KR100953778B1 - 수생 생물의 성장 촉진 및 질병에 대한 내성화 방법 - Google Patents
수생 생물의 성장 촉진 및 질병에 대한 내성화 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 시판 어류 및 갑각류의 성장 속도를 증가시키기위한 화학 합성에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 어류의 혈액에 성장 호르몬 수준의 순환의 증가를 생산하기 위해, 성장 호르몬 등의 방출을 직접 또는 간접적으로 유도하는 GHRP-6를 공급하는 것이다. 펩티드는 안정하고, 가용성이며 생리적으로 활성이다.
펩티드는 어류와 갑각류의 성장을 자극하고, 유충 품질을 개선하고, 병원균제에 대한 방어, 건조 중량, 단백질 농도 및 근육 내의 RNA를 증가시킨다.
Description
본 발명은 시판 어류 및 갑각류에서 성장 속도를 증가시키기 위한 화학적 합성에 관한 것이다.
Leu 및 Met 엔케펄린(enkephalins)의 펩티드 동종물의 합성이 보고 되었고 이들은 동물에서 성장 호르몬(GH) 방출을 자극한다고 알려졌다(Bowers C, Momany, G, Reynolds G and A. Hong, 1984. On the in vitro and in vivo activity of a new synthetic hexapeptide that acts on the Pituitaty to specifically release growth hormone. Endocrinology. 114: 1537-45).
GH-방출 펩티드(GHRPs)의 구조-활성 관계를 조사하기 위한 연구는 계속되고 있고 GHRP-6(His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2)의 동정을 가져왔고, 인간을 포함하여 동물에서 극히 강력하고 안정한 GH 분비촉진제(GHS)임이 증명되었지만, 그러나 수생 생물에서 이 화합물의 사용을 개시한 보고서는 지금까지 없었다.
본 발명자들은, 성장을 촉진하기 위한 신호 캐스케이드(시상하부-뇌하수체-표적 기관)의 갑각류 증거의 부족을 고려하여, 펩티드 GHRP-6 단독이 포유동물보다 갑각류에서 유사한 생리적 기능을 발휘할 수 있다는 새로운 사실을 설명하였다.
담수어가 양식의 중요한 생산품 임에도 불구하고, 지난 10년 동안 해조류, 연체동물 및 갑각류의 양식이 상당히 증가하였다. 양식을 위한 생물의 유전학, 번식, 영양 및 생리학의 지식의 진보는 양식 생산을 개선하기 위한 첫번째 단계이다(Comez-Chiarri M, Smith GJ, de la Fuente J. and Powers DA. 1998. Gene transfer in shellfish and algae. In de la Fuente J and Castro FO, editors. Gene transfer in aquatic organisms. Austin, Texas: RG Landes Company and Germany: Springer Verlag; p.107-125).
시판 어류 및 갑각류종의 성장 메카니즘에 포함되는 호르몬과 펩티드로부터 분자적 특징에 대한 연구는 양식의 개량에 사용하기 위해 매우 중요하다. 그것을 이해하기 위한 하나의 예는 1991년에 Silverstein et al.에 의해 사용된, 메기(Ictalarus punctatus)의 조절 및 복제를 위한, 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH)과 도파린 수용체의 안타고니스트의 용도이다(Silverstein JT., Bosworth BG and Wolters WR. 1999. Evaluation of dual injection of LHRHa and the dopamine receptor antagonist pimozide in cage spawning of channel catfish Ictalarus punctatus, Journal of the World Aquacultire Society. Vol. 30, No.2, June 263-268). 이 종들은 세계적으로 양식에 매우 중요하다.
Hashizume et al.은 1997년 동물 농장에서의 생산력을 증가시키기 위한 합성 펩티드의 사용을 보고하였다(Hashizume T., Sasaki.M., Tauchi S. and Masuda H. 1997. The effect of new growth Hormone-releasing peptide(KP 102) on the release of growth hormone in goats. Aniaml Science and Technologiy. Vol. 68, No. 3, March, 247-256). 그들은 신규한 성장 호르몬 방출 합성 펩티드를 주사함에 의한 염소에서 성장 호르몬의 유도를 설명하였다.
어류에 인슐린을 경구투여 하였고, 여러 온도에 대한 잉어의 적응에 포함된 수용체와 호르몬의 신호 변화를 설명하였다(Vera MI., Romero F., Figueroa J., Amthauer R., Leon G., Villanueva. and Krauskopf M. 1993. Oral administration of insulin in winter-acclimatized carp (Cyprinus carpio) induces hepatic ultrastructural changes. Comp. Biochem. Physiol.Vol. 106A, No.4, 677-682)
포유동물에서의 성장 호르몬 방출 펩티드의 합성 변종이 Patchett et al에 의해 1995년에 시험되었다. 이들은 적용 후 티로신과 프로락톤의 수준에 영향이 없이 개에서 GH의 강력한 경구 활성제로 알려진, 펩티드 MK-0677를 조사하였다(Patchett AA., Nargund RP., Tata JR., Chen MH., Barakat KJ., Johnston DBR., Cheng K., Chan WWS., Butler B., Hickey G., Jacks T., Schleim K., Pong SS., Chaung LYP., Chen HY., Frazier E., Leung KH., Chiu SHL. and Smith RG. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.92, 7001-7005).
성장 호르몬 방출 호르몬의 다른 적용은, 순환 GH의 증가된 수준에 의해 생성된 우유 생산 자극을 고려하여, 우유 생산을 증가하기 위해 가축에서 전개되어 왔다(Soliman EB., Hashizume T., Ohashi S. and Kanematsu S. 1997. Effect of Growth hormone(GH)-releasing hormone and its analogs on GH secretion from cultured adenohypophysial cells in cattle. Domestic animal endocrinology. Vol.14(1), 39-46).
어류 또는 갑각류에서 GHRP-6의 사용에 대한 선행 보고는 없었다. 본 명세서에 보고된 어류 및 갑각류의 성장 자극, 유생 품질 개선, 및 병원균에 대한 방어, 건조중량, 단백질 농도 및 근육중의 RNA의 증가를 위한, 어류 또는 갑각류에서 GHRP-6의 용도는 수생 생물 양식에서 생산성을 증가시키기 위한 해결책을 포함한다.
예를 들면 Penaeus japonicus 및 Litopenaeus vanname와 같은 몇몇 쉬림프종의 유전적 품종 개량에 대한 예비적 결과가 있지만 충분하지 않은데, 왜냐하면 이들 생물에 대한 유전학 및 생화학적 지식이 부족하기 때문이다(Benzie, J.A.H., 1998. Penaeid genetics and biotechnology. Aquaculture 164, 23-47 and Fjalestadl, K.T., Carr. W.H., Lotz, J.L., Sweeney, J.N., 1999. Genetic variation and selection response in body weight and disease resistance in the Pacific White Shrimp Penaeus Oannamei. Aquaculture 173, 10, Abstract only). 생산성을 향상시키기 위해 쉬림프의 양식에 생물공학, 분자 생물학, 유전공학 및 생화학을 적용시키는 것은 매우 중요하다(Bachere, E., Mialhe, E., Noel, D., Boulo, V., Morvan, A., Rodriguez, J.(1995) Knowledge and research prospects in marine mollusc and crustacean immunology. Aquarculture. 132, 17-32).
본 발명은 GHRP-6 자체가 성장을 자극하고, 유생의 품질을 개선하고, 및 병원균에 대한 내성화, 건조중량, 단백질 농도 및 어류 또는 갑각류의 근육 중의 RNA를 증가시킬 수 있다는 것을 확증한다.
본 발명의 필수 및 신규성은 HRP-6 자체가 성장을 자극하고, 유충의 품질을 개선하고, 및 병원균에 대한 내성화, 건조중량, 단백질 농도 및 어류 또는 갑각류의 근육중의 RNA를 증가시킬 수 있음을 지지하는 것이다. 분비촉진제 GHRP-6 자체는 어류 및 갑각류에 경구적으로 주사 또는 침지되어 성장을 자극시킬 수 있다.
우선적으로, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2에 대응하는 서열을 갖는 헥사펩티드 GHRP-6(성장 호르몬 방출 펩티드)의 GH 방출을 촉진하기 위한 생리적 활성을 포유 동물 및 조류등에서 설명하였다(Bowers C, Momany, G, Reynolds G and A. Hong. 1984. On the in vitro and in vivo activity of a new synthetic hexapeptide that acts on the Pituitary to specifically release growth hormone. Endocrinology. 114: 1537-45).
경골어류 GH 수준은 일(day)에 따라 매우 가변적이므로, 혈청 샘플은 각 어류당 처리 전 및 처리 후에 취했다. 결과는 복강내의 헥사펩티드 처리 후 15분에 시간 경과에 따른 실험에서 혈청 GH 수준이 증가되었다는 것을 나타낸다. 다른 척추동물과 같이, 경골어류에서 GH의 성장촉진 작용은 주로 IGF의 유도에 의해 달성된다. 간장의 IGF mRNA의 수준은 주사 후 30분에 GHRP-6의 복강내 주사에 대한 반응으로 상당히 증가하며 6시간 동안 정상치로 돌아온다(실시예 1).
이것은 펩티드 GHRP-6 자체가 포유동물과 조류보다 어류에서 유사한 생리적 기능을 발휘한다는 것을 설명하며 이 메카니즘이 유사하다는 것을 제안한다.
인 비보에서, 담수어 유생 틸라피아에서 신체 성장을 조절하는 GHRP-6의 역할을 조사하였다. 다양한 투여 방법을 이용한 GHRP-6로의 처리는, 3가지의 다른 투여 방법:a)복강내 주사, b)경구 및 c)침지(실시예 2)으로 3주간 처리한 후의 성장 증가로 결정함에 따르면, 대조군과 비교하여 상당히 성장을 자극하였다.
틸라피아 유충 1g에서 병원균 내성 및 근육 품질의 증가에서 침지에 의해 적용된 헥사펩티드 GHRP-6의 효과를 설명하였다(실시예 3). 결과는 GHRP-6로 처리된 틸라피아 군은 중량과 단백질 농도가 증가되었고 병원균 침입 강도와 범위 및 근육의 수함량은 감소하였다는 것을 나타낸다. 이 결과는 단백질 합성에서 헵타펩티드의 양성 효과를 제안한다.
다양한 투여방법: a)복강내 투여, b)경구 및 c) 침지(실시예 4)에 의해 단독으로 갑각류의 성장속도를 증가시킬 수 있는 GHRP-6를 쉬림프 Litopenaeus Schmitt에서 조사하였다.
다양한 유충 단계에서 4-침지 배스의 적용에 의해 성장 속도를 단독으로 향상시킬 수 있는 헥사펩티드를 쉬림프 Litopenaeus Schmitt에서 조사하였다. 유충 약식 사이클의 최종 단계에서 유충의 품질은 펩티드에 의해 개선되었다. 유충은 중량, 크기, 아가미 분지의 수, 주둥이뼈의 변형, 단백질 농도 및 근육에서의 RNA에서 상당한 증가를 나타내었다. 이것은 대사 활성의 증가를 증명한다.
유충의 개선된 품질은 성충 쉬림프에서도 유지되어 생물량이 증가하고 및 동물의 중량과 크기가 더욱 균일하였다. GHRP-6는 근육내 주사에 의해 성충 쉬림프 Litopenaeus Schmitt에서의 성장 속도를 촉진할 수 있었다. GHRP-6의 주사 15일 후, 처리된 동물군은 대조군에 비해 100% ~ 150%의 증가를 나타내었다(실시예 5).
음식 중에 또는 캡슐에 넣어 Artemia salina 중에 경구투여된 분비촉진제 GHRP-6는 쉬림프 Litopenaeus Schmitt에서의 성장 속도를 대조군과 비교하여 30%~40% 증가시켰다(실시예 6).
도 1은 GHRP-6 펩티드로 감염된 유충 틸라피아에서 틸라피아 IGF mRNA 수준 및 혈청 GH 수준을 나타낸 도면이다. 복강내 주사된 각 군은 3개의 동물이다. 간과 혈청 샘플을 주사 후 15분, 30분, 1시간 및 6시간에 취하였다. 처리 전에 각 동물에서 샘플 혈청을 취하였다. *대조군과 크게 다름(p<0.001 ANOVA, Duncan test).
도 2는 3주간에 걸쳐 유충 틸라피아에 GHRP-6 주사에 의한 체중 및 성장 속도에 대한 효과를 나타낸 도면이다. 각 틸라피아 7개의 군에 1주일에 2회 펩티드 0.1㎍/gbw를 복강내 주사하였고 대조군에는 살린 부형제를 주사하였다. * 대조군과 크게 다름(p=0.015, 복수범위 시험). 막대는 표준 오차를 나타난다. 삼각형은 평균성장속도를 나타낸다.
도 3은 3주간에 걸쳐 유충 틸라피아에 캡슐화되지 않고 경구에 삽관 투입된 GHRP-6의 체중 및 성장률에 대한 효과를 나타낸 도면이다. 5개 틸라피아의 군을 1주일에 2회 펩티드 0.1㎍/gbw로 처리하였고 대조군에는 살린 부형제를 주사하였다. * 대조군과 크게 다름(p=0.015, 복수 범위 시험). 막대는 표준 오차를 나타난다. 삼각형은 평균성장속도를 나타낸다.
도 4는 3주간에 걸쳐 유충 틸라피아에 경구 투여된 GHRP-6의 체중 및 성장률 에 대한 효과를 나타낸 도면이다. 5개 틸라피아의 군을 1주일에 2회 펩티드 0.1㎍/gbw로 처리하였고 대조군에는 살린 부형제를 주사하였다. *대조군과 크게 다름(p=0.007, 복수 범위 시험). 막대는 표준 오차를 나타난다. 삼각형은 평균성장속도를 나타낸다.
도 5는 침지에 의한 GHRP-6로 처리된 쉬림프 Litopenaeus Schmitt에 대한 GHRP-6의 성장 촉진 활성을 나타낸다.
A: GHRP-6 및 대조군으로 처리한 3개의 군의 체중 증가(mg)
B: GHRP-6 및 대조군으로 처리한 3개의 군의 크기 증가(mm)
C: GHRP-6 및 대조군으로 처리한 3개의 군의 아가미 분지의 절대 빈도 분포
D: GHRP-6 및 대조군으로 처리한 3개의 군의 주둥이 뼈의 절대 빈도 분포
I: 1군: 0.001mg/L;
Ⅱ: 2군: 0.01mg/L;
Ⅲ: 3군 :0.1mg/L
대조군: 1mg BSA/L
*** p<0.001.
막대는 표준 오차를 나타냄(±DS)
ANOVA 및 그 이후의 DUNCAN 시험을 중량과 크기의 차이의 통계적 계산을 위해 적용하였다. Kolmogorov-Smmirnov를 주둥이 뼈 및 아가미 분지에 대해 적용하였다.
도 6은 GHRP-6로 처리된 쉬림프 및 대조군의 건조중량을 나타낸 도면이다. *** t-테스트 p<0.001. 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 7은 GHRP-6로 처리된 쉬림프 및 대조군의 RNA, 단백질 및 DNA 사이의 관계를 나타낸 도면이다. *** t-테스트 p<0.001. 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 8은 침지에 의해 GHRP-6로 처리된 생산 조건에서 유충 쉬림프 Litopenaus Schmitt의 성장 속도를 나타낸 도면이다. 시험은 6주간 계속되었다. ***t-테스트 p<0.001. 막대는 표준 오차를 나타낸다.
실시예 1. 어류 중 GHRP-6의 생리적 활성 증명
본 실험에 평균중량이 71±28g인 틸라피아 15마리를 사용하였다. GHRP-6를 헥사펩티드와 함께 0.1㎍/gbw로 주사하였다. 간과 혈액 샘플을 처리전 및 펩티드 주사 후 15분, 30분, 1시간 및 6시간에 (그룹당 3마리) 취하였다. 혈청과 간 샘플을 모으고 전체 RNA 분리 및 노던 블롯 분석에 사용할 때 까지 -70℃에서 저장하였다. 또한, 모든 동물에서 처리하기 전에 혈청 샘플을 취하였다.
노던 블롯 분석을 사용하여 펩티드를 주사한 틸라피아에서 상대적 IGF mRNA 수준을 측정하였다. Chomczynski와 Sacchi(Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolstion by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extration. Anal Biochem 1987, 162, 156-59)에 의해 기재된 비와 같이 전체 RNA를 간 샘플로부터 정제하였다. 20㎍의 RNA를 1% 포름알데히드 아가로스 겔에서 분별하고 나일론 막(Hybond N, Amersham UK)으로 전달하고 틸라피아 IGF-I cDNA 프로브로 혼성화하고 이어서 인간 글리세르알데히드 3 포스페이트 디하이드로게나제 cDNA (GAPDH, Dr. Bryan Williams, Cleveland Foundation, OH, USA로부터 기증받음)로 재혼성화하여 신호를 정규화하였다. 혼성화 신호를 휴렛 패커드 스캔젯 스캐너로 스캔한 신호들을 디지탈 이미지 처리하여 정량화하였다. 이미지들을 Bandleader 컴퓨터 프로그램으로 처리하였다. 결과는 임의 단위의 RNA로 표현하였다.
혈청 GH 수준을 틸라피아 GH에 대한 2개의 모노크로날 항체를 사용한 ELISA로 측정하였다(Munoz et al, 제조 중).
경골어류 GH 수준이 날짜에 따라 매우 가변적이므로, 각 어류에 대해 혈청 샘플을 처리 전 및 처리 후에 취하였다. 도 1은 복강내로 헥사펩티드 처리를 한 후 15분에 시간 추적 시험에서 혈청 GH 수준의 증가를 나타낸다. 경골어류에서, 다른 척추동물에서와 같이, GH의 성장 촉진 작용은 30 분에서 GHRP-6의 복강내 주사에 대한 반응으로 상당히 증가하였고 주사 후 6 시간 중에 정상치로 돌아갔다(도 1).
실시예 2. 유충(
Oreochromis sp
) 틸라피아에서 GHRP-6의 성장 촉진 활성
2.1 복강내 주사
Aquadique Aquaculture Station(쿠바, 하바나)에서 공급된 유충 혼성 틸라피아(Oreochromis aureus)를 일정한 광주기(광-14시간 및 암흑-10시간)로 25 ℃에서 담수가 재순환되는 500 리터 탱크에서 새환경에 순응시키고 시판되는 펠렛(CENPALAB, 쿠바, 하바나)을 먹였다. 체중의 5%와 동량의 1일 배급량을 1일 2회 이들을 실험에 사용할 때까지 투여하였다.
CHRP-6(BACHEM, 스위스)를 PBS로 희석시키고 3주동안 매주 2회 어류의 그람중량당(gbw) 0.1 ㎍으로 주사하였다. 펩티드를 평균 신체 중량이 61±14.3g인 8마리의 수컷 틸라피아 군에 투여하고, 대조군으로서 61.41±29.67g의 평균 신체 중량을 갖는 7마리 수컷 틸라피아에 PBS를 주사하였다.
신체 중량을 그람 단위로 매주 측정하였다. 모든 실험에서, 동물에 마이크로칩 라벨을 붙였다(Stoelting Co. Wood Dale, U.S.A.)
복강내 투여에 의한 GHRP-6로의 처리는 0.1 ㎍/gbw(p<0.05)의 복강내 주사 처리 3주 후 성장 속도에서의 증가에 의해 측정된 바와 같이 성장을 상당히 촉진하였다(도2).
2.2 경구 투여
펩티드 방출의 다른 방법을 경구 삽관된 펩티드(도 3) 및 캡슐화 삽관된 펩티드(도 4)으로 평가하였고, 성장 속도는 또한 각각의 대조군과 비교하여 양쪽 처리에서 통계적으로 중요하였고, 후자의 경우, 처리의 마지막까지 신체 중량에서 상당한 차이가 있었다. 양쪽 경구 삽관된 처리들 간의 비교는 캡슐화된 펩티드 처리된 것이 더 많은 신체 중량 증가를 나타냈다(p<0.05).
GHRP-6 펩티드는 인산염 완충 살린(PBS)으로 희석되었고 평균 중량이 87.22±14.1g인 수컷 틸라피아 7마리의 군에 인두강으로 플라스틱 튜브를 통해 투여되었다. PBS을 평균 중량이 89.22±7.66g인 대조군(n=7, 모두 수컷 틸라피아)에 전달하였다. 처리는 0.1 ㎍/gbw으로 3주 동안 매주 2회 실시되었다. 체중을 그람 단위로 매주 측정하였다.
펩티드의 캡술화를 위해, 캡슐은 Knorr et al., 1988에 의해 이미 보고된 것과 같이 얻었다: 키토산과 알긴산을 이용하여 펩티드를 캡슐화하였다. 헥사펩티드GHRP-6를 플라스틱 튜브를 통해 평균 신체 중량이 89.09±8.38g인 수컷 틸라피아 7마리의 인두강으로 투여하였다. 대조군으로서 펩티드가 없는 폴리머 비드를 평균 신체 중량이 89.86±13.54g인 수컷 틸라피아 7마리에 투여하였다. 처리는 주 2회로 0.14㎍/gbw으로 실시되었다(도 4).
실시예 3. 유충(
Oreochromis sp
) 틸라피아에서 침지에 의한 GHRP-6의 성장 촉진 활성
평균 중량 1.5g의 틸라피아(Oreochromis sp)를 두개의 다른 투여량의 GHRP-6(10 ㎍/100ml 및 100 ㎍/100ml)으로 처리하였다. 유사 대조군을 생리적 용액으로 처리하였다.
실험에서, 중량(표 1), 생화학적 혈액 계수(표 2), 아가미의 기생충의 수(Trichodinicos(표 3) y Helmintos mongeneos(표 4)) 및 근육에서의 습도 및 단백질 농도를 측정하였다.
분석을 위해, 한 군당 평균 중량이 1g인 15마리의 동물(×3)을 선택하였다. 40 리터 탱크 9개에서 실험을 전개하였다. 45일 동안 매주 1회 적용을 하였다.
각 군과 투여량은 다음과 같다:
그룹 Ⅰ: 10 ㎍/100ml(처리 1)
그룹 Ⅱ: 100 ㎍/100ml(처리 2)
그룹 Ⅲ: 대조군(생리적 용액)
| 처리 | n | 평균중량 (g)±DS | 그룹간의 비교 | 통계적 차이 |
| 그룹Ⅰ 10 ㎍/100ml | 25 | 4.56±1.07 | Ⅰ-Ⅱ | 0.01454 |
| 그룹 Ⅱ 100 ㎍/100ml | 25 | 4.54±1.38 | Ⅱ-Ⅲ | 1.07177* |
| 그룹Ⅲ 살린용액 | 25 | 3.47±1.52 | Ⅲ-Ⅰ | 1.08632* |
*상당한 차이 있음. 복수 등급 시험
| 처리 | n | 평균중량 (g)±DS | 그룹간의 비교 | 통계적 차이 |
| 그룹 Ⅰ 10 ㎍/100ml | 15 | 27.46±4.53 | Ⅰ-Ⅱ | (2.4)* |
| 그룹 Ⅱ 100 ㎍/100ml | 15 | 25.06±5.25 | Ⅱ-Ⅲ | (1.0)* |
| 그룹Ⅲ 살린용액 | 15 | 26.46±4.08 | Ⅲ-Ⅰ | (1.4)* |
*상당한 차이 없음. 복수 등급 시험
| 처리 | n | Ia | E(%)b | 그룹간의 비교 | 통계적 차이 |
| 그룹 Ⅰ 10 ㎍/100ml | 25 | 7.73 | 100 | Ⅰ-Ⅱ | (4.42) |
| 그룹 Ⅱ 100 ㎍/100ml | 25 | 2.80 | 84.6 | Ⅱ-Ⅲ | (5.84)* |
| 그룹Ⅲ 살린용액 | 25 | 8.76 | 92.30 | Ⅲ-Ⅰ | (1.42) |
aI: 침입강도
bE: 침입신장
*상당한 차이 있음. 복수 등급 시험
| 처리 | n | Ia | E(%)b | 그룹간의 비교 | 통계적 차이 |
| 그룹 Ⅰ 10 ㎍/100ml | 25 | 0.39 | 34.7 | Ⅰ-Ⅱ | (0.304) |
| 그룹 Ⅱ 100 ㎍/100ml | 25 | 0.66 | 50 | Ⅱ-Ⅲ | (0.521) |
| 그룹Ⅲ 살린용액 | 25 | 1.07 | 46 | Ⅲ-Ⅰ | (0.826) |
aI: 침입강도
bE: 침입신장
*상당한 차이 있음. 복수 등급 시험
| 처리 | n | 평균습도 ±SD(%) | 그룹간의 비교 | 통계적 차이 |
| 그룹 Ⅰ 10 ㎍/100ml | 24 | 82.96±3.63 | Ⅰ-Ⅱ | (0.791) |
| 그룹 Ⅱ 100 ㎍/100ml | 24 | 83.5±3.31 | Ⅱ-Ⅲ | (2.666)* |
| 그룹Ⅲ 살린용액 | 24 | 86.42±3.23 | Ⅲ-Ⅰ | (3.458) |
*상당한 차이 있음. 복수 등급 시험
| 처리 | n | 평균중량 ±SD(%) | 그룹간의 비교 | 통계적 차이 |
| 그룹 Ⅰ 10 ㎍/100ml | 23 | 6.10 | Ⅰ-Ⅱ | (1.160)* |
| 그룹 Ⅱ 100 ㎍/100ml | 23 | 4.94 | Ⅱ-Ⅲ | (1.38)* |
| 그룹Ⅲ 살린용액 | 23 | 3.55 | Ⅲ-Ⅰ | (2.64)* |
*상당한 차이 있음. 복수 등급 시험
실시예 4. 침지에 의해 GHRP-6로 처리된 쉬림프
Litopenaeus schmitti
에서 GHRP-6의 성장 촉진 활성
GHRP-6의 3개의 다른 투여량을 그룹 또는 쉬림프 유충에 침지하여 적용하였다. 적용은 각각 3일 실시되었다. 보바인 혈청 알부민(BSA)을 수용한 하나의 대조군을 포함하여, 각 그룹 당 4개의 적용이 실시되었다. 1시간 당, 다음과 같이 해수 1리터당 GHRP-6의 농도로 처리되었다.
그룹 1: 0.001mg/L
그룹 2: 0.01mg/L
그룹 3: 0.1mg/L
그룹 4: BSA 1mg/L
GHRP-6 0.1mg/L로 처리된 그룹은 평균 중량 153%, 평균 크기 26%, 아가미 분지의 수 및 주둥이 뼈의 수의 증가를 나타냈다. 모든 경우에, 차이는 통계적으로 중요하였다(도 5).
전체 처리된 동물은 근육에서 더 낮은 수함량을 나타내고 그리고 GHRP-6에 의한 유충의 근육에서 대사의 활성을 나타내는 RNA/DNA, 단백질/DNA 사이의 관계에 서 값이 증가되었다(도 6과 7).
이 결과는 갑각류의 양식을 위한 유충의 품질 관련을 고려하여 매우 중요하다.
생산 조건에서 유충의 생존률은 GHRP-6 처리된 군에서 처리안된 군과 비교하여 20% 증가하였다. 동일한 조사에서, 중량은 115%, 크기는 37% 증가하였다. 한편, 동물의 균일성은 헵타펩티드로 처리된 군에서 높았고 가변 계수는 중량 및 크기에서 더 낮았다(도 8).
실시예 5. 근육내 주사에 의해 GHRP-6로 처리된 성체(adult) 쉬림프
Litopenaeus schmitti
에서 GHRP-6의 성장 촉진 활성
GHRP-6 50 ㎕를 약 15g의 성체 쉬림프의 제2 및 제3 복부 마디 사이에 주사하였다. 3일 동안 쉬림프의 중량 당 GHRP-6 1 ㎍의 투여량을 1회씩 주사하였다. 하나의 대조군에는 동일한 농도의 BSA를 주사하였다. 그룹당 15 동물을 사용하였다. 측정된 변수는 중량 및 크기였고 그룹은 펩티드로 처리하였다. GHRP-6로 처리된 동물의 군에서 100%~150% 사이로 증가한 상당한 차이가 관찰되었다(p<0.001).
동물을 연못에서 네트(0.8cm)로 유지하였다. 연못 수온은 25 ℃였고 자연광이었다.
실시예 6. 사료에 포함된 GHRP-6로 처리된 쉬림프
Litopenaeus schmitti
에서 GHRP-6의 성장 촉진 활성
GHRP-6를 후-유충(post larvae) 쉬림프 Litopenaeus schmitti의 사료에 1% 포함시켰다. 펩티드를 Knorr(Knorr D. 및 M.Daly (1988) Mechanics and diffusional changes observed in multi-layer chitosan/alginate coacervate capsules. Process Biochemistry; 48-50)에 의해 보고된 방법에 따라 캡술화하였다. 하나의 대조군은 BSA 1%를 갖는 사료를 먹였다. 실험의 시작과 끝에 평균 중량과 크기를 측정하였다. 실험을 30일간 지속하였다.
쉬림프 후-유충의 사료에 포함된 GHRP-6는 대조군과 비교하여 성장 속도를 30%~ 40% 증가시켰다. 상당한 차이가 있다(p<0.001).
6.1. Artemia salina 캡슐화
쉬림프 Litopenaeus schmitti and Litopenaeus vanamei의 후-유충에 먹이기 위해 GHRP-6를 아르테미아(Artemia)에 캡슐화하였다. 캡슐화를 위해 펩티드를 Artemia salina에 1 시간에 10mg/L의 농도로 첨가하고 Artemia를 수확하고 살린 용액으로 세척하였다. 한달동안 쉬림프의 후-유충에 1일 4회 먹였다. 대조군은 Artemia에 동일한 농도로 캡슐화된 BSA를 수용하였다.
Artemia salina에 캡슐화된 GHRP-6는 쉬림프 유충의 중량 및 크기를 대조군과 비교하여 30%~40% 개선시켰다. 상당한 차이가 있음(p<0.001).
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His D-Trp Ala Trp D-Phe Lys
1 5
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- 서열 His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2을 갖는 펩티드 GHRP-6을 사용하는 것을 특징으로 하는 어류 및 갑각류의 성장 촉진 및 질병에 대한 내성화 방법.
- 제 1항에 있어서, 어류 및 갑각류의 성장 촉진 및 질병에 대한 내성화를 위한 배합 사료에 상기 동물의 습윤중량그람당 0.01~50㎍ 펩티드의 농도로 GHRP-6을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 어류 및 갑각류의 성장 촉진 및 질병에 대한 내성화를 위한 주기적 주사에 상기 동물의 습윤중량그람당 0.01~50㎍ 펩티드의 농도로 GHRP-6을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 어류 및 갑각류의 성장 촉진 및 질병에 대한 내성화를 위하여 담수 및 해수에 1 내지 7일간의 간격으로 리터당 10~500㎍ 펩티드의 농도로 GHRP-6을 침지하여 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 어류 및 갑각류의 성장 촉진 및 질병에 대한 내성화를 위한 캡슐형 사료에 1 내지 7일간의 간격으로 상기 동물의 습윤중량그람당 0.05~10㎍ 펩티드의 농도로 GHRP-6을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 틸라피아 Oreochromis sp.에 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, Salmon sp.에 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, Litopenaeus schmitti, Litopenaeus vanamei에 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8항에 있어서, 쉬림프 Penaeus sp.에 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 기생충 감염 및 다른 질병의 예방 및 치료용인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, Trichodina sp. y Helmintos monogeneos에 기인한 기생충 감염의 예방 및 치료용인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 바다 이(sea lice)에 기인한 기생충 감염 예방 및 치료용 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 체외기생충(ectoparasites)에 기인한 기생충 감염 예방 및 치료용인 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열 His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2을 갖는 펩티드 GHRP-6을 사용하는 것을 특징으로 하는 어류 및 갑각류의 성장 촉진 및 질병에 대한 내성화를 위한 수의학적 제형물.
- 제 14항에 있어서, 주사, 경구 또는 침지(immersion) 투여로 투여될 수 있는 것인 수의학적 제형물.
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