WO2003086461A2 - Verwendung von substanzen zur behandlung von tumoren - Google Patents
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- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
Definitions
- the present invention relates to the use of an active ingredient and a method for the prevention or treatment of tumors, diagnostic detection of diseases associated with these tumors, and pharmaceuticals related thereto
- compositions and kits are provided.
- Tumor is understood to mean a tumor or the locally defined increase in tissue volume.
- any localized swelling e.g. B. by edema, acute and chronic inflammation, aneurysmal enlargement, inflammatory organ swelling (e.g. as a so-called spleen tumor).
- tumor is understood to mean tissue neoplasms (growth, piastoma, neoplasia) in the form of spontaneous, differently uninhibited, autonomous and irreversible excess growth of the body's own tissue, which is usually associated with a different degree of loss of specific cell and tissue function.
- the tumors are divided into:
- malignant (malignant) tumors with cell nucleus polymorphism, cell atypia, anaplasia and infiltrating, usually rapid, destructive growth and
- Metastasis 3. semimalignant tumors with the histological characteristics of malignant tumors and locally infiltrating growth, but usually without metastasis.
- the tumors are classified based on the tissue from which they have evolved.
- epithelial tumors that have arisen from ectoderm and entoderm a) benign tumors such as B. adenoma, papilloma and polyps. b) malignant tumors such as B. Carcinoma.
- malignant tumors such as B. Carcinoma.
- Mesoderm a) benign tumors such as B. lipoma, fibroma, osteoma, fibroid, leiomyoma, rhabdomyoma, chondroma, b) malignant tumors such as B. sarcomas.
- Nephroblastomas Nephroblastomas, neuroblastomas, medulloblastomas,
- Retinoblastomas as well as embryonic rhabdomyosarcomas and teratomas.
- prostate cancer (carcinoma of the prostate) is the most common malignant tumor in men, which occurs primarily between the ages of 50 and 70. The majority are adenocarcinomas. This malignant tumor initially spreads within the prostate due to infiltrating growth, later there is an infiltration of the bladder glands and pelvic connective tissue, relatively rarely also of the rectum, bladder or urethra. The metastasis takes place lymphogenically and / or hematogenously. Depending on the degree of histological differentiation and clinical stage, therapy is usually carried out by radical prostatectomy with regional lymph node removal, in the advanced stage withdrawal of the male sex hormones. Here, too, the prognosis depends on the stage of the carcinoma. While at a very early stage after a radical Prostatectomy heals in approx. 90% of cases; in an advanced stage, a pessimistic prognosis is more likely.
- Prostate cancer must be distinguished from prostate hyperplasia in its diagnosis.
- Prostatic hyperplasia is a benign tumor. The prostate enlarges as a result of the numerical increase in the cells and glands of the stroma.
- Prostatic hyperplasia is the most common cause of bladder emptying disorders in men. Clinically, it begins between the ages of 40 and 50. The course is slow and in batches. Symptoms usually only appear after years with a gradual weakening of the urinary stream and delayed onset of micturition. The administration of phytotherapeutic agents can be considered as therapy or alleviation of the symptoms.
- tumor markers are substances and cellular changes whose qualitative or quantitative analysis can provide information about the presence, course or prognosis of (malignant) diseases. Tumor markers are divided into:
- tumor antigens include cell membrane-bound tumor antigens, receptors (e.g. hormone receptors, receptors for growth-promoting substances
- Leukemia Leukemia
- cell markers that indicate increased expression of oncogenes and a monoclonal Indicate cell growth, as well as molecular genetic cellular changes, especially
- the humoral tumor markers are divided into two groups. The first group summarizes the humoral tumor markers that are produced by the tumor itself. This includes z. B. tumor-associated antigens, certain
- Hormones e.g. gastrin, cortisol etc.
- enzymes e.g. neuron-specific enolase (NSE)
- proteins e.g. Bence-Jones protein
- Tumor markers in this group are e.g. B. alkaline phosphatase (AP), LDH, neopterin etc.
- the object of the invention is to provide new active substances and targets for diagnostic and therapeutic applications in tumor therapy.
- At least one active ingredient can be used for the prevention or treatment of tumors, in particular malignant tumors.
- This active ingredient influences the expression and / or the function of proteins synthesized and / or secreted by the tumor in eukaryotic cells, as a result of which the increase in tissue volume and / or the metastasis of the tumor is at least partially inhibited. Influencing the expression and / or function of the proteins synthesized and / or secreted by the tumor means in particular the inhibition of these proteins.
- This active ingredient can also be used for the manufacture of a medicament or a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tumors.
- a substance for the detection of the expression and / or the function of tumors in particular malignant tumors, of synthesized and / or secreted proteins in eukaryotic cells, for the detection of diseases associated with these tumors.
- Diseases associated with these tumors include B. the already mentioned prostate carcinomas, prostate hyperplasia (prostate hypertrophy) etc. But also all other tumor-associated diseases in which the proteins according to the invention are synthesized and / or secreted are included in the invention.
- a method for the prevention or treatment of tumors in particular malignant tumors, is claimed, wherein eukaryotic cells are treated with an active ingredient which influences the expression and / or the function of proteins synthesized and / or secreted by tumors, in particular inhibited, and thereby at least partially inhibits the increase in tissue volume and / or the metastasis of the tumors.
- a method for recognizing diseases which are associated with tumors is claimed, eukaryotic cells being brought into contact with a substance which expresses and / or functions thereof Detects tumors synthesized and / or secreted proteins.
- the proteins synthesized and / or secreted by the tumors can be the proteins listed in Table I shown below.
- the substance that is used for the detection and / or detection of tumor-associated diseases for. B. an antibody that is directed against these proteins, and in a detection method known to those skilled in the art, such as. B. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is used.
- ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
- the specific antibody directed against the antigen to be determined is bound to a carrier substance (e.g. cellulose, polysterol), on which immune complexes form after incubation with the sample.
- a labeled antibody is added to these immune complexes.
- the immune-complex-bound enzyme-substrate complexes can be made visible or the antigen concentration in the sample can be determined by photometric determination of the immune-complex-bound marker enzymes by comparison with standards of known enzyme activity.
- Other substances that can be used for diagnostic detection are e.g. B. so-called oligonucleotides, which are suitable with the aid of the so-called polymerase chain reaction (PCR), to provide a quantitative detection of the proteins under investigation using a molecular genetic method in which certain DNA sections are selectively amplified.
- Scores hits determined using the MASCOT technique.
- MW Theo. Theoretical (calculated) molecular weight.
- the active substance or the substance is directed against the proteins themselves synthesized and / or secreted by the tumors.
- it can be the active ingredients such. B. act on antisense sequences. These are then directed directly against the synthesized and / or secreted proteins.
- the active ingredient can be genetically modified mutants. So z. B. by genetic engineering mutants in which the catalytic center is switched off (so-called deficient mutants), are constructed. Although the tumor-associated proteins are synthesized, they have no or only a reduced enzymatic activity. These deficient mutants, which were previously introduced into the tumor tissue, cannot fulfill the task assigned to them in the tumor tissue, which at least partially inhibits the increase in tissue volume and / or the metastasis of the tumor.
- the active ingredient is directed against activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of proteins synthesized and / or secreted by tumors.
- activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors can e.g. B. up- and downstream members of the transduction cascade of the proteins listed in Table I, transcription factors that the Regulate the expression level of the proteins mentioned, but also so far unknown molecules, which are influenced by the active ingredient and are involved in the expression and / or function of the proteins mentioned.
- the active ingredient or substance be a polynucleotide which encodes a peptide, in particular a polypeptide, this peptide preferably influencing, in particular inhibiting, the expression and / or function of proteins synthesized and / or secreted by tumors.
- the active substance or the substance can be a peptide, preferably a polypeptide, this peptide preferably influencing, in particular inhibiting, the expression and / or function of proteins synthesized and / or secreted by tumors.
- the active substance or the substance can be a “small molecular compound”, preferably a “small molecular compound” with a molecular weight (MW) ⁇ 1,000.
- the malignant tumor is a prostate carcinoma.
- prostate cancer is the most common malignant tumor in men. Only if a prostate tumor can be detected at an early stage, e.g. B. by prostate-specific antigen-based mass screening (Bartsch G, Horninger W, Klocker H, Reissigl A, Oberaigner W, Schonitzer D, Severi G, Robertson C, Boyle P: Prostate cancer mortality after introduction of prostate-specific antigen mass screening in the Federal State of Tyrol, Austria. Urology 2001; 58: 417-24), the pure (preventive) surgical removal of the prostate can be considered (Bukkapatnam R, Pow-Sang JM: Radical prostatectomy in the management of clinically localized prostate cancer.
- cytotoxic agents Heidenreich A, von Knobloch R, Hofmann R: Current Status of cytotoxic chemotherapy in hormone refractory prostate cancer: Eur Urol 2001; 39: 121-30
- gene therapy Miyake H, Hara I, Kamidono S , Gleave ME: Novel therapeutic strategy for advanced prostate cancer using antisense oligodeoxynucleotides targeting anti-apoptotic genes upregulated after androgen withdrawal to delay androgen-independent progression and enhance chemosensitivity.
- Immunotherapy Rosini Bl, Small EJ: Immunotherapy for prostate cancer.
- the active ingredient or the substance can be administered orally, intravenously, topically and / or by inhalation.
- the form of administration depends on the tumor itself and the constitution of the patient. Other forms of administration are known to the person skilled in the art.
- the invention encompasses a pharmaceutical composition which in particular inhibits an effective amount of at least one active substance which influences, in particular inhibits, the expression and / or the function of proteins synthesized and / or secreted by tumors, in particular malignant tumors, and optionally a pharmaceutical Carrier has.
- the active substance can be a polynucleotide which encodes a peptide, in particular a polypeptide, this peptide preferably influencing, in particular inhibiting, the expression and / or function of proteins synthesized and / or secreted by tumors, in particular malignant tumors.
- the active ingredient can be a peptide, preferably a polypeptide, this peptide preferably influencing, in particular inhibiting, the expression and / or function of proteins synthesized and / or secreted by tumors, in particular malignant tumors.
- the active ingredient can also be a so-called "small molecular compound", preferably a "small molecular compound” with a molecular weight (MW) ⁇ 1,000.
- MW molecular weight
- a pharmaceutical composition which contains an effective amount of at least one active ingredient
- Expression and / or function of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of proteins, which are synthesized and / or secreted by tumors, in particular malignant tumors, are influenced, in particular inhibited, and optionally have a pharmaceutical carrier.
- the active ingredient can be a polynucleotide which encodes a peptide, preferably a polypeptide, this peptide preferably expressing and / or functioning of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of tumors, in particular malignant tumors , synthesized and / or secreted proteins influenced, in particular inhibited.
- the active ingredient can also be a peptide, preferably a polypeptide, this peptide preferably influencing the expression and / or function of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of proteins synthesized and / or secreted by tumors, in particular malignant tumors, inhibited in particular.
- Another active ingredient according to the invention can, for. B. a "small molecular compound", preferably a "small molecular compound” with a molecular weight (MW) ⁇ 1,000.
- the invention comprises a diagnostic kit, this diagnostic kit containing at least one substance for detecting the expression and / or function of tumors, in particular malignant tumors, of synthesized and / or secreted proteins, for the detection of diseases which are associated with these tumors stand.
- a corresponding disease is a prostate cancer, which is claimed in a particularly preferred embodiment.
- the pictures show:
- Fig. 1 Schematic representation of the experimental setup
- Fig. 2 Gel electrophoretic and MS analysis of benign and malignant prostate tissue and the equivalent spots.
- Fig. 3 Preparative gels with tissue-specific protein expression.
- Benign and malignant prostate tissue was obtained from patients who had previously undergone prostatectomy. Patients were identified using PSA (prostate specific antigen) screening and the tumors were confirmed with ultrasound. Each patient's consent was obtained prior to the operation. Immediately after the prostate was removed, it was transferred to a sterile box and cooled there. The samples were transferred to the pathologist, where tissue sections 0.5 to 1 cm thick were made. The sections were divided into a left and a right half, embedded in a "freezing matrix" and shock-frozen. The rest of the prostate was fixed in formalin and further processed according to standard procedures. To obtain tissue samples, thin sections were removed from both sides of the prostate and stained with hematoxilin-aeosine. The pathologist located and marked the tumor.
- PSA state specific antigen
- Tumor tissue was removed from the hematoxilin-aesin-stained strips and stored at -80 ° C. Marked benign control strips were removed from non-tumor-affected regions and subjected to an identical treatment If necessary, tumors were stored at - 80 ° C.
- Phosphorimager Fluji FLA 3000, Raytest, Straubenhard, Germany.
- the "multiple photon detection" measurements were carried out on 1600 pixel MPD imagers (BioTracers Inc., Herndon, USA) according to the manufacturer's instructions for at least 24 hours for a 24 cm x 24 cm area per measurement.
- a scan was carried out of 0.5 mm per pixel. In some cases, smaller regions have been scanned for a longer time to achieve higher sensitivity, or scanned at 0.25 mm per pixel to increase resolution.
- the MPD imagers have been adjusted to detect either 1-125 or 1-131 with each measurement.
- Protein identification was carried out using preparative 2D-PAGE gels. These gels contain up to 1 mg of protein, which were iodinated under the same chemical conditions as for radioactive iodination, but with the addition of non-radioactive iodine molecules. Silver-colored proteins with a running behavior like the radioactive proteins were automatically collected using the Genomic Solutions Flexys Robot. In some cases, the silver-stained proteins were removed from the gel where there was no radioactive signal, but where the silver gels differed between benign and malignant tissues. Gel parts were digested automatically with trypsin in a Genomic Solutions Investigator Progest, and 10% of the proteins obtained were transferred to a MALDI template using a Genomic Solutions Investigator ProMS robot applied.
- MALDI-TOF was carried out on a Bruker AutoFlex according to the manufacturer's instructions. If necessary, up to 90% of the peptide obtained by trypsin digestion was analyzed using the LC / MS / MS method. An LC-Packing Ultimate Micro HPLC was connected to a Bruker Esquire ion trap mass spectrometer, or the samples were analyzed using the same mass spectrometer using the Nanospray MS / MS method. Protein identification was carried out using the MASCOT program version 1.07 (Matrix Science, UK), using our own algorithms.
- Fig. 2 shows the results of these experiments.
- 2A represents malignant, 2 B benign and 2 C the comparative gel (2 A + 2 B).
- 2C shows the different expression of individual proteins in the different tissues.
- Table I shows the proteins determined using the example of two preparative gels (pH range 4-10).
- 3 shows the proteins determined using the example of two preparative gels (pH range 4-10).
- So z. B. for protein 11 (gamma-seminoprotein) a total of 5 isoforms, which were detected at pH 6.5 - 7.5, thus proving the existence of several isoforms of the same protein.
- protein 11 gamma-seminoprotein
- proteins see Table I. It can also be shown that the expression of certain proteins (see Table I) is partially inhibited, ie downregulated. Thus, these proteins are suitable targets for known and still to be developed active substances for the treatment of the diseases associated with them, and suitable targets for the detection of these diseases.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Wirkstoffes sowie ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Tumoren, diagnostischen Nachweis von mit diesen Tumoren assoziierten Erkrankungen, sowie diesbezügliche pharmazeutische Zusammensetzungen und Kits.
Description
Beschreibung
Verwendung von Substanzen zur Behandlung von Tumoren
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Wirkstoffes sowie ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Tumoren, diagnostischen Nachweis von mit diesen Tumoren assoziierten Erkrankungen, sowie diesbezügliche pharmazeutische
Zusammensetzungen und Kits.
Unter Tumor wird eine Geschwulst bzw. die örtlich umschriebene Zunahme des Gewebevolumens verstanden. Im weiteren Sinne kann jede lokalisierte Anschwellung, z. B. durch ein Ödem, einer akuten und chronischen Entzündung, aneurysmatische Erweiterung, einer entzündlich bedingten Organschwellung (z. B. als sogenannter Milztumor) verstanden werden. Im engeren Sinne werden unter Tumor gewebliche Neubildungen (Gewächs, Piastom, Neoplasie) in Form eines spontanen, verschiedengradig enthemmten, autonomen und irreversiblen Überschußwachstums von körpereigenem Gewebe, das in der Regel mit unterschiedlich ausgeprägtem Verlust spezifischer Zell- und Gewebefunktion verbunden ist, verstanden. Die Tumore werden zur besseren Klassifikation unterteilt in:
I. nach ihrem biologischen Verhalten:
1. benigne (gutartige) Tumore mit differenzierten Zellen und langsamen, lokal verdrängendem Wachstum.
2. maligne (bösartige) Tumore mit Zellkempolymorphie, Zellatypie, Anaplasie und infiltrierendem, meist raschem, destruierendem Wachstum und
Metastasierung.
3. semimaligne Tumore mit den histologischen Kennzeichen maligner Tumore und lokal infiltrierendem Wachstum, jedoch in der Regel ohne eine Metastasierung.
I. histogenetische Systematik:
Hierbei werden die Tumore klassifiziert anhand des Gewebes, aus dem sie entwicklungsgeschichtlich hervorgegangen sind. Es gibt: 1. epitheliale Tumore, die aus Ektoderm und Entoderm hervorgegangen sind: a) benigne Tumore wie z. B. Adenom, Papillom und Polypen. b) maligne Tumore wie z. B. Karzinom. 2. mesenchymale Tumore, hervorgegangen aus dem
Mesoderm: a) benigne Tumore wie z. B. Lipom, Fibrom, Osteom, Myom, Leiomyom, Rhabdomyom, Chondrom, b) maligne Tumore wie z. B. die Sarkome.
3. embryonale Tumore sind aus undifferenziertem
Gewebe hervorgegangen. Hierzu zählen z. B.
Nephroblastome, Neuroblastome, Medulloblastome,
Retinoblastome sowie embryonale Rhabdomyosarkome und Teratome.
III. Klassifikation nach klinischen und pathologischen Befunden: Unter anderem gelten hier die TNM-Klassifikation, Grading, Lauren-Klassifikation, Dukes-Klassifikation, Kieler- Klassifikation, Rappaport-Klassifikation etc.
Schon diese kurze Übersicht der Tumoreinteilung zeigt, welche Vielfalt (und zum Teil Gegensätzlichkeit) innerhalb der verschiedenen Tumorarten besteht. So ist z. B. nicht nur zwischen benignen und malignen Tumoren zu unterscheiden, sondern auch zwischen Mortalität bzw. Letalität der einzelnen Tumore und die Wahrscheinlichkeit, daß sich ein benigner Tumor zu einem malignen Tumor weiterentwickelt.
Einzelne Tumore wie z. B. die Mamakarzinome (Brustkrebs), der häufigste maligne Tumor der Frau, treten gehäuft vor allem zwischen dem 45. und 70. Lebensjahr auf. Frühsymptome sind verdächtige Tastbefunde, die in der Regel infolge der
Krebsfrüherkennungsuntersuchungen sowie bei regelmäßiger Selbstuntersuchung der Brust entdeckt werden. Abhängig von Tumorstadium und Differenzierungsgrad des Tumors kann dabei die Prognose von durchaus positiv bis sehr schlecht ausfallen. Infolge der frühen lymphogenen und hämatogenen Metastasierung bei Mammakarzinomen kommt es auf eine rasche Diagnostizierung des Tumors an, um frühestmöglich mit der Therapie einsetzen zu können.
Prostatakarzinome (Karzinom der Prostata) ist demgegenüber der häufigste maligne Tumor des Mannes, der vor allem zwischen dem 50. und 70. Lebensjahr auftritt. In der Mehrzahl handelt es sich dabei um Adenokarzinome. Dieser maligne Tumor breitet sich durch infiltrierendes Wachstum zunächst innerhalb der Prostata aus, später erfolgt eine Infiltration von Bläschendrüsen und Beckenbindegewebe, relativ selten auch von Rektum, Harnblase oder Urethra. Die Metastasierung erfolgt lymphogen und/oder hämatogen. Die Therapie erfolgt abhängig vom histologischen Differenzierungsgrad und klinischen Stadium in der Regel durch radikale Prostatektomie mit regionaler Lymphknotenausräumung, im fortgeschrittenen Stadium Entzug der männlichen Sexualhormone. Auch hierbei ist die Prognose abhängig vom Stadium des Karzinoms. Während in einem sehr frühen Stadium nach einer radikalen
Prostatektomie in ca. 90 % der Fälle eine Heilung eintritt, ist bei fortgeschrittenem Stadium eher mit einer pessimistischen Prognose zu rechnen.
Prostatakarzinome sind von Prostatahyperplasie in der Diagnose zu unterscheiden. Bei der Prostatahyperplasie handelt es sich um einen benignen Tumor. Dabei vergrößert sich die Prostata durch numerische Zunahme der Zellen und Drüsen des Stromas. Die Prostatahyperplasie ist die häufigste Ursache von Blasenentleerungsstörungen bei Männern. Klinisch beginnt sie vor allem zwischen dem 40. und 50. Lebensjahr. Der Verlauf ist langsam und schubweise. Das Auftreten von Beschwerden erfolgt dabei meistens erst nach Jahren mit allmählicher Abschwächung des Harnstrahls und verzögertem Miktionsbeginn. Hierbei kann als Therapie bzw. Linderung der Symptomatik die Verabreichung von Phytotherapeutika in Betracht gezogen werden.
Da generell eine frühe Erkennung, d. h. Diagnostizierung, der Tumore für den raschen Therapiebeginn wichtig ist und auch die Prognose um so besser ist, je früher der Tumor erkannt wird, sind eine Reihe von sogenannten Tumormarkern im klinischen Einsatz. Als Tumormarker werden dabei allgemein Substanzen und zelluläre Veränderungen bezeichnet, deren qualitative oder quantitative Analyse eine Aussage über Vorliegen, Verlauf oder Prognose von (bösartigen) Erkrankungen ermöglichen kann. Eingeteilt werden Tumormarker in:
1. Zelluläre Tumormarker:
Darunter fallen unter anderem zellmembranständige Tumorantigene, Rezeptoren (z. B. Hormonrezeptoren, Rezeptoren für wachstumsfördernde Substanzen bei
Leukämie) und Zellmarker, die auf eine vermehrte Expression von Onkogenen und ein monoklonales
Zellwachstum hindeuten, sowie molekulargenetische zelluläre Veränderungen, vor allem
Chromosomenaberrationen.
2. Humorale Tumormarker:
Diese sind gegenüber physiologischen Bedingungen in Serum, Urin und anderen Körperflüssigkeiten in erhöhten Konzentrationen nachweisbare (meist physiologisch vorkommende) Substanzen, die vom Tumorgewebe synthetisiert und/oder sezemiert, durch Tumorzerfall freigesetzt oder als Reaktion des Organismus auf einen Tumor gebildet werden. Die physiologische Bedeutung von Tumormarkern ist nur unzureichend bekannt. Im menschlichen Organismus wirken sie in der Regel nicht immunogen. Die klinische (diagnostische) Bedeutung ist abhängig von ihrer Spezifität und Sensitivität. Die humoralen Tumormarker werden in zwei Gruppen unterteilt. In der ersten Gruppe werden die humoralen Tumormarker zusammengefaßt, die vom Tumor selbst produziert werden. Darunter fallen z. B. tumorassoziierte Antigene, bestimmte
Hormone (z. B. Gastrin, Cortisol etc.), Enzyme (z. B. neuronspezifische Enolase (NSE)), sowie Proteine (z. B. Bence-Jones-Protein). In der zweiten Gruppe sind die Tumormarker enthalten, die vom Tumor zwar induziert, aber nicht selbst produziert werden. Wichtige humorale
Tumormarker dieser Gruppe sind z. B. alkalische Phos- phatase (AP), LDH, Neopterin etc.
Die bisher gemachten Aussagen zeigen, wie wichtig selektive und sensitive Nachweisverfahren für Tumore sind. Weiterhin besteht ein großer Bedarf an neuen Targets bei der Tumortherapie.
Dementsprechend stellt sich die Erfindung die Aufgabe, neue Wirkstoffe und Targets für diagnostische und therapeutische Anwendungen bei der Tumortherapie bereitzustellen.
Überraschenderweise konnte in Experimenten mit verschiedenen Tumoren gezeigt werden, daß bestimmte Proteine nur in dem von Tumoren befallenen Gewebe synthetisiert und/oder sezerniert wurden. Damit spielen diese Proteine eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Tumoren und dem Verlauf einer Tumorerkrankung.
Demzufolge wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1 bis 5, 14, 18, sowie 22 gelöst. Bevorzugte Ausführungen sind in den abhängigen Ansprüchen 6 bis 13, 15 bis 17, 19 bis 21 sowie 23 genannt. Der Inhalt aller dieser Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Erfindungsgemäß kann mindestens ein Wirkstoff zur Vorbeugung oder Behandlung von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, verwendet werden. Dabei beeinflußt dieser Wirkstoff die Expression und/oder die Funktion von vom Tumor synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen in eukaryotischen Zellen, wodurch die Zunahme des Gewebevolumens und/oder die Metastasierung des Tumors zumindest partiell gehemmt wird. Unter Beeinflussung der Expression und/oder Funktion der vom Tumor synthetisierten und/oder sezernierten Proteine wird insbesondere die Inhibierung dieser Proteine verstanden. Dieser Wirkstoff kann ferner zur Herstellung eines Medikamentes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Behandlung von Tumoren verwendet werden.
Weiterhin wird die Verwendung einer Substanz zum Nachweis der Expression und/oder der Funktion von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen in
eukaryotischen Zellen, zur Erkennung von Erkrankungen, die mit diesen Tumoren in Zusammenhang stehen, beansprucht. Unter Erkrankungen, die mit diesen Tumoren in Zusammenhang stehen, fallen z. B. die schon erwähnten Prostatakarzinome, Prostatahyperplasie (Prostatahypertrophie) etc.. Aber auch alle anderen tumorassoziierten Erkrankungen, in denen die erfindungsgemäßen Proteine synthetisiert und/oder sezerniert werden, werden von der Erfindung umfaßt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, beansprucht, wobei eukaryotische Zellen mit einem Wirkstoff behandelt werden, der die Expression und/oder die Funktion von von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert, und dadurch die Zunahme des Gewebevolumens und/oder die Metastasierung der Tumore zumindest partiell hemmt.
Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Erkennung von Erkrankungen, die mit Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, in Zusammenhang stehen, beansprucht, wobei eukaryotische Zellen mit einer Substanz in Kontakt gebracht werden, die die Expression und/oder die Funktion von von diesen Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteine nachweist.
Bei den von den Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen kann es sich in einer besonders bevorzugten Ausführungsform um die in der nachfolgend dargestellten Tabelle I aufgelisteten Proteine handeln. Somit kann die Substanz, die zum Nachweis und/oder zur Erkennung von tumorassoziierten Erkrankungen eingesetzt wird, z. B. ein Antikörper sein, der gegen diese Proteine gerichtet ist, und in einem dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren, wie z. B. ELISA (enzyme-linked immuno sorbent
assay) eingesetzt wird. Bei solchen sogenannten Immunoassays wird der gegen das zu bestimmende Antigen gerichtete spezifische Antikörper (bzw. bei Antikörperbestimmungen homologe Testantigene) an eine Trägersubstanz (z. B. Zellulose, Polysterol) gebunden, an der sich nach der Inkubation mit der Probe Immunkomplexe bilden. In einem nachfolgenden Schritt wird diesen Immunkomplexen ein markierter Antikörper zugeführt. Durch Zugabe eines homogenen Substrates zum Reaktionsansatz können die Immunkomplex-gebundenen Enzym- Substrat-Komplexe sichtbar gemacht bzw. die Antigenkonzentration in der Probe über eine photometrische Bestimmung der Immunkomplex- gebundenen Markerenzyme durch Vergleich mit Standards bekannter Enzymaktivität ermittelt werden. Weitere Substanzen, die für den diagnostischen Nachweis verwendet werden können, sind z. B. sogenannte Oligonukleotide, die mit Hilfe der sogenannten Polymerase- Kettenreaktion (PCR) geeignet sind, über ein molekulargenetisches Verfahren, bei dem selektiv bestimmte DNA-Abschnitte amplifiziert werden, einen quantitativen Nachweis der untersuchten Proteine zu erbringen. Weitere Verfahren, wie ein bekanntes Zielprotein quantitativ oder qualitativ nachgewiesen werden kann, sind dem Fachmann geläufig. Wirkstoffe, die zur zumindest partiellen Hemmung dieser Proteine genutzt werden können, sind ebenfalls dem Fachmann bekannt. So können z. B. sogenannte Antisensesequenzen als Wirkstoff genutzt werden. Weiterhin können gentechnisch veränderte Mutanten dieser Proteine erfindungsgemäß als Wirkstoff genutzt werden, so z. B. sogenannte „deficient mutants", in denen die enzymatische Aktivität ausgeschaltet wurde.
Tabelle I: Detektierte gewebespezifische Proteine
MW Theo. = Theoretisches (berechnetes) Molekulargewicht.
MW Bereich = Im Molekulargewichtsbereich der angegebenen
Markerproteine gefunden. pl = isoelektrische Punkt
Expr. Cancer (0 = sowohl in malignem als auch benignem Gewebe gefunden; + upreguliert; - downreguliert).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff oder die Substanz gegen die von den Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteine selbst gerichtet. Wie schon beschrieben, kann es sich bei den Wirkstoffen z. B. um Antisensesequenzen handeln. Diese sind dann direkt gegen die synthetisierten und/oder sezernierten Proteine gerichtet. Weiterhin kann es sich bei dem Wirkstoff um gentechnisch veränderte Mutanten handeln. So können z. B. durch gentechnische Verfahren Mutanten, in denen das katalytische Zentrum ausgeschaltet wird (sogenannte deficient-Mutanten), konstruiert werden. Dabei werden zwar die tumorassoziierten Proteine synthetisiert, sie weisen aber keine oder nur eine verminderte enzymatische Aktivität auf. Diese deficient-Mutanten, die zuvor in das Tumorgewebe eingeschleust wurden, können die ihnen zugewiesene Aufgabe im Tumorgewebe nicht erfüllen, womit die Zunahme des Gewebevolumens und/oder die Metastasierung des Tumors zumindest partiell gehemmt wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Wirkstoff gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen gerichtet. Diese Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/ oder biologische Vorläufer können z. B. up- und downstream liegende Mitglieder der Transduktionskaskade der in Tabelle I aufgelisteten Proteine, Transkriptionsfaktoren, die den
Expressionslevel der genannten Proteine regulieren, aber auch bis jetzt unbekannte Moleküle sein, die durch den Wirkstoff beeinflußt werden und an der Expression und/oder Funktion der genannten Proteine beteiligt sind.
Bei der Erfindung ist es möglich, bekannte sowie noch unbekannte Wirkstoffe oder Substanzen zu verwenden. So kann z. B. der Wirkstoff oder die Substanz ein Polynukleotid sein, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteine beeinflußt, insbesondere inhibiert. Weiterhin kann der Wirkstoff oder die Substanz ein Peptid sein, vorzugsweise ein Polypeptid, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteine beeinflußt, insbesondere inhibiert. Weiterhin kann der Wirkstoff oder die Substanz ein „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000, sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem malignen Tumor um ein Prostatakarzinom. Wie schon beschrieben, stellen Prostatakarzinome die häufigsten malignen Tumore bei Männern dar. Nur wenn ein Prostatatumor in einem frühen Stadium nachgewiesen werden kann, z. B. durch prostataspezifische antigenbasierende Massenscreenings (Bartsch G, Horninger W, Klocker H, Reissigl A, Oberaigner W, Schonitzer D, Severi G, Robertson C, Boyle P: Prostate cancer mortality after introduction of prostate-specific antigen mass screening in the Federal State of Tyrol, Austria. Urology 2001 ; 58:417-24), kann die reine (vorbeugende) chirugische Entnahme der Prostata in Betracht gezogen werden (Bukkapatnam R, Pow-Sang JM: Radical prostatectomy in the management of clinically localized prostate cancer. Cancer Control 2001 ; 8:496-502; Pentyala SN, Lee J,
Hsieh K, Waltzer WC, Trocchia A, Musacchia L, Rebecchi MJ, Khan SA: Prostate cancer: a comprehensive review. Med Oncol 2000; 17:85-105). Für die fortgeschrittene, nicht mehr auf ein Organ begrenzte Erkrankung, ist eine vorbeugende Entnahme der Prostata nicht mehr ausreichend. Für diese zum Teil inoperativen Prostatatumore (Prostatakarzinome) ist, wie schon beschrieben, die Hemmung der männlichen Sexualhormone eine mögliche Therapiewahl (Hussain A, Dawson N: Management of advanced/metastatic prostate cancer: 2000 update. Oncology (Huntingt) 2000; 14; 1677-88; discussion 1688, 1691- 4). Diese Hemmung der Produktion männlicher Sexualhormone, zum Teil in Kombination mit der chirurgischen oder pharmakologischen Kastration, inhibiert zum Teil die Proliferation und Metastasierung des Tumors und erlaubt damit desen Kontrolle für einen gewissen Zeitraum (Afrin LB, Ergul SM: Medical therapy of prostate cancer: 1999. J S C Med Assoc 2000; 96:77-84; Auclerc G, Antoine EC, Cajfinger F, Brunet- Pommeyrol A, Agazia C, Khayat D: Management of advanced prostate cancer. Oncologist 2000; 5:36-44). Die meisten Prostatatumore entwickeln dabei mit der Zeit eine gewisse Resistenz gegenüber dieser endokrinologischen Therapie, und mit der Zeit werden sie androgen- insensitiv (Eder IE, Culig Z, Putz T, Nessler-Menardi C, Bartsch G, Klocker H: Molecular biology of the androgen receptor: from molecular understanding to the clinic. Eur Urol 2001 ; 40:241-51 ; Crawford ED, Rosenblum M, Ziada AM, Lange PH: Hormone refractory prostate cancer. Urology 1999; 54:1-7). Weitere mögliche Therapiemöglichkeiten, wie z. B. die Verwendung von cytotoxischen Agenzien (Heidenreich A, von Knobloch R, Hofmann R: Current Status of cytotoxic chemotherapy in hormone refractory prostate cancer: Eur Urol 2001 ; 39:121-30), Gentherapie (Miyake H, Hara I, Kamidono S, Gleave ME: Novel therapeutic strategy for advanced prostate cancer using antisense oligodeoxynucleotides targeting anti-apoptotic genes upregulated after androgen withdrawal to delay androgen-independent progression and enhance chemosensitivity. Int J. Urol 2001 ; 8:337-49) und
Immunotherapie (Rini Bl, Small EJ: Immunotherapy for prostate cancer. Curr Oncol Rep 2001 ; 3:418-23) befinden sich zwar in der klinischen Erprobung, bis jetzt konnte aber kein signifikanter Erfolg bei der Prostatakarzinombehandlung erzielt werden (DiPaola RS, Kumar P, Hait WN, Weiss RE: State-of-the-art prostate cancer treatment and research. A report from the Cancer Institute of New Jersey. N J Med 2001 ; 98:23- 33). Die Identifizierung von Genen, die nur bei Tumoren exprimiert werden, bzw. in denen eine unterschiedliche Expression in benignen und malignen Tumoren nachgewiesen werden kann, ist deshalb ein erfolgsversprechender Ansatz zur Therapie dieser Tumore (Magee JA, Araki T, Patil S, Ehrig T, True L, Humphrey PA, Catalona WJ, Watson MA, Milbrandt J: Expression profiling reveals hepsin overexpression in prostate cancer. Cancer Res 2001 ; 61 :5692-6; Welsh JB, Sapinoso LM, Su AI, Kern SG, Wang-Rodriguez J, Moskaluk CA, Frierson HF, Jr., Hampton GM: Analysis of gene expression identifies candidate markers and pharmacological targets in prostate cancer. Cancer Res 2001 ; 61 :5974-8; Stamey TA, Warrington JA, Caldwell MC, Chen Z, Fan Z, Mahadevappa M, McNeal JE, Nolley R, Zhang Z: Molecular genetic profi-ling of Gleason grade 4/5 prostate cancers of compared to benign prostatic hyperplasia. J Urol 2001 ; 166:2171-7; Dhanasekaran SM, Barrette TR, Ghosh D, Shah R, Varambally S, Kurachi K, Pienta KJ, Rubin MA, Chinnaiyan AM: Delineation of prognostic biomarkers in prostate cancer. Nature 2001 ; 412:822-6; Waghray A, Schober M, Reroze F, Yao F, Virgin J, Chen YQ: Identification of differentially expressed genes by serial analysis of gene expression in human prostate cancer. Cancer Res 2001 ; 61 :4283-6; Chaib H, Cockrell EK, Rubin MA, Macoska JA: Profiling and verification of gene expression pattems in normal and malignant human prostate tissues by cDNA microarray analysis. Neoplasia 2001 ; 3:43-52; Chetcuti A, Margan S, Mann S, Russell P, Handelsman D, Rogers J, Dong Q: Identification of differentially expresssed genes in organ-confined prostate cancer by gene expression array. Prostate 2001 ; 47:132-40). Deshalb kann durch
Inhibierung der beschriebenen tumorassoziierten Proteine erfindungsgemäß ein Therapieansatz zur Behandlung dieser Tumore angeboten werden.
Der Wirkstoff oder die Substanz kann dabei oral, intravenös, topisch und/oder per Inhalation in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verabreicht werden. Die Verabreichungsform hängt dabei vom Tumor selbst sowie der Konstitution des Patienten ab. Weitere Verabreichungsformen sind dem Fachmann bekannt.
Weiterhin wird von der Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfaßt, die eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes, der die Expression und/oder die Funktion von von Tumoren, insbesondere von malignen Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger aufweist. Bei dem Wirkstoff kann es sich um ein Polynukleotid handeln, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteine beeinflußt, insbesondere inhibiert. Weiterhin kann der Wirkstoff ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, sein, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteine beeinflußt, insbesondere inhibiert. Auch kann der Wirkstoff ein sogenannter „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000, sein. Zu den weiteren Merkmalen eines solchen Wirkstoffes wird auf den entsprechenden bisherigen Text der Beschreibung Bezug genommen.
Erfindungsgemäß ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfaßt, die eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes, der die
Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteine beeinflußt, insbesondere inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger.aufweist. Dabei kann es sich bei dem Wirkstoff um ein Polynukleotid handeln, welches ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteine beeinflußt, insbesondere inhibiert. Auch kann der Wirkstoff ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, sein, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteine beeinflußt, insbesondere inhibiert. Ein weiterer erfindungsgemäßer Wirkstoff kann z. B. ein „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000, sein. Zu den weiteren Merkmalen eines solchen Wirkstoffes sowie der Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern, gegen die dieser Wirkstoff gerichtet ist, wird auf den entsprechenden bisherigen Text der Beschreibung Bezug genommen.
Schließlich umfaßt die Erfindung ein Diagnosekit, wobei in diesem Diagnosekit mindestens eine Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen enthalten ist, zur Erkennung von Erkrankungen, die mit diesen Tumoren in Zusammenhang stehen. Dabei kann z. B. eine dementsprechende Erkrankung ein Prostatakarzinom sein, was in einer besonders bevorzugten Ausführungsform beansprucht wird. Zu weiteren
Merkmalen einer solchen Substanz wird auf den entsprechenden bisherigen Text der Beschreibung Bezug genommen.
Die bestehenden Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und den Figuren. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Abbildungen zeigen:
Fig. 1 : Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Fig. 2: Gelelektrophoretische sowie MS-Analyse von benignem und malignem Prostatagewebe und den äquivalenten Spots.
Fig. 3: Präparative Gele mit gewebespezifischer Proteinexpression.
Material und Methoden:
Patienten und Gewebeproben:
Benignes und malignes Prostatagewebe wurde von Patienten, die zuvor einer Prostatektomie unterzogen wurden, erhalten. Die Patienten wurden mit Hilfe des PSA (prostata specific antigen) Screenings nachgewiesen, und die Tumore wurden mit Ultraschall bestätigt. Eine Einwilligung jedes Patienten wurde vor Durchführung der Operation eingeholt.
Sofort nach der Entnahme der Prostata wurde diese in eine sterile Box überführt und dort gekühlt. Die Proben wurden zum Pathologen überführt, wo 0,5 bis 1 cm dicke Gewebeschnitte gemacht wurden. Die Schnitte wurden in eine linke und eine rechte Hälfte unterteilt, in eine „freezing matrix" eingebettet und schockgefroren. Der Rest der Prostata wurde in Formalin fixiert und entsprechend Standardverfahren weiterbehandelt. Für den Erhalt von Gewebeproben wurden dünne Sektionen von beiden Seiten der Prostata entnommen und mit Hematoxilin-Aeosin angefärbt. Der Pathologe lokalisierte und markierte den Tumor. Tumorgewebe wurde aus den Hematoxilin-Aesin-gefärbten Streifen entnommen und bei -80°C aufbewahrt. Markierte benigne Kontrollstreifen wurden von nicht-tumorbefallenen Regionen entnommen und einer identischen Behandlung unterzogen. Die Tumore wurden, sofern erforderlich, bei - 80°C gelagert.
Proteomics Analyse:
Protein Alkylierung, Jodierung, 2D-PAGE und sowie die Datenanalyse wurden, entsprechend Standardverfahren durchgeführt. Radioaktives
Jod stammt von Amersham Biosciences (Freiburg). Die Markierung von
Proteinen mit Jod 1-125 oder 1-131 wurden einzeln mit identischen
Konzentrationen an Jod ausgeführt. Sämtliche radioaktiven Arbeiten sind entsprechend der „Strahlenschutzverordnung 2001 " (Deutschland) entstanden. Für die 2D-PAGE sind die Proben miteinander vermischt worden und entsprechend dem Schema von Figur 1 co- elektrophoretisch aufgetrennt worden. Die radioaktiven Messungen sind mit einem „Multiple Photon Detektion" (MPD) oder einem
Phosphorimager (Fuji FLA 3000, Raytest, Straubenhard, Deutschland) durchgeführt worden.
Die „Multiplen Photon Detektion" Messungen sind an 1600 Pixel MPD Imagers (BioTracers Inc., Herndon, USA), entsprechend den Anweisungen des Herstellers für mindestens 24 Stunden, für einen 24 cm x 24 cm Bereich pro Messung durchgeführt worden. Dabei wurde eine Scannung von 0,5 mm pro Pixel eingestellt. In einigen Fällen sind kleinere Regionen für eine längere Zeit gescannt worden, um eine höhere Sensitivität zu erzielen, oder bei 0,25 mm pro Pixel gescannt worden, um die Auflösung zu erhöhen. Die MPD Imagers wurden dabei darauf eingestellt, entweder 1-125 oder 1-131 bei jeder Messung zu detektieren. Aufgrund der geringeren Halbwertzeit von 1-131 ist dieses Isotop immer vor 1-125 für jede einzelne Probe gemessen worden. MPD Daten sind mit der IMAGEVIEW Software (BioTraces) in Matrizendaten überführt worden. Diese Daten sind dann mit der BIOPREPARATION Software entsprechend den Anweisungen des Herstellers analysiert worden. Radioaktive Daten wurden mit Hilfe eines Algorithmus für die Analyse herkömmlicher Software in TIFF-Daten konvertiert. Einige radioaktive Messungen wurden mit einem Phosphorimager durchgeführt.
Die Proteinidentifizierung wurde mit präparativen 2D-PAGE-Gelen durchgeführt. Diese Gele enthalten bis zu 1 mg Protein, die unter identischen chemischen Bedingungen wie bei der radioaktiven Jodierung, jedoch unter Zugabe nicht-radioaktiver Jodmoleküle, jodiert wurden. Silbergefärbte Proteine mit einem Laufverhalten wie die radioaktiven Proteine wurden mit Hilfe des Genomic Solutions Flexys Robot automatisiert eingesammelt. In einigen Fällen wurden die silbergefärbten Proteine an den Stellen des Gels entfernt, an denen kein radioaktives Signal vorhanden war, an denen jedoch die Silbergele zwischen benignen und malignen Gewebe sich unterschieden. Gelteile wurden mit Trypsin automatisch in einem Genomic Solutions Investigator Progest verdaut, und 10 % der erhaltenen Proteine wurden auf einen MALDI Template mit Hilfe eines Genomic Solutions
Investigator ProMS Roboter aufgetragen. MALDI-TOF wurde entsprechend den Angaben des Herstellers an einem Bruker AutoFlex durchgeführt. Sofern nötig, wurden bis zu 90% des durch den Trypsinverdau erhaltenen Peptides mit Hilfe der LC/MS/MS Methode analysiert. Dabei war eine LC-Packing Ultimate Micro HPLC mit einen Bruker Esquire lonenfallen-Massenspektrometer verbunden, oder die Proben wurden mit Hilfe der Nanospray MS/MS Methode am gleichen Massenspektrometer analysiert. Die Proteinidentifizierung wurde mit Hilfe des MASCOT Programms Version 1.07 (Matrix Science, UK), unter Nutzung eigener Algorithmen, durchgeführt.
Resultate:
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des den Resultaten zugrundeliegenden Versuchsaufbaus. Dabei werden zwei zu analysierende Proben A und B jeweils separat mit 1-125 und 1-131 markiert, um die jodierten Proben 125-A, 125-B, 131 -A und 131-B zu erhalten. In den Gelen 1 und 2 wird jede Probe jeweils im Vergleich zur gleichen, aber anders markierten Probe analysiert, wie es auch in den Figuren dargestellt ist. In den Gelen 3 and 4 werden die Proben A und B gegen die entsprechende andere Probe unter den gleichen Bedingungen analysiert. Somit enthalten diese Gele vier Replikate der Proben A und B, wobei diese in direkter Beziehung zu den Proben A und B stehen
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse dieser Versuche. Dabei repräsentiert Fig. 2 A malignes, 2 B benignes sowie 2 C das vergleichende Gel (2 A + 2 B). Fig. 2 C zeigt die unterschiedliche Expression einzelner Proteine in den unterschiedlichen Geweben. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in der schon dargestellten Tabelle I zusammengefaßt.
Fig. 3 zeigt am Beispiel zweier präparativer Gele (pH-Bereich 4-10) die ermittelten Proteine. Es ist insbesondere darauf hinzuweisen, daß mehrere Isoformen einzelner Proteine gefunden wurden. So existieren z. B. für Protein 11 (gamma-seminoprotein) insgesamt 5 Isoformen, die bei pH 6,5 - 7,5 detektiert wurden, womit die Existenz mehrerer Isoformen ein und desselben Proteins bewiesen wurde. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß nicht nur bestimmte Proteine, sondern vor allem auch spezifische Isoformen einzelner Proteine bei Tumoren gebildet werden. Ferner kann gezeigt werden, daß zum Teil die Expression bestimmter Proteine (siehe Tabelle I) gehemmt, d.h. downreguliert wird. Somit stellen diese Proteine geeignete Targets für bekannte und noch zu entwickelnde Wirkstoffe für die Behandlung der mit ihnen assoziierten Erkrankungen, sowie geeignete Targets für den Nachweis dieser Erkrankungen, dar.
Claims
1. Verwendung eines Wirkstoffes zur Vorbeugung oder Behandlung von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, wobei der Wirkstoff die Expression und/oder die Funktion von vom Tumor synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen in eukaryotischen Zellen beeinflußt, insbesondere inhibiert, und dadurch die Zunahme des Gewebevolumens und/oder die Metastasierung des Tumors zumindest partiell hemmt.
2. Verwendung eines Wirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Behandlung von Tumoren, wobei der Wirkstoff die Expression und/oder die Funktion von vom Tumor synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen in eukaryotischen
Zellen beeinflußt, insbesondere inhibiert, und dadurch die Zunahme des Gewebevolumens und/oder die Metastasierung des Tumors zumindest partiell hemmt.
3. Verwendung einer Substanz zum Nachweis der Expression und/oder der Funktion von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen in eukaryotischen Zellen, zur Erkennung von Erkrankungen, die mit diesen Tumoren in Zusammenhang stehen.
4. Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß eukaryotische Zellen mit einem Wirkstoff behandelt werden, der die Expression und/oder die Funktion von von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert, und dadurch die Zunahme des Gewebevolumens und/oder die Metastasierung der Tumoren zumindest partiell hemmt.
5. Verfahren zur Erkennung von Erkrankungen, die mit Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, in Zusammenhang stehen, dadurch gekennzeichnet, daß eukaryotische Zellen mit einer Substanz in Kontakt gebracht werden, die die Expression und/oder die Funktion von von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen nachweist.
6. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen um die Proteine der Tabelle I, insbesondere derer Isoformen, handelt.
7. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz gegen die von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteine gerichtet ist.
8. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen gerichtet ist.
9. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die
Expression und/oder Funktion von von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert.
10. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, ist, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von von Tumoren synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert.
11. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000, ist.
12. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den malignen Tumoren um Prostatakarzinome handelt.
13. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz oral, intravenös, topisch und/oder per Inhalation verabreichbar ist.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes, der die Expression und/oder Funktion von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Peptid, vorzugsweise ein
Polypeptid, ist, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000, ist.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes, der die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, ist, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen beeinflußt, insbesondere inhibiert.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000, ist.
22. Diagnosekit, umfassend mindestens eine Substanz zum Nachweis von Expression und/oder Funktion von von Tumoren, insbesondere maligner Tumoren, synthetisierten und/oder sezernierten Proteinen, zur Erkennung von Erkrankungen, die mit diesen Tumoren in Zusammenhang stehen.
23. Diagnosekit nach Anspruch 22 zur Erkennung von Prostatakarzinomen.
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