA3蛋白質の高親和性結合は、 その親 和性の高さ故に低親和性の HSS2配列- GATA3蛋白質間の結合に比べて阻害を受け難 い。 したがって、 クロマチンリモデリングに必要な HSS2配列と GATA3蛋白質との 結合は、 他の GATA3結合配列と GATA3蛋白質との結合に比べて結合親和性が低いと いう特性により、 HSS2配列と GATA3蛋白質との結合を選択的に阻害することが可 能となり得るデコイ濃度が存在し得る。 このような濃度は、 当業者であれば、 vitroの、 例えばゲルシフトアツセィなどの技法および培養細胞を用いる一般的 な実験手法で容易に推定することができる。
デコイとして用いるオリゴヌクレオチドは DNAであっても RNAであってもよく、 修飾されたヌクレオチドを含んでもよく、 さらに他の化合物を含有していてもよ い。 また、 GATA3蛋白質に対する結合能が消失されない限り、 上記オリゴヌクレ ォチドの配列内に 1つ以上の位置に欠失、 置換および/または付加などの変異を 含んでいてもよい。 さらに、 一本鎖または二本鎖でもよく、 線状でも環状でもよ い。 より好ましいデコイオリゴヌクレオチドは、 二本鎖オリゴヌクレオチドであ り、 1つ以上の GATA3結合配列を含有するものである。 なお、 配列番号 3、 4、 5および 6は、 それぞれの配列のセンス鎖を表しており、 二本鎖で用いる場合に は、 それぞれのオリゴヌクレオチドとその相補鎖が結合したものを用いることと する。 投与前または投与後の分解を抑制するために、 オリゴヌクレオチドは、 リ ン酸ジエステル部分の酸素原子を硫黄原子で置換したチォホスホジエステル結合 を含有するように修飾したものでもよく、 またはリン酸ジエステル部分を電荷を 持たないメチルホスフェートで置換したものでもよく、 アルキル化、 ァシル化ま たはその他の化学修飾を施したものでもよい。 本発明の GATA3デコイは、 常用の 化学的または生化学的手法により合成することができる。 該デコイが核酸である 場合は、 あらゆる遺伝子操作技法 （制限酵素切断、 遺伝子組換え法などを含む） 、 PCR法または核酸合成機を利用して合成可能である。 これらは、 当業者には容易 に実施することができる。
本明細書中に用いる HSS2配列とは、 ゲノム上の IL- 4遺伝子と IL-13遺伝子との 間に存在する CNS-1と呼ばれる領域内に存在する DNase Iにより切断を受け易い DN ase I高感受性部位 （HSS2部位） の近傍に存在する GATA3結合配列を含む配列であ る。 例えば、 図 1上段の HSS2の欄に示す (そのセンス鎖を配列番号 3に示す)配列 はマウスの HSS2配列であり、 ヒトの HSS2配列を配列番号 6 (センス鎖のみを示し ている）に示している。 該 HSS2配列が GATA3蛋白質と結合し得、 該結合が T細胞に おける Th2サイトカインの産生に必要なクロマチンリモデリングに必要であるこ とを見出している。
本明細書中に用いる 「GATA3結合配列」 とは、 GATA3蛋白質が特異的に結合する DNA配列を意味しており、 （A/T) GATACA/G)という GATA3蛋白質結合コンセンサス 配列を含有するものである。 GATA3蛋白質は多くの遺伝子に対して作用する転写 因子であり、 GATA3蜜白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域には G ATA3結合配列が存在し、 該配列への GATA3蛋白質の結合が該遺伝子の転写活性化 に必要であることは公知である。 このような遺伝子の例としては、 例えば IL- 5遺 伝子、 TCRa遺伝子および CD8などが挙げられるが、 これらには限定されない。 前 記クロマチンリモデリングに必要な HSS2配列への GATA3蛋白質の結合もまた、 HSS 2配列中の GATA3結合配列へ GATA3蛋白質が結合するものであるが、 この HSS2配列 への GATA3蛋白質の結合は、 上述の遺伝子転写制御領域における GATA3結合配列へ の GATA3蛋白質の結合に比べて GATA3蛋白質結合親和性が低く、 さらに特定の遺伝 子に対する転写活性化を担うものではなく、 クロマチンリモデリングによるクロ マチン構造の変化のみを担っていると考えられている。 したがって、 本明細書中 では 「遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列」 という場合には、 HSS2配列内 の GATA3結合配列は含まないこととする。
本明細書中で用いる 「クロマチンリモデリング」 という用語は、 T細胞におい て、 染色体の Th2サイトカイン遺伝子クラスターを含有する部分に GATA3蛋白質が 結合することにより、 クロマチンの構造が、 Th2サイト力インがそれらの遺伝子 に特有な転写制御機構により遺伝子の転写が可能な構造へと変化することを指す。 即ち、 GATA3蛋白質とゲノム内の HSS2配列との結合が阻害または抑制されるとク リモデリングが起こらず、 Th2サイトカインが安定かつ十分に産生され ない。
様々な動物種について GATA3蛋白質のアミノ酸配列が公知となっている。 例え ばマウスの野生型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列を配列番号 1、 およびヒトの野生 型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列を配列番号 2に示している。 これらは保存性が非 常に高く、 ヒトの第 38位のアミノ酸である Alaがマウスでは欠損しており、 第 38 位より C末端側のアミノ酸位が 1つずつずれている。 いずれの種における GATA3蛋 白質においても、 その基本的構造は保存されており、 N末端側に 2つのトランス 活性化ドメイン、 トランス活性化ドメイン 1 (ヒトでは第 30〜74アミノ酸位、 マウ スでは第 30〜73アミノ酸位）およびトランス活性化ドメイン I I (ヒトでは第 131〜2 14アミノ酸位、 マウスでは第 130〜213アミノ酸位）を含むトランス活性化領域を 有し、 それより C末端側に 2つのジンクフィンガ一領域を有している。 これらの 2 つのジンクフィンガ一領域はそれぞれ、 N末端に近い方のものを Nフィンガー領域 (ヒトでは第 264〜288アミノ酸位、 マウスでは第 263〜287アミノ酸位）、 C末端に 近い方のものを Cフィンガー領域（Cフィンガ一： ヒトでは第 305〜326アミノ酸位、 マウスでは第 304〜325アミノ酸位）と呼ばれている。 これらのジンクフィンガー 領域は、 それぞれ 4個のシスティン残基を含有しており、 このシスティン残基の いずれかが欠失、 置換されても、 その機能を消失し得る。 遺伝子転写制御領域内 の GATA3結合配列への結合には、 Nフィンガー領域および Cフィンガ一領域の両方 が必要であり、 さらに結合後に転写活性化を誘導するためにはトランス活性化領 域が必要である。 一方、 クロマチンリモデリングに必要な HSS2配列への GATA3蛋 白質の結合には、 Cフィンガー領域のみが必要であり、 Nフィンガー領域は必要で はない。 すなわち、 GATA3変異体蛋白質であって、 Cフィンガー領域内のアミノ酸 E列が保存されているか、 または 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換若しく は付加されたアミノ酸配列を含んでいても HSS2への結合能を保持し得る程度の欠 失、 置換若しくは付加であるものは、 クロマチンリモデリングを誘導し得るため、 本発明の範囲に包含される。 したがって、 Nフィンガー領域内に 1若しくは複数 のアミノ酸残基の欠失、 置換または挿入を有する GATA3変異体蛋白質は、 遺伝子 転写制御領域内の GATA3結合配列への結合能を消失し得るが、 この欠失、 置換ま たは挿入によっては HSS2配列への結合能は影響されない。 HSS2配列への結合は可 能であるが、 遺伝子転写制御領域内の GATA3結合配列への結合能を消失している 好ましい GATA3変異体蛋白質は、 Nフィンガー領域内に少なくとも 1残基以上、 好 ましくは 5残基以上、 より好ましくは 8残基以上、 さらに好ましくは 10残基以上の アミノ酸配列の欠失、 置換または挿入を有しているものである。 例えば、 実施例 において用いるマウス delN GATA3変異体蛋白質は、 IL- 5および TCR a遺伝子転写 制御領域内の GATA3結合配列への結合能を消失しているが、 HSS2配列への結合能 は保持しておりクロマチンリモデリングを誘導し得る。
また結合後のクロマチンリモデリングの誘導には、 トランス活性化領域が必要 であり、 この領域に 1若しくは複数、 （好ましくは 10 基以上）のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する GATA3変異体蛋白質は、 GATA3結合 配列への結合は可能であるが、 クロマチンリモデリングを誘導し得ないものが有 り得る。 GATA3結合配列への結合は可能であるが、 クロマチンリモデリングを誘 導し得ない好ましい GATA3変異体蛋白質は、 トランス活性化領域内のアミノ酸配 列の少なくとも 1残基以上、 好ましくは 10残基以上、 さらに好ましくは 50残基以 上、 特に好ましくは 100残基以上に欠失、 置換または揷入を有しているものであ る。 例えば、 実施例に用いているマウス delTA GATA3変異体蛋白質は、 GATA3結合 配列への結合能は保持しているが、 クロマチンリモデリング誘導能を消失してい る。
したがって、 Nフィンガ一領域内のアミノ酸配列の少なくとも 1残基以上、 好ま しくは 5残基以上、 より好ましくは残基以上、 さらに好ましくは 10残基以上に欠 失、 置換または挿入を有しており、 かつトランス活性化領域内のアミノ酸配列の 少なくとも 1残基以上、 好ましくは 10残基以上、 さらに好ましくは 50残基以上、 特に好ましくは 100残基以上に欠失、 置換または挿入を有している GATA3変異体蛋 白質は、 遺伝子転写制御領域内の GATA3結合配列への結合能を消失しており、 さ らに HSS2配列への結合能は保持しているが、 クロマチンリモデリング誘導能を消 失し得る。 このような GATA3変異体蛋白質を外因的に核内に導入する (遺伝子操作 的手法でも蛋白質の注入法によるものでもよい）と、 HSS2配列に結合して、 内因 性の GATA3蛋白質の HSS2配列への結合を阻害するが、 クロマチンリモデリングは 誘導せず、 かつ IL- 5および TCR aを含む遺伝子制御領域内の GATA3結合配列には結 合しないため、 これらへの内因性の GATA3蛋白質の結合を阻害することがない。 即ち、 GATA3蛋白質の機能のうち、 クロマチンリモデリングの誘導のみを選択的 に阻害し、 Th2サイト力インの産生を抑制し得る。 このような GATA3変異体蛋白質 の例としては、 配列番号 1に示すマウス野生型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列のう ち、 第 29位〜第 168位までのアミノ酸残基と Nフィンガー領域内の少なくとも第 28 0位〜第 287位 （例えば、 第 263位から 287位） までのアミノ酸残基とを欠失したマ ウス GATA3変異体蛋白質、 および該欠失アミノ酸残基のヒトに対応するアミノ酸 残基 (即ち、 配列番号 2に示すヒト GATA3蛋白質アミノ酸配列の第 29位〜第 169位 までのアミノ酸残基と Nフィンガ一領域内の少なくとも第 281位〜第 288位 （例え ば、 第 264位から 288位） までのアミノ酸残基を欠失したマウス GATA3変異体蛋白 質が挙げられる。
上記の Th2サイトカインの産生を抑制し得る GATA3変異体蛋白質またはその誘導 体は、 Th2サイトカイン関連アレルギー疾患の治療および/または予防のための医 薬組成物として利用することができる。 したがって、 該 GATA3変異体蛋白質を含 有する医薬組成物もまた、 本発明の範囲に包含される。 この場合の 「GATA3変異 体蛋白質の誘導体」 とは、 該 GATA3変異体蛋白質の HSS2配列への結合能、 および 遺伝子転写活性化^およびクロマチンリモデリング誘導能のいずれ も変化させ ることなく、 該 GATA3変異体蛋白質に任意の修飾または改変を加えたものを指す。 本発明の GATA3変異体蛋白質は、 すでに報告されている GATA3蛋白質のアミノ酸 配列（マウス GATA3蛋白質については配列番号 1、 およびヒト GATA3蛋白質につい ては配列番号 2を参照のこと）を参照すれば、 その作製方法は当業者には容易に 想到し得る。 特定のアミノ酸配列をコードする核酸を作製する常用の技法で作製 することができる。 この技法には、 PCR法、 種々の突然変異誘発法、 制限酵素切 断、 MAリガーゼによる連結などの多様な遺伝子操作技法を適宜利用するとよい。 Sambrookら (Molecul ar Cloning: A Laboratory Manual. 第 2版， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harb or, NY, 1989) などを参照のこと。 例えば、 野生型 GATA3蛋白質アミノ酸配列を コードする核酸は、 該当する動物種に由来する cDNAライブラリーなどから PCRま たはハイプリダイゼーション法によりクローニングすることもでき、 該核酸を上 記手法により所望の変異体をコードするように改変するとよい。 そうして得られ た所望の変異体をコードする核酸を適切な発現べクタ一にクロ一ニングして適切 な宿主 （例えば、 大腸菌または哺乳動物細胞など） に形質転換することにより、 該変異体を発現させることができる。 そして、 当業者には、 該形質転換細胞から 変異体蛋白質を得ることは容易である。 したがって、 上記核酸を含有するべクタ ― (例えば、 レトロウイルスベクタ一など） 、 および該ベクタ一を含有する宿主 細胞もまた、 本発明の範囲に包含される。 上記変異体をコードする核酸が機能し 得る形で連結されている発現ベクターを、 T細胞に送達され得る形態で投与する ことにより、 T細胞内で該変異体の発現が可能となる。
本発明の 「医薬組成物」 は、 薬学的に許容される担体を含み、 必要に応じて増 粘剤、 安定剤および/または可溶化剤などの添加剤を含有することができる。 そ のような担体または添加剤の例としては、 ラクトース、 クェン酸、 ステアリン酸、 ステアリン酸マグネシウム、 スクロース、 デンプン、 タルク、 ジエラチン、 寒天、 植物油、 エチレングリコールなどが挙げられるが、 これらに限定されない。 さら に、 香料、 防腐剤、 着色剤、 甘味剤なども投与方法に応じて適宜添加される。
「薬学的に許容される」 という用語は、 各国政府の監督当局により承認されてい るか、 または各国の薬局方もしくは一般的に認知されている薬局方に動物、 哺乳 動物、 および特にヒトへの使用に関して列記されていることを指し、 当業者は容- 易に理解できる。 2サイトカイン関連疾患の治療および/または予防に有効な量 を、 経口および鼻孔からの吸入もしくは吸引による投与、 経口投与、 静脈内、 腹 腔内、 筋肉内、 皮内および皮下注射ならびに連続輸液による非経口投与、 局所へ の塗布を含む局所投与を含む （これらに限定はされない） 、 様々な適切な経路で 投与することができる。 また、 特定の組織または細胞型 （本発明の場合は胸腺ま たは T細胞が好ましい） に特異的に送達され得るように送達ビヒクルと共に投与 することができる。 本発明の医薬組成物を含む製剤は、 溶液、 懸濁液、 ェマルジ ヨン、 シロップ、 リボソーム、 錠剤、 丸剤、 粉末、 顆粒、 カプセル剤、 エアロゾ ル剤、 スプレー剤、 軟膏、 クリームなど、 様々な用途に適した形態とすることが できる。 また該組成物は、 1回または複数回の用量にて、 凍結乾燥粉末またはべ レツトの形態で、 投与の前に該組成物を所望の濃度となるように混合するための 注射用の滅菌済みの水、 生理的食塩水またはバッファーの入ったアンプルと共に 提供されることも有り得る。 本発明の医薬組成物の治療および/または予防に有 効な量は、 標準的な臨床技術により医療従事者により判断することができる。 さ らに、 in W /roまたは疾患モデル動物などを用いたゾ/ z W ?アツセィを随意に利 用して、 最適用量範囲の特定に役立てることができる。 用いる厳密な用量はまた、 投与経路および疾患の重篤度にも依存し、 実施者の判断および各患者の症状に応 じて決定するべきである。 本明細書中に用いる場合 「患者」 という用語は、 あら ゆる哺乳動物、 好ましくはヒトを指す。
核酸および/またはその誘導体もしくは修飾物である GATA3デコイおよび/また は GATA3変異体蛋白質を有効成分として含有する医薬組成物の場合の好ましい剤 形には、 遺伝子治療に一般的に用いられるリポソ一ムがあるが、 これは Szoka, F. ら（Bi ochim. Bi ophys. Acta, Vo l . 601 559 (1980) )または Brunner, J.ら (Bi och im. Bi ophys. Ac ta, Vo l . 455 322 (1976) ) などを含む多数の文献に記載されて いる方法で作製することができる。 さらに、 本発明は、 GATA3蛋白質と HSS2配列との結合を阻害し得る化合物を標 的として、 Th2サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および/または予防するた めの薬剤をスクリーニングするための方法も包含する。 スクリーニングされる化 合物は、 核酸および蛋白質等の生体に存在する物質も含み、 低分子量のもの高分 子量のものを問わず、 あらゆる物質が含まれる。 即ち、 本発明のデコイおよび GA TA3変異体蛋白質およびこれらの誘導体をスクリ一二ングすることもできる。 該 方法において、 野生型 GATA3蛋白質と HSS2配列を含有する dsDNAまたはその誘導体 とが結合する条件 （これは、 一般的なゲルシフトアツセィ等に用いる条件でよい。 例えば Leeら、 （1998) J. I廳 unol . 160 : 2343等の文献を参照してもよい） 下で、 野生型 GATA3蛋白質と HSS2配列を含有する dsDNAまたはその誘導体とを、 試験化合 物存在下または非存在下でィンキュベートして野生型 GATA3蛋白質と HSS2配列を 含有する dsDNAまたはその誘導体との結合を検出することにより、 野生型 GATA3蛋 白質と HSS2配列との結合を阻害し得る試験化合物を特定することができる。 上記 の方法では、 野生型 GATA3蛋白質の替わりに、 HSS2配列への結合能を有する GATA3 変異体蛋白質（例えば、 本明細書中の de lTA または de lN GATA3変異体蛋白質など、 伹しこれに限定されるわけではない）を使用してもよい。
また、 該方法は、 野生型 GATA3蛋白質と IL- 5および/または TCR aなど（これらに 限定はされない）の GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域 内の GATA3結合配列を含有する dsDNAまたはその誘導体とが結合する条件下で、 該 遺伝子転写制御領域内の GATA3結合配列を含有する dsDNAまたはその誘導体と野生 型 GATA3蛋白質とを、 試験化合物存在下または非存在下でィンキュベ一トして、 野生型 GATA3蛋白質と該遺伝子転写制御領域内の GATA3結合配列との結合を、 阻害 しないか、 または野生型 GATA3蛋白質と HSS2配列との結合を阻害する ^度に比べ て低い程度でしか阻害しない試験化合物をさらに特定することができ、 GATA3結 合配列のうち HSS2配列への GATA3蛋白質の結合のみを選択的に阻害する化合物を 特定し得る。 この段階では、 野生型 GATA3蛋白質の替わりに、 遺伝子転写制御領 域内の GATA3結合配列への結合能を有する GATA3変異体蛋白質 (例えば、 本明細書 中の delTA GATA3変異体蛋白質など、 但しこれに限定されるわけではない）を使用 してもよい。
上記方法に用いる dsDNAまたはその誘導体は、 放射性、 蛍光または化学発光を はじめとする様々な標識化合物で標識すると、 検出および上記方法における結合 阻害の程度の比較が容易となる。 適切な標識化合物の選択および標識化、 ならび に結合阻害の程度の比較のための方法は、 当業者であれば容易に実施可能である。 常用のゲルシフトアツセィ、 または固相支持体に結合した GATA3蛋白質を用いる 方法など様々な方法で可能である。 さらに、 HSS2配列を含有する dsDNAの誘導体 としては、 上記デコイについての記載で述べたような、 誘導体および修飾物が含 まれる。 図面の簡単な説明
図 1は、 ゲルシフトアツセィの結果を示す写真及び図である。 それぞれのアツ セィに用いた DNAを上方に記している。 delN変異体蛋白質は、 IL-5プロモー夕一 および TCRひェン八ンサ一内の GATA3結合配列には結合するが、 HSS2内 GATA3結合 配列には結合できない。 さらに、 delC変異体蛋白質はいずれの GATA3結合配列に も結合しない。 delTA変異体蛋白質は、 いずれの GATA3結合配列にも結合する。 図 2は、 各 GATA3変異体蛋白質を発現させた形質転換 T細胞における IL- 13遺伝 子と I L- 4遺伝子の間の領域についての DNas e I高感受性アツセィの結果を示す写 真及び図である。
図 3は、 各 GATA3変異体蛋白質を発現させた形質転換 T細胞における IL- 4遺伝子 のコード領域についての DNase I高感受性アツセィの結桌を示す写真及び図であ る。
図 4は、 各 GATA3変異体蛋白質を発現させた形質転換 Thl細胞における、 IFNァ、 IL - 4および IL- 5についてその発現を免疫化学的フローサイトメトリ一法により調 ベた結果を示す図である。 delTA変異体および delC変異体は、 試験した全てのサ イト力インについて Thl細胞の同様の発現パターンを示した。 しかし、 delN発現 形質転換細胞では、 野生型 GATA3蛋白質を発現させた細胞と同様、 非感染細胞に 比べて IFNァの発現が抑制され、 IL- 4の発現が向上し、 Τ1ι2と同様の傾向が見られ た。
図 5は、 GATA3蛋白質への結合における HSS2配列と遺伝子の転写制御領域内の G ΑΤΑ3結合配列との競合実験の結果を示す写真である。 図の左は、 HSS2配列 （HSSG ΑΤΑ配列） を含むプローブを用いて、 GATA3を発現している COS細胞の細胞抽出液 で EMSA (El ectrop oret i c Mobi l i ty Shi f t Assay) をおこなった結果である。 図 の右は、 遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列 （TCRaGATA配列） を含むプロ ーブを用いて、 GATA3を発現している COS細胞の細胞抽出液で EMSA (Elec t rop ore t ic Mobi l i ty Shi f t Assay) をおこなった結果である。
図 6は、 ゲルシフトアツセィを用いた、 GATA3蛋白質の HSS2配列 （CNS-1) と遺 伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列 （TCR aェンハンサー配列） への結合親和 性の比較を行つた結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明をより明確に実証するために下記の実施例を記載するが、 本発明は下記 実施例に限定されるものではない。
[実施例 1 ] 野生型 GATA3蛋白質および GATA3変異体蛋白質をコードする遺伝子 の作製
野生型 GATA3蛋白質および種々の GATA3変異体蛋白質を作製した。 マウス GATA3 蛋白質 cDNA、 レトロウイルスベクター pMXI、 哺乳動物細胞発現ベクター PME18S は、 それぞれ筑波大学の山本教授、 東京大学医科学研究所の北村教授、 東京医科 歯科大学の丸山助教授より分与された。 野生型および変異 GATA3CDNAを、 T細胞に 導入するために、 GFP (Green Fluorescent Protein)をバイシストロニックに発現 する pMXIの EcoRIと NOt l部位に挿入した。 また COS細胞で発現させるために、 pMEl 8Sの同じく EcoRIと Notl部位に揷入した。
delTA変異体は、 転写活性化領域の欠損 （第 29〜168位のアミノ酸を欠失してい る） である。 この欠損を含むふたつの PCRフラグメントを GATA3蛋白質 cDNAを铸 型として作成した。 その際のプライマ一として、 プライマー 1 : 5' - GGMGTGTTAC TTCTGCTCTAAMGCTG- 3' (配列番号 7 )/ プライマ一 2 ： 5' -ACCCGGCGGATCCCGGGTGG TGCGTGTCTGGGTG-3' (配列番号 8 )およびプライマ一 3： 5' -AGACACGCACCACCCGGGA TCCGCCGGGTCGGCCAGG -3' (配列番号 9 ) I プライマー 4 : 5' -GTGGGAGGTTTTTTCTC TAGACTAGTCT-3' (配列番号 1 0 )の組み合わせを用いた。 得られたふたつの PCRフ ラグメントを、 プライマ一 1とプライマー 4を用いて増幅することにより結合さ せた。 この PCRフラグメントの塩基配列を決定して確認し、 EcoRIおよび Not lで切 断し pMXIおよび pMEl 8Sに挿入した。
delN変異体は、 Nフィンガ一の欠損 （第 263〜287位のアミノ酸を欠失してい る） を持つ。 この欠損を含む 2つの PCRフラグメントを GATA3 cDNAを铸型として作 成した。 プライマーとして、 プライマー 1 / プライマ一 5 : 5' -GGTAGAGTCCCTCCC TGCCTTCTGTGCTG-3* (配列番号 1 1 )およびプライマ一 6： 5' -GCAGGGAGGGACTCTACC ATAAAATGAATGGGCAG-3' (配列番号 1 2 ) I プライマー 4の組み合わせを用いた。 さらにこの 2つの PCRフラグメントを、 プライマ一 1とプライマー 4を用いて増幅 することにより結合させた。 この PCRフラグメントの塩基配列を決定することに より確認し、 EcoRIおよび Not lで切断し、 pMXIおよび PME18Sに挿入した。
delC変異体は、 Cフィンガ一の欠損 （第 304〜325位のアミノ酸を欠失してい る） を持つ。 この欠損を含むふたつの PCRフラグメントを GATA3CDNAを鍀型として 作成した。 プライマーとして、 プライマ一 1 / プライマー 7 ： 5' -TTCATAGTCAG GGGTCGACAGCCTTCGCTTGGGCT-3 ' (配列番号 1 3 )およびプライマー 8 ： 5' -AAGCGAA GGCTGTCGACCCCTGACTATGAAGAAAGAAGG-3 ' (配列番号 1 4)/ プライマー 4の組み合 わせを用いた。 さらにこのふたつの PCRフラグメントを、 プライマー 1とプライ マ一 4を用いて増幅することにより結合させた。 この PCRフラグメントの塩基配 列を決定することにより確認し、 EcoRIおよび Not lで切断し、 pMXIおよび PME18S に挿入した。
以上のように作製した GATA3蛋白質および GATA3変異体蛋白質をコ一ドする遺伝 子を含むベクターを COS細胞にて発現させてその細胞抽出物を SDS- PAGE電気泳動 に供した。 それぞれの GATA3変異体蛋白質および野生型 GATA3蛋白質は、 予測どお りの分子量の位置に検出された（データは示していない）。
[実施例 2 ] HSS2配列と遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列への GATA3蛋 白質の特異性
HSS2配列 （HSSGATA配列） を含むプローブを用いて、 GATA3を発現している COS 細胞の細胞抽出液で EMSA (Electrophoret ic Mobi l i ty Shi f t Assay) を行った。 その結果を図 5に示す。 HSS2配列を含むプローブに結合する蛋白質複合体は、 ラ ベルされていない同じ配列や遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列 （TCRaGAT A配列； T細胞受容体 a鎖のェンハンサ一の GATA配列） の DNAを過剰に加えることに より、 競合阻害がおこり消失した。 変異のある HSS2配列では阻害がおこらず、 特 異的な配列を認識していることが判明した。 抗 GATA3抗体特異的なスーパ一シフ トが観察され、 複合体の蛋白質は GATA3であることが判明した。
同様に遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列を含むプロ一ブを用いた EMSA でも、 GATA3の複合体が認められ、 GATA配列を含む HSS2配列およびプローブと同 じ遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列により、 競合的に複合体が消失した。 変異のある HSS2配列では阻害がおこらず、 GATA3の複合体が特異的な配列を認識 していることが判明した。
[実施例 3 ] GATA3結合配列への結合に必要な GATAS¾白質の領域の同定 上記実施例 1で得られた COS細胞で発現させた GATA3変異体蛋白質および野生型 GATA3蛋白質と、 HSS2配列 （図 1上段 HSS2、 配列番号 3にそのセンス鎖側を示 す） 、 GATA3結合配列を含む IL- 5プロモーター配列 （図 1上段 IL- 5プロモータ一、 配列番号 4にそのセンス鎖側を示す） および GATA3結合配列を含む TCR o;ェンハン サー配列 （図 1上段 TCRひェンハンサー、 配列番号 5にそのセンス鎖側を示す） を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを用いてゲルシフトアツセィを実施した。 ゲルシフトアツセィは、 上記合成オリゴヌクレオチド32Pで放射性標識し、 定 法に従って実施した。 その結果を図 1に示す。 野生型 （WT) GATA3蛋白質および d e 1 TA変異体蛋白質は上記 3種の GATA3結合配列に結合したが、 de 1N変異体は HSS2配 列にしか結合しなかった。 また del C変異体は上記 3種の GATA3結合配列のいずれに も結合しなかった。 この結果から、 HSS2配列以外の GATA3結合配列への GATA3蛋白 質の結合は、 GATA3蛋白質の Cフィンガー領域と Nフィンガー領域の双方とも必要 であることが示唆され、 このことはすでに報告されている知見とも一致する。 一 方、 HSS2配列への GATA3蛋白質の結合には、 GATA3蛋白質の Cフィンガー領域が必 要であることが示唆され、 他の GATA3結合配列への結合とその結合様式が異なつ ていることが示唆される。
本発明者らのさらなる研究により、 HSS2配列への GATA3蛋白質の結合は、 ゲル シフトアツセィを用いた親和性測定実験の実験結果から、 他の GATA3結合配列へ の結合と比べて結合親和性が低いことが判った （図 6 ) 。 この発明者らの知見の 他に、 GATA3結合配列のうちで結合親和性が他の GATA3結合配列とは異なっている ものは報告されていない。 即ち、 GATA3結合配列のうち、 クロマチンリモデリン グの機序を担っている HSS2配列のみが低親和性結合配列であることが考えられる。 したがって、 高結合親和性を示す GATA3結合配列 （例えば、 IL- 5プロモー夕一 配列内のもの；配列番号 4、 および TCR CKェンハンサー配列内のもの；配列番号 5など） は、 クロマチンリモデリングを担っている、 結合親和性の低い HSS2配列 との GATA3蛋白質の結合を特異的に阻害し、 HSS2配列以外の GATA3結合配列への GA TA3蛋白質の高親和性結合は阻害しない GATA3デコイとして、 低濃度で有効に用い ることができる。
[実施例 4 ] 上記で調製した GATA3蛋白質およびその変異体のクロマチンリモ デリングに対する影響—
GATA3蛋白質およびその変異体のクロマチンリモデリングに対する影響を DNase I高感受性アツセィにて検討した。 DNase I高感受性アツセィでは、 クロマチン リモデリングを起こすことによって、 DNase Iにゲノム中のその作用部位が露出 されるために特定の断片が検出され得るということを利用したアツセィである。
DNase I高感受性アツセィは、 Takemoto, Ν·ら ( (1998)前掲) に記載の方法に したがつて実施した。 フエニックス Ecoパッケージング細胞株は東京大学医科学 研究所、 北村博士より分与された。 フェニックス Ecoパッケージング細胞株には、 リポフエクタミンプラス （ギブコ BRL) を用いてプラスミドを導入した。 .
DOl l. lOTCR o; i3 -トランスジエニックマウス （Murphy, K. M.ら、 Science 250 : 1720 (1990) ) 由来のナイーブ T細胞を CD4の発現を指標にしてセルソ一夕一にて 回収した （Takemoto, N.ら Int. Immunol . 10 : 1981 (1998)参照のこと） 。 得られ たナイーブ T細胞を、 ニヮトリ卵白アルブミンに由来するペプチド抗原および抗 原提示細胞 （放射線照射したマウス脾臓細胞） により刺激した。 1日後レトロゥ ィルスを感染させるために、 レトロウイルスを含む培養上清にポリプレン （0. 5 g/ml) を加えたもので、 活性化した T細胞を培養した。 その際、 培養プレート を 1800rpm、 32 で 1時間遠心した。 次の日に、 もう一度繰り返した。 Thlへの分 化を誘導する IL- 12および抗 IL- 4抗体存在下に、 引き続き培養した。 抗原刺激後 7日において、 GFPを発現している細胞を、 セルソ一夕一を用いて分離した。 1 週間おきに抗原刺激を加えながら、 IL-12および抗 IL-4抗体存在下でさらに 2週 間培養した。
得られた感染ナイーブ T細胞を 0. 5 %NP- 40含有 RSBバッファー （lOmM Tri s、 pH 7. 4、 10mM NaCK 5mM MgCl2) 中に懸濁し、 ホモジナイザーで細胞を破壊して細 胞溶解液を得て、 そこから核を抽出した。 得られた核を I X 偭ずつ 100 1の RS Bバッファ一に含有されるように調製し、 これに 0、 5、 10、 15、 20 jti g/mlとなる ように DNase I (Worthington Biochemical, Freehold, NJ) を添加して、 37 で 12分間インキュベートして DNase Iを作甩させた。 2 X反応停止バッファー （1 % SDS、 20mM Tris、 pH 7. 4、 6OO1 NaCK lOmM EDTA 50 z g/mlプロティナーゼ K) を 100 1添加して反応を停止させ、 反応液をー晚 37 にて激しく浸透して該液に 含まれる蛋白質を分解させた。 該溶液より、 酢酸アンモニゥム沈殿、 フエノー ル-クロロホルム抽出、 およびエタノール沈殿により DNAを精製した。 該 DNAを Sea Iで消化した後、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 膜にブロッテイングし、 さらに Q!32PATP標識化プローブ （IL- 4遺伝子転写開始点の約 7. Okb〜約 6. 7kbに相 当する、 BamHIおよび NspVとで消化したゲノム DNA断片） で、 一般的なサザンプロ ット法に用いる条件下でハイブリダィズさせた。 結果を図 2に示す。 HSS3切断断 片は感染させていない細胞、 野生型 GAT A3蛋白質発現細胞、 およびいずれの GATA3 変異体蛋白質発現細胞のいずれのゲノム DNAからも検出されたが、 クロマチンリ モデリングを起こした Th2細胞に特異的な Th2特異的 DNase I高感受性配列である H SS2切断断片および SS 1切断断片は、 非感染細胞のゲノム DNAでは検出されず、 野生型 GATA3蛋白質を感染発現させた野生型 GATA3蛋白質発現細胞では検出された。 さらに、 GATA3変異体蛋白質を感染発現させた細胞については、 de lN変異体発現 細胞では野生型 GATA3蛋白質発現細胞と同様、 HSS2切断断片および HSS 1切断断片 が検出されたのに対して、 delTA GATA3変異体蛋白質および delC GATA3変異体蛋 白質発現細胞ではこれらの断片は共に検出されなかった。 この結果は上記実施例 2のゲルシフトアツセィの結果から推察された、 クロマチンリモデリングを担う HSS2配列への結合に必要な GATA3蛋白質の部位は、 Cフィンガー部位であるとの結 果と一致する。 しかし、 delTA変異体発現細胞で HSS2切断断片および HSS 1切断断 片が検出されなかったということから、 delTA変異体は、 HSS2配列に結合はする ものの、 'クロマチンリモデリングに必要な部位を欠失し いることが示唆された。 即ち、 delTA変異体は、 GATA3蛋白質の HSS2配列への結合によるクロマチンリモデ リングに対して、 ドミナントネガティブ変異体として機能し得ることがわかった。 さらに、 同様の実験を、 IL- 4コード領域に対する32P標識化プローブを用いて、 それぞれ IL- 4コ ド領域内の DNase I高感受性領域を検出したところ、 やはり、 d elN GATA3変異体蛋白質は野生型 GATA3蛋白質と同様の結果をもたらしたが、 delT A GATA3変異体蛋白質および de lC GATA3変異体蛋白質は、 野生型 GATA3蛋白質に認 められる作用をしめさなかった （図 3 ) 。 このことからも、 delTA GATA3変異体 蛋白質は、 HSS2配列に結合はするものの、 クロマチンリモデリングに必要な部位 を欠失していることが示唆された。 即ち、 de lTA変異体は、 GATA3蛋白質の HSS2配 列への結合によるクロマチンリモデリングに対して、 ドミナントネガティブ変異 体として機能し得ること、 および delC GATA3変異体蛋白質は、 HSS2配列に結合で きないためクロマチンリモデリングを誘導し得ないという上記推察が支持される。
[実施例 5 ] 上記で調製した GATA3蛋白質およびその変異体の Th2細胞への分化 に対する影響
上記実施例 3と同様にして得たナイーブ T細胞を IL- 11刺激により TM細胞へと 分化させた （Takemoto, N.ら、 Int . Immunol . 10 : 1981 (1998)参照のこと） 。 分 化した Thl細胞を、 上記実施例 3と同様に各 GATA3変異体蛋白質および野生型 GATA 3蛋白質のいずれかをコードする上記ウィルスで感染させ、 それぞれの感染細胞 における IFNァ、 IL- 4および IL- 5の細胞内発現量をフローサイトメトリ一法にて 検出した。 上記感染細胞を回収後、 PMA (50ng/ml) とィオノマイシン （500 ng/m
1) で 6時間活生化する。 細胞を回収する 2時間前にモネンシン （2 M) を加え 培養した。 37°Cにて 5分間 4%パラホルムアルデヒドにて固定化して洗浄した後、 0. 5%トリトン X- 100含有溶解バッファー （50mM Tri s、 150mM NaCK 5mM EDTAお よび 0. 02% NaN3、 H 7. 5) 中に懸濁して氷上にて 10分間静置することにより、 細 胞膜を透過性にした。 抗体の非特異的吸着を阻止するために 3%BSAおよび 0. 1 % NaN3含有 PBSでブロッキング （氷上、 30分静置） し、 FITC標識抗 IFN r抗体 （XMG1.
2) 、 フィコエリチン標識抗 IL - 4抗体 （11B11、 RSD Sys tems, Minneapo l i s, MN) 、 または PE標識抗 IL- 5抗体 （TRFK5； Pharmingen) で 60分間染色し、 結合していな い抗体を洗浄除去した後、 フローサイトメトリー解析に供した。 その解析結果を 図 4に示す。 図 4の右端の列には、 IL- 4刺激により Th2細胞に分化させた細胞'を、 上記と同様に処理および解析した結果を示している。 何も感染させていない Thl に分化した細胞の解析結果 （左端） と比較すると、 Th2細胞では、 IFN Tは発現せ ず、 IL-4および IL-5が高レベルで発現が認められることがわかる。 一方の Thl細 胞では IFNrが高レベルで発現しており、 IL- 4および IL- 5はほとんど発現してい ないことがわかる。 また Thl細胞に野生型 GATA3蛋白質を発現させると、 Thl細胞 と比較して IFN？ "発現が低減され、 さらに IL- 4および IL- 5の発現が誘導された。 即ち、 Thl細胞では、 野生型 GATA3蛋白質の発現により Th2サイト力インの発現が 誘導され、 その表現型が Th2細胞の表現型へと変化することが見て取れる。
本実験に用いた 34種の GATA3変異体蛋白質のうち、 delN GATA3変異体蛋白質は、 IFNrおよび IL- 4については野生型 GATA3蛋白質と同様の作用を呈し、 Th2細胞の 表現型へと変化させた。 該変異体蛋白質が野生型 GATA3蛋白質とは異なり、 IL - 5 を誘導し得ないのは、 上述したように IL-5の十分な発現にはプロモーター配列内 の GATA3結合配列に GATA3蛋白質が結合する必要があるので、 該変異体蛋白質がプ 口モーター配列内の GATA3結合配列への結合能を喪失しているせいであると考え られる。 一方、 deLC GATA3変異体蛋白質および delTA GATA3変異体蛋白質を発現 させても、 このような表現型の変化すなわち IFNァ、 IL- 4および IL- 5の発現パ夕 ーンの変化は認められなかった。 上記ゲルシフトアツセィおよび上記 DNase I高 感受性アツセィで得られた結果から、 delC GATA3変異体蛋白質は HSS2配列に結合 し得ないためにクロマチンリモデリングを誘発できないこと、 および delTA GATA 3変異体蛋白質は HSS2配列に結合はするもののクロマチンリモデリングを誘発で きないことが判っており、 上記フローサイトメトリー解析結果は、 クロマチンリ モデリングが Th 2細胞への分化に必須であることをあらためて実証するものであ つた。
さらに、 データは示していないが、 Nフィンガー領域を部分的に欠損した GATA3 変異体蛋白質 （第 280位から 288位のアミノ酸残基の欠損した変異体蛋白質） につ いても、 上記全ての実験において試験したところ、 delN変異体蛋白質と同様の結 果が得られた。 また、 Nフィンガー領域内の一つのアミノ酸残基 （対応する GATA - 1蛋白質の残基が FOG - 1 (Cri spino, J . D.ら、 ol . Cel l . 3 : 219 (1999) )との接触を 仲介するために必須である） が置換された変異体 （V264G) は、 野生型 GATA3蛋白 質と同様の結果を示した。 一方、 Nフィンガ一領域と Cフィンガー領域の間に存在 する、 第 304から第 306位の 3つのアミノ酸残基を AMに置換した変異体は、 IL - 5の 産生は減少させたが、 IFN Tおよび IL- 4については野生型 GATA3蛋白質とほぼ同様 の結果を示した。 さらに、 Cフィンガー領域を含む第 309位から 345位が欠損した 変異体も、 上記の delC GATA3変異体蛋白質と同様の結果を示した。
以上の結果をまとめると、 delC GATA3変異体蛋白質は、 クロマチンリモデリン グに必要な HSS2配列への結合能を欠失しており、 かつ HSS2以外の GATA3結合配列 への結合能も欠失している。 すなわち、 GATA3蛋白質の Cフィンガー領域が HSS2配 列のみならずあらゆる GATA3結合配列への結合には必須である。 delN GATA3変異 体蛋白質は、 HSS2配列への結合能を有しておりかつ Th2細胞の表現型への変化を 誘導し得ることから、 GATA3蛋白質の Nフィンガ一領域は HSS2配列への結合および クロマチンリモデリングには関与していないが、 HSS2以外の GATA3結合配列への 結合には必須である。 つまり、 GATA3結合配列の中で、 HSS2配列のみが GATA3蛋白 質との結合に GATA3蛋白質の Cフィンガ一領域しか必要とせず、 他の GATA3結合配 列は Cフィンガー領域および Nフィンガー領域の両方を必要とする。 さらに、 delT A GATA3変異体蛋白質は、 HSS2を含む試験した全ての GATA3結合配列に結合はする ものの、 クロマチンリモデリングを誘導せず、 Th2細胞の表現型への変化を誘導 しない。 即ち delTA GATA3変異体蛋白質はクロマチンリモデリングにおける GATA3 蛋白質の ミナントネガティブ変異体となり得る。 delTA 0ATA3変異体蛋白質は、 トランス活性化領域の一 ¾5を欠失しており、 この欠失した領域に HSS2配列に結合 した後のクロマチンリモデリングに対して必要な領域が含まれている。 この考察 から、 トランス活性化領域と Nフィンガー領域との両方に欠失を有する GATA3変異 体蛋白質は、 HSS2配列に結合は結合するがクロマチンリモデリングは誘導せず、 HSS2以外の GATA3結合配列には結合し得ないため、 クロマチンリモデリング以外 の GATA3蛋白質により誘導される細胞内の機構 （IL- 5、 TCR aなどの転写活性化 等） には影響を与えない GATA3変異体蛋白質となり得、 Th2細胞の分化のみを特異 的かつ効果的に阻害するドミナントネガティブ変異体であることが、 当業者には 容易に考えられる。
また、 他の GATA3結合配列への結合には Cフィンガーと Nフィンガ一の両方が必 要であるのに対して、 HSS2配列への GATA3蛋白質の結合には、 GATA3蛋白質内の C フィンガー部位のみしか必要ではなく、 この結合は相対的に低親和性であること から、 クロマチンリモデリングに関与する低親和性の GATA3蛋白質と HSS2配列と の結合を特異的に阻害し得るデコイとして、 結合親和性の高い GATA3結合配列を 含むォリゴヌクレオチドが非常に有用であることが示唆された。
[実施例 6 ] ゲルシフトアツセィを用いた、 GATA3蛋白質の HSS2配列 （CNS-1) と遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列 （TCR aェンハンサ一配列） への結合 親和性の比較
上記実施例 1で得られた COS細胞で発現させた GATA3野生型 GATA3蛋白質と、 HSS 2配列 （図 6上段右 「HSS2」 、 配列番号 3にそのセンス鎖側を示す） 、 および GAT A3結合配列を含む TCR ェンハンサー配列 （図 6上段左 「TCR aェンハンサー」 、 配列番号 5にそのセンス鎖側を示す） を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを用い てゲルシフトアツセィによる結合の競合阻害実験を実施した。 ゲルシフトアツセ ィは、 上記合成オリゴヌクレオチドを32 Pで放射性標識したプローブを用いて、 定法に従って実施した （図 6 ) 。 野生型 GATA3蛋白質を32Pで放射性標識した GATA 3結合配列を含む TCR ェンハンサー配列を fflいて複合体を形成させ電気泳動によ り検出した （図 6上段左レーン 1 ) 。 プローブと同じ GATA3結合配列を含む TCR a ェンハンサー配列を持つ非標識の DMを、 プローブの量の 50倍、 100倍を結合反応 液に加えた。 また HSS2配列を持つ非標識の DNAを 50倍、 100倍、 200倍、 400倍、 80 0倍加えた （図 6下段左） 。 逆に HSS2配列を32 Pで放射性標識したプローブを用い てゲルシフトアツセィをおこない、 TCR o!ェンハンサー配列を持つ非標識の DNAを 5倍、 10倍、 20倍、 50倍、 100倍 （図 6上段右） 、 および 1ISS 2配列を持つ非標識の DNAを同じく 5倍、 10倍、 20倍、 50倍、 100倍 （図 6下段右） 加えて結合の競合阻 害をおこなった。
その結果、 遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列をプローブとしたゲルシ フトアツセィでは、 同じ HSS2配列以外の配列では 50倍の量で競合阻害されたが、 HSS2配列では 200倍の量でも完全には阻害されなかつた。 逆に HSS2配列をプロ一 ブとした場合では、 遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列では 50倍の量でほ ぼ阻害されるのに対して、 HSS2配列では 100倍の量でも完全には阻害されない。 この結果から、 GATA3蛋白質への結合親和性は、 HSS2配列よりも遺伝子の転写制 御領域内の GATA3結合配列の方が高いことが判明した。 産業上の利用の可能性
本発明により、 Th2サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および/または予防 するための、 GATA3デコイおよび GATA3変異体蛋白質が提供される。 本発明の該デ コィおよび GATA3変異体蛋白質は、 Th2サイトカイン遺伝子クラスターにおけるク ロマチンリモデリングを選択的に抑制することが可能であり、 Th2サイトカイン 以外の GATA3蛋白質の細胞内機能に影響することなく、 効果的に ¾2サイトカイン の発現を抑制し得る。 したがって、 これらを有効成分として含有する Th2サイト カイン関連アレルギー疾患を治療および/または予防するための医薬組成物、 な らびにこれを投与することを含む Th2サイトカイン関連アレルギー疾患の治療お よび/または予防方法は、 極めて有効である。 '

Claims

請求の範囲
1 . Th2サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および/または予防するための GATA3デコイ。
2 . T細胞において GATA3蛋白質とゲノム内の HSS2配列との結合を阻害すること により Th2サイトカイン遺伝子クラスターを含有する部分におけるクロマチンリ モデリングを抑制して 1種以上の Th2サイトカインの産生を抑制することを特徴 とする、 請求項 1記載の GATA3デコイ。
3 . GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内の GATA3結 合配列への GATA3蛋白質の結合は阻害しないことを特徴とする、 請求項 2記載の G ATA3デコイ。
4 . GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内の GATA3結 合配列への GATA3蛋白質の結合を、 GATA3蛋白質とゲノム内の HSS2配列との結合を 阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しないことを特徴とする、 請求項 2記 載の GATA3デコイ。
5 . GATA3蛋白質とゲノム内の HSS2配列との結合を特異的に阻害する、 請求項 1記載の GATA3デコイ。
6 . 配列番号 3、 4、 5もしくは 6に示す配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチ ドまたはその誘導体を含有する、 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の GATA3デ コィ。
7 . T細胞において GATA3蛋白質とゲノム内の HSS2配列との結合を阻害するのに 有効であり、 かつ GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域 内の GATA3結合配列への GATA3蛋白質の結合を、 GATA3蛋白質とゲノム内の HSS2配 列との結合を阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しないような濃度で投与 し得ることを特徴とする、 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の GATA3デコイ。
8 . 以下の： a) 野生型の GATA3蛋白質のアミノ酸配列における Cフィンガー領域内のアミノ 酸配列は保存されている、 または、
b) 野生型の GATA3蛋白質ァミノ酸配列における Cフィンガー領域内のアミノ酸 配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ 酸配列を含み、 かつ HSS2配列への結合能を保持している、
という特徴のいずれかを有している、 GATA3変異体蛋白質またはその誘導体。 9 . 野生型の GATA3蛋白質ァミノ酸配列におけるトランス活性化領域内に 1若 しくは複数のアミノ酸の欠失、 置換または挿入を有しており、 GATA3蛋白質のク ロマチンリモデリング誘導能を消失している、 請求項 8記載の GATA3変異体蛋白 質またはその誘導体。
1 0 . 野生型の GATA3蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内の少 なくとも 10残基以上のァミノ酸を欠失している、 請求項 9記載の GATA3変異体蛋 白質またはその誘導体。
1 1 . 野生型の GATA3蛋白質アミノ酸配列における Nフィンガー領域内に 1若し くは複数のアミノ酸の欠失、 置換または挿入をさらに有し、 GATA3蛋白質により 転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列を含む DNAへの結合 能を消失している、 請求項 8〜1 0のいずれか 1項に記載の GATA3変異体蛋白質 またはその誘導体。
1 2 . 野生型の GATA3蛋白質アミノ酸配列における Nフィンガー領域内の少なく とも 1残基以上のアミノ酸を欠失している、 請求項 8〜1 0のいずれか 1項に記 載の GATA3変異体蛋白質またはその誘導体。
1 3 . 野生型の GATA3蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内の少 なくとも 10残基以上のアミノ酸と Nフィンガー嶺域内の少なくとも 1残基以上のァ ミノ酸とを欠失している、 GATA3変異体蛋白質またはその誘導体。
1 4 . 配列番号 1に示すマウス野生型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列において第 2 9位〜第 168位までのアミノ酸を欠失している、 マウス GATA3変異体蛋白質または その誘導体。
1 5 . 配列番号 2に示すヒト野生型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列において第 29 位〜第 169位までのアミノ酸を欠失している、 ヒト GATA3変異体蛋白質またはその 誘導体。
1 6 . 配列番号 1に示すマウス野生型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列において Nフ ィンガー領域内の少なくとも第 280位〜第 287位アミノ酸をさらに欠失している、 請求項 1 4記載の GATA3変異体蛋白質またはその誘導体。
1 7 . 配列番号 2に示すヒト野生型 GATA3蛋白質のアミノ酸配列において Nフィ ンガー領域内の少なくとも第 281位〜第 288位までのアミノ酸をさらに欠失してい る、 請求項 1 5記載のヒト GATA3変異体蛋白質またはその誘導体。
1 8 . HSS2配列への結合能を有するが、 T細胞において Th2サイトカインの産生 を抑制し得る、 請求項 8〜1 7のいずれか 1項に記載の GATA3変異体蛋白質また はその誘導体。
1 9 . GATA3蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内の GATA3 結合配列を含む DNAへの結合能を消失していることを特徴とする、 請求項 1 8記 載の GATA3変異体蛋白質またはその誘導体。
2 0 . 請求項 8〜1 9のいずれか 1項に記載の GATA3変異体蛋白質をコードす る核酸。
2 1 . 請求項 2 0記載の核酸を含有するべクタ一。
2 2 . 発現ベクターである、 請求項 2 1記載のベクタ一。
2 3 . 請求項 2 1または 2 2記載のベクターを含有する宿主細胞。
2 4 . Th2サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および/または予防するため の医薬組成物であって、 哺乳動物に該薬剤を投与することにより、 該薬剤が GATA
3蛋白質とゲノム内の HSS2配列との結合を阻害することにより Th2サイトカイン遺 伝子クラスターを含有する部分におけるクロマチンリモデリングを抑制して 1種 以上の Τ1ι2サイトカインの産生を抑制することを特徴とする、 上記医薬組成物。
2 5 . 請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の GATA3デコイのうち 1種以上を含有 する、 請求項 2 4記載の医薬組成物。
2 6 . 請求項 8〜1 9のいずれか 1項に記載の GATA3変異体蛋白質のうち 1種以 上を含有する、 請求項 2 4記載の医薬組成物。
2 7 . 請求項 2 0記載の GATA3変異体蛋白質をコードする核酸のうち 1種以上を 含有する、 請求項 2 4記載の医薬組成物。
2 8 . 請求項 2 1または 2 2に記載のベクタ一のうち 1種以上を含有する、 請 求項 2 4記載の医薬組成物。
2 9 . Th2サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および/または予防するため の薬剤をスクリーニングするための方法であって、
a) 野生型 GATA3蛋白質または HSS2配列への結合能を有する GATA3変異体蛋白質 と HSS2配列を含有する dsDNAまたはその誘導体とが結合する条件下で、 野生型 GAT A3蛋白質または HSS 2配列への結合能を有する GATA3変異体蛋白質と HSS 2配列を含 有する dsDNAまたはその誘導体とを、 試験化合物存在下または非存在下でィンキ ュべ一卜し、
b) 野生型 GATA3蛋白質または HSS2配列への結合能を有する GATA3変異体蛋白質 と HSS2配列を含有する dsDNAまたはその誘導体との結合を検出し、 そして、 c) 上記結合を阻害し得る試験化合物を特定すること、
を含む、 上記方法。
3 0 . 以下のステップ；
d) 野生型 GATA3蛋白質または遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列への結 合能を有する GATA3変異体蛋白質と遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列を含 有する dsDNAまたほその誘導体とが結合する条件下で、 遺伝子の転^制御領域内 の GATA3結合配列を含有する dsDNAまたはその誘導体と、 野生型 GATA3蛋白質また は遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列への結合能を有する GATA3変異体蛋白 質とを、 試験化合物存在下または非存在下でィンキュベートし、 e) 野生型 GATA3蛋白質または遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列への結 合能を有する GATA3変異体蛋白質と、 遺伝子の転写制御領域内の GATA3結合配列を 含有する dsDNAまたはその誘導体との結合を検出し、 そして、
f) ステップ e)で検出される結合を、 上記ステップ b)で検出される結合を阻害 する程度に比べて低い程度でしか阻害しない、 試験化合物を特定すること、 をさらに含む、 請求項 2 9記載の方法。
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