WO2003080102A1 - Metodo para la estimulacion del crecimiento y resistencia a enfermedades en orgamismos acuaticos - Google Patents

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WO2003080102A1
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Rebeca Martinez Rodriguez
Amilcar Arenal Cruz
Rafael Marcos Pimentel Perez
Antonio Morales Rojas
Eulogio Pimentel Vazquez
Alexander Espinosa Vazquez
Carmen Aday Garcia Molina
Edenaida Cabrera Gonzalez
Mirta Vinjoy Campa
Sergio Toledo Perez
Olimpia Carrillo Farnes
Claudina ZALDIVAR MUÑOZ
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Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia.
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    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Definitions

  • the invention is related to the application of chemical synthesis to increase the efficiency of the growth of fish and crustaceans of commercial value.
  • the synthesis of analog peptides of the Leu-enkephalin and Met-enkephalin type has been reported and its ability to stimulate the release of growth hormone in mammals and birds has been demonstrated (Bowers C, Momany, G, Reynolds G and A. Hong 1984. Endocrinology 114: 1537-45).
  • Aquaculture 173, 10 making it one of the most important applications In penetrated shrimp it could be genetic engineering focused on improving growth and increasing its resistance to pathogens (Bachere, E., Mialhe, E., Noel, D., Boulo, V., Morvan, A., Rodr ⁇ guez , J. (1995) Aquaculture ⁇ 32, 17-32).
  • the GHRP-6 peptide is capable of stimulating growth alone, improving larval quality, increasing defenses against pathogens, increasing dry weight, protein concentration and RNA in fish muscle. , crustaceans and mollusks.
  • the use of the GHRP-6 peptide for growth stimulation and resistance to pathogens and other diseases is presented for the first time. It is also demonstrated that the GHRP-6 secretagogue alone stimulates growth in fish and crustaceans by injection, orally or by immersion. It also demonstrates its effect on the defense against pathogens, the increase of dry weight in the muscle of the treated aquatic organisms, the increase in the concentration of proteins and RNA in the tissue and the maintenance of erythrocytes as a demonstration of their safety in tilapia
  • FIG. 5 Growth experiment in Litopenaeus schmitti shrimp treated with the GHRP-6 peptide.
  • A Profile of weight gain in milligrams of shrimp in the three groups treated with the peptide and the control group.
  • B Profile of increase in millimeter length of shrimp in the three groups treated with the peptide and the control group.
  • C Distribution of the absolute frequency of the branchial branches of three groups treated with the peptide and the control group.
  • D Distribution of the absolute frequency of the rostral modifications of three groups treated with the peptide and the control group.
  • I, II, 111 Groups treated with different concentrations of peptide. Grpo control treated with BSA.
  • FIG. 7 Relationships between RNA, Protein and DNA. As can be seen in the figure, there are significant differences in what the hypertrophy of these parameters says in animals treated with peptide. *** t-test p ⁇ 0.001. The bars indicate the variation in weight ( ⁇ DS).
  • hypothalamus-pituitary-white organ liver
  • the GHRP-6 secretagogue was tested in shrimp Litopenaeus schmitti, demonstrating that it was able to stimulate shrimp growth from its application of 4 immersion baths, in different larval stages.
  • the groups treated with doses similar to tilapia had a higher quality. This was evidenced by an increase in weight, increase in height, a greater number of pairs of branchial branches and rostral modifications, a lower water content in the muscle of animals and a higher concentration of protein RNA in the muscle which evidenced a increased metabolic activity
  • the larvae treated with the peptide and the control were planted in land ponds to see their productive behavior. On the day of the harvest of the ponds, the animals treated with the peptide maintained the increase in weight, height and greater homogeneity in weight and height in this group when compared with the control.
  • the GHRP-6 secretagogue was tested in shrimp Litopenaeus schmitti, demonstrating that it is capable of stimulating shrimp growth by intramuscular injection, in adult shrimp. At the end of the 15 days of the experiment, the injected peptide stimulated the growth of individuals between 100-150% compared to the control. With significant differences (p ⁇ 0.001).
  • the GHRP-6 secretagogue was tested in shrimp Litopenaeus schmitti, demonstrating that it is capable of stimulating growth in shrimp orally, in shrimp larvae.
  • the peptide GHRP-6 included in the diet increased shrimp growth by 30-40% compared to the control. With highly significant differences (p ⁇ 0.001).
  • the bioencapsulated GHRP-6 secretagogue in saline anemia increased the growth of individuals between 30 and 40% compared to the control. With highly significant differences (p ⁇ 0.001). EXAMPLES OF REALIZATION
  • Example 1 Demonstration of the biological activity of GHRP-6 in fish.
  • tilapia average weight 71 ⁇ 28g were used for the experiment.
  • the GHRP-6 peptide was injected at a concentration of 0.1 ⁇ g / gbw (micrograms of peptide per gram of animal weight).
  • Liver and blood samples were collected before treatment and 15, 30, 60 and 360 minutes after peptide injection (three animals were used at each time). Serum and blood were frozen and stored at -70 ° C until they were used for the ELISA for the quantification of circulating GH or for the extraction of messenger RNA in the case of the liver for quantification by Southern blot of the levels of IGF-I.
  • Total liver RNA from the tilapia used in the experiment was purified according to the protocol described by Chomczvnski and Sacchi. 20 ⁇ g of total RNA were applied and run on a 1% agarose-formaldehyde gel, finally transferred to a Nylon membrane (Hybond N, Amersham UK) and hybridized with a labeled probe corresponding to the complementary DNA of IGF-I tilapia ⁇ 6 ⁇ and then re-hybridized with a probe of the human glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase gene (GADPH, kindly donated by Dr. Bryan Williams, Cleveland Foundation, OH, USA), for signal normalization.
  • the hybridization signals were quantified from the digital processing of the radiography image, using the "Hewlett Packard Scanjet Plus scanner". The images were processed with the computer program "Bandleader".
  • the serum GH levels of the injected tilapia were measured by an ELISA, using two monoclonal antibodies against tiGH (Mu ⁇ oz and cois, in preparation).
  • Example 2 Growth experiment in juvenile tilapia treated with GHRP-6
  • the GHRP-6 peptide (BACHEM, Switzerland) was diluted in sodium phosphate buffer solution
  • PBS PBS
  • peptide was applied to a group of 8 male tilapia with an average weight of 61.41 ⁇ 14.36 g and a control group of 7 male tilapia with an average weight of 61.58 ⁇ 29.67g was used and received PBS.
  • the average weight was measured each week ( Figure 1). All animals in the experiment were marked with microchips (Stoelting Co. Wood Dale, EU).
  • Peptide GHRP-6 (BACHEM, Switzerland) was diluted in PBS and administered orally through a plastic tube to the pharyngeal cavity to a group of 7 male tilapia that had an average weight of 84.66 ⁇ 12.2 g
  • a control group of 7 male tilapia with an average weight of 86.38 ⁇ 6.26g was taken, which was given PBS under the same conditions as the group treated with the peptide.
  • the treatment was carried out twice a week, for three weeks, administering a dose of 0.1 ⁇ g of peptide / g of wet weight of each fish (gbw) The average weight was measured every week ( Figure 2). All animals in the experiment were labeled with microchips (Stoelting Co. Wood Dale, E.U.).
  • Table 5 Values of moisture percentage in muscle tissue. Immersion experiment with the GHRP-6 peptide in tilapia weighing 1g over a period of 45 days.
  • Table 6 Values of protein concentration in muscle tissue. Immersion experiment with the GHRP-6 peptide in tilapia weighing 1g over a period of 45 days
  • GHRP-6 peptide 50 microL injections of the GHRP-6 peptide were made between the first and second abdominal segments using an insulin syringe. The injections are performed once every 3 days using 1 microg / g of the weight of the GHRP-6 peptide. The control group was injected with 1 microg / g BSA weight. 15 animals were used for each group. The effect of the GHRP-6 peptide was estimated by measuring the length of the carapace with a king's foot and weighed at a weight of 0.1 g error.
  • the animals were placed in nylon bags (0.8 cm of mesh light) with dimensions of 2 x 2 x 1 (length x width x height) in an earthen pond with a salinity of 30 gL-1, 25 C and natural photoperiod .
  • the effect of the GHRP-6 peptide was estimated by measuring the length of the king's foot carapace and weighed at a weight of 0.1 g error.
  • the GHRP-6 injected at the different concentrations increased the growth of individuals between 100 - 150% compared to the control. With significant differences (p ⁇ 0.001).
  • the GHRP-6 peptide was included in a diet for postiarvas of 1% crustaceans.
  • the GHRP-6 peptide included in the diet was microencapsulated by a complex coacervation method (Knorr D. and M. Daly. (1988). Process Biochemistry; 48-50). Subsequently, Litopenaeus schmitti postiarvas were fed with the aforementioned diet, as well as a control with BSA included in the feed.
  • the effect of tiGH was estimated by measuring the length of the carapace of the larvae and post-larvae with an optical micrometer and weighed at a weight of 0.1 mg of error.
  • the GHRP-6 peptide included in the diet increased shrimp growth by 30-40% compared to the control. With highly significant differences (p ⁇ 0.001).
  • the GHRP-6 peptide was bioencapsulated in Artemia with which the post-larvae of Litopenaeus schmitti and Litopenaeus vanamei were fed.
  • Artemia saline To bioencapsulate the GHRP-6 peptide in Artemia saline, it was added at a concentration of 10 mg / L for 1 hour and harvested and washed. Subsequently, the post-larvae of Litopenaeus schmitti were fed with this Artemia four times a day for a month of experimentation.
  • the control group was fed with Saline Arthremia with bioencapsulated BSA.
  • the effect of the GHRP-6 peptide was estimated by measuring the length of the carapace of the larvae and post-larvae with an optical micrometer and weighed at a weight of 0.01 mg of error.
  • the bioencapsulated GHRP-6 peptide in Artemia salina increased the growth of individuals between 30 and 40% compared to the control. With highly significant differences (p ⁇ 0.001).
  • Example 7. Growth experiment on salmon larvae (salmon salmon) by immersion baths with the peptide GHRP-6 Three groups of salmon larvae (salmon salmon) were taken and six immersion baths were applied, one every three days of one hour long with different concentrations of the GHRP-6 peptide at two of them and one group was taken as control. The concentrations of the peptide used were: 0.01 and 0.1 mg / L, in groups I and II respectively, the control group was given the same frequency of immersion baths with BSA at 1 mg / L.
  • Example 8 Effectiveness of peptide GHRP-6 on the ectoparasite "sea lice” Caliaus sp. in trout (Oncorhvnchus mvkiss).

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Abstract

La invención esta relacionada con la síntesis química con vistas a aumentar la tasa de crecimiento de peces y crustáceos comercializables. El objetivo de la invención es el suministro de GHRP-6 para provocar directa o indirectamente la liberación de hormona de crecimiento o similar y producir el aumento del nivel de hormona de crecimiento que circula en la sangre de los peces. El péptido es estable, soluble y biológicamente activo. El péptido es capaz de estimular el crecimiento, de mejorar la calidad de las larvas y de aumentar las defensas contra agentes patógenos, el peso seco, la concentración de proteínas y el ARN en el músculo de peces y crustáceos.

Description

Método para la estimulación del crecimiento y resistencia a enfermedades en organismos acuáticos.
Sector Técnico La invención está relacionada con la aplicación de la síntesis química para incrementar la eficiencia del crecimiento de peces y crustáceos de valor comercial. La síntesis de péptidos análogos del tipo Leu-encefalina y Met-encefalina ha sido reportada y se ha demostrado su capacidad de estimular la liberación de la hormona de crecimiento en mamíferos y aves (Bowers C, Momany, G, Reynolds G and A. Hong. 1984. Endocrinology . 114: 1537-45).
Arte Previo
Estudios para entender la relación estructura-actividad de péptidos liberadores de la hormona de crecimiento han sido desarrollados en mamíferos y aves, identificándose que el hexámero GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2), es extremadamente potente y seguro para provocar la liberación de la hormona de crecimiento, incluso en el hombre (Bowers C, Momany, G, Reynolds G and A. Hong. 1984. Endocrinology . 114: 1537-45), sin embargo no existen reportes previos del uso de este compuesto en organismos acuáticos.
Teniendo en cuenta que no existen evidencias en crustáceos, hasta el presente, de que exista una cascada de señales que intervienen en la estimulación del crecimiento (hipotálamo-hipófisis-órgano blanco), se muestra por primera vez, que el péptido GHRP- 6, por si solo es capaz de ejercer una función biológica similar en crustáceos.
La acuicultura es dominada por la producción de peces de agua dulce; sin embargo desde la pasada década se ha incrementado el aporte de algas marinas, moluscos y crustáceos a la producción global de la acuicultura. Una mejor comprensión de la genética, reproducción, nutrición y fisiología del organismo seleccionado es el primer paso para contribuir en su desarrollo productivo (Gómez-Chiarri M, Smith GJ, de la Fuente J and Powers DA. 1998. In de la Fuente J and Castro FO, editors. Gene transfer in aquatic organisms. Austin, Texas: RG Landes Company and Germany: Springer Verlag; p.107-125).
El conocimiento de las características moleculares de las hormonas con influencia en el crecimiento de especies marinas de importancia económica puede ser utilizado para alcanzar un mejor comportamiento productivo de estas especies en cultivo. Como ejemplo de lo anteriormente expresado se puede mencionar el uso de la hormona liberadora de la gonadotropina (GnRH) y un antagonista del receptor de la dopamina utilizado por Silverstein y colaboradores en 1999 (Silverstein JT., Bosworth BG. and Wolters WR. 1999. Journal of the World Aquaculture Society. Vol. 30, No.2, June, 263 - 268), para regular e inducir la reproducción en pez gato (Ictalarus punctatus), especie de gran importancia económica en la acuicultura mundial.
Otro resultado interesante de la utilización de péptidos sintéticos para el aumento de la productividad en animales de granja, fue lo reportado por Hashizune y colaboradores en 1997 (Hashizume T., Sasaki M., Tauchi S. and Masuda H. 1997. Animal Science and Technology. Vol. 68, No.3, March, 247-256) cuando demostraron la inducción de la hormona de crecimiento en cabras por la aplicación de inyecciones con un nuevo péptido sintético liberador de la hormona de crecimiento.
El suministro de hormonas como la insulina ha sido ensayada también en peces de forma oral demostrándose que produce cambios en señales de receptores y hormonas que intervienen en la adaptación de las carpas a diferentes temperatura (Vera MI., Romero F., Figueroa J., Amthauer R., León G., Villanueva. and Krauskopf M. 1993. Comp. Biochem. Physiol. Vol.106A, No.4, 677-682)
En mamíferos también se han estudiado otras variantes sintéticas de péptido liberador de hormona de crecimiento, como el reportado en 1995 por Patchett y colaboradores con el péptido MK-0677, designado como potente activador oral de la hormona de crecimiento en perros, sin provocar efectos en los niveles de tirosina y prolactina después de su aplicación (Patchett AA., Nargund RP., Tata JR., Chen MH., Barakat KJ., Johnston DBR., Cheng K., Chan WWS., Butler B., Hickey G., Jacks T., Schleim K., Pong SS., Chaung LYP., Chen HY., Frazier E., Leung KH., Chiu SHL. and Smith RG. 1995. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. Vol.92, 7001-7005)
También se han ensayado hormonas liberadoras de la hormona de crecimiento en vacas con fines de incremento de la producción de leche, ya que el aumento de los niveles circulantes de GH, estimula entre otras cosas la producción de leche (Solimán EB., Hashizume T., Ohashi S. and Kanematsu S. 1997. Domestic animal endocrinology. Vol.14(1), 39-46)
En peces no existen reportes anteriores de la utilización del péptido GHRP-6, por lo que su utilización para estimular crecimiento, aumentar sobrevida, aumentar la resistencia a agentes patógenos que se reportan en este documento constituyen una gran solución para la potenciación y aumento de la productividad del cultivo de organismos acuáticos. Aunque se han dado pasos de avance en la domesticación y cruzamiento genético de algunas especies de camarones como son Penaeus japonicus y Litopenaeus vannamei, no ha existido un progreso suficiente, por la falta de comprensión de los procesos genéticos y bioquímicos de estas especies (Benzie, J.A.H., 1998. Penaeid genetjcs and biotechnology. Aquaculture 164, 23-47; Fjalestadl, K.T., Carr, W.H., Lotz, J.L., Sweeney, J.N., 1999. Aquaculture 173, 10), por lo que una de las aplicaciones con mayor importancia en los camarones peneidos podría ser la ingeniería genética enfocada al mejoramiento del crecimiento y al aumento de su resistencia a agentes patógenos (Bachere, E., Mialhe, E., Noel, D., Boulo, V., Morvan, A., Rodríguez, J. (1995) AquacultureΛ 32, 17-32).
Se concierne en esta invención que el péptido GHRP-6 es capaz por si solo de estimular el crecimiento, mejorar la calidad de las larvas, aumentar las defensas contra agentes patógenos, aumentar el peso seco, concentración de proteínas y ARN en el músculo de peces, crustáceos y moluscos . Ventajas de la solución propuesta
En la presente invención se presenta por primera vez la utilización del péptido GHRP-6 para la estimulación del crecimiento y la resistencia a agentes patógenos y otras enfermedades. Se demuestra además que el secretagogo GHRP-6 por si solo estimula el crecimiento en peces y crustáceos mediante la inyección, por la vía oral o por inmersión. Se demuestra además su efecto en la defensa contra agentes patógenos, el incremento del peso seco en el músculo de los organismos acuáticos tratados, el aumento de la concentración de proteínas y ARN en el tejido y el mantenimiento de los eritrocitos como demostración de su inocuidad en tilapia.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Niveles de GH en suero y de ARN mensajero de IGF-l enhígado de tilapias juveniles inyectadas con el secretagogo GHRP-6. Cada grupo de tres animales fue inyectado intraperitonealmente. Muestras de suero y hígado fueron tomadas a los 15, 30, 60 y 360 minutos después de la inyección. Muestras de suero fueron tomadas de cada animal antes de la inyección. * diferencia significativa sobre el grupo control (p < 0.001 ANOVA, Duncan test). tiGH: Hormona de crecimiento de tilapia. Las barras indican el error estándar.
Figura 2. Crecimiento neto y específico de las tilapias tratadas con el péptido GHRP-6 por vía intraperitoneal y un grupo control durante tres semanas. * t-test p = 0.029. Las barras indican la variación en el peso ± el error estándar (ES) y los triángulos la velocidad específica de crecimiento de ambos grupos.
Figura 3. Crecimiento neto y específico de las tilapias tratadas con el péptido GHRP-6 por vía oral en solución acuosa y su grupo control. La duración del experimento fue de tres semanas. * t-test p = 0.015. Las barras indican la variación en el peso (±ES) y los triángulos la velocidad específica de crecimiento de ambos grupos (±ES) Figura 4. Crecimiento neto y específico de las tilapias tratadas con el péptido GHRP-6 encapsulado por vía oral y su grupo control. La duración del experimento fue de tres semanas. * t-test p = 0.05, ** t-test p=0.007. Las barras indican la variación en el peso (±ES) y los triángulos la velocidad específica de crecimiento de ambos grupos (±ES)
Figura 5. Experimento de crecimiento en camarones Litopenaeus schmitti tratados con el péptido GHRP-6. A: Perfil de aumento del peso en miligramos de los camarones en los tres grupos tratados con el péptido y el grupo control. B: Perfil de aumento del largo en milímetros de los camarones en los tres grupos tratados con el péptido y el grupo control. C: Distribución de la frecuencia absoluta de las ramificaciones branquiales de tres grupos tratados con el péptido y el grupo control. D: Distribución de la frecuencia absoluta de las modificaciones rostrales de tres grupos tratados con el péptido y el grupo control. I, II ,111: Grupos tratados con diferentes concentraciones de péptido. Control Grpo tratado con BSA.
*** p<0.001. Las barras indican la variación en el peso (±DS). ANOVA seguido por un DUNCAN en el caso de la talla y el peso. Kolmogorov-Smmimov en las ramificciones branquiales y modificaciones rostrales. Figura. 6 Perfil del peso seco en animales tratados con el péptido y controles. *** t-test p<0.001. Las barras indican la variación en el peso (±DS).
Figura. 7 Relaciones entre RNA, Proteína y DNA. Como se observa en la figura hay diferencias significativas lo que dice de la hipertrofia de estos parámetros en los animales tratados con péptido.*** t-test p<0.001. Las barras indican la variación en el peso (±DS). Figura 8. Crecimiento neto en condiciones de producción de camarones tratadas con baños de inmersión con el péptido GHRP-6 en su estadio larval y el grupo control con BSA. La duración del experimento fue de seis semanas. *** t-test p<0.001. Las barras indican la variación en el peso (±DS). Descripción detallada de la invención
Para demostrar la estimulación del crecimiento, en organismos acuáticos, más específicamente en peces, crustáceos y moluscos, empleando solamente el hexapéptido GHRP-6 "Growth hormone reléase peptide" de secuencia: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys- NH2, primeramente se demostró que en peces era capaz de efectuar una actividad biológica similar a la mostrada en mamíferos y aves (Bowers C, Momany, G, Reynolds G and A. Hong. 1984. Endocrinology . 114: 1537-45).
Para ello se suministraron inyecciones del péptido a tilapias juveniles y se obtuvieron muestras de suero e hígado de las mismas a diferentes tiempos, demostrándose como al igual que en mamíferos y aves, después de la inyección del péptido aumentan los niveles circulantes de la hormona de crecimiento en suero a los 15 minutos y media hora después se observó un aumento del ARN mensajero del IGF-I en hígado (Ejemplo 1).
Teniendo en cuenta que no existen evidencias hasta el presente, de que la cascada de las señales que intervienen en la estimulación del crecimiento, hipotálamo-hipófisis- órgano blanco (hígado), se conserve exactamente igual en los organismos acuáticos que en mamíferos y aves, se muestra por primera vez que el péptido GHRP-6 por si solo y administrado por diferentes vías es capaz de ejercer su actividad en peces.
Se realizaron experimentos de comparación del crecimiento en tilapias juveniles, administrándole a un grupo experimental el GHRP-6 y al grupo control se le administró solución salina en cada caso en dependencia de la vía de administración. Se utilizaron tres vías de administración: a) Inyección intraperitoneal; b) Oral; c) Inmersión.
En los tres casos se observó un incremento significativo del aumento del peso diario de las tilapias tratadas con el péptido GHRP-6 en comparación con su grupo control en cada caso. (Ejemplo 2) Otro experimento de gran valor para demostrar el efecto del péptido GHRP-6 en peces fue demostrar su aplicabilidad en tilapias de 1 mg de peso por vía de la inmersión y estudiar el efecto que este provocaba en la defensa contra los patógenos y en la calidad de su músculo (Ejemplo 3)
Los resultados muestran que el grupo de tilapias tratadas con el péptido incrementó significativamente su peso, mostró menor índice de intensidad y extensión de la invasión de agentes patógenos que el grupo control y presentó menor contenido de agua en su músculo así como mayor concentración de proteínas lo que sugiere que el aumento de peso provocado por el péptido induce un aumento de la síntesis proteica y no un aumento del contenido de agua en su músculo El secretagogo GHRP-6 también fue ensayado en camarones Litopenaeus scmitti, demostrándose que era capaz por si solo de estimular el crecimiento en crustáceos a partir de su aplicación por varias tres vías de administración: a) Inyección intramuscular; b) Oral; c) Inmersión (Ejemplo 4). El secretagogo GHRP-6 fue ensayado en camarones Litopenaeus schmitti, demostrándose que era capaz de estimular el crecimiento en camarones a partir de su aplicación de 4 baños de inmersión, en diferentes estadios larvales. Al terminar el ciclo de cultivo de las larvas en un centro de desove, los grupos tratados con dosis similares a tilapia presentaban una mayor calidad. Esto estaba evidenciado en un incremento en peso, incremento en la talla, un mayor número de pares de ramificaciones branquiales y modificaciones rostrales, un menor contenido de agua en el músculo de los animales y mayor concentración de ARN proteína en el músculo lo que evidenció una mayor actividad metabólica.
Las larvas tratadas con el péptido y el control fueron sembradas en estanques de tierra para ver su comportamiento productivo. El día de la cosecha de los estanques los animales tratados con el péptido mantuvieron el incremento del peso, de la talla y una mayor homogeneidad en el peso y la talla en este grupo al compararlos con el control.
(Ejemplo 5)
El secretagogo GHRP-6 fue ensayado en camarones Litopenaeus schmitti, demostrándose que es capaz de estimular el crecimiento en camarones mediante la inyección intramuscular, en camarones adulos. Al concluir los 15 días del experimento el péptido inyectado estimuló el crecimiento de los individuos entre un 100 - 150 % respecto al control. Con diferencias significativas (p<0.001).
(Ejemplo 6 y 6.1) El secretagogo GHRP-6 fue ensayado en camarones Litopenaeus schmitti, demostrándose que es capaz de estimular el crecimiento en camarones por vía oral, en larvas de camarón. El péptido GHRP-6 incluido en la dieta incrementó el crecimiento de los camarones entre un 30 - 40 % respecto al control. Con diferencias altamente significativas (p<0.001). El secretagogo GHRP-6 bioencapsulado en Anemia salina incrementó el crecimiento de los individuos entre un 30 y un 40 % respecto al control. Con diferencias altamente significativas (p<0.001). EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1. Demostración dé la actividad biológica del GHRP-6 en peces.
Se determinaron los niveles de ARN mensajero del IGF-I en hígado de tilapias inyectadas intraperitonealmente con GHRP-6, así como se monitoreó los niveles de GH en los mimos animales en el tiempo, demostrándose que el GHRP-6 era capaz en peces de estimular la presencia de la GH circulante en sangre y como respuesta a esta de incrementar los niveles del ARN mensajero del IGF-I después de media hora de la inyección del péptido (Figura 1).
Quince tilapias de peso promedio 71 ± 28g fueron utilizadas para el experimento. El péptido GHRP-6 fue inyectado a una concentración de 0.1 μg/gbw (microgramos de péptido por gramo de peso del animal). Las muestras de hígado y sangre se colectaron antes del tratamiento y 15, 30, 60 y 360 minutos después de la inyección del péptido (se utilizaron tres animales en cada tiempo). El suero y la sangre fueron congelados y guardados a -70°C hasta que se fueron utilizados para el ELISA para la cuantificación de la GH circulante o para la extracción del ARN mensajero en el caso del hígado para la cuantificación por Southern blotde los niveles de IGF-I.
El ARN total del hígado de las tilapias utilizadas en el experimento fue purificado según el protocolo descrito por Chomczvnski y Sacchi. 20 μg de ARN total fueron aplicados y corridos en un gel de agarosa - formaldehido del 1%, finalmente fueron transferidos a una membrana de Nylon (Hybond N, Amersham UK) y hibridadas con una sonda marcada correspondiente al ADN complementario del IGF-I de tilapia {6} y seguidamente re-hibridado con una sonda del gen humano de la gliceraldehido 3 fosfato dehidrogenesa (GADPH, gentilmente donado por el Dr. Bryan Williams, Cleveland Foundation, OH, USA), para la normalización de las señales. Las señales de la hibridación fueron cuantificadas a partir del procesamiento digital de la imagen de la radiografía, utilizando el "Hewlett Packard Scanjet Plus scanner". Las imágenes fueron procesadas con el programa de computación "Bandleader".
Los niveles de GH en el suero de las tilapias inyectadas fueron medidos por un ELISA, utilizando dos anticuerpos monoclonoles contra la tiGH (Muñoz y cois, en preparación). Ejemplo 2. Experimento de crecimiento en tilapias juveniles tratadas con GHRP-6
2.1 Aceleración del crecimiento en tilapias tratadas con GHRP-6 por vía intraperitoneal
(¡P)
El péptido GHRP-6 (BACHEM, Suiza) fue diluido en solución tampón de fosfato de sodio
(PBS) e inyectado dos veces a la semana durante tres semanas a 0.1 μg de péptido/ g de peso húmedo de cada pez (gbw). El péptido fue aplicado a un grupo de 8 tilapias machos con peso promedio de 61.41 ± 14.36 g y se utilizó un grupo control de 7 tilapias machos con peso promedio de 61.58 ± 29.67g el cual recibió PBS. Se midió el peso promedio cada semana (Figura 1). Todos los animales del experimento fueron marcados con microchips (Stoelting Co. Wood Dale, E.U.).
2.2 Aceleración del crecimiento en tilapias tratadas con GHRP-6 por vía oral
Para la administración por vía oral del péptido GHRP-6 se realizaron dos experimentos. El primero administrando el péptido en forma líquida disuelto en PBS y el segundo administrando el péptido en forma de pequeñas perlas encapsulado en alginato de calcio según el protocolo previamente publicado por Knorr y colaboradores en 1988. (Figuras 2 y 3 respectivamente) En ambos experimentos se utilizaron grupos controles a los cuales se le administró solución salina y en todos los casos se utilizaron tilapias entubadas hasta la cavidad faríngea.
2.2.1 Péptido en solución acuosa El péptido GHRP-6 (BACHEM, Suiza) fue diluido en PBS y administrado vía oral a través de un tubo plástico hasta la cavidad faríngea a un grupo de 7 tilapias machos que tenían un peso promedio de 84.66 ± 12.2 g. Se tomó un grupo control de 7 tilapias machos con peso promedio de 86.38 ± 6.26g, al cual se le suministró PBS en las mimas condiciones que al grupo tratado con el péptido. El tratamiento se realizó dos veces por semana, durante tres semanas, administrándole una dosis de 0.1 μg de péptido/g de peso húmedo de cada pez (gbw) Se midió el peso promedio cada semana (Figura 2). Todos los animales del experimento fueron marcados con microchips (Stoelting Co. Wood Dale, E.U.).
2.2.2 Péptido encapsulado Para la encapsulación del péptido se obtuvieron las cápsulas según lo reportado por Knorr y colaboradores en 1988. El hexapéptido encapsulado fue administrado a través de un tubo plástico a la cavidad faríngea a siete tilapias con un peso promedio de 89.09 ± 8.38g. Perlas de polímero sin el péptido GHRP-6 fueron suministrados por la misma vía al grupo control consistente en siete tilapias machos de peso promedio de 89.86 + 13.54g. El tratamiento se realizó dos veces por semana durante tres semanas administrando en cada ocasión 0.1 μg/gbw. Ejemplo 3. Estimulación del crecimiento en tilapias (Oreochromis sp) mediante el péptido GHRP-6 vía inmersión
Se realizó la evaluación del crecimiento en tilapia Oreochromis sp. de 1.5g utilizando el péptido GHRP-6 en dosis de 10 mg/100ml y de 100 mg/100ml, también se determinó el valor de hematocrito para tener una idea sobre el estado de la bioquímica sanguínea en los animales tratados con respecto a los controles.
En este mismo experimento se estudió la presencia de Trichodinicos y helmintos mongeneos en los animales utilizados en el ensayo, para observar y comparar la intensidad y la extensión de la invasión de estos agentes patógenos en los grupos tratados.
Por último se realizó un estudio de la concentración de proteína y del porciento de humedad en el músculo de las tilapias estudiadas.
Tres grupos con tres réplicas de 15 animales de un mismo desove, con un promedio de peso inicial de 1g fueron escogidos para el ensayo, para lo cual se utilizaron 9 tanques de 40L Todos los animales se trataron con el péptido vía inmersión una vez por semana durante 15 minutos por 45 días y el grupo control recibió la misma manipulación y la inmersión se les realizó en solución salina.
Los grupos y tratamientos se distribuyeron de la siguiente forma:
Grupo 1 10 μg/100ml (Tratamiento 1) Grupo 2 100 μg /1 OOml (Tratamiento 2)
Grupo 3 Control negativo (Solución salina)
Tabla 1. Estudio del peso. Experimento de inmersión con el péptido GHRP-6 en tilapias de 1g de peso en un período de 45 días.
Figure imgf000011_0001
*D¡ferencia significativa estadísticamente. Se le aplicó el test de rangos múltiples a las muestras Tabla 2. Estudio de los valores del Hematocrito. Experimento de inmersión con el péptido GHRP-6 en tilapias de 1g de peso en un período de 45 días.
Figure imgf000012_0001
*No hay diferencias significativas entre los grupos. Se le aplicó el test de rangos múltiples a las muestras
Tabla 3. Resultados de la intensidad de la invasión (I) y la extensión déla invasión (E) en los organismos tratados, para el protozoo cutáneo Trichodina sp._Experimento de inmersión con el péptido GHRP-6 en tilapias de 1g de peso en un período de 45 días.
Figure imgf000012_0002
al: Intensidad de la invasión bE: Extensión de la invasión
*Diferencia significativa estadísticamente. Se le aplicó el test de rangos múltiples a las muestras Tabla 4. Resultados de la intensidad de la invasión (1) y la extensión de la invasión (E) en los organismos tratados según los valores del conteo de Helmintos monogeneos encontrados en las branquias de cada pez. Experimento de inmersión con el péptido GHRP-6 en tilapias de 1g de peso en un período de 45 días.
Figure imgf000013_0001
*Diferencia significativa estadísticamente. Se le aplicó el test de rangos múltiples a las muestras
Tabla 5. Valores del porciento de humedad en el tejido muscular. Experimento de inmersión con el péptido GHRP-6 en tilapias de 1g de peso en un período de 45 días.
Figure imgf000013_0002
*Diferencia significativa estadísticamente. Se le aplicó el test de rangos múltiples a las muestras. DE: desviación estándar.
Tabla 6. Valores de la concentración de proteínas en el tejido muscular. Experimento de inmersión con el péptido GHRP-6 en tilapias de 1g de peso en un período de 45 días
Figure imgf000013_0003
*Diferencia significativa estadísticamente. Se le aplicó el test de rangos múltiples a las muestras. DE: desviación estándar. Ejemplo 4. Experimento de crecimiento en camarones Litopenaeus schmitti por baños de inmersión con el péptido GHRP-6.
Se tomaron cuatro grupos de larvas camarones se les aplicaron cuatro baños de inmersión, uno cada tres días de una hora de duración con diferentes concentraciones del péptido GHRP-6 a tres de ellos y un grupo se tomo como control. Las concentraciones del péptido utilizadas fueron: 0.001, 0.01 y 0.1 mg/L, en los grupos I, II y III respectivamente, al grupo control se le dio la misma frecuencia de baños de inmersión con BSA a 1 mg/L. Como resultado se observó que el grupo tratado con la mayor concentración de péptido 0.1 mg/L, se mejoraba la calidad de las larvas de los camarones Litopenaeus schmitti. Esto estaba evidenciado en un incremento en peso del 125-153 %, de un 15-26% de incremento en la talla, un mayor número de pares de ramificaciones branquiales y modificaciones rostrales para cada parámetro se realizó el test estadístico correspondiente encontrándose en todos los casos diferencias altamente significativas (Figura 5). Además se encontró que los animales tratados con GHRP-6 presentaban menor contenido de agua en el músculo y mayores valores de las relaciones RNA/DNA, Proteína/DNA, dando idea de lo activado del metabolismo del músculo de estas larvas (Figura 6 y 7). Estos resultados son de gran importancia ya que al acelerar el crecimiento del camarón en los estadios iniciales de su vida, provoca una mayor sobrevida en la fase del cultivo lo que es vital para aumentar la productividad de este crustáceo de tanto valor comercial en el mundo.
La ¡dea anterior fue corroborada en condiciones de producción en un aumento de la sobrevivencia del 20% en los animales tratados con GHRP-6 comparado con sus hermanos controles, además manteniéndose una estimulación del 115% en el peso y de un 37% en la talla, mostrando los animales tratados con el péptido mayor homogeneidad en la talla que sus hermanos no tratados reflejándose en que el coeficiente de variación de solo 24% y 9% en el peso y la talla respectivamente en animales tratados con el péptido a diferencia del 77% y 30% que se observa en el peso y la talla en los animales hermanos (Figura. 8).
Ejemplo 5 Estimulación del crecimiento en camarones mediante la Invección intramuscular en animales de 15 g
Las inyecciones de 50 microL del péptido GHRP-6 fueron hechas entre el primer y segundo segmento abdominal usando una jeringuilla de insulina. Las inyecciones se realizaron 1 vez cada 3 días usando 1 microg/g de peso del péptido GHRP-6. El grupo control fue inyectado con 1 microg/g de peso de BSA. Se usaron 15 animales por cada grupo. El efecto del péptido GHRP-6 fue estimado midiendo la longitud del carapacho con un pie de rey y pesadas en una pesa de 0.1 g de error. Los animales se ubicaron en bolsas de nylon (0.8 cm de luz de malla) con dimensiones de 2 x 2 x 1 (largo x ancho x altura) en un estanque de tierra con una salinidad de 30 g-L-1, 25 C y fotoperíodo natural. El efecto del péptido GHRP-6 fue estimado midiendo la longitud del carapacho de pie de rey y pesadas en una pesa de 0.1 g de error.
La GHRP-6 inyectada a las diferentes concentraciones incrementó el crecimiento de los individuos entre un 100 - 150 % respecto al control. Con diferencias significativas (p<0.001).
Ejemplo 6 Estimulación del crecimiento en camarones mediante la inclusión en la dieta
El péptido GHRP-6 fue incluido en una dieta para postiarvas de crustáceos al 1%. El péptido GHRP-6 incluido en la dieta fue microencapsulado por un método de coacervación compleja (Knorr D. and M.Daly. (1988). Process Biochemistry; 48-50). Posteriormente se alimentaron postiarvas de Litopenaeus schmitti con la dieta mencionada, así como un control con BSA incluido en el pienso. El efecto de tiGH fue estimado midiendo la longitud del carapacho de las larvas y postiarvas con un micrómetro óptico y pesadas en una pesa de 0.1 mg de error. El péptido GHRP-6 incluido en la dieta inσementó el crecimiento de los camarones entre un 30 - 40 % respecto al control. Con diferencias altamente significativas (p<0.001).
6.1. Encapsulación en artemia
El péptido GHRP-6 fue bioencapsulada en Artemia con las que fueron alimentadas las postiarvas de Litopenaeus schmitti y Litopenaeus vanamei. Para bioencapsular el péptido GHRP-6 en la Artemia salina, se le adicionó a una concentración de 10 mg/L durante 1 hora y se cosecharon y lavaron. Posteriormente se alimentaron las postiarvas de Litopenaeus schmitti con esta Artemia cuatro veces al día durante un mes de experimentación. El grupo control fue alimentado con Artremia salina con BSA bioencapsulada. El efecto del péptido GHRP-6 fue estimado midiendo la longitud del carapacho de las larvas y postiarvas con un micrometro óptico y pesadas en una pesa de 0.01 mg de error.
El péptido GHRP-6 bioencapsulado en Artemia salina incrementó el crecimiento de los individuos entre un 30 y un 40 % respecto al control. Con diferencias altamente significativas (p<0.001). Ejemplo 7. Experimento de crecimiento en larvas de salmones (salmón salar) por baños de inmersión con el péptido GHRP-6 Se tomaron tres grupos de larvas de salmones (salmón salar) y se les aplicaron seis baños de inmersión, uno cada tres días de una hora de duración con diferentes concentraciones del péptido GHRP-6 a dos de ellos y un grupo se tomo como control. Las concentraciones del péptido utilizadas fueron: 0.01 y 0.1 mg/L, en los grupos I y II respectivamente, al grupo control se le dio la misma frecuencia de baños de inmersión con BSA a 1 mg/L.
Como resultado se observó, que en el grupo tratado con la mayor concentración de péptido 0.1 mg/L, se incrementó en peso del 120-145 %, tomando como referencia 100% del grupo control y se observó un incremento de un 15-26% de incremento en la talla con respecto al grupo control. Por otra parte se encontró que los animales tratados con GHRP-6 presentaban menor contenido de agua en el músculo, incremento en los valores de las relaciones RNA/DNA, Proteína/DNA, dando idea de la activación del metabolismo en los músculo de estas larvas.
Estos resultados son de gran importancia ya que al acelerar el crecimiento de las larvas de salmones en los estadios larvales, provoca una mayor sobrevida en esta fase del cultivo lo que es vital para aumentar la productividad de esta especie tan importante en el comercio de peces en el mundo.
Ejemplo 8. Efectividad del péptido GHRP-6 sobre el ectoparásito "sea lice" Caliaus sp. en truchas (Oncorhvnchus mvkiss).
Truchas tratadas en sus estadios larvales mediante baños de inmersión dados cada tres días, en un total de 6 baños, con el péptido GHRP-6 a concentraciones de 0.01 mg/L, 0.1 mg/L y un grupo control, fueron puestos en jaulas de ceba en una región afectada por el ectoparásito Caligus sp. De cada jaula se muestrearon cinco veces 20 peces a intervalos de una semana. Ambos grupos tratados en sus estadios larvales con el péptigo GHRP-6 redujeron significativamente (p<0.05) la carga de chalimus y Caligus (dos tipos importantes de "sea lice") adultos en relación con el grupo control, no existiendo diferencia entre los grupos tratados.

Claims

REIVINDICACIONES
MÉTODO PARA LA ESTIMULACIÓN DEL CRECIMIENTO Y RESISTENCIA A ENFERMEDADES EN ORGANISMOS ACUÁTICOS.
5
1. Un método para estimular el crecimiento y resistencia a enfermedades en organismos acuáticos caracterizado porque se emplea el péptido GHRP-6 de secuencia: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2.
2. Un método para estimular el crecimiento y resistencia a enfermedades en 10 organismos acuáticos según la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido GHRP-6 es añadido en formulaciones de pienso para la alimentación de estas especies a una concentración entre 0.01 - 50 μg de péptido por gramo de peso húmedo del animal.
3. Un método para estimular el crecimiento y resistencia a enfermedades en organismos acuáticos según la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido GHRP-6
15 es suministrado en inyecciones periódicas con intervalos entre 1 y 7 días, a una concentración entre 0.05 - 10 μg de péptido por gramo de peso húmedo del animal.
4. Un método para estimular el crecimiento y resistencia a enfermedades en organismos acuáticos según la reivindicación 1, caracterizado porque se emplea el péptido en baños de inmersión a concentraciones entre 10 - 500 μg de péptido por litro,
20 con intervalos entre 1 y 7 días, en agua dulce o salada.
5. Un método para estimular el crecimiento y resistencia a enfermedades en organismos acuáticos según la reivindicación 1 , caracterizado porque se emplea el péptido encapsulado por vía oral a una concentración entre 0.05 - 10 μg de péptido por gramo de peso húmedo del animal con intervalos entre 1 y 7 días.
256. Un método según las reivindicaciones de la 1 a la 5 caracterizado porque se emplea en la tilapia Oreochromis sp.
7. Un método según las reivindicaciones de la 1 a la 5 caracterizado porque se emplea en Salmón sp.
8. Un método según la reivindicación 8 caracterizado porque se emplea en camarones 30 de las especies Litopenaeus schmitti y Litopenaeus vanamei
9. Un método según las reivindicaciones de la 1 a la 5 caracterizado porque se emplea en Penaeus sp.
10. Un método según las reivindicaciones de la 1 a la 9 caracterizado porque se emplea en el tratamiento preventivo y terapéutico de infecciones parasitarias y otras
35 enfermedades.
11. Un método según la reivindicación 10 caracterizado porque se emplea en el tratamiento preventivo y terapéutico de infecciones parasitarias causadas por Trichodina sp. y Helmintos monogeneos.
12. Un método según la reivindicación 12 caracterizado porque se emplea en el tratamiento preventivo y terapéutico de infecciones parasitarias causadas por sealice.
13. Un método según la reivindicación 10 caracterizado porque se emplea en el tratamiento preventivo y terapéutico de infecciones parasitarias causadas por ectoparásitos.
14. Una formulación veterinaria para estimular el crecimiento y la resistencia a enfermedades en peces y crustáceos caracterizada porque comprende el péptido GHRP-
6 de secuencia: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys -NH2.
15. Una formulación según la reivindicación 27 caracterizada porque puede emplearse en forma inyectable, oral o por inmersión.
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