CN1662262A - 治疗和/或预防Th2细胞因子相关变态反应病的诱骗物、GATA3突变蛋白、和包含它们的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明通过抑制GATA3蛋白与Th2细胞因子基因簇中低亲和力GATA3结合序列的结合，并因此抑制Th2细胞因子稳定且充分表达所需要的染色质重构，提供了能特异性抑制Th2细胞因子的产生的GATA3诱骗物和GATA3突变蛋白，以及包含它们的药物组合物。

Description

治疗和/或预防Th2细胞因子相关变态反应病的 诱骗物、GATA3突变蛋白、和包含它们的药物组合物
技术领域
本发明涉及治疗和/或预防与Th2细胞因子相关的变态反应疾病的制剂，以及治疗和/或预防同样疾病的方法。
背景技术
在发达国家，Th2细胞因子相关的变态反应疾病占保健支出的一大部分。全球有超过1.5亿人患有哮喘，相应地分别在日本和美国形成了每年2300亿日元和7600亿日元的哮喘治疗剂市场。过敏性哮喘是一种在儿童和成人中都广泛分布的慢性炎性肺疾病，其主要症状包括因呼吸道高反应性和呼吸道炎症引起的通气障碍，这可能会经由体位性asthmaticus导致死亡。除了环境因素外，遗传易感性也被认为与患该疾病有关。然而，患该疾病的详细机理仍有待澄清。
目前用于哮喘的治疗剂大致分为两类：1)以支气管扩张为靶用于治疗哮喘发作的黄嘌呤衍生物和β2激动剂(包括类固醇)；和2)可以用作长期施用的药剂的具有抗炎症效应的抗过敏剂，包括化学介质释放抑制剂例如色甘酸二钠、组胺拮抗剂、血栓烷抑制剂和白三烯拮抗剂。真正意义上哮喘治疗剂应该是能够控制疾病的根本方面，即呼吸道炎症反应的变态反应控制剂，而不是那些用于症状治疗的治疗剂。因此，本领域渴望开发属于这一新类别的，能够预防变态反应疾病发病的治疗药物。用于吸入或内服的类固醇是目前所使用的最有效和强有力的药品。它们通过抑制免疫细胞活性迅速地缓解呼吸道炎症并发挥强效的抗哮喘效应。然而，因为其强烈的副作用，类固醇不适宜长期使用。绝大多数迄今为止所开发的抗变态反应剂抑制在不同水平上触发哮喘发作的炎性细胞生成的化学介质。最近发现2型辅助性T淋巴细胞(Th2)及其产生的细胞因子在变态反应的发病中扮演关键角色(参见，例如O′Garra，A.(1998)Immunity 8：275；Glimcher，L.H.和Murphy，K.M.(2000)Genes Dev.14：1693；Murphy，K.M.，等(2000)Annu.Rev.Immunol.18：451)。后来，抑制Th2细胞因子，例如IL-4，IL-5和IL-13功能的抗体等，已被开发做治疗剂，目前正在进行临床试验。然而，很多变态反应疾病主要是反复地暴露于过敏原所导致的。因此，抑制靶向Th2细胞因子自身的过敏反应可能不是一种有效的治疗方法。
多组研究人员已经研究了Th2细胞的分化机理及该机理中涉及到的因子。结果，GATA3蛋白被揭示不仅具有转录因子的功能，而且对Th2细胞的分化和定型起到重要作用。这一过程的抑制剂被认为可用作针对所有类型变态反应疾病，包括很难停用类固醇药物的严重哮喘的完全新型的治疗药剂。
辅助性T淋巴细胞基于它们的细胞因子产生模式，至少被分为两个亚型：Th1和Th2。这一现象最初被认为是体内克隆的T细胞所特有的。然而，已经发现，对小鼠寄生虫的敏感性和例如人类的麻风病这样的实际疾病的预后是由这两种亚型哪一种被激活所决定。因此，这些亚型被认为是决定传染疾病预后的重要因子。产生IFNγ和淋巴毒素的Th1细胞被认为参与了细胞免疫，且对清除细菌和病毒这样的细胞内病原体很重要。Th1细胞的不适当活化诱导自身免疫疾病。另一方面，产生IL4、IL-5和IL-13等的Th2细胞与体液免疫有关，且在消灭寄生虫中发挥作用。然而，已知Th2细胞的过度活化会引起变态反应疾病，例如哮喘和特应性皮炎。
基于这一新机理的用于控制Th2细胞的有效方法对于治疗近年来增加的变态反应疾病的是必需的。Th2细胞由于抗原刺激而从初始T细胞分化，IL-4是诱导Th2细胞分化的主要的细胞因子。IL-4与其受体的结合激活了它下游的信号传导途径JAK/STAT，最终诱导Th2细胞特异的转录因子GATA3蛋白的表达。Th2细胞因子基因簇集于人第5号染色体(小鼠11号染色体)，编码IL-4，IL-13和IL-5的基因存在于q23-31的160Kb的区域内。很长一段时间，人们观察到Th2细胞因子基因群的转录在Th2细胞分化以后同时开启。然而，直到最近，其潜在的机理也还没被揭示。沿着这一脉络，本发明人最近发现了在这一基因簇内控制Th2细胞因子基因表达的区域(Takemoto，N.，等(1998)Int.Immunol.10：1981-1985；Takemoto，N.，等(2000)J.Immunol.165：6687-6691)。
这一区域(HSS1，2和3)与在不同哺乳动物中核苷酸序列高度保守的CN-1至CN-15这15个区域中的CNS-1区域表现出良好对应性。在动物实验中，这一位点的缺失削弱了IL-4，IL-5和IL-13的表达。因此，这表明这一区域有在球蛋白基因中被很好地加以研究的“位点控制区”(Locus ControlRegion，LCR)样功能。本发明人还证明了(CNS-1/HSS1，2)区域有GATA3蛋白的识别序列，GATA3蛋白实际上与该序列相结合(Takemoto，N.al.等，(2000)同上)。
发明内容
本发明涉及治疗和/或预防Th2细胞因子相关的变态反应疾病的药物组合物。特别是，本发明涉及GATA3诱骗物和GATA3突变蛋白。更进一步地，本发明提供在Th2细胞因子的产生所需要的Th2细胞因子基因簇所存在的染色体位点上特异性地抑制染色质重构的GATA3诱骗物和GATA3突变蛋白。此外，本发明还提供了一种筛选旨在抑制前述染色质重构的、用于治疗和/或预防Th2细胞因子相关的变态反应疾病的制剂的方法。
Th2细胞的体外诱导需要在IL-4存在的条件下对初始T细胞进行多重抗原刺激。通过这些反复刺激，Th2细胞分化达到最终阶段，此后不再改变其表型。这种现象被称做“细胞定型”，类似于造血干细胞定向成为分化的白细胞、而该白细胞绝不会转变为红细胞的过程。在例如哮喘这样的变态反应性疾病中被激活的Th2细胞从前被认为是处于这一最终阶段；因此被推定为不可能改变其表型和其细胞因子产生活性。然而，本发明人已经发现并报道了上述GATA3蛋白转录因子改变细胞特性并通过改变染色质结构迫使细胞产生其它的细胞因子来完成向Th1细胞的再分化的诱导，这一行为在以前被认为是不可能的(Lee等，(2000)J.Exp.Med.192：105；Takemoto，N.等，(2000)supra)。因此，特异性抑制GATA3转录因子蛋白功能的低分子化合物和诱骗物核苷酸使得作为变态反应基础的Th2细胞转化，相应地，它们代表了与涉及针对炎症的症状治疗或从总体上抑制免疫细胞的现有药物(例如，类固醇)有所不同的新型治疗剂的潜在候选物。
本发明人已经发现GATA3蛋白的主调节物功能与伴随初始(naive)T细胞向Th2细胞定型的染色质结构改变有关，更进一步地，他们还揭示，这一功能是通过GATA3蛋白的一个特定结构域对一段核苷酸序列的识别显示出来的，这一核苷酸序列与GATA3蛋白的一般功能所需的DNA序列有所不同。最后，他们还发现了GATA3蛋白用作哮喘的新型治疗剂的靶。
基于这些发现，本发明详细说明了GATA3蛋白所结合的DNA序列发挥其作为主调节物的功能(SEQ ID NO：3显示小鼠的有义链序列，SEQ IDNO：6是人类的有义链序列，图1的最上方也描述了小鼠的HSS2序列)。本发明还揭示相对于GATA3蛋白与IL-5基因和TCRα基因转录调节区域内的其它GATA3结合序列的结合，GATA3蛋白与这一序列的结合具有不同的结合方式。也就是说，我们发现与这一序列结合所需的GATA3蛋白内的区域不同于与被GATA3蛋白转录激活的基因(例如IL-5和TCRα基因)转录调节区域内的其它GATA3结合序列结合所需的区域。进一步地，还发现了结合亲和力的差异。
因此，本发明包含可用于治疗和/或预防哮喘的如下实施方案1-30：
[1]用于治疗和/或预防与Th2细胞因子相关的变态反应疾病的GATA3诱骗物。
[2]根据[1]所述的GATA3诱骗物，其中诱骗物通过抑制GATA3蛋白与基因组中HSS2序列的结合抑制Th2细胞因子基因簇区域的染色质重构，并因而抑制T细胞中一种或多种Th2细胞因子的产生。
[3]根据[2]所述的GATA3诱骗物，其中诱骗物不抑制GATA3蛋白与被GATA3蛋白转录激活的基因的转录调节区域中GATA3结合序列的结合。
[4]根据[2]所述的GATA3诱骗物，其中与GATA3蛋白与基因组中HSS2序列的结合相比，诱骗物在较低水平抑制GATA3蛋白与被GATA3蛋白转录激活的基因中转录调节区域的GATA3结合序列的结合。
[5]根据[1]所述的GATA3诱骗物，其中诱骗物特异性抑制GATA3蛋白与基因组中HSS2序列的结合。
[6]根据[1]-[5]中任一所述的GATA3诱骗物，其中诱骗物包含包含SEQID NO：3、4、5或6中所示序列的双链寡核苷酸或其衍生物。
[7]根据[1]-[6]中任一所述的GATA3诱骗物，其中诱骗物有效抑制GATA3蛋白与T细胞基因组中HSS2序列的结合，并且其中诱骗物可以被施用，所施用的浓度使得与GATA3蛋白与基因组中HSS2序列的结合相比，诱骗物在较低水平抑制GATA3蛋白与被GATA3蛋白转录激活的基因中转录调节区域的GATA3结合序列的结合。
[8]GATA3突变蛋白或其衍生物，其中
a)保留了野生型GATA3蛋白C指区域的氨基酸序列；或
b)野生型GATA3蛋白C指区域的氨基酸序列中一或多个氨基酸被缺失、取代或插入，但仍保留与HSS2序列结合的能力。
[9]根据[8]所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活区域的一或多个氨基酸被缺失、取代或插入，使得GATA3蛋白诱导染色质重构的能力丧失。
[10]根据[9]所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活区域的至少10个氨基酸残基被缺失。
[11]根据[8]-[10]任一所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白N指区域的一或多个氨基酸进一步被缺失、取代或插入，使得与包含被GATA3蛋白转录激活的基因中转录调节区域中的GATA3结合序列的DNA结合的能力丧失。
[12]根据[8]-[10]任一所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白N指区域的至少一个氨基酸残基被缺失。
[13]GATA3突变蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活区域的至少10个氨基酸残基被缺失，且N指区域的至少一个氨基酸残基被缺失。
[14]小鼠GATA3突变蛋白或其衍生物，其中SEQ ID NO：1所述小鼠野生型GATA3蛋白的氨基酸序列的第29-168位氨基酸被缺失。
[15]人GATA3突变蛋白或其衍生物，其中SEQ ID NO：2所述人野生型GATA3蛋白的氨基酸序列的第29-169位氨基酸被缺失。
[16]根据[14]所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中至少SEQ IDNO：1所述小鼠野生型GATA3蛋白N指区域氨基酸序列的第280-287位氨基酸被进一步缺失。
[17]根据[15]所述的人GATA3突变蛋白或其衍生物，其中至少SEQ IDNO：2所述人野生型GATA3蛋白N指区域氨基酸序列的第281-288位氨基酸被进一步缺失。
[18]根据[8]-[17]任一所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中蛋白或衍生物具有与HSS2序列结合、但抑制T细胞的Th2细胞因子产生的能力。
[19]根据[18]所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中与包含被GATA3蛋白转录激活的基因中转录调节区域中的GATA3结合序列的DNA结合的能力丧失。
[20]编码根据[8]-[19]中任一所述的GATA3突变蛋白的核酸。
[21]包含根据[20]的核酸的载体。
[22]根据[21]的载体，其中的载体是表达载体。
[23]包含根据[21]或[22]的载体的宿主细胞。
[24]治疗和/或预防Th2细胞因子相关的变态反应性疾病的药物组合物，其中的组合物在施用给哺乳动物后，通过抑制GATA3蛋白与基因组中HSS2序列的结合而抑制Th2细胞因子基因簇区域中的染色质重构，从而抑制一种或多种Th2细胞因子的产生。
[25]根据[24]所述的药物组合物，其中药物组合物包含根据[1]-[7]中任一的一种或多种GATA3诱骗物。
[26]根据[24]的药物组合物，其中药物组合物包含根据[8]-[19]中任一的一种或多种GATA3突变蛋白。
[27]根据[24]的药物组合物，其中药物组合物包含根据[20]的一种或多种编码GATA3突变蛋白的核酸。
[28]根据[24]的药物组合物，其中药物组合物包含根据[21]或[22]的一种或多种载体。
[29]筛选用于治疗和/或预防Th2细胞因子相关的变态反应疾病的药物的方法，该方法包括如下步骤：
a)在允许野生型GATA3蛋白或GATA3突变蛋白与双链DNA或其衍生物结合的条件下，将野生型GATA3蛋白或具有与HSS2序列结合的能力的GATA3突变蛋白与双链DNA或其包含HSS2序列的衍生物一起孵育，有或者没有测试化合物存在；
b)检测野生型GATA3蛋白或GATA3突变蛋白与双链DNA或其衍生物的结合；和
c)鉴定能抑制所述结合的测试化合物。
和
[30]根据[29]所述的方法，其中方法进一步还包括下列步骤：
d)在允许野生型GATA3蛋白或GATA3突变蛋白与双链DNA或其衍生物结合的条件下，将野生型GATA3蛋白或具有与基因的转录调节区域中的GATA3结合序列结合的能力的GATA3突变蛋白与双链DNA或其包含所述基因转录调节区域中的GATA3结合序列的衍生物一起孵育，有或者没有测试化合物存在；
e)检测野生型GATA3蛋白或GATA3突变蛋白与双链DNA或其衍生物的结合；和
f)鉴定测试化合物，与步骤b)中的结合相比，该化合物在较低水平抑制步骤e)的结合。
本文术语“Th2细胞因子”包含Th2细胞产生的白细胞介素(IL)-4，IL-13和IL-5。产生这些细胞因子是Th2细胞的特性，在Th1细胞中没有发现。
本文术语“Th2细胞因子相关的变态反应(allergic)疾病”包含前面所述的Th2细胞因子的产生与这些疾病的发作机制相关的变态反应性疾病，例如哮喘，特应性皮炎(atopic dermatitiss)，变应性哮喘(atopic asthma)和花粉症。
本文术语“GATA3诱骗物(decoy)”包含所有能特异性拮抗GATA3蛋白的DNA结合位点的化合物。这些化合物包括但不仅限于核酸及其衍生物。GATA3诱骗物的优选例子包括包含IL-5基因转录调节区的GATA3结合序列的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO：4所示的来源于小鼠的寡核苷酸及相应的人类寡核苷酸)；包含TCRα基因转录调节区GATA3结合序列的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO：5所示的来源于小鼠的寡核苷酸及相应的人类寡核苷酸)；包含HSS2序列中的GATA3结合序列的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO：3所示的来源于鼠的寡核苷酸及相应的SEQ ID NO：6所示的人类寡核苷酸)。如以下实施例所示，包含IL-5基因转录调节区的GATA3结合序列的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO：4所示寡核苷酸)或包含TCRα基因转录调节区中的GATA3结合序列的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO：5所示的寡核苷酸)与GATA3蛋白的结合特异性高于GATA3蛋白与HSS2序列内GATA3蛋白序列的结合特异性。因此，抑制GATA3蛋白与HSS2序列的结合可以在较低浓度下完成。这意味着当高结合亲和力的、含GATA3结合序列的寡核苷酸或其衍生物或修饰物被用做诱骗物对患者施用时，GATA3蛋白与HSS2序列的低亲和力结合被抑制。然而，相比于对HSS2序列与GATA3蛋白的低亲和力结合的抑制，GATA3蛋白与其它GATA3结合序列的高亲和力结合由于其高亲和力而很难被抑制。因为染色质重构所必需的HSS2序列与GATA3蛋白间的结合，相比于其它GATA3结合序列与GATA3蛋白之间的结合具有较低亲和力，诱骗物浓度应达到一定水平，使能够选择性地抑制HSS2序列与GATA3蛋白之间的结合。本领域技术人员可以用例如凝胶移位分析(gel shift assay)和细胞培养这样的技术通过一般的体外试验程序很容易地估计出这一浓度。
用做诱骗物的寡核苷酸可以是DNA或RNA，也可以包含修饰的核苷酸和其它化合物。进一步地，寡核苷酸可以包含突变体，例如在一或多个位点的序列缺失、取代和/或添加，只要诱骗物寡核苷酸没有丢失结合GATA3蛋白的能力。此外，该寡核苷酸可以是单链或双链，线性或环状。更优选地，诱骗物寡核苷酸是双链寡核苷酸并包含一或多个GATA3结合序列。SEQID NO：3，4，5和6给出了各序列的有义链，当被用作双链时，使用与其互补链退火的每一寡核苷酸。为了抑制施用前与施用后的降解，可以用硫原子取代磷酸二酯位点的氧原子产生硫代磷酸二酯键，以此来对该寡核苷酸进行修饰。此外，磷酸二酯位点可以用不带电荷的甲基磷酸取代。也可以进行烷化，酰化或其它的化学修饰。本发明的GATA3诱骗物可以用传统的化学或生物化学方法来合成。当诱骗物是核酸时，它可以用任何基因操纵技术(包括限制性酶切和基因重组方法)、PCR方法或核酸合成仪来合成。本领域技术人员可以很容易地操作这些方法。
这里所用的HSS2序列是包含在位于基因组的IL-4和IL-13基因之间CNS-1区域内的DNase I高敏感位点(HSS2位点)(该位点很容易被DNase I切开)附近的GATA3结合序列的序列。例如，图1顶部HSS2列所示的序列(有义链如SEQ ID NO：3所示)是小鼠HSS2序列。人HSS2序列如SEQ ID NO：6所示(仅示出了有义链)。如同所述那样，HSS2序列能结合到GATA3蛋白上，这样的结合对于染色质重构是必需的，染色质重构进而是T细胞中Th2细胞因子产生所必需的。
本文术语“GATA3结合序列”是指被GATA3蛋白特异性结合、包含GATA3蛋白结合共有序列(A/T)GATA(A/G)的DNA序列。GATA3蛋白是一个影响到很多基因的转录因子。已知被GATA3蛋白转录激活的基因的转录调节区含有GATA3结合序列，且GATA3蛋白与该序列的结合对于该基因的转录激活来说是必需的。这样的基因的例子包括但不仅限于IL-5基因，TCRα基因和CD8。前面所述的对染色质重构所必需的GATA3蛋白与HSS2序列的结合，也是依靠GATA3蛋白与HSS2序列内的GATA3结合序列的结合。对GATA3蛋白来说，与HSS2序列的结合相比于与前述的基因的转录调节区内GATA3结合序列的结合，结合亲和力较低。此外，它据信只是通过染色质重构对染色质结构进行修饰，而不是对特定基因进行转录激活。因此，HSS2序列中的GATA3结合序列不包括在说明书中的上下文中所使用的术语“位于基因转录调节区的GATA3结合序列”中。
本文术语“染色质重构”指T细胞中，由于GATA3蛋白与染色体上Th2细胞因子基因簇所在区域结合所引起的染色质结构的修饰，这种修饰导致Th2细胞因子基因通过基因特异性转录调节机制被转录。也就是说，当GATA3蛋白与基因组HSS2序列的结合受到抑制或阻遏时不发生染色质重构，Th2细胞因子也不能稳定地或足量地产生。
来自不同动物物种的GATA3蛋白的氨基酸序列是已知的。例如SEQ IDNO：1和2分别示出小鼠和人的野生型GATA3蛋白的氨基酸序列。这些序列是高度保守的；仅人类的第38位氨基酸丙氨酸在小鼠中缺失，这导致第38位氨基酸C-末端一侧的单个氨基酸位移。GATA3蛋白的基本结构在所有的物种中都是保守的，并在N-末端包含反式激活区，该区含两个反式激活域，反式激活域I(人氨基酸序列第30-74位，小鼠氨基酸序列第30-73位)和反式激活域II(人氨基酸序列第131-214位，小鼠氨基酸序列第130-213位)。所述序列的C-末端一侧含有两个锌指(zinc finger)区域。靠近N-末端的锌指区被称为N指(人氨基酸序列第264-288位，小鼠氨基酸序列第263-287位)，另一个靠近C-末端，被称为C指(C指：人氨基酸序列第305-326位，小鼠氨基酸序列第304-325位)。这些锌指区域的每一个含有4个半胱氨酸残基，其中任一半胱氨酸残基的缺失或取代都能导致功能的丧失。与基因转录调节区的GATA3结合序列结合既需要N指区也需要C指区，而且，进一步的，反式激活区是诱导结合后的转录激活所必需的。另一方面，染色质重构所必需的GATA3蛋白与HSS2序列的结合仅需C指区；N指区不是必需的。因此，本发明包含GATA3突变蛋白，其C指区的氨基酸序列不变或发生一或多个氨基酸的缺失、取代或添加，只要在缺失、取代或添加后还保留诱导染色质重构所必需的蛋白质与HSS2结合的能力。因此，尽管N指区发生一或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入可能导致突变蛋白丧失结合到基因转录调节区的GATA3结合序列上的能力，突变体蛋白结合到HSS2序列上的能力不受这样的缺失、取代或插入的影响。优选的能结合到HSS2序列上但不具有结合到基因的转录调节区的GATA3结合序列上的能力的GATA3突变蛋白包含在N指区的氨基酸序列中的至少一个残基，优选5个残基或更多，更优的是8个残基或更多，再优的是10个残基或更多的缺失、取代或插入。例如在实施例中所用的小鼠的delN GATA3突变蛋白已经失去了与IL-5和TCRα基因转录调节区的GATA3结合序列的结合能力，但能诱导染色质重构因为它保留了结合到HSS2序列上的能力。
此外，反式激活区域是诱导结合后的染色质重构所必需的，因此，在这个区域有一或多个氨基酸(优选10个或更多残基)的缺失、取代或添加的GATA3突变蛋白可能丧失诱导染色质重构的能力但保留了结合到GATA3结合序列的能力。优选的能结合到GATA3结合序列上但不能诱导染色质重构的GATA3突变蛋白包含反式激活区域内氨基酸序列的至少一个、优选10个或更多、更优选50个或更多、甚至更优选100个残基或更多残基的缺失、取代或插入。例如，在实施例中所用的小鼠的delTA GATA3突变蛋白有结合到GATA3结合序列的能力，但丧失了诱导染色质重构的能力。
因此，GATA3突变蛋白在N指区氨基酸序列中包含一或多个残基、优选5个或更多残基、更优选8个或更多残基、甚至更优选10个或更多残基的缺失、取代或插入，并且此外，在反式激活区域的氨基酸序列有一或多个残基、优选10个或更多残基、更优选50个或更多残基、最优选100个残基或更多残基的缺失、取代或插入时，可能丧失了与基因转录调节区的GATA3结合序列的结合能力，并且此外，可能保留了与HSS2序列结合的能力但丧失了诱导染色质重构的能力。当这种GATA3突变蛋白被外源引入细胞核时(通过基因操纵方法或蛋白质注射方法)，它们通过与HSS2序列结合但不诱导染色质重构来抑制内源GATA3蛋白与HSS2序列结合。而且，这些GATA3突变蛋白不与包括IL-5和TCRα基因在内的基因的转录调节区内的GATA3结合序列结合。因此，这些GATA3突变蛋白不抑制内源GATA3突变蛋白与它们结合。也就是说有可能在GATA3蛋白的功能中选择性地抑制对染色质重构的诱导，从而抑制Th2细胞因子的产生。这种GATA3突变蛋白的一个例子是小鼠的GATA3突变蛋白，其中SEQ ID NO：1所示小鼠野生型GATA3蛋白氨基酸序列的第29-168位的氨基酸残基和N指区的至少氨基酸残基第280-287位(例如第263-287位)发生缺失。另一例子包括小鼠GATA3突变蛋白，其中与上述缺失的氨基酸残基相对应的人氨基酸残基，即SEQ ID NO：2所示人GATA3蛋白氨基酸序列的第29-169位氨基酸残基和至少N指区的氨基酸残基第281-288位(例如264-288)发生缺失。
上述可抑制Th2细胞因子产生的GATA3突变蛋白及其衍生物可被用做治疗和/或预防与Th2细胞因子相关的变态反应疾病的药物组合物。因此，包含上述GATA3突变蛋白的药物组合物也在本发明的范围内。在此，术语“GATA3突变蛋白衍生物”包含经修饰的或改变的GATA3突变蛋白，其保留GATA3突变蛋白的活性，如与HSS2序列结合的能力、基因转录活性和诱导染色质重构的能力。
本领域技术人员参照已报道的GATA3蛋白的氨基酸序列(参见SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2分别所示的小鼠和人类的GATA3蛋白)很容易地实现产生本发明的GATA3突变蛋白的方法。这样的蛋白质可以按照产生编码特定氨基酸序列的核酸的常规技术来产生。多种遗传学操纵技术，例如PCR方法、各种诱变方法、限制性酶消化及用DNA连接酶进行连接都可以被适当地运用。(参见，例如，Sambrook等，分子克隆实验指南，第2版，1989纽约冷泉港，冷泉港实验室出版)。例如，编码野生型GATA3蛋白的氨基酸序列的核酸可通过PCR或杂交的方法从源自相应动物种的cDNA文库中克隆出来。核酸可以通过上述技术加以改变来编码所想得到的突变体。突变体可以通过将编码所想要的突变体的核酸克隆到合适的表达载体并转化合适的宿主(例如大肠杆菌和哺乳动物细胞)中而被表达。本领域技术人员可以很容易地从转化细胞中获得突变蛋白。因此，包含上述核酸的载体(例如逆转录病毒载体)和包含载体的宿主也在本发明的范围内。这样的突变体能够通过将表达载体与编码突变体的核酸功能性连接、再以能被导入T细胞的形式引入来在T细胞中表达。
本发明的“药物组合物”可以包含药学上可接受的载体，需要的时候可以加入添加剂例如增稠剂、稳定剂和/或增溶剂。这样的载体和添加剂的例子包括但不仅限于乳糖、柠檬酸、硬脂酸、硬脂酸镁、蔗糖、淀粉、滑石、明胶、琼脂、植物油和1，2-亚乙基二醇。此外，依施药方法而定，也可在需要时加入调味剂、防腐剂、着色剂、甜味剂等。术语“药学上可接受的”可以很容易地被本领域技术人员所理解，它指被每个国家的权威机构认可，或列入每一国家的药典或涉及动物、哺乳动物、尤其是人用的被广泛接受的药典。治疗和/或预防与Th2细胞因子相关的变态反应疾病的有效量可以通过很多合适的途径施用，包括但不仅限于口吸、鼻吸、口服，非口腔施药如静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、经皮注射和连续输注，和包括局部敷用在内的局部给药。此外，还可以与运输载体一起施用，以利于输送到特定的组织或细胞类型(本发明优选胸腺或T细胞)。本发明的药物组合物针对不同的应用配制成合适的形式，例如溶液、混悬剂、乳剂、糖浆、脂质体、片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、气雾剂、喷雾、油膏(ointment)和乳膏(cream)。此外，组合物可以与含无菌水、生理盐水或注射用缓冲液的安瓿剂一起提供。这些溶液与组合物混合制备成单剂量或多剂量的冻干粉末或小球，以便在施用前制成预期浓度的组合物。本发明的用于治疗和/或预防与Th2细胞因子相关变态反应疾病的药物组合物的有效剂量能由医疗人员通过标准的临床技术来决定。此外，利用疾病模型动物或类似的体内试验或体外试验可被自由地用于决定最佳剂量范围。所用的确切剂量也依赖于给药途径和疾病的严重程度，应由执行者根据每个患者的症状来决定。这里所用术语“患者”是指任何哺乳动物，优选是人。
优选的药物组合物配制剂包含用做活性成分的、是核酸和/或其衍生物或修饰物的GATA3诱骗物、和/或GATA3突变蛋白，这种配制剂包括被广泛用于基因治疗的脂质体。脂质体可由数量众多的文献所记载的方法来制备，例如Szoka，F.等(Biochim.Biophys.Acta，Vol.601 559(1980)和Brunner，J.等(Biochim.Biophys.Acta，Vol.455 322(1976))。
此外，本发明还包括用能抑制GATA3蛋白与HSS2序列结合的化合物作靶来筛选用于治疗和/或预防与Th2细胞因子相关变态反应疾病的药物的方法。被筛选的化合物包括任何物质，包括活体内存在的物质，例如核酸和蛋白质，而不考虑其分子量。也就是说，本发明的诱骗物和GATA3突变蛋白及其衍生物也能被筛选。在该方法中，通过在有或没有测试化合物的情形下，在允许野生型GATA3蛋白与dsDNA或其衍生物结合的条件下(该条件可以是那些用于一般凝胶移位分析等的条件，参见Lee等，(1998)J.Immunol.160：2343)将野生型GATA3蛋白和dsDNA或其包含HSS2序列的衍生物一起孵育，并检测野生型GATA3蛋白与dsDNA或其衍生物的结合，来鉴定能抑制野生型GATA3蛋白与HHS2序列结合的测试化合物。在这一方法中，拥有与HSS2序列结合的能力的GATA3突变蛋白(例如，本说明书中的delTA和delN GATA3突变蛋白，但本发明不限于此)能代替野生型GATA3蛋白被使用。
根据上述方法，不抑制野生型GATA3蛋白与IL-5和TCRα基因(尽管本发明不限于此)等被GATA3蛋白转录激活的基因的转录调节区GATA3结合序列结合的测试化合物，或相比于对野生型蛋白与HSS2序列结合的抑制，在较低水平抑制的测试化合物，能进一步通过将包含位于基因转录调节区域内的GATA3结合序列的dsDNA或其衍生物和野生型GATA3蛋白质一起孵育，在有或没有测试化合物的情形下，在允许野生型GATA3蛋白与dsDNA或其衍生物结合的条件下，被鉴定出来。因此，在众多GATA3结合序列中，能只特异性地抑制GATA3蛋白与HSS2序列结合的化合物能被鉴定出来。在这一过程中，具有与基因转录调节区的GATA3结合序列结合的能力GATA3突变蛋白(例如，本说明书中的delTA GATA3突变蛋白，尽管本发明不限于此)，能代替野生型GATA3蛋白被使用。
通过对用于上述方法的dsDNA或其衍生物用各种标记化合物，例如放射性、荧光和化学发光化合物进行标记，可以很容易地进行上述方法中的结合抑制程度的检测和比较。本领域技术人员可以采用各种方法，例如常规的凝胶移位分析或将GATA3蛋白固定于固体支持物上的方法，很容易地进行选择合适的标记化合物和标记及比较结合抑制水平的方法。此外，包含HSS2序列的dsDNA衍生物包括上述诱骗物中所述的衍生物和修饰物。
附图说明
图1是一系列描述凝胶移位分析结果的图片和图表。每一分析中所用的DNA指示在顶部。delN突变蛋白能与IL-5启动子和TCRα增强子区域的GATA3结合序列相结合，但不能与HSS2内的GATA3结合序列相结合。delC突变蛋白不与任何GATA3结合序列结合，delTA突变蛋白与所有GATA3结合序列结合。
图2是一系列图片和图表，描述对表达每一GATA3突变蛋白的转化的T细胞中IL-13和IL-4基因之间的区域的DNase I高敏感分析结果。
图3是一系列图片和图表，描述表达每一GATA3突变蛋白的转化的T细胞中的IL-4基因编码区的DNase I高敏感分析结果。
图4描述了通过在表达每一GATA3突变蛋白的转化的Th1细胞中用免疫化学流式细胞光度的方法来测量IFNγ、IL-4和IL-5的表达。对于所有被测试的细胞因子的表达模式而言，delTA和delC突变体显示出与Th1细胞相似。然而，在被转化的delN表达细胞中，与未感染细胞中IFNγ和IL-4的表达相比，IFNγ的表达被抑制，IL-4的表达增加。这与野生型GATA3蛋白表达细胞相似，这种趋势也与在Th2中所观察到的相同。
图5描述HSS2序列和基因转录调节区的GATA3结合序列与GATA3蛋白相结合的竞争分析结果。左图描述用自表达GATA3的COS细胞收集来的细胞提取物和包含HSS2序列(HSSGATA序列)的探针进行电泳迁移移位分析(EMSA)的结果。右图描述用自表达GATA3的COS细胞收集来的细胞提取物和包含基因转录调节区内的GATA3结合序列(TCRα GATA序列)的探针进行电泳迁移率变动分析(EMSA)的结果。
图6是一系列照片，描述比较GATA3蛋白与HSS2序列(CNS-1)和与基因转录调节区(TCRα增强子序列)内的GATA3结合序列的结合亲和力的凝胶移位分析的结果。
发明的最佳实施方式
以下以实施例的方式对本发明进行详细描述，但这并不能解释为对发明的限制。
[实施例1] 构建编码野生型GATA3蛋白和GATA3突变蛋白的基因
制备野生型GATA3蛋白和各种GATA3突变蛋白。小鼠GATA3蛋白cDNA、逆转录病毒载体pMXI和哺乳动物细胞表达载体pME18S分别由山本教授(筑波大学)、北村教授(东京大学医科学研究所)和丸山副教授(东京医科齿科大学)提供。为了将基因引入T细胞，将野生型和突变型GATA3cDNAs以双顺反子的方式插入表达绿色荧光蛋白(GFP)的pMXI的EcoRI和NotI位点之间。为了在COS细胞中表达cDNA，将cDNA也插入pME18S的EcoRI和NotI位点。
delTA突变体在转录激活区域有缺失(缺少氨基酸29-168)。使用编码GATA3蛋白的cDNA作为模板，制备包含这一缺失的两种PCR片段。反应中使用引物组合：引物1：5′-GGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTG-3′(SEQ ID NO：7)/引物2：5′-ACCCGGCGGATCCCGGGTGGTGCGTGTCTGGGTG-3′(SEQ ID NO：8)和引物3：5′-AGACACGCACCACCCGGGATCCGCCGGGTCGGCCAGG-3′(SEQ ID NO：9)/引物4：5′-GTGGGAGGTITTTTCTCTAGACTAGTCT-3′(SEQ ID NO：10)。所得到的两种PCR片段通过用引物1和引物4进行扩增而加以连接。这一PCR片段通过测序进行确认，用EcoRI和NotI消化，插入pMXI和pME18S。
delN突变体在N指有缺失(缺少氨基酸263-287)。使用GATA3 cDNA作为模板，制备包含这一缺失的两种PCR片段。反应中使用引物组合：引物1/引物5：5′-GGTAGAGTCCCTCCCTGCCTTCTGTGCTG-3′(SEQ ID NO：11)和引物6：5′-GCAGGGAGGGACTCTACCATAAAATGAATGGGCAG-3′(SEQ ID NO：12)/引物4。两种PCR片段通过用引物1和引物4进行扩增而加以连接。这一PCR片段通过测序进行确认，用EcoRI和NotI消化，插入pMXI和pME18S。
delC突变体在C指有缺失(缺少氨基酸304-325)。使用GATA3 cDNA作为模板，制备包含这一缺失的两种PCR片段。反应中使用引物组合：引物1/引物7：5′-TTCATAGTCAGGGGTCGACAGCCTTCGCTTGGGCT-3′(SEQID NO：13)和引物8：5′-AAGCGAAGGCTGTCGACCCCTGACTATGAAGAAAGAAGG-3′(SEQ ID NO：14)/引物4。两种PCR片段通过用引物1和引物4进行扩增而加以连接。这一PCR片段通过测序进行确认，用EcoRI和NotI消化，插入pMXI和pME18S。
上述生成的、包含编码GATA3和GATA3突变蛋白基因的载体在COS细胞中进行表达。对细胞提取物进行SDS-PAGE电泳。每一野生型GATA3和GATA3突变蛋白可以在预计的分子量位置检测到(数据未显示)。
[实施例2] GATA3蛋白对基因转录调节区域中HSS2序列和GATA3结 合序列的特异性
使用包含HSS2序列((HSSGATA序列)的探针对表达GATA3的COS细胞的提取物进行电泳迁移率变动分析(EMSA)。结果如图5所示。过量加入具有相同序列的非标记DNA或基因转录调节区域中的GATA3结合序列(TCRαGATA序列：T细胞受体α链增强子的GATA序列)后，由于竞争性抑制的存在，导致与包含HSS2序列的探针结合的蛋白复合物消失。突变的HSS2序列不诱导抑制，表明特异的序列被识别。观察到抗-GATA3抗体特异的迁移率巨大变动(super shift)，显示复合物中的蛋白是GATA3。
使用包含基因转录调节区域中GATA3结合序列的探针进行EMSA，也检测到GATA3复合物。加入与探针相同的、包含GATA序列的HSS2序列和基因转录调节区域内的GATA3结合序列，导致复合物竞争性消失。突变的HSS2序列不引起抑制，显示GATA3复合物所识别的是特异序列。
[实施例3] 鉴定对GATA3结合序列的结合所需要的GATA3蛋白区域
使用实施例1中获得的在COS细胞中表达的GATA3突变蛋白和野生型GATA3蛋白和双链寡核苷酸进行凝胶移位分析，所述双链寡核苷酸包含HSS2序列(图1上栏中的HSS2，SEQ ID NO：3中所示的有义链)、含GATA3结合序列的IL-5启动子序列(图1上栏中的IL-5启动子，SEQ ID NO：4中所示的有义链)、以及含GATA3结合序列的TCRα增强子序列(图1上栏中的TCRα增强子，SEQ ID NO：5中所示的有义链)。
用传统方法对上述合成寡核苷酸用32P进行放射性标记，以进行凝胶移位分析。结果如图1所示。野生型(WT)GATA3蛋白和delTA突变蛋白可与上述三种类型的GATA3结合序列结合；然而delN突变蛋白只与HSS2序列结合。此外，delC突变蛋白与三种GATA3结合序列中任何一种都不结合。这些结果显示，GATA3蛋白与HSS2序列之外的GATA3结合序列结合既需要GATA3蛋白的C指区域，也需要GATA3蛋白的N指区域。这与先前所报道过的结果相一致。另一方面，这些结果还进一步显示，GATA3蛋白与HSS2序列的结合必需有GATA3蛋白的C指区域，这相应地还显示，这一结合行为不同于其它GATA3结合序列的行为。
本发明人所进行的进一步研究还显示，根据用凝胶移位分析进行亲和力测定实验所获得的结果，GATA3蛋白与HSS2序列的结合相比于GATA3与其它GATA3结合序列的结合，具有较低亲和力(图6)。除了本发明人的这一发现以外，并没有其它的报道描述过一种GATA3结合序列与其它GATA3结合序列相比具有不同的结合亲和力。从而，这一发现显示，在GATA3结合序列中，只有HSS2序列(它参与染色质重构的控制)是低亲和力结合序列。
因此，具有高亲和力的GATA3结合序列(例如：IL-5启动子序列内的序列，SEQ ID NO：4；TCRα增强子序列内的序列，SEQ ID NO：5)能够在低浓度被有效地用作GATA3诱骗物，诱骗物能够特异性抑制GATA3蛋白与HSS2序列的低亲和力结合，而这种结合参与染色质重构；该诱骗物不抑制GATA3蛋白与HSS2序列之外的GATA3结合序列的高亲和力结合。
[实施例4] 如上述制备的GATA3蛋白和其突变体对染色质重构的影响
用DNA酶I高敏感分析检测GATA3蛋白和其突变体对染色质重构的影响。DNA酶I高敏感分析基于这样一个事实：染色质重构发生后，DNA酶I得以接近其在基因组中的作用位点，因而可以测出特异片段。
在此，按照Takemoto，N.等描述过的方法(1998，同上)进行DNA酶I高敏感分析。Phoenix Eco包装细胞系由北村博士提供(东京大学医科学研究所)。使用“lipofectamine plus”(Gibco BRL)将质粒引入Phoenix Eco包装细胞系。
以CD4表达作为指标，用细胞分拣器(见Takemoto，N.，et al.，Int.Immunol.10：1981(1998))从DO11.10 TCRαβ-转基因小鼠(Murphy，K.M.，etal.，Science 250：1720(1990))收集初始T细胞。所得到的初始T细胞用源自鸡卵清蛋白的肽抗原和用抗原呈递细胞(经照射的小鼠脾细胞)加以刺激。一天后，被激活的T细胞在补充有polyburene(0.5μg/ml)的含逆转录病毒的培养基中进行培养，以进行逆转录病毒感染。同时，培养板在32℃、1800rpm离心1小时。上述步骤于次日重复一次。在有抗IL-4抗体和IL-12(IL-12可诱导向Th1分化)存在的条件下继续培养。抗原刺激7天后用细胞分拣器分离表达GFP的细胞。培养物在有IL-12和抗IL-4抗体存在的条件下继续培养2周，每周用抗原进行刺激。
所获得的经感染的初始T细胞悬浮于0.5％的含NP-40的RSB缓冲液(10mM Tris，pH7.4，10mM NaCl，和5mM MgCl2)中，用匀浆器破碎，得到细胞裂解液。从裂解液中提取细胞核。所得到的细胞核(1×107每份)悬浮于100μl RSB缓冲液，加入DNA酶I(Worthington Biochemical，Freehold，NJ)至浓度为0、5、10、15和20μg/ml，37℃孵育12分钟，以进行DNA酶I反应。加入100μl 2x反应终止缓冲液(1％SDS，20mM Tris，pH7.4，600mMNaCl，10mM EDTA，和50μg/ml蛋白酶K)以终止反应，反应混合物在37℃剧烈摇晃过夜，以消化混合物中的蛋白质。用醋酸铵沉淀、酚-氯仿抽提和乙醇沉淀的方法从混合物中纯化DNA。DNA用ScaI消化，在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，转移至膜上。DNA在DNA印迹法常用的条件下与α32P ATP-标记的探针(用BamHI和NspV消化的基因组DNA片段，相应于IL-4基因转录起始位点的大约7.0kb和大约6.7kb)进行杂交。结果如图2所示。在所有获自非感染细胞、表达野生型GATA3蛋白的细胞和所有表达GATA3突变蛋白的细胞的基因组DNA中均检测到HSS3的消化片段。然而，特异于进行染色质重构的Th2细胞的、Th2特异性DNA酶I高敏感序列HSS2和HSS1消化片段在非感染细胞的基因组DNA中没有检测到；在表达野生型GATA3蛋白的细胞中却检测出来。此外，考虑到表达GATA3突变蛋白的感染细胞，在表达delN突变体的细胞中可以检测到HSS2和HSS1消化片段，其方式与表达野生型GATA3蛋白的细胞相类似。然而，在表达delTA和delC GATA3突变蛋白的细胞中却没有检测到这些片段。这些结果与实施例2的凝胶移位分析的结果相吻合，即：在GATA3蛋白中，对结合HSS2序列所必需的、负责染色质重构的区域是C指区域。虽然曾显示delTA突变体可与HSS2序列结合，但其中染色质重构所需要的区域却丢失了，因为在表达delTA突变体的细胞中没有检测到HSS2和HSS1消化片段。也就是说，这显示，delTA突变体可以作为GATA3蛋白与HSS2序列结合所诱导的染色质重构中的显性失活突变体。
此外，使用32P-标记的、针对IL-4编码区域的探针进行了类似实验，以检测每一IL-4编码区域内的DNA酶I高敏感区域。同样，获自delN GATA3突变蛋白的结果与获自野生型GATA3蛋白的结果相类似，而delTA和delCGATA3突变蛋白表现出的结果与野生型GATA3蛋白的有所不同(图3)。这些结果还显示，虽然delTA GATA3突变蛋白丢失了染色质重构所需要的区域，但仍能与HSS2序列结合。相应的，这些结果支持上面所提到的设想，即delTA突变体可以作为GATA3蛋白与HSS2序列结合所诱导的染色质重构中的显性失活突变体，而delC GATA3突变蛋白由于其无法与HSS2序列结合而无法诱导染色质重构。
[实施例5] 如上制备的GATA3蛋白及其突变体对Th2细胞分化的影响
初始T细胞用与实施例3相似的方法获取，用IL-11进行刺激，使之分化成Th1细胞(见Takemoto N，et al.，Int.Immunol.10：1981(1998))。分化的Th1细胞用上面所提到的每一种编码GATA3突变体或野生型GATA3蛋白的病毒进行感染，感染方式与实施例3类似。用流式细胞光度分析测量感染细胞中的IFNγ、IL-4和IL-5表达水平。收集感染细胞，用PMA(50ng/ml)和离子霉素(500ng/ml)激活6小时。回收细胞之前2小时加入莫能菌素(2μM)，培养细胞。细胞在37℃用4％低聚甲醛固定5分钟，清洗。然后，将细胞重悬于含0.5％Triton X-100的裂解缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，5mM EDTA，0.02％NaN3，pH7.5)，冰上孵育10分钟，以使细胞膜通透。用含3％BSA和0.1％NaN3的PBS进行阻断(在冰上孵育30分钟)，以抑制抗体的非特异性吸附。细胞用FITC标记的抗IFNγ抗体(XMG1.2)、藻红蛋白标记的抗IL-4抗体(11B11，R&D Systems，Minneapolis，MN)、或PE标记的抗IL-5抗体(TRFK5；Pharmingen)染色60分钟。洗去未结合的抗体，然后进行流式细胞光度分析。分析结果如图4所示。图4的最右栏显示获自Th2细胞的结果，该细胞经IL-4刺激而分化，并经上面描述的方法进行处理和分析。结果显示，与获自从非感染细胞分化来的Th1细胞的结果(左栏)相比，IFNγ在Th2细胞中不表达，而IL-4和IL-5则以较高水平表达。另一方面还显示，Th1具有高IFNγ表达和非常低的IL-4和IL-5表达。此外，与Th1细胞相比，表达野生型GATA3蛋白的Th1细胞具有较低的IFNγ表达，同时IL-4和IL-5的表达也受诱导。因此，我们发现，野生型GATA3蛋白在Th1细胞中的表达诱导Th2细胞因子的表达，导致Th1细胞表型变为Th2细胞表型。
在本实验所用34种GATA3突变蛋白中，delN GATA3突变蛋白在IFNγ和IL-4方面具有与野生型GATA3蛋白相同的功能，导致Th2细胞表型的呈现。与野生型GATA3蛋白不同，这一突变蛋白无法诱导IL-5，这可能是由于足够的IL-5表达需要GATA3蛋白与启动子序列内GATA3结合序列的结合。前面曾经说过，delN突变蛋白丧失了上面所描述过的与启动子区域内GATA3结合序列结合的能力。另一方面，表达delC和delTA GATA3突变蛋白后却没有观察到这样的表型改变，即IFNγ、IL-4和IL-5表达模式的改变。获自凝胶移位分析和DNA酶I高敏感分析的结果显示，delC GATA3突变蛋白由于无法与HSS2序列结合，因此无法诱导染色质重构；delTA GATA3突变蛋白虽然可以与HSS2序列结合，但不能诱导染色质重构。因此，上述流式细胞光度分析再次证实了染色质重构对分化成Th2细胞是必需的。
此外，一种在N指区域具有部分缺失的GATA3突变蛋白(缺乏氨基酸残基280-288)也可以用上面描述过的所有实验进行检测，它表现出与delN突变蛋白相同的结果(虽然数据未显示)。此外，在N指区域内具有一个氨基酸残基取代的突变体(V264G)(在GATA-1蛋白中的相应残基对于介导与FOG-1的接触是必需的(Crispino，J.D.et al.，Mol.Cell.3：219(1999))则显示出与野生型GATA3蛋白所得到的结果相同的结果。另一方面，位于N指区域和C指区域间的第304-306位的三个氨基酸残基被AAA取代，所得到的突变体其IL-5的产生降低，但在IFNγ和IL-4方面其结果与获自野生型GATA3蛋白的结果相同。此外，缺乏第309-345位氨基酸(该区域包含C指区域)的突变体也表现出与获自delC GATA3突变蛋白的结果相同的结果。
总结上面的结果，delC GATA3突变蛋白缺乏与染色质重构所需要的HSS2序列结合的能力，也缺乏与HSS2之外的其它GATA3结合序列结合的能力。相应地，GATA3蛋白的C指区域不仅对于与HSS2序列的结合是必需的，而且对于与所有GATA3结合序列的结合都是必需的。由于delNGATA3突变蛋白能够与HSS2序列结合和诱导Th2细胞所特有的表型改变，GATA3蛋白的N指区域不参与与HSS2序列的结合或染色质重构，但对于与HSS2序列以外的其它GATA3结合序列的结合是必需的。相应地，在GATA3结合序列中，单独HSS2序列只需要GATA3蛋白的C指区域用来与GATA3蛋白结合，而其它GATA3结合序列则既需要C指区域、也需要N指区域。此外，delTA GATA3突变蛋白与包括HSS2在内的所有被检测的GATA3结合序列相结合，然而却不诱导染色质重构或Th2细胞表型改变。相应地，delTA GATA3突变蛋白是GATA3蛋白在染色质重构方面的显性失活突变体。delTA GATA3突变蛋白丢失了反式激活区域的部分区域，这一丢失的区域包含与HSS2序列结合后进行染色质重构所必需的区域。这一讨论使得本领域普通技术人员很容易考虑到如下几点：由于在反式激活区域和N指区域都有缺失的GATA3突变蛋白与HSS2序列结合但不诱导染色质重构，而且它不与HSS2之外的其它GATA3结合序列相结合，这一突变体可以是这样一种GATA3突变体，它对除染色质重构以外的由GATA3蛋白诱导的细胞内机制(例如，IL-5、TCRα等的转录激活)没有影响，它是只特异性地有效抑制Th2细胞分化的显性失活突变体。
C指区域和N指区域对于与其它GATA3结合序列结合都是必需的，只有GATA3蛋白内的C指区域对于GATA3蛋白与HSS2序列的结合是必需的，而且这一结合具有相对低的亲和力。因此，这进一步提示，包含具有较高结合亲和力的GATA3结合序列的寡核苷酸作为诱骗物将非常有用，该诱骗物特异性抑制参与染色质重构的、GATA3蛋白与HSS2序列的较低亲和力结合。
[实施例6] 使用凝胶移位分析比较GATA3蛋白与HSS2序列(CNS-1)、 以及GATA3蛋白与基因转录调节区域(TCRα增强子序列)内的GATA3结合 序列的结合亲和力
使用获自实施例1的在COS细胞中表达的野生型GATA3蛋白、包含HSS2序列的双链寡核苷酸(“HSS2”，图6的右上栏，有义链示于SEQ ID NO：3)和包含含有GATA3结合序列的TCRα增强子序列的双链寡核苷酸(“TCRα增强子，图6左上栏，有义链示于SEQ ID NO：5)进行凝胶移位分析以进行竞争性结合抑制实验。使用用32P标记的上述合成寡核苷酸探针依照传统方法进行凝胶移位分析(图6)。野生型GATA3蛋白与含有GATA3结合序列的32P标记的TCRα增强子序列形成复合物，该复合物用电泳进行检测(图6的左上图，泳道1)。包含TCRα增强子序列(该增强子序列具有探针的GATA3结合序列)的非标记DNA以探针的50倍和100倍的量加入反应混合物。以50、100、200、400、800倍的量加入包含HSS2序列的非标记DNA(图6的左下图)。与之形成对照的是，通过使用32P标记的HSS2序列探针进行凝胶移位分析，加入5、10、20、50、100倍的包含TCRα增强子序列的非标记DNA(图6的右上栏)和5、10、20、50、100倍的包含HSS2序列的非标记DNA(图6的右下栏)，来进行结合的竞争性抑制。
结果是，使用基因转录调节区域内的GATA3结合序列作为探针进行凝胶移位分析，除HSS2序列之外的同样序列在50倍的量即表现出竞争性抑制，而HSS2序列即使在200倍的量时仍不能完全抑制。与之形成对照的是，使用HSS2序列作为探针，基因转录调节区域内的GATA3结合序列在50倍量的时候抑制几乎所有结合，而HSS2序列即使在100倍量的时候仍不能完全抑制。这些结果显示，GATA3蛋白与基因转录调节区域内的GATA3结合序列的结合亲和力高于与HSS2序列的结合亲和力。
工业实用性
本发明提供用于治疗和/或预防Th2细胞因子相关的变态反应疾病的GATA3诱骗物和GATA3突变蛋白。本发明的诱骗物和GATA3突变蛋白选择性抑制Th2细胞因子基因簇内的染色质重构，并在不影响GATA3蛋白的除Th2细胞因子之外的细胞内功能的情况下有效抑制Th2细胞因子表达。因此，包含这类诱骗物或突变蛋白作为治疗和/或预防Th2细胞因子相关的变态反应疾病的有效成分的药物组合物、以及包含施用这种组合物的用于治疗和/或预防Th2细胞因子相关的变态反应疾病的方法是极其有用的。
                                    序列表
<110>株式会社金科生物医学研究所(Ginkgo Biomedical Research Institute Co.，Ltd.)
<120>治疗和/或预防Th2细胞因子相关变态反应病的诱骗物、GATA3突变蛋白、和包含它们的药物组合物
<130>G2-A0204Y1P
<150>JP 2002-123019
<151>2002-04-24
<150>JP 2002-368545
<151>2002-12-19
<160>14
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>443
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>1
Met Glu Val Thr Ala Asp Gln Pro Arg Trp Val Ser His His His Pro
  1               5                  10                  15
Ala Val Leu Asn Gly Gln His Pro Asp Thr His His Pro Gly Leu Gly
             20                  25                  30
His Ser Tyr Met Glu Ala Gln Tyr Pro Leu Thr Glu Glu Val Asp Val
         35                  40                  45
Leu Phe Asn Ile Asp Gly Gln Gly Asn His Val Pro Ser Tyr Tyr Gly
     50                  55                  60
Asn Ser Val Arg Ala Thr Val Gln Arg Tyr Pro Pro Thr His His Gly
 65                  70                  75                  80
Ser Gln Val Cys Arg Pro Pro Leu Leu His Gly Ser Leu Pro Trp Leu
                 85                  90                  95
Asp Gly Gly Lys Ala Leu Ser Ser His His Thr Ala Ser Pro Trp Asn
            100                 105                 110
Leu Ser Pro Phe Ser Lys Thr Ser Ile His His Gly Ser Pro Gly Pro
        115                 120                 125
Leu Ser Val Tyr Pro Pro Ala Ser Ser Ser Ser Leu Ala Ala Gly His
    130                 135                 140
Ser Ser Pro His Leu Phe Thr Phe Pro Pro Thr Pro Pro Lys Asp Val
145                 150                 155                 160
Ser Pro Asp Pro Ser Leu Ser Thr Pro Gly Ser Ala Gly Ser Ala Arg
                165                 170                 175
Gln Asp Glu Lys Glu Cys Leu Lys Tyr Gln Val Gln Leu Pro Asp Ser
            180                 185                 190
Met Lys Leu Glu Thr Ser His Ser Arg Gly Ser Met Thr Thr Leu Gly
        195                 200                 205
Gly Ala Ser Ser Ser Ala His His Pro Ile Thr Thr Tyr Pro Pro Tyr
    210                 215                 220
Val Pro Glu Tyr Ser Ser Gly Leu Phe Pro Pro Ser Ser Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Ser Pro Thr Gly Phe Gly Cys Lys Ser Arg Pro Lys Ala Arg Ser
                245                 250                 255
Ser Thr Glu Gly Arg Glu Cys Val Asn Cys Gly Ala Thr Ser Thr Pro
            260                 265                 270
Leu Trp Arg Arg Asp Gly Thr Gly His Tyr Leu Cys Asn Ala Cys Gly
        275                 280                 285
Leu Tyr His Lys Met Asn Gly Gln Asn Arg Pro Leu Ile Lys Pro Lys
    290                 295                 300
Arg Arg Leu Ser Ala Ala Arg Arg Ala Gly Thr Ser Cys Ala Asn Cys
305                 310                 315                 320
Gln Thr Thr Thr Thr Thr Leu Trp Arg Arg Asn Ala Asn Gly Asp Pro
                325                 330                 335
Val Cys Asn Ala Cys Gly Leu Tyr Tyr Lys Leu His Asn Ile Asn Arg
            340                 345                 350
Pro Leu Thr Met Lys Lys Glu Gly Ile Gln Thr Arg Asn Arg Lys Met
        355                 360                 365
Ser Ser Lys Ser Lys Lys Cys Lys Lys Val His Asp Ala Leu Glu Asp
    370                 375                 380
Phe Pro Lys Ser Ser Ser Phe Asn Pro Ala Ala Leu Ser Arg His Met
385                 390                 395                 400
Ser Ser Leu Ser His Ile Ser Pro Phe Ser His Ser Ser His Met Leu
                405                 410                 415
Thr Thr Pro Thr Pro Met His Pro Pro Ser Gly Leu Ser Phe Gly Pro
            420                 425                 430
His His Pro Ser Ser Met Val Thr Ala Met Gly
        435                 440
<210>2
<211>444
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Glu Val Thr Ala Asp Gln Pro Arg Trp Val Ser His His His Pro
  1               5                  10                  15
Ala Val Leu Asn Gly Gln His Pro Asp Thr His His Pro Gly Leu Ser
             20                  25                  30
His Ser Tyr Met Asp Ala Ala Gln Tyr Pro Leu Pro Glu Glu Val Asp
         35                  40                  45
Val Leu Phe Asn Ile Asp Gly Gln Gly Asn His Val Pro Pro Tyr Tyr
     50                  55                  60
Gly Asn Ser Val Arg Ala Thr Val Gln Arg Tyr Pro Pro Thr His His
 65                  70                  75                  80
Gly Ser Gln Val Cys Arg Pro Pro Leu Leu His Gly Ser Leu Pro Trp
                 85                  90                  95
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                165                 170                 175
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<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
gaggcctcat tatcttcatt catttctc                                     28
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>4
gttagagata gcatcgcccc a                                                21
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>5
gaggtgtcct ctatctgatt gttagcaa                                         28
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
aagccccatt atcttcattc atttctca                                         28
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>7
ggaagtgtta cttctgctct aaaagctg                                         28
<210>8
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
acccggcgga tcccgggtgg tgcgtgtctg ggtg                                  34
<210>9
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>9
agacacgcac cacccgggat ccgccgggtc ggccagg                               37
<210>10
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>10
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<210>11
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>11
ggtagagtcc ctccctgcct tctgtgctg                                        29
<210>12
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>12
gcagggaggg actctaccat aaaatgaatg ggcag                                 35
<210>13
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>13
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<210>14
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>14
aagcgaaggc tgtcgacccc tgactatgaa gaaagaagg                             39

Claims (30)

1.用于治疗和/或预防与Th2细胞因子相关的变态反应疾病的GATA3诱骗物。
2.根据权利要求1所述的GATA3诱骗物，其中诱骗物通过抑制GATA3蛋白与基因组中HSS2序列的结合而抑制Th2细胞因子基因簇区域内的染色质重构，并因此抑制T细胞中一种或多种Th2细胞因子的产生。
3.根据权利要求2所述的GATA3诱骗物，其中诱骗物不抑制GATA3蛋白与GATA3结合序列的结合，该序列是被GATA3蛋白转录激活的基因中转录调节区域的GATA3结合序列。
4.根据权利要求2所述的GATA3诱骗物，其中相比于GATA3蛋白与基因组中HSS2序列的结合，诱骗物在较低水平抑制GATA3蛋白与GATA3结合序列的结合，所述GATA3结合序列是被GATA3蛋白转录激活的基因中转录调节区域的GATA3结合序列。
5.根据权利要求1所述的GATA3诱骗物，其中诱骗物特异性抑制GATA3蛋白与基因组中HSS2序列的结合。
6.根据权利要求1-5中任一所述的GATA3诱骗物，其中诱骗物包含双链寡核苷酸或其衍生物，该双链寡核苷酸或其衍生物包含SEQ ID NO：3、4、5或6中所示序列。
7.根据权利要求1-6中任一所述的GATA3诱骗物，其中诱骗物有效抑制GATA3蛋白与T细胞基因组中HSS2序列的结合，并且其中诱骗物可以被施用，所施用的浓度使得相比于GATA3蛋白与基因组中HSS2序列的结合，诱骗物在较低水平抑制GATA3蛋白与被GATA3蛋白转录激活的基因中转录调节区域的GATA3结合序列的结合。
8.GATA3突变蛋白或其衍生物，其中
a)保留了野生型GATA3蛋白C指区域的氨基酸序列；或
b)野生型GATA3蛋白C指区域的氨基酸序列中一或多个氨基酸被缺失、取代或插入，但仍保留与HSS2序列结合的能力。
9.根据权利要求8所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活区域的一或多个氨基酸被缺失、取代或插入，使得GATA3蛋白诱导染色质重构的能力丧失。
10.根据权利要求9所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活区域的氨基酸序列有至少10个氨基酸残基被缺失。
11.根据权利要求8-10任一所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白N指区域的氨基酸序列有一或多个氨基酸进一步被缺失、取代或插入，使得与DNA结合的能力丧失，所述DNA包含被GATA3蛋白转录激活的基因中转录调节区域中的GATA3结合序列。
12.根据权利要求8-10任一所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白N指区域的氨基酸序列有至少一个氨基酸残基被缺失。
13.GATA3突变蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活区域的氨基酸序列有至少10个氨基酸残基被缺失，且N指区域的氨基酸序列有至少一个氨基酸残基被缺失。
14.小鼠GATA3突变蛋白或其衍生物，其中SEQ ID NO：1所述小鼠野生型GATA3蛋白的氨基酸序列的第29-168位氨基酸被缺失。
15.人GATA3突变蛋白或其衍生物，其中SEQ ID NO：2所述人野生型GATA3蛋白的氨基酸序列的第29-169位氨基酸被缺失。
16.根据权利要求14所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中进一步缺失SEQ ID NO：1所述小鼠野生型GATA3蛋白N指区域氨基酸序列的至少第280-287位氨基酸。
17.根据权利要求15所述的人GATA3突变蛋白或其衍生物，其中进一步缺失SEQ ID NO：2所述人野生型GATA3蛋白N指区域氨基酸序列的至少第281-288位氨基酸。
18.根据权利要求8-17任一所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中所述蛋白或衍生物具有与HSS2序列结合、但抑制T细胞的Th2细胞因子产生的能力。
19.根据权利要求18所述的GATA3突变蛋白或其衍生物，其中与DNA结合的能力丧失，所述DNA包含被GATA3蛋白转录激活的基因中转录调节区域中的GATA3结合序列。
20.编码根据权利要求8-19中任一所述的GATA3突变蛋白的核酸。
21.包含根据权利要求20的核酸的载体。
22.根据权利要求21的载体，其中的载体是表达载体。
23.包含根据权利要求21或22的载体的宿主细胞。
24.用于治疗和/或预防与Th2细胞因子相关的变态反应性疾病的药物组合物，其中的组合物在施用给哺乳动物后，通过抑制GATA3蛋白与基因组中HSS2序列的结合而抑制Th2细胞因子基因簇区域中的染色质重构，从而抑制一种或多种Th2细胞因子的产生。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中药物组合物包含根据权利要求1-7中任一的一种或多种GATA3诱骗物。
26.根据权利要求24的药物组合物，其中药物组合物包含根据权利要求8-19中任一的一种或多种GATA3突变蛋白。
27.根据权利要求24的药物组合物，其中药物组合物包含根据权利要求20的一种或多种编码GATA3突变蛋白的核酸。
28.根据权利要求24的药物组合物，其中药物组合物包含根据权利要求21或22的一种或多种载体。
29.筛选用于治疗和/或预防与Th2细胞因子相关的变态反应疾病的药物的方法，其中方法包括如下步骤：
a)在允许野生型GATA3蛋白或GATA3突变蛋白与双链DNA或其衍生物结合的条件下，将野生型GATA3蛋白或具有与HSS2序列结合的能力的GATA3突变蛋白与双链DNA或其包含HSS2序列的衍生物一起孵育，有或者没有测试化合物存在；
b)检测野生型GATA3蛋白或GATA3突变蛋白与双链DNA或其衍生物的结合；和
c)鉴定能抑制所述结合的测试化合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中该方法还包括下列步骤：
d)在允许野生型GATA3蛋白或GATA3突变蛋白与双链DNA或其衍生物结合的条件下，将野生型GATA3蛋白或具有与基因的转录调节区域中的GATA3结合序列结合的能力的GATA3突变蛋白与双链DNA或其包含所述基因转录调节区域中的GATA3结合序列的衍生物一起孵育，有或者没有测试化合物存在；
e)检测野生型GATA3蛋白或GATA3突变蛋白与双链DNA或其衍生物的结合；和
f)鉴定测试化合物，与步骤b)中的结合相比，该化合物在较低水平抑制步骤e)的结合。
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