WO2003078620A1 - Isopropylmalate isomerase mutee - Google Patents

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WO2003078620A1
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dna
polypeptide
residue
seq
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Masato Ikeda
Mikiro Hayashi
Junko Ohnishi
Satoshi Mitsuhashi
Hiroshi Mizoguchi
Satoshi Nakagawa
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine

Definitions

  • the present invention provides a novel polypeptide, a DNA encoding the polypeptide, a recombinant DNA containing the DNA, a microorganism transformed with the recombinant DNA, And a method for producing an L-amino acid, which comprises culturing the microorganism in a medium.
  • Isopropyl malate isomerase is an enzyme that catalyzes the reaction of converting 2-isopropyl malate to 3-isopropyl malate on the leucine synthesis pathway.
  • Isomeryl malate large subunit forms a complex with isopropyl malate small subunit and forms isopropyl malate.
  • various microorganisms such as Escherichia coli and Bacillus subtilis (Science, 277, 1453 (1997). ), Nature, 390, 249 (1997)], and the nucleotide sequence of DNA encoding ISOM has also been clarified.
  • the gene encoding ISOM is predicted from the genome sequence information in Corynebacterium mugumica, and its nucleotide sequence has been reported (W001 / 00843, EP 1108790). ).
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing an L-amino acid using a microorganism.
  • the present inventors have found that microorganisms expressing the mutant isopropylmalate isomerase of the present invention are significantly more effective than microorganisms expressing wild-type isopropylmalate isomerase without adding leucine to the medium.
  • the present inventors have found that the productivity of L-amino acids is extremely high, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to the following (1) to (28).
  • amino acid sequence of an isopropyl malate isomerase derived from a microorganism belonging to a coryneform bacterium one or more amino acids have an amino acid sequence in which deletion, substitution, or addition has been performed, and the amino acid sequence has the amino acid sequence.
  • a polypeptide characterized in that a coryneform bacterium that produces the polypeptide as the only isomerase isomerase is exhibiting partial oral auxotrophy in a minimal medium.
  • the polypeptide has a lack of one or more amino acids in the amino acid sequence of the large subunit (hereinafter abbreviated as ISOM) of isomeric malic acid isomerase, which constitutes isopropyl malate isomerase.
  • ISOM large subunit of isomeric malic acid isomerase
  • Amino acid residues other than glycine residues are L-alanine, L-palin, L-bit isine, L-isoleucine, L-methionine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-proline, L- The polypeptide of (4) above, which is an amino acid residue selected from lysine, L-histidine, L-arginine, L-asparaginic acid and L-glutamic acid.
  • polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added is isopropyl apple. Deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence of both the small subunit of acid isomerase and the large subunit of isopropyl malate (ISOM), or one of the subunits;
  • Polypeptides having a substituted or added amino acid sequence can be mentioned, and preferably have an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of ISOM. Polypeptides can be mentioned.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, palin, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, 0-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • polypeptide of the present invention (ii) is a polypeptide having a mutation in ISOM among the polypeptides of the present invention (i), it can be obtained by the same method as described above.
  • amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 appeared on the amino acid sequence of ISOM derived from the coryneform bacterium. Find the amino acid residue at the position corresponding to the 6th amino acid residue.
  • mutant DNA is the DNA encoding the polypeptide of the present invention (iv) means that the mutant DNA is used to transform a coryneform bacterium that produces wild-type ISOM,
  • the transformant obtained by replacing the mutant DNA with the DNA encoding the wild-type ISOM by homologous recombination technology can be confirmed by exhibiting the above-described partial oral isine requirement.
  • the polypeptides of (viii) to (x) of the present invention are characterized in that, using DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a codon encoding a lysine residue at the N-terminal 456th position is It can be obtained by changing to a codon encoding an amino acid residue other than a glycine residue by the site-directed mutagenesis method described above.
  • the amino acid to be deleted or substituted is an amino acid residue other than the amino acid residue at a position corresponding to the amino acid at position 456 from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. If it is, there is no particular limitation.
  • polypeptide (xi) can be obtained by introducing the site-specific mutation into DNA encoding the polypeptide of the present invention described in any of (iv) to (X).
  • deletion or substitution or addition of one or more amino acid residues means that one or more amino acid residues have been deleted, substituted or added at an arbitrary position in the same sequence. Loss, substitution, or addition may occur simultaneously, and the amino acid residue to be substituted or added may be natural or non-natural, and the amino acid that can be substituted is the same as described above.
  • Examples of the DNA of the present invention include:
  • the codons encoding amino acid residues other than glycine residues are L-alanine, L-valine, L-mouth isine, L-isoleucine, L-methionine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L- DNA of (ii) above, which is a codon encoding an amino acid residue selected from proline, L-lysine, L-histidine, L-arginine, L-aspartic acid and L-glutamic acid
  • Codons encoding amino acid residues other than glycine residues are L-alanine, L-valine, L-mouth isine, L-isoleucine, L-methionine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-proline
  • Examples of a DNA encoding an I SOM derived from a microorganism belonging to a coryneform bacterium include DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 described in EP 1108790.
  • nucleotide sequence of the DNA encoding the I SOM derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium the region corresponding to the nucleotide sequence at positions 1366 to 1368 from the 5 'end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is The homology between the nucleotide sequence of the DNA encoding the I SOM derived from the type bacterium and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 was calculated using a homology analysis program such as BLAST and FASTA described above, and both nucleotides were calculated.
  • the region corresponding to the 1366th to 1368th base sequence from the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is a codon encoding an amino acid residue other than a glycine residue.
  • Encodes I SOM derived from microorganism belonging to bacteria The DNA can be obtained by introducing a base substitution into the DNA to be subjected to the site-directed mutagenesis method described above.
  • the codon encoding an amino acid residue other than a glycine residue may be any codon encoding an amino acid residue other than glycine, and is preferably L-alanine, L-valine, L-one isine, or L-one. Isoleucine, L-methionine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-proline, L-lysine, L-histidine, L-arginine, L-aspartic acid, and L-glucamic acid residues And amino acid residues, more preferably L-aspartic acid and L-glutamic acid residues, and still more preferably L-aspartic acid residues.
  • the DNAs of (vi) to (viii) are obtained by using the above-described site-directed mutagenesis method with respect to the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3 to obtain the base sequence of SEQ ID NO: 3 1 3 6 6 5 5 terminus of: 1 3 6 8 th base sequence can be obtained by substituting the codons that co one de the amino acid residue other than a glycine residue.
  • the DNA obtained by substituting the codon encoding the aspartic acid residue for the base sequence at position 1366 to 1336 from the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is represented by SEQ ID NO: 3.
  • the guanine at position 1367 from the 5 'end of the base sequence And DNA in which adenine is substituted for adenine.
  • the DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the DNA hybridizable under stringent conditions are the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 DNA obtained by using the colony hybridization method, plaque hybridization method or Southern blot hybridization method, etc., as a probe with a part or the whole of the complementary strand of DNA consisting of Specifically, hybridization is performed at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1. Omol / 1 sodium chloride using a filter on which DNA derived from colonies or plaques is immobilized.
  • the hybridizable DNA has a homology of at least 60% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 when calculated based on the above-described parameters using BLAST or FASTA or the like.
  • DNA preferably DNA having 80% or more homology, more preferably DNA having 95% or more homology.
  • Base is a codon DNA obtained by the above methods, a region corresponding 5 5 terminus of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3 to 1 366-1368 st base sequence encoding an amino acid residue other than glycine residue
  • the DNA is used to transform a coryneform bacterium that produces wild-type ISOM
  • the coryneform bacterium obtained by substituting the DNA encoding type ISOM by homologous recombination technology exhibits the above-mentioned partial oral isin requirement, and the DNA obtained by the above method is as described in (ix) above. ) Can be confirmed to be the DNA of the present invention.
  • the DNA obtained by the above method is a DNA having a nucleotide sequence in which a region corresponding to the nucleotide sequence at positions 1366 to 1368 from the 5 ′ end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is a codon encoding a glycine residue.
  • the DNA of the above (ix) is obtained by introducing a site-specific mutation into the DNA obtained by the above method according to the method of obtaining the DNA of the present invention of the above (ii). Can be.
  • the DNA is the DNA of the present invention of (ix) above, the DNA is used to transform a coryneform bacterium that produces a wild-type I SOM, and the DNA and the wild-type I SOM are transformed.
  • the coryneform bacterium obtained by substituting the encoding DNA with the homologous recombination technique can be confirmed by exhibiting the above-described partial oral auxin requirement.
  • Methods for obtaining DNA encoding isopelum pyrimalate isomerase or I SOM derived from microorganisms belonging to coryneform bacteria include the method of Saito et al. From a microorganism belonging to coryneform bacteria CBiochim. Biopys. Acta, 72 , 619 (1963)], and can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 as ⁇ type. Examples include a method of obtaining the DNA by PCR using a primer DNA.
  • chromosomal DNA was prepared from Corynebacterium gullica micam ATCC31032 strain, and the DNA was designated as ⁇ type, and the 5 ′ end and 3 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NOS: 3 and 4, respectively.
  • DNA having the sequence of the region is chemically synthesized, and DNA encoding isopropylmalate isomerase can be obtained by PCR using the DNA as a primer.
  • DNA having the sequences of the 5, 5 and 3 'end regions of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 was used as a primer set.
  • DNA encoding ISOM can be obtained by CR. Specific DNAs obtainable by the above method include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the like.
  • the coryneform bacterium belongs to the coryneform bacterium by a hybridization method using a part or all of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 or the DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 as a probe.
  • DNA encoding isopropylmalate isomerase or ISOM derived from a microorganism can be obtained.
  • the DNA encoding isopropyl malate isomerase or ISOM of a microorganism belonging to the coryneform bacterium may have the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the DNA can be obtained by chemically synthesizing DNA having the nucleotide sequence by a known method.
  • the DNA of the present invention may be prepared by synthesizing a DNA encoding isopropyl malate isomerase or I SOM derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium obtained in the above (i) by molecular cloning, 3rd edition or current protocol. It can be obtained by introducing site-specific mutations according to the method described in Ruth in Molecular Biology.
  • the region corresponding to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the base sequence at positions 1366 to 1368 from the end is a codon encoding an amino acid residue other than glycine. If so, the DNA is the DNA of the present invention. Further, the DNA of the present invention is a DNA encoding the ISOM derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium obtained in the above (1), which is the 5th to 1366th to 1368th from the end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. Can be obtained by chemically synthesizing a DNA having a base sequence in which a region corresponding to the base sequence is a codon encoding an amino acid residue other than glycine by a known method.
  • Examples of the DNA of the present invention thus obtained include DNA having a base sequence in which the base at position 5, 1366 from the end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is replaced with guanine by adenine. it can.
  • the DNA is a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the amino acid residue at position 456 from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been substituted with a glycine residue for a L-aspartic acid residue. This is the DNA to code.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared as necessary, and the DNA fragment is downstream of a promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant can be produced by introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector.
  • the polypeptide of the present invention can also be efficiently produced by preparing a DNA in which the nucleotide sequence of the DNA fragment is substituted with a base so that the codon is optimal for expression in a host cell.
  • any bacteria or yeast capable of expressing the target gene can be used.
  • An expression vector that can be replicated autonomously in the above-described host cell or that can be integrated into a chromosome, and that contains a promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be transcribed is used.
  • a recombinant vector comprising DNA is capable of autonomous replication in prokaryotes, as well as a promoter, ribosome It is preferable that the vector is composed of a binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. A gene that controls the promotion may be included.
  • expression vectors include, for example, pBTrp2, pBTacls pBTac2 (both commercially available from Mannheim), PKK233- 2 1 ⁇ 13 ⁇ 4 (manufactured by ⁇ &) 3 £ 280 (11 ⁇ 1: 1 ⁇ 611) PGEMEX-1 (made by Promega), pQE-8 (made by QIAGE), KYPIO (JP-A-58-110600), pKYP200 CAgric. Biol. Chem., 48, 669 (return)), LSAl CAgric Biol. Chem., 53, 277. (1989)), pGELl (Proc. Natl.Acad.Sci.
  • the promoter may be any promoter that functions in the host cell.
  • Promo One Night Ptrp
  • P L Promo One Night P B 7 Lomo One
  • T7 Promo One etc.
  • Promoted Ones which are artificially designed and modified, such as Promoted Ones (PiffiX 2), Tac Promos One, LacT7 Promos Ones, MI Promos Ones, etc. be able to.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a liposomal binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange a transcription termination sequence immediately below a structural gene.
  • Host cells include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterim, Microbacterimn, and Pseudomonas.
  • Microorganisms belonging to the genus and the like for example, Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli thigh, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli , Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli GI698, Escherichia coli TB1, Serratia ficaria s Serratia fonticola ⁇ Serratia liquefaciens s Serratia marcescens s Bacillus subtilis, Bacillus am
  • microorganisms belonging to coryneform bacteria such as Corynebacterium acetoac idophilum, Corynebacterium acetofflutafflicum, Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamic ⁇ Corynebacterium lactof eraentum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium, Corynebacterium, Corynebacterium, Corynebacterium, Corynebacterium, Corynebacterium, Corynebacterium, Corynebacterium, Corynebacterium ⁇ ⁇ It is preferable to use Brevibacterium thioffenitalis, Microbacterium a.
  • Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium callunae ATCC 15991, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13060, Corynebacterium glutamicum ATCC 13bacium, formerly of the genus Corynebacterium glutamicum ATCC 13826 Former genus Brevibacterium divaricatum), Corynebacterium glutamicmn ATCC 13869 (former genus Brevibacterium lactof ermentum) ⁇ Corynebacterium herculis ATCC 13868, Corynebacterium lilium ATCC 15990, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium ATCC 9CC, 9CCCC9, ATCC 9244 It is preferable to use saccharolyticum ATCC 14066, Brevi
  • the host cell is a genus of Corynebacterium, Brevibacterium, or When the microorganism belongs to the genus Microbacterium, pCGl (JP-A-57-134500), pCG2 (JP-A-58-35197) can be used as a vector for producing a recombinant DNA containing the DNA of the present invention.
  • PCG4 JP 57-183799
  • pCGll JP 57-134500
  • pCG116, pCE54, pCB101 all JP 58-105999
  • pCE51, pCE52, pCE53 both Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)].
  • any method for introducing DNA into the above host cells can be used.
  • examples of expression vectors include YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • promoters for glucosylglycerol-based genes such as hexose kinase, PH05 Promoter, PGK Promoter 1, GAP promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ ⁇ promoter, CUP 1 promoter, etc. Can be.
  • Host cells include the genera Saccharomyces, Schizosaccnaromyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, and Pichia.
  • Microorganisms belonging to the genera (Pichia), Candida, etc. for example, Saccharomyces cerevisiae N Schizosaccharomyces pombe, Cluybeguchi Mrs. Lactice
  • any method can be used as long as it introduces DNA into yeast.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia and the like.
  • the cultivation period is usually 1 to 6 days. If necessary, an antibacterial substance such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culturing.
  • the method for producing the polypeptide of the present invention includes a method of producing it in a host cell, a method of secreting it out of the host cell, and a method of producing it on the host cell outer membrane.
  • the method can be selected by changing the structure of.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • a usual method for isolating and purifying an enzyme can be used.
  • the polypeptide of the present invention when expressed in a lysed state in cells, the cells are collected by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated with a sonicator, french press, Menton. The cells are disrupted with a Gaulin homogenizer, Dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation / purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Tylaminoethyl (DEAE) —an anion exchange chromatography method using a resin such as Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), and a positive method using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenylsepharose, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, chromatofocusing
  • a purified sample can be obtained by using a method such as electrophoresis such as isoelectric focusing or isoelectric focusing alone or in combination.
  • the cells When the polypeptide is expressed in an insoluble form in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to collect the insoluble polypeptide as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble form of the polypeptide is soluble with a protein denaturant.
  • the polypeptide is returned to a normal tertiary structure by diluting or dialyzing the lysate and reducing the concentration of the protein denaturant in the lysate. After this operation, a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide of the present invention or a derivative such as a polypeptide having a sugar chain added to the polypeptide is secreted extracellularly, the polypeptide or the polypeptide is secreted into the culture supernatant.
  • the derivative can be recovered. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. Obtainable.
  • polypeptide of the above-mentioned 3 [1] can be mentioned, and more specifically, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 at the N-terminal position A polypeptide in which a glycine residue is substituted with an aspartic acid residue.
  • microorganism of the present invention examples include a microorganism that produces the protein of the present invention as a sole isopropylmalate isomerase, and a microorganism that produces the protein of the present invention as a sole ISOM.
  • any microorganism may be used as long as it is a microorganism that produces the polypeptide of the present invention as the sole isopropyl malate isomerase or ISOM, but is preferably a microorganism belonging to a coryneform bacterium, more preferably Is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium, Brevipacterium or Microbacterium, more preferably Corynebacterium, glutamicum, etc.
  • the microorganism of the present invention can be obtained by using the DNA of the present invention to transform host cells according to a conventional method.
  • the DNA linked to the autonomously replicating plasmid of the present invention when used for the autonomously replicating plasmid, a microorganism that does not produce isopropylmalate iso, melanase or ISOM can be used as a host cell.
  • Microorganisms that do not produce isopropyl malate isomerase or ISOM can be obtained, for example, according to the method described in Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 566 (1992).
  • the microorganism of the present invention produces isopropylmalate isomerase or IS0M using a conventional mutation treatment method, gene replacement method using recombinant DNA technology, cell fusion method, or transduction method.
  • the DNA can be obtained by introducing a site-specific mutation into the DNA encoding wild-type isopropyl malate isomerase or IS0M on the chromosomal DNA of the microorganism to be mutated.
  • the site-specific mutation can be introduced according to the method described in Molecular 'Clothing Third Edition, Current Protocols' In' Molecular Biology, and the like.
  • the DNA of the present invention obtained by the method of the above [2] cannot be replicated autonomously in a host microorganism, and is resistant to antibiotics.
  • the recombinant plasmid is introduced into the host microorganism according to the method of [3]. Can be.
  • the recombinant plasmid cannot replicate autonomously in the host microorganism, selection by the resistance of the antibiotic present on the recombinant plasmid allows the recombinant plasmid to undergo homologous recombination of the Campbell type. Microorganisms integrated into chromosomes can be obtained.
  • the gene replacement on the chromosomal DNA can be performed by the above method, but the present invention is not limited to the above method, and any other gene replacement method can be used as long as the gene on the chromosome can be replaced.
  • Other methods for producing the transformant having the DNA of the present invention on the chromosomal DNA include a cell fusion method and a transduction method.
  • a cell fusion method for example, the method described in Amida Hiroshi et al., Amino Acid Fermentation, 1996, Gakkai Shuppan Center can be mentioned.
  • the L-amino acid is obtained by culturing the microorganism obtained in the above (1) in a medium, producing and accumulating L-amino acid in the culture, and collecting the L-amino acid from the culture. —You can get amino acids.
  • the method for culturing the microorganism is the same as the method for culturing the transformant of the above [3].
  • L-amino acid is isolated and purified from the culture solution obtained by removing precipitates such as bacterial cells by using a known method such as activated carbon treatment or ion exchange resin treatment. Can be.
  • the L-amino acid that can be produced by the present invention is not particularly limited as long as it is L-amino acid, but is preferably L-lysine, L-threonine, L-glutamine, L-arginine, L-proline, L-tryptophan, Glycine, L-alanine, L-glutamic acid, L-asparagine, L-aspartic acid, L-methionine, L-va Phosphorus, L-leucine, L-isoleucine, L-cystine, L-phenylalanine, L-serine, L-histidine, L-tyrosine, L-ortinine, more preferably L-lysine, L-threonine., L -Glutamine, L-arginine, L-proline, L-tributophane, L-isoleucine, L-orutin, more preferably L-lysine, L-threonine, L-glutamine, L-arg
  • DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence in which the glycine residue at position 456 from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been substituted with an aspartic acid residue (Gly456Asp) was used for PCR.
  • the chromosomal DNA of the wild type strain ATCC13032 of Corynebacterium 'glutamicum' was prepared according to the method of Saito et al., CBiochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963) ⁇ .
  • PCR was carried out using Pfu turbo DNA polymerase (manufactured by Stratagene), an attached buffer and a primer described later.
  • Primers used for PCR are based on the known nucleotide sequence information of the ISOM gene derived from Corynebacterium glutamicum (EP 1108790), and the region encoding 1 S0M in the I301 gene (SEQ ID NO: In the amino acid sequence encoded by the region (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) in the 456th glycine residue from the N-terminal In the region consisting of 21 bases (corresponding to the 1359th to 380th positions of SEQ ID NO: 3) including the region (ggc), a codon coding for the glycine residue is replaced with an aspartic acid residue.
  • a DNA fragment consisting of a nucleotide sequence (DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5) replaced with a codon (gac) encoding the same, and a nucleotide represented by SEQ ID NO: 6 which is a complementary sequence thereof DNA consisting of the sequence was synthesized according to a conventional method.
  • Each DNA fragment having a nucleotide sequence was used as a set of primers, and the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was used as type III.
  • Pfu turbo DNA polymerase manufactured by Straugene
  • the attached buffer were used. Each of the two types of PCR was performed.
  • Amplification products of about 1.4 kb and about 0.6 kb obtained by PCR (a DNA fragment corresponding to the 1st to 1380th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and an I SOM gene from the 1360th base sequence) DNA fragment corresponding to the nucleotide sequence downstream of the C-terminal) was subjected to agarose gel electrophoresis, and extracted and purified using a GENECLEA Kit (manufactured by BIO 101). Further, both purified products were type III, and PCR was performed using a DNA fragment consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a DNA fragment consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 as primer sets.
  • pESB30 is a 2.6 kb IDNA fragment containing a bacterium subtilis-derived repansucrase gene ⁇ B at the I cleavage site of the vector pHSG299 CGene, 61, 63 (1987) having a kanamycin resistance gene (Mol. Microbiol. , 6, 1195 (1992)].
  • the strain was used in an LB agar medium containing 20 g / ml kanamycin [Pactotripton (manufactured by Difco) 10 g, yeast extract (manufactured by Difco) 5 g, sodium salt of sodium salt 10 g, pactagaichi (manufactured by Difco) A culture medium containing 16 g in 1 L of water and adjusted to pH 7.0] was used to select a transformant. The transformant was cultured overnight in an LB medium containing 20 zg / ml of kanamycin, and a plasmid was prepared from the resulting culture by the Arikari SDS method (Molecular 'Cloning Third Edition).
  • Corynepacterium glutamicum ATCC 21660 was used as an L-threonine producing bacterium.
  • the ATCC 21660 strain is a methionine auxotrophic mutation, a mutant amino-hydroxyhydroxyvaleric acid (AHV), and a mutant resistant to S- (2-aminoethyl) -cysteine (AEC) from the wild-type strain of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.
  • CAgr. Biol. Chem., 36, 1611 (1972) which is a mutant strain obtained by inducing a mutation.
  • the THC-15 strain and the parent ATCC 21660 strain were cultured on BYG agar medium at 30 ° C for 24 hours, and 10 ml of a seed medium (20 g of glucose, 10 g of peptone, 10 g of yeast extract, and 2.5 g of sodium chloride were added to water).
  • the medium was inoculated into a thick test tube containing 1 L of a medium adjusted to pH 7.4) and cultured at 30 ° C for 24 hours.
  • 1 ml of the seed culture was added to 10 ml of the main culture medium (glucose 100 g, corn steep liquor 5 g, ammonium sulfate 20 g, hydrogen phosphate monobasic.
  • Example 2 Using pCleuC456 created in Example 1, the same gene replacement method as in Example 2 was used.
  • ATCC 14752 As a L-glucamine-producing bacterium, ATCC 14752, a wild-type strain of Corynebacterium gulp Mikum, was used.
  • a primer set consisting of DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 was used.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 1.
  • the nucleotide sequence of the obtained PCR product was determined by a conventional method, and it was confirmed that the ASL-7 strain having the Gly456Asp mutation in the ISOM gene could be obtained.
  • the ASL-7 strain and the parent strain ATCC 14752 were cultured on a BYG agar medium at 28 ° C for 24 hours.
  • This cultured cell 1 platinum was added to 20 ml of a production medium (glucose 150 g, ammonium chloride 50 g, potassium monohydrogen phosphate 0.7 g, potassium dihydrogen phosphate 0.7 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g, iron sulfate 7).
  • the ASL-7 strain having the DNA of the present invention showed little difference in the growth level, but the production efficiency of L-glutamine was improved as compared with the parent strain ATCC 14752.
  • Corynebacterium glutamicum FERM P-3616 strain was used as an L-arginine producing bacterium.
  • the FERM P-3616 strain was obtained from a wild strain of Corynebacterium gulp micam by inducing D-serine-sensitive mutation, D-arginine-resistant mutation, arginine-hydroxamate-resistant mutation, and 6-azaduracil-resistant mutation The mutant strain was identified (Japanese Patent Laid-Open No. 1-257486).
  • the seed culture was added to 20 ml of the main culture medium [molasses (in terms of glucose) i50 g, corn steep liquor 5 g, ammonium sulfate 30 g, urea 3 g, 0.5 g of potassium monohydrogen phosphate, 0.5 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.25 g of magnesium sulfate dihydrate in 1 L of water, adjust to ⁇ 7.2, and add a medium containing 30 g of calcium carbonate.
  • the flask was inoculated and cultured at 30 ° C for 72 hours.
  • the cells were removed from the culture by centrifugation, and the amount of L-arginine accumulated in the supernatant was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 4.
  • the AUL-6 strain having the DNA of the present invention shows little difference in the growth level, but the production efficiency of L-arginine is improved as compared with the parent strain FERM P-3616. Was.
  • the Gly456Asp mutation was introduced into the ISOM gene of the L-proline producing bacterium.
  • Corynebacterium glutamicum NRRL B-15511 strain was used as an L-proline producing bacterium.
  • NRRL B-15511 strain was derived from a wild strain of Corynebacterium glutamicum.
  • a DNA fragment consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a DNA fragment consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 were used as primer sets.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 1.
  • the nucleotide sequence of the obtained PCR product was determined by a conventional method, and it was confirmed that the MGL-5 strain having the Gly456Asp mutation in the ISOM gene could be obtained.
  • MGL-5 strain and parent strain NL B-15511 were cultured on BYG agar medium at 30 ° C for 24 hours, and 6 ml of seed medium (glucose 10 g, meat extract 5 g, peptone 10 g, yeast extract 3 g, sodium chloride Medium test tube containing 3g in 1L of water and adjusted to pH 7.2) And cultured at 30 ° C. for 24 hours.
  • the seed culture was added to 20 ml of the main culture medium (100 g of glucose, 20 g of colony plican, 10 g of ammonium sulfate, 3 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g of magnesium sulfate heptahydrate, 0.5 g of iron sulfate 7 10 mg of hydrate, 10 mg of nicotinic acid, 0.1 g of thiamine hydrochloride, 0.1 g of biotin, 20 g of sodium L-glutamate in 1 L of water, adjusted to ⁇ 7.4, and added 30 g of calcium carbonate)
  • the flask was inoculated into a 300 ml Erlenmeyer flask and cultured at 32 ° C for 96 hours.
  • the cells were removed from the culture by centrifugation, and the amount of L-proline accumulated in the supernatant was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). Table 5 shows the results.
  • Example 2 Using pCleuC456 constructed in Example 1, a Gly456Asp mutation was introduced into the ISOM gene of an L-tryptophan-producing bacterium by the same gene replacement method as in Example 2.
  • Corynebacterium glutamicum FERM BP-1777 strain was used as an L-tributophan-producing bacterium.
  • the BP-1777 strain is derived from a wild-type strain of Corynepacterium glutamicum, which requires mutations for L-phenylalanine and L-tyrosine, resistance mutations to various aromatic amino acids, and sensitivity mutations to 3-promopyruvic acid. This is a mutant strain obtained by inducing the above (Japanese Patent No. 2578488).
  • a DNA fragment consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: ⁇ and a DNA fragment consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 as a primer set PCR was performed in the same manner as in 1.
  • the nucleotide sequence of the obtained PCR product was determined by a conventional method, and it was confirmed that a BPL-31 strain having a Gly456Asp mutation in the ISOM gene could be obtained.
  • the modified isopropyl malate isomerase or ISOM and DNA encoding them are obtained, and by using a microorganism having the DNA, it is possible to efficiently produce L-amino acid. it can.

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Description

明 細 書
変異型ィソプロピルリンゴ酸ィソメラーゼ
技術分野
本発明は、 新規なポリペプチド、 該ポリペプチドをコードする D NA、 該 D NA を含有する組換え体 D NA、該組換え体 D NAで形質転換された微生物、 該 D NA を染色体 D N A上に有する微生物、およぴ該微生物を培地に培養することを特徴と する L一アミノ酸の製造法に関する。
背景技術
ィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼは、ロイシン合成経路上の 2—ィソプロピル リンゴ酸を 3—イソプロピルリンゴ酸に変換する反応を触媒する酵素である。
またィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼ ·ラージサブュニット （以下、 I S〇M と称す） は、 ィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼ ·スモールサブュニヅトと複合体 を形成し、イソプロピルリンゴ酸イソメラ一ゼを構成しているポリべプチドである 近年、ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli)やバチルス ·サチリス (Bacillus subtilis)等、種々の微生物で全ゲノム配列が解読され〔Science, 277, 1453 (1997)、 Nature, 390, 249 (1997)〕、 I S O Mをコードする D N Aの塩基配列も明らかにな つている。
コリネバクテリウム属に属する微生物については、 コリネバクテリゥム■グル夕 ミカムにおいて、ゲノム配列情報から I S O Mをコードする遺伝子が予測され、 そ の塩基配列が報告されている (W0 01/00843、 EP 1108790)。
一方、 コリネバクテリウム ·グノレタミカム (Corynebacterium glutamicum) のリ ジン生産菌において、 I S O Mを欠損したロイシン要求株が取得されている〔Appl. Microbiol. Biotechnol. , 37, 566( 1992)〕。 同文献において、 このロイシン要求株 は、 ロイシンをある濃度で添加した培地で培養すると、生育レベルが適度に抑制さ れてリジン蓄積量が増加することが報告されている。
また、ロイシン合成経路上の別の酵素であるイソプロピルリンゴ酸シン夕ーゼを 欠損させたコリネバクテリゥム ·グルタミカムのリジン生産菌を用いて、 ロイシン 要求性とリジン生産との関連が調べられており、 ロイシンの培地への添加量を制限 して培養するとリジン蓄積量が増加するのは、生育レベルが抑制されるためである 可能性が最も高いと報告されている〔Appl. Environ. Microbiol. , 60, 133 (薦 )〕。 しかし、 これまでに、 I S O Mをコードする D NAに変異を導入することによつ て、生産培地にロイシンを添加することなく、 かつ生育レベルにも有意な変化をも たらさずに、 L—リジンの生産性を向上させることができることは知られていない c さらに、 I S O Mの変異によって L—リジンだけでなく他の多くの L—アミノ酸の 生産性を向上させることができること、および I S O Mをコードする D NAにどの ような変異を導入すれば前記効果が得られるかについて記載および示唆した報告 もない。
発明の開示
本発明の目的は、微生物を用いた効率的な L—アミノ酸の製造法を提供すること にある。 - 本発明者らは、本発明の変異型ィソプロピルリンゴ酸ィソメラーゼを発現する微 生物は、 ロイシンを培地に添加しなくとも、 野生型イソプロピルリンゴ酸イソメラ ーゼを発現する微生物に比べ、有意に高い L—アミノ酸の生産性を示すことを見い だし、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明は以下の （1 ) 〜 （2 8 ) に関する。
( 1 )コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプロピルリンゴ酸ィソメラーゼのァ ミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸 配列を有し、かつ該ァミノ酸配列を有するポリぺプチドを唯一のィソプロピルリン ゴ酸ィソメラ一ゼとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的口イシ ン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
( 2 )ポリぺプチドが、 ィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼを構成するィソプロピ ルリンゴ酸イソメラ一ゼ .ラージサブユニット （以下、 I S OMと略す） のァミノ 酸配列おいて、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を 有することを特徴とする上記 （1 ) のポリペプチド。
( 3 ) コリネ型細菌に属する微生物由来の I S OMのアミノ酸配列において、 1以 上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ該ァミノ 酸配列を唯一の I S 0Mとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的 ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。 (4)コリネ型細菌に属する微生物由来の I SOMのアミノ酸配列において、 配列 番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 456番目のアミノ酸に相応する位 置のアミノ酸残基がグリシン残基以外のァミノ酸残基であるアミノ酸配列を有す るポリペプチド。
(5)グリシン残基以外のアミノ酸残基が L—ァラニン、 L—パリン、 L一口イシ ン、 L一イソロイシン、 L—メチォニン、 L—トリプトファン、 L—フエ二ルァラ ニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L—アルギニン、 L—ァスパ ラギン酸および L—グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基である上記（4)のポ リぺプチド。
( 6 )グリシン残基以外のァミノ酸残基が Lーァスパラギン酸または Lーグルタミ ン酸である上記 （4) のポリペプチド。
(7)コリネ型細菌に属する微生物が、 コリネバクテリウム属、 ブレビバクテリウ ム属またはマイコバクテリゥム属に属する微生物である上記 （1)〜 （6)のいず れか 1つに記載のポリぺプチド。
( 8 )配列番号 1で表されるァミノ酸配列の N末端から 456番目のァミノ酸残基 がグリシン残基以外のアミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を有するポリぺプ チド。
(9)グリシン残基以外のアミノ酸残基が L—ァラニン、 L—パリン、 L—口イシ ン、 L—イソロイシン、 L—メチォニン、 L一トリプトファン、 L—フエ二ルァラ ニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L一アルギニン、 L—ァスパ ラギン酸および L—グルタミン酸から選ばれるァミノ酸残基である上記（ 8 )のポ リペプチド。
(10)グリシン残基以外のアミノ酸残基が L—ァスパラギン酸または L一グル夕 ミン酸である上記 （8) のポリペプチド。
(11)上記 （4)〜 （10)のいずれか 1つに記載のポリペプチドのアミノ酸配 列において、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 456番目のァミノ 酸に相応する位置のアミノ酸残基以外の 1以上のアミノ酸が欠失若しくは置換さ れたァミノ酸配列を有し、かつ該ァミノ酸配列を有するポリぺプチドを唯一の I S OMどして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示 すことを特徴とするポリペプチド。
(12)上記（4)〜 （11)のいずれか 1つに記載のポリペプチドのアミノ酸配 列において、 1以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ該アミノ酸 配列を有するポリぺプチドを唯一の I S 0 Mとして生産するコリネ型細菌が、最少 培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリべプチド。
(13)上記（1)〜 （12)のいずれか 1つに記載のポリペプチドをコードする DNA。
( 14)コリネ型細菌に属する微生物由来の I S OMをコードする DN Aの塩基配 列において、配列番号 3で表される塩基配列の 55末端から 1366〜1368番 目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコ ドンである塩基配列を有する DNA。
(15) グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 L—ァラニン、 Lーバリン、 L—ロイシン、 L fソロイシン、 L一メチォニン、 L—トリプトフ アン、 L—フエ二ルァラニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L— アルギニン、 L—ァスパラギン酸おょぴ L—グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残 基をコードするコドンである上記 ( 14) の DNA。
(16)グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 Lーァスパラギ ン酸または L—グルタミン酸をコードするコドンである上記 （14)の DNA。
(17)コリネ型細菌に属する微生物が、 コリネバクテリウム属、 ブレビパクテリ ゥム属、 またはマイコバクテリゥム属に属する微生物である上記（ 14)〜（16) のいずれか 1つに記載の DNA。
(18)配列番号 3で表される塩基配列の 5，末端から 1366〜 1368番目の 塩基配列がグリシン残基以外のァミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列 を有する DNA。 ·
(19) グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 L—ァラニン、 Lーバリン、 L—ロイシン、 L fソロイシン、 L—メチォニン、 L—トリプトフ アン、 L—フエ二ルァラニン、 L—プロリン、 L一リジン、 L—ヒスチジン、 L— アルギニン、 Lーァスパラギン酸および L—グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残 基をコードするコドンである上記 （18) の DNA。 (20)グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 Lーァスパラギ ン酸または L—グルタミン酸をコードするコドンである上記 （18) の DNA。
(21)配列番号 3で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとスト リンジェントな条件下でハイプリダイズする、 配列番号 3で表される塩基配列の 55末端から 1366〜 1368番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以 外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有する DNAであり、かつ 該 DNAにコードされるポリべプチドを唯一の I S OMとして生産するコリネ型 細菌が、 最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とする DNA。
(22)上記 （13)〜 （21)のいずれか 1つに記載の DN Aを含む組換え体 D NA。
(23)上記 （22) の組換え体 DN Aで形質転換された微生物。
(24)染色体 DN A上に上記 （ 13) ~ (21)のいずれか 1つに記載の D N A を含有する微生物。
(25)微生物が、 コリネバクテリウム属、 プレビパクテリゥム属またはミクロバ クテリウム属に属する微生物である上記 （23) または （24) の微生物。
(26)コリネバクテリウム属に属する微生物が、 コリネバクテリウム ·グル夕ミ カムである上記 （25)の微生物。
(27)上記 （23) 〜 （26) のいずれか 1つに記載の微生物を培地に培養し、 培養物中に Lーァミノ酸を生成蓄積させ、該培養物から L—ァミノ酸を採取するこ とを特徴とする、 L—アミノ酸の製造法。
(28) L—アミノ酸が、 L—リジン、 L—スレオニン、 L—グルタミン、 L—ァ ルギニン、 L—プロリンおよび L—トリプトファンからなる群より選ばれるァミノ 酸である上記 （27) の製造法。
[1]本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドとしては、 例えば
(i) コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプロピルリンゴ酸イソメラ一ゼのァ ミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸 配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリぺプチドを唯一のイソプロピルリン ゴ酸イソメラ一ゼとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的口イシ ン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド
( ii)ポリぺプチドが、 ィソプロピルリンゴ酸ィソメラーゼを構成するイ プロピ ルリンゴ酸イソメラ一ゼ 'ラージサブュニヅト （以下、 I S O Mと略す） のァミノ 酸配列おいて、 1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を 有することを特徴とする上記 （i ) のポリペプチド
( iii) コリネ型細菌に属する微生物由来の I S O Mのアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ該アミ ノ酸配列を唯一の I S O Mとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分 的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリぺプチド
(iv)コリネ型細菌に属する微生物由来の I S O Mのアミノ酸配列において、配列 番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 4 5 6番目のアミノ酸に相応する位 置のアミノ酸残基がグリシン残基以外のァミノ酸残基であるアミノ酸配列を有す るポリペプチド
(V) グリシン残基以外のアミノ酸残基が L—ァラニン、 Lーバリン、 L—口イシ ン、 L一イソロイシン、 L—メチォニン、 L—トリプトファン、 L—フエ二ルァラ ニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L—アルギニン、 L—ァスパ ラギン酸および L—グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基である上記（iv)のポ リぺプチド
( vi )グリシン残基以外のァミノ酸残基が L—ァスパラギン酸または L—グルタミ ン酸である上記 （iv) のポリペプチド
(vii) コリネ型細菌に属する微生物が、 コリネバクテリウム属、 ブレビパクテリ ゥム属またはマイコバクテリゥム属に属する微生物である上記 （i) 〜 （vi ) のい ずれか 1項に記載のポリぺプチド
(vii i)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 4 5 6番目のアミノ酸残 基がグリシン残基以外のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を有するポリべ プチド
(ix) グリシン残基以外のアミノ酸残基が L—ァラニン、 L—ノ リン、 L—口イシ ン、 L—イソロイシン、 L—メチォニン、 L—トリプトファン、 L—フエ二ルァラ ニン、 L一プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L一アルギニン、 L—ァスパ ラギン酸および L—グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基である上記（viii)の ポリべプチド
(X) グリシン残基以外のァミノ酸残基が L—ァスパラギン酸または L—グルタミ ン酸である上記 （viii) のポリペプチド
(xi) 上記 （iv) 〜 （X) のいずれか 1項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列に おいて、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 4 5 6番目のアミノ酸に 相応する位置のアミノ酸残基以外の 1以上のアミノ酸が欠失若しくは置換された ァミノ酸配列を有し、かつ該ァミノ酸配列を有するポリぺプチドを唯一の I S 0 M として生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すこ とを特徴とするポリペプチド
(xii) 上記（iv)〜 （xi) のいずれか 1つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列に おいて、 1以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ該アミノ酸配列 を有するポリぺプチドを唯一の I S O Mとして生産するコリネ型細菌が、最少培地 において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド
をあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼとして は、 Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8, 599 (1974)に定義され ているコ リ ネ型細菌に属する微生物である、 コ リ ネパクテ リ ゥム (Corynebacterium)属、 ブレビバクテリウム (Brevibacterium) 属、 またはミク ロバクテリウム (Microbacterium)属に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸 イソメラーゼをあげることができ、 ί列えば Corynebacterium acetoacidophil皿、 Corynebacterium acetoglutamiciun、 Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicmik Corynebacterium herculis、 Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecol Corynebacterium thermoaminogenes 、 Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium i腿 ariophilum、 Brevibacteriu roseum、 Brevibacterium thiogenitaliss Microbacterium ammoniaphilmn等の微生物由来の イソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼをあげることができる。
上記コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼは、 配列番号 3若しくは配列番号 4で表される塩基配列を有する D N Aの相補鎖、また は該 D NAの一部からなる D NAの相補鎖をプローブとして用い、後述するハイプ リダィゼ一シヨンにより、 または、配列番号 3若しくは配列番号 4で表される塩基 配列から設計できるプライマ一 D NAを用い、上記コリネ型細菌の染色体 D NAを 鎵型とした P C Rにより取得することができるィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一 ゼをコードする D N Aを用いて、 常法により取得することができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼとして は、 例えば EP 1108790に記載されている、 配列番号 1および配列番号 2で表され るァミノ酸配列からなるポリペプチドより構成されるイソプロピルリンゴ酸ィソ メラ一ゼをあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプ口ピルリンゴ酸イソメラ一ゼのアミ ノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配 列を有するポリぺプチドとしては、ィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼのスモール サブュニットおよびィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼのラージサブュニット （ I S O M)のアミノ酸配列の両方、 またはどちらか一方のサブュニヅトのアミノ酸配' 列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有す るポリペプチドをあげることができるが、好ましくは I S 0 Mのァミノ酸配列にお いて、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポ リペプチドをあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラ一ゼのスモ —ルサブュニットおよび I S O Mのアミノ酸配列の両方またはどちらか一方のサ プユニットのアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加 されたアミノ酸配列を有するサブュニヅトは、該スモールサブュニッ トおよび I S O Mをコードする D N Aの両方また.はどちらか一方の D N A、例えば配列番号 1お よび 2で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチドをコードする D N Aの両方 またはどちらか一方の D N Aに、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (以下、 モレキュラー · クロ一ニング第 3版と略す)、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー ' ノ ィォロジ一と略す）、 Nucleic Acids Research, 10， 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982 )s Gene, 3 , 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異 的変異導入法を用いて部位特異的変異を導入することにより、取得することができ る o
欠失、 置換若しくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、 上記の部位 特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数であり、 1個から数十個、 好ましくは 1〜2 0個、 より好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ま しくは 1〜5個である。
また、 1以上のアミノ酸残基が欠失、 置換若しくは付加されたとは、 同一配列中 の任意の位置において、 1または複数のアミノ酸残基の欠失、 置換若しくは付加が あることを意味し、 欠失、 置換若しくは付加が同時に生じてもよく、 置換または付 加されるァミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わないが、天然型ァミノ酸残基で あることが好ましい。天然型アミノ酸残基としては、 Lーァラニン、 L—ァスパラ ギン、 L—ァスパラギン酸、 L—グルタミン、 L—グルタミン酸、 グリシン、 L— ヒスチジン、 L一イソロイシン、 L一口イシン、 L一リジン、 L—メチォニン、 L —フエ二ルァラニン、 L一プロリン、 Lーセリン、 L—スレオニン、 L一トリプト ファン、 Lーチロシン、 Lーバリン、 L—システィンなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。 同一群に含まれるアミノ酸 残基は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、 イソロイシン、 ノルロイシン、パリン、 ノルバリン、 ァラニン、 2-アミノブタン酸、 メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチル ァラニン、 シクロへキシルァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノアジピン酸、 2-ァミノスベリン酸
C群：ァスパラギン、 グルタミン
D群： リジン、 アルギニン、 オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノ プロピオン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、 スレオニン、 ホモセリン G群：フエ二ルァラニン、 チロシン
上記（1 )の本発明のポリペプチドがイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして の活性を有するためには、配列番号 1および 2で表されるァミノ酸配列との相同性 が、 少なくとも 6 0 %以上、 通常は 8 0 %以上、 特に 9 5 %以上の相同性を有して いることが好ましい。
ァミノ酸配列および塩基配列の相同性は、 例えば Karl in and Altschulによるァ ルゴリズム BLAST CPro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)〕や FASTA (Methods Enzymol.， 183, 63 (1990)〕 を用いて決定することができる。 このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLASTNや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている〔 J. Mol . Biol. , 215, 403(1990)〕。 BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場 合には、 パラメ一夕一は例えば Score = 100、 wordlength=12とする。 また、 BLAST に基づいて BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、 パラメ一夕一は例 えば score=50、 ordlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用い る場合には、各プログラムのデフォルトパラメ一夕一を用いる。 これらの解析方法 の具体的な手法は公知である （http：〃 www.ncbi.nlm.nih. gov. )。
コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのアミ ノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配 列を有するポリペプチドを唯一のィソプ口ピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産 するコリネ型細菌は、上記方法により取得することができるポリぺプチドをコード する D N Aを用いて、野生型ィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼを生産するコリネ 型細菌を形質転換し、上記方法により取得することができるポリぺプチドをコード する D N Aと該野生型ィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼをコ一ドする D NAと を相同組換え技術を用いて置換することにより取得できる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプロピルリンゴ酸ィソメラーゼのアミ ノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列を有するポリペプチドを唯一のィソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産 するコリネ型細菌が、 最少培地において部分的ロイシン要求性を示すとは、 該コリ ネ型細菌を最少培地を用いて培養したとき、生育は認められるが、.その生育速度は 野生型ィソプロピルリンゴ酸ィソメラーゼを生産する該コリネ型細菌を該最少培 地で培養したときの生育速度より遅く、該生育速度はロイシンを適量添加すること で回復することを意味する。
本明細書において、 野生型イソプロ,ピルリンゴ酸イソメラ一ゼとは、 最少培地で 培養したときにロイシン要求性を示さないコリネ型細菌に属する微生物が有する イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのことをいい、好ましくは口イシン要求性を示 さない野生型株が有するイソプロピルリンゴ酸イソメラ一ゼのことをいう。野生型 株とは、 自然集団中で、 その微生物が属する種において、 最も高頻度に見られる型 の微生物のことをいい、コリネ型細菌に属する微生物の野生型株としては、例えば、
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、 Corynebacterium acetog丄 utamicum ATCC15806、 Corynebacterium callunae ATCC15991、 Corynebacterium glutamicum ATCC13032、 Corynebacterium glutamicum ATCC13060、 Corynebacterium glutamicum ATCC13826 (旧属種 Brevibacterium flavum、 あ るいは Corynebacterium lactofermentiun)N Corynebacterium glutamic ATCC1402Q (旧属種 Brevibacterium divaricatum)ヽ Corynebacterium glutamicum ATCC13869 (旧属種 Brevibacterium lactofermentum)、 Corynebacterium herculis ATCC13868、 Corynebacterium 1 ilium ATCC15990 、 Corynebacterium melassecola ATCC17965 ヽ Corynebacterium thermoaminogenes ATCC9244、 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、 Brevibacterium immariophilum ATCC14068、 Brevibacterium roseum ATCC13825、 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354などをあげることができる。
本明細書において、 最少培地とは、 コリネ型細菌に属する微生物が栄養要求性を 示す菌株である場合には、該栄養要求性物質を添加した培地を含むものである。た だし、 該栄養要求性物質にはロイシンは含まれない。
上記した部分的ロイシン要求性を示すとは、具体的には、 上記の方法で得られる コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプロピルリンゴ酸ィソメラーゼのアミノ 酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列 を有するポリペプチドをコードする D N Aを用いて、 コリネバクテリゥム グル夕 ミカムの野生型株 ATCC 13032を形質転換し、 相同組換え技術によって該 D N Aと 野生型ィソプ口ビルリンゴ酸ィソメラ一ゼをコードする D N Aとを置換したとき に得られる変異株が以下のような性質を示すことを意味する。
すなわち、最少寒天培地〔1% グルコース、 0.4%塩化アンモニゥム、 0.2%尿素、 0.1% リン酸二水素カリウム、 0.3% リン酸水素二カリウム、 0.04%硫酸マグネシゥ ム、 10mg/L硫酸鉄、 lmg/L硫酸マンガ 5mg/L ニコチン酸、 100〃g/L ピオチン、 5mg/Lチアミン塩酸塩、 1.6%バクトァガー （Difco)、 pH7.2〕上に、 該変異株およ び野生株 ATCC 13032を、 各々 1〜10 cells/ctfになるように塗布して 30。Cで 2〜3 日間培養したとき、該変異株は、そのコロニーの直径が ATCC 13032の 9 0 %以下、 好ましくは 8 0 %以下、 より好ましくは 7 0 %以下、 さらに好ましくは 5 0 %以下 であり、 かつ目視で充分に認識できるコロニー （コロニーの直径が 0.1舰以上） を形成する。該変異株を、 50mg/Lのロイシンを含む最少培地に塗布して同様に 30°C で 2〜3日間培養したときには、 野生型株 ATCC 13032と同等の大きさのコロニーを 形成する。
上記性質を有する上記 （i) の本発明のポリペプチドを、 唯一のイソプロピルリ ンゴ酸イソメラ一ゼとして生産するコリネ型細菌は、アミノ酸発酵に用いる通常の 生産培地において、 ロイシンを添カ卩しなくても、 野生型イソプロピルリンゴ酸イソ メラーゼを生産するコリネ型細菌と同等の生育を示す。該生産培地の組成は生産す るアミノ酸により異なるが、一般に、ァミノ酸発酵では菌の生育を促進するために、 夕ミン類等の栄養源や窒素源としてコーンスティープリカーや大豆加水分解物 などの安価な天然物を最少培地に加えた培地が用いられる。該天然物にはロイシン が微量含まれているので、 上記 （i) の本発明のポリペプチドを唯一のイソプロピ ルリンゴ酸ィソメラーゼとして生産するコリネ型細菌が呈する部分的ロイシン要 求性は相補される。
上記 (ii) の本発明のポリペプチドは、 上記 （i) の本発明のポリペプチドのう ち、 I S OMに変異を有するポリペプチドであるので、 上記と同様の方法により取 得することができる。
上記 (iii) の本発明のポリペプチドは、 上記 (i) と同様の方法により取得する ことができる。
すなわち、 コリネ型細菌に属する微生物由来の I S O Mをコ一ドするD NAに、 上記した部位特異的変位導入法により変異を導入することにより、コリネ型細菌に 属する微生物由来の I S O Mのアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする D N A を取得することができる。
上記方法によって得られるポリペプチドが上記 （iii) の本発明のポリペプチド であることは、該ポリペプチドをコードする D N A用いて、 野生型 I S O Mを生産 するコリネ型細菌を形質転換し、該 D N Aと該野生型 I S O Mをコードする D N A とを相同組換え技術により置換させることにより得られるコリネ型細菌が、最少培 地において上記した部分的ロイシン要求性を示すことにより確認することができ る。
上記（iv)の本発明のポリペプチドについて、 コリネ型細菌に属する微生物由来 の I S O Mにおいて、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 4 5 6番目 のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基とは、コリネ型細菌由来の I S O Mが有 するアミノ酸配列と配列番号 1で表されるァミノ酸配列との相同性を上記した BLASTおよび FASTAなどの相同性解析プログラムを用いて計算し、 両ァミノ酸配列 の相同性が最も高くなるように該ァミノ酸配列同士を重ね合わせたとき、該コリネ 型細菌由来の I S O Mが有するアミノ酸配列上で、配列番号 1で表されるアミノ酸 配列の N末端から 4 5 6番目のアミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基をい
Ό o
グリシン残基以外のァミノ酸残基としては、グリシン残基以外のァミノ酸残基で あればいずれのアミノ酸であってもよいが、好ましくは L—ァラニン、 L—バリン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン、 L—メチォニン、 L—トリプトファン、 Lーフ ェニルァラニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L—アレギニン、 L—ァスパラギン酸および L—グルタミン酸残基から選ばれるァミノ酸残基であ り、 より好ましくは L—ァスパラギン酸および L一グルタミン酸残基、 さらに好ま しくは L—ァスパラギン酸残基をあげることができる。
上記 （iv) 〜 （vii) のポリペプチドは、 コリネ型細菌に属する微生物由来の I S O Mをコードする D N Aにおいて、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端 から 4 5 6番目のグリシン残基に相応するアミノ酸残 ¾をコードするコドンを、上 記した部位特異的変異導入法を用いてグリシン残基以外のアミノ酸残基をコード するコドンに変えた D N Aを用いて取得することができる。
該変異 D NAが、 上記（iv)の本発明のポリペプチドをコードする D NAである ことは、該変異 D NAを用いて、 野生型 I S O Mを生産するコリネ型細菌を形質転 換し、該変異 D N Aと該野生型 I S O Mをコードする D NAとを相同組換え技術に より置換することにより得られる形質転換体が、上記した部分的口イシン要求性を 呈することをもって確認することができる。
上記 （viii) ~(x)の本発明のポリペプチドは、 配列番号 1で表されるアミノ酸 配列をコードする D NAを用いて、 N末端から 4 5 6番目の リシン残基をコード するコドンを、上記の部位特異的変異導入法によりグリシン残基以外のアミノ酸残 基をコードするコドンに変えることにより取得することができる。
グリシン残基以外のアミノ酸とは、 好ましくは Lーァラニン、 Lーバリン、 L— ロイシン、 L—イソロイシン、 L—メチォニン、 L一トリプトファン、 L—フエ二 ルァラニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L—アルギニン、 L— ァスパラギン酸および L—グル夕ミン酸残基から選ばれるアミノ酸残基であり、 よ り好ましくは Lーァスパラギン酸および L—グル夕ミン酸残基、さらに好ましくは L—ァスパラギン酸残基をあげることができる。
上記 （X) のポリペプチドは、 上記 （iv) 〜 （ix) のいずれかに記載の本発明の ポリペプチドをコードする D N Aに対して、上記部位特異的変異導入法を用いるこ とにより取得することができる。 導入する部位特異的変異は、 上記 （iv) 〜 （ix) のいずれかに記載の本発明のポリぺプチドにおいて、配列番号 1.で表されるァミノ 酸配列の N末端から 4 5 6番目に相応するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基につ いて、 欠失若しくは置換するのであれば、 どのような変異でもよい。
また、 上記 （iv) 〜 （ix) のいずれかに記載の本発明のポリペプチドを取得する 際に同時に、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 4 5 6番目に相応す るアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を、上記部位特異的変異導入法を用いて欠失若 しくは置換させることによつても上記 （X) のポリペプチドを取得することができ る o
欠失若しくは置換されるアミノ酸は、配列番号 1で表されるァミノ酸配列の N末 端から 4 5 6番目のアミノ酸に相応する位置のァミノ酸残基以外のァミノ酸残基 であれば特に限定されない。
上記で取得されるポリペプチドが上記 （X) の本発明のポリペプチドであること は、該ポリペプチドをコードする D N Aを用いて、 野生型 I S O Mを生産するコリ ネ型細菌を形質転換し、該 D N Aと該野生型 I S O Mをコードする D NAとを相同 組換え技術により置換することにより得られるコリネ型細菌が、上記した部分的口 ィシン要求性を呈することをもつて確認することができる。
上記 （xi) のポリペプチドは、 上記 （iv) 〜 （X) のいずれかに記載の本発明の ポリペプチドをコードする D N Aに上記部位特異的変異を導入することにより取 得することができる。
また上記 （iv) 〜 （X) のいずれかに記載の本発明のポリペプチドを取得する際 に同時に、配列番号 1で表されるァミノ酸配列に、上記部位特異的変異導入法を用 いてアミノ酸残基を付加することによつても取得することができる。
上記で取得されるポリペプチドが上記（xi)の本発明のポリペプチドであること は、該ポリペプチドをコードする D NAを用いて、野生型 I S O Mを生産するコリ ネ型細菌を形質転換し、該 D NAと該野生型 I S OMをコードする D NAとを相同 組換え技術により置換することにより得られるコリネ型細菌が、上記した部分的口 ィシン要求性を呈することをもつて確認することができる。
欠失、 置換若しくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位 特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数であり、 1個から数十個、 好ましくは 1〜2 0個、 より好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ま しくは 1〜5個である。
また、 1以上のアミノ酸残基が欠失、 置換若しくは付加されたとは、 同一配列中 の任意の位置において、 1または複数のアミノ酸残基の欠失、 置換若しくは付加が あることを意味し、 欠失、 置換若しくは付加が同時に生じてもよく、 置換若しくは 付加されるァミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない点、および置換可能なァ ミノ酸については、 上記と同様である。
上記 （X) または （xi) のポリペプチドが I S OMとしての活性を有するために は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列との相同性が、上記 BLASTや FASTA等を用 いて上記パラメ一夕一に基づいて計算したときに、 少なくとも 6 0 %以上、通常は 80%以上、 特に 95%以上の相同性を有していることが好ましい。
[2]本発明の DNA
本発明の DN Aとしては、 例えば、
(i)上記本発明のポリペプチドをコードする DNA
(ii)コリネ型細菌に属する微生物由来の I SOMをコードする DNAの塩基配列 において、配列番号 3で表される塩基配列の 55末端から 1366〜 1368番目 の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコ一ドするコド ンである塩基配列を有する DNA
(iii) グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 L—ァラニン、 L一バリン、 L一口イシン、 L—イソロイシン、 L—メチォニン、 L一トリプトフ アン、 L—フエ二ルァラニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L— アルギニン、 L—ァスパラギン酸および L—グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残 基をコードするコドンである上記 （ii) の DNA
(iv)グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 L—ァスパラギン 酸または L—グルタミン酸をコードするコドンである上記 （ii) の DNA。
(v) コリネ型細菌に属する微生物が、 コリネバクテリウム属、 ブレビバクテリウ ム属、 またはマイコバクテリゥム属に属する微生物である上記 （ii)〜 （iv)のい ずれか 1つに記載の DN A
(vi)配列番号 3で表される塩基配列の 5'末端から 1366〜1368番目の塩 基配列がグリシン残基以外のァミノ酸残基をコードする'コドンである塩基配列を 有する DNA '
(vii) グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 Lーァラニン、 L—バリン、 L一口イシン、 L—イソロイシン、 L-メチォニン、 L—トリプトフ アン、 L—フエ二ルァラニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L— アルギニン、 L—ァスパラギン酸および L—グル夕ミン酸から選ばれるアミノ酸残 基をコードするコドンである上記 (vi) の DNA
(viii)グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 Lーァスパラギ ン酸または L—グルタミン酸をコードするコドンである上記 （vi) の DNA
(ix)配列番号 3で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリ ンジヱントな条件下でハイブリダイズする、 配列番号 3で表される塩基配列の 55 末端から 1366〜1368番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外 のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有する DN Aであり、かつ該 DNAにコ一ドされるポリべプチドを唯一の I S OMとして生産するコリネ型細 菌が、 最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とする DN A をあげることができる。
上記（ii)の本発明の DNAにおいて、 コリネ型細菌に属する微生物由来の I S OMをコードする DNAとしては、 上記 [1]のコリネ型細菌に属する微生物由来 のイソプロピルリンゴ酸イソメラ一ゼの I SOMをコードする DNAをあげるこ とができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来の I SOMをコードする DNAは、 上記 [1] のコリネ型細菌に属する微生物由来のィソプロピルリンゴ酸ィソメラーゼの I S OMをコードする DNAであれば、 いずれの DNAでもよい。
該 DNAは、 上記 [1]の方法により取得することができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来の I SOMをコードする DNAとしては、例え ば EP 1108790に記載されている、 配列番号 3で表される塩基配列を有する DN A をあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来の I SOMをコードする DNAの塩基配列に おいて、配列番号 3で表される塩基配列の 5'末端から 1366〜1368番目の 塩基配列に相応する領域とは、コリネ型細菌由来の I SOMをコードする DNAが 有する塩基配列と配列番号 3で表される塩基配列との相同性を上記した BLASTおよ び FASTAなどの相同性解析プログラムを用いて計算し、両塩基配列の相同性が最も 高くなるように該塩基配列同士を重ね合わせたとき、該コリネ型細菌に属する微生 物由来の I SOMをコードする DNAが有する塩基配列上で配列番号 3で表され る塩基配列の 5'末端から 1366〜1368番目の塩基配列に対応する領域をい う。
配列番号 3で表される塩基配列の 5 '末端から 1366〜 1368番目の塩基配 列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである 塩基配列を有する DNAは、コリネ型細菌に属する微生物由来の I SOMをコード する D N Aに上記の部位特異的変異導入法を用いて塩基置換を導入することによ つて取得することができる。
グリシン残基以外のァミノ酸残基をコードするコドンとしては、 グリシン以外の アミノ酸残基をコードするコドンであればいずれでもよく、好ましくは L一ァラニ ン、 L—バリン、 L一口イシン、 L一イソロイシン、 L—メチォニン、 L—トリプ トフアン、 L—フエ二ルァラニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L—アルギニン、 L—ァスパラギン酸および L _グル夕ミン酸残基から選ばれるァ ミノ酸残基であり、 より好ましくは L—ァスパラギン酸および L—グルタミン酸残 基、 さらに好ましくは L—ァスパラギン酸残基をあげることができる。
上記で得られる D NAが上記 （ii) の本発明の D NAであることは、 該 D NAを 用いて、 野生型 I S〇Mを生産するコリネ型細菌を形質転換し、 該 D N Aと該野生 型 I S O Mをコードする D NAとを相同組換え技術により置換することにより得 られるコリネ型細菌が、上記した部分的口イシン要求性を呈することをもつて確認 することができる。
上記 （vi) 〜 （viii) の D N Aは、 配列番号 3で表される塩基配列を有する D N Aに対して、 上記した部位特異的変異導入法を用いることにより、 配列番号 3で表 される塩基配列の 5 5末端から 1 3 6 6〜： 1 3 6 8番目の塩基配列をグリシン残基 以外のアミノ酸残基をコ一ドするコドンに置換することにより取得できる。
グリシン残基以外のァミノ酸残基をコードするコドンとしては、グリシン以外の アミノ酸残基をコ一ドするコドンであればいずれでもよく、好ましくは L一ァラニ ン、 L—バリン、 L—ロイシン、 L一イソロイシン、 L—メチォニン、 L—トリプ トフアン、 L一フエ二ルァラニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L一アルギニン、 Lーァスパラギン酸および L一ダルタミン酸残基から選ばれるァ ミノ酸残基をコードするコドンであり、 より好ましくは L—ァスパラギン酸および L—グル夕ミン酸残基をコードするコドン、 さらに好ましくは L—ァスパラギン酸 残基をコードするコドンあげることができる。
配列番号 3で表される塩基配列の 5 '末端から 1 3 6 6〜1 3 6 8番目の塩基配 列をァスパラギン酸残基をコードするコドンに置換した D N Aとしては、配列番号 3で表される塩基配列において、 該塩基配列の 5 '末端から 1 3 6 7番目のグァニ ンをアデニンに置換した DN Aをあげることができる。
上記で得られる DN Aが上記（vi)〜 （viii)のいずれかに記載の本発明の D N Aであることは、該 DNAを用いて、 野生型 I SOMを生産するコリネ型細菌を形 質転換し、該 DNAと該野生型 I SOMをコードする; DNAとを相同組換え技術に より置換することにより得られるコリネ型細菌が、上記した部分的口イシン要求性 を呈することをもって確認することができる。
上記（ix)の DNAにおいて、 配列番号 3で表される塩基配列と相補的な塩基配 列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズ可能な DNAと は、配列番号 3で表される塩基配列からなる D N Aの相補鎖の一部分または全部を プローブとして、 コロニー ·ハイブリダィゼ一シヨン法、 プラーク 'ハイブリダィ ゼ一ション法ぁるいはサザンブロヅトハイプリダイゼ一ション法等を用いること により得られる DNAを意味し、具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の D N Aを固定ィ匕したフィルターを用いて、 0. 7〜1. Omol/1の塩化ナトリウム存 在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶 液（ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 15 Ommol/1塩化ナトリウム、 15mmol/l ク ェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することに より同定できる DNAをあげることができる。ハイブリダィゼ一シヨンは、 モレキ ユラ一 ·クロ一ニング第 3版、 カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキユラ一 - ノ、'ィォロジ一、 DNA Clonin 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことが できる。 ハイブリダィズ可能な DN Aとして具体的には、 上記した BLASTや FASTA 等を用いて上記したパラメ一夕一に基づき計算したときに配列番号 3で表される 塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有する DNA、好ましくは 80%以上 の相同性を有する DNA、さらに好ましくは 95 %以上の相同性を有する DN Aを あげることができる。 ,
上記方法で得られる DNAが、配列番号 3で表される塩基配列の 55末端から 1 366〜1368番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸 残基をコードするコドンである塩基配列を有する DNAである場合は、該 DNAを 用いて、 野生型 I S0Mを生産するコリネ型細菌を形質転換し、 該 DNAと該野生 型 I S OMをコ一ドする DNAとを相同組換え技術により置換することにより得 られるコリネ型細菌が、上記した部分的口イシン要求性を呈することをもって上記 方法で得られる DNAが、 上記（ix)の本発明の DNAであることを確認すること ができる。
上記方法で得られる DNAが、配列番号 3で表される塩基配列の 5'末端から 1 366〜1368番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基をコードするコ ドンである塩基配列を有する D N Aである場合は、上記方法で得られる D N Aに対 して、 上記（ii)の本発明の DNAを取得する方法に従い部位特異的変異を導入す ることで上記 （ix) の DNAを取得することができる。
該 DNAが、 上記 （ix)の本発明の DNAであることは、 該 DN Aを用いて、 野 生型 I SOMを生産するコリネ型細菌を形質転換し、該 DNAと該野生型 I SOM をコードする DN Aとを相同組換え技術により置換することにより得られるコリ ネ型細菌が、上記した部分的口イシン要求性を示すことにより確認することができ る ο
[3]本発明の DN Aの調製
(i) コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼまた は I 301 をコードする0 の取得
コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプ口ピルリンゴ酸ィソメラ一ゼまたは I SOMをコードする DNAを取得する方法としては、コリネ型細菌に属する微生 物から斎藤らの方法 CBiochim. Biop ys. Acta, 72, 619 (1963)〕 に従い調製する ことができる染色体 D N Aを錶型として、配列番号 3および 4で表される塩基 列、 または配列番号 3で表される塩基配列に基づき設計、合成することができるプライ マー DN Aを用いて PC R等により取得する方法等をあげることができる。
具体的には、コリネバクテリウム ·グル夕ミカム ATCC31032株から染色体 DNA を調製し、該 DNAを錶型として、 配列番号 3および 4で表されるそれそれの塩基 配列の 5'末端および 3'末端領域の配列を有する DN Aを化学合成し、 該 DNA をブラィマ一セヅトとして用いた P C Rによりイソプロピルリンゴ酸ィソメラー ゼをコードする DNAを取得できる。 また、 配列番号 3で表される塩基配列の 5， 末端および 3 '末端領域の配列を有する DNAをプライマ一セットとして用いた P CRにより I SOMをコードする DNAを取得することができる。上記方法により 取得できる具体的な D N Aとしては、配列番号 3および配列番号 4で表される塩基 配列を有する D N A、配列番号 3で表される塩基配列を有する DNA等をあげるこ とができる。
また、配列番号 3および配列番号 4で表される塩基配列、 または該列番号 3で表 される塩基配列からなる DNAの一部、 または全部をプローブとしたハイブリダィ ゼーシヨン法によって、コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸 イソメラ一ゼまたは I S OMをコードする DNAを取得することができる。
さらに、コリネ型細菌に属する微生物のィソプロピルリンゴ酸ィソメラーゼまた は I SOMをコードする DNAは、配列番号 3および配列番号 4で表される塩基配 列、 または配列番号 3で表される塩基配列に基づき、公知の方法で該塩基配列を有 する DN Aを化学合成するごとにより取得できる。
(ii)本発明の DNAの調製
本発明の DNAは、 上記 （i) で得られるコリネ型細菌に属する微生物由来のィ ソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたは I SOMをコ一ドする DNAに、モレキュ ラー.クローニング第 3版またはカレント ·プロトコ—ルズ.イン.モレキュラー · バイオロジー等に記載された方法に従い、部位特異変異を導入することにより取得 することができる。
上記 （i)で得られる DNAが、 配列番号 3で表される塩基配列において 5， 末 端から 1366〜1368番目の塩基配列に相応する領域がグリシン以外のアミ ノ酸残基をコードするコドンを有する場合は、 該 DNAは本発明の DNAである。 また本発明の DN Aは、 上記（1)で得られるコリネ型細菌に属する微生物由来 の I SOMをコードする DNAにおいて、配列番号 3で表される塩基配列の 5，末 端から 1366~1368番目の塩基配列に相応する領域がグリシン以外のアミ ノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有する DNAを、公知の方法で化学 合成することにより取得できる。
このようにして得られる本発明の DNAとして、例えば、配列番号 3で表される 塩基配列の 5，末端から 1366番目の塩基がグァニンからアデニンに置換された 塩基配列を有する DN Aをあげることができる。 該 D NAは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 4 5 6番目のアミ ノ酸残基がグリシン残基から Lーァスパラギン酸残基に置換したアミノ酸配列か らなるポリべプチドをコードする D NAである。
[ 4 ] 本発明のポリぺプチドの製造
上記 [ 1 ]の本発明のポリペプチドは、 モレキュラー 'クロ一ニング第 3版や力 レントプロトコ一ルズ ·ィン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された方法等 を用い、 例えば以下の方法により、 上記 [ 2 ]の本発明の D N Aを宿主細胞中で発 現させて製造することができる。
即ち、 上記で取得された D N Aを基にして、 必要に応じて該蛋白質をコードする 部分を含む適当な長さの D N A断片を調製し、該 D N A断片を適当な発現ベクター のプロモー夕—の下流に挿入した組換え体 D N Aを作製する。該組換え体 D N Aを、 該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を作製する ことができる。
また該 D N A断片の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩 基を置換した D N Aを調製することにより、本発明のポリペプチドを効率的に製造 することもできる。
宿主細胞としては、 目的とする遺伝子を発現できる細菌、 または酵母であればい ずれも用いることができる。発現べクタ一としては、上記宿主細胞において自立複 製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリベプチドをコ一ドする D N Aを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコー ドする: D N Aを含有してなる組換えべクタ一は原核生物中で自立複製可能である と同時に、 プロモーター、 リボソーム結合配列、 本発明の D NA、 転写終結酉己列、 より構成されたべクタ一であることが好ましい。プロモー夕一を制御する遺伝子が 含まれていてもよい。
発現べク夕一としては、 例えば、 pBTrp2、 pBTacls pBTac2 (いずれもべ一リンガ —マンハイム社より市販)、 PKK233- 2 1^1¾(^&社製) 3£280( 11^1：1^611社製)、 pGEMEX-1 (Promegaネ土製)、 pQE-8 (QIAGE 社製）、 KYPIO (特開昭 58-110600)、 pKYP200 CAgric. Biol . Chem. , 48, 669 (歸）〕、 LSAl CAgric. Biol . Chem. , 53, 277 (1989)〕、 pGELl 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、 pBluescript II SK (-) (Stratagene社製)、 Trs30 CEscherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407) より調製〕、 pTrs32 CEscherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408) より調製〕、 pGHA2 CEscherichia coli IGHA2 (FEM B-400) より調製、特開昭 60-221091〕、 pGKA2 CEscherichia coli IGKA2 (FERM BP- 6798) より調製、 特開昭 60- 221091〕、 pTerm2 (US4686191N US4939094, US5蘭 35)、 pSupex、 ρϋΒΙΙΟヽ pTP5、 pC194、 pEG400〔J. BacterioL , 172, 2392 (1990)〕、 pGEX (Pharmacia社製)、 pETシステム （Novagen 社製） 等をあげることができる。
プロモー夕一としては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよ い。例えば、 プロモ一夕一 (Ptrp)s 1 ^プロモ一夕一、 PLプロモ一夕一、 PB 7 ロモ—夕—、 T7プロモー夕—等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモ一夕一を あげることができる。 また Ptrpを 2つ直列させたプロモー夕一 (PiffiX 2 )、 tac プロモ一夕一、 lacT7プロモ一夕一、 M I プロモー夕一のように人為的に設計改 変されたプロモ一夕一等も用いることができる。 リポソ一ム結合配列であるシャイ ン―ダルガノ （ Shine-Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば 6 〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換えべクタ —においては、本発明の D NAの発現には転写終結配列は必ずしも必要 はないが、 構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、 ェシエリヒア属 (Escherichia)^ セラチア属 (Serratia), バチルス属 (Bacillus), ブレ.ビバクテリゥム属 (Brevibacterium), コリネバクテ リウム属 (Corynebacterim)、 ミクロノ クテリゥム属 (Microbacterimn)、 シユー ドモナス（Pseudomonas )属等に属する微生物、例えば、 Escherichia coli XLl-B lue、 Escherichia coli XL2- Blue、 Escherichia coli 腿、 Escherichia coli MC1000、 Escherichia coli KY3276、 Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W3110、 Escherichia coli NY49、 Escherichia coli GI698、 Escherichia coli TB1、 Serratia ficarias Serratia fonticolaヽ Serratia liquefacienss Serratia marcescenss Bacillus subtilis、 Bacillus amyloliquefaciens、 Brevibacterium roseumヽ Brevibacterium thiogenitaliss Brevibacterium i腿 ariophil皿、 Brevibacterium ammoniagenes ヽ Brevibacterium immariophilum ATCC14068 ヽ Brevibacterium saccharolyticum ATCC1価 6、 Brevibacterium flavum ATCC14067、 Brevibacterium lactof ermentum ATCC13869、 Corynebacterium acetoacidophilmk Corynebacterium callunaes Corynebacterium glutamicum ATCC13032、 Corynebacterium glutamicum ATCC13869 、 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 、 Corynebacterium callunaeヽ Corynebacterium herculis、 Corynebacterium liliunu Corynebacterium melassecola、 Corynebacterium thermoaniinogenes Microbacterium a noniaphi lum ATCC15354、 Pseudomonas putida 、 Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができ る。
と く に、 コ リ ネ型細菌に属する微生物、 例えば Corynebacterium acetoac idophilum、 Corynebacterium acetofflutafflicum、 Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamic^ Corynebacterium lactof eraentum、 Corynebacterium herculis 、 Corynebacterium lilium ヽ Corynebacterium melassecola 、 Corynebacterium thermoaminogenes 、 Brevibacterium saccharolyticum 、 Brevibacterium immariophilum 、 Brevibacterium roseum ヽ Brevibacterium thioffenitalis、 Microbacterium a翻 oniaphilum等を使用することが好ましい。
よ り 具体的に は、 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 、 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806、 Corynebacterium callunae ATCC 15991、 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032、 Corynebacterium glutamicum ATCC 13060、 Corynebacterium glutamicum ATCC 13826 (旧属種 Brevibacterium f lavum)、 Corynebacterium glutamicum ATCC 14020 (旧属種 Brevibacterium divaricatum)、 Corynebacterium glutamicmn ATCC 13869(旧属種 Brevibacterium lactof ermentum)ヽ Corynebacterium herculis ATCC 13868、 Corynebacterium lilium ATCC 15990、 Corynebacterium melassecola ATCC 17965、 Corynebacterium thermoaminogenes ATCC 9244、 ATCC 9245、 ATCC 9246および ATCC 9277、 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066、 Brevibacteriui immariophilum ATCC 14068、 Brevibacterium roseum ATCC 13825 、 Brevibacterium thio^enitalis ATCC 19240 、 Microbacterium 纖 oniaphilum ATCC 15354を使用することが好ましい。
宿主細胞が、 上記の Corynebacterium 属、 Brevibacterium 属、 または Microbacterium属に属する微生物であるときは、本発明の D NAを含む組換え体 D N Aを作製するために用いられるベクターとして、 pCGl (特開昭 57- 134500)、 pCG2 (特開昭 58-35197)、 pCG4(特開昭 57-183799)、 pCGll (特開昭 57-134500)、 pCG116、 pCE54、pCB101 (いずれも特開昭 58- 105999)、pCE51、pCE52、 pCE53〔いずれも Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)〕 等を用いることが好ましい。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 ！; Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 69, 2110 (1972)〕、 プロトプラスト法 (特開昭 57- 186492、 特開昭 57-18649)、電気穿孔法〔例えば、 Journal of Bacteriology, 175, 4096 ( 1993)、 Appl. Microbiol. Biotechnol. , 5 3 541 ( 1999)〕、 Gene, 17, 107 ( 1982)および Molecular & General Genetics, 168, HI ( 1979)に記載の方法等をあげることが できる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419), pHS19、 pHS15等をあげる ことができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用い てもよく、 例えば、 へキソースキナーゼ等の角军糖系の遺伝子のプロモーター、 PH05 プロモ一夕一、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモータ一、 ADHプロモーター、 gal 1プ 口モー夕—、 gal 10プロモ一夕一、 ヒートショックポリペプチドプロモ一夕一、 MF α ΐ プロモ一夕一、 CUP 1プロモー夕一等をあげることができる。
宿主細胞としては、 サヅカロマイセス (Saccharomyces) 属、 シゾサヅカロマイ セス (Schizosaccnaromyces)属、 クリュイべ口ミセス (Kluyveromyces 属、 トリ コスポロン (Trichosporon) 属、 シヮニォミセス (Schwanniomyces) 属、 ピヒア
(Pichia) 属、 キャンディダ (Candida) 属等に属する微生物、 例えば、 サヅカロ マイセス ·セレビッシェ (Saccharomyces cerevisiae)N シソサッカロマイセス · ボンべ ( Schizosaccharomyces pombe )、 ク リュイべ口 ミセス · ラクテイス
(Kluyveromyces lactis)、 トリコスポロン'プノレランス（Trichosporon pullulans)、 シヮニォミセス .アルビウス (Schwanniomyces alluvius)、 キャンディダ 'ユーテ ィリス (Candida utilis) 等をあげることができる。 組換えべクタ一の導入方法としては、酵母に D NAを導入する方法であればいず れも用いることができ、例えば、エレクトロポレーシヨン法 Diethods Enzymol. , 194, 182 (1990)〕、スフエロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 ( 1978)〕、 酢酸リチウム法〔J. Bacteriology, 153, 163 ( 1983)〕、 Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 75, 1929 ( 1978)記載の方法等をあげることができる。
酵母により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリべプチドを得 ることができる。
本発明のポリぺプチドの生産形態としては、 そのままの構造で生産する以外に、 モレキュラー .クローニング第 3版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合タンパク質として生産することもできる。
本発明のポリペプチドは、上記方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養 物中に本発明のポリペプチドを生成、 蓄積させ、 該培養物より本発明のポリべプチ ドを採取することで得ることができる。
該形質転換体の培養は、 通常の培養法によつて実施することができる。
培地としては、 該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る 炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 該形質転換体の培養を効率的に行える培地 であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、 例えばグルコース、 果糖、 シユークロ一ス、 マルトース、 でん ぷん加水分解物等の糖類、 エタノールなどのアルコール類、 酢酸、 乳酸、 コハク酸 等の有機酸類を用 、ることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 炭酸アン モニゥム、 酢酸アンモニゥムなどの各種無機または有機アンモニゥム塩類、 尿素、 その他窒素含有化合物、 およぴ肉エキス、 酵母エキス、 コーン 'スティ一プ' リカ 一、 大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としてはリン酸第一水素力リゥム、 リン酸第二水素力リゥム、硫酸アンモ 二ゥム、 塩化ナトリウム、 硫酸マグネシウム、 炭酸カルシウム等を用いることがで きる。
その他、 必要に応じて、 ピオチン、 チアミン等の微量栄養源を加えることができ る。 これら微量栄養源は、 肉エキス、 酵母エキス、 コーン 'スティープ' リカー、 大豆加水分解物、 カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
培養は、 振とう培養、 深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一 般に 20°C〜42°Cが好適である。 とくに 30°C〜40°Cが好ましい。培地中の pHは、 5
〜 9に維持することが好ましい。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶 液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。培養期間は通常 1〜6 日間である。 また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗 生物質を培地に添加してもよい。
プロモー夕一として誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換 した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサ一を培地に添カ卩しても よい。 例えば、 1 ^プロモー夕一を用いた組換えべクタ一で形質転換した微生物を 培養するときにはイソプロピル一/?— D—チォガラクトビラノシド等を、 trpプロ モーターを用いた組換えべクタ—で形質転換した微生物を培養するときにはィン ドールァクリル酸等を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、 宿主 細胞外に分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用 する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選 択することができる。
本発明のポリぺプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポールソンらの方法〔J. Biol. Chem. , 264, 17619 ( 1989)〕、 ロウらの方法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 ( 1989)、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990)〕、 ま たは特閧平 5-336963、 W094/23021等に記載の方法を準用することにより、 該ポリ ぺプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 本発明のポリペプチドの活性部位を含 むポリべプチドの手前にシグナルぺプチドを付加した形で発現させることにより、 本発明のポリぺプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、 特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵素 遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明の形質転換体により製造されたポリべプチドを単離精製するためには、通 常の酵素の単離精製法を用いることができる。 例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終 了後、 細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液にけん濁後、 超音波破碎機、 フレ ンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破碎し、 無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機 溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル（DEAE) —セファロ一ス、 DIAION HPA- 75 (三菱化成社製） 等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ一法、 S-Sepharose FF (Pharmacia社製） 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラ フィ一法、 プチルセファロ一ス、 フエ二ルセファロ一ス等のレジンを用いた疎水性 クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティ一クロマトグラ フィ一法、 クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を 単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞 を回収後、 破碎し、 遠心分離を行うことにより、 沈殿画分としてポリペプチドの不 溶体を回収する。 回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。該 可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることに より、 該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、 上記と同様の単離精 製法により該ポリべプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリべプチド、あるいは該ポリべプチドに糖鎖の付加されたポリべプチ ド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリべプチドあるいは 該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の 遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、 該培養上清から、 上記と同様の単離精製法を用いることにより、 精製標品を得ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、 上言 3 [ 1 ]のポリペプチドをあ げることができ、 より具体的には配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端かち 4 5 6番目のグリシン残基がァスパラギン酸残基に置換したポリペプチドをあげ ることができる。
[ 5 ] 本発明の L一アミノ酸の製造法
(i) 本発明の微生物 本発明の微生物としては、本発明の蛋白質を唯一のィソプロピルリンゴ酸ィソメ ラ一ゼとして生産する微生物、または本発明の蛋白質を唯一の I S 0Mとして生産 する微生物をあげることができる。
上記微生物としては、本発明のポリぺプチドを唯一のィソプロピルリンゴ酸ィソ メラーゼまたは I S O Mとして生産する微生物であれば、いずれの微生物でもよい が、好ましくはコリネ型細菌に属する微生物、 より好ましくはコリネバクテリゥム 属、 ブレビパクテリゥム属またはミクロバクテリウム属に属する微生物、 さらに好 ましくはコリネバクテリゥム，グルタミカムなどをあげることができる
本発明の微生物は、 本発明の D NAを用いて、 宿主細胞を常法に準じて形質転換 することにより取得することができる。
形質転換において、 自律複製型プラスミ ドに本発明の D NA連結したプラスミ ド を用いる場合は、宿主細胞としてイソプロピルリンゴ酸イソ,メラ一ゼまたは I S O Mを生産しない微生物を用いることができる。
ィソプロピルリンゴ酸ィソメラーゼまたは I S OMを生産しない微生物は、例え ば Appl. Microbiol. Biotechnol. , 37, 566 (1992)に記載の方法に準じて取得する ことができる。
また、 本発明の微生物は、 通常の変異処理法、 組換え D N A技術による遺伝子置 換法、 細胞融合法、 あるいは形質導入法等を用いて、 イソプロピルリンゴ酸イソメ ラ一ゼまたは I S 0 Mを生産する微生物の染色体 D N A上の野生型ィソプロピル リンゴ酸ィソメラーゼまたは I S 0 Mをコードする D N Aに部位特異的変異を導 入して取得することができる。部位特異的変異の導入は、 モレキュラー 'クロ一二 ング第 3版、 カレントプロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記 載の方法に従って行うことができる。
組換え D N A技術を用いた本発明の微生物の作製方法としては、 具体的 は、上 記 [ 2 ] の方法で得られる本発明の D N Aを、 宿主微生物中では自律複製できず、 かつ抗生物質に対する耐性マーカ一遺伝子および枯草菌のレパンシュクラーゼ遺 伝子^ B CMol. Microbiol. , 6, 1195 (1992)〕 を有するプラスミドに組み込むこ とで得られる組換え体プラスミドを用いる方法をあげることができる。
該組換え体プラスミドは、 上記 [ 3 ] の方法に従い、 該宿主微生物に導入するこ とができる。
該組換え体プラスミドは該宿主微生物中で自律複製できないので、該組換え体プ ラスミド上に存在する抗生物質の耐性で選択することにより、該組換え体プラスミ ドが Campbellタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれた微生物を取得する ことができる。
つぎに、本発明の D N Aと共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシユークラ —ゼが自殺基質を生産することを利用した選択!: J. Bacteriol. , 174, 5462 (1992)〕 を行うことによって、宿主微生物の染色体 D N A上のィソプロピルリンゴ酸ィソメ ラーゼまたは I S O Mをコードする D N Aが本発明の D N Aに置換された微生物 を取得することができる。
以上の方法で、染色体 D NA上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法 に限らず、染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いる こともできる。
上記の染色体 D N A上に本発明の D N Aを有する形質転換体を作製する方法と しては、 他にも細胞融合法、形質導入法をあげることができる。例えば、 相田浩ら 編、 アミノ酸発酵、 1 9 8 6年、 学会出版センターに記載の方法をあげることがで さる。
( 2 ) L—アミノ酸の製造
L—アミノ酸は、 上記（1 ) で得られる微生物を培地に培養し、 培養物中に L— ァミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物中より該 Lーァミノ酸を採取することにより、 該 L—アミノ酸を得ることができる。
該微生物を培養する方法は、 上記 [ 3 ] の形質 換体の培養法と同様である。 培養終了後、 菌体などの沈殿物を除去して得られた培養液より、 活性炭処理、 ィ オン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することにより L—ァミノ酸を単離精 製することができる。
本発明により製造することができる L—ァミノ酸は、 Lーァミノ酸であれば特に 限定されないが、 好ましくは L一リジン、 Lースレオニン、 L—グルタミン、 L一 アルギニン、 L—プロリン、 L一トリプトファン、 グリシン、 L—ァラニン、 L一 グルタミン酸、 L—ァスパラギン、 Lーァスパラギン酸、 L—メチォニン、 Lーバ リン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン、 L—システィン、 L—フエ二ルァラニン、 L—セリン、 L—ヒスチジン、 Lーチロシン、 L一オル二チン、 より好ましくは L —リジン、 L—スレオニン.、 L—グルタミン、 L—アルギニン、 L—プロリン、 L 一トリブトファン、 L—イソロイシン、 L—オル二チン、 さらに好ましくは Lーリ ジン、 Lースレオニン、 L—グルタミン、 L一アルギニン、 L—プロリン、 Lート リプトフアンをあげることができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるもの ではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 . I S O M遺伝子置換用ブラスミ ド pCleuC456の作製
配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 4 5 6番目のグリシン残基が ァスパラギン酸残基に置換 (Gly456Asp)されたアミノ酸配列を有するポリべプチド をコードする D NAを、 P C Rを用いた部位特異的変異法（モレキュラー ·クロー ニング第 3版） により以下のようにして取得した。
まず、 コリネバクテリゥム 'グルタミカムの野生型株 ATCC13032の染色体 D NA を、 斎藤らの方法 CBiochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)^ に従って調製した。 次いで、 該染色体 D N Aを鐯型として、 Pfu turbo DNAポリメラーゼ （ストラタ ジーン社製)、添付のバヅファ一および後述のプライマ一を用いて P C Rを行った。 P C Rに用いたプライマーは、公知のコリネバクテリゥム ·グルタミカム由来の I S O M遺伝子の塩基配列情報 （EP 1108790) に基づき、 該 I 3 01 遣伝子中の1 S 0 Mをコードする領域（配列番号 3で表される塩基配列） 中で、 該領域によりコ一 ドされる I S O Mの有するアミノ酸配列（配列番号 1で表されるアミノ酸配列）の N末端から第 4 5 6番目のグリシン残基をコードする領域 （ggc) を含む 2 1塩基 からなる領域（配列番号 3の第 1 3 5 9〜1 3 8 0番目に相当） において、 該グリ シン残基をコ一ドするコドンをァスパラギン酸残基をコ一ドするコドン（gac)に置 換した塩基配列（配列番号 5で表される塩基配列からなる D NA)からなる D NA 断片、およびその相補配列である配列番号 6で表される塩基配列からなる D NAを 常法に従い合成した。
また、 配列番号 3で表される塩基配列の 5 '末端部分の 2 1塩基からなる D NA 断片 （配列番号 7で表される塩基配列からなる DN A；)、 および I SOM遺伝子の 35末端下流に位置する遺伝子の塩基配列の相補配列である 21塩基からなる DN A断片 （配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA) を合成した。
配列番号 5で表される塩基配列を有する D N Aと配列番号 8で表される塩基配 列を有する DNA、および配列番号 6で表される塩基配列を有する DNA断片と配 列番号 Ίで表される塩基配列を有する D N A断片を各々ブラィマ一セットとして 用い、コリネバクテリゥム.グルタミカム ATCC13032株の染色体 DNAを錶型とし て、 Pfu turbo DNAポリメラ一ゼ （ストラ夕ジーン社製） と添付のバッファ一を用 いて 2種類の P CRを各々行った。
P C Rにより得られた、約 1.4kbおよび約 0.6kbの増幅産物（配列番号 3で表さ れる塩基配列の第 1〜1380番目の塩基配列に対応する DNA断片、および第 1 360番目から I SOM遺伝子の C末下流の塩基配列に対応する DN A断片）をァ ガロースゲル電気泳動し、 GENECLEA Kit (BIO 101社製）を用いて抽出、精製した。 さらに、両精製物を鐯型とし、配列番号 7で表される塩基配列からなる DNA断 片と配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA断片をプライマーセヅトとし て用いて PCRを行った。 この PCRにより、配列番号 1で表される I SOMの有 するアミノ酸配列の N末端から第 456番目のグリシン残基をコードするコドン (ggc )がァスパラギン酸をコードするコドン（gac )に置換された約 2 · Okbの D N A断 片を取得した。 得られた約 2. Okbの DNA断片をァガロースゲル電気泳動した後、 GENECLEAN Kitを用いて抽出、 精製した。
次に dATP存在下、 Taq polymerase (ベ一リンガーマンハイム社製） を 72°C、 10 分間反応させることにより、該 D N A断片の 3，末端にアデニンを付加した。得られ た約 2. Okbの DNA断片を、 TAクローニング法（モレキュラー'クローニング第 3 版） により、 プラスミド pESB430に揷入した。 pESB30は、 カナマイシン耐性遺伝子 を有するベクター pHSG299 CGene, 61, 63 (1987)〕 の I切断部位に、 Bacillus subtil is由来のレパンシュクラーゼ遺伝子 ^ Bを含む 2.6kbの ID NA断片 〔Mol. Microbiol.， 6, 1195 (1992)〕 を連結したプラスミドである。
具体的には、 pESB30を 1 (宝酒造社製） で切断後、 ァガロースゲル電気泳動 し、 GENECLEAN IQtを用いて pESB30断片を抽出、 精製した。 得られた pESB30断片 の両末端を D N Aプランティングキヅト（DNA Blunting Kit、宝酒造社製）を用い、 添付のプロトコールに従って、平滑化した。平滑化した PESB30断片をフエノール · クロ口ホルム抽出及びエタノール沈殿により濃縮した後、 dTTP存在下、 Taqポリメ ラ一ゼ （Boehringer Mannheim社製） を 70°Cで 2時間反応させ、 3， 末端にチミン を付加して、 PESB30- T断片を調製した。
この PESB30- T断片と、 上記で得られたアデニンを付加した約 2.0kbの D NA断 片を混合し、 ライゲ一シヨンキット ver l (宝酒造社製） を用い、 連結反応を行つ た。得られた反応産物を用い、 常法 （モレキュラー .クロ一ニング第 3版） に従つ て Escherichia coli DH5 a (東洋紡社製） を形質転換した。
該菌株を、 20 g/mlのカナマイシンを含む LB寒天培地 〔パクトトリプトン （デ ィフコ社製） 10g、 酵母エキス （ディフコ社製） 5g、 塩ィ匕ナトリウム 10g、 パク トァガ一 （ディフコ社製） 16gを水 1Lに含み、 pH7.0に調整された培地〕 上で培 養し、 形質転換株を選択した。 該形質転換株を 20 zg/mlのカナマイシンを含む L B培地で終夜培養し、 得られた培養液からアル力リ S D S法（モレキュラー 'クロ —ニング第 3版） によりプラスミ ドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、 該プラスミドは、 pESB30 に上記で得られた約 2.0kb の D NA断片が揷入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプ ラスミドを pCleuC456と命名した。
実施例 2 . 本発明の； D N Aを有する L—リジン生産菌の造成
実施例 1で作製したプラスミド、 pCleuC456を用い、 遺伝子置換法によって L— リジン生産菌の I S OM遺伝子に Gly456Asp変異を導入した。
L一リジン生産菌としては、 遺伝形質が明らかなコリネパクテリゥム グルタミ カム AHP- 3株（FE BP- 7382) を用いた。 コリネパクテリゥム グルタミカム AHP - 3 株は、コリネバクテリゥム グル夕ミカムの野生株 ATCC 13032の染色体上のホモセ リンデヒドロゲナーゼ遺伝子 ( ）にアミノ酸置換変異 Val59Ala、 ァスパルトキナ —ゼ遺伝子 ( C)にアミノ酸置換変異 Thr331Ile、 およびピルビン酸カルボキシラ —ゼ遺伝子 にアミノ酸置換変異 Pro458Serを有する菌株である。
遺伝子置換法による L—リジン生産菌 AHP-3株の I S O M遺伝子への変異の導入 は、 次に示すような 2回の組換え操作によって行った。 まず、 上記で作製したブラ スミド pCleuC456が、 コリネ型細菌内では自律複製できないことを利用して、 以下 の方法で、 該プラスミドが相同組換えでコリネバクテリゥム グル夕ミクム AHP - 3 株の染色体 D N A中に組み込まれた株を、 それそれ選択した。
具体的には、該プラスミドを用い、 レストらの方法〔Appl. Microbiol. Biotech.， 52, 541 (1999)〕 に従って電気穿孔法にて AHP- 3株を形質転換し、 カナマイシン耐 性株を選択した。選択したカナマイシン耐性株のうちの 1株から得た染色体の構造 をサザンハイブリダィゼ一シヨン （モレキユラ一'クロ一ニング第 3版） により調 ベた結果、 プラスミドが Campbellタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれ ていることが確かめられた。 このような株では、 野生型および変異型の I S 0 M遺 伝子が染色体上に近接して存在しており、その間で 2回目の相同組換えが起こりや すくなつている。
該形質転換株 （1回組換え体） を S U C寒天培地 〔ショ糖 100g、 肉エキス 7g、 ペプトン 10g、 塩化ナトリウム 3g、 酵母エキス （ディフコ社製） 5g、 バクトァガ 一（ディフコ社製） 18gを水 1Lに含み pH7.2に調整した培地〕上に塗布し、 30°C で 1日間培養して、生育するコロニーを選択した。 遺伝子が存在する株は、 シ ョ糖を自殺基質に転換するので、 S U C寒天培地では生育できない〔J. Bacteriol. , 174, 5462 (1991)〕。 これに対し、 染色体上に近接して存在する野生型と変異型の I S O M遺伝子間での 2回目の相同組み換えにより^ B遺伝子が欠失した株では、 自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この 2回目の相同組み換えの 際には、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子のいずれかが、 Bとともに欠失する。 このとき野生型が とともに欠失した株では、 変異型への遺伝子置換が起こつ たことになる。
このようにして得られた 2回組換え体の染色体 D N Aを、斎藤らの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)〕 により調製し、 配列番号 3で表される塩基配列 からなる D N A断片と配列番号 6で表される塩基配列かちなる D N A断片をブラ イマ一セットとして、 Pfu turbo D N Aポリメラ一ゼ （ストラタジーン社製） ξ添 付のバッファ一を用いて P C Rを行った。これらの！3 C R産物の塩基配列を常法に より決定し、 2回組み換え体の染色体 D N Α上に存在する I S 0 M遺伝子が野生型 であるか変異型であるかを判定し、 I S OM遺伝子内部に Gly456Asp変異を有する AHL-456株が取得できたことを確認した。
実施例 3 . I S O M変異株による L—リジン生産試験
取得した AHL- 456株および親株である AHP- 3株を、 B Y G寒天培地（グルコース 10g、 肉エキス 7g、 ペプトン 10g、 塩化ナトリウム 3g、 酵母エキス 5g、 バクトァ ガ一 18 gを水 1 Lに含み pH7.2に調整した培地） を用いて 30°Cで 24時間培養し、 各菌株をそれそれ 250mlの種培地 (スクロ一ス 50g、コーンスティ一プリカ一 40g、 硫酸アンモニゥム 8.3g、 尿素 lg、 リン酸二水素カリウム 2g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.83g、 硫酸鉄 7水和物 10mg、 硫酸銅 5水和物 lm g、 硫酸亜鉛 7水和物 10mg、 β -ァラ二、ノ 10mg、ニコチン酸 5mg、チアミン塩酸塩 1.5mg、ビォチ 0.5mg を水 1Lに含み PH7.2に調整後、 炭酸カルシウムを 30 g加えた培地） が入った 2 L バヅフル付き三角フラスコに植菌し、 30°Cで 12時間〜: 16時間培養した。
得られた種培養液全量を、 それそれ 1, 400mlの本培養培地（グルコース 60g、 コ —ンスティ一プリカ一 20g、塩化アンモニゥム 25g、リン酸二水素カリウム 2.5g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.75g、硫酸鉄 7水和物 50mg、硫酸マンガン 5水和物 13mg 塩化カルシウム 2水和物 50mg、 硫酸銅 5水和物 6.3mg、 硫酸亜鉛 7水和物 1.3mg、 塩化ニッケル 6水和物 5mg、塩化コバルト 6水和物 1.3mg、 モリブデン酸 アンモニゥム 4水和物 1.3mg、 ニコチン酸 14mg、 β -ァラ二、ノ 23mg、 チアミン塩 酸塩 7mg、 ビォチン 0.42mgを水 1Lに含む培地） が入った 5Lジャーファーメン 夕一に植菌し、 34°C、 lvvm、 800rpm条件下で、 アンモニア水で pH7.0に調整しな がら培養した。
培地中のグルコースが消費された時点でグルコース ·フィード液 （グルコース 400g、 塩化アンモニゥム 45gを水 1Lに含む培地） を連続的に添カ卩した。 該フィ一 ド液の添加は、流加速度が 2菌株間で同じになるように調整しながら行い、 ±咅養時 間が 30時間に達したところで培養を終了した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中の L—リジン塩酸塩の蓄積量を 高速液体クロマトグラフィー （HPLC) により定量した。 結果を第 1表に示す。 第 1表
Figure imgf000037_0001
第 1表から明らかなように、 本発明の D N Aを有する AHL- 456株では、生育レべ ルは変わらないが、 L—リジンの生産効率は親株 AHP- 3に比べ向上していた。 実施例 4 . 本発明の D N Aを有する Lースレオニン生産菌の造成
実施例 1で造成した pCleuC456を用い、実施例 2と同様な遺伝子置換法によって L—スレオニン生産菌の I S O M遺伝子に Gly456Asp変異を導入した。
Lースレオニン生産菌としては、 コリネパクテリゥム グルタミクム ATCC 21660 を用いた。 ATCC 21660株は、コリネバクテリゥム グルタミカムの野生株 ATCC 13032 から、 メチォニン要求性変異、 ひ-アミノ ヒドロキシ吉草酸 (AHV)耐性変異、 お よび S- (2-アミノエチル) -システィン (AEC)耐性変異を誘導することにより取得さ れた変異株である CAgr. Biol. Chem. , 36, 1611 (1972)〕。
得られた 2回組換え体の染色体 D Ν Αを用い、配列番号 7で表される塩基配列か らなる D N A断片と配列番号 8で表される塩基配列からなる D N A断片をプライ マ一セットとして、 実施例 1と同様な方法により P C Rを行った。得られた P C R 産物の塩基配列を常法により決定し、 I S O M遺伝子に Gly456Asp 変異を有する THC-15株が取得できたことを確認した。
実施例 5 . I S O M変異株による L—スレオニン生産試験
THC- 15株および親株である ATCC 21660株を、 BYG寒天培地上で 30°Cで 24時間培 養し、 10mlの種培地（グルコース 20g、 ペプトン 10g、 酵母エキス 10g、 塩化ナト リゥム 2.5gを水 1Lに含み PH7.4に調整した培地)が入った太型試験管に植菌して 30°Cで 24時間培養した。 次に、 1mlの種培養液を 10mLの本培養培地 （グルコース 100g、 コーンスティ一プリカ一 5g、 硫酸アンモニゥム 20g、 リン酸一水素力.リウ ム 0.5g、 リン酸二水素カリウム 0.5g、 硫酸マグネシウム 7水和物 lg、 硫酸鉄 7 水和物 10mg、硫酸マンガン 5水和物 10mg、ビォチン O. lmg、： L—メチォニン O. lmg を水 1Lに含み pH7.4に調整後、 20gの炭酸カルシウムを加えた培地）が入った太型 試験管に植菌し、 30°Cで 72時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中の L—スレオニンの蓄積量を高 速液体クロマトグラフィー （HPLC) により定量した。 結果を第 2表に示す。
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000038_0002
第 2表から明らかなように、 本発明の D N Aを有する THC- 15株では、 生育レべ ルは変わらないが、 Lースレオニンの生産効率は親株 ATCC 21660に比べ向上して いた。
実施例 6 . 本発明の D N Aを有する L一グル夕ミン生産菌の造成
実施例 1で造成した pCleuC456を用い、実施例 2と同様な遺伝子置換法によって
L—グル夕ミン生産菌の I S O M遺伝子に Gly456Asp変異を導入した。
L一グル夕ミン生産菌としては、 コリネバクテリゥム グル夕ミクムの野生型菌 株である ATCC 14752 (特公昭 62-51112) を用いた。
得られた 2回組換え体の染色体 D NAを用い、配列番号 7で表される塩基配列か らなる D N Aと配列番号 8で表される塩基配列からなる D NAをプライマ一セッ トとして、 実施例 1と同様な方法により P C Rを行った。得られた P C R産物の塩 基配列を常法により決定し、 I S O M遺伝子に Gly456Asp変異を有する ASL- 7株が 取得できたことを確認した。
実施例 7 . I S O M変異株による L—グル夕ミン生産試験
ASL- 7株および親株である ATCC 14752株を、 BYG寒天培地上で 28°Cで 24時間培 養した。 この培養菌体 1白金を、 20mlの生産培地 （グルコース 150g、 塩化アンモ ニゥム 50g、 リン酸一水素カリウム 0.7g、 リン酸二水素カリウム 0.7g、 硫酸マグ ネシゥム 7水和物 0.5g、 硫酸鉄 7水和物 20mg、 硫酸マンガン 5水和物 20mg、 硫 酸亜鉛 7水和物 10mg、 ピオチン 6〃g、 チアミン塩酸塩 lmg、 肉エキス 5gを水 1L に含み PH7.2に調整後、炭酸カルシウムを 50g加えた培地）が入った 300ml容三角 フラスコに接種し、 28°Cで 96時間培養した。 遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中の L—グル夕ミンの蓄積量を高 速液体クロマトグラフィー （HPLC) により定量した。 結果を第 3表に示す。
第 3表
Figure imgf000039_0001
第 3表から明らかなように、本発明の D N Aを有する ASL- 7株では、生育レベル にほとんど差異はみられないが、 L—グルタミンの生産効率は親株 ATCC 14752に 比べ向上していた。
実施例 8 . 本発明の D N Aを有する L—アルギニン生産菌の造成
実施例 1で造成した pCleuC456を用い、実施例 2と同様な遺伝子置換法によって L—アルギニン生産菌の I S O M遺伝子に Gly456Asp変異を導入することを試みた c
L—アルギニン生産菌としては、コリネバクテリゥム グルタミカム FERM P- 3616 株を用いた。 FERM P- 3616株は、 コリネバクテリゥム グル夕ミカムの野生株から、 D—セリン感受性変異、 D—アルギニン耐性変異、 アルギニンハイドロキサメート 耐性変異、および 6-ァザゥラシル耐性変異を誘導することにより取得された変異株 である （特開平 1-257486)。
得られた 2回組換え体の染色体 D N Aを用い、配列番号 7で表される塩基配列か らなる D N A断片と配列番号 8で表される塩基配列からなる D N A断片をプライ マーセヅトとして、 実施例 1と同様な方法により P C Rを行った。得られた P C R 産物の塩基配列を常法により決定し、 I S O M遺伝子に Gly456Asp 変異を有する AUL-6株が取得できたことを確認した。
実施例 9 . I S O M変異株による L—アルギニン生産試験
AUL-6株および親株である FERMP- 3616株を、 BYG寒天培地上で 30°C、 24時間培 養し、 6mlの種培地 （グルコース 20g、 ペプトン 10g、 酵母エキス 10g、 塩化ナト リウム 2.5gを水 1Lに含み pH7.2に調整した培地）が入った太型試験管に植菌して 30°Cで 24時間培養した。次に 2mlの種培養液を 20mlの本培養培地〔廃糖蜜（グル コース換算） i50g、コーンスティ一プリカ一 5g、硫酸アンモニゥム 30g、尿素 3g、 リン酸一水素カリウム 0.5g、 リン酸二水素カリウム 0.5g、硫酸マグネシウム 2水 和物 0.25gを水 1Lに含み ρΗ7·2に調整後、 炭酸カルシウムを 30g加えた培地〕 が 入った 300ml容三角フラスコに接種し、 30°Cで 72時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中の L—アルギニンの蓄積量を高 速液体クロマトグラフィー （HPLC) により定量した。 結果を第 4表に示す。
第 4表
Figure imgf000040_0001
第 4表から明らかなように、 本発明の D NAを有する AUL- 6株では、生育レベル にほとんど差異はみられないが、 L—アルギニンの生産効率は親株 FERM P- 3616に 比べ向上していた。
実施例 1 0 . 本発明の D NAを有する L一プロリン生産菌の造成
実施例 1で造成した pCleuC456を用い、実施例 2と同様な遺伝子置換法によって
L—プロリン生産菌の I S O M遺伝子に Gly456Asp変異を導入した。
L—プロリン生産菌としては、 コリネバクテリゥム グルタミカム NRRL B-15511 株を用いた。 NRRL B- 15511株は、コリネバクテリゥム グルタミカムの野生株から、
6-メルカプトグァノシン耐性変異を誘導することにより取得された変異株である (特公平 4-7196)。
得られた 2回組換え体の染色体 D N Aを用い、配列番号 7で表される塩基配列か らなる D N A断片と配列番号 8で表される塩基配列からなる D N A断片をプライ マ一セヅトとして、実施例 1と同様な方法により P C Rを.行った。得られた P C R 産物の塩基配列を常法により決定し、 I S O M遺伝子に Gly456Asp変異を有する MGL-5株が取得できたことを確認した。
実施例 1 1 . I S O M変異株による L—プロリン生産試験
MGL- 5株および親株である N L B-15511株を、 BYG寒天培地上で 30°C、 24時間 培養し、 6mlの種培地（グルコース 10g、 肉エキス 5g、 ペプトン 10g、酵母エキス 3g、塩化ナトリウム 3gを水 1Lに含み pH7.2に調整した培地）が入った太型試験管 に植菌して 30°Cで 24時間培養した。次に 2mlの種培養液を 20mlの本培養培地（グ ルコース 100g、 コ一ンスティ一プリカ一 20g、 硫酸アンモニゥム 10g、 リン酸二 水素カリウム 3g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 5g、 硫酸鉄 7水和物 10mg、 ニコ チン酸 10mg、チアミン塩酸塩 0. 1g、 ピオチン 0. 1g、 L一グルタミン酸ソ一ダ 20g を水 1Lに含み ρΗ7· 4に調整後、炭酸カルシウムを 30g加えた培地）が入った 300ml 容三角フラスコに接種し、 32°Cで 96時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中の L—プロリンの蓄積量を高速 液体クロマトグラフィー （HPLC) により定量した。 結果を第 5表に示す。
第 0表
Figure imgf000041_0001
第 5表から明らかなように、本発明の D N Aを有する MGL - 5株では、生育レベル は変わらないが、 L—プロリンの生産 ¾ /率は親株 ERL B-15511に比べ向上してい た。
実施例 1 2 . 本発明の D N Aを有する L—トリブトファン生産菌の造成
実施例 1で造成した pCleuC456を用い、実施例 2と同様な遺伝子置換法によって L—トリプトファン生産菌の I S O M遺伝子に Gly456Asp変異を導入した。
L—トリブトファン生産菌としては、 コリネバクテリゥム グルタミカム FERM BP-1777株を用いた。 ΙΈΕ BP- 1777株は、 コリネパクテリゥム グルタミカムの野 生株から、 L—フヱニルァラニンおよび Lーチロシンの要求性変異、種々の芳香族 アミノ酸アナ口グに対する耐性変異、および 3-プロモピルビン酸の感受性変異を誘 導することにより取得されだ変異株である （日本特許第 2578488号)。
得られた 2回組換え体の染色体 D N Aを用い、配列番号 Ίで表される塩基配列か らなる D N A断片と配列番号 8で表される塩基配列からなる D N A断片をプライ マーセットとして、実施例 1と同様な方法により P C Rを行った。得られた P C R 産物の塩基配列を常法により決定し、 I S O M遺伝子に Gly456Asp変異を有する BPL-31株が取得できたことを確認した。 実施例 1 3 . I S O M変異株による L—トリプトファン生産試験
BPL- 31株および親株である FERM BP- 1777株を、 BYG寒天培地上で 30° 24時間 培養し、 6mlの種培地 （グルコース 20g、 ポリペプトン 15g、 酵母エキス 15g、 塩 化ナトリウム 2. 5g、尿素 lg、 L-フエ二ルァラニン 200mg、 L-チロシン 200mgを水 1Lに含み pH7.2に調整した培地）が入った太型試験管に植菌して 30°Cで 24時間培 養した。 次に 2mlの種培養液を 20 lの本培養培地 （グルコース 60g、 コーンステ ィ一プリカ一 10g、 硫酸アンモニゥム 20g、 リン酸一水素カリウム 0.5g、 リン酸 二水素カリウム 0.5g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.25g、 硫酸マンガン 7水和物 10mgN ピオチン 0.03gを水 1Lに含み pH7.2に調整後、 炭酸カ シウムを 20g加え た培地） が入った 300ml容三角フラスコに接種し、 30°Cで 72時間培養した。 遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中の Lートリブトフアンの蓄積量 を高速液体クロマトグラフィー （HPLC) により定量した。 結果を第 6表に示す。
第 6表
Figure imgf000042_0001
第 6表から明らかなように、 本発明の D N Aを有する BPL- 31株では、 生育レべ ルは変わらないが、 L—トリブトファンの生産効率は親株 FERM BP-1777に比べ向 上していた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、改変されたィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼまたは I S O M およびそれらをコードする D N Aが得られ、該 D N Aを有する微生物を用いること により、 L一アミノ酸を効率的に生産することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号 5—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 6一人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 7一人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 8一人工配列の説明：合成 D N A

Claims

請求の範囲
1. コリネ型細菌に属する微生物由来のィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼ のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列を有し、かつ該ァミノ酸配列を有するポリぺプチドを唯一のィソプ Pピル リンゴ酸ィソメラーゼとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的口 ィシン要求性を示すことを特徴とするポリぺプチド。
2. ポリぺプチドが、 ィソプロピルリンゴ酸ィソメラ一ゼを構成するィソプ 口ピルリンゴ酸イソメラ一ゼ'ラージサブユニット （以下、 I S OMと略す） のァ ミノ酸配列おいて、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列を有することを特徴とする請求項 1に記載のポリぺプチド。
3. コリネ型細菌に属する微生物由来の I S O Mのァミノ酸配列において、
1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ該ァ ミノ酸配列を唯一の I S O Mとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部 分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
4. コリネ型細菌に属する微生物由来の I S O Mのアミノ酸配列において、 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の N末端から 4 5 6番目のアミノ酸に相応す る位置のァミノ酸残基がグリシン残基以外のァミノ酸残基であるアミノ酸配列を 有するポリべプチド。
5. グリシン残基以外のアミノ酸残基が L—ァラニン、 L一バリン、 L一口 イシン、 L一イソロイシン、 L—メチォニン、 L—トリプトファン、 L—フエニル ァラニン、 L—プロリン、 L一リジン、 L—ヒスチジン、 L—アルギニン、 Lーァ スパラギン酸および L—グル夕ミン酸から選ばれるアミノ酸残基である請求項 4 に記載のポリペプチド。
6. グリシン残基以外のアミノ酸残基が L—ァスパラギン酸または Lーグル 夕ミン酸である請求項 4に記載のポリべプチド。
7. コリネ型細菌に属する微生物が、 コリネバクテリウム属、 ブレビバクテ リゥム属またはマイコバクテリゥム属に属する微生物である請求項 1〜 6のいず れか 1項に記載のポリぺプチド。
8. 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 4 5 6番目のアミノ酸 残基がグリシン残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリ ぺプチド。
9. グリシン残基以外のアミノ酸残基が L—ァラニン、' L—バリン、 L一口 イシン、 L—イソロイシン、 L—メチォニン、 L—トリプトファン、 L—フエニル ァラニン、 L—プロリン、 L—リジン、 L一ヒスチジン、 L—アルギニン、 L -ァ スパラギン酸および L一グルタミン酸から選ばれるァミノ酸残基である請求項 8 に記載のポリペプチド。
10. グリシン残基以外のァミノ酸残基が L—ァスパラギン酸または Lーグル 夕ミン酸である請求項 8に記載のポリぺプチド。
11. 請求項 4〜 1 0のいずれか 1項に記載のポリべプチドのアミノ酸配列に おいて、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 4 5 6番目のアミノ酸に 相応する位置のアミノ酸残基以外の 1以上のアミノ酸が欠失若しくは置換された アミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリべプチドを唯一の I S〇M として生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すこ .とを特徴とするポリペプチド。
12. 請求項 4〜 1 1のいずれか 1項に記載のポリペプチドのァミノ酸配列に おいて、 1以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ該アミノ酸配列 を有するポリぺプチドを唯一の I S O Mとして生産するコリネ型細菌が、最少培地 において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
13. 請求項 1〜1 2のいずれか 1項に記載のポリペプチドをコードする D N
A。
14. コリネ型細菌に属する微生物由来の I S O Mをコ一ドするD NAの塩基 配列において、配列番号 3で表される塩基配列の 5，末端から 1 3 6 6〜 1 3 6 8 番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のァミノ酸残基をコードする コドンである塩基配列を有する D NA。
15. グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 Lーァラニン、 Lーバリン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン、 L—メチォニン、 L—トリプトフ アン、 L—フエ二ルァラニン、 L—プロリン、 L一リジン、 L—ヒスチジン、 L— アルギニン、 L—ァスパラギン酸および L一グル夕ミン酸から選ばれるアミノ酸残 基をコードするコドンである請求項 1 4に記載の D NA。
16. グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 L—ァスパラ ギン酸または L—グルタミン酸をコードするコドンである請求項 1 4に記載の D NA。
17. コリネ型細菌に属する微生物が、 コリネバクテリウム属、 ブレビバクテ リウム属、またはマイコバクテリゥム属に属する微生物である請求項 1 4〜1 6の いずれか 1項に記載の D NA。
18. 配列番号 3で表される塩基配列の 5，末端から 1 3 6 6〜 1 3 6 8番目 の塩基配列がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配 列を有する D NA。
19. グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 L—ァラニン、 L—バリン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン、 L一メチォニン、 L—トリプトフ アン、 L—フエ二ルァラニン、 L一プロリン、 L—リジン、 L—ヒスチジン、 L一 アルギニン、 L—ァスパラギン酸および L—グル夕ミン酸から選ばれるァミノ酸残 基をコードするコドンである請求項 1 8に記載の D NA。
20. グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、 Lーァスパラ ギン酸または L—グル夕ミン酸をコ一ドするコドンである請求項 1 8に記載の D NA。
21. 配列番号 3で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる D NAとス トリンジェントな条件下でハイプリダイズする、配列番号 3で表される塩基配列の 5 '末端から 1 3 6 6〜 1 3 6 8番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以 外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有する D NAであり、かつ 該 D NAにコードされるポリべプチドを唯一の I S O Mとして生産するコリネ型 細菌が、 最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とする D NA。
22. 請求項 1 3〜2 1のいずれか 1項に記載の D NAを含む組換え体 D NA。
23. 請求項 2 2記載の組換え体 D N Aで形質転換された微生物。
24. 染色体 D NA'上に請求項 1 3〜2 1のいずれか 1項に記載の D N Aを含 有する微生物。
25. 微生物が、 コリネバクテリウム属、 ブレビパクテリゥム属またはミクロ パクテリゥム属に属する微生物である請求項 2 3または 2 4に記載の微生物。
26. コリネバクテリゥム属に属する微生物が、 コリネパクテリゥム ·グル夕 ミカムである請求項 2 5に記載の微生物。
27. 請求項 2 3〜 2 6のいずれか 1項に記載の微生物を培地に培養し、培養 物中に L一アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物から L—アミノ酸を採取することを 特徴とする、 L一アミノ酸の製造法。
28. L—アミノ酸が、 L—リジン、 L—スレオニン、 L—グルタミン、 L - アルギニン、 L一プロリンおよび L—トリプトフアンからなる群より選ばれるアミ ノ酸である請求項 2 7に記載の製造法。
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