WO2003077930A1

WO2003077930A1 - Verwendung von mindestens einem flavonoid des quercetins zur erhöhung des spiegels von nützlichen kurzkettigen fettsäuren im unteren intestinaltrakt

Info

Publication number: WO2003077930A1
Application number: PCT/DE2003/000475
Authority: WO
Inventors: Detlef Schmiedl; Regina Reszka
Original assignee: G.O.T. Therapeutics Gmbh
Priority date: 2002-03-20
Filing date: 2003-02-15
Publication date: 2003-09-25
Also published as: AU2003210147A1; DE10212502A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem Flavonoid des Quercetins in Kombination mit mindestens einem Saccharid ausgewählt aus resistenter Stärke (RS), einem Nichtstärke-Polysaccharid oder einem Oligosaccharid zur kontinuierlich verbesserten Erhöhung des Spiegels von nützlichen kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) im unteren Intestinaltrakt sowie zur Stimulierung der Rückresorption von Flüssigkeit und gelöster Elektrolyte.

Description

VERWENDUNG VON MINDESTENS EINEM FLAVONOID DES QUERCETINS ZUR ERHÖHUNG DES SPIEGELS VON NÜTZLICHEN KURZKETTIGEN FETTSÄUREN IM UNTEREN INTESTINAL_TRAKT

Beschreibung

Die Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem Flavonoid des Quercetins in Kombination mit mindestens einem Saccharid ausgewählt aus resistenter Stärke (RS), einem Nichtstarke-Polysaccharid oder einem Oligosaccharid zur kontinuierlich verbesserten Erhöhung des Spiegels von nützlichen kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) im unteren Intestinaltrakt sowie zur Stimulierung der Rückresorption von Flüssigkeit und gelöster Elektrolyte.

Eine Reihe von Studien zeigen eine inverse Korrelation zwischen dem Verzehr Ballaststoff-angereicherter Nahrung und dem Kolonkrebsrisiko. Acetat, Propionat und Butyrat - drei der so genannten kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) aus der Gruppe der C2-5 organischen Fettsäuren werden durch anaerobe bakterielle Fermentation unverdaulicher Nahrungsbestandteile z.B. α-Amylase resistenter Stärke (RS) und anderer Ballaststoffe (Inulin, Fructooligosaccharide, ß-Glukane u.a.) im Dickdarm von Säugern gebildet. Sie werden durch das Kolonepithel absorbiert. Auf Grund der epidemiologischen Befunde wird eine antineoplastische Rolle für Butyrat postuliert.

Im Dickdarm von Säugern liegen Acetat, Propionat und Butyrat zu ca. 83% der gesamten SCFA mit einer Gesamtkonzentration von ungefähr 100 mM und einem weitestgehend konstanten molaren Verhältnis von ungefähr 60:25:15 vor. Von diesen drei Säuren hat Butyrat den stärksten Effekt auf das Wachstum und die Differenzierung der Kolonozyten, während Propionat geringere Effekte und Acetat keine nachweisbaren Effekte auf das Wachstum und die Differenzierung der Kolonozyten ausübt (1).

Bekannt ist ferner, dass die Gesamtkonzentration und die relative molare Konzentration der individuellen SCFA durch die als Substrat für die mikrobielle Fermentation angebotenen unverdaulichen Kohlenhydrate, Proteine und Ballaststoffarten beeinflußt werden.

So sind z.B. aus EP 0756 828 B1 Diätfasern enthaltende Nahrungszusammensetzungen bekannt, die u.a. geeignet sind, nützliche kurzkettige Fettsäuren (SCFA) in einem ausgewogenem Anteil und mit ausreichender und gleichmäßiger Geschwindigkeit während des Durchgangs durch lleum und Dickdarm zu bilden.

Es ist beschrieben, dass eine Erhöhung des Spiegels an SCFA und insbesondere an Butyrat die Inzidenz von Dickdarmerkrankungen wie Krebs und chronischer Entzündungen beeinflußt. Butyrat spielt eine wichtige Rolle für das Wachstum der Kolonmukosa und die Proliferation der Epithelzellen. Dabei übernimmt es zwei Funktionen:

- der größte Teil dient der aeroben Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) der Kolonepithelzellen und wird dabei verbraucht und

- es wirkt als Signalmetabolit, der die Zellmigration und die Proliferation normaler Kolonepithelzellen stimuliert.

Eine Senkung des Butyratspiegels im Kolon führt zu chronischer mukosaler Athrophie. Einlaufe mit SCFA-Lösungen erhöhen die mukosale Regeneration, die Kryptenlänge und den DNS-Gehalt der Kolonepithelzellen. (2, 3, 4, 5, 6)

Im Falle einer Entzündung oder von Kolonkrebs ändern sich die funktioneilen Eigenschaften des Butyrats in den Kolonzellen. Je mehr die anaerobe ATP- Produktion durch Glykolyse dominiert, desto niedriger ist die Butyratoxidation. Die meisten Daten zu Butyrateffekten stammen von in vitro Experimenten mit Krebszeil- Linien. Im Gegensatz zu normalen Epithelzellen inhibiert Butyrat die Proliferation und aktiviert die Apoptose in Krebszellen. Es stimuliert die Expression von Tumorsuppressorproteinen (APC, E-Cadherin). Dadurch bindet mehr ß-Catenin an die zelluläre Plasmamembran. Ein anderer Teil des ß-Catenin bindet an das im Zytosol lokalisierte APC-Protein. Nach Phosphorylierung des Dimers wird ß-Catenin proteolytisch abgebaut. Beide Effekte behindern die Akkumulierung des ß-Catenin im Zellkern durch die die Onkogenese resultieren würde (7).

Weiterhin beeinflußt Butyrat die Wechselwirkung zwischen Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinasen, woraus eine Arrestierung der neoplastischen Zellen in der G1 Phase des Zellzyklus sowie eine Aktivierung der Apoptose resultiert. In Gegenwart von Butyrat und Glucose ist die Expression der Cycline Ai und D /D₃ gesenkt, während die Expression des Cyclins Di steigt. Desweiteren sind die Cyclin- abhängigen Kinasen cdc2 und cdk2 vermindert, während die Cyclin-abhängigen Kinasen cdk 4 und cdk 6 unverändert bleiben. Entsprechend der Aktivierung der Apoptose sind die zellulären Konzentrationen des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA) sowie bei 2 (Inhibitor der Apoptose) als auch mutiertes Protein p53 verringert

(1).

Im Zusammenhang mit Colitis Ulcerosa und dem kolorektalen Krebs korrelieren erhöhte Level des Laminin Rezeptors mit der Krebsentwicklung. Kolonkrebszellen binden vorzugsweise an Laminin, ein Glycoprotein - Bestandteil der Basalmembran, über Fibronektin oder Kollagen IV. Butyrat reduziert jedoch die Adhärenz von Krebszellen zum Laminin. Es wird angenommen, dass das Enzym Galaktosyltransferase an der Bindung der Krebszellen an das Laminin beteiligt ist. Diese Daten erlauben die Schlußfolgerung, dass eine verstärkte Zelldifferenzierung zu einem verringerten Zugang Laminin-bindenden Proteins an der Basalmembran führt. Es ist bisher nicht bekannt, ob ähnliche Wechselwirkungen bei entzündlichen Prozessen existieren. Jedoch sind Colitis ulcerosa und Dickdarmkrebs durch einen Verlust des Laminin charakterisiert (1 , 7).

Es ist darüber hinaus bekannt, dass sich in Abwesenheit von SCFA im Dickdarm von Tieren und Menschen eine entzündliche Erkrankung (Diversion Colitis) entwickelt (8).

Typisch für Patienten mit Colitis ulcerosa und Kolonkrebs sind niedrige Butyratspiegel im Dickdarm sowie dessen häufige Besiedlung mit Sulfatreduzierenden Bakterien (z.B. Desulfovibrio). Diese Bakterien sind für erhöhte Konzentrationen an Sulfiten, Sulfiden und Mercaptanen verantwortlich. Diese Metabolite reduzieren sehr stark die Butyratoxidation, und die Butyrataufnahme der Kolonozyten wird durch 3-Mercaptopropionat kompetitiv gehemmt. Diese Metabolite induzieren weiterhin Veränderungen in der Kryptenarchitektur, die mit solchen bei Colitis ulcerosa vergleichbar sind. In Anwesenheit hoher Butyratspiegel sind diese jedoch umkehrbar (9, 10)

Die Behandlung mittels Butyrateinläufe wurde erfolgreich in einem transmuralen Entzündungsmodell der Ratte (TNBS-Colitis Modell) getestet. Einlaufe mit 1 ml 80mM Natriumbutyratlösung hatten einen signifikanten therapeutischen Effekt. Durch TNBS-Einwirkung im Rattenkolon entwickeln sich mehr und größere Tumore als nach Azoxymethaneinwirkung (AOM) im Vergleich zu Kontrollen. Auch die Karzinogenese wurde durch Butyrateinläufe im TNBS-Modell unterdrückt. Daneben konnte gezeigt werden, dass sich die im TNBS-Modell herunterregulierte Transglutaminaseaktivität in Kolonozyten durch Butyrateinläufe früher normalisiert (7). Weiterhin sind Ergebnisse zu einer Reihe von klinischen Studien mit SCFA- Einlauftherapien bei Patienten mit Colitis ulcerosa veröffentlicht. 100 ml einer Lösung, pH 7, die 80 mM Natriumacetat, 30 mM Natriumpropionat und 40mM an Natriumbutyrat und Glukose-frei war, wurde verwendet. Die Ergebnisse zu den Studien an Colitis ulcerosa Patienten waren jedoch weniger aussagekräftig. In einigen Studien wurde der Entzündungsgrad um mehr als 60% reduziert und der Kryptlabel-Index im oberen Kryptenkompartiment sowie die Dichte polymorphkerniger Leukozyten (Neutrophile, Phagozyten) in der Lamina propia der Mucosawand waren signifikant gesenkt. Die Zeilproliferation war jedoch allgemein unverändert. Andere Studien zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen Placebo- und SCFA-Gruppen. Aber ein positiver Trend wurde nur in den SCFA- Gruppen gefunden. Teilweise traten mehr Fälle einer vollständige Remission oder signifikante Verbesserungen auf.

Kontinuierlich erhöhte luminale Konzentrationen von SCFA und längere Kontaktzeiten sind deshalb unbedingt notwendig für therapeutische Effekte bei Colitis ulcerosa, um pathologische Mechanismen zu überwinden. Eine bekannte Möglichkeit ist die kontinuierliche orale Aufnahme von gutfermentierbarer RS, Inulin, Fruktooligosacchariden oder anderen Ballaststoffen, bei deren Fermentation ausreichend hohe Butyratspiegel gebildet werden, wie auch in EP 0756 828 B1 , das Diätfasern enthaltende Nahrungsmittel beschreibt. Als Faserstoffe werden insbesondere lösliche und nichtlösliche Nichtstärke-Polysaccharide, nicht-verdaubare Oligosaccharide und/oder resistente Stärke eingesetzt.

Da ein weiterer kritischer Punkt im Studiendesign die Notwendigkeit verschiedener Co-Faktoren für eine optimale Wirkung von SCFAs ist, zum Beispiel von Glukose für die Bildung von ATP durch Glycolyse und als Substrat für nichtpathologische Bakterien, ist resistente Stärke (RS) als ein brauchbares Substrat für die Mehrzahl der intestinalen Bakterien, die Glukose und SCFA produzieren, auch anderweitig beschrieben (bevorzugt RS Typ 1 bis 4 (7,11)). Wie bereits erwähnt, sind Butyrat und Propionat bevorzugte Substrate der aeroben ATP-Bildung der Kolonepithelzellen. Daraus resultiert eine erhöhte energetische Kapazität zelluläre Ungleichgewichte und Störungen der intestinalen Barrierefunktion zu überwinden. Acetat aktiviert die kapillare Blutzirkulation (7).

Insbesondere aus diesen Untersuchungen von Jakobasch et al. (7) am transmuralen Entzündungsmodell der Ratte (TNBS) zum Einfluß oral applizierter resistenter Stärke auf die Pathogenese ist bekannt, dass in gesunden Kontrollen nach 1-wöchiger RS- Aufnahme (1 ,5 - 2g RS/ Tag) die SCFA-Spiegel und insbesondere die Butyratspiegel im Kolon signifikant gegenüber gesunden Kontrollen (RS-freies Futter) erhöht waren. Nach Induktion der Entzündung kam es in der RS-freien Gruppe im proximalen und distalen Kolon zu einem signifikant ausgeprägten und in der RS-Gruppe im distalen Kolon zu einem leichten Anstau der SCFA, bedingt durch eine Resorptionsstörung. Berechnete Resorptionsraten erlauben die Schlußfolgerung, dass die induzierte Resorptionsstörung für Butyrat und Propionat schneller abklingt als für Acetat im Laufe des Heilungsprozesses. Unter RS-freier Ernährung waren selbst nach 21 Tagen die Werte für die Acetatabsorption noch nicht normalisiert. Die induzierte Resorptionsstörung für SCFA war im distalen Kolon unter RS-Fütterung signifikant niedriger. Eine allgemeine Normalisierung der Resorption war bereits am 13 Tag nach TNBS-Einwirkung zu verzeichnen. Unter RS-Fütterung war außerdem im proximalen Kolon die Hemmung der SCFA-Resorption vollständig aufgehoben. Histologische Untersuchungen zeigen weiterhin eine schnellere Regeneration der Kryptenstruktur der Kolonwand nach TNBS-induzierter Colitis bei RS-Fütterung.

Neuere Untersuchungen zeigen, daß Butyrat Dosis-abhängig die Aktivierung des NFKB modulieren kann. So konnte gezeigt werden, daß Butyrat die Entzündungsantwort in Biopsiematerial von CD-Patienten durch Inhibierung der NFκB-Aktivierung in Immunzellen unterdrückt. Hohe Spiegel an zirkulierenden und mukosalen proinflamatorischen Zytokinen sind charakteristisch für CED (CD u. Colitis ulcerosa). Intestinales Biopsiematerial sowie einkernige Zellen der Lamina propria (LPMC) isoliert aus entzündeter Mukosa von CD-Patienten produzieren mehr IL1 ß, IL-6 und TNF als normale Kontrollen. Die TNF-Sekretion konnte Dosis-abhängig durch Butyrat in entzündetem und nichtentzündetem Gewebe vermindert werden. Wobei nach Einstellung 10mM Butyrat-Spiegeln die TNF-Level auf Kontrollwerte sanken. Ähnliche Ergebnisse wurden für IL-6 und weniger deutlich für IL-1 ß beobachtet. Weiterhin wurde gezeigt, daß Butyrat über die Runterregulation der mRNA -Expression die Produktion der proinflammatorischen Zytokine in intestinalen Biopsien und isolierten LPMC drosselt (15).

Zirkulierendes bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) kann zu einer Aktivierung von Monozyten (Immunzellen, Haupteffektor der Entzündungsantwort) in Patienten mit CED führen. Allgemein ist bekannt, daß Monozyten eine ganze Reihe von Zytokinen (TNF, IL-1 ß, IL-6) als Antwort auf LPS-Stimulation ausschütten. Die mit LPS durchgeführte Stimulation bewirkte eine gesteigerte TNF-Ausschüttung von einzellkernigen Zellen des peripheren Blutes (PBMC). Durch Butyrat konnte dieser Effekt unterdrückt werden. Entsprechend senkte Butyrat die Expression von mRNA für entzündungsfördernde Zytokine in diesen Blutzellen. Verantwortlich hierfür war der in einkernigen Blutzellen (PBMC) und Zellen der Lamina propria (LPMC) nachgewiesene Effekt der Butyrat-vermittelten Unterdrückung der Translokation der aktivierten Form des NFKB. Dieser Effekt war verbunden mit einem Anstieg der lκB- Spiegel (15).

Auf Grund der o. g. Fakten ist es notwendig, kontinuierlich hohe Spiegel an den kurzkettigen Fettsäuren Acetat, Propionat und insbesondere Butyrat im Dickdarm einzustellen.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, weitere geeignete Mittel bereitzustellen, die die Konzentration von SCFA's erhöhen und entzündungshemmende Wirkungen insbesondere im Dickdarm zeigen.

Überraschend wurde gefunden, dass eine kombinierte Gabe von mindestens einem Flavonoid des Quercetins in Kombination mit mindestens einem Saccharid ausgewählt aus resistenter Stärke (RS), einem Nichtstarke-Polysaccharid oder einem Oligosaccharid eine signifikante, kontinuierliche Erhöhung des Spiegels von nützlichen kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) im unteren Intestinalbereich, vorzugsweise im Kolon (Dickdarm), bewirkt, wobei diese kombinierte Gabe einen unerwarteten synergistischen Effekt auslöst.

Flavonoide sind an sich bekannten antiinfammatorische Substanzen. Es sind phenolische Verbindungen, die in höheren Pflanzen weit verbreitet sind und von Mensch und Tier mit der Nahrung aufgenommen werden. Mehr als 500 verschiedene Flavonoide sind derzeit bekannt, wobei Quercetin eins der am häufigsten vorkommenden ist. Flavonoide können als Agiycone, Glykoside und in methylierter Form vorliegen. Im allgemeinen liegen sie jedoch als Glycoside in pflanzlichem Material vor. Verschiedene Zucker können am Aglycon ß-glycosidisch gebunden sein. Diese Bindung ist durch Enzyme der intestinalen Mikroflora spaltbar, während dem Säugetierorganismus die entsprechenden Enzyme zur Spaltung der ß- glycosidischen Bindung fehlen. Zur Zeit ist weder geklärt, ob die Glycoside oder die Agiycone besser, noch in welchem Ausmaß sie absorbiert werden (7, 14). Wenig ist bisher über den Einfluß der Flavonoide auf die Mukosa des Gastrointestinaltraktes bekannt, mit der sie nach oraler Aufnahme in Kontakt kommen.

Neuere Untersuchungen in der Ussing-Kammer an Epithelgewebe des proximalen Kolon der Ratte zeigen, dass nach serosaler Applikation von 100 μM Quercetin der ausschließlich vom Epithel ausgehende aktive lonentransport (elektrogener lonentransport), gemessen als Kurzschlußstrom l_Sc, sowie die Potentialdifferenz (PD) über dem Epithel ansteigt, nach 25min ein Maximum durchläuft und 90 min nach Applikation wieder Ausgangswerte erreicht (12). Dieser Effekt war Konzentrations-abhängig (25 -150μM) nachweisbar. Untersuchungen an Epithelgewebe des Jejunum, lleum und distalen Kolon der Ratte zeigen den gleichen Trend. Im Gegensatz dazu führte die Applikation von Quercetin (100μM) auf der mucosalen Seite des Epithelgewebes proximalen Rattenkolons (Lumenseite des Dickdarms) erst nach Entfernen der Schleimschicht (Mucus) auf der mucosalen Seite zu einer signifikanten Veränderung des l_sc und der PD.

Flux-Messungen für Na⁺ , CI^" u. HC0₃ ^" -Ionen zeigten nur für letztere einen Effekt des Quercetin. So wurde nachgewiesen, dass Quercetin signifikant den serosal -> mucosal (s -> m) CI^"- und HC0₃ ^" Flux, also die Sekretion von Chlorid- und Hydrogenkarbonat-Ionen steigert.

Als Konsequenz daraus erhöhte Quercetin die Nettochloridsekretion, die dem induziertem Anstieg von l_sc entsprach. Eine Behandlung mit dem Chlorid- Kanalblocker 5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoesäure (NPPB) verminderte die Quercetininduktion des l_sc. Dabei war die Quercetin-induzierte Steigerung von l_sc von der extrazellulären Chloridkonzentration abhängig. Des weiteren konnte der Quercetin-induzierte l_sc durch Blocker des Na⁺ - K⁺- 2CI^" Co-Transporters (Bumetanide und Azosemide) teilweise inhibiert werden. Im Gegensatz dazu hat das Glycosid 3-Rhamnosyl-glucosyl-Quercetin (Rutin) keinen Einfluß auf l_sc und PD unter den gleichen experimentellen Bedingungen (12).

Offensichtlich beeinflußt das Aglycon Quercetin den intestinalen Elektrolyttransport. Diese Ergebnisse stehen jedoch im Widerspruch zu Befunden, die zeigen, dass das Aglycon Quercetin nach intraperitonealer Applikation induzierte Diarrhöen (PGE₂ oder Castor-oil) und die intestinal Flüssigkeitssekretion im Tiermodell reduziert. Der gleiche Effekt wurde nach oraler Gabe von Quercetin-3-L-Rhamnosid (Quercetrin) bei induzierten Diarrhöen nachgewiesen. Jedoch beeinflußt das Glycosid den Wasser- und Elektrolyttransport unter normalen Bedingungen nicht (13). Auch die orale Aufnahme von Rutin (5- 100mg/kg Körpergewicht) nach TNBS-induzierter Colitis bei Ratten zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Inzidenz von Diarrhöen im Vergleich mit der Kontrollgruppe (14).

Desweiteren wurde nun gefunden, dass die erfindungsgemäße Kombination von Flavonoiden mit einem o.g. Saccharid zur Stimulierung der Rückresorption von Flüssigkeit und gelösten Elektrolyten im unteren Intestinaltrakt geeignet ist, was insbesondere bei Diarrhöen von Bedeutung ist.

Gemäß der Erfindung sind die genannten Substanzen bevorzugt bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) einsetzbar, da insbesondere die Flavonoide a) verschiedene Enzyme, die bei Entzündungen aktiviert sind, inhibieren können, b) eine Reihe von Zellen des Immunsystems in vitro runterreguliert werden und c) die meisten Flavonoide potente Antioxidantien und Radikalfänger sind.

In einer bevorzugten Ausführungsvariante ist das Flavonoid 3-Rhamnosyl-glucosyl quercetin (Rutin).

Anstelle RS, vorzugsweise α-Amylase resistente Stärke, oder zusätzlich zur RS können Nichtstärke-Polysaccharide, vzw. Inulin und ß-Glucane, und/oder Oligosaccharide, vzw. kurz- und langkettiges Inulin und Fructooligosaccharide, zugesetzt werden.

Die erfindungsgemäße Verwendung von mindestens einem Flavonoid und mindestens einem Saccharid erfolgt in bevorzugten Mengenverhältnissen. Gemäß der Erfindung wird das Flavonoid in einer Dosierung von 0,05-150 mg/kg Körpergewicht/Tag verwendet, die Anwendung von Sacchariden erfolgt in einer bevorzugten Dosierung von 5-50 g/Tag, vorzugsweise 5-30 g/Tag, besonders bevorzugt 10-15 g/Tag.

Die erfindungsgemäße Kombination bewirkt einen überraschenden synergistischen Effekt und führt zu einer signifikanten Steigerung des SCFA-Spiegels im Dickdarm im Vergleich zur Gabe von Rutin allein und resistenter Stärke allein, vgl. Abb. 4, 5 und 6. Infolge wird die Wiederherstellung der Barrierefunktion des Kolonepithels bei entzündlichen Prozessen begünstigt.

Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Kombinationspräparate, die mindestens ein Flavonoid des Quercetins, vorzugsweise Rutin, in Kombination mit resistenter Stärke, ggf. mit an sich üblichen Hilfs- und Trägerstoffen umfassen.

Diese Präparate können oral als Nahrungsergänzungsmittel oder in der Nahrung appliziert werden. Alternativ sind die Präparate in Form von pharmazeutischen Darreichungsformen bevorzugt als Tabletten, Pellets, Kapseln, Granula oder Dragees einsetzbar. In einer anderen bevorzugten Anwendungsform können die Kombinationspräparate auch rektal, vorzugsweise durch Suppositorien, rektale Schaumprodukte und Klistiere, appliziert werden. Ihre Herstellung ist dem Fachmann bekannt.

Die Kombinationspräparate werden insbesondere zur Therapie von mit mangelndem SCFA-Spiegel in Zusammenhang stehenden Erkrankungen oder prophylaktisch z.B. vor Operationen zur Verbesserung der Gewebefestigkeit usw. eingesetzt. Das heißt sie werden zur therapeutischen Behandlung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED), Morbus Crohn (CD), Colitis ulzera usw. verwendet.

Die Erfindung wird anhand von Beispielen belegt, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll.

Ausführungsbeispiel

Leitfähigkeitsmessungen in der Ussing-Kammer an partiell gestripter, proximaler gesunder bzw. entzündeter Kolonwand zeigen einen signifikanten Einfluß erhöhter SCFA-Spiegel, insbesondere an Butyrat, auf die Barrierefunktion, ausgedrückt als epithelialer Widerstand R^e [Ω*cm²]. Während unter RS-freier Fütterung am 4. Tag nach induzierter Entzündung die Barriere signifikant gegenüber gesunden Kontrollen erniedrigt war, blieb die epitheliale Barriere in den Gruppen, die höhere Spiegel an SCFA, insbesondere an Butyrat aufwiesen (RS oder RS/Rutin), gegenüber gesunden Tierproben erhalten (Fig. 1 , Tab. 1 ).

Tab. 1.

Resultate der one-way ANOVA für den Epithel-Widerstand (R^e), α=0,95; P<0,05: signifikante Unterschiede.

Untersuchungen zum Einfluß der Fütterungsregime auf den elektrogenen lonentransport wurden ebenfalls durchgeführt. Die Fütterung RS- bzw. RS/Flav.- haltigem Futter (Rutin) hat erwartungsgemäß keinen Einfluß auf den elektrogenen lonentransport verglichen mit der Kontrollgruppe, ausgedrückt als Kurzschlußstrom (short-circuit current: lsc), gemessen an proximaler partiell gestripter Kolonwand gesunder Ratten (Fig. 2). Offensichtlich beeinflußt nur das serosal verabreichte Aglycon Quercetin den elektrogenen lonentransport. Weiterhin wurden in der Ussing- Kammer Untersuchungen zum Einfluß der Fütterungsregime auf die induzierbare Chloridsekretion durchgeführt. Dazu wurde auf der serosalen Seite Prostaglandin E₂ (PGE₂)und Theophylin zugesetzt. Die Fütterung von RS- bzw. RS/Flav.-haltigem Futter (Rutin) hat ebenfalls erwartungsgemäß keinen Einfluß auf die durch PGE₂/Theophylin induzierbare Chloridsekretion verglichen mit der Kontrollgruppe, ausgedrückt als ΔI (Δ 1= I_gesamt - lsc), gemessen an proximaler partiell gestripter Kolonwand gesunder Ratten (Fig. 3).

Die Ergebnisse in den Abb. 1 - 3, zusammenfassend, lassen den Schluß zu, dass die orale Applikation von resistenter Stärke in Kombination mit dem Flavonoid Rutin die Wiederherstellung der Barrierefunktion des Kolonepithels bei endzündlichen Prozessen des Dickdarms erheblich begünstigt, jedoch keinen Einfluß auf den elektrogenen lonentransport und auf die induzierbare Chloridsekretion ausübt.

In überraschender Weise steigert die kombinierte orale Applikation von RS u. Rutin signifikant die Spiegel der SCFA (μmol/g wet weight) zusätzlich nicht nur im Caecum, sondern auch im proximalen u. distalen Kolon, und insbesondere im Rectum der Ratten verglichen zur Kontroll-, RS- und Rutingruppe (Fig. 4., Tab. 2).

Tab. 2.

Resultate der one-way ANOVA für die SCFAs, α=0,95; P<0,05: signifikante

Unterschiede (c: control, RS: resistente Stärke, Ru: Rutin).

Die Spiegel an SCFA können auch auf die Trockenmasse der Lumeninhalte bezogen werden. Die Angabe erfolgt dann in [μmol/g Trockengewicht]. Der Befund, dargestellt in Abb. 4 ist auch signifikant, wenn die Werte auf die Trockenmasse bezogen werden (Fig. 5.)

Nach Berechnung der molaren Verhältnisse der SCFA aus deren Mittelwerten (Fig. 4) ergibt sich folgendes Bild (Fig. 6).

Aus der Abb. 6 ist ableitbar, dass dem Befund aus Abb. 4 ein synergistischer und kein additiver Effekt zu Grunde liegt, da sich die molaren Verhältnisse der SCFA Acetat, Propionat und Butyrat zwischen den Gruppen RS, RS/Rutin u. Rutin in jedem Abschnitt des unteren Intestinaltraktes unterscheiden. Besonders deutlich wird dies im distalen Kolon der Ratten.

Konsequenterweise sind die erhöhten Spiegel an Butyrat in der RS/Rutin- Gruppe zum einen auf eine Stimulation der Gesamtproduktion an SCFA zurückzuführen (absolute Steigerung). Zum anderen ist offensichtlich eine RS/Rutin- stimulierte, Darmflora-vermittelte Verschiebung der Produktion zu Gunsten des Butyrats für die Änderung der molaren Verhältnisse an SCFA (relative Steigerung) und für die Gesamtproduktion von Butyrat in dieser Gruppe verantwortlich. Wie auch immer, aus den Abb. 4, 5 u. 6. wird deutlich, dass nach kombinierter Applikation von Rutin und resistenter Stärke (RS) höhere Spiegel an SCFA, insbesondere an Butyrat (absolut und/oder relativ) in den weiter rektalwärts liegenden Darmabschnitten entstehen als nach Applikation von RS oder Rutin bzw. Kontrollfutter allein.

Ein Vergleich der Feuchtegehalte bzw. Trockenmasseanteile in den Darminhalten der einzelnen Abschnitte ergab überraschender Weise folgendes Bild (Fig. 7.).

Der Dickdarm ist ein Organ, in dem u.a. die Resorption von Wasser und darin gelöster Elektrolyte stattfindet. Demzufolge muss sich unter normalen Bedingungen die Trockenmasse des Lumeninhaltes rektalwärts (vom Caecum zum Rektum) erhöhen. Dies ist in Abb. 7 für die Kontrollgruppe anschaulich belegt. Während im Caecum der Kontrollgruppe eine durchschnittliche Trockenmasse von ca. 20% vorliegt, liegt die Trockenmasse im Rectuminhalt bei ca. 40%. Auch in den anderen Gruppen (RS, RS/Rutin, Rutin) ist die Resorption von Wasser an Hand der steigenden Trockenmassen ersichtlich.

Eine besonders ausgeprägte Resorption von Flüssigkeit findet jedoch nur in der RS/Rutin-Gruppe, besonders deutlich im distalen Kolon, statt.

Tab. 3. Resultate der one-way ANOVA, α=0,95; P<0,05: signifikante Unterschiede.

Bisher veröffentlichte im Stand der Technik diskutierte Ergebnisse belegen jedoch, dass nur serosal appliziertes Quercetin (Aglycon) in vitro den lonentransport in Epithelzellen (jedoch Sekretion von Chlorid und Hydrogenkarbonat-Ionen) stimuliert, während nach oraler Applikation von Rutin (Quercetinglycosid) in Tierexperimenten ein Einfluß auf lonentransportprozesse im Dickdarm nicht nachweisbar war. In Abb. 7 wird dieses Ergebnis noch einmal bestätigt. Die Resorptionen von Wasser in der Rutingruppe und der Kontrollgruppe sind erwartungsgemäß gleich. Jedoch, und das war sehr überraschend, erfolgt bei kombinierter Applikation von Rutin und RS eine signifikant verstärkte Resorption von Flüssigkeit aus dem Lumen (Tab. 3).

Eine Stimulation der Rückresorption von Flüssigkeit und Elektrolyten im Dickdarm ist immer dann von besonderem Interesse, wenn sie z.B. bei Erkrankungen wie Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Durchfallerkrankungen, Diarrhöen, Cholera u.a. gestört ist. Die kombinierte Applikation von Rutin und resistenter Stärke könnte demzufolge als Mittel mit antidiarrhötischer Wirkung eingesetzt werden.

Zusammenfassend wird festgestellt:

Insbesondere nach einer kombinierten oralen Applikation von α- Amylase resistenter Stärke (RS) und dem Flavonoid 3-Rhamnosyl-glucosylquercetin (Rutin) gemäß der Erfindung werden signifikant die Spiegel der SCFA (Acetat, Propionat und Butyrat (μmol/g Feuchtgewicht) nicht nur im Caecum, sondern auch im proximalen u. distalen Kolon, und insbesondere im Rectum von Ratten verglichen zur Kontroll-, RS- und Rutingruppe (Fig. 4., Tab. 2) erhöht.

Aus den molaren Verhältnissen der SCFA in den einzelnen Darmabschnitten (Abb. 6) ist ableitbar, dass dem Befund aus Abb. 4 ein synergistischer Effekt zu Grunde liegt, da sich die molaren Verhältnisse der SCFA Acetat, Propionat und Butyrat zwischen den Gruppen RS, RS/Rutin u. Rutin in jedem Abschnitt des unteren Intestinaltraktes unterscheiden. Besonders deutlich wird dies im distalen Kolon der Ratten.

Konsequenterweise sind die erhöhten Spiegel an Butyrat in der RS/Rutin- Gruppe zum einen auf eine Stimulation der Gesamtproduktion an SCFA zurückzuführen (absolute Steigerung). Zum anderen ist offensichtlich eine RS/Rutin- stimulierte, Darmflora-vermittelte Verschiebung der Produktion zu Gunsten des Butyrats für die Änderung der molaren Verhältnisse an SCFA (relative Steigerung) und für die Gesamtproduktion von Butyrat in dieser Gruppe verantwortlich. Erfindungsgemäß ist die Stimulation der SCFA-Bildung und insbesondere die Bildung von Butyrat nach oraler Applikation auch dann möglich, wenn an die Stelle der resistenten Stärke ein anderer Ballaststoff, wie z.B. ein Nichtstarke-Polysaccharid Inulin und ß-Glucane oder ein Oligosaccharid, wie z.B. hydrolysiertes Inulin und Fructane u.a. im Kombinationspräparat tritt.

Möglich ist dies auch, wenn gemischte Ballaststoffe aus der o. g. Gruppe an die Stelle der RS treten. Des weiteren ist dies möglich, wenn die resistente Stärke im Gemisch mit einem oder mehreren der o.g. Ballaststoffe zusammen mit einem Flavonoid, bevorzugt Rutin oral appliziert wird. Neben der bevorzugten oralen Applikation kann auch die Applikation rektal durchgeführt werden, mittels z.B. einer isotonischen Lösung, die des weiteren Glukose und /oder Fruktose und/ oder Oligomere und/oder Polymere davon und Rutin enthält.

Der Dickdarm ist ein Organ, in dem u.a. die Resorption von Wasser und darin gelöster Elektrolyten stattfindet. Demzufolge muss sich unter normalen Bedingungen die Trockenmasse des Lumeninhaltes rektalwärts (vom Caecum zum Rektum) erhöhen.

Ein Vergleich der Feuchtegehalte bzw. Trockenmasseanteile in den Darminhalten der einzelnen Abschnitte für alle Gruppen (Kontrolle, RS, RS/Rutin, Rutin) ergab überraschender Weise folgendes Bild: Während im Caecum der Kontrollgruppe eine durchschnittliche Trockenmasse von ca. 20% vorliegt, liegt die Trockenmasse im Rectuminhalt bei ca. 40%. Auch in den anderen Gruppen (RS, RS/Rutin, Rutin) ist die Resorption von Wasser an Hand der steigenden Trockenmassen ersichtlich.

Eine besonders ausgeprägte Resorption von Flüssigkeit findet jedoch nur in der RS/Rutin-Gruppe, besonders deutlich im distalen Kolon, statt (Abb. 7, Tab. 3). Der zugrunde liegende Mechanismus dieses Befundes ist bisher ungeklärt. Deutlich wird jedoch, dass es einen ursächlichen Zusammenhang zwischen hohen Spiegeln der SCFA Acetat, Propionat und Butyrat, Glukose (mikrobielle Fermentationprodukte der RS) und dem Flavonoid Rutin oder dessen Abbauprodukten im Kolon der Ratten gibt. Bisher ungeklärt ist, ob das Rutin oder das Aglycon Quercetin nach Abspaltung des Zuckerrestes, von der mukosalen Seite her stimulierend wirkt oder resorbiertes Rutin oder das Aglycon von der serosalen Seite her wirksam wird. Unklar ist auch, ob die Natrium-Kalium-Pumpe der Epithelzellen stimuliert wird und/oder ein verstärkter Natrium/Wasserstoffprotonen-Austausch stattfindet.

Methoden

1. Zusammensetzung der semisynthetischen Diäten

Tab. 4. Zusammensetzung der Rattennahrung (g/1000g Nahrung)

Charakterisierung der intestinalen Barrierefunktion

Die intestinale Barrierefunktion der partiell gestripten proximalen Darmwand von gesunden Ratten und an einem Colitis-Modell (TNBS) der Ratte wurden mit elektrophysikalischen Messungen in der Ussing-Kammer analysiert entsprechend der Methode beschrieben in (Rohweder, J. et al. In vitro characterization of the intestinal barrier function in two Standard modeis of colitis in rats. Langenbecks Arch Chir. I (Forumband 1997): 439 - 443.) Auslösung von Colitis

Die Colitis wird ausgelöst durch rektale Applikation von Trinitrobenzensulfonsäure (TNBS) in Ethanol (vgl. Rohweder et.al.)

4. Die Bestimmung von kurzkettigen Fettsäuren (SCFA).

Die SCFAs wurden bestimmt mit der Methode beschrieben in Schmiedl, D. et al., Production of a heat-stable, butyrogenic resistant starch. Carbohydrate polymers, 43, (2000): 183 - 193.

Produktion von resistenter Stärke Typ 3 für die Fütterungsstudie Die verwendete resistente Stärke wurde produziert durch Hitze-Feuchte- Behandlung eines RS3-haltigen Produktes, so genannte Novelose 330 von National Starch and Chemical. Diese Methode ist beschrieben in EP 0012 459. Die Bestimmung des RS-Gehaltes.

Der Inhalt von RS wurde ebenfalls nach Schmiedl et al. bestimmt. Die Bestimmung der Trockensubstanz.

200 mg des gefrorenen homogenisierten Inhaltes (Frischgewicht) wurden in einer getrockneten, kleinen Glasflasche mit einem Glasstopfen gewogen und bei einer Temperatur von 105°C 2 Stunden getrocknet. Die heiße Flasche wurde in einem Excikator auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die abgekühlte Flasche wurde erneut gewogen. Die Trockensubstanz wurde wie folgt berechnet: 100 * trockenes Gewicht/Frischgewicht = (%). Die Bestimmung wurde wiederholt.

Literatur

(1 ) Velazquez, O.C., Lederer, H.M. and J.L. Rombeau Butyrate and the Colonocyte. Implications for Neoplasia. Digestive Diseases and Sciences, 41 , No. 4 (April 1996): 727-739.

(2) Sakata, T.

Influence of short-chain fatty acids on epithelial cell proliferation in the rat intestine: A possible explanation for trophic effects of fermentable fiber, gut microbes and luminal trophic factors. Br. J. Nutr., 58, (1987), 95-101.

(3) Kripke, S.A. et al.

Stimulation of intestinal mucosal growth with intracolonic infusion of short- chain fatty acids. J. Parenter. Enter. Nutr., 13, (1989), 109-116.

(4) Janne, P., Carpenter, Y and G. Willems

Colonic mucosal atrophy induced by a liquid elemental diet in rats. Am. J. Dig. Dis.,22, (1977), 808-812.

(5) Koruda, M.J. et al.

Parenteral nutrition supplemented with short-chain fatty acids: Effect on the small-bowel mucosa in normal rats. Am. J. Clin. Nutr.,51 , (1990), 685-689.

(6) Friedel, D and G.M. Levine

Effect of short-chain fatty acids on colonic function and structure. J. Parenter. Enter. Nutr., 16, (No. 1), (1992), 1-4.

(7) Jacobasch, G. et al.

Dietary resistant starch and chronic inflammatory bowel diseases. Int. J. Colorectal Dis., 14, (1999), 201-211.

(8) Chapman, M.A.S. et al.

Butyrate oxidation is impaired in the colonic mucosa of sufferers of quiescent ulcerative colitis. Gut, 35, (1994), 73-76.

(9) Stein, J. et al.

Mercaptopropionate inhibits butyrate uptake in isolated apical membrane vesicles of the rat distal colon. Gastroentorology, 108, (1995), 673-679.

(10) Pitcher, M.C.L., and J.H. cummings Hydrogen sulfide: a bacteria toxin in ulcerative colitis? Gut, 39, (1996), 1-4.

(11 ) Haralampu, S.G.

Resistant starch - a review of the physical properties and biological impact of

RS₃ .

Carbohydrate Polymers, 41 , (2000), 285 - 292.

(12) Cermak, R., Föllmer, U. and S. Wolffram

Dietary Flavonol quercetin induces chlorid secretion in rat colon.

Am. J. Physiol., 275 (Gastrointest. Liver Physiol. 38), (1998) :G1166-G1172.

(13) Galvez, J. et al.

Antidiarrhoeic activity of quercitrin in mice and rats. J. Pharm. Pharmacol., 45, (1993): 157-159.

(14) Havsteen, B.

Flavonoids, a class of natural products of high pharmacological potency.

Biochemical Pharmacology, 32, (No. 7) (1983): 1141 - 1148.

(15) Segain, J.-P. et al.

Butyrate inhibits inflammatory responses through NFKB inhibition: implications for Crohn s disease. Gut, 47, (2000), 397 - 403.

Claims

Patentansprüche

1. Verwendung von mindestens einem Flavonoid des Quercetins in Kombination mit mindestens einem Saccharid ausgewählt aus resistenter Stärke, einem Nichtstarke-Polysaccharid oder einem Oligosaccharid zur kontinuierlich verbesserten Erhöhung des Spiegels von nützlichen kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) im unteren Intestinaltrakt.

2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen zur Erhöhung des Acetat-, Propionat- und/oder Butyratspiegels, insbesondere des Butyratspiegels, verwendet werden.

3. Verwendung von mindestens einem Flavonoid des Quercetins in Kombination mit mindestens einem Saccharid ausgewählt aus resistenter Stärke, einem Nichtstarke-Polysaccharid oder einem Oligosaccharid zur Stimulierung der Rückresorption von Flüssigkeit und gelösten Elektrolyten.

4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Flavonoid 3-Rhamnosyl-glucosyl quercetin (Rutin) verwendet wird.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Saccharide in Kombination eingesetzt werden.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Saccharid eine α-Amylase resistente Stärke verwendet wird.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Nichtstärke-Polysaccharide Inulin und ß-Glucane verwendet werden.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Oligosaccharide kurz- und langkettiges Inulin und Fructooligosaccharide verwendet werden. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Flavonoid in einer Dosierung von 0,05-150 mg/kg Körpergewicht/Tag verwendet wird.

Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Saccharid in einer Dosierung von 5-50 g/Tag, vorzugsweise 5-30 g/Tag, insbesondere 10-15 g/Tag, verwendet wird.

Kombinationspräparat umfassend mindestens ein Flavonoid des Quercetins, vorzugsweise Rutin, in Kombination mit mindestens einem Saccharid ausgewählt aus resistenter Stärke, einem Nichtstarke-Polysaccharid oder einem Oligosaccharid als Nahrungsmittel bzw. Nahrungsergänzungsmittel oder zur pharmazeutischen Applikation.

Kombinationspräparat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es mit an sich üblichen Hilfs- und Trägerstoffen zur oralen oder rektalen Applikation vorliegt.