WO2003083115A1

WO2003083115A1 - Gène abcc13 associé à un transporteur abc

Info

Publication number: WO2003083115A1
Application number: PCT/JP2003/003879
Authority: WO
Inventors: Toshihisa Ishikawa; Hikaru Yabuuchi
Original assignee: Gs Platz Co., Ltd.
Priority date: 2002-03-28
Filing date: 2003-03-27
Publication date: 2003-10-09
Also published as: JP2003284560A; AU2003220853A1

Description

明細書

ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13 技術分野

本発明は， ABC トランスポーター関連遺伝子に関する。より詳細には，本発明は， ABC トランスポーター関連遺伝子，この遺伝子によりコードされる蛋白質，この蛋白質を認識する抗体，ならびに本発明の遺伝子，蛋白質および抗体を用いる種々の疾患の診断および治療に関する。背景技術

A T P結合カセット（A B C) トランスポーターは，細菌からヒト等の高等生物にわたるすベての細胞において見いだされる，最も大きな蛋白質のスーパーファミリ一の 1つであり，約 2 5 0種類（ヒトでは約 5 0種類）のメンバーが知られている。ほとんどの A B C蛋白質は，活性なトランスポーターであるが，ィォンチャネルとして機能するものも存在する。多くの A B C蛋白質は，臨床的に非常に有用である。例えば，癌に化学療法に対する耐性を与え，薬物の体内動態に関与する多剤耐性 P—糖蛋白質，嚢胞性繊維症遺伝子産物，マラリア寄生虫にクロロキン耐性を付与する p f m d r , 細菌中の細胞からトキシンを輸出する蛋白質，デュービン—ジョンソン症候群に関与する蛋白質等が知られている（Dean et al., Genome Research 11, 1156-1166 (2001)) 。典型的な ABC トランスポーターは，複数個の膜スバニングドメイン（M S D) および 1つから 2つのヌクレォチド結合ドメイン（N B D) 力、ら構成される。

いくつかの ABC トランスポーターおよびチャネルについては，その構造および機能が明らかにされている力他の多くの ABC トランスポーターの機能および生理学的役割はまだ不明である。したがって， ABC トランスポーターの構造および作用メカニズムを解析し，種々の疾患との関連性を解明することは，疾患の予防 ·治療方法の開発に有用であろう。

したがって、本発明は，新規な ABC トランスポ一ター関連遺伝子，この遺伝子によりコードされる蛋白質およびこの蛋白質を認識する抗体を提供することを目的とする。発明の開示

本発明は，配列番号 1 , 2または 3に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列を有する D N Aを提供する。本発明はまた，該 D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし，かつ ABC トランスポーター蛋白質をコードする D N Aを提供する。

別の観点においては，本発明は，配列番号 4 , 5または 6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはそのフラグメントを提供する。さらに，本発明は，これらの蛋白質をコ一ドする D NAを提供する。

また別の観点においては，本発明は，配列番号 1 , 2または 3に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 5 0塩基を有するオリゴヌクレオチド，あるいは，配列番号 1 , ·2または 3に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 1 2— 5 0 0塩基を有するオリゴヌクレオチドを提供する。

さらに別の観点においては，本発明は，上述の本発明の蛋白質またはそのフラグメントを認、識する抗体を提供する。

本発明の 1つの観点においては，大腸癌を診断する方法が提供される。該方法は，患者の大腸組織に由来する試料と上述の本発明のオリゴヌクレオチドとを接触させ，該試料と該オリゴヌクレオチドとの間にハイプリダイゼーションが生ずるか否かを判定することにより，試料中の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13 をコードする R NAの存在または量を検出することを含む。あるいは，該方法は，患者の大腸組織に由来する試料と上述の本発明の抗体とを接触させ，該試料に抗体が結合するか否かを判定することにより，該試料中の ABC トランスポ一ター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質の存在または量を判定することを含む。

本発明の別の観点においては，造血幹細胞を分化の程度にしたがってタイピングする方法が提供される。該方法は，造血細胞に由来する試料と本発明のオリゴヌクレオチドとを接触させ，該試料と該ォリゴヌクレオチドとの間にハイブリダィゼーシヨンが生ずる力否かを判定することにより，試料中の ABC トランスポ —ター関連遺伝子 ABCC13をコ一ドする R N Aの存在または量を検出することを含む。あるいは，該方法は，造血細胞に由来する試料と上述の本発^の抗体とを接触させ，該試料に抗体が結合する力否かを判定することにより，該試料中の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質の存在または量を判定することを含む。

さらに，本発明は，上述の本発明のオリゴヌクレオチドを含む大腸癌診断用キットおよび造血幹細胞タイビング用キット，ならびに上述の本発明の抗体を含む大腸癌診断用キットおよび造血幹細胞タイビング用キッ卜を提供する。本発明はまた，薬剤および上述の本発明の抗体を含む，薬剤を造血幹細胞にターゲティングするための組成物を提供する。本発明はさらに，上述の本発明の抗体および該抗体に結合した化学療法剤を含む，骨髄移植前処置用医薬組成物を提供する。図面の簡単な説明

図 1は， ABCC13 バリアント Aの全長 cDNA配列を示す。

図 2は， ABCC13 バリアント Bの全長 cDNA配列を示す。

図 3は， ABCC13 バリアント Cの全長 cDNA配列を示す。

図 4は， ABCC13 バリアント Aをコードする蛋白質のアミノ酸配列を示す。図 5は， ABCC13バリアント Bをコードする蛋白質のアミノ酸配列を示す。図 6は， ABCC13 バリアント Cをコードする蛋白質のアミノ酸配列を示す。図 7は，ヒト成人および胎児組織における ABCC13遺伝子の発現パターンを示す。

図 8は，ヒト成人消化管におけるヒト ABCC13遺伝子の発現パターンを示す。図 9は，ヒト成人白血球画分における ABCC13遺伝子の発現パターンを示す。図 1 0は，ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞における ABCC13遺伝子の発現を示す。発明の詳細な説明本発明は，新規なヒト ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13をコードする DN Aを提供する。該 DN Aに相補的な DN Aも本発明の範囲に含まれる。 ABCトランスポーター関連遺伝子 ABCC13の c DNAには少なくとも 3種類のバリアント，すなわち，バリアント A(GenBank受託番号; AY063514;

2001,11,16), バリアント B(GenBank受託番号; AY063515; 2001,11,16), バリアント C (GenBank受託番号; AF418600; 2001，9，7)が存在し，これらはそれぞれ図 1 _ 3に示される塩基配列を有する。これらの配列に基づいて，ゲノム配列 (GenBank受託番号 AF130358) の解析を行ったところ，これらのバリアントは，スプライシングの相違により生じたバリアントであることが明らかとなつた。

本発明はまた，図 1—3に示されるヒト ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13 をコードする DN Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし, かつ ABC トランスポーター蛋白質をコードする DNAを提供する。好ましくは, このような DNAは，ヒ卜以外の哺乳動物に由来する DNAである。

ハイブリダィズとの用語は， DNAまたはこれに対応する RNAが，溶液中でまたは固体支持体上で，別の DNAまたは RNA分子と水素結合相互作用により結合することを意味する。このような相互作用の強さは，ハイブリダィゼーション条件のストリンジエンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択 1生によって，種々のストリンジェンシ一のハイブリダイゼーシヨン条件を用いることができ，ストリンジエンシーは，塩濃度または変性剤の濃度を変化させることにより調節することができる。そのようなストリンジヱンシ一の調節方法は当該技術分野においてよく知られており，例えば，〃Mo 1 e c u 1 a r C 1 o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma nu a l , 第 2版. Co l d S p r i n g Ha r b o r La b o r a t o r y, S a mb r o o k, F r i t s c h, &M a n i a t i s, e d s . , 1989) に記載されている。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは， 50。/。ホルムァミドの存在下で， 70 OmMの N a C 1中 42°C, またはこれと同等の条件をいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は， 50 %ホルムァミド， 5XS SC, 5 OmMN a H₂P0₄, p H 6. 8， 0. 5 % S D S , 0. 1 m gZmL超音波処理サケ精子 DNA，および 5 Xデンハルト溶液中で 42°Cで一夜のハイブリダィゼーシヨン； 2XS SC, 0. 1%SD Sで 45°Cでの洗浄；および 0. 2XS SC, 0. 1 %SD Sで 45°Cでの洗浄である。

本発明の DNAは，配列番号 1， 2または 3に記載される塩基配列に基づいてプライマ一を設計し，適当な cDNAライブラリをテンプレートとして，ポリメラーゼ連鎖反応（PCR) により目的とする配列を増幅することにより製造することができる。このような P CR手法は当該技術分野においてよく知られており，例えば， " PCR P r o t o c o l s, A Gu i d e t o Me t h o d s a n d Ap p l i c a t i o n s , Ac a d em i c P r e s s, M i c h a e l , e t a 1. , e d s. , 1990に記載されている。

また別の観点においては，本発明は， ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質またはそのフラグメントを提供する。上述の本発明の DNAの配列を解析したところ，ノくリアント A, Bおよび Cはそれぞれ， 274アミノ酸， 140アミノ酸および 325アミノ酸の長さの蛋白質をコードすることが明らかとなった（図 4_6) 。本発明の蛋白質またはそのフラグメントは，上述の本発明の DNAを用いて，当該技術分野において知られる方法により組換え的に製造することができる。

ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13をコードする DNAを，適当な発現ベクターに中に組み込み，これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して，所望の蛋白質を発現させることができる。本発明の蛋白質を発現させるために用いることができる宿主細胞の例としては，限定されないが，大腸菌，枯草菌等の原核生物宿主，および酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。

ベクターは，本発明の DNAの発現を駆動するプロモーター領域を含み，さらに転写および翻訳の制御配列，例えば T A T Aボックス，キヤッピング配列， C AAT配列， 3' 非コード領域，ェンハンサ一等を含んでいてもよい。プロモーターの例としては，原核生物宿主中で用いる場合には， b l aプロモーター， c a tプロモータ一， 1 a c Zプロモータ一，真核生物宿主中で用いる場合には，ヘルぺスウィルスの TKプロモータ一， S V40初期プロモーター，酵母解糖系酵素遺伝子配列プロモーター等が挙げられる。ベクターの例には，限定されない力 p BR 322, pUC 1 1 8, p UC 1 19 , え g t l O, え g t l l, p MAM-n e o , p KRC, B P V, ワクチニァ， SV40, 2—ミクロン等が含まれる。さらに，シグナル配列を用いて本発明の蛋白質を分泌発現させるように，あるいは，本発明の蛋白質を別の蛋白質との融合蛋白質の形で発現させるように，ベクターを構築することができる。そのような発現ベクターの構築は当該技術分野においてよく知られている。

本発明の DNAを発現するよう構築されたベクターは，トランスフォーメーシヨン，トランスフエクシヨン，コンジユゲーシヨン，プロトプラスト融合，エレクトロポレーシヨン，粒子銃技術，リン酸カルシゥム沈澱，直接マイクロインジェクシヨン等により，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて本発明の蛋白質を産生させ，細胞または培地から所望の組換え蛋白質を回収し，精製することにより，本発明の蛋白質を得ることができる。精製は，サイズ排除クロマトグラフィー， HPLC, イオン交換クロマトグラフィー，および免疫ァフィ二ティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。

さらに別の観点においては，本発明は， ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いることができるオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドを用いて定量 PCR法，ノザンブロット法，インシトウ一ハイブリダイゼーション法などを行うことにより，ヒト組織における ABCC13遺伝子の発現量およびノまたは組織分布を検出することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドは，当該技術分野において知られるプロトコルを用いて，市販の DNA合成機（例えば 394合成器， Ap p l i e d B i o s y s t ems社製）で合成することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドは， ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13 を増幅または検出するための PCRプライマーとして用いることができる。このプライマ一を用いることにより，試料中の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13の存在または量または変異を検出することができる。プライマーとして用いるためには，本発明のオリゴヌクレオチドは，配列番号 1 , 2または 3に示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 5 0塩基，特に 6— 2 0塩基の配列を有することが好ましい。

本発明のオリゴヌクレオチドはまた，試料中において ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13 を検出するための核酸プローブとして用いることができる。本発明のプローブは，配列番号 1， 2または 3に記載される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列の少なくとも 1 2塩基， 2 0 , 3 0 , 5 0または 1 0 0塩基またはそれ以上の連続する塩基配列を有し， ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13の特定の領域に特異的にハイブリダィズするよう選択される。ハイブリダィゼーシヨンが生じるような条件下で試料をプローブと接触させ， ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC 13に結合したプローブの存在または量を検出することにより，試料中における ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13 の存在または量または変異を検出することができる。

プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例としては，限定されないが，プラスチック，ァガロース，セファロース，ポリアクリルアミド，ラテックスビーズおよびニトロセルロース等が含まれる。プローブをそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。プローブは，標準的な標識技術，例えば放射性標識，酵素標識（西洋ヮサビペルォキシダーゼ，アルカリホスファターゼ），蛍光標識，ピオチン一ァビジン標識，化学発光等を用いて標識することにより可視化することができる。試料中で ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC 13の存在を検出するためのキットは，上述のプローブに加えて，洗浄試薬，結合したプローブの存在を検出することができる試薬，ならびに使用の指針を含むことができる。

さらに別の観点においては，本発明は， ABC トランスポーター関連遺伝子

ABCC13 によりコ一ドされる蛋白質を認、識する抗体を提供する。認識するとは, 抗体が，特定の条件下において，本発明の蛋白質またはそのフラグメントに対して，他のポリべプチドに結合するより高い親和性をもって結合することを意味する。本発明の抗体を，ウェスタンプロット法， ELISA法，組織染色法などの手法において用いて，ヒト組織における ABCC13遺伝子によりコ一ドされる蛋白質の発現量および組織分布を検出することができる。また，本発明の抗体は，免疫ク口マトグラフィ一により ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質を精製するために，あるいは薬剤を所望の標的細胞にターゲティングするために用いることができる。

本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，ならびにこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗体のヒト化型は，キメラ化または C D Rグラフティング等の当該技術分野において知られる手法の 1つを用いて製造することができる。

本発明の抗体は，配列番号 4, 5または 6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはそのフラグメントを認識することができる。本発明の抗体は，試料中における ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質の存在およびまたは量を検出する方法において用いることができる。そのような検出方法は，免疫複合体が形成されるような条件下で試料を抗体と接触させ，そしてホスファターゼポリべプチドにコンジユゲートした抗体の存在およびまたは量を検出することを含む。

一般に，モノクローナル抗体およびハイプリドーマを製造する手法は当該技術分野においてよく知られている（C a mp b e 1 1 , "Mo n o 1 o n a 1 A n t i b o d y Te c hn o l o g y : L a b o r a t o r y Te c hn i q u e s i n B i o c h em i s t r y a n d Mo l e c u l a r B i o l o g y", E l s e v i e r S c i e n c e Pu b l i s h e r s, Am s t e r d a m, Th e Ne t h e r l a n d s, 1 984 ; S t . G r

0 t h e t a 1. , J . Immun o l . Me t h o d s 35 : 1— 21,

1980) 。本発明の蛋白質またはフラグメントを免疫原として用いて，抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ゥサギ等）に皮下または腹膜内注射することにより免疫することができる。免疫に際してアジュバントを用いてもよく，そのようなアジュバントは当該技術分野においてよく知られている。ポリクローナル抗体は，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し， E L I SAアツセィ，ウェスタンブロット分析，またはラジオィムノアッセィ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて，所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。

モノクローナル抗体は，免疫した動物から脾臓細胞を切除し，ミエローマ細胞と融合させ，モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞を作成することにより得ることができる。 E L I S Aアツセィ，ウェスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセィ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて，本発明の蛋白質またはそのフラグメントを認、識する抗体を産生するハイプリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイプリドーマをクローユングし，適切な条件下で培養し，分泌された抗体を回収し，当該技術分野にぉレ、てよく知られる方法，例えばイオン交換カラム，ァフィ二ティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。

上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。標識としては，放射性同位体，ァフィ二ティー標識（例えばピオチン，アビジン等），酵素標識（例えば西洋ヮサビペルォキシダーゼ，アルカリホスファタ一ゼ等），蛍光標識（例えば F I T Cまたはローダミン等），常磁 1~生原子等が挙げられる。そのような標識を行う方法は当該技術分野においてよく知られている。上述の抗体は，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例には，プラスチック，ァガロース，セファロース，ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズ等が含まれる。抗体をそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。

試料中で ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質の存在を検出するためのキットは，上述の抗体に加えて，洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬，例えば，標識第 2抗体，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，または抗体結合試薬，ならびに使用の指針を含むことができる。

後述の実施例において記載されるように，本発明の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13は，特定のヒト組織または細胞において高い発現量を示すため，本発明の抗体は，癌診断マーカーとして，および造血細胞の分化のマーカ一として用いることができる。さらに，薬剤または遺伝子を造血幹細胞に特異的にターゲティングするための標識として用いて，小児白血病の治療，癌ミサイル療法等に用いることができる。大腸癌マーカー

本発明の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13は，ヒト各種組織において特徵的な発現パターンを有する。 ABCC13ノくリアント Aおよび Cの遺伝子配列（図 1および 3 ) を元に PCRプライマーを設計し，ヒトの各組織の cDNA を用いて，定量 PCRによりヒト各種組織における ABCC13遺伝子の発現量の定量化を行った（図 7 , 8 ) 。 ABCC13 遺伝子は胎児肝臓，胎児肺，胎児脾臓, 胎児心臓および成人大腸に強い発現が検出されたが，他の成人組織においては低い発現しか見られなかった。

すなわち，本発明は， ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13またはこれと相補的な D N Aの部分配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする，大腸癌の診断方法を提供する。該方法は，患者から採取した大腸組織試料から R NAを抽出し，該 R NAを本発明のオリゴヌクレオチドと接触させてハイブリダィゼーシヨンが生ずる力否かを判定することにより，該試料中の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13 の発現量を判定する工程を含む。あるいは, 大腸組織試料標本を用いて，本発明のォリゴヌクレオチドとインシトウ一ハイブリダィゼーシヨンさせることにより， ABCC13 遺伝子の発現を判定してもよレ、。本発明のオリゴヌクレオチドを含む，このような診断方法に用いるためのキットもまた本発明の範囲内である。

本発明はまた，本発明の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質に対する抗体を用いることを特徴とする，大腸癌の診断方法を提供する。該方法は，患者から採取した大腸組織試料と本発明の抗体とを接触させて，該試料に抗体が結合する力否かを判定することにより，該試料中の

ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC 13によりコードされる蛋白質の存在または量を判定する工程を含む。本発明の抗体を含む，このような診断方法に用いるためのキットもまた本発明の範囲内である。造血細胞の分化マーカー

ABC トランスポーター遺伝子のいくつかが，幹細胞の表現型のマーカーとして使用しうることが示唆されている (Zhou, et al.， Nature Medicine 7, 1028- 1034 (2001)； Bunting, Stem Cells 20, 11-20 (2002)) 。本発明の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13は，胎児肝臓において強い発現が認められ，成人の各種白血球では，特に骨髄細胞において強い発現が検出されるが，末梢白血球および成熟した各白血球画分には低いかあるレ、は全く発現が検出されない（図 7 , 9 ) 。このことは， ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13が造血細胞，特に未分化の造血細胞において大量に発現され，分化した造血細胞ではほとんど発現されていないことを示す。したがって，本発明の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13およびこれによりコ一ドされる蛋白質は，造血細胞の分化マー力一として有用である。

すなわち，本発明は，造血幹細胞を分化の程度にしたがってタイピングする方法を提供する。該方法は，造血細胞試料から R N Aを抽出し，該 R NAを本発明のオリゴヌクレオチドと接触させてハイブリダィズが生ずる力否かを判定することにより，該試料中の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13の発現量を判定する工程を含む。あるいは，造血細胞試料標本を用いて，本発明のオリゴヌクレオチドとインシトウーハイブリダィゼーシヨンさせることにより， ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13の発現を判定してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドを含む，このようなタイピング方法に用いるためのキットもまた本発明の範囲内である。

本発明はまた，本発明の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質に対する抗体を用いることを特徴とする，造血幹細胞を分化の程度にしたがってタイピングする方法を提供する。該方法は，造血細胞試料と本発明の抗体とを接触させて，該試料に抗体が結合するか否かを判定することにより，該試料中の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質の存在または量を判定する工程を含む。本発明の抗体を含む，このようなタイビング方法に用いるためのキットもまた本発明の範囲内である。

本発明にしたがえば，骨髄または臍帯血から採取した造血細胞集団から未分ィヒの骨髄細胞を容易に選択することができる。このような未分化骨髄細胞は，骨髄移植治療，各種造血細胞のインビトロ増殖等に有用である。造血幹細胞へのターゲティング

さらに，本発明の ABC トランスポ一ター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質に対する抗体は，未分化骨髄細胞に特異性を有するため，薬剤や遺伝子を薬剤を造血幹細胞にターゲティングさせるために用いることができる。造血幹細胞は体細胞と比較して化学療法剤に対する感受性が高レ、ため，化学療法を受けることにより造血幹細胞の数が減少し，脱毛などの副作用が生じたり，感染症にかかりやすくなる。したがって，化学療法剤による癌治療を行う際には, 造血幹細胞の損傷を防止するためにあらかじめ骨髄細胞を採取して保存しておき, 治療後に患者にこれを戻すことが行われている。本発明にしたがえば， ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13 によりコ一ドされる蛋白質に対する抗体に, 化学療法剤に対する耐性を付与する遺伝子，例えば MD R 1遺伝子を結合させて化学療法前に患者に投与することにより，そのような耐性遺伝子を造血幹細胞にターゲテイングすることができる。このことにより，患者の骨髄内で化学療法剤に対する耐性を獲得した造血幹細胞を生じさせることができる。例えば，ヒト癌細胞に多剤耐性を与えることに関与する MD R 1遺伝子を用いて，化学療法剤が骨髄に及ぼす毒性を減少させうることが示されている（Mickisch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 547-551 (1991)； Hanania, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 15346-15351 (1996)) 。さらに， ABC トランスポ一ター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質に対する抗体に，遺伝子疾患に関与する種々の遺伝子を結合させて患者に投与することにより，そのような疾患の遺伝子治療を行うことができる。

逆に，本発明の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質に対する抗体に化学療法剤を結合させて，化学療法剤を造血幹細胞に特異的にターゲティングすることもできる。本発明にしたがえば，骨髄移植の前処置として，全身に大量の化学療法剤を使用したり放射線照射をすることなく，患者の造血幹細胞を選択的に減少させることができる。この場合，分化した白血球はほとんど減少しないため，患者が感染症にかかるリスクを大きく低下させることができる。すなわち，本発明の抗体およびこの抗体に結合した化学療法剤を含む医薬組成物もまた本発明の範囲内である。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2 0 0 2 - 9 2 0 6 5号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によつて限定されることはない。実施例 1 ABCC13遺伝子のクローニング

NCBIデータベース検索により，ヒト 21番染色体（21qll.2) 上に新規 ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13を含む領域が見レ、だされた (GenBank受託番号 AF130358)。この領域を Exon解析プログラム GENSCANを用いて解析して，ェクソンであると予想される領域の cDNA配列を得た。この配列に基づいて PCRプライマ一を設計し， Origene (登録商標） Rapid-Screen cDNA Library Panelを用いて， PCR法を応用した cDNAクロ一ニングを行つた。クローニングに用いた PCR試薬は Ex Taq (登録商標）ポリメラーゼ (TaKaRa)を使用した。 PCRの条件は， 95°C， 30sec→56°C, 30sec— 72°C, 2minを 30サイクル行った後， 72°C, 2minで伸張反応を完了させ反応を停止した。使用した PCR プライマーの配列は，

フォヮ一ドプライマ一： 5'-CATATTCCTGGTTTAGCAGA-3'

ノくッタワードプライマ一： 5' GTGAGCATGTTAAAACGTTG-3'

を用いた。各プライマーの最終濃度は， 200nMに調整した。この結果，ヒト胎盤 cDNAライブラリより 3種類の ABCC13 バリアント A, Bおよび Cが得られた（図 1一 3 , 配列番号 1一 3 ) 。

これらの cDNA配列によりコードされる蛋白質の推定アミノ酸配列を，それぞれ図 4— 6 (配列番号 4— 6 ) に示す。アミノ酸の疎水性プロファイルの分析から，ドメイン構造を予測した。図 4一 6において TMと記載される配列は，貫膜ドメインであると予測される領域である。これらのドメイン構造および部分配列は，既知の ABC トランスポーター A B C C 1 (GenBank受託番号 L 0 5 6

2 8 ) と高い相同性を有していた。実施例 2 ヒト各種組織における ABCC13遺伝子の発現

得られた ABCC13 バリアント Aおよび Cの D NA配列を元に PCRプライマ一を設計し，定量 PCR装置を用いてヒト各種組織における ABCC13遺伝子の発現量の定量化を行った。

クロンテック社より購入したヒト各臓器の cDNAを用いて，定量的 PCRを行つた。装置は Smart Cycler (TaKaRa)を用レ、，試薬は Ex Taq (登録商標） R- PCR Version (TaKaRa)を使用した。 PCRの条件は， 95°C, 30sec→58°C, 30sec →72°C, 30secを 40サイクル行つた後， 72°C, 2minで伸張反応を完了させ反応を停止した。使用した PCRプライマーの配列は，

フォヮ一ドプライマ一： 5' CATATTCCTGGTTTAGCAGA-3'

バックヮードプライマ一： 5'-GTGAGCATGTTAAAACGTTG-3'

を用いた。各プライマーの最終濃度は， 200nMに調整した。

主要なヒ卜成人および胎児組織における ABCC13遺伝子の発現量を図 7に示す。 ABCC13は胎児肝臓，胎児肺，胎児脾臓，胎児心臓および成人大腸に強い発現が検出されたが，他の成人組織においては低い発現しか見られなかった。次に，成人消化管を中心に ABCC13遺伝子の発現を調べた結果， '上行結腸および横行結腸において，特に強い発現がみられた（図 8 ) 。

さらに，成人白血球を中心に ABCC13遺伝子の発現を調べた結果，特に骨髄細胞において強!/、発現が検出され，末梢白血球および成熟した各白血球画分には低いかあるいは全く発現が検出されなかった（図 9 ) 。実施例 3 ヒト白血球培養細胞における ABCC13遺伝子の発現

ヒト白血球培養細胞 H L— 6 0 , およびより未分化のヒト白血球培養細胞 K 5 6 2における ABCC13遺伝子の発現を調べた。培養細胞からの R N Aを抽出 · 精製し，逆転写により第 1鎖 cDNAを合成した後，実施例 2と同様の定量的 PCR法を用いた。

R NAの精製は， R NA抽出用試薬である ISOGEN (株式会社ニッボンジーン）を用い，説明書に従った。簡単に説明すると， 1X10⁶個の細胞を回収し， ISOGEN 1 ml中でホモジェナイズし，クロ口ホルムで抽出し，水層を別なチュ —ブに移した。等量のイソプロパノールと混合後， 15,000rpm， 4 °C, 1 5分間遠心し， RNAの沈殿を得て，上清を取り除いたあと， 7 0 %エタノールを 150 i l加え， 15,000rpm, 4 °C， 5分間遠心し，上清を除去した。次にこれを風乾し， DEPC処理水に溶解し，吸光度計で定量した。

第 1鎖 cDNA合成は，逆転写キットである Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen社製， CatNo:11904-018)を用い，説明書にしたがって行った。簡単に説明すると，上記の定量の結果から， 5 y gのトータル RNAを用い，オリゴ (dT)プライマーをもとに， SuperScriptll (登録商標）逆転写酵素を用いて第 1鎖 cDNA合成を行つた。

この c D NAを用いて，実施例 2と同様に定量的 PCR法により ABCC13遺伝子の発現量を調べた。結果を図 1 0に示す。 ABCC13遺伝子は，より未分化のヒト白血球培養細胞 K 5 6 2において発現が認められたが， H L— 6 0細胞では発現が検出されなかつた。産業上の利用性

本発明の新規な A B C トランスポーター関連遺伝子 A B C C 1 3およびこれによりコードされる蛋白質、ならびにこの蛋白質に対する抗体は、大腸癌のマーカ一として、造血細胞の分化マ一カーとして、および造血幹細胞へのターゲティングに用いるのに有用である。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 1， 2または 3に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列を有する DNA。

2. 請求項 1記載の DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし， ABC トランスポーター蛋白質をコードする DNA。

3. 配列番号 4, 5または 6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはそのフラグメント。

4. . 請求項 3に記載の蛋白質をコードする DNA。

5. 配列番号 1， 2または 3に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 50塩基を有するオリゴヌクレオチド。

6. 配列番号 1， 2または 3に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 1 2— 100塩基を有するオリゴヌクレオチド。

7. 請求項 3に記載の蛋白質またはそのフラグメントを認識する抗体。

8. 大腸癌を診断する方法であって，患者の大腸組織に由来する試料と請求項 6記載のォリゴヌクレオチドとを接触させ，前記試料と前記ォリゴヌクレオチドとの間にハイブリダイゼ一ションが生ずるか否かを判定することにより，試料中の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13をコードする RN Aの存在または量を検出することを含む方法。

9. 請求項 6記載のオリゴヌクレオチドを含む，大腸癌診断用キット

1 0 . 大腸癌を診断する方法であって，患者の大腸組織に由来する試料と請求項 7記載の抗体とを接触させ，前記試料に抗体が結合するか否かを判定することにより，前記試料中の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質の存在または量を判定することを含む方法。

1 1 . 請求項 7記載の抗体を含む，大腸癌診断用キット。

1 2 . 造血幹細胞を分化の程度にしたがってタイピングする方法であって，造血細胞に由来する試料と請求項 6記載のォリゴヌクレオチドとを接触させ，前記試料と前記オリゴヌクレオチドとの間にハイブリダィゼーシヨンが生ずる力否かを判定することにより，試料中の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13 をコードする R N Aの存在または量を検出することを含む方法。

1 3 . 請求項 6記載のォリゴヌクレオチドを含む，造血幹細胞タイピング用キッ卜。

1 4 . 造血幹細胞を分化の程度にしたがってタイピングする方法であって，造血細胞に由来する試料と請求項 7記載の抗体とを接触させ，前記試料に抗体が結合するか否かを判定することにより，前記試料中の ABC トランスポーター関連遺伝子 ABCC13によりコードされる蛋白質の存在または量を判定することを含む方法。

1 5 . 請求項 7記載の抗体を含む，造血幹細胞タイピング用キット。

1 6 . 薬剤および請求項 7記載の抗体を含む，前記薬剤を造血幹細胞にターゲティングするための,組成物。

1 7 . 請求項 7記載の抗体および前記抗体に結合した化学療法剤を含む，骨髄移植前処置用医薬組成物。