WO2003077938A1 - Verwendung von polypeptiden humanen ursprungs zur behandlung mikrobieller infektionserkrankungen - Google Patents

Verwendung von polypeptiden humanen ursprungs zur behandlung mikrobieller infektionserkrankungen Download PDF

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WO2003077938A1
WO2003077938A1 PCT/EP2003/002705 EP0302705W WO03077938A1 WO 2003077938 A1 WO2003077938 A1 WO 2003077938A1 EP 0302705 W EP0302705 W EP 0302705W WO 03077938 A1 WO03077938 A1 WO 03077938A1
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polypeptides
seq
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polypeptide
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PCT/EP2003/002705
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Christiane Kirchhoff
Hans Henning Von Horsten
Petra Derr
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Lagow Gmbh
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics

Definitions

  • polypeptides of human origin for the treatment of microbial infectious diseases
  • the present invention relates to the use of polypeptides of human origin with the amino acid sequence given in SEQ ID No.5 or SEQ ID No.6 or of biologically active fragments thereof for the treatment of microbial infectious diseases.
  • the object of the present invention is therefore to provide new agents with antimicrobial activity.
  • the object is achieved by using polypeptides of human origin with the amino acid sequence given in SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6 or fragments thereof with the same antimicrobial activity for the production of pharmaceuticals for the treatment of microbial infectious diseases.
  • polypeptides according to the invention are derived from the epididymis-specific, human polypeptides HE2 ⁇ l and HE2c-2 already known in the prior art according to SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2. They were identified using cDNA cloning and analysis. The polypeptides described for the first time in DE 4002981 have been proposed for use in the diagnosis and treatment of male infertility.
  • HE2c-1 and HE2c-2 cDNA clones are members of a family of epididymis-specific variants which result from the differential splicing of the corresponding mRNA (Hamil et al. (2000) , Endocrinology, 141, 1245-1253; see Figure 1).
  • the polypeptides resulting from the different splice variants (hereinafter referred to as HE2 polypeptides) are shown schematically in FIG. 2.
  • the HE2 polypeptides are cationic polypeptides which have a signal sequence of 25 amino acids which is typical for secretion polypeptides and which is split off when exported from the cell.
  • Different expression patterns of different HE2 variants within the human epididymis as well as the binding of specific HE2 polypeptide variants to specific regions of human spermatozoa suggest special functions of the individual polypeptides in post-testicular sperm maturation in the proximal epididymis and in fertilization.
  • Experimental data also indicate an androgen-dependent regulation at the post-transcriptional level (Hamil et al. (2000), Endocrinology, 141, 1245-1253).
  • Binlb an epididymis-specific polypeptide (Binlb) was also isolated in the rat epididymis (Li et al. (2001), Science, 291, 1783-1785).
  • the analysis of the amino acid sequence showed the presence of a structural motif from 6 cysteine residues typical of the family of the ß-defensins - a group of antimicrobial polypeptides - which form 3 disulfide bridges with a characteristic bridging pattern (cf. FIG. 3) also at Binlb.
  • the authors were able to show that Binlb also exhibits the antimicrobial activity inherent in the ß-defensins.
  • Li et al. also point out the structural relationship of Binlb with the human epididymis-specific HE2 variant HE2ßl, which also includes the structural motif typical of ß-defensins.
  • HE20.1 and HE2c-2 differ only by three amino acids; the three dotted lines mark the amino acid exchanges.
  • Fig. 4 Proteolytic cleavage of recombinantly expressed HE2 polypeptides in vitro. Furin peptidase cleavage of MBP-proHE2o.l protein expressed in E. coli and subsequent Western blot analysis with P3 antiserum (1: 500). Lane 1: factor Xa / furin double digestion of 50 ⁇ g MBP-proHE2 ⁇ l; Lane 2: furin digestion of 50 ⁇ g MBP-HE2 ⁇ .l. The furin cleavage of HE2c-l was more efficient in the double digestion.
  • Fig. 5 Antibacterial activity of synthetic C-terminal HE2 ⁇ ; polypeptide fragments.
  • M marker proteins;
  • Lane 1 about 50 ⁇ g of the partially cyclized HE2 ⁇ 2 fragment;
  • Fig. 6 Quantification of antibacterial activity by CFU assay of the linear HE2c-2 fragment ( ⁇ ) and the partially cyclic HE2c-2 fragment ( ⁇ ) against E. coli DH5ot.
  • Fig. 8 Gel retardation assay of the linear HE2C.2 polypeptide fragment.
  • Lanes 1-9 each used 300 ng of a 500 bp PCR amplificate which is not related to the polypeptides according to the invention.
  • Lane O contains 800 ng of the amplificate.
  • Lane M contains an lkb DNA length standard.
  • Lanes 1-9 also contain increasing polypeptide concentrations (lane 1: 0 ⁇ g; lane 2: 0.6 ⁇ g; lane 3: 1.2 ⁇ g; lane 4: 1.8 ⁇ g; lane 5: 2.4 ⁇ g; Lane 6: 3.0 ⁇ g; lane 7: 6.0 ⁇ g; lane 8: 18.0 ⁇ g; lane 9: 30.0 ⁇ g).
  • the HE2 variants HE2c-1 and HE2o-2 with SEQ ID Nos. 1 and 2 do not include the ß-defensin-typical structural motif. It was therefore all the more surprising that the knowledge on which the present invention is based was that the polypeptides according to SEQ, comprising amino acids 61 to 103 of SEQ Nos. 1 or 2, proposed according to the invention. ID numbers 5 or 6 or fragments of the same expressed antimicrobial activity. According to the invention, a new class of antimicrobial polypeptides is thus made available, the origin of which lies in the male genital tract and which cannot be assigned to any known class of antimicrobial polypeptides.
  • the variants HE2 ⁇ l and HE2o.2 differ only in terms of three amino acids in positions 77, 85 and 89 (based on SEQ ID No. 1 and 2), ie the polypeptide HE2o; 2 is an allelic variant of the first by Kirchhoff et al. described human epididymis-specific polypeptide HE2c-1 (see. DE 4002981).
  • the epididymis-specific polypeptides HE2 ⁇ .l and HE2c-2 are synthesized in the human epididymis as pre-pro polypeptides. They contain a typical N-terminal signal sequence (amino acids 1 to 25, see FIG.
  • polypeptide obtained after cleavage of the signal sequence according to SEQ. ID. Nos. 3 and 4 is an antimicrobially inactive pro-polypeptide (cf. FIG. 2, FIG. 9), from which only after renewed cleavage at a conserved interface between amino acids 60 and 61 (based on SEQ ID No. 1 and 2 ) the mature, antimicrobially active polypeptide emerges (cf. SEQ. ID. Nos. 5 and 6).
  • a particularly preferred embodiment of the invention relates to the use of the fragments comprising the 30 C-terminal amino acids 74 to 103 (based on SEQ. ID. Nos. 1 or 2) according to SEQ. ID. Nos. 7 and 8 as antimicrobial agents.
  • antimicrobially active variants of the polypeptides according to the invention which differ from those in SEQ. ID. Nos. 5, 6, 7 and 8, differentiate the sequences indicated by exchange, insertion or deletion of one or more amino acids, polypeptides which have the ⁇ -defensive motif not counting as variants in the sense of the invention.
  • polypeptides according to the invention can have one or more additional amino acids at the N-terminal end, provided the antimicrobial activity is retained.
  • polypeptides according to the invention have additional amino acids at their N-terminus, preferably 1 to 13, without their antimicrobial activity being adversely affected.
  • the polypeptides HE2C.1 and HE2c-2 according to the invention are expressed in human epididymis as pre-pro polypeptides, which are compared to those in SEQ. ID. Nos. 5 and 6 specified sequences have additional amino acids at the N-terminal end and an internal proteolytic cleavage site between amino acids 60 and 61 (based on SEQ. ID. Nos. 1 and 2).
  • the mature HE2otl and HE2C-2 polypeptides according to SEQ. ID. Nos. 5 and 6 are kept in an antimicrobial inactive state by the sequence preceding the 35 amino acid long at the N-terminal end (amino acids 1-35 based on SEQ. ID. Nos. 3 and 4) (cf. example 4 and example 5 ). Only after proteolytic cleavage of this N-terminal domain at the internal proteolytic cleavage site between amino acids 60 and 61 (based on SEQ. ID. Nos. 1 and 2) is the antimicrobial activity obtained.
  • the invention also relates to polypeptides in which the previously defined antimicrobial polypeptides have an additional amino acid sequence at the N-terminal end, which inactivates the polypeptides with regard to their antimicrobial activity, and in which the inactivating amino acid sequence links to the antimicrobially active polypeptides via a proteolytic cleavage site is.
  • it is a cleavage site which is recognized by an enzyme which is specific for the pathogen or pathogens of the infectious disease to be treated in each case.
  • Such an internal proteolytic cleavage site opens up the possibility of producing a locally activatable antimicrobial active substance based on the HE2 ⁇ .-polypeptides according to the invention, which only develops its activity when it comes into contact with certain bacterial pathogenicity factors (such as proteases). Even with systemic administration, such an antibiotic substance is only present in active form at the site of the infection. The patient's natural body flora as well as healthy cells and tissues are spared. The local activation of the respective antibiotic by means of the cleavage site according to the invention also helps to minimize the bacterial selection process of resistance to the relevant antimicrobial agent.
  • any amino acid sequences which comprise a suitable cleavage site can be considered as the N-terminal sequence, which keeps the HE2 ⁇ l and HE20.2 polypeptides according to the invention in an inactive state.
  • the length of the amino acid sequences can vary, with the amino acid sequence 1 to 35 (based on SEQ. ID. Nos. 3 and 4) being particularly preferred.
  • the cleavage site which enables the inactivating sequence to be cleaved from the antimicrobially active HE2 ⁇ polypeptide portion can be any amino acid sequence which is recognized by an enzyme of the pathogen with sufficient specificity and is used for cleavage. It is particularly advantageous if it is an enzyme specific for the pathogen that is not synthesized by human or animal tissue cells or by bacteria from the natural body flora.
  • IgAl protease type 2 described in the prior art, which i.a. Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae and Neisseria eningi tidis) have been detected (Wood and Burton (1991), Infection and Immunity, 59 (5), 1818-1822; Pohlner et al., (1992), Biotechnology 10 , 799-804 Their synthesis and secretion, for example in the genus Neisseria, is strictly linked to the virulence of the species in question.
  • the IgAl protease type 2 recognizes the short amino acid sequence:
  • the IgAl protease type 2 is therefore particularly suitable for the proteolytic activation of recombinant fusion polypeptides.
  • the recognition sequence can vary by exchanging, inserting or deleting individual amino acids.
  • Another suitable specific protease is the metal protease ZapA (Fernandez et al., (2000), Braz J Med Biol Res, 33 (7), 765-770), which, for example, has the amino acid sequence
  • protease is synthesized by the human pathogenic bacterium Proteus mirabilis as a virulence factor and secreted into the surrounding medium.
  • This cleavage site can also be used in the context of the present invention, wherein individual amino acid residues of the recognition sequence can be exchanged, provided that this does not hinder the recognition by ZapA.
  • activating factors Depending on the type of pathogen, further enzymes are conceivable as activating factors.
  • protozone infections such as of the amebiasis caused by .Entai7.oe.foa histolytica consider specific cysteine proteases as activating enzymes.
  • Protozoa such as Trypanosoma cruzi, Plasmodium fal - ciparum, Cryptosporidium parvum and Toxoplasma gondii also synthesize extracellular cysteine proteases, which are involved in the pathogenicity mechanisms of the respective organism.
  • Cysteine proteases that act as virulence factors have also been detected in some helminths and bacteria.
  • polypeptides according to the invention can be produced either by recombinant methods or by chemosynthetic means.
  • Recombinant expression systems in which the DNA coding for polypeptides or peptides is cloned into a vector or a phagemid and which, after being introduced into a suitable host cells which allow heterologous expression of the coding DNA constitutively or after the addition of an inducer have been widely described in the prior art and include, inter alia, the baculovirus expression system, the 6His expression system and the MBP fusion protein expression system.
  • the invention thus also relates to a method for producing a polypeptide or polypeptide fragment according to one of the preceding claims, in which
  • step (b) introducing the vector or phagemid of step (a) into a cell;
  • the cloning can be carried out, for example, starting from epididymal mRNA by reverse transcription and subsequent PCR amplification of the resulting cDNA with the aid of the method described by Fröhlich et al. (2000), Androl., 21, 421-30, described oligonucleotide primers.
  • an epididymal cDNA library can serve as the starting point for a PCR.
  • the desired fragment can easily be generated by means of PCR (cf. Example 2).
  • Eukaryotic cells such as, for example, cells from Trichoplusia ni ("high five" cells; Parrington et al. (1997), Virus Genes, 14, 63-72) or CHO cells, and the like are used as host cells for use in these methods prokaryotic cells into consideration, with E. coli being particularly preferred.
  • the cDNA can also be produced synthetically using the known sequences.
  • the chemical synthesis of the polypeptides according to the invention can be carried out using methods described in the prior art, for example using automated peptide synthesizers (Barany and Merrifield, "Solid Phase Peptide Synthesis”, in “The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol 2, Ch. 1, 3-284; Steward and Young (1984), “Solid-Phase Peptides Synthesis, 2nd Ed.”, Pierce Chemical Company, Rockford, III; Atherton and Shepard (1989), “Solid- Phase Synthesis - A Practical Approach ", Oxford University Press, Oxford).
  • the polypeptides can be modified after synthesis according to known methods, for example by introducing an intramolecular disulfide bridge.
  • An intramolecular disulfide bridge between two cysteine residues can be formed by removing the cysteine protective group and subsequent oxidation by atmospheric oxygen.
  • any undesirable properties of the polypeptides resulting from the synthesis can be countered using standard methods which are familiar to the person skilled in the field of protein chemistry.
  • solubilizing substances such as DMSO or urea are added.
  • polypeptides according to the invention can be used in linear or in cyclic form.
  • Cyclic polypeptides in the sense of the invention can have either a partial or completely cyclic structure.
  • polypeptides with a partially cyclic structure there is a linkage of free reactive side groups of amino acids within the amino acid chain with the consequence of an intramolecular ring formation, in which, however, at least one of the amino acids or Carboxy termini of the amino acid chain are not included in the ring formation.
  • the formation of a disulfide bridge by reaction of two cysteine residues within the primary structure leads to a polypeptide with a partially cyclic structure.
  • polypeptides with a completely cyclic structure the terminal amino acids at both ends of the polypeptide are included in the ring formation.
  • complete cyclization of a polypeptide can be achieved artificially, for example, by expression thereof using the IMPACT TM TWIN system (New England Biolabs, Schwalbach, Germany) (Evans et al. (1999), Biopolymers, 51, 333-342).
  • polypeptides according to the invention can be present as oligomers, in particular as dimers.
  • a particularly preferred embodiment of the invention relates to the use of the fragments comprising the 30 C-terminal amino acids 74 to 103 (based on SEQ. ID. Nos. 1 or 2) according to SEQ. ID. Nos. 7 or 8 as an antimicrobial.
  • the 30 C-terminal amino acids of the HE2 ⁇ 2 polypeptide were produced chemosynthetically in the context of the present invention both in the form of a linear polypeptide and in the form of a polypeptide partially cyclized by introduction of an intramolecular disulfide bridge (cf. FIG. 7; example 6) and with regard to them antimicrobial activity was examined.
  • the polypeptides according to SEQ ID No. 7 or 8 are accordingly antimicrobial fragments of the polypeptides according to the invention. Because of their anti-microbial properties, the polypeptides according to the invention defined above are proposed for the treatment of microbial infectious diseases.
  • infectious disease denotes all pathogenic changes caused by microorganisms compared to the normal state in the body of humans and animals.
  • the polypeptides proposed according to the invention thus provide an alternative to the known antibiotics, and they can be used in an analogous manner both with regard to the possible indications as well as with regard to the application forms and formulations.
  • the term "microorganism” includes bacteria, protozoa, yeasts, viruses, etc., insofar as they are able to cause pathogenic changes in humans and animals.
  • the microorganism causing the infectious disease is a bacterium.
  • the binding of the synthetic HE2c-2 polypeptides to nucleic acids such as DNA indicates an activity of the polypeptides according to the invention against DNA and RNA viruses.
  • the infectious disease is a disease of the urogenital tract.
  • parenteral administration refers to all applications in which the active substance, ie the polypeptides defined according to the invention, are introduced into the patient's body bypassing the gastrointestinal tract.
  • Parenteral administration can be carried out, for example, subcutaneously, intravenously or as a suppository.
  • the polypeptides can be formulated with suitable adjuvants, auxiliaries and / or carriers. Suitable agents are known in the prior art.
  • adjuvants of the type which have the immune response in the body can also be used increase. Examples of these are hydroxides of various metals, such as aluminum hydroxide, components of the bacterial cell wall, oils, saponins or cytokines.
  • polypeptides according to the invention can also be formulated for local application.
  • the local application includes application to affected body surfaces or administration using an inhaler.
  • Formulations suitable for inhalation can be present as an aerosol in combination with a propellant such as carbon dioxide in a suitable pressure vessel.
  • a propellant such as carbon dioxide
  • formulations of polypeptides for topical application they can be introduced, for example, in gels, emulsions, ointments or in transdermal systems or as solutions which, for example, can be used for inflammatory processes in the throat area.
  • Immunogenic fragments of the HE2-derived polypeptides were synthesized by f-moc solid phase methods.
  • Polyclonal rabbit anti-polypeptide antisera were produced by coupling the polypeptides via cysteine residues to the carrier substance keyhole limpet hemocyanin (KLH, Sigma, Deisenhofen, Germany).
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • an artificial cysteine residue at the C-terminus was added to the polypeptides PI (SEQ ID No. 9) and P2 (SEQ ID No. 10) during the synthesis;
  • the sequence of the P3 polypeptide corresponded to the 30 C-terminal amino acids of the HE2c-2 polypeptide (SEQ ID No.
  • the immune sera were obtained after 60, 90 and 125 days of immunization (Pineda Antibody Service, Berlin).
  • a monospecific purification of the polyclonal antibodies was carried out by coupling the polypeptides to epoxy-activated Sepharose 6B (Amersham-Pharma-Biotech, Freiburg, Germany) and subsequent affinity chromatography.
  • a HE2o.l cDNA fragment (SEQ ID No. 15; Osterhoff et al. (1994), Biol. Repro., 50, 516-525), which lacked the region coding for the signal peptide, and therefore for a polypeptide encoded according to SEQ ID No. 3 (hereinafter referred to as proHE2c-1), was subcloned into the vector pMAL-c2x (New England Biolabs, Schwalbach, Germany) after using PCR to generate a HindIII restriction site at the 3 'end had been.
  • the oligonucleotide shown in SEQ ID No. 13 was used as the sense oligonucleotide.
  • the cells were harvested by centrifugation and the pellet was resuspended in column buffer (20 mM TRIS-HC1, pH 7.4; 200 mM NaCl). The cells were frozen by overnight at -20 ° C and subsequent Thawing open at room temperature. The suspension was then sonicated for 7 minutes and centrifuged at 27,000 xg for 30 minutes. The supernatant was diluted 1: 5 with column buffer and loaded onto an amylose column. The column was washed with 5 volumes of column buffer and eluted competitively with column buffer containing 10 M maltose. The supernatant, which contained recombinant MBP-proHE2o.l fusion protein, was dialyzed against autoclaved, deionized water and lyophilized.
  • column buffer (20 mM TRIS-HC1, pH 7.4; 200 mM NaCl
  • the cells were frozen by overnight at -20 ° C and subsequent Thawing open at room temperature. The suspension was then sonicated for 7 minutes and centrifuge
  • MBP-proHE2 ⁇ ; l fusion protein was made using 1.5 U recombinant truncated human furin (New England Biolabs) per ⁇ g of fusion protein in a reaction buffer of 100 mM HEPES, pH 7.5 at 25 ° C., 0.5% Triton X-100, 2mM CaCl2, 1mM ß-mercaptoethanol enzymatically digested for 3h at 30 ° C.
  • factor Xa New England Biolabs
  • the corresponding batches were cooled and incubated overnight at room temperature with 1 ⁇ g factor Xa per 50 ⁇ g MBP-HE2 ⁇ l.
  • the batches were extracted using a StrataClean column (Stratagene) in order to obtain salt-free samples for SDS-PAGE with subsequent Western blot and immunodetection (Ziegler et al. (1997), Anal. Biochem., 250, 257-260) ,
  • FIG. 4 shows the result of the detection using the P3 antiserum. It was found that the maltose-binding protein (MBP) used as the affinity tag had a molecular weight of 42 KDa which could be determined both theoretically and by SDS-PAGE. The MBP-proHE2c-1 fusion protein had a theoretical molecular weight of 50 KDa. The upper band in lane 2, FIG. 4 corresponded to the MBP-proHE2c-1 fusion protein, which had not yet been digested by furin. The apparent molecular weight of this large fusion protein could not be determined correctly on the TRICIN gel shown in FIG. 4, since it bounded outside the peptide marker range.
  • MBP maltose-binding protein
  • proHE2o.l To purify proHE2o.l, an aliquot of the MBP-proHE2 ⁇ l fusion protein obtained from Example 2 was digested with factor Xa but not with furin under the reaction conditions described in Example 3. After cleaving proHE2 ⁇ l from the maltose-binding protein (MBP) by factor Xa, the two cleavage products MBP and proHE2o.l were separated from one another by gel filtration on Superose 12 (Amersham-Pharmacia Biotech). The Superose 12 column was operated on an FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) system (LKB-Bromma). 120 mM ammonium bicarbonate, pH 8.0 was used as the running buffer.
  • MBP maltose-binding protein
  • FIG. 9a shows the Superose 12 FPLC fractions of a single run, chronologically applied to the tricin gel. It was found that fraction 16 contained proHE2ofl polypeptide. Fractions 1 to 17 of 4 runs were each pooled and tested in a conventional radial diffusion assay for antimicrobial activity against E. coli DH5o; examined. It was found that none of the fractions - not even fraction 16 - had antibiotic activity (FIG. 9b). The proHE2o.l polypeptide therefore has no antimicrobial activity.
  • Mature HE2c-1 was recombinantly produced in the baculovirus expression system.
  • An insert construct was prepared starting from the HE2cl cDNA fragment used in Example 2 (SEQ ID No. 15; Osterhoff et al. (1994), Biol. Repro., 50, 516-525) encoded for mature HE2o.l with N-terminal 6-histidine tag and factor Xa cleavage site.
  • the oligonucleotide shown in SEQ ID No. 16 was used as the sense oligonucleotide.
  • the oligonucleotide shown in SEQ ID No. 17 was used as the anti-sense oligonucleotide.
  • the construct was cloned into the pMelBac vector (INVITROGEN) via the BamHI and Hindlll restriction site. After co-transfection with Bac-N-Blue-DNA, the virion-containing supernatant of the transfected cells was examined in the plaque assay for the presence of recombinant virions. These were increased and used for the targeted infection of high-five insect cells. The recombinant protein was released from the infected cells into the culture supernatant and purified from this using IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) on a nickel NTA column.
  • IMAC Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography
  • the insect culture medium contained low-molecular components (including histidine) which disrupt the nickel IMAC, the culture supernatants were precipitated with acetone before IMAC cleaning and resuspended in distilled water.
  • the purified 6-histidine-HE2c-1 fusion polypeptide was freed from the histidine day by factor Xa cleavage.
  • the mature HE2 ⁇ l polypeptide was then present and was finally purified to homogeneity by RP-HPLC (Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography) on a C4 column.
  • RP-HPLC Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography
  • a fragment consisting of the 30 C-terminal amino acids of the HE2o.2 polypeptide variant was chemically synthesized using f-moc solid-phase methods.
  • a disulfide bridge was introduced into the linear HE2C-2 polypeptide fragment using standard methods. It was found that the linear HE2o.2 polypeptide fragment tended to aggregate due to its free cysteine residues (cf. FIG. 5a, lane 1).
  • the partially cyclized fragment showed little solubility in water and was therefore dissolved in a mixture of 99.5% dirnethyl sulfoxide / 0.5% trifluoroacetic acid. Both HE2o.2 polypeptide fragments were subsequently examined for antimicrobial activity.
  • E. coli DH5 ⁇ Bacteria were precultured overnight at 37 ° C. for 18 h in 3 ml of Luria-Bertani (LB) medium (10 g / 1 bacto-trypton, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl , pH 7.2). In order to obtain a logarithmically growing culture, 50 ⁇ l of this bacterial suspension were inoculated into 50 ml of fresh LB medium and incubated at 37 ° C. for a further 2.5 h.
  • LB Luria-Bertani
  • the bacteria were then centrifuged off and resuspended in 10 ml mM Na 3 PO 4 , pH 7.2.
  • the bacterial agar should have a thickness of 2-3 mm
  • the samples containing the polypeptide fragment were separated by continuous acetic acid-urea-polyacrylamide gel electrophoresis (CAU-PAGE), after which the gel was washed in 10 mM Na 3 PO 4 , pH 7.2 for 20 min until the pH of the gel had reached 7.2
  • the gel was then placed on the prepared agar plate and incubated for 3 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the gel was removed and the agar was overlaid with 2% agarose (MetaPhor, Biozym) in LB medium and incubated overnight for 16 hours.
  • the bands of antimicrobially active proteins and peptides were clearly recognizable as inhibitory zones in the agar.
  • the crystal violet dye served as a positive control.
  • FIG. 5b The results of the gel overlay assay are shown in FIG. 5b. It was shown that both the linear form and the partially cyclized form of the fragment comprising the 30 C-terminal amino acids of HE2c-2 have an antimicrobial activity against E. coli. In the acetic acid-urea-polyacrylamide gel it could be seen that the linear form of the fragment showed several bands in the gel, despite homogeneous mass in ESI-MS investigations, which suggested an oligomer formation. A large part of the partially cyclic molecules was separated out of focus in the upper part of the gel, while several individual bands were visible in the lower area of the gel, which in turn indicates oligomer formation. In the overlay assay, the areas where cell lysis was observed corresponded to the lower areas of the gel. The aggregates in the upper area of the gel showed no killing ability (cf. FIG. 5b).
  • E. coli DH5o. (Life Technologies Inc., Rockville, USA). E. coli DH5c bacteria were grown overnight at 37 ° C for 18 h to preculture in 3 ml Luria Bertani medium (LB). In order to obtain a logarithmically growing culture, 50 ⁇ l of this bacterial suspension were inoculated into 50 ml of fresh LB medium and incubated at 37 ° C. until an OD 620 of 0.2 was reached. The bacteria were then diluted 1:10 4 with 10% LB medium in 10 mM Na 3 PO 4 , pH 7.2.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Polypeptiden humanen Ursprungs mit der in SEQ ID Nr.5 oder SEQ ID Nr.6 angegebenen Aminosäuresequenz oder von biologisch aktiven Fragmenten oder Varianten derselben zur Behandlung von mikrobiellen Infektionserkrankungen.

Description

Verwendung von Polypeptiden humanen Ursprungs zur Behandlung mikrobieller Infektionserkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Polypeptiden humanen Ursprungs mit der in SEQ ID Nr.5 oder SEQ ID Nr.6 angegebenen Aminosäuresequenz oder von biologisch aktiven Fragmenten derselben zur Behandlung von mikrobiellen Infektionserkrankungen.
Weltweit leiden über 2 Billionen Menschen an den ernsthaften Folgen von Infektionskrankheiten. In vielen Ländern Asiens, Afrikas sowie Mittel- und Südamerikas bilden diese Erkrankungen die häufigste Todesursache. Nicht zuletzt durch den Einsatz von Antibiotika konnte die Mortalität in den Industrienationen auf etwa 2-4% gesenkt werden. Das verstärkte Auftreten von gegen Antibiotika resistenten Stämmen pathogener Bakterien droht jedoch, diese Erfolge in Frage zu stellen. So wurde beispielsweise in den Jahren von 1989 bis 1993 eine 20-fache Zunahme von Infektionen mit Vankomycin-resistenten Enterokokken beobachtet. Als Reaktion auf die dramatische Zunahme und Verbreitung von Resistenzen bei klinisch relevanten Mikroorganismen fordert die Weltgesundheitsorganisation (WHO) seit mehreren Jahren nachdrücklich die Entwicklung neuer antibiotisch wirksamer Leitstrukt ren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung neuer Mittel mit antimikrobieller Wirksamkeit.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Verwendung von Polypeptiden humanen Ursprungs mit der in SEQ ID Nr.5 oder SEQ ID Nr.6 angegebenen Aminosäuresequenz oder von Fragmenten derselben mit gleicher antimikrobieller Wirksamkeit zur Herstellung von Pharmazeutika für die Behandlung von mikrobiellen Infektions- erkrankungen gelöst .
Die erfindungsgemäßen Polypeptide leiten sich von den im Stand der Technik bereits bekannten Epididymis-spezifischen, humanen Polypeptiden HE2αl und HE2c-2 gemäß SEQ ID Nr.l oder SEQ ID Nr.2 her. Deren Identifizierung erfolgte anhand von cDNA-Klonierung und -Analyse. Diese erstmals in der DE 4002981 beschriebenen Polypeptide wurden für die Verwendung bei der Diagnose und der Behandlung der männlichen Infertilität vorgeschlagen.
Es hat sich inzwischen gezeigt, dass die ursprünglich identifizierten HE2c-l- und HE2c-2-cDNA-Klone Mitglieder einer Familie Epididymis-spezifischer Varianten sind, die aus dem differen- tiellen Spleißen der entsprechenden mRNA hervorgehen (Hamil et al. (2000), Endocrinology, 141, 1245-1253; vgl. Figur 1). Die aus den verschiedenen Spleißvarianten hervorgehenden Polypeptide (nachfolgend als HE2-Polypeptide bezeichnet) sind schematisch in Figur 2 gezeigt.
Bei den HE2-Polypeptiden handelt es sich um kationische Polypeptide, die eine für Sekret-Polypeptide typische Signalsequenz von 25 Aminosäuren besitzen, welche beim Export aus der Zelle abgespalten wird. Unterschiedliche Expressionsmuster verschiedener HE2-Varianten innerhalb des menschlichen Epididymis sowie die Bindung spezifischer HE2-Polypeptidvarianten an bestimmte Regionen menschlicher Spermatozoen (Osterhoff et al. (1994), Biol . Repro., 50, 516- 525; Hamil et al . (2000), Endocrinology, 141, 1245-1253) lassen spezielle Funktionen der einzelnen Polypeptide bei der post- testicularen Spermareifung im proximalen Epididymis sowie bei der Befruchtung vermuten. Experimentelle Daten verweisen darüber hinaus auf eine Androgen-abhängige Regulation auf post-trans- kriptionaler Ebene (Hamil et al. (2000), Endocrinology, 141, 1245-1253) .
Kürzlich wurde auch im Epididymis der Ratte ein Epididymis-spezifisches Polypeptid (Binlb) isoliert (Li et al . (2001), Science, 291, 1783-1785) . Die Analyse der Aminosäure-Sequenz zeigte das Vorhandensein eines für die Familie der ß-Defensine - einer Gruppe antimikrobiell wirksamer Polypeptide - typischen Strukturmotivs aus 6 Cystein-Resten, die 3 Disulfidbrücken mit charakteristischem Verbrückungsmuster bilden (vgl. Figur 3) auch bei Binlb. Die Autoren konnten in Untersuchungen mit E. coli zeigen, daß Binlb ebenfalls die den ß-Defensinen eigene antimikro- bielle Wirksamkeit entfaltet. Li et al. weisen darüberhinaus auf die strukturelle Verwandtschaft von Binlb mit der humanen Epididymis-spezifischen HE2-Variante HE2ßl hin, welche ebenfalls das für ß-Defensine typische Strukturmotiv umfaßt.
Beschreibung der Figuren;
Fig. 1: Revidierte Struktur des humanen HE2-Genlocus, der zwei zusätzliche Exons und zwei Promotoren aufweist (vgl . Jia et al. (2001), Gene, 263, 211-218). Offene Leserahmen sind gepunktet dargestellt, ß-Defensindomänen schwarz .
Fig. 2: Schematische Darstellung der neuen HE2-Polypeptid-Isoformen, die sich anhand von klonierten cDNAs vorhersa- gen lassen, sowie Lokalisation von Polypeptidfragmen- ten für die Antipolypeptid-Antikörperherstellung. HE20.1 and HE2c-2 unterscheiden sich lediglich durch drei Aminosäuren; die drei gepunkteten Linien markieren die Aminosäureaustausche. Signalpeptide = Rechtecke mit weißem Hintergrund; Signalpeptidase- und Proproteinkonvertase-Schnittstellen (1); reife Polypeptide = hellgraue Rechtecke; Lokalisation der Poly- peptidfragmente für die Antikörperherstellung, P1-P5 = dunkelgraue Rechtecke, Zahlen verweisen auf entsprechende Aminosäurereste innerhalb der HE2-Polypeptide; ß-Defensin-ähnliche Module = Rechtecke mit schwarzem Hintergrund.
Fig. 3: Aminosäuresequenzen von HE2ßl und HE2C in einem Aminosäuresequenz-Alignment mit humanen ß-Defensinen (hBDl- 4) sowie ß-Defensinkonsensus-Sequ.enz . Bindestriche wurden eingefügt, um das Alignment zu verbessern.
Fig. 4: Proteolytische Spaltung von rekombinant exprimierten HE2-Polypeptiden in-vitro. Furin-Peptidase-Spaltung von in E. coli exprimierten MBP-proHE2o.l Protein und nachfolgende Western-Blot Analyse mit P3-Antiserum (1:500). Bahn 1: Faktor Xa/Furin-Doppelverdau von 50 μg MBP-proHE2αl; Bahn 2: Furinverdau von 50 μg MBP- HE2σ.l . Die Furinspaltung von HE2c-l war im Rahmen des Doppelverdaus effizienter.
Fig. 5: Antibakterielle Aktivität synthetischer C-terminaler HE2α;-Polypeptidfragmente. a) Kontinuierliche Essigsäu- re-Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Coo- massiefärbung der Polypeptidfragmente mit und ohne intramolekularer Disulfidbrücke. M = Markerproteine; Bahn 1 = etwa 50 μg des partiell cyklisierten HE2α2- Fragments; Bahn 2 = 10 μg lineares HE2α2-Fragment; Bahn 3 = Positivkontrolle (Kristallviolett) . b) Gel- Overlay eines parallelen Essigsäure-Harnstoff-Gels. Die antimikrobielle Aktivität wird durch klare Zonen ohne bakterielles Wachstum sichtbar.
Fig. 6: Quantifizierung der antibakteriellen Aktivität durch CFU-Assay des linearen HE2c-2-Fragments (±) und des partiell cyklischen HE2c-2-Fragments (■) gegen E. coli DH5ot.
Fig. 7: Schematische Darstellung epididymaler HE2-Polypeptid- Isoformen. Prozessierung, Aminosäuresequenz und Struktur reifer in vivo HE2c--Isoformen im Vergleich mit den synthetischen HE2c--Polypeptidfragmenten, die im Rahmen der antibakteriellen Assays verwendet wurden. Signal- peptid = Rechteck mit weißem Hintergrund; gespaltene Pro-Domäne = Hellgraues Rechteck; prozessierte Polypeptide = Rechtecke mit schwarzem Hintergrund. Die Ziffern beziehen sich auf die Numerierung der Aminosäuren beginnend mit Methionin 1 (1-25: Signalpeptid; 26-60: verlängertes Pro-Polypeptid; 61-103: reifes HE2oi; 74-103: synthetisches Polypeptid).
Fig. 8: Gel-Retardations-Assay des linearen HE2C.2-Polypeptid- fragments . In den Bahnen 1-9 wurden jeweils 300 ng eines 500 bp-PCR-Amplifikats verwendet, welches nicht mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden verwandt ist. Bahn O enthält 800 ng des Amplifikats. Bahn M enthält einen lkb-DNA-Längenstandard. Die Bahnen 1-9 enthalten ferner steigende Polypeptid-Konzentrationen (Bahn 1: 0 μg; Bahn 2: 0,6 μg; Bahn 3: 1,2 μg; Bahn 4: 1,8 μg; Bahn 5: 2,4 μg; Bahn 6: 3,0 μg; Bahn 7: 6,0 μg; Bahn 8: 18,0 μg; Bahn 9: 30,0 μg) . Während bei der Negativkontrolle (linkes Gel) ein synthetisches Polypeptid mit einer aus HE2-Propeptid-Domäne abgeleiteten Aminosäuresequenz verwendet wurde (vgl. SEQ ID Nr.9), enthielten die als "HE2o." gekennzeichneten Proben (rechtes Gel) das erfindungsgemäße HE2c-2-Polypeptidfrag- ment. Die schwarzen Dreiecke markieren die PCR-Ampli- fikatbande.
Fig. 9: a) Gelelektrophoretische Trennung von Superose 12- FPLC-Fraktionen des gespaltenen MBP-proHE2o.l-Fusions- proteins nach Faktor Xa-Verdau. Fraktion 16 enthält das proHE2o.l-Polypeptid, welches vom Maltose-Binde- Protein (MBP) abgespalten wurde, b) Untersuchung pro- HE2o.l-Polypeptid haltiger Fraktionen aus der Gelfiltration auf antimikrobiellen Aktivität gegen E. coli DH5α im Radial-Diffusions-Assay. In die linke Agarver- tiefung (-) wurden etwa 20 μg proHE2c-l-Polypeptid pipettiert. In die rechte Vertiefung (+) wurden zum Vergleich ebenfalls etwa 20 μg des synthetischen, linearen HE20.1-Fragments (SEQ ID Nr.7) gegeben.
Die HE2-Varianten HE2c-l- und HE2o-2 mit den SEQ ID Nrn.l und 2 umfassen das ß-Defensin-typische Strukturmotiv nicht. Umso überraschender war daher die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Erkenntnis, daß die erfindungsgemäß vorgeschlagenen, die Aminosäuren 61 bis 103 der SEQ Nrn. 1 oder 2 umfassenden Polypeptide gemäß SEQ. ID Nrn. 5 oder 6 oder Fragmente derselben ausgeprägte antimikrobielle Wirksamkeit entfalten. Erfindungs- gemäß wird somit eine neue Klasse antimikrobiell wirksamer Polypeptide zur Verfügung gestellt, deren Ursprung im männlichen Genitaltrakt liegt und die keiner bekannten Klasse antimikrobiell wirksamer Polypeptide zuzuordnen sind.
Wie ein Vergleich der in SEQ ID Nrn.l und 2 bzw. 5 und 6 angegebenen Sequenzen zeigt, unterscheiden sich die Varianten HE2αl und HE2o.2 lediglich hinsichtlich dreier Aminosäuren in den Positionen 77, 85 und 89 (bezogen auf SEQ ID Nrn.l und 2), d.h. es handelt sich bei dem Polypeptid HE2o;2 um eine allelische Variante des ersten von Kirchhoff et al. beschriebenen humanen Epididymis-spezifischen Polypeptids HE2c-l (vgl. DE 4002981) . Die Epididymis-spezifischen Polypeptide HE2σ.l und HE2c-2 werden im humanen Nebenhoden als Prä-Pro-Polypeptide synthetisiert. Sie enthalten eine typische N-terminale Signalsequenz (Aminosäuren 1 bis 25, vgl. Figur 2), die beim Transport aus der Zelle abgetrennt wird. Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß es sich bei dem nach Abspaltung der Signalsequenz erhaltenen Polypeptid gemäß den SEQ. ID. Nrn. 3 und 4 um ein antimikrobiell nicht aktives Pro-Polypeptid handelt (vgl. Figur 2, Figur 9), aus dem erst nach erneuter Spaltung an einer konservierten Schnittstelle zwischen den Aminosäuren 60 und 61 (bezogen auf SEQ ID Nrn.l und 2) das reife, antimikrobiell aktive Polypeptid hervorgeht (vgl. SEQ. ID. Nrn. 5 und 6) .
Erfindungsgemäß hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß das reife Polypeptid gemäß den SEQ. ID. Nrn. 5 und 6 sowie Fragmente desselben ausgeprägte antimikrobielle Wirksamkeit aufweisen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung der die 30 C-terminalen Aminosäuren 74 bis 103 (bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 1 oder 2) umfassenden Fragmente gemäß den SEQ. ID. Nrn. 7 und 8 als antimikrobielle Mittel.
Erfindungsgemäß einbezogen sind ferner antimikrobiell wirksame Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide, die sich von den in den SEQ. ID. Nrn. 5, 6, 7 und 8, angegebenen Sequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden, wobei Polypeptide, welche das ß-Defen- sin-Motiv aufweisen, nicht als Varianten im erfindungsgemäßen Sinne gelten.
Ferner können die erfindungsgemäßen Polypeptide am N-terminalen Ende eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren aufweisen, soweit die antimikrobielle Wirksamkeit erhalten bleibt . So können die in den SEQ. ID. Nrn. 7 und 8 angegebenen Polypeptide zusätzliche Aminosäuren an ihrem N-Terminus, vorzugsweise 1 bis 13, aufweisen, ohne daß ihre antimikrobielle Aktivität negativ beeinflußt wird. Die erfindungsgemäßen Polypeptide HE2C.1 und HE2c-2 werden im humanen Nebenhoden als Prä-Pro-Polypeptide exprimiert, die gegenüber den in SEQ. ID. Nrn. 5 und 6 angegebenen Sequenzen zusätzliche Aminosäuren am N-terminalen Ende sowie eine interne proteolytische Spaltstelle zwischen den Aminosäuren 60 und 61 (bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 1 und 2) aufweisen.
Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß die reifen HE2otl und HE2C-2-Polypeptide gemäß den SEQ. ID. Nrn. 5 und 6 durch die 35 Aminosäure lange am N-terminalen Ende vorgeschaltete Sequenz (Aminosäuren 1-35 bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 3 und 4) in einem antimikrobiell inaktiven Zustand gehalten werden (vgl. Beispiel 4 und Beispiel 5) . Erst nach proteolytischer Abspaltung dieser N-terminalen Domäne an der internen proteolytischen Spaltstelle zwischen den Aminosäuren 60 und 61 (bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 1 und 2) wird die antimikrobielle Wirksamkeit erhalten.
Dementsprechend betrifft die Erfindung auch Polypeptide, bei denen die zuvor definierten antimikrobiell wirksamen Polypeptide am N-terminalen Ende eine zusätzliche Aminosäuresequenz aufweisen, welche die Polypeptide bezüglich ihrer antimikrobiellen Wirksamkeit inaktiviert, und bei denen die inaktivierende Aminosäuresequenz über eine proteolytische Spaltstelle mit den antimikrobiell wirksamen Polypeptiden verknüpft ist. Erfindungsgemäß handelt es sich um eine Spaltstelle, die von einem Enzym erkannt wird, welches für den oder die Erreger der jeweils zu behandelnden Infektionskrankheit spezifisch ist. Eine solche interne proteolytische Spaltstelle eröffnet die Möglichkeit, einen lokal aktivierbaren antimikrobiellen Wirkstoff auf der Basis der erfindungsgemäßen HE2α.-Polypeptide herzustellen, der seine Aktivität erst entfaltet, wenn er mit bestimmten bakteriellen Pathogenitätsfaktoren (wie beispielsweise Proteasen) in Kontakt kommt. Eine solche antibiotische Substanz liegt auch bei systemischer Verabreichung nur am Ort der Infektion in aktiver Form vor. Die natürliche Körperflora des Patienten sowie gesunde Körperzellen und Gewebe werden auf diese Weise weit- gehend geschont. Die lokale Aktivierung des jeweiligen Antibiotikums mittels der erfindungsgemäßen Spaltstelle trägt ferner dazu bei, den bakteriellen Selektionsprozess von Resistenzen gegen den betreffenden antimikrobiellen Wirkstoff zu minimieren.
Als N-terminale Sequenz, welche die erfindungsgemäßen HE2αl- und HE20.2-Polypeptide in inaktiven Zustand hält, kommen grundsätzlich beliebige Aminosäuresequenzen in Betracht, die eine geeignete Spaltstelle umfassen. Die Aminosäuresequenzen können hinsichtlich ihrer Länge variieren, wobei die Aminosäuresequenz 1 bis 35 (bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 3 und 4) besonders bevorzugt sind.
Bei der Spaltstelle, die eine Abspaltung der inaktivierenden Sequenz von dem antimikrobiell aktiven HE2α-Polypeptidanteil ermöglicht, kann es sich um jede Aminosäuresequenz handeln, die von einem Enzym des Erregers mit hinreichender Spezifität erkannt und zur Spaltung genutzt wird. Besonders vorteilhaft ist es, wenn es sich um ein für den Erreger spezifisches Enzym handelt, das weder von humanen oder tierischen Gewebezellen noch von Bakterien der natürlichen Körperflora synthetisiert wird.
Ein solches Enzym mit hoher Sequenzspezifität ist die im Stand der Technik beschriebene IgAl-Protease Typ2, die u.a. bei Pro- teus mirabilis, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae und Neisseria eningi tidis) nachgewiesen wurde (Wood and Burton (1991), Infection and Immunity, 59(5), 1818-1822; Pohlner et al., (1992), Biotechnology 10, 799-804. Ihre Synthese und Sekretion ist beispielsweise bei der Gattung Neisseria streng an die Virulenz der betreffenden Spezies gekoppelt.
Die IgAl-Protease Typ2 erkennt beispielsweise die kurze Aminosauresequenz :
T P A P R P P 1 T P und spaltet proteolytisch an der mit Hilfe des Pfeils oben dargestellten Position. Die IgAl-Protease Typ2 eignet sich demgemäß besonders zur proteolytischen Aktivierung von rekombinanten Fusionspolypeptiden. Die Erkennungssequenz kann durch Austausch, Insertion oder Deletion einzelner Aminosäuren variieren.
Eine weitere geeignete spezifische Protease ist die Metallopro- tease ZapA (Fernandez et al., (2000), Braz J Med Biol Res, 33(7), 765-770), welche beispielsweise die Aminosäuresequenz
A F R 1 S A A Q
erkennt und an der mit Hilfe des Pfeils dargestellten Position spaltet . Die Protease wird von dem humanpathogenen Bakterium Proteus mirabilis als Virulenzfaktor synthetisiert und in das umgebende Medium sekretiert. Auch diese Spaltstelle kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung genutzt werden, wobei einzelne Aminosäurerste der ErkennnungsSequenz ausgetauscht werden können, sofern dies die Erkennung durch ZapA nicht behindert.
Je nach Erregerart sind weitere Enzyme als aktivierende Faktoren denkbar. So kommen beispielsweise bei Protozoneninfektionen wie z.B. der durch .Entai7.oe.foa histolytica verursachten Amöbiasis spezifische Cysteinproteasen als aktivierende Enzyme in Betracht. Auch Protozoen wie Trypanosoma cruzi , Plasmodium fal - ciparum, Cryptosporidium parvum und Toxoplasma gondii synthetisieren extrazelluäre Cysteinproteasen, die in die Pathogen- itätsmechanismen des jeweiligen Organismus involviert sind. Als Virulenzfaktoren fungierende Cysteinproteasen konnten auch bei einigen Helminthen und Bakterien nachgewiesen werden.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide kann sowohl mittels rekombinanter Verfahren als auch auf chemosynthetischem Wege erfolgen. Rekombinante ExpressionsSysteme, bei denen die für Polypeptide oder Peptide kodierende DNA in einen Vektor oder ein Phagemid kloniert wird, und die nach Einbringen in eine ge- eignete Wirtszelle die heterologe Expression der kodierenden DNA konstitutiv oder nach Zugabe eines Induktors erlauben, sind im Stand der Technik vielfach beschrieben und umfassen u.a. das Baculovirus-Expressionssytem, das 6His-Expressionssystem und das MBP-Fusionsprotein-Expressionssystem.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder Polypeptidfragmentes nach einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem man
(a) eine DNA, die für ein Polypeptid mit einer der in SEQ ID Nr.5 bis SQ ID Nr.8 angegebenen AminosäureSequenzen kodiert oder Fragmente oder Varianten derselben, in einen Vektor oder ein Phagemid kloniert;
(b) den Vektor oder das Phagemid der Stufe (a) in eine Zelle einbringt ; und
(c) die Zelle unter Bedingungen kultiviert, die eine Expression der DNA ermöglichen.
Die Klonierung kann beispielsweise ausgehend von epididymaler mRNA durch reverse Transkription und nachfolgender PCR-Amplifi- kation der entstandenen cDNA mit Hilfe der bei Fröhlich et al . (2000), Androl., 21, 421-30, beschriebenen Oligonukleotidpri- mer erfolgen. Alternativ kann, wie in DE 4002981 beschrieben, eine epididymale cDNA-Bibliothek als Ausgangspunkt für eine PCR dienen. Das gewünschte Fragment läßt sich mittels PCR ohne weiteres generieren (vgl. Beispiel 2).
Als Wirtszellen zur Anwendung in diesen Verfahren kommen euka- ryotische Zellen, wie beispielsweise Zellen von Trichoplusia ni ("high five"-Zellen; Parrington et al. (1997), Virus Genes, 14, 63-72) oder CHO-Zellen, sowie prokaryotische Zellen in Betracht, wobei E. coli besonders bevorzugt ist.
Die cDNA kann darüber hinaus anhand der bekannten Sequenzen auch synthetisch hergestellt werden. Die chemische Synthese der erfindungsgemäßen Polypeptide kann nach im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, beispielsweise mit Hife automatisierter Peptid-Synthesizer erfolgen (Bar- any und Merrifield, "Solid Phase Peptide Synthesis", in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology" , Vol. 2, Ch.l, 3-284; Steward und Young (1984) , "Solid-Phase Peptides Synthesis, 2nd Ed.", Pierce Chemical Company, Rockford, III; Atherton und Shep- pard (1989), "Solid-Phase Synthesis - A Practical Approach" , Oxford University Press, Oxford) .
Die Polypeptide können nach der Synthese gemäß bekannten Verfahren modifiziert werden, beispielsweise durch die Einführung einer intramolekularen Disulfid-Brücke. Die Bildung einer intramolekularen Disulfid-Brücke zwischen zwei Cystein-Resten kann dabei durch Entfernung der Cystein-Schutzgruppe und nachfolgende Oxidation durch Luftsauerstoff erfolgen.
Dabei sollte darauf geachtet werden, daß der basische Charakter der jeweiligen Polypeptide erhalten bleibt.
Gegebenenfalls aus der Synthese resultierende, unerwünschte Eigenschaften der Polypeptide, wie beispielsweise eine geringe Löslichkeit, können mit Standardmethoden, die dem auf dem Gebiet der Proteinchemie tätigen Fachmann geläufig sind, begegnet werden. Zur Erhöhung der Löslichkeit der Polypeptide können z.B. löslichkeitsvermittelnde Substanzen wie beispielsweise DMSO oder Harnstoff zugesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in linearer oder in cyklischer Form eingesetzt werden. Cyklische Polypeptide im Sinne der Erfindung können entweder partielle oder vollständig cyklische Struktur aufweisen.
Bei Polypeptiden mit partiell cyklischer Struktur liegt eine Verknüpfung freier reaktiver Seitengruppen von Aminosäuren innerhalb der Aminosäurekette mit der Folge einer intramolekularen Ringbildung vor, bei der jedoch mindestens einer der A ino- oder Carboxy-Termini der Aminosäurekette nicht in die Ringbildung einbezogen sind. Beispielsweise führt die Bildung einer Disul- fidbrücke durch Reaktion zweier Cystein-Reste innerhalb der PrimärStruktur zu einem Polypeptid mit partiell cyklischer Struktur.
Bei Polypeptiden mit vollständig cyklischer Struktur sind die terminalen Aminosäuren an beiden Enden des Polypeptids in die Ringbildung einbezogen. Eine solche vollständige Cyklisierung eines Polypeptids kann beispielsweise durch eine Expression desselben mittels des IMPACT TM-TWIN-Systems (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland) künstlich erreicht werden (Evans et al. (1999) , Biopolymers, 51, 333-342) .
Schließlich können die erfindungsgemäßen Polypeptide als Oligo- mere, insbesondere als Dimere vorliegen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung der die 30 C-terminalen Aminosäuren 74 bis 103 (bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 1 oder 2) umfassenden Fragmente gemäß den SEQ. ID. Nrn. 7 oder 8 als antimikrobielle Mittel.
Die 30 C-terminalen Aminosäuren des HE2α2-Polypeptids wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung sowohl in Form eines linearen Polypeptids, als auch in Form eines durch Einführung einer intramolekularen Disulfidbrücke partiell cyklisierten Polypeptids chemosynthetisch hergestellt (vgl. Figur 7; Beispiel 6) und hinsichtlich ihrer antimikrobiellen Aktivität untersucht.
Beide synthetischen Polypeptide erwiesen sich sowohl im Gel- Overlay-Assay als auch im Colony-Forming-Unit Assay als bakterizid gegenüber E. coli (vgl. Figuren 5 und 6; Beispiel 7) . Bei den Polypeptiden gemäß SEQ ID Nrn.7 oder 8 handelt es sich demgemäß um antimikrobiell wirksame Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptide. Aufgrund ihrer anti-mikrobiellen Eigenschaften werden die oben definierten erfindungsgemäßen Polypeptide zur Behandlung mikrobieller Infektionserkrankungen vorgeschlagen. Im Rahmen der Erfindung bezeichnet der Begriff "Infektionserkrankung" sämtliche durch Mikroorganismen hervorgerufenen patho- genen Änderungen gegenüber dem Normalzustand im Körper von Mensch und Tier. Die erfindungsgemäß vorgeschlagenen Polypeptide liefern somit eine Alternative zu den bekannten Antibiotika, und sie können sowohl hinsichtlich der in Betracht kommenden Indikationen als auch hinsichtlich der Applikationsformen und Formulierungen auf analoge Weise zum Einsatz kommen.
Erfindungsgemäß fallen unter den Begriff "Mikroorganismus" Bakterien, Protozoen, Hefen, Viren etc., soweit diese in der Lage sind pathogene Veränderungen in Mensch und Tier hervorzurufen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der die Infektionskrankheit verursachende Mikroorganismus ein Bakte- rium.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit Hilfe von Gel-Re- tardations-Assays nachgewiesene Bindung der synthetischen HE2c-2- Polypeptide an Nukleinsäuren wie DNA, weist auf eine Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide gegen DNA- und RNA-Viren hin.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Infektionserkrankung eine Erkrankung des Urogenital- Traktes .
Die erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich insbesondere für die parenterale Applikation, und sie können dementsprechend formuliert sein. Als parenterale Applikation werden vorliegend alle Applikationen bezeichnet, bei denen der Wirkstoff, d.h die erfindungsgemäß definierten Polypeptide, unter Umgehung des Magen-Darm-Traktes in den Körper des Patienten eingebracht werden. Die parenterale Verabreichung kann beispielsweise subkutan, intravenös oder als Zäpfchen erfolgen. Die Polypeptide können zu diesem Zweck mit geeigneten Adjuvantien, Hilfs- und/oder Trägerstoffen formuliert werden. Geeignete Agentien sind im Stand der Technik bekannt. Erfindungsgemäß können auch Adjuvanzien desjenigen Typs zum Einsatz kommen, welche die Immunantwort im Körper erhöhen. Beispiele hierfür sind Hydroxide verschiedener Metalle, wie Aluminiumhydroxid, Bestandteile der bakteriellen Zellwand, Öle, Saponine oder Cytokine.
Ferner können die erfindungsgemäßen Polypeptide auch für die lokale Applikation formuliert sein.
Die lokale Applikation umfasst im Rahmen der vorliegenden Erfindung u.a. das Aufbringen auf betroffene Körperoberflächen oder die Verabreichung mittels eines Inhalators . Formulierungen, die sich zur Inhalation eignen, können als Aerosol in Verbindung mit einem Treibgas wie Kohlendioxid in einem geeigneten Druckbehälter vorliegen. Bei Formulierungen von Polypeptiden zur topischen Applikation können diese beispielsweise in Gele, Emulsionen, Salben oder in transdermale Systeme eingebracht werden oder als Lösungen vorliegen, die z.B. bei entzündlichen Prozessen im Rachenbereich Anwendung finden können.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert:
Beispiel 1
Herstellung chemosynthetischer Polypeptide und Gewinnung von Anti-Polypeptid-Antiseren
Immunogene Fragmente der aus HE2 abgeleiteten Polypeptide wurden durch f-moc-Festphasenverfahren synthetisiert. Polyklonale Ka- ninchen-Anti-Polypeptid-Antiseren wurden durch Kupplung der Polypeptide über Cysteinreste an die TrägerSubstanz Keyhole- Limpet-Hämocyanin (KLH, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) hergestellt. Um eine derartige Kupplung zu ermöglichen, wurde den Polypeptiden Pl (SEQ ID Nr.9) und P2 (SEQ ID Nr.10) bei der Synthese ein artifizieller Cystein-Rest am C-Terminus zugefügt; das Polypeptid P3 entsprach hinsichtlich seiner Sequenz den 30 C- terminalen Aminosäuren des HE2c-2-Polypeptids (SEQ ID Nr.8) und enthielt einen für diesen Zweck geeigneten N-terminalen Isoleu- cinrest. Die Polypeptide P4 (SEQ ID Nr.11) und P5 (SEQ ID Nr.12) enthielten einen C-terminalen, endogenen Cysteinrest. Die Immunseren wurden nach 60, 90 und 125 Tagen der Immunisierung erhalten (Pineda Antikörper-Service, Berlin) . Eine monospezifische Reinigung der polyklonalen Antikörper wurde durch Kopplung der Polypeptide an Epoxy-aktivierte Sepharose 6B (Amersham-Pharma- cia-Biotech, Freiburg, Deutschland) und anschließender Affinitätschromatographie durchgeführt .
Beispiel 2
Herstellung von rekombinante HE2αl-Polypeptid in E. coli
Ein HE2o.l-cDNA-Fragment (SEQ ID Nr.15; Osterhoff et al . (1994), Biol. Repro., 50, 516-525), dem die für das Signalpeptid kodierende Region fehlte, und das demnach für ein Polypeptid gemäß SEQ ID Nr.3 kodierte (im folgenden als proHE2c-l bezeichnet), wurde in den Vektor pMAL-c2x (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland) subkloniert, nachdem mit Hilfe einer PCR eine Hindlll-Restriktionsschnittstelle am 3 ' -Ende generiert worden war. Als Sense-Oligonukleotid wurde das in SEQ ID Nr.13 dargestellte Oligonukleotid verwendet. Als Anti-Sense-Oligonukleotid wurde das in SEQ ID Nr.14 dargestellte Oligonukleotid verwendet. Fragmente, die am 3 ' -Ende mit HindiII geschnitten worden waren und stumpfe 5 ' -Enden aufwiesen, wurden in einen Zmnl/Hiidlll- verdauten Vektor ligiert . Das reko binante Plasmid wurde in DH5α.-Zellen amplifiziert und durch Sequenzierung bestätigt. Für die heterologe Expression des Polypeptids wurde der hinsichtlich cytosolischer Proteasen defiziente Stamm E. coli ER2508 (New England Biolabs) ausgewählt und transformiert. Transformierte Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 2 x 108 Zellen pro ml kultiviert, und die Expression wurde durch Zugabe von 3 mM IPTG induziert. Nach 3-stündiger Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugation abgeerntet, und das Pellet wurde in Säulenpuffer (20 mM TRIS-HC1, pH 7,4; 200 mM NaCl) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Einfrieren über Nacht bei -20°C und nachfolgendem Auftauen bei Raumtemperatur aufgeschlossen. Anschließend wurde die Suspension 7 Minuten lang mit Ultraschall behandelt und 30 Minuten lang bei 27000 x g zentrifugiert . Der Überstand wurde 1:5 mit Säulenpuffer verdünnt und auf eine Amylose-Säule geladen. Die Säule wurde mit 5 Volumen Säulenpuffer gewaschen und kompetitiv mit Säulenpuffer, welcher 10 M Maltose enthielt, eluiert. Der Überstand, der rekombinantes MBP-proHE2o.l-Fusions- protein enthielt, wurde gegen autoklaviertes, deionisiertes Wasser dialysiert und lyophilisiert .
Beispiel 3
Proteolytische Spaltung des mittels Affinitätschromatographie gereinigten MBP-proHE2αl-Fusionsproteins
MBP-proHE2α;l-Fusionsprotein wurde unter Verwendung von 1,5 U rekombinantem trunkiertem humanem Furin (New England Biolabs) pro μg Fusionsprotein in einem Reaktionspuffer aus 100 mM HEPES, pH 7,5 bei 25°C, 0,5% Triton-X-100, 2 mM CaCl2, 1 mM ß-Mercapto- ethanol 3h lang bei 30°C enzymatisch verdaut. Für den anschließenden Verdau mit Faktor Xa (New England Biolabs) wurde die entsprechenden Ansätze gekühlt und über Nacht bei Raumtemperatur mit 1 μg Faktor Xa pro 50 μg MBP-HE2αl inkubiert. Die Ansätze wurden mittels einer StrataClean-Säule (Stratagene) extrahiert, um salzfreie Proben für eine SDS-PAGE mit anschließendem Western-Blot und Immundetektion zu erhalten (Ziegler et al . (1997), Anal. Biochem. , 250, 257-260).
Bei der Western-Blot-Analyse mit nachfolgender Immundetektion wurden proteinhaltige Proben zunächst entweder mittels eines 15%igen Laemmli-Gels oder eines 16,5%igen TRIS-TRICINE-Gels, welches 6M Harnstoff enthielt, getrennt (Schägger und von Jagow (1987), Anal. Biochem., 166, 368-379) und anschließend in einem kontinuierlichen Puffersystem unter Verwendung eines semi-dry Blotters (Phase, Lübeck, Deutschland) auf PVDF-Membranen (Milli- pore, Eschborn, Deutschland) transferiert. Um die Effizienz des Transfers der kationischen HE2-Polypeptide zu erhöhen, wurde die Standardtransfermethode wie bei Szewcyk und Kozloff (1985) , Anal. Biochem., 150, 403-407, beschrieben modifiziert. Die Immundetektion von Polypeptiden wurde nach Standardmethoden unter Verwendung des CL-HRP Substratsystems (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) in einer Verdünnung von 1:10 und einem Röntgenfilm (Kodak) durchgeführt. Die Spezifität der Antikörperbindung wurde durch Kompetition bestätigt (Derr et al . (2001), Reproduction, 121, 435-446) . Entsprechende Polypeptid-Banden wurden bei Bedarf aus Coomassie-gefärbten Gelen ausgeschnitten und durch eine N- terminale Sequenzierung (TopLab, München, Deutschland) weiter analysiert.
Figur 4 zeigt das Ergebnis der Detektion unter Verwendung des P3-Antiserums. Es zeigte sich, daß das als Affinitätstag benutzte Maltose-Binde-Protein (MBP) ein sowohl theoretisch als auch durch SDS-PAGE bestimmbares Molekulargewicht von 42 KDa aufwies. Das MBP-proHE2c-l-Fusionsprotein besaß ein theoretisches Molekulargewicht von 50 KDa. Die obere Bande in Bahn 2, Figur 4 entsprach dem MBP-proHE2c-l-Fusionsprotein, welches noch nicht durch Furin verdaut worden war. Das apparente Molekulargewicht dieses großen Fusionsproteins konnte auf dem in Figur 4 dargestellten TRICIN-Gel nicht korrekt ermittelt werden, da es außerhalb des Peptidmarkerbereichs bandierte. Die Analyse des ungespaltenen MBP-proHE2αl mittels herkömmlicher 10% SDS-PAGE-Gele ergab jedoch ebenfalls ein apparentes Molekulargewicht von etwa 50 KDa für das Fusionsprotein. Nach Spaltung durch Furin resultierte das vollständig prozessierte HE2αl, welches ein theoretisches Molekulargewicht von 4,7 KDa besaß. Obwohl das apparente Molekulargewicht sich etwas kleiner als theoretisch erwartet darstellte, entsprach die untere Bande in Bahn 1 und 2 dem Furin-prozes- sierten HE2cl. Das proHE2c-l besaß ein theoretisches Molekulargewicht von 8,6 KDa. Die obere, im Western-Blot reaktive Bande in Bahn 1 entsprach dem proHE2 l, welches durch Spaltung des MBP- proHE2cl mit Faktor Xa-Protease freigesetzt und noch nicht durch Furin weiterprozessiert wurde. Beispiel 4
Aufreinigung von proHE2αl an Superose 12 und anschließender Untersuchung der FPLC-Fraktionen auf antimikrobielle Aktivität.
Zur Aufreinigung von proHE2o.l zu wurde ein Aliquot des aus Beispiel 2 gewonnen MBP-proHE2αl-Fusionsproteins unter den in Beispiel 3 beschrieben Reaktionsbedingungen mit Faktor Xa, nicht aber mit Furin verdaut. Nach Abspaltung von proHE2αl vom Maltose-Binde-Protein (MBP) durch Faktor Xa wurden die beiden Spaltprodukte MBP und proHE2o.l durch Gelfiltration an Superose 12 (Amersham-Pharmacia Biotech) voneinander getrennt. Die Superose 12-Säule wurde an einer FPLC- (Fast Protein Liquid Chromatography) -Anlage (LKB-Bromma) betrieben. Als Laufpuffer wurde dabei 120 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8.0 benutzt. Die aufgefangenen Fraktionen wurden über Nacht lyophilisiert . Durch den Unterdruck beim Lyophilisieren sublimierte das Ammoniumbicarbonat ebenfalls aus den Fraktionen, so daß nur Proteinbestandteile zurückblieben. Figur 9a zeigt die chronologisch auf dem Tricin- gel aufgetragenen Superose 12-FPLC-Fraktionen eines einzigen Laufs. Dabei zeigte sich, daß Fraktion 16 proHE2ofl-Polypeptid enthielt. Die Fraktionen 1 bis 17 von 4 Läufen wurden jeweils vereinigt und in einem herkömmlichen Radial-Diffusions-Assay auf antimikrobielle Aktivität gegen E. coli DH5o; untersucht. Es zeigte sich, daß keine der Fraktionen - auch nicht Fraktion 16 - antibiotische Aktivität besaß (Figur 9b) . Das proHE2o.l-Polypeptid weist somit keine antimikrobielle Aktivität auf.
Beispiel 5
Expression von reifem HE2αl im Baculovirus-Expressionssystem
Reifes HE2c-l wurde im Baculovirus-Expressionssystem rekombinant hergestellt. Es wurde ausgehend von dem in Beispiel 2 verwendeten HE2cl-cDNA-Fragment (SEQ ID Nr.15; Osterhoff et al . (1994), Biol. Repro. , 50, 516-525) ein Insertkonstrukt hergestellt, das für reifes HE2o.l mit N-terminalem 6-Histidintag und Faktor Xa- Spaltstelle kodiert. Als Sense-Oligonukleotid wurde das in SEQ ID Nr.16 dargestellte Oligonukleotid verwendet. Als Anti-Sense- Oligonukleotid wurde das in SEQ ID Nr.17 dargestellte Oligonukleotid verwendet. Das Konstrukt wurde über die BamHI- und Hindlll-Restriktionsschittstelle in den pMelBac-Vektor (INVITRO- GEN) kloniert. Nach Co-Transfektion mit Bac-N-Blue-DNA wurde der virionenhaltige Kuturüberstand der transfizierten Zellen im Plaque-Assay auf das Vorkommen rekombinanter Virionen untersucht . Diese wurden vermehrt und für die gezielte Infektion von High-Five-Insektenzellen verwendet. Das rekombinante Protein wurde von den infizierten Zellen in den Kulturüberstand abgegeben und aus diesem über IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) an einer Nickel-NTA-Säule aufgereinigt . Da das Insekten-Kulturmedium niedermolekulare Komponenten (u.a. Histi- din) enthielt, die die Nickel-IMAC stören, wurden die Kulturüberstände vor der IMAC-Reinigung mit Aceton präzipitiert und in destilliertem Wasser resuspendiert. Das gereinigte 6-Histidin- HE2c-l-Fusionspolypeptid wurde durch Faktor Xa-Spaltung vom Hi- stidintag befreit. Danach lag das reife HE2αl-Polypeptid vor, das durch RP-HPLC (Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography) an einer C4-Säule schließlich zur Homogenität aufgereinigt wurde. Das reife HE2c-l-Polypeptid erwies sich wie erwartet in einem herkömmlichen Radial-Diffusions-Assay als antimikrobiell aktiv gegen E. coli DH5α.
Beispiel 6
Herstellung chemosynthetischer HE2α2-Polypeptidfragmente
Ein aus den 30 C-terminalen Aminosäuren der HE2o.2-Polypeptidva- riante bestehendes Fragment wurde chemisch nach f-moc Festphasenmethoden synthetisiert. Um neben dem linearen Polypeptidfrag- ment auch eine partiell cyklische Form desselben zu erhalten, wurde nach Standardmethoden eine Disulfidbrücke in das lineare HE2C-2-Polypeptidfragment eingeführt. Es ließ sich feststellen, daß das lineare HE2o.2-Polypeptidfragment aufgrund seiner freien Cystein-Reste zur Aggregatbildung neigte (vgl. Figur 5a, Bahn 1) . Das partiell cyklisierte Fragment zeigte eine geringe Löslichkeit in Wasser und wurde daher in einer Mischung von 99,5% Dirnethylsulfoxid/0,5% Trifluoressigsäure gelöst. Beide HE2o.2- Polypeptidfragmente wurden im folgenden auf eine antimikrobielle Aktivität untersucht .
Beispiel 7
a) Nachweis der antibakteriellen Aktivität des HE2o.2-Polypep- tidfragment
Der Nachweis der antimikrobiellen Aktivität erfolgte mittels eines Gel-Overlay-Assays wie bei Lehrer et al. (1991), J Immunol Methods, 137, 167-173, beschrieben. E. coli DH5σ.-Bakterien wurden über Nacht 18 h lang bei 37°C zur Vorkultur in 3 ml Luria- Bertani (LB) -Medium (10 g/1 Bacto-Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl, pH 7,2) angezogen. Um eine logarithmisch wachsende Kultur zu erhalten, wurden 50 μl dieser Bakteriensuspension in 50 ml frisches LB-Medium überimpft, und weitere 2,5 h lang bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien abzentrifu- giert und in 10 ml mM Na3P04, pH 7,2, resuspendiert. Anschließend wurde die optische Dichte der Suspension bei 620 nm gemessen. Auf Basis der Beziehung OD620 0,2 = 5 x 10 CFU/ml wurde ein Volumen mit 4 x 106 CFU zu 10 ml 40°C warmen LB-Medium in 10 mM Na3P04, pH 7,2 mit 1 % Agarose (MetaPhor, Biozym, kleine Elek- troendomose (EEO) , niedriger S04 2"-Gehalt) gegeben und gut gemischt. Mit dem E. coli-haltigen Agar wurden Platten gegossen. Der bakterienhaltige Agar sollte eine Dicke von 2-3 mm haben. Die das Polypeptidfragment enthaltenden Proben wurden mittels einer kontinuierlichen Essigsäure-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel- elektrophorese (CAU-PAGE) aufgetrennt. Danach wurde das Gel in 10 mM Na3P04, pH 7,2, 20 min lang gewaschen bis der pH des Gels 7,2 erreicht hatte. Anschließend wurde das Gel auf die vorbereitete Agarplatte gelegt und 3 h lang bei 37°C inkubiert. Nach Abschluß der Inkubation wurde das Gel entfernt und der Agar mit 2 % Agarose (MetaPhor, Biozym) in LB-Medium überschichtet und über Nacht 16 h lang inkubiert. Die Banden antimikrobiell aktiver Proteine und Peptide waren als Hemmhöfe im Agar deutlich zu erkennen. Der Farbstoff Kristallviolett diente dabei als Posi- tivkontrolle .
Die Ergebnisse des Gel Overlay Assays sind in Figur 5b dargestellt. Es zeigte sich, daß sowohl die lineare Form als auch die partiell cyklisierte Form des die 30 C-terminalen Aminosäuren von HE2c-2 umfassenden Fragments eine antimikrobielle Wirkung gegen E. coli aufweisen. Im Essigsäure-Harnstoff-Polyacrylamid- Gel ließ sich erkennen, daß die lineare Form des Fragments trotz homogener Masse in ESI-MS-Untersuchungen mehrere Banden im Gel zeigte, was auf eine Oligomerbildung schließen ließ. Ein großer Teil der partiell cyklischen Moleküle wurde im oberen Teil des Gels unscharf getrennt, während im unteren Bereich des Gels mehrere einzelne Banden zu erkennen waren, was wiederum auf Oligomerbildung hinweist. Im Overlay-Assay entsprachen die Bereiche, in denen eine Lyse der Zellen zu verzeichnen war, den unteren Bereichen des Gels. Die Aggregate im oberen Bereich des Gels zeigten kein Abtötungsvermögen (vgl. Figur 5b) .
b) Quantifizierung der antibakteriellen Aktivität
Der Colony-Forming Unit Assay erfolgte unter Verwendung des Testorganismus E. coli DH5o. (Life Technologies Inc., Rockville, USA) . E. coli DH5c--Bakterien wurden über Nacht 18 h lang bei 37°C zur Vorkultur in 3 ml Luria-Bertani-Medium (LB) angezogen. Um eine logarithmisch wachsende Kultur zu erhalten, wurden 50 μl dieser Bakteriensuspension in 50 ml frisches LB-Medium überimpft, und bei 37°C inkubiert bis eine OD620 von 0,2 erreicht wurde. Die Bakterien wurden dann 1:104 mit 10 % LB-Medium in 10 mM Na3P04, pH 7,2 verdünnt. Je 100 μl dieser Bakteriensuspension wurden mit je 11 μl einer Lösung des HE2c-2-Polypeptidfrag- ments definierter Konzentration 3 h lang bei 37°C inkubiert. Nach 1:10-Verdünnung mit 10 mM Na3P04, pH 7,2 wurden je 100 μl jeder Probe auf LB-Agar ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Kolonien pro Platte wurden gezählt, um eine anti- biotische Aktivitätskurve zu erstellen. Die Grenze der Detek- tierbarkeit in diesem Assay entsprach 10 CFU/ml.
Das Ergebnis der Quantifizierung der Aktivität ist in Figur 6 gezeigt. Wie der Figur zu entnehmen ist, war eine Konzentration von weniger als 70 μg/ml sowohl des linearen als auch des partiell cyklischen, synthetischen HE2c-2-Polypeptidfragments bei einer Natriumkonzentration von 20 mM ausreichend, um 90% einer Kultur von E. coli DH5c- abzutöten.
Beispiel 8
Gel Retardations-Assays
Um zu überprüfen, ob die erfindungsgemäßen Peptide direkt mit freien Nukleinsäuren in Wechselwirkung treten, wurden Gel-Re- tardations-Assays wie bei Park et al . (1998), Biochemical and Biophysical Research Communications, 244, 253-257, beschrieben, durchgeführt. Jeweils 300 ng eines 500 bp-PCR-Amplifikates, das nicht mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden oder deren kodierenden Nukleinsäuren verwandt ist, wurde mit steigenden Konzentration des linearen HE2o.2-Polypeptidfragments oder einem als Negativkontrolle dienendem Peptid (Pl, vgl. SEQ ID Nr.9) in 20 μl Bindungs-Puffer (5% Glycerol, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20 mM KC1 und 50 μg/ml BSA) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 4 μl nativer Ladepuffer (10% Ficoll 400, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM EDTA, 0,25% Bromphenol-Blau und 0,25% Xylen-Cyanol) zugesetzt. 12 μl der Probe wurden auf einem l%igen Agarose-Gel unter Verwendung eines 0,5xTris-Borat-Laufpuffers getrennt.
Wie in Figur 8 gezeigt, konnte bei Inkubation des DNA-PCR-Am- plifikats mit dem als Negativkontrolle verwendeten synthetischen Peptid Pl auch bei Verwendung der höchsten Peptid-Konzentration keine Interaktion zwischen DNA und Peptid beobachtet werden, die sich in einer Abnahme der Bandenintensität des besagten Amplifi- kats äußert. Hingegen waren bereits 1,2 μg des HE2σ.2-Polypeptid- fragments ausreichend, um eine vollständige Verschiebung der Amplifikat-Bande im Agarose-Gel zu bewirken ( "Gel-Shift") .

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Polypeptiden mit der in SEQ ID Nr.5 oder SEQ ID Nr.6 angegebenen Aminosäuresequenz oder von Fragmenten oder Varianten derselben zur Behandlung von mikrobiellen Infektionserkrankungen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment die in SEQ ID Nr.7 oder SEQ ID Nr.8 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.
3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid am N-terminalen Ende zusätzliche Aminosäuren aufweist, welche die Aktivität des Polypeptids nicht beeinflussen.
4. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment am N-terminalen Ende zusätzliche Aminosäuren aufweist, welche die Aktivität des Fragments nicht beeinflussen.
5. Verwendung von Varianten der Polypeptide und/oder Fragmenten gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 mit gleicher antimikrobieller Wirksamkeit zur Behandlung von mikrobiellen Infektionserkrankungen.
6. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptide in linearer oder in cyklischer Form vorliegen.
7. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptide als Monomere, Dimere oder als Oli- gomere vorliegen.
8. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobielle Infektionserkrankung eine bakterielle Infektionserkrankung ist.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Infektionerkrankung eine Erkrankung des Urogenital-Traktes ist.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptide oder Fragmente derselben zur parenteralen Applikation formuliert sind.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptide oder Fragmente derselben zur lokalen Applikation formuliert sind.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptide oder Fragmente oder Varianten derselben nach den Ansprüchen 1 bis 4 an ihrem N- terminalen Ende eine zusätzliche Aminosäuresequenz aufweisen, welche die antimikrobielle Wirksamkeit inaktiviert, wobei die inaktivierende Aminosäuresequenz über eine proteolytische Spaltstelle mit den Polypeptiden oder Fragmenten oder Varianten derselben verknüpft ist, und die Spaltstelle von einem Enzym erkannt wird, welches von dem/den Erreger (n) einer mikrobiellen Erkrankung, nicht jedoch von gesunden Kδrperzellen produziert wird.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym die IgAl-Protease vom Typ 2 ist.
14. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym die Metalloprotease ZapA ist .
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