ES2296324T3 - Secuencias de acido nucleico de genes ciita. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A LAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO QUE COMPRENDEN LA TOTALIDAD O UNA PARTE DE LA SECUENCIA DE ACIDOS NUCLEICOS DE UN GEN CIITA. ESTAS SECUENCIAS PUEDEN COMPRENDER UNA SECUENCIA QUE PRESENTA ACTIVIDAD PROMOTORA DE LA TRANSCRIPCION, EN PARTICULAR EXPRESADA DE MANERA ESPECIFICA EN UN TIPO CELULAR. TAMBIEN PUEDEN COMPRENDER UNA SECUENCIA CODIFICANTE. APLICACIONES TERAPEUTICAS Y DIAGNOSTICAS, EN PARTICULAR RELATIVAS A LAS AFECCIONES PARA LAS CUALES ES DESEABLE ACTUAR AL NIVEL DE LA EXPRESION DE LOS GENES QUE CODIFICAN PARA LAS MOLECULAS DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC) DE CLASE II.
Description
Secuencias de ácido nucléico de genes CIITA.
La presente invención se refiere a nuevas
secuencias de ácido nucléico susceptibles de estar implicadas en el
control y la regulación de la expresión de genes que codifican para
moléculas MHC de tipo II, y su utilización, en particular, como
medicamento para el tratamiento de afecciones para las cuales es
deseable actuar sobre el nivel de expresión de genes que codifican
para moléculas MHC de tipo II.
Las moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad (designado a continuación MHC), de clase II son
glicoproteínas heterodiméricas transmembranales directamente
implicadas en la activación de los linfocitos T helper CD4 +
durante la respuesta inmunitaria.
En el hombre, este complejo de clase II está
representado por las moléculas que pertenecen al sistema HLA (Human
Leucocyte Antigen). Los genes que codifican para las cadenas
\alpha y \beta que constituyen las moléculas
HLA-DR, HLA-DQ y
HLA-DP se localizan al nivel de la región D del
cromosoma 6.
La expresión de estos genes está perfectamente
regulada. Contrariamente a los genes que codifican para las
moléculas MHC de tipo I que se expresan de manera ubícua, los genes
que codifican para las moléculas del MHC de clase II se expresan
sea de manera constitutiva solamente en algunos tipos celulares
tales como los linfocitos B, los linfocitos T activados, los
macrófagos, las células del epitelio tímico, las células dendríticas
tales como por ejemplo las células de Langerhans, sea de manera
inducida después de estímulación, por ejemplo por citoquinas, y más
concretamente por el interferón \gamma (INF\gamma) o el la
interleucina 4 (IL4), en varios otros tipos celulares tales como
por ejemplo las células que pertenecen a la línea de los macrófagos
o monocitos, las células endoteliales, los fibroblastos, las células
musculares o las células cancerosas tales como por ejemplo las
células de melanoma.
Además en los linfocitos B, la expresión de los
genes que codifican para las moléculas MHC de clase II, es
transitoria. En efecto, la diferenciación de las células B en
plasmocitos que producen las immunoglobulinas, se acompaña de la
extinción de algunos genes, los cuales codifican para el MHC de
clase II.
Del mismo modo, se puso de manifiesto que la
tasa de expresión de las moléculas MHC de tipo II constituye un
factor determinante del proceso de activación de las células T.
En consecuencia, todo indica claramente que los
mecanismos moleculares de regulación de la expresión de estos genes
constituyen un elemento clave de la eficacia de la respuesta
inmunitaria. Todo defecto en este método de regulación puede
desembocar en importantes desordenes inmunológicos, o enfermedades
autoinmunes. Así pues, en algunos casos, se observó una expresión
anormal de los genes MHC de clase II en la superficie de células
que normalmente no deberían ex-cebarse de tales
genes. Del mismo modo, una sobre expresión de estos genes puede
observarse que conduce a una activación aberrante y no controlada de
los linfocitos CD4 + [BOTTAZZO et al, 1986, Immunol.
Revolución., 94, 137-169]. Tales manifestaciones
podrían ser, al menos en parte, responsables de afecciones tales
como la diabetes insulinodependiente, la esclerosis en placa, la
poliartritis reumatoide o el lupus eritematoso. A la inversa, en
algunos pacientes, una immunodeficiencia pudo ponerse en evidencia
resultando de un desorden en la expresión de los genes MHC de clase
II. Citemos por ejemplo el síndrome BLS (bare lymphocytes syndrome)
que es una afección recesiva para la cual la expresión de los genes
MHC de clase II es muy limitada, o incluso inexistente, lo que se
traduce por la ausencia de respuestas inmunitarias celular y
humoral y se acompaña de numerosas infecciones, a menudo
fatales.
Varios equipos científicos analizaron los
mecanismos de regulación de la expresión de los genes MHC de clase
II e identificaron un cierto número de moléculas transactivadoras
susceptibles de fijarse, directa o indirectamente, en secuencias
promotoras específicas de los dichos genes [para una revisión, ver
MACH et al., 1996, Annu. Revolución. Immunol. 14,
301-331].
El solicitante anteriormente identificó y
caracterizó uno de estos factores, el factor CIITA (clase II
transactivador) [STEIMLE et al., 1993, Cell 75,
135-146 y EP 648836]. El documento WO 9606107 pone
de manifiesto además que existen dos dominios en el seno del factor
CIITA más implicados en la activación de la transcripción de los
genes MHC de clase II, y más concretamente el ámbito definido por la
secuencia SEQ ID Nº 21 de la presente invención, que corresponde a
la traducción de la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID
Nº17. Sin embargo, de manera sorprendente y contrariamente a lo que
se observa para los otros factores implicados en la regulación de
la expresión de los genes MHC de clase II (COOSWELL et al.,
1991, Crit. Revolución. Immunol. 11, 87-112),
STEIMLE et al. pusieron de manifiesto que la expresión del
factor CIITA coincide estrechamente con la expresión de los genes
MHC de clase II y es absolutamente requerido tanto para la expresión
constitutiva como para la inducción de dichos genes MHC. Por otra
parte, SILACCI et al. (1994, J. Exp. Med., 180,
1329-1336) pusieron de manifiesto que la extinción
de los genes MHC de clase II durante la diferenciación de los
plasmocitos se asocia a la extinción del gen que codifica para el
factor CIITA.
Por otra parte, LENNON et al. (1997,
Immunogenetics, 45, 266-273) definieron la secuencia
promotora de un gen CIITA responsable de la expresión diferencial
de este factor en las células B. No obstante, la existencia de esta
sola secuencia no permite explicar porque se observa una expresión
diferencial del factor CIITA en diferentes tipos celulares. Además,
no da cuenta de la inducción por las citoquinas.
El solicitante ha identificado, a partir de
muestras resultantes de diferentes tejidos de origen humano, la
organización compleja de las secuencias que aseguran el control de
la expresión del factor CIITA, aislado y caracterizado de otras
regiones promotoras y puesta en evidencia la existencia de varias
formas del factor CIITA, y también de diferentes genes CIITA.
Por "gen CIITA", se entiende designar una
secuencia de ácido nucleico constituido por una parte promotora
(P), una parte no traducida (NT), y una parte que codifica (Prot),
la parte codante que codifica para una de las formas del factor
CIITA definida.
Más concretamente, los inventores identificaron
un cierto número de secuencias de ácido nucléico de genes CIITA y
en consecuencia susceptibles, en particular, de ser implicados en el
control y la regulación de la expresión de genes que codifican para
moléculas MHC de clase II. Por la expresión "secuencia de ácido
nucleico de genes CIITA", se entiende que la secuencia en
cuestión incluye la totalidad o parte de una secuencia de ácido
nucléico correspondiente al ARNm resultantes de diferentes tejidos o
líneas celulares que expresan una actividad CIITA de manera
constitutiva o después de la inducción. Puede pues tratarse también
de secuencias al menos parcialmente que codifican como por ejemplo
secuencias que se producen en el control de la expresión, en
particular, de las secuencias teniendo una actividad de promotor
transcripcional.
Por "secuencia de ácido nucleico", se
entiende un fragmento de ADN y/o de ARN, ramal doble o ramal simple,
aislado natural, o de síntesis, que designa un encadenamiento
preciso de nucleótidos, modificados o no, permitiendo definir un
fragmento o una región de un ácido nucléico.
Por "polipéptido", se propone designar una
secuencia precisa de aminoácidos, independientemente de su
importancia o su función, natural aislado o de síntesis, modificado
o no.
Por "variante alélica" de un polipéptido,
se entiende designar el conjunto de los polipéptidos mutados y
polimorfismos que pueden existir en el ser humano, obtenidos en
particular, por truncamiento, sustitución, eliminación o adición de
residuos de aminoácidos, así como los variables artificiales
aplicadas "in vitro".
Por "secuencia de ácido nucleico que presenta
una actividad de promotor transcripcional", se entiende una
secuencia de ácido nucleico que permite controlar, es decir, de
iniciar y/o de modular al menos, la transcripción de un gen,
homólogo o heterólogo, localizado más abajo de la dicha secuencia.
Del mismo modo, se hablará de la función promotora de las dichas
secuencias.
Por "secuencia de ácido nucleico homóloga con
una primera secuencia de ácido nucleico", se entiende una
secuencia de ácido nucleico que presenta naturalmente un vínculo
funcional con la dicha primera secuencia. Así por ejemplo, según la
invención, una secuencia de ácido nucleico que presenta una
actividad de promotor CITA, es decir que dirige naturalmente la
transcripción de una secuencia de ácido nucleico que codifica para
un factor CIITA como homólogo para esta misma secuencia de ácido
nucleico que codifica para un gen CIITA. En el caso contrario, se
hablará de "secuencia de ácido nucleico heterólogo".
Por "gen informador", se entiende cualquier
secuencia de ácido nucleico localizada más abajo de una segunda
secuencia de ácido nucleico, que permite analizar la actividad de
promotor transcripcional de la dicha segunda secuencia. En efecto,
la transcripción de este gen receptor se traduce por la aparición de
un producto (ARN o polipéptido) fácilmente detectable según las
técnicas convencionales bien conocidas.
Debe comprenderse que la presente invención no
concierne a las secuencias nucleotídicas genómicas en su entorno
cromosómico natural, es decir, en el estado natural, se trata de
secuencias que se aislaron, es decir, que se tomaron previamente
directa o indirectamente, por ejemplo por copia (ADNc), y que se
modificó su entorno, al menos parcialmente.
La invención tiene así por objeto una secuencia
de ácido nucleico que comprende la totalidad o parte de la
secuencia de ácido nucleico de un gen CIITA, SEQ ID Nº3 o de su
secuencia complementaria, tal como la dicha parte o su secuencia
complementaria presenta una actividad de promotor transcripcional
inducida por una citoquina, o ramal que comprende la parte no
traducida de la secuencia SEQ ID Nº3.
Entre las secuencias especialmente interesantes,
es necesario citar las que comprenden SEQ ID nº6, o su secuencia
complementaria.
Algunas secuencias identificadas según la
invención son capaces de ex-cebar su actividad de
promotor transcripcional después de la inducción por una
citoquina, tal como por ejemplo el interferón \gamma o la
interleucina 4. Un ejemplo preferido de una tal secuencia está
representado por la secuencia que comprende la totalidad o parte de
una secuencia identificada SEQ ID nº6, o su secuencia
complementaria.
La invención concierne igualmente a las
secuencias de ácido nucleico que comprenden toda o parte de la
secuencia SEQ ID Nº10 o de su secuencia complementaria.
\newpage
La presente invención se refiere además a una
secuencia de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia
que presenta una actividad de promotor transcripcional, tal como,
particularmente, las secuencias que comprenden la totalidad o parte
de la secuencia, SEQ ID nº6, o de su secuencia complementaria,
localizada más arriba de al menos una secuencia de ácido nucleico
heterólogo u homólogo, tal como por ejemplo una secuencia de ácido
nucleico que comprende la totalidad o parte de una secuencia elegida
entre:
Las secuencias de ácido nucléico identificadas
SEQ ID Nº7, SEQ ID Nº8, SEQ ID Nº9, SEQ ID Nº11, SEQ ID Nº12, SEQ
ID Nº13, SEQ ID Nº14 y SEQ ID Nº15, y sus secuencias
complementarias.
Conviene precisar que en este caso, es posible
tener al menos dos secuencias que presentan una actividad de
promotor transcripcional y/o al menos dos secuencias de ácidos
nucléicos heterólogos u homólogos, situadas una con relación a la
otra de manera contigua, distante, en el mismo sentido o en sentido
inverso, siempre que la función de promotor transcripcional o la
transcripción de las dichas secuencias no se afecten.
Del mismo modo, en este tipo de construcciones
de ácido nucléico, es posible introducir secuencias nucleicas
"neutras" o intrones que no afecten la transcripción y se
empalman antes de la etapa de traducción. Se describen ampliamente
tales secuencias y sus utilizaciones en la literatura.
Según la invención, las secuencias de ácido
nucléico o sus fragmentos pueden, en particular, codificar para la
totalidad o parte de polipéptidos que tengan la secuencia en
aminoácidos de un factor CIITA tales como se describe en la presente
invención.
Se dirá mientras que codifican para polipéptidos
CIITA.
Pueden también utilizarse como sonda o como en
los métodos de detección o definición o de amplificación enzimática
de ácido nucléico. En este caso, los fragmentos presentan un tamaño
mínimo de 10 bases, y se preferirá fragmentos de 20 bases, y
preferiblemente de 30 bases.
La presente invención concierne igualmente a una
secuencia de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria
a una secuencia objetivo que pertenece a un gen o a un ARN cuya
expresión se desea bloquear específicamente. Tal secuencia
constituye un oligonucleótido antisentido que hibrida a la secuencia
de la cual es complementario y puede así bloquear la expresión del
ARNm que lleva esta secuencia. El término "oligonucleótido" se
utiliza aquí de manera general para designar del polinucleótido de
2 a 100, y más generalmente de 5 a 50 nucleótidos en serie
ribo-desoxirribo - o mixto. Según la invención, tal
secuencia es capaz de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico que comprende una secuencia que presenta una actividad de
promotor transcripcional o con una secuencia de ácido nucleico que
comprende una secuencia como se definió anteriormente y capaz ya sea
de bloquear la actividad promotora de dicha secuencia, o de inhibir
la síntesis del polipéptido codificado por la dicha
secuencia.
secuencia.
Las condiciones de hibridación, según la
invención, son determinadas con el fin de garantizar al menos un
95% de homología, el experto en la técnica dispone de los
conocimientos suficientes para permitirle definir dichas
condiciones.
Si las secuencias descritas son, en general, las
secuencias normales, la invención se refiere también a las
secuencias mutadas en la medida en que implican al menos una
mutación específica y preferiblemente menos de 20 mutaciones en
total.
Preferiblemente, la presente invención se
refiere a secuencias nucleotídicas en las cuales las mutaciones
puntuales no están enmudecidas, es decir, que conducen ya sea a una
modificación de la regulación de la eficacia o de la especificidad
celular de la transcripción del gen localizada más abajo de dicha
secuencia, o a una modificación de la secuencia que codifica
afectando a la expresión del gen CIITA, o a una modificación del
aminoácido codificado con relación a la secuencia normal que afecta
la función del factor CIITA correspondiente.
La presente invención se refiere, en particular,
a una secuencia de ácido nucleico que comprende una mutación que
afecta la función de promotor transcripcional de dicha secuencia.
De manera preferida, esta mutación lleva a las regiones implicadas
en la actividad de promotor transcripcional lo que permite la
fijación de factores implicados en la etapa de iniciación,
activación o modulación de la transcripción, o más generalmente en
la transcripción. Estas regiones pueden por ejemplo consistir al
menos en un sitio implicado en el proceso de transcripción elegido
entre el grupo que consiste en el sitio Nf-GMb
(Shannon et al., 1988. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85,
674-678), el sitio NF-IL6 (Akira y
Kishimoto, 1992, Immunil. Revolución. 127, 25-50),
el sitio PEA3 (Wasylyk et al., 1989, EMBO J., 8,
3371-3378), el sitio AP1 (Pollock et Treisman, 1990,
Nucleic Acid Res.18, 6197-6204), la caja CCAAT
(Dorn et al., 1987, Cell, 50, 863-872) la
caja E2A (Murre et al., 1959, Cell, 56,
777-783), el sitio IRF1/2 (Tanaka et al.,
1993, Molecular and Tejido Biology, 13, 4531-4538),
el sitio MYC (actuará et al., 1989, EMBO J., 8,
4273-4279), el sitio OCT. (Rosales et al.,
1987, EMBO J. Natl. Acad. SCI. Los EE.UU, 85,
674-678), la caja GAS (Pelligrini y Schindler, 1993,
Trends Biochem. SCI., 18, 338-342), la caja E
(Blackwell et al., 1990, Ciencia, 250,
1149-1151) y el sitio Nf_{\kappa}B (Senegal y
Baltimore, 1986, Cell, 46, 705-716).
La presente invención se refiere también a una
secuencia nucleotídica que puede comprender nucleótidos no
naturales, en particular, nucleótidos azufrados por ejemplo o de
estructura \alpha o \beta, o nucleótidos marcados por un
marcador que es, a título de ejemplo, escogido en el grupo que
consiste en una enzima, la biotina, la iminobiotina, un componente
fluorescente, un componente radioactivo, un componente
quimioluminescente, un componente de electrodensidad, un componente
magnético, un antígeno, un hapteno y un anticuerpo.
La presente invención se refiere también a
vectores de clonación o expresión que implican al menos una
secuencia nucleotídica tal como se describió anteriormente.
Estos vectores de clonación o expresión pueden
además comprender elementos que garantizan la expresión de la
secuencia en la célula hospedera, particularmente, de las
secuencias promotoras y/o de las secuencias de regulación eficaces
en dicha célula, si se trata de una secuencia que codifica.
Si se trata de una secuencia que tiene una
actividad de promotor transcripcional, el vector comprenderá además
secuencias de ácido nucléico homólogas o heterólogas que se desean
excebo en la dicha célula.
De manera preferencial, estos vectores de
clonación o expresión incluyen al menos un gen de interés colocado
bajo el control de al menos una secuencia de ácido nucleico tal
como se describe anteriormente y que presenta una actividad de
promotor transcripcional.
El dicho gen de interés podrá por ejemplo ser
escogido entre el grupo consistente en los genes que codifican para
el factor CIITA, las cadenas \alpha y \beta de las moléculas
HLA-DR, HLA-DQ y/o
HLA-DP y los genes receptores tales como por
ejemplo el gen que codifica para la \beta globina de conejo.
El vector en cuestión puede ser escogido entre
los vectores con replicación autónoma o entre los vectores de
integración cromosómica.
En el caso de sistema con replicación autónoma,
en función de la célula hospedera, procariota o eucariota, se
utilizará preferiblemente sistemas de tipo plásmidos o sistemas
virales, los vectores virus que puedan, en particular, ser
adenovirus, poxvirus o virus herpéticos. El experto en la técnica
conoce las tecnologías utilizables para cada uno de estos
virus.
Cuando se desee la integración de la secuencia
en los cromosomas de la célula hospedera, será necesario prever por
una y otra parte la secuencia de ácido nucleico que integra una o
varias secuencias procedentes de la célula hospedera con el fin de
garantizar la recombinación. Se trata aquí igualmente de
procedimientos que están ampliamente descritos en la literatura
anterior. Se podrán, en particular, utilizar sistemas de tipo
plásmido o viral, como por ejemplo, los retroviruses o los AAV
(Asociación Adénovirus Virus).
La invención se refiere también a las células
procariotas o eucariotas transformadas por un vector tal como se
describe anteriormente, en particular, con el fin de garantizar la
expresión de al menos una de las formas del factor CIITA
identificadas según la invención.
Entre las células utilizables para la
realización de la invención, es necesario citar por supuesto las
células procariotas, las células de levadura y las células
animales, en particular los cultivos de células de mamífero.
De manera preferencial, la célula hospedera se
elige en el grupo que consiste en una célula dendrítica, linfocito
B, linfocito T, macrófago, monocito, célula del epitelio tímico,
célula muscular, fibroblasto, célula endotelial y célula cancerosa,
en particular, célula de melanoma.
Las células así obtenidas pueden permitir
preparar polipéptidos CIITA naturales o mutados, pero también
fragmentos de estos polipéptidos.
Estas células pueden también utilizarse como
modelo con el fin de estudiar los modos de regulación de la función
de promotor transcripcional de las secuencias identificadas según la
invención y de identificar inhibidores específicos, cuya acción
podría eventualmente orientarse en un tipo celular dado. Estas
células pueden además utilizarse como modelo con el fin de estudiar
las interacciones entre los diferentes factores CIITA aislados, o
sus variantes, y las regiones que dirigen la transcripción de los
genes que codifican para las moléculas del MHC de clase II, y sobre
todo con el fin de seleccionar los variantes de los factores CIITA
susceptibles de actuar como agonista o antagonista sobre el
receptor de CITTA Estos tipos de modelo celular pueden realizarse
aplicando técnicas conocidas de ingeniería genética. Por otra parte,
la utilización de tales modelos celulares con el fin de probar
compuestos farmacéuticos se conoce bien por el experto en la
técnica.
La presente invención se refiere también a
organismos como los animales, en particular ratones, cuyo genoma se
modificó genéticamente con el fin de integrar al menos una de las
secuencias de ácido nucléico según la invención. Aquí aún, estos
animales pueden ser utilizados como animales modelos con el fin de
probar la eficacia de algunos productos farmacéuticos.
La presente invención se refiere también a un
método de producción de un polipéptido CIITA, en particular, tal
como se definió en la SEQ ID Nº 17, que comprende (i) el cultivo de
una célula hospedera transformada por un vector que comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido CIITA
tal como se describe anteriormente, en condiciones de cultivo
convenientes que permiten la producción de dicho polipéptido y (ii)
la recuperación de dicho polipéptido.
La recuperación de dicho polipéptido puede
efectuarse de manera intracelular o manera extracelular en el medio
de cultivo cuando el vector se concibió para garantizar la excreción
del polipéptido por la inclinación, por ejemplo, de una secuencia
"líder", estando el polipéptido bajo la forma de un
pre-polipéptido. Las construcciones que permiten la
secreción de los polipéptidos se conocen, tanto para los sistemas
procariotas como los sistemas eucariotas.
La presente invención se refiere también a un
polipéptido CIITA susceptible de ser obtenido por la aplicación del
método anteriormente mencionado.
La presente invención se refiere además a los
polipéptidos CIITA que corresponden a las secuencias de ácido
nucléico descritas anteriormente, bajo forma no natural, es decir,
que no se toman en su entorno natural pero se obtienen por
purificación a partir de fuentes naturales o bien obtenidas por
recombinación genética.
La invención se refiere también a los mismos
polipéptidos obtenidos por síntesis química y que pueden comprender
aminoácidos no naturales. La invención se refiere también a dichos
polipéptidos bajo una forma completa o parcialmente retro y/o
inverso que presenta una actividad equivalente a la observada para
el factor CIITA nativo o una de su variantes según la presente
invención, o por lo menos una actividad inmunológica idéntica a la
del factor CIITA padre.
Por otra parte, los polipéptidos, y más
concretamente su variables, tales como se describen anteriormente,
pueden presentar la misma función transactivadora de la expresión de
los genes que codifican para las moléculas MHC de clase II como un
factor CIITA, o por lo menos, la misma capacidad para fijarse en el
centro de fijación específico de un factor CIITA durante la
expresión de dichos genes.
La presente invención concierne además a un
anticuerpo dirigido contra uno cualquiera de los polipéptidos
descritos anteriormente o contra un polipéptido que comprende al
menos una mutación que afecta la función del factor CIITA como se
describe a continuación, y más concretamente un anticuerpo
policlonal o monoclonal obtenido por reacción inmunológica de un
organismo humano o animal con un agente immunogénico que comprende
al menos uno de dichos polipéptidos.
La invención se refiere también a moléculas
capaces de inhibir o la función activatrice de la expresión de los
genes que codifican para las moléculas MHC de clase II de los
polipéptidos identificados según la invención, sea su capacidad
para fijarse en el sitio de fijación de CIITA. Puede tratarse de
polipéptidos que comprenden al menos un cambio que afecta a la
función del factor CIITA. Un polipéptido tal modificado, que
consiste por ejemplo en un análogo estructural de dicho
polipéptido, puede desempeñar el papel de señuelo. Puede también
tratarse de anticuerpos tales como se mencionan anteriormente que
son capaces por ejemplo de bloquear sea la totalidad o parte del
factor CIITA susceptible de reaccionar con su receptor específico,
sea una región del factor CIITA capaz de obrar recíprocamente al
menos con otro factor transactivador en la expresión de los genes
que codifican para las moléculas MHC de clase II.
La invención se refiere también a moléculas
capaces de inhibir específicamente la inducción por los citoquinas
de la expresión de los genes que codifican para las moléculas MHC de
clase II. Estas moléculas consisten, en particular, total o
parcialmente de una secuencia de ácido nucleico que comprende al
menos una mutación que afecta a la función de promotor
transcripcional de la dicha secuencia y por que la o las mutaciones
se localizan en la secuencia de ácido nucleico identificada SEQ ID
nº6, o su secuencia complementaria.
La presente invención se refiere también a
composiciones farmacéuticas que implican como principio activo al
menos una sustancia tal como una secuencia de ácido nucleico o una
molécula inhibidora tales como se define anteriormente. Más
concretamente, la invención se refiere a una composición
farmacéutica para el tratamiento de afecciones para los cuales se
desea un aumento de la expresión de los genes que codifican para las
moléculas MHC de clase II, en particular, en un tipo celular. Por
otra parte, es posible observar este aumento de la expresión de los
genes que codifican para las moléculas MHC de clase II después de la
inducción por una citoquina, y más concretamente por el interferón
\gamma ó la interleucina 4, en particular, cuando dicha
composición farmacéutica incluye al menos una sustancia que
consiste en una secuencia de ácido nucleico susceptible de
activación por la dicha citoquina tal como se describe
anteriormente. La invención se refiere además a uno dicha
composiciones farmacéuticos para el tratamiento de afecciones para
las cuales se desea una reducción de la expresión de los genes que
codifican para las moléculas MHC de clase II, y más concretamente
sobre una composición farmacéutica que comprende como principio
activo a) sea una secuencia de ácido nucleico según la invención
cuya secuencia queda modificada de tal manera que la actividad
promotora de dicha secuencia sea afectada, o que conduce a la
producción de un polipéptido CIITA inactivo tal como anteriormente
se describe, b) o un polipéptido CIITA inactivo.
La invención se refiere por otra parte a una
vacuna utilizable, en particular, para el tratamiento de cáncer o
enfermedades autoinmunes caracterizada por que comprende al menos
una de las composiciones farmacéuticas anteriormente
mencionadas.
Finalmente, la presente invención se refiere más
concretamente a métodos de diagnóstico de una predisposición con
una afección vinculada a un desorden de la expresión de los genes
que codifican para las moléculas MHC de clase II caracterizada por
que se efectúa una muestra biológica en un paciente, sel determina
la presencia de al menos una mutación al nivel ya sea de las
secuencias que presentan una actividad de promotor transcripcional,
o de las secuencias que codifican para uno de los factores CIITA
identificados según la presente invención, por análisis de las
dichas secuencias de ácido nucléico y comparación con las secuencias
silvestres según la invención, siendo la presencia de al menos una
tal mutación indicativo de una predisposición de dicho paciente a
la dicha afección.
Se describen en la literatura numerosas
afecciones, directa o indirectamente, vinculadas a un desorden de
la expresión de los genes que codifican para las moléculas MHC de
clase II. Citemos para ejemplo, afecciones tales como la diabetes
insulino dependiente, la esclerosis en placa, la poliartritis
reumatoide o el lupus eritematoso en los cuales uno de los
componentes podría ser una sobre expresión de los genes que
codifican para las moléculas MHC de classeII; o a la inversa el
síndrome BLS (bare lymphocytes syndrome) que está asociado a
una severa immunodeficiencia.
Entre las mutaciones que se buscan, es necesario
citar más concretamente las mutaciones que afectan a la función
promotora de las secuencias de ácido nucléico, de las mutaciones que
afectan a la especificidad celular de la dicha función promotora, o
de las mutaciones que afectan la inducción por una citoquina de la
dicha función promotora.
La secuencia de ácido nucleico analizada puede
tanbién ser un ADN genómico, un ADNc o un ARN.
Las herramientas de diagnóstico basadas en la
presente invención pueden permitir un diagnóstico positivo y
diferencial en un sujeto tomado aisladamente o bien un diagnóstico
presintomático en un sujeto de riesgo.
Los métodos que permiten poner en evidencia una
mutación en un gen con relación al gen natural son, por supuesto,
muy numerosos, pueden ser puestas en práctica para el estudio del
ADN genómico, el ADNc, el ARN y/o del polipéptido. Se puede
esencialmente dividirlos en dos grandes categorías, el primer tipo
de método es el en el cual la presencia de una mutación es
detectada por comparación de la secuencia mutada con la secuencia
correspondiente natural no mutada, y el segundo tipo en el cual la
presencia de la mutación se detecta de manera indirecta. De manera
ventajosa, la mutación puede ser detectada por la puesta en
evidencia de falsas apariciones debidos a la presencia de la
mutación después de análisis por hibridación realizada con la ayuda
de al menos una sonda de oligonicleotidos específica de la mutación
buscada.
En cada uno de los casos, se preferirán en
general los métodos en los cuales se amplía la totalidad o parte de
la secuencia que corresponde a la totalidad o parte de la secuencia
definida SEQ ID nº3 es amplificada con la puesta en evidencia de la
mutación. Se conocen bien estos métodos de amplificación.
Por otra parte, los factores mutados CIITA
encontrados en los sujetos que presentan desórdenes de la expresión
de los genes que codifican para las moléculas MHC de tipo II pueden
presentar un diferente antigenicidad de los factores CIITA
naturales identificados SEQ ID nº16, SEQ ID nº17 o SEQ ID nº18. Es
pues posible realizar un diagnóstico o pronóstico de una
susceptibilidad con desordenes vinculados a una desregulación de la
expresión de los genes que codifican para las moléculas MHC de tipo
II, poniendo en evidencia el producto del gen mutado de CIITA, por
ejemplo con la ayuda de anticuerpos, en particular, de anticuerpos
monoclonales, tales como se describen anterior-
mente.
mente.
Otras características y ventajas de la presente
invención aparecerán con la lectura de los siguientes ejemplos,
ilustrados por las figuras 1 a 9. No obstante, la invención no
deberá limitarse al contenido de dichos ejemplos.
La Figura 1 representa las cuatro extremos 5'
del ARNm CIITA identificados según el ejemplo 1. Las regiones que
codifican son indicadas por cajas anchas, las regiones 5' no
traducidas por cajas más pequeñas. Las regiones no homólogas son
indicadas por un relleno distinto. Está indicada la posición de los
dos s P 1 y P2 utilizadas para la amplificación por
RACE-PCR.
La Figura 2 indica la secuencia y la posición de
los diferentes sitios de fijación de los factores de transcripción
conocidos identificados sobre la secuencia de la 5' región que
flanquea el gen CIITA de tipo I. El sitio principal de iniciación de
la transcripción es indicado también por una flecha en + 1.
La Figura 3 indica la secuencia y la posición de
los diferentes sitios de fijación de factores de transcripción
conocidos identificados sobre la secuencia del 5' región que
flanquea el gen CIITA de tipo III. El sitio principal de iniciación
de la transcripción es indicado también por una flecha en + 1.
La Figura 4 indica la secuencia y la posición de
los diferentes sitios de fijación de factores de transcripción
conocidos identificados sobre la secuencia de la 5' región que
flanquea el gen CIITA de tipo IV. El sitio principal de iniciación
de la transcripción es indicado también por una flecha en + 1.
La Figura 5 es una representación esquemática de
las sondas utilizadas en las pruebas de protección con la RNAs
durante los análisis de los perfiles de expresión de los diferentes
ARNm CIITA. Las diferentes sondas se proponen con sus tamaños
"antes de" y "después de" digestión por la RNAse. Cada una
de las sondas corresponde a una parte del exon 1 y a 226 bases
comunes en cada uno de los ARNm.
La Figura 6 es una representación esquemática de
la expresión diferencial de los cuatro tipos de transcritos de
CIITA. La cantidad de cada uno de los tipos de ARNm se indica en
porcentaje con relación a la cantidad total de expresión de CIITA
medida con la ayuda del control interno y después de la
cuantificación por PhosphoImager de los fragmentos obtenidos
seguidos con el análisis de protección por la RNAse.
La Figura 7 es una representación esquemática
del mismo tipo que el de la Figura 6, salvo que la expresión
transcritos de los CIITA es observada después de la inducción por el
interferón \alpha (+IFN\gamma).
La figura 8 representa la organización del
promotor IV humano silvestre y mutado. Se indican la secuencia y
posiciones de los elementos aquí conservados. Las mutaciones
puntuales introducidos a nivel de los elementos GAS, caja E e
IRF-1 se precisa por debajo de la secuencia
silvestre.
La figura 9 representa el análisis funcional del
promotor IV silvestre (wt) y de los mutantes Gm, Em e Im. La tasa
de estimulación de la expresión del gen informador analizado se
indica en porcentaje con relación al la tasa observada con el
plásmido informador silvestre (l100%). Los resultados indicados
corresponden a la media de tres experiencias independientes, está
precisada la desviación normal.
La invención es ilustrada también por los
identificadores de secuencia SEQ ID Nº 1 a SEQ ID Nº 25, los cuales
representan:
-SEQ ID Nº1 a SEQ ID Nº3: las secuencias de los
tres tipos de ADNc que corresponden a los genes CIITA (secuencias
designadas I,II e IV con la figura 1), identificadas según la
invención;
- SEQ ID Nº4 a SEQ ID Nº6: las secuencias
identificadas como que presentan una actividad de promotor
transcripcional en los genes CIITA de forma I, II e IV y designados
respectivamente PI, PII y PIV;
- SEQ ID Nº 7 a SEQ ID Nº 10: las secuencias que
corresponden respectivamente a los diferentes genes CIITA de forma
I a IV, desprovistos de secuencias que presentan una actividad de
promotor transcripcional;
- SEQ ID Nº 11: la secuencia correspondiente a
la parte que codifica del gen - SEQ ID Nº 12: la secuencia que
corresponde a la parte que codifica del gen CIITA de forma II;
- SEQ ID Nº13: la secuencia que corresponde a la
parte que codifica del gen CIITA de forma III;
- SEQ ID Nº14: la secuencia que corresponde a la
parte que codifica del gen CIITA de forma IV, incluida allí una
parte no traducida;
- SEQ ID Nº 15: un fragmento de la secuencia SEQ
ID Nº14, que corresponde a los nucleótidos 901 a 3390, contado a
partir del primer nucleótido del SEQ ID Nº13;
- SEQ ID Nº16: la traducción a amino ácidos de
SEQ ID Nº11, que corresponde a un factor CIITA de forma I
presentando 101 aminoácidos suplementarios en el extremo N terminal,
con relación a SEQ ID Nº17;
- SEQ ID Nº 17: la traducción a amino ácidos de
la parte que codifica genes CIITA de forma I a IV, a partir de un
ATG localizado 21 bases más abajo del extremo 5' del exon 2 común
(figura 1);
- SEQ ID Nº 18: la traducción en aminoácidos del
gen CIITA de forma III, al inicio de un segundo ATG, que
corresponde con un factor CIITA que presenta 24 aminoácidos
suplementarios en el extremo N terminal;
- SEQ ID Nº 19: la traducción a aminoácidos de
SEQ ID Nº15,
- SEQ ID Nº 20 25: cebos de PCR.
Los ARN citoplásmicos o totales se extrajeron a
partir de diferentes líneas celulares: Raji (linfoma de Burkitt),
Mann (linfocito B humano), CEM (línea limfoblastoide T), THP1
(mono), PP2 (fibroblasto), Me67 (melanoma) después de la inducción
por el interferón \gamma y HUVEC (célula endotelial humana), según
la técnica descrita por Wilkinson (1988, Nucleic Acid Res. 16,
10933). El ARN total procedente de la línea BCl (células
dendriticas) ha sido preparado con ayuda de un reactivo al Trizol
(Gibco Brl). Los ARN procedentes de bazo, timo, amígdala y riñón
humanos fueron proporcionados gratuitamente por P Sapino.
El extremo 5' de los ARN obtenidos fue analizado
por la técnica RACE PCR (Frohman et al., 1988, Proc. Natl.
Acad. SCI. Los EE.UU, 85, 8998-9002) según las
instrucciones del fabricante (Gibco BRL) con las modificaciones
siguientes. Después de la transcripción inversa de los ARN y antes
de la etapa de amplificación, se añade una cola de dATP en el
extremo del ADNc. Durante la amplificación PCR, 5 \mul de
ADNc-dA aislado se añaden a 40 \mul de una mezcla
de amplificación que incluye 200 \muM de cada uno de los dNTP y 25
pmol d's específico del gen que codifica para el factor CIITA PI
(5' -GTCCAGTTCCGCGATATTGG-3') y P2 (5'
-TCCCTGGTCTCTTCATCA-3'), 25 pmol d' de adaptación
ADXSC (5' -GACTCGAGTCGACATCG-3') y 10 pmol d' de
adaptación XSCT17 (5' -GACTCGAGTCGACATCGAT-3').
Después de una préincubation de 5 minutos a 95ºC, se añaden 2
unidades de Taq polimerasa y se realiza la amplificación en 30
ciclos de 45 segundos a 94ºC, 25 segundos a 54ºC, 2 minutos a 72ºC.
La última incubación se realiza durante 10 minutos a 72ºC.
Estas amplificaciones permitieron poner en
evidencia cuatro tipos de ADNc que corresponden al factor CIITA. El
análisis de las secuencias de estos ácidos nucléicos mostró que
estos ácidos nucléicos presentaban todos un extremo 3' común
(Exon2) pero divergian completamente al nivel de su extremo 5',
definiendo así cuatro tipos diferentes de exon 1. Estas cuatro
secuencias (Exon 1 variable + Exon 2 común) se identifica I, II, III
e IV (Figura I).
Como lo indica el análisis de las secuencias,
estos cuatro transcritos I, II, III e IV presentan una fase de
lectura común que comienza con el ATG localizada 21 bases más abajo
extremo 5' del Exon 2 común (Figura 1). En el caso de las
secuencias II e IV, este ATG es el primer codón de iniciación. En el
caso de las secuencias I e III, se observa además otro ATG que
conduce a la síntesis de un factor CIITA que presenta 101 ó 24
aminoácidos suplementarios, respectivamente, en el extremo N
terminal del polipéptido traducido.
El sitio de iniciación de la transcripción de
los diferentes ARNm CIITA humanos identificados fue probado por
protección con la RNAse utilizando fragmentos de ADN específicos de
los diferentes Exons 1.
Para los transcritos de tipo I, tres fragmentos
protegidos se identificaron a partir de ácido nucléico aislado de
hígado. El fragmento principal corresponde al sitio de iniciación de
la transcripción localizada 380 bases más arriba del extremo 3' del
Exon 1 (Figura 1). Este sitio se obtuvo como nucleótido + 1 del
ARNm de tipo I. Los dos otros transcritos se obtuvieron a partir de
los sitios de iniciación localizados en posiciones -14 y + 8. Las
localizaciones de estos sitios de iniciación son compatibles con la
utilización, durante la traducción, de las señales ATG
identificadas en el Ejemplo 1.
Para los transcritos de tipo III, se
identificaron varios fragmentos protegidos a partir de ácido
nucléico aislado de linfocitos B. El transcripto mayor corresponde
con una iniciación a partir de la posición 183 bases más arriba del
extremo 3' del Exon 1 y define la posición + 1 de los transcritos de
tipo III. Se localizan otros dos sitios de iniciación a las
posiciones -8 y -4. Otros sitios menores son identificados en las
posiciones -23 y + 34. Estos sitios de iniciación son compatibles
con la utilización de los dos sitios ATG localizados en el Ejemplo
1.
Para los transcritos de tipo IV, se
identificaron numerosos fragmentos protegidos a partir de ácidos
nucléicos aislados de células de melanoma inducidas por el
interferón \gamma. El transcipto principal corresponde a una
iniciación de la transcripción localizada 75 bases más arriba del
extremo 3' del Exon 1 que define la posición + 1 de los transcritos
de tipo IV. Se observa un segundo sitio de iniciación principal en
la posición + 17, así como seis sitios menores localizados entre
las posiciones -54 y + 69 del Exon 1. Estos sitios de iniciación
son compatible con la utilización del ATG localizada 21 bases más
abajo del extremo 5' del Exon 2 (Ejemplo 1).
La presencia de sitios de iniciación diferentes
para cada uno de los ARN I, II, III e IV sugieren que las regiones
promotoras que controlan la expresión de los genes correspondientes
son diferentes (tenida en cuenta PI, PII, PIII y PIV).
Teniendo las divergencias de secuencia
observadas el nivel de los extremos 5' del ARNm (Exon 1 y secuencia
no traducida), el solicitante aisló a continuación las secuencias
genómicas, incluyendo las regiones promotoras, de los genes I, II,
III e IV a partir de un banco mágico \lambda que incluye el genoma
humano.
La comparación de las secuencias que
corresponden a los cuatro promotores PI, PII, PIII y PIV no muestran
homología significativa. Ninguna de estas regiones contiene caja
TATA o GC. Esta última observación explica el número importante de
sitios de iniciación observados para el transcrito dado.
Por el contrario, varios sitios que corresponden
a sitios de fijación de elementos que actúan en cis durante la
transcripción de otros genes pudieron identificarse. Así pues, se
encuentra al promotor PI contiene un sitio Nf-GMb,
un sitio NF-IL6, dos sitios NF-IL6
inversos, un sitio PEA3 y un sitio PEA3 en sentido inverso, un
sitio AP1 y una caja CCAAT (Figura 2). Del mismo modo, el promotor
PIII contiene una caja E2A en sentido inverso, un sitio IRF1/2, un
sitio MYC en sentido inverso y un sitio OCT en sentido inverso
(Figura 3). En el promotor IV son encontrados un sitio
Nf-GMa, una caja GAS, una caja E, un sitio IRF1/2 y
un sitio NfkB (Figura 4).
Con el fin de estudiar el perfil de expresión de
estos diferentes genes en diversos tipos celulares, se prepararon
cuatro fragmentos de ADNc específicos de cada una de las formas de
ARNm como sonda de protección a lal RNAse. Estas sondas están
representadas en la figura 5. Se utiliza un control interno que
permite evaluar la expresión total de los genes que codifican para
CIITA (el nucleótido 1152, sitio PstI, al nucleótido 1344, sitio
NcoI, protegiendo 193 bases de la región común del ARNs (Exon 2).
Las pruebas de protección a la RNAse se realizan sobre 25 \mug
de ARN como anteriormente se describe (Steimle et al., 1993,
Cell, 75, 135-146). Los resultados son
cuantificados por utilización de un PhosphorImager. La función
promotora se cuantifica como siendo el producto de la expresión de
un tipo específico de ARNm con relación a la expresión total de los
genes que codifican para CIITA medido a partir del control
interno.
Se analizó el ARNm resultantes de diferentes
tejidos o líneas celulares que expresaban el gen CIITA de manera
constitutiva o después de inducción por el interferón allí.
Los resultados (Tabla 1 y Figura 6) ponen de
manifiesto que existe un uso diferencial de los promotores PI, PII,
PIII y PIV. Así pues, se puso de manifiesto que el ARNm de tipo I,
resultante de la utilización del PI, se expresaran muy fuertemente
en las células dendríticas (Figura 6), más débilmente en el bazo y
el timo, y en absoluto en los otros tejidos o líneas celulares.
El ARNm de tipo III se detecta en una alta
proporción en diferentes líneas celulares de linfocitos B, así como
en tejidos ricos en linfocitos B tales como el bazo y las amígdalas,
o el timo (Figura 6). Por el contrario, este ARNm de tipo III se
expresa muy débilmente en las células dendríticas o en células
inductibles por el interferón \gamma (Me67.1, THP1, HUVEC y
PP2).
El ARNm de tipo IV son la forma principalmente
expresada después de la inducción por el interferón \gamma. Este
hecho pudo observarse en diferentes líneas celulares inductibles
como Me67.1 (melanoma), THP1 (mono), HUVEC (células endoteliales) y
PP2 (fibroblastos). Por el contrario, este ARNm se expresa
débilmente en los linfocitos B o las células dendríticas (Figura
5).
La actividad funcional y la especificidad de los
tejidos orgánicos de los promotores PIII y PIV fueron analizadas
por transfección celular con construcciones que asociaban un gen
receptor y un promotor. Dado que el ARNm de tipo III se expresa
mayoritariamente en los linfocitos B y que el ARNm de tipo IV es
expresado preferencialmente en las células inductibles por el
interferón \gamma, las líneas celulares de prueba elegidas son la
línea Raji (linfocito B) y Me67.8 (melanoma). El gen receptor
elegido es el gen que codifica para el P glo de conejo. La región
promotora que debe probarse se clona previamente sobre este gen en
el plásmido pG\betaG(+) (Sperisen et al., 1992, PCR.
Methods Appl. 1, 164-170). Los plásmidos
pIII-974 e pIII-322 contienen los
fragmentos -974(NheI)/+101 (HpaII) y -322 (Pstl)/+101
(HpaII) de las regiones genómicas localizadas en 5' del Exon 1 de
tipo III, respectivamente. Los plásmidos pIV-950 e
pIV-461 contienen los fragmentos -950 (XhoI)/+75 y
-461 (KpnI)/+75 de las regiones genómicas localizadas en 5' del
Exon 1 de tipo IV, respectivamente. Se utiliza también un plásmido
llamado de referencia como control: se trata de un plásmido que
contiene un gen que codifica para la \beta globina de conejo que
presenta una eliminación de 40 bases que se transcribe bajo el
control de un promotor constitutivo de pollo
(pGA\betac\betaGID, Sperisen et al., 1992). La expresión
del gen receptor es medida por RT-PCR cuantitativo
tal como se describe en Sperisen AL, y 1992 con las modificaciones
siguientes. 5.10^{6} de células Raji y 2.5 10^{6} de células
Me67.8 transfectadas por electroporación a 250V, 960 \muF
(GenePulser, BioRad) con 20 \mug de una preparación plásmida
constituida de un informe definido de tal plásmido como se describe
anteriormente y del plásmido de referencia y 400 \mug de ARNt de
E. Coli como molécula portadora en 750 \mul de tampón
RPMI. Para la etapa de inducción por el interferón \gamma, los
cultivos celulares se colocan después de su transformación en
presencia (500U/ml) o en ausencia del inductor. Las células se
cultivan a 37ºC durante 48 horas. Los ARN totales se extraen con el
reactivo al Trizol y se someten a una digestión por el ARNsa
libre-ADNseI (Boehringer). Se utiliza 1 \mug de
ARN total para la transcripción inversa en presencia de un
(dT)_{20} y de transcriptasa inversa ARNsa libre
Superscript (50U, GIBCO BRL) y de 10U de inhibidor de ARNsa. En un
segundo tiempo, 1/10 del ADNc obtenido se amplía con los cebos
\beta GP5' (5' -TCCCCCAAAACAGACAGAATGG-3') (40
pmol) y \beta GP3' (5' -GTCACAGTGCAGTTCACTCAG-3')
(40 pmol) en un volumen de 50 \mul que contiene 5 \mul de
tampón 10x Vent en presencia de 2 \muCi (\alpha^{32}
P)dCTP (Amersham). Después de una preincubación de 3 minutos
a 95ºC, se añaden 2U de Vent ADN polimerasa (NEB). La amplificación
se realiza en 30 ciclos de 40 segundos a 94ºC, 30 segundos a 59ºC y
60 segundos a 72ºC. Se depositan Los productos de PCR son
desnaturalizados y depositados sobre gel de poliacrilamida
desnaturalizante (6%, 8M urea). Las señales son cuantificadas por el
Phospholmager.
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que
el transfección de linfocitos B con los plásmidos
pIII-974 y pIII-322 se acompaña de
una fuerte actividad del promotor PIII, mientras que los mismos
promotores son inactivos en las células Me67.8 antes o después de
la inducción. Se constata además en los linfocitos B que el
PIII-322 se expresa mejor que el plásmido
pIII-974.
Por el contrario, con los plásmidos
pIV-950 y pIV-461 se observa una
expresión básica en los linfocitos B pero una muy fuerte expresión
en las células Me67.8 inducidas, y en otros tipos celulares
inducidos (Hela, 2FTGH). Por otra parte, las señales de expresión
de estos dos plásmidos pIV-950 y
pIV-461 tienen valores de 0.13 y 0.18,
respectivamente, antes de la inducción y 7.9 y 29.6,
respectivamente, después de la inducción por el interferón.
\vskip1.000000\baselineskip
Como lo indica la figura 4, SEQ ID Nº 6, que
corresponde más concretamente al promotor CIITA de tipo IV
inductible por una citoquina, contiene al menos tres regiones que
pueden ser implicada en la regulación en cis de la expresión
del gen localizada previamente de dicha secuencia. Se trata las
cajas GAS, E e IRF-1.
Con el fin de estudiar la importancia funcional
de estos elementos, se condujeron algunas experiencias de
mutagénesis dirigidas. Para ello, se construyó un gen receptor que
contiene previamente el gen que codifica para la beta globina de
conejo del plásmido pG\betaG(+) un fragmento de 308 pares de bases
que corresponden a la secuencia -308/+75 de SEQ ID Nº 6. Por
mutagénesis dirigida, se introdujeron varias mutaciones específicas
en el plásmido así construido, en el nivel las regiones que deben
estudiarse (véase Figura 8), dando lugar a tres mutantes tenidos en
cuenta Gm, Em e Im que corresponde respectivamente a la mutación de
las cajas GAS, cajas E e IRF-1.
La actividad transcripcional del plásmido
silvestre (PIV-308 wt) y de cada uno de los mutantes
(Gm, Em e Im) se analiza en la línea celular Me67.8 (melanoma) por
amplificación cuantitativa por PCR reversa de los ARN expresados
(Sperisen et al., 1992, PCR Meth. Appli., 1,
164-170) después de activación por el interferón
gamma. El transfección de las células, la inducción, la preparación
de los ARN y el análisis por PCR reverso se realizan según las
condiciones experimentales anteriormente descritas en
Muhlethaler-Mottet et al., 1997, EMBO J., 16,
2851-2860.
La transfección del plásmido silvestre dentro de
las células Me67.8, en ausencia de activación por el interferón
gamma, conduce a un nivel muy bajo de expresión del gen receptor que
codifica para la \beta globina (no mostrada). Después del
tratamiento de estas mismas células transfectadas con el interferón
gamma, se observa (figura 9) una muy fuerte expresión del gen
\beta globina que traduce una fuerte actividad del promotor IV
(el valor obtenido representa la tasa de estímulo 100%).
De manera idéntica, se analizó la expresión del
gen \beta globina colocado bajo el control de las secuencias IV
mutadas (Gm, Em e Im). Los resultados observados (figura 9) ponen de
manifiesto que las mutaciones aportadas individualmente a las
diferentes regiones conducen a una abolición casi total de la
activación por el interferón gamma (19% de estímulo para Gm, 16%
para Em y 23% para Im). Por otra parte, se construyó un doble
mutante para el cual las mutaciones de las cajas GAS y E se
combinaron. El análisis de la expresión del gen \beta globina
puesto bajo el control de tal promotor IV mutado pone de manifiesto
que se observa también en este caso una expresión del gen receptor
que corresponde al 17% de estímulo obtenido con el promotor
silvestre.
Por lo tanto, estos resultados indican
claramente que cada uno de las regiones GAS, caja E e
IRF-1 desempeñan un papel funcional en la inducción
por el interferón gamma de la expresión de los genes colocados bajo
el control del promotor IV.
\newpage
Habiendo mostrado la importancia funcional del
sitio de fijación IRF-1 para la función del promotor
IV y dado el papel desempeñado por el factor IRF-1
en la inducción de varios genes activables por el interferón gamma,
tal como por ejemplo el gen GBP (Briken et al., 1995, Mol
Cell. Bio., 15,975-982), estudiamos el papel del
factor IRF-1 en la inducción por el interferón gamma
del gen CIITA. Para ello, la expresión de ARN mensajeros de CIITA
se analizó, después de estímulo por el interferón gamma, en
fibroblastos embrionarios derivados de ratón de fenotipo silvestre
o ratón IRF-1, es decir, que no expresan el factor
IRF-1. Los experimentos de protección con la ARNsa
permitieron poner en evidencia que, contrariamente a lo que se
observa en los ratones silvestres, la expresión de los ARN
mensajeros de CIITA obtenidos después de estímulo por el interferón
gamma se reduce fuertemente en la línea IRF-1'. De
manera idéntica, se puso de manifiesto que el estímulo del gen GBP
se inhibe también en los ratones mutantes. Estos resultados ponen de
manifiesto que la secuencia IRF-1 es un factor
esencial para la eficacia de la inducción por el interferón
gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante tiene por objeto solamente ayudar al lector y no forma
parte del documento de patente europeo. Aunque se concedió el mayor
cuidado a su elaboración, no pueden excluirse errores u omisiones y
el OEP declina toda responsabilidad a este respecto.
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Cell. Biol., 1995, vol. 15, 975-982
[0101]
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: TRANSGEN SA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11 RUE MOLSHEIM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: STRASBOURG
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 67082
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (33)388 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (33)388 22 58 07
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLÉICO DE GENES CIITA, SUSCEPTIBLES DE ESTAR IMPLICADOS EN EL CONTROL Y LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES CODANTES PARA MOLÉCULAS MHC DE TIPO II Y SU UTILIZACIÓN, PRINCIPALMENTE COMO MEDICAMENTO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 25
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: FR 9704954
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO: 22-APR-1997
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5463 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: gen cIIta de TIPO I
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4564 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: gen cIIta de TIPO II
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5105 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: gen cIIta de TIPO IV
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 717 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor cIIta de TIPO I
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 133 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor cIIta de TIPO II
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRICPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 664 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor cIIta de TIPO IV
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4746 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta de TIPO I
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4431 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta de TIPO II
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4549 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta de TIPO III
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4441 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE: DE BRINS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta de TIPO IV
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4649 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta de TIPO I
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4346 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta de TIPO II
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4418 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta de TIPO III
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4366 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta de TIPO IV
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA. SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2480 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: 901-3390
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1207 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta de TIPO I
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1106 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta de TIPO I
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1130 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cIIta
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 830 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cebo P1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCCAGTTCC GCGATATTGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cebo P2
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCCTGGTCT CTTCATCA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cebo de adaptación ADXSC
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTCGAGTC GACATCG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cebo de adaptación XSCT17
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTCGAGTC GACATCGAT
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cebo betaGP5'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCCCCAAAA CAGACAGAAT GG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMALES: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: cebo betaGP3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCACAGTGC AGTTCACTCA G
\hfill21
Claims (48)
1. Secuencia de ácido nucleico que comprende la
totalidad o parte de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID Nº3 de
un gen CIITA o su secuencia complementaria, tal que o la dicha parte
o su secuencia complementaria
a) presenta una actividad de promotor
transcripcional inducida por una citoquina, o bien
b) incluye la parte no traducida de la secuencia
SEQ ID Nº3.
2. Secuencia de ácido nucleico mutada con
relación a una secuencia según la reivindicación 1, que contiene
menos de 20 mutaciones puntuales en total y que presenta una
actividad de promotor transcripcional inducida por una
citoquina.
3. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia incluye la
secuencia SEQ ID Nº6 o su secuencia complementaria.
4. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 1 caracterizada porque la dicha actividad de
promotor se expresa específicamente en un tipo celular.
5. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 1 caracterizada porque la dicha citoquina es
escogida entre el grupo que consiste en el interferón \gamma la
la interleucina 4.
6. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 5 caracterizada porque dicha secuencia incluye
la totalidad o parte de la secuencia SEQ ID Nº6, o de su secuencia
complementaria.
7. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 1 caracterizada porque comprende, toda o parte
de la secuencia SEQ ID Nº10 o de su secuencia complementaria.
8. Secuencia de ácido nucleico
caracterizada porque comprende al menos una secuencia según
la reivindicación 1a) o según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6 en su dependencia de la reivindicación 1a),
localizada previamente al menos una cualquiera de las secuencias
según la reivindicación 7.
9. Secuencia de ácido nucleico
caracterizada porque comprende al menos una secuencia según
la reivindicación 1a) o según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6 en su dependencia de la reivindicación 1a),
localizada previamente la totalidad o parte de al menos una
cualquiera de las secuencias SEQ ID Nº7, SEQ ID Nº8, SEQ ID Nº 9,
SED ID Nº 11, SEQ ID Nº 12, SEQ ID Nº 13, SEQ ID Nº 14 Y SEQ 10 Nº
15 y su secuencia complementaria.
10. secuencia de ácido nucleico que codifica
para un polipéptido CIITA que consiste en los aminoácidos definidos
según el SEQ ID Nº17.
11. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 1, que comprende al menos 10 bases, utilizable como
cebo para la amplificación enzimática o como sonda de detección.
12. Secuencia de ácido nucleico que comprende la
totalidad o parte de la secuencia SEQ ID Nº3 o de su secuencia
complementaria, que comprende de 5 a 50 nucleótidos, capaz de
hibridación con una secuencia de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en condiciones que
garantizan al menos un 95% de homología, y capaz de bloquear la
actividad promotora de la dicha secuencia.
13. Secuencia de ácido nucleico que comprende la
totalidad o parte de la secuencia SEQ ID Nº3 o de su secuencia
complementaria, que comprende de 5 a 50 nucleótidos, capaz de
hibridación con una secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 1 en condiciones que garantizan al menos un 95% de
homología, y capaz de inhibir la síntesis del polipéptido
codificado por la dicha secuencia.
14. Vector de clonación o de expresión
caracterizado porque comprende al menos una secuencia según
una de las reivindicaciones 1 a 10.
15. Vector de expresión según la reivindicación
14 que comprende al menos un gen de interés colocado bajo el
control de al menos una secuencia de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
16. Vector de expresión según la reivindicación
15 caracterizado porque el dicho gen de interés se elige
entre los genes que codifican para un factor CIITA, las cadenas
\alpha y \beta de las moléculas HLA-DR,
HLA-DQ y/o HLA-DP.
17. Vector de expresión según la reivindicación
15 caracterizado porque el dicho gen de interés es un gen
receptor.
18. Vector de expresión según la reivindicación
17 caracterizado porque el dicho gen receptor es el gen que
codifica para la \beta globina de conejo.
19. Vector de expresión según la reivindicación
14 que comprende al menos una secuencia según la reivindicación 6
colocada bajo el control de elementos que permiten la expresión de
dichas secuencias.
20. Vector de expresión según la reivindicación
19 caracterizado porque los dichos elementos que permiten la
expresión consisten en al menos una secuencia de ácido nucleico
según la reivindicación 1a) o según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6 en su dependencia de la reivindicación
1a).
21. Vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 20 caracterizado porque se trata de un
vector con replicación autónoma.
22. Vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 20 caracterizado porque se trata de un
vector de integración cromosómica.
23. Vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 20 caracterizado porque se trata de un
vector viral.
24. Vector según una de las reivindicaciones 14
a 20 caracterizado porque el vector se realiza sobre la base
de un adenovirus, de un retrovirus, de un poxvirus o de un virus
herpético.
25. Célula transformada por y que comprende un
vector según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24.
26. Célula según la reivindicación 25
caracterizada porque se trata de una célula procariota.
27. Célula según la reivindicación 25
caracterizada porque se trata de una célula eucariota.
28. Célula según la reivindicación 25
caracterizada porque la dicha célula se escoge en el grupo
que consiste en célula dendrítica, linfocito B, linfocito T,
macrófago, monocito, célula del epitelio tímico, célula muscular,
fibroblasto, célula endotelial y célula cancerosa, en particular,
célula de melanoma.
29. Método de producción de un polipéptido CIITA
tal como se define en la secuencia SEQ ID Nº17, que incluye
(i) el cultivo de una célula hospedera según una
de las reivindicaciones 25 a 28, en condiciones de cultivo
convenientes que permiten la producción del dicho polipéptido y
(ii) la recuperación del dicho polipéptido.
30. Polipéptido CIITA susceptible de ser
obtenido por la aplicación del método según la reivindicación
29.
31. Polipéptido según la reivindicación 30
caracterizado porque presenta la misma función
transactivadora de la expresión de los genes que codifican para
moléculas MHC de clase II que un factor CIITA.
32. Anticuerpo policlonal o monoclonal
caracterizado porque se obtiene por reacción inmunológica de
un organismo humano o animal con un agente immunogénico que
comprende al menos un polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 31.
33. Molécula inhibidora capaz de inhibir la
actividad transactivadora de un polipéptido según la reivindicación
31 que consiste en un anticuerpo según la reivindicación 32.
34. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 1a) caracterizada porque comprende una
mutación puntual que afecta a la actividad de promotor
transcripcional de la dicha secuencia modificando la regulación de
la eficacia o la especificidad celular del dicho promotor.
35. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 7, caracterizada porque comprende una mutación
puntual que afecta la función o la expresión de un factor
CIITA.
36. Método de diagnóstico de una predisposición
a una afección vinculada a un desorden de la expresión de los genes
que codifican para las moléculas MHC de clase II
caracterizada porque:
- se determina, sobre una muestra biológica de
un paciente, la presencia de al menos una mutación de una secuencia
de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 7 que afecta
función o a la expresión de un factor CIITA, por análisis de la
dicha secuencia de ácido nucleico y comparación con una secuencia
silvestre.
37. Método de diagnóstico según la
reivindicación 36 caracterizada porque la o las mutaciones
que se busca determinar son mutaciones que afectan la actividad de
promotor transcripcional de una secuencia de ácido nucleico según
una de las reivindicaciones 1 a 6.
38. Método de diagnóstico según la
reivindicación 37 caracterizado porque la o las mutaciones
que se busca determinar son mutaciones que afectan la especificidad
celular de la dicha actividad de promotor transcripcional.
39. Método de diagnóstico según la
reivindicación 37 caracterizada porque la o las mutaciones
que se busca determinar son mutaciones que afectan la inducción por
una citoquina de la dicha función promotora.
40. Método según una de las reivindicaciones 36
a 39 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico
analizada es un ADN genómico.
41. Método según una de las reivindicaciones 36
a 40 caracterizado porque se determina la presencia de al
menos una mutación por hibridación.
42. Método según la reivindicación 41
caracterizado porque la dicha hibridación se realiza con
ayuda de al menos una sonda oligonucleotídica específica de la
mutación buscada.
43. Composición farmacéutica que comprende al
menos una sustancia tal como se define según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, 12-24 o
30-35.
44. Composición farmacéutica según la
reivindicación 43 caracterizada porque comprende al menos una
sustancia según una cualquiera de las reivindicaciones
1-6, 14-16, 19, 20, 30 para el
tratamiento de afecciones para las cuales se desea un aumento de la
expresión de los genes que codifican para las moléculas MHC de clase
II.
45. Composición farmacéutica según la
reivindicación 44 caracterizada porque el dicho aumento de la
expresión de los genes que codifican para las moléculas MHC de
clase II se desea específicamente en un tipo celular.
46. Composición farmacéutica según la
reivindicación 45 caracterizada porque el dicho aumento de la
expresión de los genes que codifican para las moléculas MHC de
clase II se desea después de la inducción por una citoquina, y más
concretamente por el interferón \gamma ó la interleucina 4.
47. Composición farmacéutica según la
reivindicación 46 caracterizada porque la dicha sustancia
consiste en la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación
5.
48. Composición farmacéutica según la
reivindicación 44 caracterizada porque comprende al menos una
sustancia según una cualquiera de las reivindicaciones 10, 11,
30-33 para el tratamiento de afecciones para las
cuales se desea una reducción de la expresión de los genes que
codifican para las moléculas MHC de clase II.
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