WO2003075004A2 - Verfahren und vorrichtung zur parallelanalyse von bio-molekülen - Google Patents

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WO2003075004A2
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Josef Stegemann
Robert Alexander Ventzki
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Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL)
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Definitions

  • the separation (fractionation) of a mixture of substances according to one or more physical or chemical parameters of the individual substances is generally of great importance as an analytical method in chemistry and biotechnology.
  • One technique of separation is to have the mixture of substances (sample), influenced by physical or chemical parameters, move through a suitable separation medium.
  • the individual substances are separated according to their properties through interactions with the separation medium and are then available as individual fractions.
  • suitable parameters are electrical forces, pressure, centrifugal forces, gravitation and osmotic forces, diffusion, sieve effects, exclusion, Van der Waals forces, pH value gradients.
  • the separation medium can be either solid, liquid or colloidal.
  • the different migration behavior of the individual fractions can generally be used to draw conclusions about their properties.
  • Separation process or two-dimensional (hereinafter referred to as 2D separation process) separation medium:
  • a single sample is placed at certain points at the opening of a (capillary) tube that contains the separation medium and in this separated.
  • a corresponding number of (capillary) tubes are required for the simultaneous separation of several samples. Examples include capillary gel electrophoresis for DNA analysis and high pressure liquid chromatography (HPLC).
  • Another disadvantage of the ID or 2D separation method which is also based on edge effects, is that due to different migration times of the samples in the center of the separation medium, compared to the edge regions, the bands can expand further (so-called smilling effect).
  • increasing the band width reduces the selectivity of the analysis. This effect is caused by interactions between the samples and the surface that surrounds and absorbs the separation medium as well as in the case of the electrophoretic Separation by thermally induced inhomogeneities in the viscosity of the separation medium and by electroosmotic effects on its boundary surfaces.
  • the separation medium e.g. a gel
  • the capillary tubes and the glass panes surrounding the separation medium must be extremely clean in order to minimize the edge effects mentioned above. There is also the risk that bubbles will form in the separation medium during filling or during the separation process.
  • a common disadvantage of both of the separation methods outlined is that the number of samples analyzed at the same time (a maximum of a few 100) is relatively small.
  • US 5,051,162 relates to a separation device according to the electrophoresis method combined with a fluorescence detector and to a sample container assigned to it.
  • the electrophoresis device contains a number of gel layers in plate form which are arranged substantially parallel to one another, these plate form (essentially two-dimensional) gel layers representing a multiplicity of migration lines along which sample fractions which have been previously marked, from upper ends to lower ends of the plate-like gel layers are able to migrate.
  • An upper buffer container is provided which contains a buffer solution which is in contact with the upper ends of the plate-shaped gel layers. Below this is another buffer container, which also contains a buffer solution, which is connected to the lower ends of the plate-shaped gel layers.
  • the flow of the sample material through a flow cell provided on the Peltier block is realized via a reagent pump and a reservoir connected to it and a valve block.
  • This publication describes, among other things, the arrangement of particles in one plane with the aid of a fluorescence-activated flow cytometer (FACS device) and is therefore relevant for the sample loading area described in the present patent application.
  • FACS device fluorescence-activated flow cytometer
  • the object of the invention is to provide a method and a device with which a separation of substance mixtures, for example mixtures of biomolecules, DNA fragments, proteins or the like, can be carried out with a high throughput rate, and a simultaneous (on-line) or subsequent detection as well as, in addition or alternatively, a qualitative, quantitative and preparative analysis is made possible.
  • substance mixtures for example mixtures of biomolecules, DNA fragments, proteins or the like
  • a three-dimensional separation and thus an analysis of up to 10 4 samples can be carried out in parallel.
  • a three-dimensional separation is characterized by the separation in a separation medium which essentially extends over three dimensions, in that the samples to be separated are supplied to the separation medium in a two-dimensional arrangement.
  • the method proposed according to the invention is characterized in particular by very simple handling with regard to the supply of the sample mixtures to be analyzed.
  • DNA sequencing reactions can, for example, be carried out on a two-dimensional, ie essentially flat, support which is then fed to the device for separating the individual samples.
  • Edge area so that the separation processes carried out in connection with 1-dimensional or 2-dimensional processes caused by edge effects, e.g. with regard to an expansion of the bands (smiling effect).
  • the method proposed according to the invention offers the not inconsiderable advantage that individual capillary tubes are now filled, as in the 1-dimensional separation method usual - can be omitted. Furthermore, compared to inserting the separation medium between two glass plates - as is required in some conventional two-dimensional separation processes - the requirements of the handling personnel are lower, since according to the process proposed according to the invention, the separation medium is poured into an essentially cylindrical container. In addition, the three-dimensional separation process provides a much larger volume of separation medium in which the separation of a large number of samples can be carried out simultaneously in parallel.
  • the forces required to cause the samples to migrate through the separation medium can be physical or chemical in nature. Examples include electrical forces, gravitation, centrifugal forces, or by diffusion, pressure and concentration gradients as well as forces created by osmosis, which can act individually or in combination on the samples.
  • a preferred way of the three-dimensional separation method proposed according to the invention uses a force exerted on the samples by an electric field in order to bring about their migration through the separation medium.
  • the samples are generally electrically charged; the separation process is called electrophoresis. Due to different charge and mass, the sample molecules move through the separation medium at different speeds.
  • the relative mobility of a substance is given based on a standard that has also been separated. This means that not only can substances be separated, but also characterized more closely by their migration behavior.
  • electrophoretic separation methods in free solution (migrating boundary layer electrophoresis, continuous carrier-free electrophoresis, capillary electrophoresis) from separation in stabilizing media, such as agarose gels or polyacrylamide gels.
  • stabilizing media such as agarose gels or polyacrylamide gels.
  • the separation principle of electrophoresis has already achieved great importance as an analysis method in biotechnology, since the separation mechanism can be used almost universally. For example, proteins, amino acids, peptides, blood plasma proteins, vitamins, enzymes, cells and cell components can be separated; it is also a very gentle process, ie the samples are generally available for further preparative or analytical steps after the separation process.
  • a characteristic of electrophoresis is the current flow through the separation medium and the associated conversion of electrical energy into heat. This is called Joule 'see heat; it is released within the medium through which the electrical current flows, in this case within the separation medium, and causes a temperature rise in the latter. On the one hand, this would cause a decomposition of the samples and, on the other hand, a change in the separation properties of the separation medium and ultimately its decomposition. Even before the actual decomposition of the separation medium "is it generally results in a temperature-dependent change in its electrical conductivity and viscosity.
  • the individual migration paths of the samples through the separation medium can be kept parallel to the vertical axis of the analysis cavity by thermal insulation of the separation volume, viewed in the radial direction.
  • a second room enclosing the first room can contain a medium which is used as thermal insulation can serve for the first room. Since, ideally, no heat is transported in the radial direction via the boundary wall of the first space into the surroundings, the Joule heat generated in the electrophoresis method can only be dissipated via the end faces of a device suitable for carrying out the method proposed according to the invention. Under the idealizing assumptions that heat exchange takes place only through heat conduction and that a homogeneous heat conversion takes place in the separation medium, a temperature profile is established in the analysis cavity according to the following quadratic function:
  • the above formula is only a rough approximation, since in reality there are other mechanisms of heat exchange (e.g. through radiation).
  • the Joule heat conversion is not homogeneous, partly due to the inhomogeneous temperature along the z-axis, which influences the electrical field parameters via the electrolytic conductivity.
  • the temperature In the inner central area of the first room and in its peripheral area, however, the temperature is essentially the same, in other words, there is no temperature gradient in the radial (r) direction.
  • the identical temperature profile along the vertical axis (z-axis) in the interior of the room and at its edge areas results in an isotropic gel viscosity seen in the radial direction of the first room and ensures uniform ion mobility.
  • the electrical field lines and migration paths of the samples from one electrode to the opposite electrode which occur in the first space then run parallel to the z-axis, i.e. the vertical axis of the first space without deflection in the radial direction.
  • the temperature profile in the separation medium parallel to its vertical axis (z-axis) in its edge region corresponds to the temperature profile in the central region. This prevents deflection, ie curvature of the migration balins due to temperature influences.
  • the formation of the migration paths of the individual samples, starting from the sample loading area and running strictly parallel to the Z-axis, can be supported in that in the first room, and possibly in the surrounding second room, on the respective surface with the area normal to the sample migration direction by means of a temperature control Device generates and maintains a temperature profile along the sample migration direction corresponds essentially to that temperature profile along the sample migration direction in the center of the first room.
  • the first space In order to maintain a temperature distribution which is essentially independent of a coordinate running perpendicular to the direction of sample migration, the first space, and possibly the second space surrounding it, can be thermally insulated against a heat flow perpendicular to the direction of sample migration.
  • the electrically converted Joule heat can be dissipated in the first room, and possibly in the second room surrounding it, on their respective end faces - in the case of a cylindrical shape - with the surface normal in or against the sample migration direction by means of a temperature control device.
  • the separating structure is assigned electrode elements, which can be configured, for example, in the form of plates or rings, in such a way that when an electrical voltage is applied to them, the (electrically charged) individual samples migrate essentially in the direction of the vertical axis of the separation device.
  • the second chamber may be surrounded by a further space or stand in this in conjunction, in which) a solvent, such as an electrolyte or a buffer medium is that of the substantially cylindrical shape arranged separating structure is in contact with the end sides'.
  • a solvent such as an electrolyte or a buffer medium
  • Setting or maintaining the desired electrical, chemical, and physical properties of the separation medium and the solvent surrounding the electrodes can be promoted by circulating the solvent contained in the further space, be it an electrolyte or a buffer medium, between the electrode elements.
  • a heat dissipation can be connected to the end faces of the first space, and optionally of the second space, with a circulation.
  • the buffer medium is advantageously circulated in the radial direction, either from the center into the peripheral region or in the opposite direction, and can take place by means of a circulating device (pump).
  • the electrical properties — or other physical and chemical properties — of the solvent advantageously correspond to those of the separation medium accommodated in the first space.
  • the further space can be connected to an external reservoir to improve ion exchange.
  • the separation medium used in the process proposed according to the invention is accommodated within the first space in such a way that a ratio of its radial extension to its longitudinal extent is> 0.2, preferably> 0.3, particularly preferably greater than 0.5 established.
  • the separation medium can be either solid, liquid or colloidal; it can be a transparent or a non-transparent separation medium.
  • separation media are polyacrylamide, agarose or hydroxyl cellulose.
  • a medium should preferably be used as the buffer medium, the physical, electrical and chemical properties of which are as close as possible to those of the selected separation medium.
  • the sample can be applied by introducing a two-dimensional layer (sample plate) in or on which the individual samples are arranged in two dimensions essentially in terms of area.
  • a sample plate for receiving samples can be integrated into the separation layer itself.
  • the individual samples can be fixed in place on or on a carrier material or on essentially 2-dimensional arrangements of punctiform elevations or depressions, e.g. applied by arrays of pins, microelectrodes, hollow bodies, pipettes, tips.
  • the sample plates used preferably comprise a porous support material.
  • the individual samples of the respective sample application can also be localized, for example, by electrical or magnetic forces on the sample plate.
  • the samples can also be placed directly on the separation medium, e.g. be applied in regularly arranged depressions located at one of its interfaces. In this case, part of the separation medium itself represents the sample plate. As a rule, however, sample plates represent independent devices for handling the samples.
  • Chemical reactions or physical treatments or measurements can be carried out on the individual samples before the separation process. This is preferably done in or on the sample plate, or in a device from which the individual samples can be transferred to the sample plate.
  • the individual samples can consist of individual molecules or of a large number of molecules of the same type are amplified, for which purpose, in addition to the PCR method, cloning and subsequent selective multiplication can also be used. Reactions preceding the separation (eg DNA sequencing reactions) can also be carried out in the same way.
  • a two-dimensional distribution of the individual samples on the sample plate, or a device from which the individual samples can be transferred to the sample plate, can be carried out, for example, by a cell sorter or a fluorescence-activated cell sorter (FACS).
  • the individual samples can be present, for example, on or in particles, preferably in host organisms, for example yeasts, bacteria or so-called competent cells.
  • the particles are distributed on the basis of measured physical or chemical properties.
  • the physical properties can be, for example, the intensity or wavelength of emitted fluorescent light.
  • the two-dimensional distribution of the individual samples on the sample plate takes place "in such a way that the distance between adjacent individual samples does not fall below a minimum distance.
  • the minimum distance is essentially dependent on the type of separation and the samples and must be chosen such that the independent separation and detection of the
  • a The organism's color change is based on the presence of such a DNA segment (insert), which is caused by the targeted manipulation of its DNA to form a dye, which causes the formation of the dye in organisms which carry an insert
  • FACS device fluorescence-activated cell sorter
  • the sample distribution based on measured properties can be followed by further chemical reactions or physical treatment steps, for example sequencing reactions, preferably in the sample plate. Separation according to 3 parameters
  • the individual sample preparation of the respective sample application can be carried out in such a way that several samples are first separated in parallel processing according to one parameter in an essentially two-dimensional separation medium.
  • the two-dimensional separation medium, containing the separated sample fractions is then brought into contact as a sample plate with an interface of the three-dimensional separation medium.
  • the samples contained in the two-dimensional separation medium can then be separated in the three-dimensional separation medium according to a further parameter by migration in a direction which is oriented essentially perpendicular to their original running direction.
  • the separation by the two-dimensional separation medium can also be preceded by a pre-separation in a one-dimensional separation medium so that the method proposed according to the invention can be used to separate samples according to a total of three independent parameters.
  • a plurality of one-dimensional separation media with pre-separated sample fractions contained therein can be brought into contact with the interface of the three-dimensional separation medium in a substantially parallel arrangement as a sample plate, and the samples can be separated therein.
  • the method proposed according to the invention enables the separation of samples according to only two parameters, but in parallel processing with high throughput.
  • the samples can be detected by appropriate methods and, additionally or alternatively, a chemical or physical treatment of the separation medium and / or the samples can take place. If necessary, individual sample fractions can also be removed from the separation medium for further analytical or preparative steps.
  • the above-described electrophoresis techniques can be used using the above-described sample plates, which contain a suitable separation medium for this purpose. This is particularly important for the separation of protein mixtures proposed as an application according to three independent parameters (eg pH value, size, hydrophobicity or solubility) by means of the three-dimensional separation process proposed according to the invention. Detection, fraction collector
  • a combination of detection and preparative collection of the sample fractions makes sense in many cases. In exceptional cases, the preparation of the individual sample fractions is carried out exclusively without a detection. A distinction can be made between two methods for collecting the sample fractions during the separation process:
  • the first embodiment collects the sample fractions directly at an interface of the separation medium and stores them there in or on a suitable collection medium.
  • the collecting medium preferably consists of a membrane or individual sample plates, which can be guided past an interface of the separation medium at regular time intervals.
  • the sample fractions are deposited on different partial surfaces of the membrane or on different sample plates, depending on the retention time, by regularly transporting the collecting membrane out of the separating device or regularly changing the sample plates.
  • the samples are led out of the separation device through an array of capillaries, tubes or tubes and collected by an external fraction collector.
  • the detection can take place during the sample migration (online detection) or after completion of the separation. Detection of the samples during their migration can be attributed to a two-dimensional imaging process.
  • the sample fractions are detected as they pass through a selected, two-dimensional plane detection area.
  • the detection area oriented essentially perpendicular to the migration direction of the samples is preferably close to an interface of the separation medium; it can be inside or outside the Separation medium lie.
  • a continuous series of two-dimensional images can be recorded from this essentially two-dimensional detection area at time intervals, for example by means of the detection devices described below, and recorded in a suitable manner. The spatial distances along the migration direction that result from the separation of the sample fractions between them are thus implemented in the time intervals of their passage through the detection area.
  • a three-dimensional imaging method is required.
  • a stereoscopic imaging method can be used for this.
  • an essentially two-dimensionally defined detection area can be moved through the separation medium, preferably in the direction of its vertical axis (z-axis) (scanning). From this detection area, e.g. by the detection devices described below, a series of two-dimensional images are recorded and recorded in a suitable manner.
  • Separation process e.g. by parallel cuts, disassembled into slices, however, a return to a conventional two-dimensional imaging method can also take place in the case of detection after completion of the separation process.
  • the cuts preferably run parallel or perpendicular to the sample migration direction.
  • the essentially two-dimensional slices of the separation medium obtained in this way can be imaged by customary, suitable 2D scanning methods. Preparative isolation of individual sample fractions by removing them from the disks is then also easily possible.
  • a preferred technique for online detection is a confocal detection device, the measuring head of which can be designed as a multiple measuring head.
  • the confocal detection device is provided with one or more optical systems which are designed such that the object-side focal or line-shaped foci of the illumination beam paths coincide with those of the detection beam paths.
  • the beam paths of the optical systems for illumination and detection are preferably arranged at right angles to one another.
  • the dichroic beam splitter for separating the beam paths from the illumination and detection device can be omitted in this case.
  • the (multiple) measuring head of the confocal detection device can be provided with optical absorption filters and alternatively or additionally with interference filters.
  • the detection device can be in x, y; r, ⁇ direction with respect to a cross-sectional area of the first space, which contains the separation medium and the individual samples to be separated therein, are moved (scanning).
  • the generally electrical signal generated during the scanning in the detection device can then be supplied to suitable devices for amplification and recording.
  • the detection area can be illuminated point by point.
  • one (or more) monochromatic, coherent light sources eg lasers
  • the beam (s) can be deflected towards an objective, which focuses it on a point in the detection plane.
  • the beam (s) can strike fluorescent molecules which emit fluorescent light of a different, larger wavelength by excitation with light of the laser wavelength.
  • the same or a different lens detects part of the emitted light, which is diverted through the dichroic beam splitter to a detector, for example a photomultiplier, avalanche diode or a CCD camera.
  • the optical beam paths the illumination device and the detection device are designed such that their two object-side focus points lie (point) confocal on one another in the detection area.
  • Image construction is made possible by moving (scanning) the measuring head in the x, y or ⁇ , r direction relative to the separation medium.
  • a simplified detection device uses a cylindrical confocal arrangement of an illumination device in combination with a line detector.
  • the radiation emanating from the line of illumination is focused in the form of a line in the detection area by a suitable optical system.
  • the illuminated line in the detection area is imaged on the detection line by a suitable optical system.
  • the arrangement of the optical systems assigned to the line detector and the lighting device is designated as cylindrical confocal if the two object-side focal lines of the. assigned optical beam paths are congruent with each other.
  • the detection area can be illuminated, for example, by means of a line-shaped arrangement of light-emitting diodes or laser diodes or a correspondingly fan-shaped moved or expanded laser beam.
  • the optical system which is assigned to a cylindrical confocal combination of illumination and detection device, can contain one or more gradient index lens fields, cylindrical lenses, microlens fields or a combination of these optical elements.
  • One or more gradient index lens fields are preferably used.
  • Such a lens field (array) consists of a large number of individual gradient index lenses arranged close to one another.
  • Gradient index lenses are characterized in that the Refractive index within the cylindrical lens body decreases continuously from the central axis to the outside. Light rays entering the face are thereby deflected sinusoidally within the lens.
  • Gradient index lenses are manufactured in diameters of approximately 0.1 to 2 millimeters.
  • the length of the cylindrical lens body determines the focal length or the optical imaging properties of the lens.
  • Gradient index lenses of a certain length produce an upright 1-to-1 image. When several such lenses are arranged in an array, the images of individual lenses overlap to form a spatially continuous, upright 1-to-1 image of any desired extent.
  • a cell-shaped area By imaging the light of a light-emitting diode row, or preferably a laser diode row, by means of a gradient index lens array in the detection area, a cell-shaped area can be spatially selectively illuminated in this area.
  • the same lens array can be used for spatially selective imaging of the illuminated area within the separation medium on a line-shaped detection device, for example a CCD or photodiode line.
  • the light emanating from the illuminated area in the detection area can be separated by a dichroic beam splitter in a wavelength-specific manner from the light emanating from the illumination device and fed to the detection device.
  • other optical absorption and interference filters can be used to improve the spectral selectivity of the detection.
  • Another embodiment variant of the detection device uses an orthogonally cylindrical confocal arrangement of a cell-shaped lighting device in combination with a line detector.
  • a cell-shaped area can be spatially selectively illuminated in the detection area.
  • the illuminated area can be imaged onto the detection device by one or two gradient index lens arrays (s) with an optical axis arranged at an angle with respect to the optical axis of the lighting device.
  • the essentially rectangular (orthogonally confocal) arrangement of the optical axes of illumination and detection devices can reduce the background radiation caused by (Rayleigh) scattering of the illumination light in the separation medium and a better spatial resolution in the direction of the z-axis can be achieved.
  • the dichroic beam splitter for separating the beam paths from the illumination and detection device can be omitted in this case.
  • optical absorption and interference filters can be used to improve the spectral selectivity of the detection.
  • the variants of cylindrical confocal arrangements described above can also be designed as a multiple measuring head by combining several such illumination and detection lines.
  • the illumination and detection units combined in such a multiple measuring head can also be individually designed to receive different radiation, for example those with different wavelengths or polarizations.
  • the above-described illumination and detection lines with optical axes arranged essentially orthogonally to one another and focus lines lying confocally on one another are shifted one-dimensionally in the x or ⁇ direction with respect to the separation medium (scanning).
  • a point-confocal or cylindrical confocal detection device can be integrated in one of the electrodes, preferably the electrode to which the samples migrate within the separation medium of the first space.
  • the electrode is then moved together with the detector.
  • the homogeneity of the electrical field built up in the separation medium - averaged over one or more scan periods - is not impaired by the detection device. Due to the arrangement of a confocal detection device above the separation medium, gas bubbles arising in the course of the electrophoresis process above the first space do not impair the imaging of the fluorescent light onto the detector. Illumination perpendicular to the direction of migration
  • an illumination device can be arranged such that its optical axis is essentially perpendicular to the migration direction of the samples.
  • a preferably monochromatic, coherent radiation source e.g. one or more lasers, an essentially two-dimensionally extending, substantially perpendicular to the migration direction of the samples oriented detection area illuminated.
  • the light beam (s) can be deflected or divided in a fan shape by a suitable optical system, for example by galvanometric deflection devices, rotating polygon mirrors or cylindrical lenses.
  • the detection area can be inside the separation medium or outside the separation medium, preferably close to one of its interfaces.
  • the detection area remains stationary with respect to the separation medium.
  • the sample fractions are then detected as they pass through the detection area.
  • the detection area can be shifted for scanning by the separation medium, preferably in the direction of its vertical axis (z-axis) (scanning).
  • the separation medium can be removed from the separation device and fed to a separate detection device.
  • the direction of polarization of the illuminating light is preferably selected such that only a minimal fraction of the background radiation caused by (Rayleigh) scattering in the separation medium and the surrounding solvent is emitted in the direction of the detection devices.
  • the wavelength of the illuminating light is preferably chosen so that optimal fluorescence excitation of the appropriately labeled sample fractions is achieved, and the interference radiation caused by the fluorescent medium and the surrounding solvent is minimized.
  • Monochromatic radiation sources with a high degree of polarization for example lasers, are preferably used.
  • the radiation emitted by the sample fractions can be recorded by a detection device whose optical axis is essentially parallel to
  • the vertical axis of the cylindrical separation body lies and intersects one of its end faces.
  • the detection device then collects radiation which emerges from the front of the separation body.
  • the optical axis of the DeteMons device can be oriented against the migration direction, but preferably in the direction of the migration of the samples.
  • an arrangement of the detection device with an optical axis lying essentially obliquely to the vertical axis of the separation body can also be advantageous.
  • the optical axis of the detection system intersects the wall surface of the essentially cylindrical separation body; it can be oriented in or against the direction of migration.
  • the detection device collects radiation that emanates from the detection area, e.g. through a corresponding window, through the surrounding wall surface of the separation body. In any case, care must be taken to ensure that an optical system with a high numerical aperture is used in the detection device.
  • the radiation from the detection area e.g. through a corresponding window
  • Detection level is from the optical
  • the detection device for detecting the entire detection area can be shifted relative to it in the x-, y- or ⁇ -direction (scanning).
  • a device which is used to carry out the method according to the invention comprises a separation structure which contains at least one space which extends substantially over three space coordinates and which is designed such that it can be filled with a separation medium.
  • the samples to be separated are fed to the separation medium on one end face.
  • a detection device is assigned to the separation arrangement formed in this way.
  • a device for the preparative collection of the individual sample fractions can be assigned.
  • the separating device is advantageously designed in such a way that an electric field can be built up in it, or that it can be subjected to centrifugal accelerations, or by a suitable device, for example by a pump or pneumatics a hydrostatic pressure or a gas pressure can be applied.
  • Electrophoresis device is advantageously designed in such a way that an electric field can be built up in it, or that it can be subjected to centrifugal accelerations, or by a suitable device, for example by a pump or pneumatics a hydrostatic pressure or a gas pressure can be applied.
  • the arrangement should contain a second space, which surrounds the first space and is arranged concentrically to it, with thermal insulation.
  • the first space should have a radius / length ratio R / Z greater than 0.5 in order to ensure good dissipation of the joules released during electrophoresis through the end faces of the separation medium contained in it. Heat dissipation is particularly good when the radius to length ratio R / Z is greater than 1.
  • the total number of individual samples that can be separated by the device grows square with the radius of the first space that contains the separation medium.
  • the second space surrounding the first space can contain an insulation medium which serves for the thermal insulation of the separation body in the radial direction.
  • the insulation causes the formation of a temperature profile in the first room that is largely independent of the radial (r) coordinate.
  • the formation of a temperature profile in the first room that is independent of the radial (r) coordinate can be supported by temperature control of the room boundary of the first room along the migration direction of the samples (vertical axis or z axis).
  • the temperature of the room boundary can e.g. done electrically or by means of a tempering medium.
  • the end faces of the first space and, if appropriate, the second space are covered by electrodes in such a way that when an electrical medium is applied in the separation medium accommodated in the first space
  • the electrode elements are preferably plate-shaped and contain electrically conductive connections, which are each arranged on the side of the electrodes that face away from the separation medium. The spaces surrounding the electrodes border on that
  • Separation medium They are designed to be mixed with a liquid or a
  • Electrolytes preferably a buffer medium, can be filled and further so that a heat flow over the end faces of the separation medium is made possible.
  • a heat exchange device is preferably provided there. This is advantageously combined with a temperature control device.
  • the liquid surrounding the electrodes is preferably used as the heat exchange medium. If in the device proposed according to the invention for carrying out the method, the second space which absorbs the heat insulation is enclosed by a reservoir which is connected to the spaces surrounding the electrodes in a manner which permits exchange, in the case of use for electrophoresis a diffusive ion exchange can occur between them the liquid volumes located on the anode-side and cathode-side end regions of the first space. In this way, on the one hand, the amount of the buffer medium required can be reduced, and on the other hand, the setting or constant maintenance of the desired chemical, physical and electrical properties of the buffer medium can be promoted.
  • the buffer medium is actively replaced by a suitable circulation system, for example by a pump.
  • thermostatting for example by means of a heat exchanger, can be provided in the circulation circuit, by means of which the joules emerging at the end faces of the separation medium can be dissipated.
  • Photodetection devices can be classified according to the type of data acquisition. The following devices can be distinguished:
  • the 3D image recording system is designed such that at least one photometric measurement value can be assigned to each volume element of the separation medium during an image recording, that is to say each data record comprises a location vector with 3 coordinates, to which at least one photometric measurement value is assigned.
  • the online detection system is designed in such a way that each photometric measured value is assigned a two-dimensional location vector and, in addition, the time as the third coordinate. Online detection systems are designed in such a way that they record measured values at regular time intervals from a stationary level (detection level) through which the sample fractions migrate.
  • the detection plane can lie inside the separation medium or outside near an interface of the separation medium. Two types of devices can be distinguished for online detection:
  • point confocal or cylindrical confocal scanners with a single measuring head or with a multiple measuring head can be considered.
  • Scanners with multiple measuring heads have the advantage that shorter readout times are required to read out a given area and the scanning process can be carried out at lower speeds.
  • the individual measuring heads combined to form a multiple measuring head can be used individually for measuring radiation with different properties, e.g. different wavelength.
  • the installation of the measuring head in one of the electrodes is particularly advantageous.
  • a particularly simple and at the same time advantageous scanner is characterized by cylindrical confocal optics.
  • Such a scanner is characterized by cylindrical illumination optics and by one or more preferably coherent radiation sources, e.g. Laser with optics for beam expansion.
  • the illumination optics are designed so that the radiation from the radiation sources is focused into the detection plane.
  • the selection of a cylindrical lens, preferably a cylindrical lens, results in an illuminated focus line in the detection plane.
  • the detection optics is set up so that this line is imaged on a line detector.
  • the optical axes of the illumination optics and detection optics are advantageously oriented at an angle to one another. A structure using two is also advantageous
  • Lighting devices which are essentially symmetrical on both sides Detection optics are arranged.
  • the detection optics are characterized by accurate imaging properties.
  • Arrays of lenses are preferably used.
  • the use of a gradient index lens array is particularly advantageous.
  • Optics and line detector form a mechanical unit that is mounted on a movable slide.
  • the carriage can be moved along a Cartesian coordinate or rotate about an axis by means of a drive device.
  • the control and readout electronics for the line detector is synchronized with the movement of the carriage.
  • a data recording device and an EDP device for data evaluation are assigned to the scanning device thus formed.
  • Point confocal scanners have a better spatial resolution than cylindrical confocal scanners.
  • the spatial resolution in the direction of the optical axis (depth of field) is of particular importance here.
  • Electronic control, data recording and data evaluation are, however, more complex with point confocal scanners. It must be taken into account that the mechanical slide described above must be modified in such a way that the point confocal measuring head can perform movements along two coordinates, and thus an area (detection plane). can feel.
  • 2D imaging systems with an orthogonal lighting device for a detection plane are characterized by the following features:
  • a detection system is assigned to the lighting device, formed from an objective and a detector, preferably a CCD camera.
  • the arrangement of the objective and the detector is chosen so that the detection area is displayed two-dimensionally on the detector.
  • the properties of the lens are selected so that the imaging takes place with a high aperture and at the same time high spatial resolution.
  • the optical axis of the objective can run essentially parallel to the migration direction of the samples. In this arrangement, the lens absorbs radiation which emerges from the end of the separation medium.
  • the optical axis of the lens can also run at an angle to the migration direction.
  • the detection device is provided on the side of the separating device.
  • the data can be recorded by a suitable recording device, which records data sets at periodic intervals, essentially in the form of two-dimensional images.
  • a 3D Image recording device for the detection of sample fractions after completion of their separation.
  • the data recording device is synchronized with the translation device.
  • the 3D image recording device described above can also be constructed independently of the separating device. In this case, the separation medium can be removed from the separation device after completion of the separation process and fed to the separate 3D image recording device.
  • a fraction collection device can be provided. It is particularly advantageous to couple the fraction collection device to the sample detection device. Such a coupling enables the exchange and assignment of data, as well as one-sided or mutual control between the two units.
  • the first variant is characterized by a transport mechanism for collecting media such as plates, membranes, microtiter plates or arrays made of test tubes.
  • the collecting medium preferably consists of a membrane or individual sample plates.
  • the collection media are placed directly at an interface of the separation medium by the transport mechanism, exchanged at regular time intervals and conveyed out of the separation device.
  • a roll-off device similar to a film projector, which transports a membrane is preferably used.
  • the properties of the membrane are chosen so that the fractions emerging from the separation medium are bound to it.
  • the second variant is characterized by a capillary array or an array of hollow bodies, such as tubes or tubes.
  • One end each is positioned as an inlet opening near the sample outlet surface at the interface of the separation medium.
  • the outlet openings are located outside the separation device above a fraction collecting device, preferably a collecting device for Microtiter plates or sample plates.
  • the transport from the inlet opening is effected by pneumatics, which act on all capillaries together, or on each capillary individually, or by electrical forces.
  • the electrical field or the pneumatics are designed so that the sample fractions are led out of the separation apparatus and fed to the fraction collection device.
  • a shaping device is provided for machining and manufacturing sample plates and for machining the surface of separation bodies.
  • the molded part is a plate-shaped tool which has elevations or depressions on its surface, preferably in a periodically two-dimensional arrangement.
  • the material of the surface is preferably chosen so that it on the one hand, molding processes, such as Polymerization of, for example, acrylamide, promotes or at least does not hinder, and on the other hand has good separation properties, i.e. that there is little or no affinity for the materials to be molded.
  • Sample plates are primarily assigned to the three-dimensional separation method according to the invention and the separation device described above. However, their properties and possible uses are designed in such a way that their application can also be more extensive. So they are generally useful objects in the field of cloning, as described.
  • sample plates which are preferably used in the context of three-dimensional separation, have to be adapted to the described separation device and to the specific applications in several ways.
  • sample plates used in three-dimensional separation are essentially matched to those of the separator. Since the separating device is preferably cylindrical, a circular format is one of the possible advantageous formats. However, such a format is difficult to handle in conventional automatic laboratory handling systems, since it is usually adapted to rectangular formats are. A square format therefore appears to be a compromise.
  • the dimensions of the sample plates are chosen such that they can be arranged near an (end) interface of the separation medium.
  • the sample plate containing the individual samples is preferably arranged near an (end) interface of the separation medium.
  • the transfer of the individual samples from the sample plate into the separation medium takes place by means of suitable physical or chemical parameters such as e.g. electrical forces, pressure, centrifugal forces, gravitation, osmotic forces, diffusion or capillary forces.
  • Sample plates are therefore preferably made at least partially of porous material.
  • the porous or permeable material enables electrical currents, liquid flows, gas flows, a difrusive mass transfer etc. It is advantageous if the porous material is arranged so that a material transport in or against the surface normal is made possible.
  • the porous material of the sample plates can preferably be such that it enables samples to be fixed or embedded locally on it.
  • the local fixation of samples can also be made possible by the fact that the sample plates have fixed partition walls, e.g. in the form of a honeycomb structure or depressions in the surface.
  • a local fixation can also be made possible by electrostatic forces by means of electrodes, or by magnetic fixation on small particles made of magnetic material.
  • the electrodes or particles can be arranged on the surface of the sample plates or can be embedded therein.
  • Such materials are preferably also selected for sample plates which can withstand higher temperature loads, in particular temperature loads such as occur in the PCR method. At least it is advantageous if at least the components of the sample plate withstand higher temperatures which are involved in local fixation of the samples.
  • Sample plates advantageously also consist of materials that do not hinder the growth of cells, or that can selectively or non-selectively promote the growth of cells. This is particularly important for those types of sample plates that are to be used for the FACS-based cloning method described in this patent application. Not all of the specifications shown as advantageous can be combined in one design of sample plates. It is therefore advantageous to provide sample plates for very specific applications. Examples of this are sample plates for cell culture using nutrient media, for example agarose, sample plates for the PCR method, sample plates for silica filtration, sample plates for separation purposes, which contain a suitable separation medium, for example agarose or polyacrylamide, or special sample plates for chemical, physical or photometric measurement purposes.
  • nutrient media for example agarose
  • sample plates for the PCR method sample plates for silica filtration
  • sample plates for separation purposes which contain a suitable separation medium, for example agarose or polyacrylamide, or special sample plates for chemical, physical or photometric measurement purposes.
  • the removal or supply of substances such as Samples or reagents from or in sample plates or the loading layer of a separation body can be carried out using suitable loading tools. Because of the large number of samples (in the order of 10,000 individual samples), such a tool is characterized by a regular arrangement (array) of hollow bodies, tips, pins or capillaries, which can accommodate and transfer a large number of samples at the same time.
  • This array is advantageously characterized in that the individual elements of the array have connections. These connections are preferably pneumatic connections or electrical contacts or a combination thereof. The elements are designed so that substances can be taken up or released by them or with their help.
  • Another tool for filling sample plates consists of a translation mechanism for sample plates.
  • the translation mechanism is controlled by a cell sorter, preferably a FACS device.
  • the control device (cell sorter, FACS device) is designed through its structure and its control program so that droplets or parts of a liquid flow are directed towards the sample plate through, for example, an orifice.
  • the control device also controls the mechanical translation device for moving the sample plate in one or more coordinates.
  • the method proposed according to the invention and the device provided therefor are particularly suitable as an instrument for the simultaneous separation of a very large number of mixtures of biomolecules or chemical substances such as DNA fragments, proteins, blood or blood plasma in a three-dimensional separation medium.
  • the preferred main application of the method proposed according to the invention is in the field of three-dimensional electrophoresis.
  • several thousand individual samples containing a large number of short DNA sections can be separated simultaneously in parallel processing.
  • the method proposed according to the invention and the separation thaw suitable for this can be used for "shotgun” sequencing.
  • Another area of application of the method proposed according to the invention would be the “DNA fingerprint” technique.
  • a further area of application of the method proposed according to the invention is in protein analysis and in the expression analysis of biomolecules.
  • Protein mixtures and the like can be separated, in particular with regard to three parameters, which can be given, for example, by the pH value, the size and the hydrophobicity (or solubility) of the biomolecules.
  • Further applications are the separation of substances, inorganic or organic molecules, DNA, RNA, lipids, peptides, amino acids, the sequence analysis of nucleic acids, detection of point mutations, the use of the separation medium 6 in the expression analysis and protein analysis with regard to several parameters such as pH , Size and hydrophobicity (or solubility) of the individual samples 29, the diagnosis of diseases and the analysis of metabolic products.
  • Figure 1 shows the basic structure of a separation arrangement (separation apparatus) with a cavity for receiving a separation medium with a
  • Figure 2 shows the schematic structure of an arranged between two electrodes
  • Figure 3 is a schematic representation of a separation apparatus with a movable
  • Figure 4 is a schematic representation of a separation apparatus with a movable
  • FIG. 5 shows the schematic representation of a separation apparatus with a lighting device arranged on the side and a stationary detector with an optical axis running essentially parallel to the vertical axis (z-axis),
  • FIG. 6 shows the schematic representation of a separation apparatus with a lighting device arranged on the side and a stationary detector with an optical axis which extends essentially at an angle to the vertical axis (z-axis) and
  • FIG. 7 shows the directions of heat transfer that occur on a schematically reproduced electrophoretic separation apparatus comprising two concentric rooms and the temperature profile that arises.
  • FIG. 1 shows the basic structure of a separation apparatus 1 with a cavity for receiving the separation medium 6 and a sample plate 7.
  • the arrangement of a separating thaw 1 shown schematically in FIG. 1 comprises a first space 2 which serves as an analysis space.
  • the first space 2 is preferably arranged concentrically to the vertical axis (z-axis) identified by reference number 15.
  • the first room 2 is enclosed by a room boundary 2.1 and separated from the environment and designed so that it can accommodate a separation medium 6.
  • a separation medium 6 is accommodated in the first space 2, which, depending on the application, can be both solid, liquid and colloidal.
  • the separation medium 6 can be transparent or non-transparent; the separation medium 6 is, for example, polyacrylamide, agarose or hydroxyl cellulose.
  • the radius designated 2.2 of the first space 2 is preferably in a range between 2 and 15 cm, while the length of the first space 2 in the direction of the z-axis 15 can be in the range between 2 cm and 30 cm.
  • Sample plate 7 is arranged, with which a plurality of individual samples 29 can be applied.
  • the individual samples 29 are applied essentially two-dimensionally, i.e. the
  • Positions of the individual samples 29 on the sample plate 7 can essentially by two
  • Extent 7.1 of the sample plate 7 is small compared to the longitudinal extent of the first
  • the individual samples migrate in the direction of the sample migration direction 14, which runs essentially parallel to the z-axis 15 (vertical axis) of the separating thaw 1, through the separation medium 6 accommodated in the first space 2.
  • the migration of the individual samples 29 through the Separation medium 6 can be brought about, for example, via electrical forces, gravitational forces, via diffusion, pressure or concentration gradients, via osmosis or centrifugal forces.
  • the separation thaw 1 is designed so that the physical or chemical quantities mentioned above can be applied individually or in combination.
  • a first electrode element 4 and a second electrode element 5, which are preferably plate-shaped, can be assigned to the end faces of the first space 2 serving as the analysis cavity (see FIG. 2).
  • Figure 2 shows schematically the structure of a separation apparatus 1 arranged between two electrode elements 4, 5 with two concentrically accommodated spaces for accommodating a separation medium 6 and insulation 13, and a reservoir for accommodating a buffer medium 31.
  • the reservoir can, e.g. as shown schematically in FIG. 2, are formed by a concentrically accommodated, further space 12.
  • the two spaces 2 and 3, which are accommodated concentrically to one another, and the reservoir form a cylinder arrangement 10 which is delimited on the end faces by the electrode elements 4 and 5, which are preferably configured in the form of plates.
  • the electrode elements 4 and 5 cover the end faces of the first space 2 serving as the analysis cavity, and possibly also the end faces of the second space 3.
  • the electrode elements 4 and 5 each comprise electrically conductive connections.
  • the electrically conductive connections can contain, for example, a braid, which is accommodated on those sides of the electrode elements 4 or 5 which face the first space 2, ie the space containing the separation medium 6.
  • the braid can preferably be made from a corrosion-resistant, electrically conductive material, such as platinum.
  • the second space 3 which surrounds the first space 2 and is arranged concentrically to it, can accommodate an insulation 13 around the space boundary 2.1 of the first space, which prevents the radial heat exchange perpendicular to the z-axis 15.
  • the Joule 'generated during electrophoresis dissipates heat according to the separating defrost 1 shown schematically in FIG. 2 exclusively via the end faces of the first room 2.
  • the fact that there is no temperature gradient in the radial (r-) direction in the separation structure 1 proposed according to the invention is the prerequisite for there to be an isotropic viscosity in the radial direction, based on the vertical axis (z-axis 15) of the first space 2 Separation medium 6, and a uniform ion mobility.
  • the migration paths along which the individual samples 29 pass through the separation medium 6 in the sample migration direction 14 run essentially parallel to the z-axis 15 without radial deviations.
  • the second space 3 can also be connected to a reservoir, which can surround it as a further space 12 in a concentric arrangement. Between the reservoir 12 and the second space 3 can be a suitable Connection an exchange of the buffer medium 31 take place, which supports the setting or maintenance of the electrical, physical and chemical properties of the buffer medium 31 contained in the second room 3. In addition, the buffer medium 31 can assist in setting or maintaining the physical, chemical and electrical properties in the separation medium 6 contained in the first space 2.
  • the buffer medium 31 (which is generally in the form of a liquid solution) can preferably be used to dissipate the Joule heat released in the course of the electrophoretic separation process by means of a thermostat provided in or on the reservoir.
  • the exchange of the buffer medium 31 between the second space 3 and the reservoir can be carried out by a circulation device, e.g. a pump.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of a separation apparatus 1 with an associated (online) detection device 45 with a movable measuring head 46 with an optical axis 43 running essentially parallel to the z-axis 15 and a point-confocal arrangement of the lighting and detection device.
  • the detection device 45 shown schematically in FIG. 3 is a point confocal detection device which detects the radiation emanating from a focus point 22 located in the detection area 8 and emerging from the cylinder arrangement 10 at the end. To scan the entire surface of the detection area 8 of the first space 2, the detection device 45 can be displaceable in the direction of the x-axis 16 and in the direction of the y-axis 17.
  • the illumination device assigned to the measuring head 46 comprises a preferably monochromatic, coherent radiation source 26, for example a laser, and an optical system for coupling it into the measuring head 46.
  • a monochromatic, coherent radiation source 26 for example a laser
  • the course of the radiation emitted by the radiation source 26 is indicated in FIG. 3 by the illuminating beam path 20 .
  • the laser beam 52 shown here by way of example can be fanned out by a lens 27 and then strikes a dichroic beam splitter 54, which deflects it in the direction of an optics 18.
  • the optics 18 is designed in such a way that it bundles the illuminating radiation 20 with a high numerical aperture on the focus point 22 located in the detection area 8 and at the same time detects a maximum proportion of the radiation emanating from the sample fractions located in the focus point 22 and onto the Detector 44 bundles.
  • the dichroic beam splitter 54 inserted in the beam path 19
  • the radiation emanating from the sample fractions located in the focus point 22 is separated from the illumination radiation 20 in a wavelength-dependent manner and is fed to the detector 44 following the detection beam path 21.
  • the detector 44 produces a generally electrical signal which corresponds to the radiation received and which can be transmitted to a data recording unit 30.
  • the detection device 45 e.g. optical properties, preferably the fluorescence intensity or wavelength or the absorption or transmittance of the individual samples 29 are determined.
  • the individual samples 29 contained in the sample plate 7 can be used to support the detection with marking substances, e.g. with fluorescent dyes.
  • the advantage of the detection device 45 shown schematically in FIG. 3 in a point confocal arrangement can be seen in its high spatial resolution, in particular in its resolution in the direction of the x-axis 16 and the y-axis 17.
  • a disadvantage of the point confocal arrangement is that only radiation emanating from one focal point 22 reaches the detector 44, so that the detection device 45 for scanning (scanning) the entire detection plane 8 in the direction of two coordinates, e.g. in the direction of the x-axis 16 and in the direction of the y-axis 17.
  • a plurality of essentially identical confocal measuring heads 46 can be combined to form a multiple measuring head.
  • radiation emanating from a plurality of focus points 22 located in the detection plane 8 can be recorded simultaneously. This reduces the path length by which the detection device 45 has to be shifted so that it can detect the entire detection plane 8 during the scanning process (scanning).
  • the measuring head 46 or the multiple measuring head of the detection device 45 can be integrated into one of the two electrode elements 4 or 5.
  • the electrode element 4, 5 is carried along by the measuring head 46 during its scanning movement. This results, averaged over long times, within the separation medium 6 a homogeneous electric field which is not distorted by the measuring head 46. Among other things, this is a prerequisite for a migration of Individual samples 29 along the sample migration direction 14 essentially parallel to the z-axis 15.
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a separation apparatus with an associated, overhead (Orüme-) DeteMons device 45 with a measuring head 46 with an orthogonally cylindrical confocal arrangement of the lighting and detection device.
  • the detection device 45 assigned to the separation structure 1 shown in FIG. 4 is provided above the cylinder arrangement 10.
  • the sample plate 7 is provided at the opposite end of the cylinder arrangement 10; Starting from the sample plate 7, the individual samples 29 migrate in the sample migration direction 14 through the separation medium 6.
  • the advantage of the arrangement shown in FIG. 4 of a separating thaw 1 with an above-lying detection device 45 can be seen in the fact that when used for electrophoretic separation on the upper electrode element 4 (see FIG. 2)
  • Gas bubbles which can otherwise impair the detection, do not collect between the detection area 8 and the detection device 45, but can rise to the side.
  • the detection device 45 shown schematically in FIG. 4 is a cylindrical confocal arrangement which detects the radiation emanating from a focal line 22 located in the detection region 8 and emerging from the cylinder arrangement 10 on the end face. To scan the entire area of the detection area 8 of the first space 2, the detection device 45 must be displaceable in the direction of only one coordinate, in the example of FIG. 4 along the displacement direction 42 parallel to the x-axis 16.
  • the illumination device assigned to the measuring head 46 comprises a preferably monochromatic, coherent radiation source 26, which can be designed, for example, as a linear arrangement (array) of laser diodes, and suitable optics 18 for focusing the radiation onto the focus line 22.
  • the optics 18 contains an arrangement of Cylindrical lenses, microlenses, or gradient index lenses or a combination of the above elements and is designed in such a way that it bundles the illumination radiation from the radiation source 26 with a high numerical aperture onto the focal line 22 located in the detection plane 8.
  • the course of the radiation emanating from the radiation source 26 is indicated in FIG. 4 by the illumination beam path 20.
  • the optical axis of the illumination beam path 20 and the detection beam path 21 are inclined, preferably at right angles (orthogonal) to one another and intersect on the focus line 22 in the detection area 8.
  • Detection device 45 can also be assigned two or more lighting devices.
  • the optical axes of the illumination beam paths 20 of all provided lighting devices and the detection beam path 21 intersect in the focus line 22.
  • Suitable radiation in the example in FIG. 4 a gradient index lens field 50, bundles the radiation emanating from the sample fractions located in the focus line 22 onto a detector field 56.
  • the properties of the optics are selected such that the sample fractions located in the focus line 22 are imaged on the detector field 56 with a high numerical aperture and high spatial separation sharpness.
  • additional optical absorption or interference filters can be provided in the detection beam path 21, e.g. To increase the spectral selectivity with wavelength-dependent detection, additional optical absorption or interference filters can be provided.
  • a cellular arrangement of individual detectors, e.g. Photodiodes provided.
  • the detector field 56 generates a generally electrical signal which corresponds to the incoming radiation and which can be fed to a data acquisition unit 30.
  • the advantage of the detection device 45 shown schematically in FIG. 4 in an orthogonally cylindrical confocal design can be seen in its high spatial resolving power, in particular in its resolving power (depth of field) in the direction of the z-axis 15.
  • a further advantage of the cylindrical confocal arrangement is that radiation emanating from a focus line 22 reaches the detector field 56, so that the detection device 45 for scanning (scanning) the entire detection area 8 in the direction of only one coordinate, in the example of FIG. 4 in the direction the x-axis 16 must be shifted.
  • the direction of displacement 42 of the detection device 45 is preferably perpendicular to the focus line 22.
  • a plurality of substantially identical cylindrical confocal measuring heads 46 can also be combined to form a multiple measuring head.
  • radiation emanating from a plurality of focus lines 22 located in the detection region 8 can be recorded simultaneously. This reduces the path length, by which the detection device 45 must be moved so that it can cover the entire detection area 8 during the scanning process (scanning).
  • the cylindrical confocal measuring head or the multiple measuring head of the detection device 45 can be placed in one of the two electrode elements 4 or 5 integrated.
  • the electrode element 4, 5 is carried along by the measuring head 46 during its scanning movement. This results, averaged over long times, within the separation medium 6 a homogeneous electric field which is not impaired by the measuring head 46.
  • this is a prerequisite for migration of the individual samples 29 along the sample migration direction 14 essentially parallel to the z-axis 15.
  • FIG. 5 shows the schematic representation of a separation apparatus 1 with a laterally arranged lighting device and a stationary detector for two-dimensional image recording, the optical axis 43 of which is oriented essentially parallel to the vertical axis (z-axis 15) of the cylinder arrangement 10.
  • an illumination device can be arranged laterally to the cylinder arrangement 10, i.e. In an essentially radial (r-) direction to the vertical axis (z-axis 15). Radiation emanating from a radiation source 26 assigned to this illuminating device falls on a device that fans the radiation, e.g. a lens 27 is collimated by a lens 28 and passes through the cylinder arrangement 10 essentially perpendicular to the z-axis 15. The beam fanned out in the direction of the y-axis 17 illuminates a detection area 8, which in the example of FIG. 5 is inside the separation medium 6 is close to its front-side interface facing away from the sample plate 7.
  • the laser beam 52 used for illumination in the example in FIG. 5 can also be fanned out by means of galvanometric deflection devices or rotating polygon mirrors.
  • the buffer medium 31 received in the second room 3 in its chemical Properties, for example the concentration of substances dissolved in it, are advantageously matched to the properties of the separation medium 6 accommodated in the first space 2.
  • a detection device 45 can be accommodated on one end of the cylinder arrangement 10, preferably on the end facing away from the sample plate 7.
  • the optical axis 43 of the detection device 45 lies essentially parallel to the vertical axis (z-axis 15) of the cylinder arrangement 10. In this arrangement, the detection device 45 takes the face out of the first space 2, i.e. radiation emerging from the analysis room.
  • an optic 18 can be arranged on an end face of the cylinder arrangement 10.
  • the imaging properties of the optics 18 are selected such that a two-dimensional imaging of the image plane 24 lying within the detection area 8 onto the imaging plane 25 lying in the image recording unit 23 takes place with high spatial resolution and a high numerical aperture.
  • a point lying in the image plane 24 is sharply imaged by the optics 18 into the imaging plane 25 on the front side of the image recording unit 23.
  • the detection device 45 can be relative to the cylinder arrangement 10 in one or two coordinate directions, e.g. in the direction of the x-axis 16 and in the direction of the y-axis 17 to scan (scan) the entire detection area 8.
  • the image acquisition unit 23, e.g. a high-resolution CCD camera generates a generally electrical signal which corresponds to the incident radiation and which can be transmitted to a data recording unit 30.
  • FIG. 6 shows the schematic representation of a separation apparatus 1 with a lighting device arranged on the side and a stationary detection device 45 with an optical axis 43 which extends essentially obliquely to the vertical axis (z-axis 15).
  • the detection device 45 with an associated image recording unit 23 and optics 18 is arranged laterally to the cylinder arrangement 10 that its optical axis 43 is inclined to the z-axis 15 of the cylinder arrangement 10 by the inclination angle 41.
  • the detection device 45 receives radiation which emerges from the cylinder arrangement 10 essentially laterally through a suitable window 40.
  • the radiation source 26 with this fanning-out lens 27 and a converging lens 28 is still provided essentially to the side of the cylinder arrangement 10.
  • the plane detection area 8, which is illuminated by the illumination device through radiation incident essentially laterally into the cylinder arrangement 10, is oriented essentially perpendicular to the z-axis 15 analogously to the illustration according to FIG.
  • An image recording unit 23 with an optical system 18 assigned to it is provided laterally outside the space boundary 2.1 of the first room 2.
  • the imaging properties of the optics 18 are selected such that a two-dimensional imaging of the image plane 24 lying within the detection area 8 onto the imaging plane 25 lying in the image recording unit 23 takes place with high spatial resolution and a high numerical aperture.
  • the optics 18 sharply images a point lying in the image plane 24 through the window 40 into the imaging plane 25 on the front of the image recording unit 23.
  • the detection device 45 can be displaced relative to the cylinder arrangement 10 in order to scan (scan) the entire detection plane 8.
  • the image acquisition unit 23, e.g. a high-resolution CCD camera generates a generally electrical signal which corresponds to the incident radiation and which can be transmitted to a data recording unit 30.
  • the arrangement of the detection device 45 which is shown schematically in FIG. 6, to the side of the cylinder arrangement 10 can preferably be used for the detection of samples after the completion of the separation process.
  • the first space 2, containing the separation medium 6 and the separated sample fractions is displaced relative to the detection area 8, preferably in the sample migration direction 14, after the separation process has ended.
  • the detection device can synchronize with this 45 capture a series of two-dimensional still images recorded by the data recording unit 30.
  • FIG. 7 shows the emerging heat transport directions 62 on a schematically reproduced electrophoretic separation apparatus comprising two concentric rooms (see FIG. 2) and the resulting temperature profile 60 that prevails along the z-axis 15 of the arrangement.
  • the first space 2 is enclosed by a further, second space 3 arranged concentrically to this and forms with it a cylinder arrangement 10.
  • the boundary 2.1 of the first space 2 is indicated by the line running parallel to the z-axis 15.
  • the second space 3 can accommodate insulation 13 so that no heat exchange in the radial direction is possible between the first space 2 accommodating the separation medium 6 and the surroundings.
  • Spaces 2 and 3 are delimited by plate-shaped electrode elements 4 and 5 on their respective end faces. Electrically conductive connections are included on the plate-shaped electrode elements 4 and 5 in order to apply a voltage between the electrode elements 4 and 5, which causes the individual samples 29 to migrate from the sample plate 7 in the sample migration direction 14 essentially parallel to the z-axis 15.
  • the Joule heat generated in the course of the electrophoretic separation process ideally dissipates into the surroundings only via the end faces of the first space 2, so that due to the lack of temperature gradients in the radial direction, a heat transport direction 62 represented by the double arrows shown in FIG central level 67 to the electrode elements 4 and 5.
  • a temperature profile 60 shown in FIG. 7 is formed in the interior of the first space 2 and is characterized by a temperature gradient that only prevails in the direction of the z-axis 15.
  • the course of this temperature profile which is characteristic of the electrophoretic separation apparatus proposed according to the invention, is to be briefly derived below:
  • the electrical power density p within the electrophoretic separation thaw 1 is given by the scalar product of the electrical field vector E and the current density vector j:
  • the temperature T (z) which is ideally exclusively dependent on the z coordinate, can be determined by means of the integral shown below:
  • T (z) T max - k • const.
  • a separation assembly 1 was tested under various test conditions for the separation of samples by means of electrohoresis.
  • the prototype of an ARAKIS sequencer was used as an online detection and data acquisition unit.
  • the detection area 8 was illuminated perpendicular to the sample migration direction 14) by a helium-neon laser of wavelength 594 nm (yellow) with an optical power of 3 W.
  • the laser is also part of the ARAKIS sequencing device.
  • Polyacrylamide gel in various concentrations between 10 and 20% was used as the separation medium 6.
  • the separation distance was 6 cm (z direction) and the diameter of the first space 2 receiving the separation medium 6 was also 6 cm.
  • the electrophoretic power was limited to 10 W, which resulted in a voltage of approximately 60 V between the electrodes 4, 5. With a separation distance of 6 cm, this corresponds to an electrical field strength of approximately 10 V / cm.
  • the method according to the invention is also suitable for simultaneous DNA and protein sequencing of a complex number of individual samples 29 in the context of "shotgun” sequencing, parallel “signature” sequencing and for sequencing in the context of protein and expression analysis.
  • the density of the sample application 7 used in the separation thaw 1 in the experiments carried out was 2 mm between the individual samples 29. A higher packing density of the sample application 7 down to distances of less than 1 mm is possible.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und Vorrichtung zum parallelen Auftrennen einer Vielzahl von Einzelproben (29) innerhalb eines 3-dimensionalen Separationsmediums (6), wobei die nachfolgenden Verfahrensschritte durchlaufen werden: In einem ersten Raum (2), der sich im wesentlichen über alle drei Raumkoordinaten erstreckt, ist das Separationsmedium (6) enthalten. Eine Vielzahl von Einzelproben (29) wird in der Nähe einer Grenzfläche des ersten Raumes (2) angeordnet, wobei die Einzelproben (29) im wesentlichen flächenmässig angeordnet werden, d.h. ihre jeweiligen Schwerpunktpositionen werden durch zwei Koordinaten beschrieben. Unter dem Einfluss von einer oder mehreren physikalischen Grössen vermögen die Einzelproben (29) im wesentlichen senkrecht zur Fläche ihrer Auftragung durch das Separationsmedium (6) zu migrieren, wobei sie entsprechend einer oder mehrerer ihrer Eigenschaften aufgetrennt werden. Als physikalische Grössen kommen zum Beispiel elektrische Kräfte (Elektrophorese), Gravitation, Diffusion, Druck- und Konzentrationsgradienten sowie Osmose oder Zentrifugalkräfte in Betracht. Die Detektion der Einzelproben (29) erfolgt in ausgewählten Bereichen (8) innerhalb oder ausserhalb des Separationsmediums (6) während ihrer Migration (Online-Detektion). Alternativ zur Online-Detektion kann eine 3D-Datenaufnahme nach Abschluss der Migration erfolgen. Dazu kann ein entsprechendes 3D-Bildaufnahmeverfahren verwendet werden. Im einfachsten Fall wird das Separationsmedium (6) in Scheiben zerlegt, die dann durch ein 2D-Aufnahmeverfahren ausgewertet werden. In diesem Fall sind die Fraktionen der Proben auch präparativ zugänglich. Ergänzend oder alternativ zur Bildaufnahme kann ein Fraktionssammler an einer Grenzfläche des Separationsmediums (6) angebracht werden.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Parallelanalyse von Bio-Molekülen
Die Aurtrennung (Fraktionierung) eines Stoffgemisches nach einem oder mehreren physikalischen oder chemischen Parametern der einzelnen Substanzen hat allgemein als Analyseverfahren in der Chemie und Biotechnologie einen hohen Stellenwert. Eine Technik der Auftrennung besteht darin, das Stoffgemisch (Probe), beeinflußt durch physikalische oder chemische Parameter, durch ein geeignetes Separationsmedium wandern zu lassen. Dabei werden die einzelnen Substanzen durch Wechselwirkungen mit dem Separationsmedium entsprechend ihren Eigenschaften aufgetrennt und liegen anschließend als einzelne Fraktionen vor. Als geeignete Parameter kommen zum Beispiel elektrische Kräfte, Druck, Zentrifugalkräfte, Gravitation und osmotische Kräfte, Diffusion, Siebeffekte, Ausschluß, Van-der-Waals-Kräfte, pH- Wert-Gradienten zum Einsatz. Das Separationsmedium kann je nach Anwendung sowohl fest, flüssig als auch kolloidvorliegen. Aus dem unterschiedlichen Wanderungsverhalten der einzelnen Fraktionen lassen sich im allgemeinen Rückschlüsse auf ihre Eigenschaften ziehen. Im Falle einer qualitativen Analyse des Stoffgemisches werden nur die relevanten Eigenschaften der Fraktionen während oder nach der Separation gemessen und aufgezeichnet und die Fraktionen selbst verworfen. Im Falle einer quantitativen Analyse werden die Mengenanteile der einzelnen Fraktionen am Stoffgemisch während oder nach der Separation bestimmt. Im Falle einer präparativen Trennung werden die einzelnen Fraktionen aufgefangen und stehen somit zur weiteren Verarbeitung oder Analyse zur Verfügung.
Die bisher eingesetzten Techniken sind beschränkt auf die Auftrennung des Stoffgemisches in einem im wesentlichen eindimensional (im folgenden als 1D-
Auftrennverfahren bezeichnet) oder zweidimensional (im folgenden als 2D- Auftrennverfahren bezeichnet) ausgeführten Separationsmedium:
Bei 1D- Auftrennverfahren wird eine einzelne Probe im wesentlichen punktuell an der Öffnung eines (Kapillar-)Röhrchens plaziert, welches das Separationsmedium enthält und in diesem aufgetrennt. Zur gleichzeitigen Auftrennung von mehreren Proben wird eine entsprechende Anzahl von (Kapillar-)Röhrchen benötigt. Beispiele hierfür sind die Kapillar-Gel-Elektrophorese zur DNA-Analyse sowie das Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatografie(HPLC-) Verfahren.
Bei 2D-Auftrennverfahren sind mehrere Einzelproben zueinander benachbart in einer linearen Reihe (eindimensional) angeordnet. Sie durchlaufen das im wesentlichen zweidimensional (als flächige Schicht) vorliegende Separationsmedium in mehreren parallelen nebeneinander liegenden Mikrationsbahnen. Die Anzahl der mit dieser zweidimensionalen Anordnung gleichzeitig auftrennbaren Proben ist durch die Anzahl der Bahnen im Separationsmedium gegeben. Beispiele taerfür sind die Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese (PAGE) zur DNA-Sequenzierung sowie die 2D-Gel-Elektrophorese zur Proteinanalyse.
Bei ID- und 2D- Auftrennverfahren ist geometrisch bedingt die Oberfläche des Separationsmediums groß gegenüber seinem Volumen. Deshalb werden viele Nachteile der ID- und 2D- Auftrennverfahren durch Randeffekte an den Oberflächen des Separationsmediums bzw. den das Separationsmedium umgebenden Begrenzungsflächen verursacht. Beispiele für Ursachen dieser Randeffekte sind Wechselwirkungen der Probenfraktionen oder des Separationsmediums mit den umgebenden Begrenzungsflächen sowie thermische Effekte.
Beim 1 D-Auftrennverfahren besteht z.B. das Problem, das dafür eingesetzte Kapillar- Röhrchen aufgrund Ihres geringen Durchmessers (In der Regel einige Zehntel mm) durch Anhaftung der Proben an den Innenwänden der Kapillar-Röhrchen zum Verstopfen neigen. Die Kapillare wird dadurch zur weiteren Verwendung unbrauchbar. Aus dem gleichen Grund ist das Einbringen des Separationsmediums nicht einfach. Weiterhin können hierbei oder während der Separation entstehende Blasen die Kapillare blockieren.
Ein ebenfalls auf Randeffekten beruhender Nachteil des ID- bzw. 2D- Auftrennverfahrens liegt darin, daß sich aufgrund unterschiedlicher Migrationszeiten der Proben im Zentrum des Separationsmediums verglichen mit den Randbereichen, ein Aufweiten der Banden weiter einstellen kann (sogenannter Smilling-Effekt). Eine Vergrößerung der Bandenbreite verringert jedoch die Trennschärfe der Analyse. Dieser Effekt wird durch Wechselwirkungen zwischen den Proben und der Oberfläche verursacht, welche das Separationsmedium umgibt und aufnimmt sowie im Falle der elektrophoretischen Auftrennung durch thermisch bedingte Inhomogenitäten der Viskosität des Separationsmediums und durch elektroosmotische Effekte an seinen Begrenzungsflächen.
Während bei üblichen 1 D-Auftrennverfahren eine Vielzahl einzelner Kapillar-Röhrchen einzeln zu befüllen sind, wird bei einigen gängigen 2D-Auftrennverfahren das Separationsmedium, z.B. ein Gel, zwischen zwei Glasscheiben einer Gel-Kassette eingebracht. In beiden Fällen müssen sowohl die Kapillar-Röhrchen als auch die das Separationsmedium umgebenden Glasscheiben äußerst rein sei, um die oben angeführten Randeffekte zu minimieren. Ferner besteht das Risiko, daß es beim Befüllen oder während des Trennvorganges im Separationsmedium zur Bildung von Blasen kommt.
Ein gemeinsamer Nachteil beider skizzierten Auftrennverfahren liegt darin, daß die Zahl der gleichzeitig analysierten Proben (maximal einige 100) relativ gering ist.
Zur Lösung oder zur Umgehung der oben aufgeführten Probleme wurde eine Vielzahl von Techniken vorgeschlagen und Verfahren ausgearbeitet. Die im folgenden angeführten Veröffentlichungen umschreiben den Stand der Technik und zeigen weitere für die Beschreibung des vorgeschlagenen Verfahrens bedeutende Aspekte.
US 5,051,162 bezieht sich auf eine Trenn-Vorrichtung nach dem Elektrophorese- Verfahren kombiniert mit einem Fluoreszenzdetektor und auf einen diesem zugeordneten Probenbehälter. Das Elektrophoresegerät enthält eine Anzahl von in plattenförmiger Form vorliegenden Gelschichten, die im wesentlichen parallel zueinander angeordnet sind, wobei diese plattenförmigen (im wesentlichen zweidimensionalen) Gelschichten eine Vielzahl von Wanderungslinien darstellen, entlang welcher Probenfraktionen, die zuvor markiert wurden, von oberen Enden zu unteren Enden der plattenförmigen Gelschichten zu wandern vermögen. Es ist ein oberer Pufferbehälter vorgesehen, der eine Pufferlösung enthält, die in Kontakt mit den oberen Enden der plattenförmigen Gelschichten steht. Darunter befindet sich ein weiterer Pufferbehälter, welcher ebenfalls eine Pufferlösung enthält, die mit den unteren Enden der plattenförmigen Gelschichten in Verbindung steht. Es sind Vorrichtungen vorhanden zur Erzeugung eines elektrischen Potentials zwischen der Pufferlösung im besagten oberen Pufferbehälter und der Pufferlösung, welche im unteren Behälter enthalten ist. Dadurch wirkt eine elektrophoretische Kraft auf die Probenfraktionen und bewirkt deren Wanderung entlang der Migrationslinien. Es sind Anregungseinrichtungen zur Fluoreszenz- Anregung der entsprechend markierten Probenfraktionen vorgesehen. Die Fraktionen wandern auf den besagten Migrationslinien in den plattenförmigen Gelschichten. Es sind Einrichtungen zur individuellen und gleichzeitigen Detektion von Fluoreszenzlicht vorgesehen, welches von den Probenfraktionen, die markiert sind und sich in den besagten Migrationslinien bewegen, emittiert wird, wobei das Fluoreszenzlicht an den unteren Enden der plattenförmigen Gelschichten ausgestrahlt wird.
Die Veröffentlichung "Gene Expression Analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays", Sidney Brenner, Maria Johnson, John Bridgham, George Golda, David Ff. Lloyd, Davida Johnson, Shujun Luo, Sarah McCurdy, Michael Foy, Mark Ewan et al. aus Nature Biotechnology Vol. 18, Juni 2000, Seiten 630 bis 634 beschreibt ein Verfahren zur Parallelanalyse einer großen Anzahl von Sequenzen. Ein System, wie in diesem Artikel veröffentlicht, umfasst eine auf einen Peltierelement montierte Durchflusszelle, die unterhalb eines konfokalen Mikroskops angeordnet ist. Dem konfokalen Mikroskop ist ein Filter sowie eine CCD-Kamera nachgeordnet, welche ihrerseits mit einem Rechner verbunden ist. Über eine Reagenzienpumpe und ein mit dieser in Verbindung stehendes Reservoir und einem Ventilblock wird der Durchfluss des Probenmaterials durch eine auf dem Peltierblock vorgesehene Durchflusszelle realisiert. Diese Publikation beschreibt u.a die Anordnung von Partikeln in einer Ebene mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Durchfluss-Cytometers (FACS-Gerät) und ist deshalb relevant für den in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebenen Bereich Probenladung.
Aus der Veröffentlichung "Effect of gelation conditions on the gel structure and resolving power of agarose-based DNA sequencing gels" , Noriko Kusukawa, Mikhail V. Ostrovsky, Mark M. Garner, in Elektrophoresis 1999, Vol. 20, Seite 1455 bis 1460 werden die Bedingungen untersucht, unter denen Agarose-Gele, die zur DNA-Sequenzierung eingesetzt werden, gelatinieren. Die verwendeten Gele werden sowohl einer rapiden Abkühlung als auch einer allmählichen Abkühlung ausgesetzt. Mittels eines Elektronenmikroskopes vorgenommene Analysen belegen, daß die schnell abgekühlten Gele eine homogene Porenstrukturen mit einer kleinen durchschnittlichen Porengröße aufweisen, gegenüber solchen Gelen, die langsam abgekühlt werden und eine wesentlich größere durchschnittliche Porengröße aufweisen. Außerdem sind die rasch abgekühlten Gele optisch transparenter. Die Photodetektion der Proben ist daher einfacher.
Angesichts der aus dem Stande der Technik aufgezeigten Lösungen liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, mit welchen eine mit einer hohen Durchsatzrate erfolgende Auftrennung von Stoffgemischen, z.B. Gemische von Biomolekülen, DNA-Fragmenten, Proteinen oder dergleichen erfolgen kann und eine gleichzeitige (On-line) oder anschließende Detektion sowie ergänzend oder alternativ eine qualitative, quantitative und präparative Analyse ermöglicht wird.
Erfϊndungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale der Patentansprüche 1 und 41 gelöst.
Mit dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren und der zur Durcliführung dieses Verfahrens vorgeschlagenen Vorrichtung läßt sich eine drei-dimensionale Auftrennung und damit eine Analyse von bis zu 104 Proben in paralleler Abarbeitung durchführen. Eine dreidimensionale Auftrennung ist im Gegensatz zu den oben beschriebenen ein- und zweidimensionalen Separationen gekennzeichnet durch die Auftrennung in einem Separationsmedium, welches sich im wesentlichen über drei Dimensionen erstreckt, ferner dadurch, daß die aufzutrennenden Proben dem Separationsmedium zweidimensional angeordnet zugeführt werden. Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren zeichnet sich insbesondere durch eine sehr einfache Handhabung hinsichtlich der Zufuhr der zu analysierenden Probengemische aus. Dazu können beispielsweise DNA- Sequenzierungsreaktionen auf einem zweidimensionalen, also im wesentlichen flächigen Träger durchgeführt werden, welcher dann der Vorrichtung zur Auftrennung der Einzelproben zugeführt wird. Bei der Gen-Expressionsanalyse durch das "Ansequenzieren" der exprimierten Gene kann der Nutzer von allen Vorteilen des SAGE- Verfahrens profitieren, spart sich jedoch arbeitsaufwendige Schritte bei der Probenvorbereitung. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren einer 3-dimensional erfolgenden Auftrennung von Einzelproben können diese hinsichtlich dreier unterschiedlicher und unabhängiger Parameter analysiert werden. Als Parameter seien beispielhaft der pH- Wert, die Größe und die Hydrophobizität (bzw. Solubilität) der einzelnen Proben genannt.
Beim erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren einer Auftrennung in einem drei- dimensionalen Separationsmedium hält sich die Mehrzahl der Proben nicht in dessen
Randbereich auf, so daß die im Zusammenhang mit 1-dimensional bzw. 2-dimensional durchgeführten Auftrennverfahren durch Randeffekte verursachte Probleme, z.B. hinsichtlich einer Aufweitung der Banden (Smiling-Effekt), nicht auftreten können.
Insbesondere unterbleibt das dem ein-dimensionalen Auftrennverfahren innewohnende Verstopfen von Kapillarröhrchen vollständig. Hinsichtlich der Handhabung bietet das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren den nicht unerheblichen Vorteil, daß nunmehr ein Befüllen einzelner Kapillarröhrchen - wie beim 1 -dimensionalen Auftrennverfahren üblich - entfallen kann. Ferner sind an das Geschick der Handhabungspersonen im Vergleich zum Einführen des Separationsmediums zwischen zwei Glasplatten - wie bei einigen üblichen zweidimensionalen Auftrennverfahren erforderlich - geringere Anforderungen zu stellen, da gemäß des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens das Separationsmedium in einen im wesentlichen zylinderformigen Behälter eingegossen wird. Ausserdem steht beim dreidimensionalen Auftrennverfahren ein wesentlich größeres Volumen an Separationsmedium zur Verfügung, in welchem die Auftrennung einer Vielzahl von Proben in paralleler Abarbeitung gleichzeitig erfolgen kann.
Die zur Herbeiführung einer Migration der Proben durch das Separationsmedium erforderlichen Kräfte können physikalischer oder chemischer Natur sein. Als Beispiele seien elektrische Kräfte, Gravitation, Zentrifugalkräfte, oder durch Diffusion, Druck- und Konzentrationsgradienten sowie durch Osmose entstehende Kräfte angeführt, die einzeln oder in Kombination auf die Proben wirken können.
Elektrophorese
Ein bevorzugter Weg des erfindungsgemäß vorgeschlagenen dreidimensionalen Separationsverfahrens bedient sich einer durch ein elektrisches Feld auf die Proben ausgeübten Kraft, um deren Migration durch das Separationsmedium zu bewirken. Hierzu sind die Proben im allgemeinen elektrisch geladen; der Separationsvorgang wird als Elektrophorese bezeichnet. Aufgrund unterschiedlicher Ladung und Masse bewegen sich die Proben-Moleküle mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das Separationsmedium. Meistens wird die relative Beweglichkeit einer Substanz bezogen auf einen mitaufgetrennten Standard angegeben. Dadurch lassen sich nicht nur Stoffe auftrennen, sondern auch durch ihr Wanderungs- Verhalten näher charakterisieren.
Im Rahmen des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens und der Vorrichtung lassen sich zur Separation nach dem Elektrophoreseprinzip alle bekannten Techniken nutzen. Man unterscheidet elektrophoretische Trennmethoden in freier Lösung (Wandernde- Grenzschichten-Elektrophorese, kontinuierliche trägerfreie Elektrophorese, Kapillar- Elektrophorese) von der Auftrennung in stabilisierenden Medien, wie z.B. Agarose-Gele oder Polyacrylamid-Gele. Das Trennprinzip der Elektrophorese hat als Analyseverfahren in der Biotechnologie bereits einen hohen Stellenwert erreicht, da der Trennmechanismus beinahe universell einsetzbar ist. So z.B. lassen sich Eiweiße, Aminosäuren, Peptide, Blutplasmaproteine, Vitamine, Enzyme, Zellen und Zellbestandteile auftrennen; zudem handelt es sich um ein sehr schonendes Verfahren, d.h. die Proben stehen im allgemeinen nach dem Trennvorgang für weitere präparative oder analytische Schritte zur Verfügung.
Joule 'sehe Wärme
Ein Charakteristikum der Elektrophorese ist der durch das Separationsmedium auftretende Stromfluß und die damit verbundene Umsetzung von elektrischer Energie in Wärme. Diese wird als Joule 'sehe Wärme bezeichnet; sie wird innerhalb des vom elektrischen Stromfluß durchsetzten Mediums, in diesem Fall innerhalb des Separationsmediums, frei und bewirkt in diesem einen Temperaturanstieg. Dieser würde einerseits eine Zersetzung der Proben und andererseits eine Veränderung der Trenneigenschaften des Separationsmediums und letztlich dessen Zersetzung bewirken. Schon vor der eigentlichen Zersetzung des Separationsmediums kommt "es im allgemeinen zu einer temperaturabhängigen Veränderung seiner elektrischen Leitfähigkeit und Viskosität. Dies ist eine der hauptsächlichen Ursachen für den oben angeführten Effekt der Bandenverbreiterung (Smiling-Effekt) und die Abweichungen der Migrationsbahnen vom gewünschten (parallelen) Verlauf. Bei allen Elektrophorese-Trennverfahren muß deshalb dafür Sorge getragen werden, daß die Joule 'sehe Wärme aus dem Separationsmedium abgeführt wird, um einen übermäßigen Temperaturanstieg in diesem zu verhindern. Bei der Thermostatisierung des Trennaufbaus kommt es dabei nicht nur auf die insgesamt abzuführende Wärmeleistung an, sondern auch auf die Schaffung bzw. Einhaltung eines spezifischen Temperaturprofils innerhalb des Separationsmediums. Je nach Trennverfahren ist die Einhaltung eines vorgegebenen Temperaturverlaufs im Separationsmedium mehr oder weniger kritisch für die erzielbare Trennschärfe und die entsprechenden zur Thermostatisierung notwendigen Maßnahmen mehr oder weniger aufwendig.
Temperaturprofil
Mittels des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Elektrophorese-Verfahrens und der zugehörigen Vorrichtung lassen sich die einzelnen Migrationsbahnen der Proben durch das Separationsmedium durch thermische Isolation des Separationsvolumens, in radiale Richtung gesehen, parallel zur Hochachse des Analysehohlraumes halten. Dazu kann ein, den ersten Raum umschließenden, zweiter Raum ein Medium enthalten, welches als thermische Isolation für den ersten Raum dienen kann. Da idealerweise kein Wärmetransport in radialer Richtung über die Begrenzungswandung des ersten Raumes in die Umgebung erfolgt, kann die beim Elektrophorese- Verfahren entstehende Joule'sche Wärme ausschließlich über die Stirnseiten einer zur Durchführung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens geeigneten Vorrichtung abgeführt werden. Unter den idealisierenden Annahmen, daß ein Wärmeaustausch nur durch Wärmeleitung erfolgt und weiterhin, daß ein homogener Wärmeumsatz im Separationsmedium stattfindet, stellt sich im Analysehohlraum ein Temperaturprofϊl gemäß folgender quadratischer Funktion ein:
T (z) = Tmax - az2
Wegen der oben genannten, vereinfachenden Annahmen gilt obige Formel nur in grober Näherung, da in der Realität noch andere Mechanismen des Wärmeaustausches (z.B durch Strahlung) vorliegen. Außerdem ist der Joule'sche Wärmeumsatz nicht homogen, unter anderem bedingt durch die inhomogene Temperatur entlang der z-Achse, die über die elektrolytische Leitfähigkeit die elektrischen Feldparameter beeinflußt. Im inneren Zentralbereich des ersten Raumes und in dessen Peripheriebereich herrscht jedoch im wesentlichen gleiche Temperatur, mit anderen Worten, es liegt kein Temperatur- Gradient in radialer (r-) Richtung vor. Das identische Temperaturprofϊl entlang der Hochachse (z- Achse) im Inneren des Raumes und an dessen Randbereichen bewirkt eine in radialer Richtung des ersten Raumes gesehen isotrope Gelviskosität und gewährleistet gleichmäßige Ionenmobilität. Die sich in dem ersten Raum einstellenden elektrischen Feldlinien und Migrationsbahnen der Proben von einer Elektrode zur gegenüberliegenden Elektrode verlaufen dann parallel zur z- Achse, d.h. der Hochachse des ersten Raumes ohne Auslenkung in radiale Richtung.
Gemäß des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Elektrophorese-Verfahrens entspricht das Temperaturprofil im Separationsmedium parallel zu seiner Hochachse (z-Achse) in dessen Randbereich dem Temperaturprofϊl im Zentralbereich. Dadurch ist eine Auslenkung, d.h. eine Krümmung der Migrationsbalinen aufgrund von Temperatureinflüssen ausgeschlossen. Die Ausbildung der von der Proben-Ladefläche ausgehend streng parallel zur Z-Achse verlaufenden Migrationsbahnen der Einzelproben kann dadurch unterstützt werden, daß im ersten Raum, sowie gegebenenfalls im diesen umgebenden zweiten Raum, an der jeweiligen Oberfläche mit dem Flächennormal senkrecht zur Probenmigrationsrichtung mittels einer Temperier-Vorrichtung entlang der Probenmigrationsrichtung ein Temperaturprofil erzeugt und aufrechterhalten wird, welches im wesentlichen demjenigen Temperaturprofϊl entlang der Probenmigrationsrichtung im Zentrum des ersten Raumes entspricht.
Zur Beibehaltung einer Temperaturverteilung, die im wesentlichen von einer senkrecht zur Probenmigrationsrichtung verlaufenden Koordinate unabhängig ist, kann der erste Raum, und gegebenenfalls der ihn umgebende zweite Raum, gegen einen Wärmefluß senkrecht zur Probenmigrationsrichtung thermisch isoliert werden.
Ebenso kann im ersten Raum, und gegebenenfalls im diesen umgebenden zweiten Raum, an deren jeweiligen Stirnflächen - bei zylinderformiger Ausbildung - mit dem Flächennormal in oder gegen die Probenrnigrationsrichtung, mittels einer Temperier- Vorrichtung die elektrisch umgesetzte Joule'sche Wärme abgeführt werden.
Nach dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Elektrophorese- Verfahren sind dem Trennaufbau Elektrodenelemente, die zum Beispiel platten- oder ringförmig konfiguriert sein können, derart zugeordnet, daß bei Anlegen einer elektrischen Spannung an diesen die (elektrisch geladenen) Einzelproben im wesentlichen in Richtung der Hochachse der Separationsvorrichtung migrieren.
Der zweite Raum kann von einem weiteren Raum umgeben sein oder in mit diesem in Verbindung stehen, in welchen) ein Lösungsmittel, wie zum Beispiel ein Elektrolyt oder ein Puffermedium enthalten ist, welches mit den Stirnseiten' des im wesentlichen zylinderförmig angeordneten Trennaufbaus in Kontakt steht. Ein Einstellen bzw. Aufrechterhalten gewünschter elektrischer, chemischer, und physikalischer Eigenschaften des Separationsmediums und des die Elektroden umgebenden Lösungsmittels kann dadurch begünstigt werden, daß das im weiteren Raum enthaltene Lösungsmittel, sei es ein Elektrolyt, sei es ein Puffermedium, zwischen den Elektrodenelementen umgewälzt wird. In vorteilhafter Weise kann mit einer Umwälzung eine Wärmeabfuhr über die Stirnflächen des ersten Raumes, sowie gegebenenfalls des zweiten Raumes, verbunden werden. Eine Umwälzung des Puffermediums geschieht in vorteilhafter Weise in radialer Richtung, entweder vom Zentrum in den Peripheriebereich oder entgegengesetzt, und kann mittels einer Umwälzeinrichtung (Pumpe) stattfinden. In vorteilhafter Weise entsprechen die beispielsweise elektrischen Eigenschaften - oder auch andere physikalische und chemische Eigenschaften - des Lösungsmittels denen des im ersten Raum aufgenommenen Separationsmediums. Der weitere Raum kann zur Verbesserung eines Ionenaustausches mit einem externen Reservoir in Verbindung stehen. Das bei dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren eingesetzte Separationsmedium ist im Falle der elektrophoretischen Auftrennung innerhalb des ersten Raumes derart aufgenommen, daß sich ein Verhältnis seiner radialen Erstreckung zu seiner Längsausdehnung von > 0,2, vorzugsweise > 0,3, besonders bevorzugt größer >0,5 einstellt.
Das Separationsmedium kann je nach Anwendung sowohl fest, flüssig als auch kolloid vorliegen; es kann sich um ein transparentes oder ein nicht transparentes Separationsmedium handeln. Als Beispiele für Separationsmedien seien Polyacrylamid, Agarose oder auch Hydroxylcellulose genannt. Abhängig vom eingesetzten Separationsmedium ist vorzugsweise ein Medium als Puffermedium eirrzusetzen, dessen physikalische, elektrische und chemische Eigenschaften denjenigen des ausgewählten Separationsmediums möglichst nahe kommen.
Probenauftrag
Der Probenauftrag kann durch Einbringen einer zweidimensionalen Schicht (Probenplatte) erfolgen, in oder auf der die Einzelproben im wesentlichen flächenmäßig zweidimensionalangeordnet werden. Eine solche Probenplatte zur Aufnahme von Proben kann in die Separationsschicht selbst integriert sein. Die Einzelproben können sich örtlich fixiert in oder auf einem Trägermaterial oder auf im wesentlichen 2-dimensionalen Anordnungen von punktförmigen Erhebungen oder Vertiefungen befinden, z.B. aufgebracht durch Arrays von Pins, Mikroelektroden, Hohlkörpern, Pipetten, Tips. Die eingesetzten Probenplatten umfassen bevorzugt ein poröses Trägermaterial. Die Einzelproben des jeweiligen Probenauftrags können auch zum Beispiel durch elektrische oder magnetische Kräfte auf der Probenplatte lokalisierbar sein. Ebenfalls können die Proben auch direkt auf das Separationsmedium, z.B. in an einer seiner Grenzflächen befindlichen, regelmäßig angeordneten Vertiefungen aufgetragen werden. In diesem Fall stellt ein Teil des Separationsmediums selbst die Probenplatte dar. In der Regel stellen Probenplatten jedoch eigenständige Vorrichtungen zur Handhabung der Proben dar.
An den Einzelproben können vor dem Separationsvorgang chemische Reaktionen oder physikalische Behandlungen oder Messungen vorgenommen werden. Dies geschieht vorzugsweise in oder auf der Probenplatte, oder in einer Vorrichtung, von der die Einzelproben auf die Probenplatte übertragen werden können. Beispielsweise können die Einzelproben aus einzelnen Molekülen oder aus einer Vielzahl gleichartiger Moleküle amplifiziert werden, wozu beispielsweise neben dem PCR- Verfahren auch das Klonen und eine anschließende selektive Vermehrung eingesetzt werden kann. In gleicher Weise lassen sich auch der Separation vorangehende Reaktionen (z.B. DNA-Sequenzierungsreaktionen) durchführen.
Eine zweidimensionale Verteilung der Einzelproben auf der Probenplatte, oder einer Vorrichtung, aus der die Einzelproben auf die Probenplatte übertragen werden können, kann beispielsweise durch einen Cell Sorter oder einen fluoreszenz-aktivierten Cell Sorter (FACS) erfolgen. Die Einzelproben können dazu beispielsweise an oder in Partikeln vorliegen, vorzugsweise in Wirtsorganismen, z.B. Hefen, Bakterien oder sogenannten Kompetenten Zellen. Dabei werden die Partikel, aufgrund jeweils gemessener physikalischer oder chemischer Eigenschaften verteilt. Die physikalischen Eigenschaften können zum Beispiel die Intensität oder Wellenlänge von abgestrahltem Fluoreszenzlicht sein. Die zweidimensionale Verteilung der Einzelproben auf der Probenplatte erfolgt "derart, daß der Abstand zwischen benachbarten Einzelproben einen Mindestabstand nicht unterschreiten. Der Mindestabstand ist im wesentlichen abhängig von der Art der Separation und den Proben und muß so gewählt werden, daß die unabhängige Auftrennung und Detektion der Eizelproben gewährleistet ist. Der Verteilung von Partikeln, z.B. Kompetenten Zellen, können Amplifizierungsschritte folgen. Von hoher praktischer Bedeutung ist in diesem Zusammenhang das Aussortieren und Verteilen von Organismen, die einen zu sequenzierenden DNA-Abschnitt (Insert) tragen. Bei konventionellen Sequenzierungstechniken wird aufgrund einer Farbänderung des Organismus auf die Präsenz eines solchen DNA-Abschnittes (Insert) geschlossen. Dazu wird der Organismus durch gezielte Manipulation seiner DNA zur Bildung eines Farbstoffes veranlaßt. In Organismen, die ein Insert tragen, ist durch dieses die Bildung des Farbstoffes gestört. Die Manipulation der DNA des Organismus kann so modifiziert werden, daß der gebildete Farbstoff, z.B. GFP (=Green Fluorescent Protein), bzw. die Farbänderung, von einem Fluoreszenz-Aktivierten Cell Sorter (FACS-Gerät) erfaßt werden kann und somit als Kriterium zur automatischen Sortierung bzw. Verteilung von Organismen auf der Probenplatte dienen kann. Der Probenverteilung aufgrund gemessener Eigenschaften können weitere chemische Reaktionen oder physikalische Behandlungsschritte, z.B. Sequenzierungs-Reaktionen, vorzugsweise in der Probenplatte, folgen. Separation nach 3 Parametern
Die Einzelprobenpräparation des jeweiligen Probenauftrages kann derart erfolgen, daß zunächst in einem im wesentlichen zweidimensionalen Separationsmedium mehrere Proben in paralleler Abarbeitung nach einem Parameter aufgetrennt werden. Das zweidimensionale Trennmedium wird dann, die aufgetrennten Probenfraktionen enthaltend, als Probenplatte mit einer Grenzfläche des dreidimensionalen Separationsmediums in Kontakt gebracht. Die in dem zweidimensionalen Separationsmedium enthaltenen Proben können dann durch Migration in eine Richtung, die im wesentlichen senkrecht zu ihrer ursprünglichen Laufrichtung orientiert ist, in dem dreidimensionalen Separationsmedium nach einem weiteren Parameter aufgetrennt werden. Der Auftrennung durch das zweidimensionale Separationsmedium kann außerdem eine Vorseparation in einem eindimensionalen Separationsmedium vorangestellt werden, so daß mit dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren eine Auftrennung von Proben nach insgesamt drei unabhängigen Parametern erzielt werden kann. Alternativ können anstelle des zweidimensionalen Separationsmediums mehrere eindimensionale Separationsmedien mit darin enthaltenen, vorseparierten Probenfraktionen in im wesentlichen paralleler Anordnung als Probenplatte mit der Grenzfläche des dreidimensionalen Separationsmediums in Kontakt gebracht werden und die Proben in diesem aufgetrennt werden. Auf diese Weise ermöglicht das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren die Auftrennung von Proben nach nur zwei Parametern, jedoch in paralleler Abarbeitungsweise mit hohem Durchsatz. Zwischen den einzelnen Separationsschritten kann jeweils eine Detektion der Proben durch entsprechende Verfahren erfolgen und ergänzend oder alternativ eine chemische oder physikalische Behandlung des Separationsmediums und/oder der Proben erfolgen. Gegebenenfalls können außerdem einzelne Probenfraktionen für weitere analytische oder präparative Schritte aus dem Separationsmedium entnommen werden.
Für die ein- oder zweidimensionale Vorseparation der Einzelproben können z.B. die oben beschriebenen Elektrophoresetechniken unter Verwendung der oben beschriebenen Probenplatten, die zu diesem Zweck ein geeignetes Separationsmedium enthalten, genutzt werden. Dies ist insbesondere von Bedeutung für die als Anwendung vorgeschlagene Auftrennung von Proteingemischen nach drei unabhängigen Parametern (z.B. pH- Wert, Größe, Hydrophobizität bzw. Solubilität) mittels des erfindungsgemäß vorgeschlagenen dreidimensaionalen Separationsverfahrens. Detektion, Fraktionskollektor
Zur qualitativen und quantitativen Analyse von Proben kann deren Detektion im Rahmen des erfindungsgemäß vorgeschlagenen dreidimensionalen Separationsverfahrens durch eine Vielzahl verschiedener Techniken erfolgen. Vorzugsweise werden Photodetektionsverfahren eingesetzt. Im einfachsten Falle erfolgt eine Detektion durch einfaches Betrachten.
Eine Kombination von Detektion und präparativem Sammeln der Probenfraktionen ist in vielen Fällen sinnvoll. In Ausnahmefällen erfolgt unter Verzicht auf eine Detektion ausschließlich ein präparatives Sammeln der einzelnen Probenfraktionen. Für das Sammeln der Probenfraktionen während des Trennvorgangs können zwei Verfahren unterschieden werden:
Die erste Ausführungsvariante sammelt die Probenfraktionen unmittelbar an einer Grenzfläche des Separationsmediums und speichert sie dort in oder auf einem geeigneten Sammelmedium. Vorzugsweise besteht das Sammelmedium aus einer Membran oder einzelnen Probenplatten, die in regelmäßigen zeitlichen Abständen an einer Grenzfläche des Separationsmediums vorbeigeführt werden können. Durch einen regelmäßigen Transport der Sammelmembran aus der Trennvorrichtung, bzw. ein regelmäßiges Auswechseln der Probenplatten, werden die Probenfraktionen je nach Retentionszeit auf verschiedenen Teilflächen der Membran, bzw. auf verschiedenen Probenplatten, abgelegt.
Bei der zweiten Variante werden die Proben durch ein Array aus Kapillaren, Röhren oder Schläuchen aus der Trennvorrichtung herausgeführt und von einem externen Fraktionskollektor gesammelt.
Die Detektion kann während der Proben-Migration (Online-Detektion) oder nach Abschluß der Separation erfolgen. Eine Detektion der Proben während ihrer Migration kann auf ein zweidimensionales Abbildungsverfahren zurückgeführt werden. Dazu werden die Probenfraktionen bei ihrem Durchgang durch einen ausgewählten, zweidimensionalen ebenen Detektionsbereich delektiert. Der im wesentlichen senkrecht zur Migrationsrichtung der Proben orientierte Detektionsbereich liegt vorzugsweise nahe einer Grenzfläche des Separationsmediums; er kann innerhalb oder außerhalb des Separationsmediums liegen. Von diesem im wesentlichen zweidimensionalen Detektionsbereich kann in zeitlichen Intervallen, z.B. durch die im folgenden beschriebenen Detektionseinrichtungen, eine fortlaufende Serie zweidimensionaler Abbildungen aufgenommen und auf geeignete Weise aufgezeichnet werden. Die durch die Separation der Probenfraktionen zwischen ihnen entstehenden räumlichen Distanzen entlang der Migrationsrichtung werden also in zeitliche Abstände ihres Durchganges durch den Detektionsbereich umgesetzt.
Im Falle einer Detektion nach Abschluß des Separationsvorganges ist ein dreidimensionales Abbildungsverfahren erforderlich. Hierzu kann beispielsweise ein stereoskopisches Abbildungsverfahren eingesetzt werden. Alternativ dazu kann ein im wesentlichen zweidimensional definierter Detektionsbereich durch das Separationsmedium, vorzugsweise in Richtung dessen Hochachse (z-Achse), bewegt werden (Scannen). Von diesem Detektionsbereich können, z.B. durch die im folgenden beschriebenen Detektionseinrichtungen, eine Serie zweidimensionaler Abbildungen aufgenommen und auf geeignete Weise aufgezeichnet werden.
Indem das dreidimensionale Separationsmedium nach Abschluß des
Separationsvorganges, z.B. durch parallele Schnitte, in Scheiben zerlegt wird, kann jedoch auch im Fall einer Detektion nach Abschluß des Separationsvorganges eine Rückführung auf ein herkömmliches zweidimensionale Abbildungsverfahren erfolgen. Vorzugsweise verlaufen die Schnitte parallel oder senkrecht zur Probenmigrationsrichtung. Die auf diese Weise erhaltenen, im wesentlichen zweidimensionalen Scheiben des Separationsmediums können durch übliche, geeignete 2D-Abtastverfahren abgebildet werden. Eine präparative Isolation von einzelnen Probenfraktionen durch Herauslösen aus den Scheiben ist dann ebenfalls leicht möglich.
Konfokale Detektion
Eine bevorzugte Technik zur Online-Detektion ist eine konfokale Detektionseinrichtung, deren Meßkopf als Mehrfach-Meßkopf ausgebildet sein kann. Die konfokale Detektionseinrichtung ist mit einem oder mehreren optischen Systemen versehen, welche so ausgelegt sind, daß die objektseitigen punkt- oder linienformigen Foci der Illuminations-Strahlengänge mit denjenigen der Detektions-Strahlengänge zusammenfallen. Zur Fokussierung des Illuminationslichtes und Erfassung des von den Proben im Detektionsbereich ausgehenden Lichtes kann ein- und dasselbe oder verschiedene optische Systeme dienen. Im letzeren Fall sind die Strahlengänge der optischen Systeme zur Illumination und Detektion vorzugsweise rechtwinklig zueinander angeordnet. Außerdem kann in diesem Fall der dichroitische Strahlteiler zur Separation der Strahlengänge von Beleuchtungs- und Detektionseinrichtung entfallen.
Durch Wahl einer konfokalen Detektionsanordnung kann durch (Rayleigh-)Streuung im Separationsmedium und im umgebenden Medium verursachte Hintergrundstrahlung reduziert und eine bessere räumliche Auflösung in Richtung der optischen Achse erreicht werden. Mittels eines Mehrfach-Meßkopfes lassen sich größere Flächenbereiche der Querschnittsfläche des ersten Raumes simultan abtasten. Zur Detektion von mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten Einzelproben kann der (Mehrfach-)Meßkopf der konfokalen Detektionseinrichtung mit optischen Absorptions- und alternativ oder ergänzend mit Interferenz-Filtern versehen werden.
Zum Bildaufbau kann die Detektionseinrichtung in x, y; r, ω-Richtung in Bezug auf eine Querschnittsfläche des ersten Raumes, welcher das Separationsmedium und die darin aufzutrennenden Einzelproben enthält, verfahren werden (Scannen). Das während des Scannens in der Detektionseinrichtung erzeugte, im allgemeinen elektrische Signal kann dann geeigneten Einrichtungen zur Verstärkung und Aufzeichnung zugeführt werden.
Punkt-konfokale Detektion
Gemäß einer weiteren möglichen Ausfuhrungsvariante der konfokalen Detektion kann der Detektionsbereich punktweise beleuchtet werden. In bevorzugter Ausfuhrungsweise wird ein (oder mehrere) monochromatische, kohärente Lichtquellen (z.B. Laser) eingesetzt. Mittels eines dichroitischen Strahlteilers kann der/die Strahl(en) zu einem Objektiv hin umgelenkt werden, welches ihn/sie auf einen Punkt in der Detektionsebene fokussiert. Der/die Strahl(en) kann dabei, um ein Beispiel zu geben, auf fluoreszierende Moleküle treffen, die durch Anregung mit Licht der Laserwellenlänge Fluoreszenzlicht einer anderen, größeren Wellenlänge abstrahlen. Das gleiche oder ein anderes Objektiv erfaßt je nach numerischer Apertur einen Teil des abgestrahlten Lichtes, welches durch den dichroitischen Strahlteiler auf einen Detektor, zum Beispiel einen Photomultiplier, Avalanche-Diode oder eine CCD-Kamera, umgeleitet wird. Je nach Stärke des Lichtsignales wird ein entsprechendes Detektorsignal erzeugt. Die optischen Strahlengänge der Beleuchtungseinrichtung und der Detektionseinrichtung sind so ausgelegt, daß ihre beiden objektseitigen Fokuspunkte im Detektionsbereich (punkt-)konfokal aufeinander liegen. Ein Bildaufbau wird durch ein Bewegen (Scannen) des Meßkopfes in x,y- oder ω,r- Richtung relativ zum Separationsmedium ermöglicht.
Zylindrisch konfokale Detektion
Eine vereinfachte Detektionseinrichtung nutzt eine zylindrisch konfokale Anordnung einer Beleuchtungsvorrichtung in Kombination mit einem Zeilendetektor. Die von der Beleuchtungszeile ausgehende Strahlung wird durch ein geeignetes optisches System linienfbrmig in den Detektionsbereich fokussiert. Die ausgeleuchtete Linie im Detektionsbereich wird durch ein geeignetes optisches System auf die Detektionszeile abgebildet. Als zylindrisch konfokal wird die Anordnung der dem Zeilendetektor und der Beleuchtungsvorrichtung zugeordneten optischen Systeme bezeichnet, wenn die beiden objektseitigen Fokuslinien der . zugeordneten optischen Strahlengänge deckungsgleich aufeinander liegen.
Die Ausleuchtung des Detektionsbereiches kann beispielsweise mittels einer zeilenförmigen Anordnung von Leuchtdioden oder Laserdioden bzw. eines entsprechend fächerförmig bewegten oder aufgeweiteten Laserstrahls erfolgen. Durch Ansteuerung der einzelnen Leuchtdioden oder Laserdioden bzw. der Bewegung des Laserstrahls synchronisiert zum Auslesevorgang des Zeilendetektors kann eine Verbesserung des Signal-zu-Rausch- Verhältnisses im Sinne des Mode-Locking- Verfahrens erreicht werden. Das optische System, welches einer zylindrisch konfokalen Kombination aus Illuminations- und Detektionseinrichtung zugeordnet ist, kann ein oder mehrere Gradienten-Index-Linsenfelder, Zylinderlinsen, Mikrolinsenfelder oder eine Kombination dieser optischen Elemente enthalten.
Gradienten-Index-Linsen
Bevorzugt werden ein oder mehrere Gradienten-Index-Linsenfelder eingesetzt. Ein solches Linsenfeld (Array) besteht aus einer Vielzahl einzelner, dicht nebeneinander angeordneter Gradienten-Index-Linsen. Gradienten-Index-Linsen zeichnen sich dadurch aus, daß der Brechungsindex innerhalb des zylinderförmigen Linsenkörpers von der Zentralachse nach außen hin kontinuierlich abnimmt. Stirnseitig eintretende Lichtstrahlen werden dadurch innerhalb der Linse sinusförmig abgelenkt. Gradienten-Index-Linsen werden in Durchmessern von etwa 0,1 bis 2 Millimetern gefertigt. Die Länge des zylinderförmigen Linsenkörpers bestimmt die Brennweite bzw. die optischen Abbildungseigenschaften der Linse. Gradienten-Index-Linsen einer bestimmten Länge erzeugen eine aufrechte 1-zu-l- Abbildung. Bei Anordnung mehrerer solcher Linsen zu einem Array überlagern sich die Bilder einzelner Linsen zu einer räumlich kontinuierlichen, aufrechten 1 -zu- 1 -Abbildung beliebiger Ausdehnung. Durch Abbildung des Lichtes einer Leuchtdioden-Zeile, oder vorzugsweise einer Laserdioden-Zeile, mittels eines Gradienten-Index-Linsen- Arrays in den Detektionsbereich kann in diesem ein zellenförmiger Bereich räumlich selektiv beleuchtet werden. Das gleiche Linsen- Array kann zur räumlich selektiven Abbildung des beleuchteten Bereiches innerhalb des Separationsmediums auf eine zeilenförmige Detektionseinrichtung, z.B. eine CCD- oder Photodioden-Zeile, dienen. In diesem Fall kann das von dem beleuchteten Bereich im Detektionsbereich ausgehende Licht durch einen dichroitischen Strahlteiler wellenlängenspezifisch von dem von der Beleuchtungseinrichtung ausgehenden Licht separiert und der Detektionseinrichtung zugeführt werden. Zusätzlich zum dichroitischen Strahlteiler können weitere optische Absorptions- und Interferenz-Filter zur Verbesserung der spektralen Selektivität der Detektion zum Einsatz kommen.
Orthogonal zylindrisch konfokale Detektion
Eine andere Ausführungsvariante der Detektionseinrichtung nutzt eine orthogonal zylindrisch konfokale Anordnung einer zellenförmigen Beleuchtungsvorrichtung in Kombination mit einem Zeilendetektor. Dazu kann durch Abbildung des Lichtes einer Leuchtdioden-Zeile, oder vorzugsweise einer Laserdioden-Zeile, mittels eines geeigneten optischen Systems, vorzugsweise mittels einer Zylinderlinse, in den Detektionsbereich in diesem ein zellenförmiger Bereich räumlich selektiv beleuchtet werden. Der beleuchtete Bereich kann durch ein oder zwei Gradienten-Index-Linsen-Array(s) mit gegenüber der optischen Achse der Beleuchtungseinrichtung winklig angeordneter optischer Achse auf die Detektionseinrichtung abgebildet werden. Durch die im wesentlichen rechtwinklige (orthogonal konfokale) Anordnung der optischen Achsen von lUuminations- und Detektions-Einrichtungen kann eine Verringerung der durch (Rayleigh-)Streuung des Illuminations-Lichtes im Separationsmedium verursachten Hintergrundstrahlung erzielt werden und eine bessere räumliche Auflösung in Richtung der z-Achse erreicht werden. Außerdem kann in diesem Fall der dichroitische Strahlteiler zur Separation der Strahlengänge von Beleuchtungs- und Detektionseinrichtung entfallen. Auch bei dieser Ausgestaltung des optischen Systems können optische Absorptions- und Interferenz-Filter zur Verbesserung der spektralen Selektivität der Detektion zum Einsatz kommen. Auch die oben beschriebene Varianten von zylindrisch konfokalen Anordnungen können als Mehrfach-Meßkopf ausgeführt werden, indem mehrere solcher Illuminations- und Detektionszeilen zusammengefaßt werden. Die in einem solchen Mehrfach-Meßkopf zusammengefaßten Illuminations- und Detektionseinheiten können auch zur Aufnahme unterschiedlicher Strahlung, z.B. solcher mit verschiedener Wellenlänge oder Polarisation, individuell ausgelegt werden.
Zum Aufbau eines Bildes werden die oben beschriebenen Illuminations- und Detektionszeilen mit im wesentlichen orthogonal zueinander angeordneten optischen Achsen und konfokal aufeinander liegenden Fokuslinien eindimensional in x- oder ω- Richtung gegenüber dem Separationsmedium verschoben (Scannen).
Integration Detektor in Elektrode
Eine punkt-konfokale oder zylindrisch konfokale Detektionseinrichtung kann im Fall der elektrophoretischen Separation in einer der Elektroden, bevorzugt derjenigen Elektrode, auf welche die Proben innerhalb des Separationsmediums des ersten Raumes zuwandern, integriert sein. Beim Scan- Vorgang wird dann die Elektrode zusammen mit dem Detektor bewegt. Dadurch wird die Homogenität des im Separationsmedium aufgebauten elektrischen Feldes - gemittelt über einen oder mehrere Scan-Perioden - nicht durch die Detektionseinrichtung beeinträchtigt. Durch die Anordnung einer konfokalen Detektionseinrichtung oberhalb des Separationsmediums beeinträchtigen im Zuge des Elektrophoresevorganges entstehende Gasblasen oberhalb des ersten Raumes nicht die Abbildung des Fluoreszenzlichtes auf den Detektor. Beleuchtung senkrecht zur Migrationsrichtung
Bei einer weiteren Ausföhrungsvariante einer Detektionseinrichtung kann eine Beleuchtungseinrichtung so angeordnet sein, daß ihre optische Achse im wesentlichen senkrecht zur Migrationsrichtung der Proben verläuft. Gemäß dieser Anordnung wird durch eine vorzugsweise monochromatische, kohärente Strahlungsquelle, z.B. einen oder mehrere Laser, ein im wesentlichen sich zweidimensional erstreckender, im wesentlichen senkrecht zur Migrationsrichtung der Proben orientierter Detektionsbereich beleuchtet. Dazu kann der/die Lichtstrahl(en) durch ein geeignetes optisches System, beispielsweise durch galvanometrische Umlenkeinrichtungen, rotierende Polygonspiegel oder Zylinderlinsen, fächerförmig ausgelenkt bzw. aufgeteilt werden.
Der Detektionsbereich kann dabei innerhalb des Separationsmediums oder außerhalb des Separationsmediums, vorzugsweise nahe einer seiner Grenzflächen liegen. Im Falle einer Detektion während der Migration der Proben (Online-Detektion) bleibt der Detektionsbereich stationär in Bezug auf das Separationsmedium. Die Probenfraktionen werden dann bei ihrem Durchtritt durch den Detektionsbereich detektiert. Im Falle einer Detektion nach Abschluß der Migration kann der Detektionsbereich zur Bildaufnahme durch das Separationsmedium, vorzugsweise in Richtung dessen Hochachse (z-Achse), verschoben werden (Scannen). Dazu kann das Separationsmedium aus der Trennvorrichtung entnommen werden und einer separaten Detektionsvorrichtung zugeführt werden.
Bevorzugt wird die Polarisationsrichtung des Illuminations-Lichtes so gewählt, daß nur ein minimaler Bruchteil der durch (Rayleigh-) Streuung im Separationsmedium und dem umgebenden Lösungsmittel verursachten Hintergrundstrahlung in Richtung der Detektionseinrichtungen abgestrahlt wird. Die Wellenlänge des Illuminations-Lichtes wird bevorzugt so gewählt, daß eine optimale Fluoreszenz-Anregung der entsprechend markierten Probenfraktionen erreicht wird, sowie die vom Separationsmedium und umgebenden Lösungsmittel ausgehende, durch Eigenfluoreszenz verursachte Störstrahlung minimiert wird. Vorzugsweise werden monochromatische Strahlungsquellen mit hohem Polarisationsgrad, beispielsweise Laser, eingesetzt.
Die Aufnahme der von den Probenfraktionen emittierten Strahlung kann durch eine Detektionseinrichtung erfolgen, deren optische Achse im wesentlichen parallel zur
Hochachse des zylinderförmigen Separationskörpers liegt und eine seiner Stirnflächen schneidet. Es wird dann von der Detektionseinrichtung Strahlung aufgefangen, welche stirnseitig aus dem Separationskörper austritt. Die optische Achse der DeteMonseinrichtung kann dabei entgegen der Migrationsrichtung, vorzugsweise jedoch in Richtung der Migration der Proben orientiert sein.
Bei relativ langgestreckten Separationskörpern, d.h. solchen mit einem Verhälnis ihrer radialen zu ihrer Längserstreckung von beispielsweise < 1, kann jedoch auch eine Anordnung der Detektionseinrichtung mit im wesentlichen schräg zur Hochachse des Separationskörpers liegender optischer Achse von Vorteil sein. In diesem Fall schneidet die optische Achse des Detektionssystems die Wandfläche des im wesentlichen zylinderförmigen Separationskörpers; sie kann dabei in oder entgegen der Migrationsrichtung orientiert sein. Von der Detektionseinrichtung wird dann Strahlung aufgefangen, die vom Detektionsbereich ausgehend, z.B. durch ein entsprechendes Fenster, durch die rings umgebende Wandfläche des Separationskörpers austritt. In jedem Fall ist dafür Sorge zu tragen, daß in der Detektionseinrichtung ein optisches System mit hoher numerischer Apertur eingesetzt wird. Die Strahlung aus der
Detektionsebene, oder aus einem Teilbereich der Detektionsebene, wird vom optischen
System z.B. auf eine hoch auflösende CCD-Kamera zweidimensional abgebildet, welche der Detektionseinrichtung nachgeschaltet ist. Wird nur ein Teilbereich der Detektionsebene
-abgebildet, so kann die Detektionseinrichtung zur Erfassung des gesamten Detektionsbereiches gegenüber diesem entsprechend in x-, y-, oder ω-Richtung verschoben werden (Scannen).
Eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienende Vorrichtung umfasst einen Separationsaufbau, der mindestens einen Raum enthält, der sich wesentlich über drei Raumkoordinaten erstreckt und der so beschaffen ist, daß er mit einem Separationsmedium befüllt werden kann. Dem Separationsmedium werden an einer Stirnfläche die aufzutrennenden Proben zugeführt. Der auf diese Weise gebildeten Separations- Anordnung ist eine Detektions-Einrichtung zugeordnet. Alternativ oder zusätzlich zur Detektions-Einrichtung kann eine Vorrichtung zum präparativen Sammeln der einzelnen Probenfraktionen (Fraktionssammler) zugeordnet sein. Um eine Migration der Proben durch das Separationsmedium zu veranlassen, ist die Trennvorrichtung auf vorteilhafte Weise so gestaltet, daß ein elektrisches Feld darin aufgebaut werden kann, oder daß sie Zentrifugalbeschleunigungen ausgesetzt werden kann, oder daß durch eine geeignete Vorrichtung, z.B. durch eine Pumpe oder Pneumatik ein hydrostatischer Druck oder ein Gasdruck appliziert werden kann. Elektrophorese- Vorrichtung
Im Falle des Einsatzes der Vorrichtung zur Elektrophorese sollte die Anordnung einen den ersten Raum umgebenden, konzentrisch zu diesem angeordneten, zweiten Raum mit einer Wärmeisolation enthalten. Der erste Raum sollte ein Radius zu Längenverhältnis R/Z größer als 0,5 aufweisen, um eine gute Abfuhr der bei der Elektrophorese freiwerdenden Joule 'sehen Wärme durch die Stirnseiten des in ihm enthaltenen Separationsmediums zu gewährleisten. Eine besonders gute Wärmeabfuhr liegt dann vor, wemi das Radius zu Längenverhältnis R/Z bei größer als 1 liegt. Außerdem wächst die Gesamtanzahl der mit der Vorrichtung auftrennbaren Einzelproben quadratisch mit dem Radius des ersten Raumes, der das Separationsmedium enthält.
In bevorzugter Ausgestaltung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen elektrophoretischen Trennaufbaues kann der den ersten Raum umgebenden zweite Raum ein Isolationsmedium enthalten, welches der thermischen Isolation des Separationskörpers in radialer Richtung dient. Die Isolation bewirkt die Ausbildung eines von der radialen (r-)Koordinate weitgehend unabhängigen Temperaturprofils im ersten Raum. Die Ausbildung eines von der radialen (r-) Koordinate unabhängigen Temperaturprofils im ersten Raum kann durch eine Temperierung der Raumbegrenzung des ersten Raumes entlang der Migrationsrichtung der Proben (Hochachse oder z-Achse) unterstützt werden. Die Temperierung der Raumbegrenzung kann z.B. elektrisch oder mittels eines Temperiermediums erfolgen.
In bevorzugter Ausgestaltung des Trennaufbaus sind die Stirnseiten des ersten Raumes und gegebenenfalls des zweiten Raumes von Elektroden derart überdeckt, daß sich in dem im ersten Raum aufgenommenen Separationsmedium bei Anlegen einer elektrischen
Spannung ein möglichst homogenes elektrisches Feld einstellt. Die Elektrodenelemente sind bevorzugt plattenförmig ausgebildet und enthalten elektrisch leitende Verbindungen, die jeweils auf der Seite der Elektroden angeordnet sind, die dem Separationsmedium abgewandt liegen. Die die Elektroden umgebenden Räume grenzen an das
Separationsmedium an. Sie sind so gestaltet, daß sie mit einer Flüssigkeit oder einem
Elektrolyten, vorzugsweise einem Puffermedium, aufgefüllt werden können und weiterhin so, daß ein Wärmefluß über die Stirnseiten des Separationsmediums ermöglicht wird.
Vorzugsweise ist dort eine Wärmeaustauschvorrichtung vorgesehen. Auf vorteilhafte Weise ist diese mit einer Temperiervorrichtung kombiniert. Als Wärmeaustauschmedium dient vorzugsweise die die Elektroden umgebende Flüssigkeit. Wird bei der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens der die Wärmeisolation aufnehmende zweite Raum von einem Reservoir umschlossen, welches mit den die Elektroden umgebenden Räumen in einer einen Austausch ermöglichenden Weise verbunden ist, kann im Falle der Anwendung zur Elektrophorese ein diffusiver Ionenaustausch zwischen den an den anodenseitigen und kathodenseitigen Stirnbereichen des ersten Raumes befindlichen Flüssigkeitsvolumina erzielt werden. Dadurch kann einerseits die Menge des erforderlichen Puffermediums herabgesetzt werden, und andererseits eine Einstellung bzw. Konstanthaltung gewünschter chemischer, physikalischer und elektrischer Eigenschaften des Puffermediums begünstigt werden. In bevorzugter Ausführung erfolgt ein aktiver Austausch des Puffermediums durch eine geeignete Umwälzanlage, z.B. durch eine Pumpe. Dabei kann in besonders vorteilhafter Ausführung eine Thermostatisierung, z.B. durch einen Wärmetauscher, im Zirkulationskreislauf vorgesehen sein, mittels der die an den Stirnseiten des Separationsmediums austretende Joule 'sehe Wärme abgeführt werden kann.
Detektionsvorrichtung
Photodetektions- Vorrichtungen können nach Art der Datenaufnahme klassifiziert werden. Es können folgende Vorrichtungen unterschieden werden:
a) Das 3D-Bildaufnahme-System zur Detektion der Probenfraktionen nach Abschluß des Separationsvorganges oder b) Das Online-Detektions-System zur Detektion der Probenfraktionen während des Separationsvorganges.
Das 3D-Bildaufnahme-System ist so gestaltet, daß bei einer Bildaufnahme jedem Volumenelement des Separationsmediums mindestens ein photometrischer Meßwert zugeordnet werden kann, das heißt jeder Datensatz umfaßt einen Ortsvektor mit 3 Koordinaten, dem mindestens ein photometrischer Meßwert zugeordnet ist.
Das Online-Detektionssystem ist so gestaltet, daß jedem photometrischen Meßwert ein zweidimensionaler Ortsvektor und zusätzlich die Zeit als dritte Koordinate zugeordnet ist. Online-Detektionssysteme sind so gestaltet, daß sie in regelmäßigen zeitlichen Intervallen Meßwerte aus einer stationären Ebene (Detektionsebene), durch die die Probenfraktionen hindurch migrieren, aufnehmen. Die Detektionsebene kann dazu innerhalb des Separationsmediums oder außerhalb nahe einer Grenzfläche des Separationsmediums liegen. Für die Online-Detektion können wiederum zwei Vorrichtungstypen unterschieden werden:
a) Konfokale Scanner und b) 2D-Bildaufhahme-Systeme mit orthogonaler Beleuchtungsvorrichtung.
Konfokale Scanner
Als vorteilhafte Ausführungsvariante konfokaler Scanner kommen punktkonfokale oder zylindrisch konfokale Scanner mit einfachem Meßkopf oder mit Mehrfachmeßkopf in Betracht. Scanner mit Mehrfachmeßkopf bieten den Vorteil, daß zum Auslesen einer gegebenen Fläche kürzere Auslesezeiten nötig sind und der Scan- Vorgang mit geringeren Geschwindigkeiten durchgeführt werden kann. Außerdem können die einzelnen, zu einem Mehrfach-Meßkopf zusammengefaßten Meßköpfe individuell zur Messung von Strahlung mit unterschiedlichen Eigenschaften, z.B. unterschiedlicher Wellenlänge, eingerichtet werden. Bei Betrieb konfokaler Scanner in Verbindung mit elektrophoretischen Trennvorrichtungen ist der Einbau des Meßkopfes in eine der Elektroden besonders vorteilhaft.
Zylindrisch konfokaler Scanner
Ein besonders einfacher und gleichzeitig vorteilhafter Scanner zeichnet sich durch zylindrisch konfokale Optik aus. Eine solcher Scanner ist gekennzeichnet durch eine zylindrische Beleuchtungsoptik und durch eine oder mehrere vorzugsweise kohärente Strahlungsquellen, z.B. Laser mit Optik zur Strahlaufweitung. Die Beleuchtungsoptik ist so gestaltet, daß die Strahlung der Strahlungsquellen in die Detektionsebene fokussiert wird. Durch die Wahl einer Zylinderoptik, vorzugsweise einer Zylinderlinse, ergibt sich eine beleuchtete Fokuslinie in der Detektionsebene.
Die Detektionsoptik ist so eingerichtet, daß diese Linie auf einen Zeilendetektor abgebildet wird. Die optischen Achsen von Beleuchtungsoptik und Detektionsoptik sind vorteilhaft winklig zueinander orientiert. Vorteilhaft ist auch ein Aufbau unter Verwendung von zwei
Beleuchtungseinrichtungen, welche im wesentlichen symmetrisch beidseitig zur Detektionsoptik angeordnet werden. Die Detektionsoptik zeichnet sich durch punktgetreue Abbildungseigenschaften aus. Vorzugsweise werden Anordnungen (Arrays) von Linsen verwendet. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung eines Gradientenindex-Linsenarrays.
Optik und Zeilendetektor bilden mechanisch eine Einheit, welche auf einen beweglichen Schlitten montiert ist. Durch eine Antriebsvorrichtung kann der Schlitten entlang einer kartesischen Koordinate bewegt werden oder um eine Achse rotieren. Die Steuerungs- und Auslese-Elektronik für den Zeilendetektor ist synchronisiert mit der Bewegung des Schlittens. Der so gebildeten Scan-Vorrichtung ist ein Datenaufzeichnungsgerät zugeordnet und ein EDV-Gerät zur Datenauswertung.
Punktkonfokaler Scanner
Punktkonfokale Scanner weisen gegenüber zylindrisch konfokalen Scannern eine bessere Ortsauflösung auf. Von besonderer Bedeutung ist hier die Ortsauflösung in Richtung der optischen Achse (Tiefenschärfe). Elektronische Steuerung, Datenaufzeichnung und Datenauswertung sind bei punktkonfokalen Scannern jedoch aufwendiger., es ist zu berücksichtigen, daß der oben beschriebene mechanische Schlitten in der Weise modifiziert werden muß, daß der punktkonfokale Meßkopf Bewegungen entlang zweier Koordinaten ausfuhren kann, und damit eine Fläche (Detektionsebene) abtasten kann.
Orthogonale Beleuchtung
2D-Bildaufhahme-Systeme mit orthogonaler Beleuchtungsvorrichtung für eine Detektionsebene sind durch folgende Merkmale gekennzeichnet:
Sie verfügen über eine Beleuchtxmgseinrichtung, gebildet durch eine vorzugsweise kohärente Lichtquelle, z.B. einen oder mehrere Laser mit Strahlaufweitungsoptik, die so an der Trennvorrichtung angebracht ist, daß im Separationsmedium oder nahe einer Grenzfläche des Separationsmediums eine Detektionsebene so aufgespannt wird, daß die Probenfragmente durch diese Ebene hindurch migrieren können. Der Beleuchtungsvorrichtung zugeordnet ist ein Detektionssystem, gebildet aus einem Objektiv und einem Detektor, vorzugsweise einer CCD-Kamera. Die Anordnung des Objektivs und des Detektors ist so gewählt, daß eine zweidimensionale Abbildung des Detektionsbereiches auf den Detektor erfolgt. Die Eigenschaften des Objektivs sind so gewählt, daß die Abbildung mit hoher Apertur und gleichzeitig hoher Ortsauflösung erfolgt. Die optische Achse - des Objektivs kann im wesentlichen parallel zur Migrationsrichtung der Proben verlaufen. In dieser Anordnung nimmt das Objektiv Strahlung auf, welche stirnseitig aus dem Separationsmedium austritt.
Die optische Achse des Objektivs kann aber auch schräg zur Migrationsrichtung verlaufen. In diesem Fall ist die Detektionsvorrichtung seitlich an der Trennvorrichtung vorgesehen. In diesem Fall ist es empfehlenswert, ein prismenförmiges Fenster zum Separationsraum hin vorzusehen, dessen optische Eigenschaften, insbesondere der Brechungsindex, denen des Separationsmediums ähneln. Bei einem solchen Aufbau kann es vorteilhaft sein, die im Detektionsbereich schräg zur Richtung der Probenmigration, vorzugsweise senkrecht zur optischen Achse des Objektivs, anzuordnen. Dies hat den Vorteil besserer Abbildungseigenschaften, jedoch den Nachteil, daß Differenzen der Probenlaufzeiten aufgrund unterschiedlicher Wege durch das Separationsmedium korrigiert werden müssen.
Die Datenaufzeichnung kann durch ein geeignetes Aufzeichnungsgerät erfolgen, welches in periodischen Intervallen Datensätze, im wesentlichen in Form von zweidimensionalen Bildern, aufnimmt.
Indem an das oben beschriebene 2D-Bildaufnahmesystem ein Translationsmechanismus adaptiert wird, der eine Verschiebung des Detektionsbereiches entlang einer Achse, vorzugsweise der Hochachse, durch das Separationsmedium bewirkt, kann ein 3D- Bildaufnahmegerät zur Detektion von Probenfraktionen nach Beendigung ihrer Separation aufgebaut werden. Das Datenaufnahmegerät ist in diesem Fall mit der Translationsvorrichtung synchronisiert. Das oben beschriebene 3D-Bildaufnahmegerät kann auch unabhängig von der Trennvorrichtung aufgebaut sein. In diesem Fall kann das Separationsmedium nach Abschluß des Separationsvorganges aus der Trennvorrichtung entnommen werden und dem separaten 3D-Bildaufnahmegerät zugeführt werden.
Präparatives Sammeln einzelner Fraktionen
Alternativ oder vorzugsweise ergänzend zur Probendetektionseinrichtung kann eine Fraktionssammelvorrichtung vorgesehen sein. Besonders vorteilhaft ist es, die Fraktionssammelvorrichtung mit der Probendetektionseinrichtung zu koppeln. Eine solche Kopplung ermöglicht den Austausch und die Zuordnung von Daten, sowie eine einseitige oder gegenseitige Steuerung zwischen den beiden Einheiten.
Es können zwei Ausführungsvarianten unterschieden werden:
Die erste Ausführungsvariante ist gekennzeichnet durch einen Transportmechanismus für Sammelmedien wie Platten, Membranen, Microtiterplatten oder Arrays aus Reagenzröhrchen. Vorzugsweise besteht das Sammelmedium aus einer Membran oder einzelnen Probenplatten. Die Sammelmedien werden durch den Transportmechanismus unmittelbar an einer Grenzfläche des Separationsmediums plaziert, in regelmäßigen Zeitabständen ausgetauscht und aus der Trennvorrichtung herausbefördert. Vorzugsweise wird eine Abrollvorrichtung, ähnlich einem Filmprojektor, benutzt, die eine Membran transportiert. Die Eigenschaften der Membran sind so gewählt, daß die aus dem Separationsmedium austretenden Fraktionen an ihr gebunden werden. Durch den regelmäßigen Transport der Sammelmembran aus der Trennvorrichtung, bzw. ein regelmäßiges Auswechseln der Probenplatten, werden die Probenfraktionen je nach Retentionszeit auf verschiedenen Teilflächen der Membran, bzw. auf verschiedenen Probenplatten, abgelegt.
Die zweite Ausführungsvariante ist gekennzeichnet durch ein Kapillaren-Array oder ein Array aus Hohlkörpern, wie z.B. Röhren oder Schläuchen. Jeweils ein Ende ist als Eintrittsöffnung nahe der Probenaustrittsfläche an der Grenzfläche des Separationsmediums positioniert. Die Austrittsöffnungen befinden sich außerhalb der Trennvorrichtung über einem Fraktionssammelgerät, vorzugsweise einem Sammelgerät für Mikrotiterplatten oder Probenplatten. Der Transport von der Eintrittsöfrhung wird bewirkt durch eine Pneumatik, die auf alle Kapillaren gemeinsam, oder auf jede Kapillare einzeln wirkt, oder durch elektrische Kräfte. Das elektrische Feld oder die Pneumatik sind so ausgelegt, daß die Probenfraktionen aus der Trennapparatur herausgeführt und dem Fraktionssammelgerät zugeführt werden.
Zur Bearbeitung und Herstellung von Probenplatten, sowie der Bearbeitung der Oberfläche von Separationskörpern ist eine Formvorrichtung vorgesehen. Das Formteil ist ein plattenförmiges Werkzeug, welches an seiner Oberfläche Erhebungen, bzw. Vertiefungen in vorzugsweise periodisch zweidimensionaler Anordnung besitzt. Das Material der Oberfläche ist vorzugsweise so gewählt, daß es einerseits Formungsprozesse, wie z.B. Polymerisation von beispielsweise Acrylamid, fördert oder zumindest nicht behindert, und andererseits gute Trenneigenschaften besitzt, d.h. daß nur geringe, oder keine Affinität gegenüber den zu formenden Materialien besteht.
Probenplatten
Probenplatten sind primär dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen dreidimensionalen Trennverfahren und der Trennvorrichtung zugeordnet. Allerdings sind ihre Eigenschaften und Verwendungsmöglichkeiten so gestaltet, daß ihre Anwendung auch weitergehend gefaßt werden kann. So sind sie generell nützliche Gebrauchsgegenstände im Bereich Klonierung, wie beschrieben.
Eine wesentliche Funktion von Probeplatten im Rahmen des erfindungsgemäß vorgeschlagenen dreidimensionalen Separationsverfahrens ist das Beladen der Trennvorrichtung. Probenplatten, die bevorzugt im Rahmen der dreidimensionalen Separation verwendet werden, sind dazu in mehrfacher Hinsicht an die beschriebene Trennvorrichtung und an die spezifischen Anwendungen anzupassen.
Eines der Hauptmerkmale von Probenplatten, die im Rahmen der dreidimensionalen Separation verwendet werden, ist, daß ihr Format und ihre Abmessungen im wesentlichen denen der Trennvorrichtung angepasst sind. Da die Trennvorrichtung vorzugsweise zylindrisch aufgebaut ist, ist ein kreisförmiges Format eines der möglichen vorteilhaften Formate. Ein solches Format ist jedoch in üblichen automatischen Laborhandhabungs- Systemen schwer zu handhaben, da diese gewöhnlich an rechteckige Formate angepaßt sind. Als Kompromiss erscheint daher ein quadratisches Format vorteilhaft. Die Abmessungen der Probenpatten sind derart gewählt, daß sie nahe einer (stirnseitigen) Grenzfläche des Separationsmediums angeordnet werden können.
Vorzugsweise wird zum Laden der Trennvorrichtung die die Einzelproben enthaltende Probenplatte nahe einer (stirnseitigen) Grenzfläche des Separationsmediums angeordnet. Die Übertragung der Einzelproben aus der Probenplatte in das Separationsmedium erfolgt durch geeignete physikalische oder chemische Parameter wie z.B. elektrische Kräfte, Druck, Zentrifugalkräfte, Gravitation, osmotische Kräfte, Diffusion oder Kapilarkräfte. Vorzugsweise sind deshalb Probenplatten zumindest teilweise aus porösem Material gefertigt. Das poröse oder permeabel ausgebildete Material ermöglicht elektrische Ströme, Flüssigkeitsströme, Gasströme, einen difrusiven Stoffaustausch etc. . Dabei ist es vorteilhaft, wenn das poröse Material so angeordnet ist, daß ein Materialtransport in oder entgegen zur Flächennormalen ermöglichst wird. Bezüglich seiner Materialeigenschaften wie z.B. der Porengröße und der Saugfähigkeit, kann das poröse Material der Probenplatten vorzugsweise so beschaffen sein, daß es ermöglicht auf ihm Proben örtlich zu fixieren bzw. einzubetten.
Die örtliche Fixierung von Proben kann auch dadurch ermöglicht werden, daß die Probenplatten feste Trennwände, z.B. in Form einer Wabenstruktur oder Vertiefungen in der Oberfläche, aufweisen. Eine örtliche Fixierung kann ebenfalls durch elektrostatische Kräfte mittels Elektroden, oder durch magnetische Fixierung an kleinen Partikeln aus magnetischem Material, ermöglicht werden. Dazu können die Elektroden bzw. Partikel an der Oberfläche der Probenplatten angeordnet sein, bzw. in diese eingelassen sein.
Vorzugsweise sind für Probenplatten auch solche Materialien gewählt, die höheren Temperaturbelastungen, insbesondere Temperaturbelastungen, wie sie beim PCR- Verfahren auftreten, standhalten. Zumindest ist es vorteilhaft, wenn zumindest die Bestandteile der Probenplatte höheren Temperaturen standlialten, welche an einer örtlichen Fixierung der Proben beteiligt sind.
Vorteilhaft bestehen Probenplatten auch aus Materialien, die das Wachstum von Zellen nicht behindern, bzw. die das Wachstum von Zellen selektiv oder auch nicht-selektiv begünstigen können. Dies ist besonders für diejenigen Typen von Probenplatten wichtig, die für das in dieser Patentapplikation beschriebene FACS-gestützte Klonierungs- Verfahren verwendet werden sollen. Nicht alle als vorteilhaft dargestellten Spezifikationen lassen sich in einer Ausführung von Probenplatten vereinen. Deshalb ist es vorteilhaft, Probenplatten für ganz spezifische Anwendungen vorzusehen. Beispiele hierfür sind Probenplatten für Zellkultur unter Verwendung von Nährmedien, z.B. Agarose, Probenplatten für das PCR- Verfahren, Probenplatten für Silica-Filtration, Probenplatten für Separationszwecke, die ein geeignetes Separationsmedium, z.B. Agarose oder Polyacrylamid enthalten, oder spezielle Probenplatten für chemische, physikalische oder photometrische Meßzwecke.
Probentransport/ Austausch
Die Entnahme oder Zuführung von Stoffen wie z.B. Proben oder Reagenzien aus oder in Probenplatten oder der Ladeschicht eines Separationskörpers kann durch geeignete Ladewerkzeuge erfolgen. Wegen der großen Anzahl der Proben (in der Größenordnung von 10.000 Einzelproben) ist ein solches Werkzeug gekennzeichnet durch eine regelmäßige Anordnung (Array) von Hohlkörpern, Tips, Pins oder Kapillaren, welche eine Vielzahl von Proben gleichzeitig aufnehmen und überfuhren können.
Auf vorteilhafte Weise ist dieses Array dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Elemente des Arrays Anschlüsse aufweisen. Diese Anschlüsse sind vorzugsweise pneumatische Anschlüsse oder elektrische Kontakte oder eine Kombination daraus. Die Elemente sind so ausgelegt, daß von ihnen bzw. mit ihrer Hilfe Stoffe aufgenommen oder abgegeben werden können.
Ein anderes Werkzeug zum Befüllen von Probenplatten besteht aus einem Translationsmechanismus für Probenplatten. Der Translationsmechanismus wird gesteuert durch einen Zellsortierer, vorzugsweise ein FACS-Gerät. Das Steuergerät (Zellsortierer, FACS-Gerät) ist durch seinen Aufbau und sein Steuerungsprogramm so ausgelegt, daß Tröpfchen oder Teile eines Flüssigkeitsstroms durch z.B eine Blende in Richtung der Probenplatte gelenkt werden. Die Ansteuerung der mechanischen Translationsvorrichtung zur Bewegung der Probenplatte in einer oder mehreren Koordinaten erfolgt ebenfalls durch das Steuergerät. Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren und die dafür vorgesehene Vorrichtung eignen sich insbesondere als Instrument zu einer simultan vorzunehmenden Auftrennung einer sehr großen Anzahl von Gemischen von Biomolekülen oder chemischen Substanzen wie z.B. DNA-Fragmente ,Proteine, Blut- oder Blutplasma in einem dreidimensionalen Separationsmedium. Es läßt sich für alle analytischen Techniken einsetzen, welche lediglich eine relativ geringe Trenngenauigkeit verlangen und in denen die genaue Identität der einzelnen Proben nicht von herausragender Bedeutung ist. Die bevorzugte Hauptanwendung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens liegt auf dem Feld der dreidimensionalen Elektrophorese. Mittels des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens lassen sich in paralleler Abarbeitung mehrere tausend Einzelproben simultan auftrennen, die eine Vielzahl kurzer DNA- Abschnitte (einige 10 bis 100 Basen) enthalten. Dadurch bietet sich der Einsatz des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens zur Gen-Expressionsanalyse gemäß der SAGE-Technik (Serial Analysis of Gene Expression) an, jedoch unter Vermeidung des bei dieser Technik erforderlichen, aufwendigen Verkettungsschrittes der einzelnen DNA- Abschnitte.
Werden längere Sequenzen der Einzelklone (150 bis 200 bp (Basenpaare)) benötigt, kann das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren sowie der dazu geeignete Trennauftau zur "Shotgun"-Sequenzierung eingesetzt werden. Ein weiteres Anwendungsgebiet des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens wäre die "DNA-fingerprint" -Technik.
Schließlich liegen ein weitere Anwendungsgebiete des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens in der Proteinanalyse sowie in der Expressionsanalyse von Biomolekülen. Dabei lassen sich Proteingemische und dergleichen, insbesondere hinsichtlich dreier Parameter auftrennen, die z.B. durch den pH- Wert, die Größe und die Hydrophobizität (bzw. Solubilität) der Biomoleküle gegeben sein können. Weitere Anwendungen sind die Auftrennung von Substanzen, anorganischen oder organischen Molekülen, DNA, RNA, Lipiden, Peptiden, Aminosäuren, die Sequenzanalyse von Nukleinsäuren, Detektion von Punktmutationen, der Einsatz des Separationsmediums 6 bei der Exprimierungsanalyse und Proteinanalyse hinsichtlich mehrerer Parameter wie z.B. pH-Wert, Größe und Hydrophobiezität (bzw. Solubilität) der Einzelproben 29, der Diagnose von Krankheiten und der Analyse metabolischer Produkte. Zeichnungen
Anhand der Zeichnungen wird das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren eingehender erläutert.
Es zeigt:
Figur 1 den prinzipiellen Aufbau einer Auftrennanordnung (Separationsapparatur) mit einem Hohlraum zur Aufnahme eines Separationsmediums mit einer
Probenanordnung,
Figur 2 den schematischen Aufbau einer zwischen zwei Elektroden angeordneten
(elektrophoretischen) Separationsapparatur mit konzentrischen Räumen zur Aufnahme einer Isolation und eines Puffermediums,
Figur 3 die schematische Wiedergabe einer Separationsapparatur mit beweglichem
Meßkopf mit Beleuchtungs- und Detektionseinrichtung in punktkonfokaler Anordnung und im wesentlichen parallel zur Hochachse (z-Achse) verlaufender optischer Achse,
Figur 4 die schematische Wiedergabe einer Separationsapparatur mit beweglichem
Meßkopf mit Beleuchtungs- und Detektionseinrichtung in orthogonal zylindrisch konfokaler Anordnung,
Figur 5 die schematische Wiedergabe einer Separationsapparatur mit seitlich angeordneter Beleuchtungseinrichtung und einem stationären Detektor mit im wesentlichen parallel zur Hochachse (z-Achse) verlaufender optischer Achse,
Figur 6 die schematische Wiedergabe einer Separationsapparatur mit seitlich angeordneter Beleuchtungseinrichtung und einem stationären Detektor mit im wesentlichen schräg zur Hochachse (z-Achse) verlaufender optischer Achse und Figur 7 die sich einstellenden Wärmeübertragungsrichtungen an einer schematisch wiedergegebenen, zwei konzentrische Räume umfassenden elektrophoretischen Separationsapparatur und das sich einstellende Temperaturprofil.
Figur 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau einer Separationsapparatur 1 mit einem Hohlraum zur Aufnahme des Separationsmediums 6 und einer Probenplatte 7.
Die in Figur 1 schematisch wiedergegebene Anordnung eines Trennauftaus 1 umfaßt einen ersten Raum 2, der als Analyseraum dient. Der erste Raum 2 ist vorzugsweise konzentrisch zur mit Bezugszeichen 15 gekennzeichneten Hochachse (z-Achse) angeordnet. Der erste Raum 2 ist durch eine Raumbegrenzung 2.1 umschlossen und von der Umgebung getrennt und so gestaltet, daß er ein Separationsmedium 6 aufnehmen kann. Im ersten Raum 2 ist ein Separationsmedium 6 aufgenommen, welches je nach Anwendung sowohl fest, flüssig als auch kolloid vorliegen kann. Das Separationsmedium 6 kann transparent oder nicht transparent sein; beim Separationsmedium 6 handelt es sich beispielsweise um Polyacrylamid, Agarose oder Hydroxylzellulose.
Der mit 2.2 bezeichnete Radius des ersten Raumes 2 liegt bevorzugt in einem Bereich zwischen 2 und 15 cm, während die Längenerstreckung des ersten Raumes 2 in Richtung der z-Achse 15 im Bereich zwischen 2cm und 30 cm liegen kann.
Im Trennauftau 1 gemäß der Darstellung in Figur 1 ist oberhalb der oberen Stirnseite der vom ersten Raum 2 mit seiner Raumbegrenzung 2.1 gebildeten Zylinderanordnung 10 eine
Probenplatte 7 angeordnet, mit welcher eine Vielzahl von Einzelproben 29 aufgebbar ist.
Die Auftragung der Einzelproben 29 erfolgt im wesentlichen zweidimensional, d.h. die
Positionen der Einzelproben 29 auf der Probenplatte 7 können im wesentlichen durch zwei
(kartesische) Koordinaten, z.B. in Richtung der x- Achse 16 bzw. der y- Achse 17, angegeben werden. Der Abstand der in der Probenplatte 7 aufgenommenen Einzelproben
29 zu den ihnen benachbarten Einzelproben liegt im Bereich von wenigen Millimetern, vorzugsweise unterhalb von 5 mm. Die in Richtung der z-Achse 15 verlaufende axiale
Erstreckung 7.1 der Probenplatte 7 ist gering gegenüber der Längserstreckung des ersten
Raumes 2, d.h. des Analyseraumes. Die radiale Erstreckung 9 der Probenplatte 7, d.h. ihre Erstreckung senkrecht zur z-Achse 15, entspricht bevorzugt dem Durchmesser 2.2 des ersten Raumes 2. Unter Einfluß einer physikalischen oder chemischen Größe wandern die Einzelproben in Richtung der Probenmigrationsrichtung 14, die im wesentlichen parallel zur z-Achse 15 (Hochachse) des Trennauftaus 1 verläuft, durch das im ersten Raum 2 aufgenommene Separationsmedium 6. Die Migration der Einzelproben 29 durch das Separationsmedium 6 läßt sich z.B, über elektrische Kräfte, Graviationskräfte, über Diffusion, Druck- oder Konzentrationsgradienten, über Osmose oder Zentrifugalkräfte herbeiführen.
Der Trennauftau 1 ist so gestaltet, daß die oben genannten physikalischen oder chemischen Größen einzeln oder in Kombination appliziert werden können.
Zur (elektrophoretischen) Separation der Einzelproben 29 mittels elektrischer Kräfte können beispielsweise den Stirnseiten des als Analysehohlraum dienenden ersten Raumes 2 ein erstes Elektrodenelement 4 sowie ein zweites Elektrodenelement 5 zugeordnet sein, welche bevorzugt plattenförmig ausgebildet sind (vgl. Figur 2).
Figur 2 zeigt schematisch den Aufbau einer zwischen zwei Elektrodenelementen 4,5 angeordneten Separationsapparatur 1 mit zwei konzentrisch zueinander aufgenommenen Räumen zur Aufnahme eines Separationsmediums 6 und einer Isolation 13, sowie einem Reservoir zur Aufnahme eines Puffermediums 31. Das Reservoir kann, z.B. wie in Figur 2 schematisch wiedergegeben ist, durch einen konzentrisch aufgenommenen, weiteren Raum 12 gebildet werden.
Die beiden konzentrisch zueinander aufgenommenen Räume 2 bzw. 3 sowie das Reservoir bilden eine Zylinderanordnung 10, die an den Stirnseiten durch die vorzugsweise plattenförmig konfigurierten Elektrodenelemente 4 bzw. 5 begrenzt wird. Die Elektrodenelemente 4 bzw. 5 überdecken die Stirnseiten des als Analysehohlraum dienenden ersten Raumes 2, und gegebenenfalls auch die Stirnseiten des zweiten Raumes 3.
Die Elektrodenelemente 4 bzw. 5 umfassen jeweils elektrisch leitende Verbindungen. Die elektrisch leitenden Verbindungen können beispielsweise ein Geflecht enthalten, welches auf denjenigen Seiten der Elektrodenelemente 4 bzw. 5 aufgenommen ist, die dem ersten Raum 2, d.h. dem das Separationsmedium 6 enthaltenden Raum, zugewandt sind. Das Geflecht kann bevorzugt aus einem korrosionsbeständigen, elektrisch leitendem Material, wie z.B. Platin, gefertigt werden. Bei Anlegen einer elektrischen Spannung an die Elektrodenelemente 4 bzw. 5 wandern die Einzelproben 29 in Probenmigrationsrichtung 14 vom Elektrodenelement 4 in Richtung auf das Elektrodenelement 5 durch das Separationsmedium 6, wobei sie entsprechend ihrer elektrophoretischen Mobilität aufgetrennt werden.
Der den ersten Raum 2 umschließende, konzentrisch zu diesem angeordnete zweite Raum 3 kann rings um die Raumbegrenzung 2.1 des ersten Raumes eine Isolation 13 aufnehmen, welche den radialen Wärmeaustausch senkrecht zur z-Achse 15 unterbindet. Dadurch stellt sich in diesem das Separationsmedium 6 enthaltenden Raum 2 ein von einer radialen (r-)Koordinate unabhängiger Temperaturverlauf mit einem Gradienten ausschließlich in Richtung der z-Achse 15 und einem nur unwesentlichen Temperaturabfall in radialer Richtung ein (vgl. Figur 7). In Folge dessen dissipiert die bei der Elektrophorese erzeugte Joule 'sehe Wärme gemäß des in Figur 2 schematisch wiedergegebenen Trennauftaus 1 ausschließlich über die Stirnseiten des ersten Raumes 2. Unter der idealisierenden Annahme eines ausschließlich durch Wärmeleitung stattfindenden Wärmetransports sowie einer homogenen elektrischen Leitfähigkeit des Separationsmediums 6 stellt sich in diesem ein ausschließlich von der z-Koordinate abhängiger Temperaturverlauf ein, der der nachfolgend wiedergegebenen quadratischen Beziehung folgt:
T (z) — Tmax - az
Die Maximaltemperatur Tmax , Bezugszeichen 61, wird im allgemeinen in einer zentralen Ebene 67 in der Mitte der Zylinderanordnung 10, das ist die bei der Koordinate z = 0 liegende, durch die x- Achse 16 und die y- Achse 17 aufgespannte Fläche, vorliegen. Der Umstand, daß im erfindungsgemäß vorgeschlagenen Trennaufbau 1 kein Temperaturgradient in radialer (r-)Richtung auftritt, ist die Voraussetzung dafür, daß sich in radialer Richtung, bezogen auf die Hochachse (z-Achse 15) des ersten Raumes 2, eine isotrope Viskosität des Separationsmediums 6, sowie eine gleichmäßige Ionenmobilität einstellt. Dadurch verlaufen die Migrationsbahnen, entlang denen die Einzelproben 29 in Probenmigrationsrichtung 14 das Separationsmedium 6 durchwandern, im wesentlichen parallel zur z-Achse 15 ohne radiale Abweichungen.
Der zweite Raum 3 kann darüber hinaus mit einem Reservoir in Verbindung stehen, welches diesen als weiteren Raum 12 in konzentrischer Anordnung umgeben kann. Zwischen dem Reservoir 12 und dem zweiten Raum 3 kann über eine geeignete Verbindung ein Austausch des Puffermediums 31 erfolgen, der die Einstellung bzw. Aufrechterhaltung der elektrischen, physikalischen und chemischen Eigenschaften des im zweiten Raum 3 enthaltenen Puffermediums 31 unterstützt. Außerdem kann das Puffermedium 31 bei der Einstellung bzw. Aufrechterhaltung der physikalischen, chemischen und elektrischen Eigenschaften im ersten Raum 2 enthaltenen Separationsmediums 6 unterstützend wirken.
Vorzugsweise kann das (im allgemeinen als flüssige Lösung vorliegende) Puffermedium 31 zur Abfuhr der im Zuge des elektrophoretischen Separationsvorganges freiwerdenden Joule'schen Wärme mittels einer im oder am Reservoir vorgesehenen Thermostatisiervorrichtung dienen.
Der Austausch des Puffermediums 31 zwischen dem zweiten Raum 3 und dem Reservoir kann durch eine Umwälzeinrichtung, z.B. eine Pumpe, unterstützt werden.
Figur 3 zeigt in schematischer Wiedergabe eine Separationsapparatur 1 mit zugeordneter (Online-)Detektionseinrichtung 45 mit beweglichem Meßkopf 46 mit im wesentlichen parallel zur z-Achse 15 verlaufender optischer Achse 43 und punktkonfokaler Anordnung von Beleuchtungs- und Detektionsvorrichtung.
Bei der in Figur 3 schematisch dargestellten Detektionseinrichtung 45 handelt es sich um eine punktkonfokale Detektionseimichtung, die die von einem im Detektionsbereich 8 gelegenen Fokuspunkt 22 ausgehende, stirnseitig aus der Zylinderanordnung 10 austretende Strahlung detektiert. Zur Abtastung der gesamten Fläche des Detektionsbereiches 8 des ersten Raumes 2 kann die Detektionseinrichtung 45 in Richtung der x-Achse 16 sowie in Richtung der y- Achse 17 verschiebbar sein.
Die dem Meßkopf 46 zugeordnete Beleuchtungsvorrichtung umfaßt eine vorzugsweise monochromatische, kohärente Strahlungsquelle 26, z.B. einen Laser, sowie eine Optik zu dessen Einkoppelung in den Meßkopf 46. Der Verlauf der von der Strahlungsquelle 26 ausgehenden Strahlung wird in Figur 3 durch den Illuminations-Strahlengang 20 angedeutet. Der hier beispielhaft dargestellte Laserstrahl 52 kann z.B. durch eine Linse 27 aufgefächert werden und trifft dann auf einen dichroitischen Strahlteiler 54, der ihn in Richtung einer Optik 18 umlenkt. Die Optik 18 ist so gestaltet, daß sie die Illuminations- Strahlung 20 mit hoher Numerischer Apertur auf dem in dem Detektionsbereich 8 gelegenen Fokuspunkt 22 bündelt und gleichzeitig einen maximalen Anteil der von den im Fokuspunkt 22 befindlichen Probenfraktionen ausgehenden Strahlung erfaßt und auf den Detektor 44 bündelt. Durch den im Strahlengang 19 eingefügten dichroitischen Strahlteiler 54 wird die von den im Fokuspunkt 22 befindlichen Probenfraktionen ausgehende Strahlung wellenlängenabhängig von der Illuminations-Strahlung 20 getrennt und dem Detektions-Strahlengang 21 folgend dem Detektor 44 zugeführt. Der Detektor 44 produziert ein der aufgenommenen Strahlung entsprechendes, i.a. elektrisches Signal, welches an eine Datenaufnahmeeinheit 30 übertragen werden kann.
Mittels der Detektionseinrichtung 45 können z.B. optische Eigenschaften, vorzugsweise die Fluoreszenz-Intensität oder -Wellenlänge oder das Absorptions- oder Transmissionsvermögen der Einzelproben 29 ermittelt werden. Die in der Probenplatte 7 enthaltenen Einzelproben 29 können zur Unterstützung der Detektion mit Markierungsstoffen, z.B. mit fluoreszenten Farbstoffen, versehen werden.
Der Vorteil der in Figur 3 schematisch wiedergegebenen Detektionseinrichtung 45 in punktkonfokaler Anordnung ist in ihrem hohen räumlichen Auflösungsvermögen, insbesondere in ihrem Auflösungsvermögen in Richtung der x- Achse 16 und der y- Achse 17, zu sehen. Ein Nachteil der punktkonfokalen Anordnung ist, daß jeweils nur von einem Fokuspunkt 22 ausgehende Strahlung zum Detektor 44 gelangt, so daß zur Abtastung (Scannen) der gesamten Detektionsebene 8 die Detektionseinrichtung 45 in Richtung zweier Koordinaten, z.B. in Richtung der x- Achse 16 sowie in Richtung der y- Achse 17, verschoben werden muß.
In der Detektionseinrichtung 45 können mehrere, im wesentlichen gleichartige konfokale Meßköpfe 46 zu einem Mehrfach-Meßkopf zusammengefasst werden. Dadurch kann von mehreren in der Detektionsebene 8 liegenden Fokuspunkten 22 ausgehende Strahlung gleichzeitig aufgenommen werden. Dies verringert die Weglänge, um die die Detektionseinrichtung 45 verschoben werden muß, damit sie beim Abtastvorgang (Scannen) die gesamte Detektionsebene 8 erfassen kann.
Im Falle der Auftrennung der Einzelproben 29 durch elektrische Kräfte (elektrophoretische Separationsapparatur, vgl. Figur 2) kann der Meßkopf 46 bzw. der Mehrfach-Meßkopf der Detektionseinrichtung 45 in eines der beiden Elektrodenelemente 4 bzw. 5 integriert sein. In diesem Fall wird das Elektrodenelement 4,5 vom Meßkopf 46 bei seiner Abtastbewegung mitgeführt. Dadurch ergibt sich, über lange Zeiten gemittelt, innerhalb des Separationsmediums 6 ein homogenes elektrisches Feld, welches nicht vom Meßkopf 46 verzerrt wird. Dies ist unter anderem Voraussetzung für eine Migration der Einzelproben 29 entlang der Probenmigrationsrichtung 14 im wesentlichen parallel zur z- Achse 15.
Figur 4 zeigt in schematischer Wiedergabe einer Separationsapparatur mit zugeordneter, oben liegender (Orüme-)DeteMonseinrichtung 45 mit einem Meßkopf 46 mit orthogonal zylindrisch konfokaler Anordnung von Beleuchtungs- und Detektionsvorrichtung.
Im Gegensatz zu der in Figur 3 wiedergegebenen Anordnung mit unten liegender Detektionseinrichtung 45 ist die dem in Figur 4 wiedergegebenen Trennaufbau 1 zugeordnete Detektionseinrichtung 45 oberhalb der Zylinderanordnung 10 vorgesehen. Die Probenplatte 7 ist am entgegengesetzten stirnseitigen Ende der Zylinderanordnung 10 vorgesehen; von der Probenplatte 7 ausgehend, wandern die Einzelproben 29 in Probenmigrationsrichtung 14 durch das Separationsmedium 6. Der Vorteil der in Figur 4 wiedergegebenen Anordnung eines Trennauftaus 1 mit oben liegender Detektionseinrichtung 45 ist darin zu erblicken, daß die bei seiner Verwendung zur elektrophoretischen Trennung am oberen Elektrodenelement 4 (vgl. Figur 2) entstehenden
Gasblasen, die ansonsten die Detektion beeinträchtigen können, sich nicht zwischen dem Detektionsbereich 8 und der Detektionseinrichtung 45 ansammeln, sondern seitlich aufsteigen können.
Bei der in Figur 4 schematisch dargestellten Detektionseinrichtung 45 handelt es sich um eine zylindrisch konfokale Anordnung, die die von einer im Detektionsbereich 8 gelegenen Fokuslinie 22 ausgehende, stirnseitig aus der Zylinderanordnung 10 austretende Strahlung detektiert. Zur Abtastung der gesamten Fläche des Detektionsbereiches 8 des ersten Raumes 2 muß die Detektionseinrichtung 45 in Richtung von nur einer Koordinate, im Beispiel von Figur 4 entlang der Verschiebungsrichtung 42 parallel zur x- Achse 16, verschiebbar sein.
Die dem Meßkopf 46 zugeordnete Beleuchtungsvorrichtung umfaßt eine vorzugsweise monochromatische, kohärente Strahlungsquelle 26, die z.B. als lineare Anordnung (Array) von Laserdioden ausgeführt sein kann, sowie eine geeignete Optik 18 zur Fokussierung der Strahlung auf die Fokuslinie 22. Die Optik 18 enthält eine Anordnung von Zylinderlinsen, Mikrolinsen, oder Gradienten-Index-Linsen oder eine Kombination obiger Elemente und ist so gestaltet, daß sie die von der Strahlungsquelle 26 ausgehende Illuminations- Strahlung mit hoher Numerischer Apertur auf die in der Detektionsebene 8 gelegene Fokuslinie 22 bündelt. Der Verlauf der von der Strahlungsquelle 26 ausgehenden Strahlung wird in Figur 4 durch den Illuminations-Strahlengang 20 angedeutet. Die optische Achse des Illuminations- Strahlenganges 20 und des Detektions-Strahlenganges 21 liegen schräg, vorzugsweise rechtwinklig (orthogonal), zueinander und kreuzen sich auf der Fokuslinie 22 im Detektionsbereich 8. Alternativ zu einer einzelnen Beleuchtungsvorrichtung, wie sie in Figur 4 schematisch dargestellt ist, können der Detektionseinrichtung 45 auch zwei oder mehr Beleuchtungsvorrichtungen zugeordnet sein. Die optischen Achsen der Illuminations-Strahlengänge 20 aller vorgesehenen Beleuchtungsvorrichtungen und der Detektions-Strahlengang 21 schneiden sich in der Fokuslinie 22.
Durch eine geeignete Optik, im Beispiel der Figur 4 ein Gradienten-Index-Linsenfeld 50, wird die von den in der Fokuslinie 22 befindlichen Probenfraktionen ausgehende Strahlung auf ein Detektorfeld 56 gebündelt. Die Eigenschaften der Optik sind so gewählt, daß die Abbildung der in der Fokuslinie 22 befindlichen Probenfraktionen auf das Detektorfeld 56 mit hoher Numerischer Apertur und hoher räumlicher Trennschärfe erfolgt. Im Detektions- Strahlengang 21 können, z.B. zur Erhöhung der spektralen Trennschärfe bei wellenlängenabhängiger Detektion, zusätzlich optische Absorptions- oder Interferenzfilter vorgesehen sein. Als Detektorfeld 56 ist eine zellenförmige Anordnung von Einzeldetektoren, z.B. Photodioden, vorgesehen. Das Detektorfeld 56 erzeugt ein der eintreffenden Strahlung entsprechendes, im allgemeinen elektrisches Signal, welches einer Datenaufnahmeeinheit 30 zugeführt werden kann.
Der Vorteil der in Figur 4 schematisch wiedergegebenen Detektionseinrichtung 45 in orthogonal zylindrisch konfokaler Ausführung ist in ihrem hohen räumlichen Auflösungsvermögen, insbesondere in ihrem Auflösungsvermögen (Tiefenschärfe) in Richtung der z-Achse 15, zu sehen. Ein weiterer Vorteil der zylindrisch konfokalen Anordnung ist, daß jeweils von einer Fokuslinie 22 ausgehende Strahlung zum Detektorfeld 56 gelangt, so daß zur Abtastung (Scannen) des gesamten Detektionsbereiches 8 die Detektionseinrichtung 45 in Richtung von nur einer Koordinate, im Beispiel von Figur 4 in Richtung der x- Achse 16, verschoben werden muß. Die Verschiebungsrichtung 42 der Detektionseinrichtung 45 liegt, wie in Figur 4 angedeutet, vorzugsweise rechtwinklig zur Fokuslinie 22.
In der Detektionseinrichtung 45 können auch mehrere, im wesentlichen gleichartige zylindrisch konfokale Meßköpfe 46 zu einem Mehrfach-Meßkopf zusammengefasst werden. Dadurch kann von mehreren im Detektionsbereich 8 liegenden Fokuslinien 22 ausgehende Strahlung gleichzeitig aufgenommen werden. Dies verringert die Weglänge, um die die Detektionseinrichtung 45 verschoben werden muß, damit sie beim Abtastvorgang (Scannen) den gesamten Detektionsbereich 8 erfassen kann.
Im Falle der Auftrennung der Einzelproben 29 durch elektrische Kräfte (elektrophoretische Separationsapparatur, vgl. Figur 2) kann analog zum punktkonfokalen Meßkopf (vgl. Figur 3) auch der zylindrisch konfokale Meßkopf bzw. der Mehrfach-Meßkopf der Detektionseinrichtung 45 in eines der beiden Elektrodenelemente 4 bzw. 5 integriert sein. In diesem Fall wird das Elektrodenelement 4,5 vom Meßkopf 46 bei seiner Abtastbewegung mitgeführt. Dadurch ergibt sich, über lange Zeiten gemittelt, innerhalb des Separationsmediums 6 ein homogenes elektrisches Feld, welches nicht vom Meßkopf 46 beeinträchtigt wird. Dies ist unter anderem Voraussetzung für eine Migration der Einzelproben 29 entlang der Probenmigrationsrichtung 14 im wesentlichen parallel zur z- Achse 15.
Figur 5 zeigt die schematische Wiedergabe einer Separationsapparatur 1 mit einer seitlich angeordneten Beleuchtungseinrichtung und einem stationären Detektor zur zweidimensionalen Bildaufhahme, dessen optische Achse 43 im wesentlichen parallel zur Hochachse (z-Achse 15) der Zylinderanordnung 10 orientiert ist.
Seitlich zur Zylinderanordnung 10, d.h. in im wesentlichen radialer (r-)Richtung zu deren Hochachse (z-Achse 15), kann eine Beleuchtungseinrichtung angeordnet sein. Von einer dieser Beleuchrungseinrichtung zugeordneten Strahlungsquelle 26 ausgehende Strahlung fällt auf eine die Strahlung auffächernde Vorrichtung, z.B. eine Linse 27, wird durch eine Linse 28 kollimiert und durchtritt die Zylinderanordnung 10 im wesentlichen senkrecht zur z-Achse 15. Durch den in Richtung der y- Achse 17 aufgefächerten Strahl wird ein Detektionsbereich 8 ausgeleuchtet, der im Beispiel der Figur 5 innerhalb des Separationsmediums 6 nahe seiner stirnseitigen, der Probenplatte 7 abgewandten Grenzfläche liegt. Alternativ zu einem durch die Linsen 27,28 gebildeten zylindrischen optischen System kann der im Beispiel der Figur 5 zur Illumination dienende Laserstrahl 52 auch mittels galvanometrischer Umlenkeinrichtungen oder rotierender Polygonspiegel aufgefächert werden.
Um die im allgemeinen auftretende optische Beugung der Illuminations-Strahlung beim Durchgang durch das Separationsmedium 6 zu unterdrücken, kann im Falle der
Auftrennung mittels elektrischer Kräfte (elektrophoretische Separationsapparatur, vgl.
Figur 2) das im zweiten Raum 3 aufgenommene Puffermedium 31 in seinen chemischen Eigenschaften, z.B. der Konzentration von in ihm gelösten Stoffen, den Eigenschaften des im ersten Raum 2 aufgenommenen Separationsmediums 6 vorteilhafterweise angeglichen werden.
Auf einer Stirnseite der Zylinderanordnung 10, vorzugsweise der der Probenplatte 7 abgewandten Stirnseite, kann eine Detektionseinrichtung 45 aufgenommen werden. Die optische Achse 43 der Detektionseinrichtung 45 liegt im wesentlichen parallel zur Hochachse (z-Achse 15) der Zylinderanordnung 10. In dieser Anordnung nimmt die Detektionseinrichtung 45 stirnseitig aus dem ersten Raum 2, d.h. dem Analysenraum austretende Strahlung auf.
Wie der schematischen Darstellung des Trennauftaus 1 gemäß Figur 5 darüber hinaus entnehmbar ist, kann an einer Stirnseite der Zylinderanordnung 10 eine Optik 18 angeordnet sein. Die Abbildungseigenschaften der Optik 18 sind so gewählt, daß eine zweidimensionale Abbildung der innerhalb des Detektionsbereiches 8 liegenden Bildebene 24 auf die in der Bildaufnahmeeinheit 23 liegende Abbildungsebene 25 mit hoher räumlicher Auflösung und hoher Numerischer Apertur erfolgt. Gemäß des in Figur 5 eingezeichneten Detektions-Strahlenganges 21 wird ein in der Bildebene 24 liegender Punkt durch die Optik 18 in die Abbildungsebene 25 an der Vorderseite der Bildaufnahmeeinheit 23 scharf abbildet.
Wenn die Bildebene 24 nur einen Teilbereich des Detektionsbereiches 8 abdeckt, so kann die Detektionseinrichtung 45 relativ zur Zylinderanordnung 10 in ein oder zwei Koordinatenrichtungen, z.B. in Richtung der x- Achse 16 und in Richtung der y- Achse 17 verschoben werden, um den gesamten Detektionsbereich 8 abzutasten (scannen).
Die Bildaufnahmeeinheit 23, z.B. eine hochauflösende CCD-Kamera, erzeugt ein der auftreffenden Strahlung entsprechendes, im allgemeinen elektrisches Signal, welches an eine Datenaufnahmeeinheit 30 übertragen werden kann.
Figur 6 zeigt die schematische Wiedergabe einer Separationsapparatur 1 mit seitlich angeordneter Beleuchtungseinrichtung und einer stationären Detektionseinrichtung 45 mit im wesentlichen schräg zur Hochachse (z-Achse 15) verlaufender optischer Achse 43.
Im Gegensatz zu der Darstellung in Figur 5 ist bei der in Figur 6 schematisch wiedergegebenen Separationsapparatur 1 die Detektionseinrichtung 45 mit zugeordneter Bildaufnahmeeinheit 23 und Optik 18 seitlich zur Zylinderanordnung 10 angeordnet, so daß ihre optische Achse 43 zur z-Achse 15 der Zylinderanordnung 10 um den Schrägstellungswinkel 41 geneigt ist. Die Detektionseinrichtung 45 nimmt bei dieser Anordnung Strahlung auf, welche aus der Zylinderanordnung 10 in wesentlichen seitlich durch ein geeignetes Fenster 40 austritt.
Analog zur Darstellung der Separationsapparatur in Figur 5 ist die Strahlungsquelle 26 mit dieser nachgeschalteten auffächernden Linse 27 und einer Sammellinse 28 nach wie vor im wesentlichen seitlich der Zylinderanordnung 10 vorgesehen. Die von der Beleuchtungseinrichtung durch im wesentlichen seitlich in die Zylinderanordnung 10 einfallende Strahlung illuminierte, ebene Detektionsbereich 8 liegt analog zur Darstellung gemäß Figur 5 im wesentlichen senkrecht zur z-Achse 15 orientiert.
Seitlich außerhalb der Raumbegrenzung 2.1 des ersten Raumes 2 ist eine Bildaufnahmeeinheit 23 mit einer ihr zugeordneten Optik 18 vorgesehen. Die Abbildungseigenschaften der Optik 18 sind so gewählt, daß eine zweidimensionale Abbildung der innerhalb des Detektionsbereiches 8 liegenden Bildebene 24 auf die in der Bildaufnahmeeinheit 23 liegende Abbildungsebene 25 mit hoher räumlicher Auflösung und hoher Numerischer Apertur erfolgt. Gemäß des in Figur 6 eingezeichneten Detektions- Strahlenganges 21 bildet die Optik 18 einen in der Bildebene 24 liegenden Punkt durch das Fenster 40 in die Abbildungsebene 25 an der Vorderseite der Bildaufnahmeeinheit 23 scharf ab.
Wenn die Bildebene 24 nur einen Teilbereich des Detektionsbereiches 8 abdeckt, so kann die Detektionseinrichtung 45 relativ zur Zylinderanordnung 10 verschoben werden, um die gesamte Detektionsebene 8 abzutasten (scannen).
Die Bildaufnahmeeinheit 23, z.B. eine hochauflösende CCD-Kamera, erzeugt ein der auftreffenden Strahlung entsprechendes, im allgemeinen elektrisches Signal, welches an eine Datenaufnahmeeinheit 30 übertragen werden kann.
Die in Figur 6 schematisch dargestellte Anordnung der Detektionseinrichtung 45 seitlich der Zylinderanordnung 10 kann vorzugsweise zur Detektion von Proben nach Abschluß des Separationsvorganges eingesetzt werden. Dazu wird der erste Raum 2, das Separationsmedium 6 und die aufgetrennten Probenfraktionen enthaltend, nach Abschluß des Separationsvorganges relativ zum Detektionsbereich 8, vorzugsweise in Probenmigrationsrichtung 14, verschoben. Synchron dazu kann die Detektionseinrichtung 45 eine Serie von zweidimensionalen Einzelbildern aufnehmen, die durch die Datenaufzeichnungseinheit 30 aufgezeichnet werden.
Figur 7 zeigt die sich einstellenden Wärmetransportrichtungen 62 an einer schematisch wiedergegebenen, zwei konzentrische Räume umfassenden elektrophoretischen Separationsapparatur (vgl. Figur 2) und das sich daraus ergebende, entlang der z-Achse 15 der Anordnung vorherrschende Temperaturprofil 60.
Der erste Raum 2 ist von einem weiteren, konzentrisch zu diesem angeordneten zweiten Raum 3 umschlossen und bildet mit diesem eine Zylinderanordnung 10. Die Begrenzung 2.1 des ersten Raums 2 ist durch die parallel zur z-Achse 15 verlaufende Linie angedeutet. Der zweite Raum 3 kann eine Isolation 13 aufnehmen, so daß kein Wärmeaustausch in radialer Richtung zwischen dem das Separationsmedium 6 aufnehmenden ersten Raum 2 und der Umgebung möglich ist. Die Räume 2 bzw. 3 werden von plattenförmig konfigurierten Elektrodenelementen 4 bzw. 5 an ihren jeweiligen Stirnseiten begrenzt. An den plattenförmig konfigurierten Elektrodenelementen 4 bzw. 5 sind elektrisch leitende Verbindungen enthalten, um eine Spannung zwischen den Elektrodenelementen 4 bzw. 5 anzulegen, welche eine Wanderung der Einzelproben 29 aus der Probenplatte 7 in Probenmigrationsrichtung 14 im wesentlichen parallel zur z-Achse 15 hervorruft. Die im Zuge des elektrophoretischen Separations Vorganges entstehende Joule'sche Wärme dissipiert idealerweise ausschließlich über die stirnseitigen Flächen des ersten Raumes 2 in die Umgebung, so daß sich aufgrund des fehlenden Temperaturgradienten in radialer Richtung eine durch die in Figur 7 eingezeichneten Doppelpfeile dargestellte Wärmetransportrichtung 62 von der zentralen Ebene 67 ausgehend auf die Elektrodenelemente 4 bzw. 5 zu einstellt. Im Inneren des ersten Raumes 2 bildet sich dadurch ein in Figur 7 wiedergegebenes Temperaturprofil 60 aus, welches durch einen lediglich in Richtung der z-Achse 15 vorherrschenden Temperaturgradienten charakterisiert ist. Der Verlauf dieses für die erfindungsgemäß vorgeschlagene elektrophoretische Separationsapparatur charakteristischen Temperaturprofils soll im folgenden kurz hergeleitet werden:
Die elektrische Leistungsdichte p innerhalb des elektrophoretischen Trennauftaus 1 (Separationsapparatur) ist durch das Skalarprodukt des elektrischen Feldvektors E und des Stromdichtevektors j gegeben:
p = E • 7 = [W/m3]. Im Falle einer idealen thermischen Isolierung in radialer Richtung und einer homogenen elektrischen Leitfähigkeit des Separationsmediums 6, stellt sich ein Wärmetransport nur in Richtung der Wärmetransportrichtung 62 im wesentlichen parallel zur z-Achse 15 des Trennaufbaus 1 ein. In diesem Falle hängt der Wärmeflußdichte q lediglich von der z- Koordinate und der elektrischen Leistungsdichte p (betrachtet im stationären Zustand) ab und wird durch das nachfolgend wiedergegebene Integral über die z-Achse 15 beschrieben:
q(z) = e .-
Figure imgf000045_0001
E(z') • j(z') dz'
q(z) = [W/m2] Wärmeflußdichte- Vektor an der Position z ez = Einheitsvektor in z-Richtung
E(z ) = [V/m] elektrischer Feldvektor an der Position z' j(z') = [A/m2] Stromdichte- Vektor an der Position z'
Daraus lässt sich die idealerweise ausschließlich von der z-Koordinate abhängige Temperatur T(z) mittels des nachfolgend wiedergegebenen Integrals bestimmen:
T(z) = Tmax - k • const.
Figure imgf000045_0002
Das parallel zur z-Achse 15 vorherrschende Temperaturprofil 60 ist durch eine Maximaltemperatur Tmax 61 in der zentralen Ebene 67 mit der Koordinate z = 0 gekennzeichnet. Von der Maximaltemperatur Tmax 61 ausgehend, stellt sich eine Temperaturabnahme zu den beiden stirnseitigen Enden der Zylinderanordnung 10 ein, d.h. in Richtung zu- bzw. abnehmender z-Koordinate auf das erste Raumende 64 an der Position +z/2 bzw. das zweite Raumende 65 an der Position -z/2 zu. Wird die elektrische Leistungsdichte p(z) über das gesamte Separationsmedium 6 als homogen angenommen, nimmt das Temperaturprofil 60 den in Figur 7 wiedergegebenen, quadratisch von der z- Koordinate abhängigen Verlauf an. Bei praktischen Anwendungen können jedoch aufgrund von sich einstellenden Ungenauigkeiten, Temperaturschwankungen oder Chargenverteilungsschwankungen Inhomogenitäten auftreten und zu einer nichtquadratischen Temperaturverteilung fuhren.
Beispiel:
Ein Trennaufbau 1 wurde unter verschiedenen Versuchsbedingungen zur Trennung von Proben mittels Elektrohorese getestet. Als Online-Detektions- und Datenaufnahmeeinheit diente der Prototyp eines ARAKIS-Sequenziergerätes. Die Beleuchtung des Detektionsbereiches 8 erfolgte senkrecht zur Probenmigrationsrichtung 14) durch einen Helium-Neon-Laser der Wellenlänge 594 nm (gelb) mit einer optischen Leistung von 3 W. Der Laser ist ebenfalls Bestandteil des ARAKIS-Sequenziergerätes.
Als Separationsmedium 6 wurde Polyacrylamid-Gel in verschiedenen Konzentrationen zwischen 10 und 20% eingesetzt. Die Separationsdistanz betrug 6 cm (z-Richtung) und der Durchmesser des das Separationsmedium 6 aufnehmenden ersten Raumes 2 betrug ebenfalls 6 cm. Bei der DNA-Sequenzierung werden unter diesen Bedingungen in einem standardisierten zweidimensionalen Gel Sequenzen mit einer Lesbarkeit von bis zu 150 bp Länge (bp = Basenpaare) erhalten.
Die elektrophoretische Leistung war auf 10 W begrenzt, wodurch sich eine Spannung von etwa 60 V zwischen den Elektroden 4, 5 einstellte. Dies entspricht bei einer Separationsdistanz von 6 cm einer elektrische Feldstärke von etwa 10 V/cm.
Die mit dem skizzierten Trennauftau 1 unter oben angegebenen Bedingungen erhaltenen Resultate zeigten, daß DNA-Fragmente in einem Zeitraum von 4 bis 6 Stunden den Detektionsbereich erreichten, ohne daß sich ein Einfluß thermischer Effekte wie zum Beispiel ungleichmäßige Banden-Migration (,,Smiling"-Effekt) bemerkbar machte.
Unter den oben genannten Bedingungen lag die Auftrennung der Banden jedoch stets unterhalb der Einzelbasen- Auflösung, selbst bei einer Erhöhung der Gel-Konzentration auf bis zu 20%. Als begrenzende Faktoren für die Trennleistung (Auflösung) wird die provisorische Art und Weise der Detektion, die starke Diffusion der Proben aufgrund ihrer langen Migrationszeit im schwachen elektrischen Feld und die nach langer Migrationszeit eintretende Erschöpfung der Pufferkapazität angesehen. Wurde die Separationsdistanz in einem modifizierten Trennauftau 1 auf 10 cm ausgedehnt, konnte dennoch Einzelbasen-Auflösung erzielt werden. DNA- Sequenzierungen, die unter diesen Bedingungen durchgeführt wurden, lieferten lesbare DNA-Sequenzen von etwa 50 bp (Basenpaare) Länge, was für Gen-Identifikation im Rahmen von Expressionsstudien ("signature sequencing") als ausreichend angesehen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich weiterhin für Simultan-DNA- und Protein- Sequenzierungen einer komplexen Anzahl von Einzelproben 29 im Rahmen von "Shotgun"-Sequenzierungen, parallelen "signature"-Sequenzierungen und für Sequenzierungen im Rahmen der Protein- und Expressionsanalyse. Die Dichte des im Trennauftau 1 verwendeten Proben- Auftrages 7 bei den durchgeführten Experimenten betrug 2 mm Abstand zwischen den Einzelproben 29. Eine höhere Packungsdichte des Probenauftrages 7 bis auf Abstände unterhalb von 1 mm ist möglich.
Bezugszeichenliste
I Trennaufbau (Separationsapparatur) 2 erster Raum (hohl)
2.1 Raumbegrenzung
2.2 Durchmesser erster Raum
3 zweiter Raum 3.1 Raumbegrenzung 3.2 Durchmesser zweiter Raum
4 erstes Elektrodenelement
5 zweites Elektrodenelement
6 Separationsmedium
7 Probenplatte 7.1 Axiale Erstreckung (der Probenplatte)
8 Detektionsbereich
9 Radialerstreckung (der Probenplatte)
10 Zylinderanordnung
I I Boden 12 weiterer Raum (Reservoir)
13 Isolation
14 Probenmigrationsrichtung
15 z-Achse
16 x-Achse 17 y- Achse
18 Optik
19 Strahlengang
20 Illuminations-Strahlengang
21 Detektions-Strahlengang 22 Fokuspunkt/Fokuslinie
23 Bildaufnahmeeinheit
24 Bildebene
25 Abbildungsebene
26 Strahlungsquelle 27 Linse (zur Strahl- Auffächerung)
28 Sammellinse
29 Einzelproben 30 Datenaufnahmeeinheit
31 Puffermedium
40 Fenster
41 Schrägstellungswinkel
42 Verschiebungsrichtung
43 Optische Achse
44 Detektor
45 Detektionseinrichtung
46 (konfokaler) Meßkopf
50 Gradienten-Index-Linsenfeld
52 Laserstrahl
54 dichroitischer Strahlteiler
56 Detektorfeld
60 Temperaturprofil
61 Maximaltemperatur Tmax
62 Wärmetransportrichtung
64 erstes Raumende (+ z/2)
65 zweites Raumende (- z/2)
67 zentrale Ebene

Claims

Patentansprüche
Verfahren zum parallelen Auftrennen einer Vielzahl von Einzelproben (29) in einem Separationsmedium (6) mit nachfolgenden Verfahrensschritten:
a) In einem ersten Raum (2), der sich wesentlich über alle drei Raumkoordinaten erstreckt, ist das Separationsmedium (6) enthalten,
b) Es wird eine Vielzahl von Einzelproben (29) nahe einer Grenzfläche des ersten Raumes (2) angeordnet,
c) Die Einzelproben (29) werden im wesentlichen derart angeordnet, daß sich ihre Schwerpunktpositionen durch zwei Koordinaten beschreiben lassen,
d) Unter Einfluß einer oder mehrerer physikalischen oder chemischer Größen erfolgt das Wandern der Einzelproben (29) durch das Separationsmedium (6) und
e) Es erfolgt eine Detektion der Probenfraktionen, und alternativ oder ergänzend ein präparatives Aufsammeln der Probenfraktionen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß während der Migration eine Detektion der Einzelproben (29) in ausgewählten Bereichen innerhalb des
Separationsmediums (6) oder nahe einer Grenzfläche des Separationsmediums (6) erfolgt.
Verfahren gemäß der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß nach Abschluß der Migration der Einzelproben (29) eine Detektion durch eine 3D-
Datenaufhahme, vorzugsweise durch ein 3D-Bildaufhahmeverfahren, erfolgt.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenfraktionen nach Durchlaufen des Separationsmediums (6) oder nach Abschluß der Separation, vorzugsweise von einer Fraktionssammelvorrichtung, aufgenommen werden.
. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Separationsmedium (6) nach Abschluß der Separation in Scheiben zerlegt wird, die dann durch ein 2D-Detektionsverfahren ausgewertet werden können, und aus denen ergänzend oder alternativ einzelne Probenfraktionen gesammelt werden können. . Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Elektrodenelemente (4, 5) derart angeordnet werden, daß bei Anlegen einer elektrischen Spannung die Einzelproben (29) im wesentlichen senkrecht zur Ebene ihrer Auftragung durch das Separationsmedium (6) migrieren. . Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß im ersten Raum (2) eine Temperaturverteilung erzeugt und aufrechterhalten wird, die im wesentlichen von einer senkrecht zur Probenmigrationsrichtung (14) verlaufenden Koordinate unabhängig ist.
8. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 6 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Raum (2) senkrecht zur Probenmigrationsrichtung (14) thermisch isoliert ist.
9. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß im ersten Raum (2) und/oder im weiteren Raum (3) an der jeweiligen Oberfläche mit dem Flächennormal senkrecht zur Probenmigrationsrichtung (14) mittels einer Temperiervorrichtung entlang der Probenmigrationsrichtung (14) ein Temperaturprofϊl (60) erzeugt und aufrechterhalten wird, welches im wesentlichen demjenigen Temperaturprofil entlang der Probenmigrationrichtung (14) im Zentrum des ersten Raums (2) entspricht.
10. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß im ersten Raum (2) und/oder im weiteren Raum (3) an deren jeweiligen Stirnflächen mit dem Flächennormal in oder gegen die Probenmigrationsrichtung (14) mittels einer Temperiervorrichtung die elektrisch umgesetzte Joule'sche Wärme abgeführt wird.
11. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Raum (2) von einem weiteren Raum (3) umschlossen ist, in welchem ein Lösungsmittel, Elektrolyt oder Puffermedium (31) enthalten ist, welches mit den Elektrodenelementen (4, 5) in Kontakt steht.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Elektrodenelementen (4, 5) durch Umwälzung ein Austausch der sie umgebenden Flüssigkeiten (31) erfolgt.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Separationsmedium (6) im ersten Raum (2) derart dimensioniert ist, daß sich ein Verhältnis seiner Radialerstreckung (9) zu seiner
Längserstreckung (15) von > 0,5, vorzugsweise > 1 einstellt.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Separationsmedium (6) Polyacrylamid, Agarose, oder Hydroxylzellulose im ersten Raum (2) enthalten ist.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Probenauftrag durch zweidimensionales Anordnen der Einzelproben (29) in oder auf einer im wesentlichen zweidimensionalen
Probenplatte erfolgt, die von außen in die Trennvorrichtung (1) eingeführt werden kann, oder die Teil des Separationsmediums (6) ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelproben (29) in oder auf der Probenplatte örtlich fixiert sind, vorzugsweise durch eine poröse
Trägerschicht, oder in bzw. auf im wesentlichen zweidimensional angeordneten punktförmigen Vertiefungen oder Erhebungen der Probenplatte.
Verfahren gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelproben (29) durch elektrische oder magnetische Kräfte in oder auf der
Probenplatte lokalisierbar sind.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelproben (29) zwischen verschiedenen Probenplatten, vorzugsweise durch Druck, Diffusion, elektrische oder magnetische Kräfte übertragen werden können. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß in oder auf den Probenplatten chemische Reaktionen, physikalische Behandlungen, Messungen oder Separationen nach einem oder mehreren Parametern durchgeführt werden.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelproben (29) an oder in Partikeln, vorzugsweise in Wirtsorganismen, z.B. Hefen, Bakterien oder sogenannten Kompetenten Zellen, vorliegen.
Verfahren zur Verteilung von Partikeln in oder auf einer Probenplatte, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung oder Verfahren eingesetzt wird, bei dem die Partikel entsprechend gemessener physikalischer oder chemischer Eigenschaften verteilt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß zur 2-dimensionalen Verteilung von Partikeln, vorzugsweise von Wirtsorganismen, z.B. Hefen, Bakterien oder sogenannten Kompetenten Zellen, eine Vorrichtung oder Verfahren eingesetzt wird, bei dem diese aufgrund gemessener Eigenschaften, vorzugsweise in oder auf einer Probenplatte, verteilt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß zur zweidimensionalen Verteilung der Partikel eine Vorrichtung oder Verfahren eingesetzt wird, bei dem die Partikel, beispielsweise durch einen Cell Sorter oder einen Fluoreszenz- Aktivierten Cell Sorter (FACS), vorzugsweise in oder auf einer
Probenplatte, verteilt werden.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtsorganismen, z.B. Hefen, Bakterien Kompetente Zellen, aufgrund in ihnen produzierter Farbstoffe (z.B. GFP = Grün Fluoreszierende
Proteine), vorzugsweise in oder auf einer Probenplatte verteilt werden.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelproben (29) aus einzelnen Molekülen oder einer Vielzahl vorzugsweise gleichartiger Moleküle, vorzugsweise in oder auf einer
Probenplatte vervielfacht werden.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelproben (29) durch Klonen und anschließende selektive Vermehrung vervielfacht werden, und zwar vorzugsweise in oder auf einer Probenplatte, in die Wirtsorganismen, wie z.B. Hefen, Bakterien oder sogenannte Kompetente Zellen, mittels der Verfahren gemäß den Ansprüchen 21 -24 verteilt wurden.
27. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelproben (29) durch PCR vervielfacht werden.
28. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 15 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelproben (29) als Fraktionen einer Vorseparation einer oder mehrerer Ursprungsprobe(n) in oder auf einer Probenplatte angeordnet werden.
29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenplatte aus einem Separationsmedium (6) besteht oder ein Separationsmedium (6) enthält, und die Anordnung der Fraktionen durch Separation einer oder mehrerer Proben in der Probenplatte erfolgt.
30. Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben ihrerseits Fraktionen einer oder mehreren vorhergehenden Separation(en) mit vorzugsweise anderen Trenneigenschaften sind, die durch präparativen Übertrag auf die Probenplatte transferiert wurden.
31. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Analyse von Proteingemischen oder zur Analyse metabolischer Produkte eingesetzt wird.
32. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion der Probenfraktionen mittels einer konfokalen
Detektionseinrichtung (45), wie einer punkt- oder zylindrisch- konfokalen Detektionseinrichtung, erfolgt.
33. Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion mit einer einen konfokalen Mehrfach-Messkopf (46) enthaltenden konfokalen
Detektionseinrichtung (45) erfolgt.
34. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 32 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion der Probenfraktionen mit einer Detelttionseinrichtung (45) mit einem Mehrfach-Messkopf (46) erfolgt, dessen Optik ein Gradienten-Index-Linsen-Feld (50), ein Mikrolinsenfeld, ein Zylinderlinsensystem oder eine Kombination dieser Elemente umfaßt.
35. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 32 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektionseinrichtung (45) in x, y; r, ω-Richtung in Bezug auf einen Detektionsbereich (8) des ersten Raumes (2) verfahrbar ist.
36. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrodenelemente (4, 5) in die Detektionseinrichtung (45) integriert sind und sich mit dieser bewegen.
37. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß zur Detektion der Probenfraktionen eine bildgebende Optik mit Bildaufhahmeverfahren verwendet wird, deren optische Achse (43) im wesentlichen parallel zur Probenmigrationsrichtung (14) der Einzelproben (29) verläuft.
38. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß zur Detektion der Probenfraktionen eine bildgebende Optik mit Bildaufhahmeverfahren verwendet wird, deren optische Achse im wesentlichen schräg zur Probenmigrationsrichtung (14) verläuft.
39. Verfahren gemäß Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß zur optischen Anregung der Probenfragmente ein oder mehrere Laserstrahl(en) (52, 53) durch eine Zylinderoptik (27, 28) fächerförmig aufgeweitet oder durch bewegte bzw. rotierende Spiegel seitlich oder schräg zur Probenmigrationsrichtung (14) so in das Separationsmedium (6) projiziert wird/werden, daß in diesem ein ebener
Detektionsbereich (8) ausgeleuchtet wird.
40. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 32 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelproben (29) mit Farbstoffen, vorzugsweise mit fluoreszierenden Farbstoffen, markiert sind. r Λ
- 54 -
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem oder mehrerer der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
a) der Trennauftau (1) einen vorzugsweise zylindrischen Hohlraum (2) umfasst, der sich wesentlich über 3 Raumkoordinaten erstreckt, b) der Hohlraum (2) so gestaltet ist, daß er mit einem Separationsmedium (6) befüllt werden kann,
c) dem Trennauftau (1) eine Vorrichtung zugeordnet ist, die es ermöglicht, dem Separationsmedium (6) an einer Stirnseite aufzutrennende Proben
(28), im wesentlichen 2-dimensional in einer Ebene angeordnet, zuzuführen,
d) der Trennauftau (1) so gestaltet ist, daß auf die Proben mindestens eine oder mehrere der folgenden physikalischen oder chemischen Größen wirken kann: ein elektrisches Feld, ein Druckgradient, eine osmotische Kraft, Gravitation, Zentrifugalkraft und
e) dem Trennauftau (1) eine Vorrichtung zur Detektion der Probenfraktiönen, bzw. eine Vorrichtung zum präparativem
Aufsammeln der Probenfraktionen, zugeordnet ist
Vomchtung gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß dem Trennaufbau (1) eine Online-Detektionseinrichtung zugeordnet ist, die emittierte Strahlung nur aus einem im wesentlichen ebenen Detektionsbereich (8), vorzugsweise nahe einer
Grenzschicht des Separationsmediums (6) aufnimmt, durch die die Probenfraktionen hindurch migrieren.
Vorrichtung gemäß Anspruch 41 oder 42, dadurch gekennzeichnet, daß dem Trennauftau (1) eine dreidimensionalePhotodetektionseinrichtung zugeordnet ist, die Probenfraktionen im gesamten Separationskörper oder einem Teilvolumen davon delektieren kann in der Weise, daß jedem Volumenelement des Separationskörpers eine Intensität und ein dreidimensionaler Ortsvektor zugeordnet wird. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 41 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß dem Trennauftau (1) eine Fraktionssammelvorrichtung zugeordnet ist, welche enthält:
a) einen Transportmechanismus für Platten oder Schichten, z.B. Membranen, die durch den Transportmechanismus periodisch an einer Grenzfläche des Separationskörpers gewechselt werden, so daß die dort austretenden Probenfraktionen je nach Retentionszeit auf verschiedenen Platten, oder Teilflächen einer Schicht oder Membran, gebunden werden oder b) einem Kapillaren- Array mit Einfrittsöffhungenen nahe einer Grenzfläche des Separationsmediums (6) und Austrittsöffhungen über einer Fraktionssammelvorrichtung, vorzugsweise einer
FraMonssarnmelvorrichtung für Mikrotiterplatten, so daß die Probenfraktionen beim Austritt aus dem Separationskörper durch das Kapillaren- Array aus dem Trennauftau (1) vorzugsweise durch Anschluß einer Pneumatik oder durch elektrische Felder herausgeführt werden können.
Vorrichtung gemäß einem . oder mehrerer der Ansprüche 41 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß der Trennauftau (1) so gestaltet ist daß
a) sich an zwei Seiten (Stirnseiten) des Hohlraums (2) Elektroden (4, 5) befinden,
b) die Räume zwischen Elektroden (4, 5) und Separationsmedium (6) mit einer
Flüssigkeit, vorzugsweise mit einem Puffermedium (31) aufgefüllt werden können
c) an den Stirnflächen eine Wärmeabfuhr gewährleistet ist, durch eine Temperiervorrichtung mit Puffermedium (31) als Wärmetransportmedium, welches vom Zentrum (67) in Radialrichtung (9, 16) zur Peripherie oder in entgegengesetzter Richtung bewegt wird.
Vorrichtung gemäß Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß der Hohlraum (2) in radialer Richtung thermisch isoliert ist.
47. Vorrichtung gemäß Anspruch 45 oder 46, dadurch gekennzeichnet, daß entlang der Hochachse (15) eine Profiltemperiervorrichtung vorgesehen ist.
48. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 45 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß eine Umwälzeinrichtung, z.B. eine Pumpe, zur Zirkulation des
Puffermediums (31) vorgesehen ist.
49. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 45 bis 48, dadurch gekennzeichnet, daß das Radius-/Längenverhältnis (9, 15) des ersten Raumes (2) r/Z größer 0,5, bevorzugt größer 1 ist.
50. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 41 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß, vorzugsweise an einer der Stirnflächen des Separationsmediums (6), ein Gas- oder Flüssigkeitsdruck aufgebaut werden kann.
51. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 41 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß der Trennauftau 81) so gestaltet ist, daß er Zentrifugalbeschleunigungen ausgesetzt werden kann.
52. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 41 bis 51, dadurch gekennzeichnet, daß dem Trennauftau (1) ein Meßkopf, vorzugsweise ein Mehrfach-Meßkopf (46), zugeordnet ist, bei dem die objektseitigen Fokuspunkte von Beleuchtungs- und Detektions-Strahlengängen (punkt-)konfokal aufeinanderliegen.
53. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 41 bis 51, dadurch gekennzeichnet, daß dem Trennauftau ein Meßkopf, vorzugsweise ein Mehrfach- Meßkopf, zugeordnet ist, bei dem die objektseitigen Fokuslinien von Beleuchtungsund Detektions-Strahlengängen (zylindrisch)-konfokal aufeinanderliegen.
54. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 52 oder 53, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektionseinrichtung (45) in eine der Elektroden (4, 5) integriert ist und mit dieser eine ein- oder mehrdimensionale Scanbewegung relativ zum Separationsmedium (6) durchfuhrt.
55. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 41 bis 51, dadurch gekennzeichnet, daß eine Photodetektionseinrichtung (45) vorgesehen ist, welche a) über eine Beleuchtungseinrichtung verfügt, die einen im wesentlichen zweidimensionalen, ebenen Detektionsbereich (8) im Separationsmedium (6) oder nahe einer Grenzfläche des Separationsmediums (6) beleuchtet, vorzugsweise durch eine kohärente Lichtquelle (26), wie z.B. einen Laser, welcher zu diesem Zweck durch eine entsprechende Optik oder durch eine Scanbewegung eines Reflektors aufgefächert wird und
b) über ein optisches System verfügt, welches den Detektionsbereich (8) bildhaft (zweidimensional) auf einen Bilddetektor (23, 24) abbildet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Achse (43) der Detektionseinrichtung (45) im wesentlichen in oder gegen die Probenmigrationsrichtung (14) verläuft, und die optische Achse (43) der Beleuchtungseinrichtung im wesentlichen senkrecht zur Probenmigratioiisrichtung
(14) verläuft.
Vorrichtung gemäß Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Achse (43) der Detektionseinrichtung (45) schräg zur Probenmigrationsrichtung (14) verläuft, und die optische Achse der Beleuchtungseinrichtung (26) im wesentlichen senkrecht zur Probenmigrationsrichtung (14) verläuft, oder daß die optische Achse der Beleuchtxmgseinrichtung (26) ebenfalls schräg zur Probenmigrationsrichtung (14), beispielsweise senkrecht zur optischen Achse der Detektionseinrichtung (45), verläuft.
Vorrichtung gemäß Anspruch 56 oder 57, dadurch gekennzeichnet, daß an die Detektionseinrichtung (45) ein Datenaufzeichnungsgerät (30) angeschlossen ist, welches Daten während des Separationsvorganges (im Sinne einer Online- Detektion) aufzeichnet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 55 zur Aufnahme einer dreidimensionalen Abbildung gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß
a) die optische Achse (43) der Detektionseinrichtung (45) schräg zur optischen Achse der Beleuchtungseinrichtung (26), vorzugsweise senkrecht zur optischen
Achse (43) der Beleuchtungseinrichtung (26), verläuft b) die Bildaufhahmevorrichtung (23) über einen Translationsmechanismus verfugt, der eine relative Translationsbewegung, vorzugsweise bezüglich des Separationsmediums (6), durchführen kann
c) die Bildaufnahmevorrichtung (23) über ein Datenaufzeichnungsgerät verfugt, welches während der Translationsbewegung Daten aufzeichnet.
Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 41 bis 59, dadurch gekennzeichnet, daß dem Trennauftau (6) ein Formteil zur Herstellung zweidimensional angeordneter Vertiefungen in einer der Grenzflächen des
Separationsmediums (6) oder in einer separaten Schicht (Probenplatte) zugeordnet ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß die separate Schicht (Probenplatte)
a) sich wesentlich über zwei Dimensionen erstrecken, und b) vorzugsweise ganz oder teilweise aus porösem oder permeablem Material aufgebaut sind, und Poren enthalten kann, c) so gestaltet sind, daß Proben in ihnen örtlich fixiert werden können, d) so gestaltet sind, daß ein Probentransport in Richtung der Flächennormalen, oder entgegen der Flächennormalen, oder vorzugsweise in beide Richtungen möglich ist e) temperaturresistent sind f) für mindestens eine Zellkultur geeignet sind g) ein zur Separation von Probengemischen geeignetes Medium enthalten und h) transparent sind.
Vorrichtung gemäß Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, daß auf ihrer Oberfläche Vertiefungen 2-dimensional angeordnet sind.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 61 oder 62, dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen oder auf ihrer Oberfläche Elektroden oder magnetische, oder magnetisierbare Partikel zweidimensional angeordnet sind.
64. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 6 Ibis 63, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenplatten zur Separation von Probengemischen geeignetes Medium, z.B. Agarose oder Polyacrylamid enthalten.
65. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 61 bis 64, dadurch gekennzeichnet, daß sie einer Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 41 bis 52 zugeordnet sind.
66. Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 61 bis 65, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei einem Verfahren gemäß einem oder mehrerer der
Ansprüche 1 bis 40 eingesetzt werden.
67. Vorrichtung zum Befüllen von Probenplatten zum Einsatz in einem Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 40, dadurch gekennzeichnet,
a) daß die Partikel gesteuert durch ein Sortiergerät, z.B ein FACS-Gerät, oder einen Zellsortierer ausgewählt werden, z.B. durch Auslenken in Richtung einer Lochblende und
b) daß die Positionierung der ausgewählten Partikel auf der Probenplatte durch eine Translationsvorrichtung erfolgt, deren Translationsbewegung durch das Sortiergerät gesteuert wird.
68. Vorrichtung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 41 bis 67, dadurch gekennzeichnet, daß dem Trennauftau (1) oder den Probenplatten eine regelmäßige
Anordnung (Array) aus Hohlkörpern, Tips, oder Kapillaren zugeordnet ist, die zur Zuführung oder Entnahme von Proben geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, daß, z.B. durch einen Anschluß an eine Pneumatik, Volumina verschoben werden können, oder daß, vermittelt durch einen elektrischen Kontakt, elektrische Feldkräfte wirken können.
69. Verwendung des Verfahrens gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 1 - 40, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Auftrennung und Analyse von biologischem Material eingesetzt wird.
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