JPH07503068A - 密度グラジエント造画システムを使用した非移動式の毛管等電フォーカス処理を実施して普遍的に検出する方法及び装置 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 密度グラジェント造画システムを使用した非移動式の毛管等電フォーカス処理を 実施して普遍的に検出する方法及び装置発明の背景 分野二本発明は毛管電気泳動と、毛管電気泳動検出法と、そのような方法に基づ いた装置の分野に関し、さらにはシュリーレン光学に関するものである。

技術の現状：気体、液体、あるいは臨界超過流体（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ）のごとき流体での密度グラジェント（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｇｒａｄ ｉｅｎｔ）によって製造されるもののごとき屈折率グラジエン］・は、そのグラ ジェントを通過する光の屈曲を引き起こすことは知られている。屈折率グラジェ ント界によって引き起こされる光の屈曲を観測して計測する光学的方法は一般に シュリーレン光学と呼ばれている。従来、光の屈曲から生じるシュリーレン像は 写真板に記録され、デンシトメーターを使用して写真板の光度配分が分析された 。

近年、写真画像の評価はコンピュータによってなされている。これらの方法は、 非常に複雑な円環状及び放射状の形状が発生している場合のプラズマ研究に役立 つものである。

アメリカ合衆国特許第４，５４７，０７１号はシュリーレン光学を使用して不均 質な流体サンプルにおける光度グラジェントを計測するセンサーを開示している 。そのようなセンサーにおいては、レーザー光ビームはサンプルチャンバーを通 過するようにガイドされ、チャンバーに沿って移動させられる。チャンバーの反 対側に位置するグラジェント光ポジションセンサーは、レーザー光ビームがサン プルを通過中にレーザー光ビームの屈折を検出する。屈折量はサンプル内の全ポ イントにおける光度グラジェントを示す。レーザービームをサンプルチャンバー に沿って移動させるのではなく、ビームを一定に保持し、サンプルを含んだサン プルチャンバーを移動させることが可能である。しかし、サンプルチャンバーと の関係でレーザーと検出器とを一緒に移動させ、レーザービームをサンプルチャ ンバーにフォーカスしたままにすることは、たとえ比較的大きなチャンバーであ ろうと、サンプルチャンバーをレーザービーム中に移動させ、レーザービームを 適正にフォーカスさせておくことと同様に困難である。小型毛管サンプルチャン バーで実施することも非常に困難であり、非実用的である。

本発明者のアメリカ合衆国特許第４，７８４，４９４号、第４，９４０，３３３ 号、及び第４，９９３，８３２号は、非常に小型のサンプルにおける密度及び熱 グラジェントを検出するために利用することが可能な検出器を紹介している。

これら検出器は光源を利用し、検出対象のグラジェントを有したサンプルを通過 する１あるいは２のプローブ光ビームを発生させ、プローブビームはビームポジ ション検出器で計測される。プローブビームを発生させるには多様な光源が使用 可能であり、例えば、レーザーあるいは光発生ダイオード（ＬＥＤ）がある。し かし、これらの検出器は一般的に検出対象のグラジェントが光のプローブビーム を通過するところで使用されるようにデザインされている。

サンプルのある特定の成分はある特定の周波数の光を吸収するであろうし、その ような成分の密度は、ある条件下で、サンプルを通過する光ビームのうちサンプ ルによって吸収される光量を計測することで測定することが可能である。そのよ うな吸収検出はまた一般的にサンプルを検出器の光ビームに通過させて行われる 。

毛管電気泳動は生物分析化学における重要な分離手段になった。ｐＬ−ｎＬ量程 度の非常に少量の生物学的サンプルの分離及び検出は毛管電気泳動で達成可能で ある。これは一般的に分離の通常手段では不可能であり、高速液体クロマトグラ フィーでさえも達成されない。異なる種類のサンプルに使用するいくつかの毛管 電気泳動分離方法が存在する。それらは毛管ゾーン電気泳動、移動境界毛管電気 泳動（ｍｏｖｉｎｇ　ｂｏｕｎｄａｒｙ　ｃａｐｉｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒ。

ｐｈｏｒｅｓｉｓ）、毛管等速泳動（ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　、 及び毛管等電フォーカス手法（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ）を 含む。毛管ゾーン電気泳動、移動境界毛管電気泳動、及び毛管等速泳動は全て、 本発明者の前記合衆国特許で紹介された検出器の使用が可能であり、分離中に毛 管サンプル分離チャンバーをサンプルが通過するという利点を備えている。毛管 ゾーン電気泳動と移動境界毛管電気泳動はダイナミックプロセスであり、分離は ある瞬間に生じ、ゾーンは直ちに拡散して消散する。拡散はサンプルがサンプル チャンバーを通過して検出器に移動するときに発生する。これによって多様なゾ ーンの検出はさらに困難になり、望むほどの精度を達成できない。等速泳動は、 サンプルが毛管を通過する際にゾーンが比較的シャープなままであるという利点 を有しているが、等速泳動は扱うのが困難なプロセスである。

等電フォーカスはサンプル成分の等電点の相違に基づいてサンプル成分の分離を 行うのに使用されてきた。近年になって、毛管電子泳動技術の開発は毛管内で等 電フォーカス処理の実施に関心を集めてきた。理由は、１０−１００μｍ径の毛 管からのジュール熱の効率的な放散が、大きなサンプルチャンバー内で発生する 対流の影響を排除し、非常に効率の良い分離を可能にするからである。微小孔、 すなわち非常に小さな内径の毛管はまた少量のサンプルを必要とするだけであり 、このことはモノクロナール抗体及び他のタンパク質のような生体成分の分析に 適している。毛管等電フォーカスプロセスは毛管の端部間に電界を確立し、両生 体（ａｍｏｐｈｏ　１ｙｔｅ）の混合物を使用して毛管内に安定なｐＨグラジェ ントを確立する。同時に、タンパク質のごとき両性アナライト（ａｎａｌｙｔｅ ）はこのｐＨグラジェントに沿って移動し、ｐＨがその等電点と等しいポイント にフォーカスされる。その後に泳動は停止する。このように安定状態が達成され 、毛管内に維持される。この分離プロセス中に、高いピーク密度を有した狭いガ ウスのバンドが発生し、アナライト分離の高解析度をもたらす。検出器にてフォ ーカスしているアナライトを検出するために、フォーカスされたゾーンは通常は 毛管の１端部に位置している固定検出器を通過して移動されねばならない。毛管 内のサンプルのフォーカス処理に続いてモービリゼーションプロセスが実行され る。

通常に使用されるモービリゼーションプロセスは毛管の１端部にて電解質に塩の 添加を必要とする。この塩は毛管の関係端部のｐＨを変化させる。このｐＨのシ フトによって毛管内にフォーカスされたアナライトはそれらの等電点を外れ、結 果として毛管の端部に向かって移動あるいは泳動し、検出器を通過するであろう 。

モービリモーションプロセス中に、フォーカスしたゾーンのひずみと解析度の損 失は避けられない。さらに、モービリゼーションプロセスはまた、通常に使用さ れる等電フォーカスシステムを使用したフォーカス処理自体に必要な約５分間に 対して少なくとも約１５分間を要する。検出は必要とされるため、必要なモービ リゼーションは、等電フォーカス法を、他の毛管電気泳動技術と比較して利点が 少ないと考えられる相対的にスローな分離法にしている。従って、モービリゼー ションステップを排除するためにオンライン検出法を開発し、等電フォーカス分 離技術を使用して検出のスピードと能力を高めることが必要である。

スラブ（ｓｌａｂ）に対して実施される電気泳動のためにいくつかのオンライン スキャニング分光ラジオメータ検出法が開発されている。しかし、そのような方 法は、サイズが小さいために微小孔を有した毛管内で実態される電気泳動ではう まく使用することができない。近年、連続的に毛管等電フォーカス分離をモニタ ーするための試みがなされている。例えば、０．４−０．６ｍｍの内径の毛管内 で青色に染められたタンパク質のフォーカス処理が写真に撮られており、その写 真がタンパク質のゾーンを研究するのに使用された。しかし、この技術はタンパ ク質の染色を要し、良好な量的情報を提供することができない。側倒では、毛管 内での分離はサンプルチャンバーの縦方向に沿って離れて配置された化学物質電 極を使用してモニターされた。複雑な１００個の化学電極アレイが使用されたに もかかわらず、この実験で得られた解析度は非常に低いものであった。

現在利用できる毛管電気泳動装置では、毛管チューブは一般的に約１ｍの長さで あり、各端部は分離される溶質すなわちサンプルを保持している容器内に手を使 用して配置されなければならない。毛管チューブが長ければ長いほど、サンプル がチューブ内を移動するのに必要な時間が長くなる。新サンプルが分離されると きには、毛管チューブの１＃４部は新サンプルを含む別容器に移動されねばなら ない。また、毛管の端部は容器間を移動されるので、システムの操作に必要な電 極もまた移動されなければならない。約１０ＫＶまでの電圧がシステムの操作に 必要とされるので、毛管チューブと電極を容器間で移動する者は電極との接触の 危険性に頻煩にさらされる。

毛管電気泳動の最も成功の可能性が高い適用は、研究所、医薬品製造施設、及び 病院における日常的な分析のためのものである。しかし、多くの場合は、サンプ ルの比較的素早い分離と正確な検出が要求される。理由は、分析データのフィ− ・ドパツクが治療の効果を観察し、病院の患者の治療における投薬量を調整し、 あるいは製造の条件を制御するのに不可欠だからである。毛管電気泳動の異なる 方法は異なるタイプのサンプルや状況に適用されるので、同じ器具で異なる方法 を実施できることは便利であろう。現在の商業的に流通している毛管電気泳動器 具をいくつかの分離法に適用できるように変更することは不可能である。各器具 及び毛管カートリッジは特定タイプの分離、例えば、毛管等速泳動用、あるいは 移動境界毛管電気泳動用としてデザインされている。さらなる問題は現在商業的 に入手できる毛管電気泳動器具は、精度が高くて汎用であり、しかも安価である 検出器を欠いている。通常の吸収分光測光器は汎用ではあるが、細い毛管を使用 した毛管電気泳動には充分精度が高いとは言えず、高価なモノクロメータが必要 となる。使用する蛍光計はほとんどの分析で高価なレーザーと光電子倍増管ばか りでなく、蛍光デリバタイゼーション（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）を必要 とする。そのような検出器を要する通常の毛管電気泳動器具は普通は高価であり 、サイズも大きい。

また、時にはサンプル成分を分離したり、特定することが望ましく、あるいは、 電気泳動技術では分離が内器な成分に対しては、そのような成分がサンプル内に 存在するか否かを決定することが望ましい。従って、これらの成分を検出するに は他のさらに複雑な検出器並びに検出法が必要である。

発明の概要 本発明によれば、密度グラジェント検出は、毛管等電フォーカス処理技術によっ て分離される多様なバンドの成分を検出するための検出手段並びに検出法として 使用することに適していることが発見された。等電フォーカス技法は全長が約１ ０ｃｍの毛管チューブのごとき比較的短い毛管チューブにて効果的に達成され、 実際の分離はそのようなチューブのさらに短い部分で行われることも発見されて いる。さらに、光ビームは、分離されたサンプルを含む部分を通過して毛管通路 に沿って延びるように、毛管チューブ及び分離されたサンプル内の毛管通路にフ ォーカスが可能である光シートあるいは光線として発生可能であり、すなわち、 非常に小さな高さで所定の幅のビームとして発生可能であることも発見されてい る。光ビーム内の光は光ビームの幅方向に沿ってサンプル内で密度グラジェント により屈折され、光ビームの幅方向に沿って光ビームの光度の変化を創出し、等 電フォーカス処理によって毛管通路内で確立される密度グラジェントを表す。毛 管チューブと、内部のサンプルを通過した後の光ビームをモニターすることで、 サンプルの分離は容易に、素早く行われる。

ビームの部分の屈曲により直接的に密度グラジェントを検出するために光ビーム を使用する代わりに、ビーム内の光の波長を選択し、分離されたサンプル内の特 定成分によって吸収させることも可能である。この場合には、光ビーム内の光は 光ビームの幅方向に沿ってサンプル内の特定成分によって吸収され、等電フォー カス処理によって濃縮された、すなわち分離された毛管通路内の特定サンプル成 分の密度を表すところの、幅方向に沿った光ビームの光度の変化を創出する。

また、毛管チュブと内部のサンプルを通過した後の光ビームをモニターすること で、サンプルの分離は容易で、素早く行われる。密度及び密度グラジェントは相 関関係があり、密度グラジェントは密度の第２プリバチイブ（ｓｅｃｏｎｄ　ｄ ｅｒｉｖａｔ　１ｖｅ）である。従って、密度の計測値は密度グラジェントを示 すものであり、その逆も言える。

本発明の好適実施例においては、サンプルを通過した後の光ビームの光度は、分 離が生じると思われる毛管部分に沿って延びる光ダイオードの形態にて光検出器 によってモニターされる。光ダイオードアレイはサンプル内の密度グラジェント を通過する光の屈折によって生じる光度の相違を解析して検出可能なほどに充分 に小さなサイズの別々のセンサー要素によって構成されている。そのような構成 によって、光源、検出器、及びサンプルチャンバー、すなわち、毛管通路は全て 相関的にアレンジされ、高精度の光ビームフォーカス処理と検出を維持するが、 計測は毛管内の固定サンプル分離手法で実施可能である。計測値を得るために光 ビームを通過させてサンプルを移動させる必要はない。対象の全サンプルはサン プルを通過する光ビームによってその性質が把握される。さらに、密度グラジェ ントが直接的に計測される本好適実施例においては、光ビームは筒状レンズを有 した安価なＨｅ−Ｎｅレーザーによって発生され、ビームはレーザーから光シー トに変換され、光シートを毛管通路にフォーカスさせる。しかし、光シートを創 出する様々な他の手段も使用することが可能である。

本発明の別実施例によれば、サンプルを通過した後の光ビームの光度は検出対象 の光ビームの幅方向と比較して狭いセンサー部を有した単一光ダイオードの形態 で光検出器によってモニターされ、検出器は常にビームの小さな部分のみを検知 する。光ダイオードは予期される分離が生じるサンプルチャンバーに沿って移動 するように搭載される。ビームを通過してサンプルチャンバーに沿って光ダイオ ードを移動させることで、ダイオードは通過する特定の位置での光度を計測し、 光ダイオードが通過する各ポイントでビームの光度に応じた出力を提供する。光 ビームは検出器と共に移動しない。すなわち、サンプルチャンバーと光ビームは 相関関係を有してアレンジされた状態であり、光ビームとサンプルチャンバーと のアラインメントを維持する問題は存在しない。

単純で使用が容易な毛管電気泳動装置は相互に接続され、顕微鏡スライドのごと きガラス板で共に保持された第１タンク（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）と第２タンクと で構築可能である。スライドに固定された毛管は両タンク間に延びており、毛管 チューブを通る毛管通路は両タンク間を延びて、それらを接続している。電極は 両タンク内に挿入され、タンクはスポイト（ｓｙｒｉｎｇｅ）から延びているチ ューブを容易に受け入れるように形状化されており、液体を容易にタンクに注入 したり、タンクから引き出したりさせる。このように、溶質すなわちサンプルを スポイトでタンクから抜き出して新溶質すなわちサンプルを注入し、又はタンク 内で混合してタンク内で容易に中身を変更することができる。そのような装置に おいて、毛管通路は通常は約１０ｃｍの長さであり、毛管径は１０か６１００ミ クロンの範囲である。タンクは小毛管を有しており、少量のサンプル量が必要と なるだけである。しかし、タンクの容積は毛管の容積よりも大きく、毛管を満た すために充分なサンプルを保存する。このようなアレンジにて、電気泳動のいか なる方法にでも利用が【ＩＴ能である。容具なる電気泳動の方法に対して異なる 装置を使用する必要はない。

本発明の１方法は等電フォーカス技術を使用して、電気泳動では通常不可能な多 様なサンプル成分の電気泳動分離を可能にしている。この方法は分離の能力を有 し、検出対象成分に対する高度な特異性を有した試薬の選択に関与している。

この試薬はサンプルに加えられ、好適にはその量はサンプル内に存在可能な検出 対象の全サンプル成分と相互作用するのに充分な量である。試薬はそれ自体の等 電点を有しており、試薬と成分との生産物は異なる等を点を有している。従って 、等電フォーカス処理でサンプル内の試薬とサンプル内の試薬と成分の生産物は 各々分離して、本発明の検出器によって検出可能なサンプル内の異なるバンドを 形成する。

好適実施例の詳細な説明 溶質内の屈折率グラジェントを通過する光は屈折することは周知である。このグ ラジェントを通過する際の光屈折の物理的理由は屈折率と光拡散速度との関係に 存在する。光の異なる部分は時間とともに異なる程度に前進し、相シフトを発生 させる。従って、図１に示すように所定時間ｔ＋ｄｔ中に屈折率ｎ＋ｄｎの溶質 を通過する矢印１０で示される光ビームのトップの光は距Ｉ！ＩＤ１だけ進む。

屈折率ｎの溶質を通過する矢印１１で示される光ビームのボトムの光は距離Ｄ２ だけ進む。この結果、光波面の傾斜が生じ、光は波面に対して垂直に進むので光 ビームは図示のごとくに傾斜する。図１において、Ｄ２はＤｌよりも大きく、従 って上方傾斜が起こるが、ｎとｎ＋ｄｎの値によっては傾斜は下方向きとなるこ ともある。

屈折率グラジェントを通過する光路は、媒体を通過する光は移動する時間が最少 となるコースを通過するというフェルマーの法則を使用して計算可能である。

屈折角θと、光拡散率ｄ　ｎ　／　ｄ　ｘに垂直な屈折率グラジェント、及びグ ラジェントを通過する通路長りの関係は以下のように表される。

ｔａｎθ＝ｓｉｎｈ　（Ｄ／ｎ）（ｄｎ／ｄｘ）＝（Ｄ／ｎ）（ｄｎ／ｄｘ）＋ 　（ｄｎ／ｄｘ）’　（Ｄ’／ｎ３３　り＋　（ｄｎ／ｄｘ）　５（Ｄ’／ｎ６ り＋、、、、。

式中ｎは媒体の屈折率である。本発明のセンサーが使用される状況では、Ｄとθ は小さい。よって近似式は以下のごとくになる。

θ＝　（Ｄ／ｎ）（ｄｎ／ｄｘ） 図２はこの方法の背景にある検出の原理を図示したものである。サンプルチャン バー距ＨＤのサンプルチャンバー壁１２と１３間に略式に示されているサンプル チャンバー内の溶質の非均−な配分状態で、密度グラジェントは確立される。

このグラジェントは対応する屈折率グラジェントｄｎ／ｄｘ＝　（ｄｎ／ｄｃ） （ｄｃ／ｄｘ）を形成し、拡散光ビームを角度θ＝　（Ｄ／ｎ）（ｄｎ／ｄａ） （ｄｃ／ｄｘ）の分だけ傾斜あるいは屈折させる。この屈折はポジション検出器 １４にて光ビームのポジションを計測することで計測可能である。密度グラジェ ントの語測中に創出される情報は溶質−一屈折率ｎの不変の特性に関連する。従 って、溶剤とは異なるｎを有した溶質によって創出される密度グラジェントは光 ビーム内の屈折あるいは＃ｉ斜に注目することで検出されるであろう。

図３は図２のものと同一の原理を示すが、いくらか異なって図示されている。

従って、もし線１６によって示される密度グラジェントが壁１２と１３によって 定義されるサンプルチャンバー内のサンプル内に存在するなら、サンプルを通過 するように導かれるプローブ光ビーム１７は角度θで上記のように屈折するであ ろう。これによってビームのポジションは上記のようにポジションセンサー１４ の表面上を移動する。

図４は図２に類似したものであるが、光ビームの幅方向内に密度グラジェント１ ８を有した幅広光ビームを示す。よって、図１、図２及び図３にて示すように均 一に屈折する光ビームではなく、グラジェントを通過しないグラジェント１８の １側部の光ビーム１９の一部はサンプルを直線的に通過して検出器１４に到達す る。光ビームの一部２０はグラジェント１８を通過し、破線矢印によって示され るように角度θだけ屈折し、部分１９を部分的にオーバーラツプして検出器１４ に到達する。オーバーラツプが検出器に生じる２２で示した所では、検出器１４ に到達する先は非オーバーラツプ部分よりも明るい。グラジェント１８の他方の 側部の光ビームの一部２１はサンプルを直線的に通過し、検出器１４に到達する 。図４にて示されるように、光がほとんど、あるいは全く射さない部位２３が存 在するであろう。従って、１あるいはそれ以上のグラジェントを有するサンプル を通過した後の単一光ビームはサンプル内に存在するグラジェントを示す多様な 光度を有するであろう。サンプル内のグラジェントは一般的に明るいスポットを もたらし、はとんど光度のないスポットが続き、もし光度を計測するだけならば 、サンプルを直線的に通過する光を表すレベルで、増加あるいは正の信号（増加 した光度）であり、減少した、あるいは負の信号（減少した光度）が続き、さら に、サンプルを直線的に通過した光を表すレベルが続く。

もし、検出器１４が検出器アレイのように多数の小さな検出器に分解され、各検 出器がビームの小部分からの光を検出するならば、個々の検出器の比較あるいは スキャンは長さ方向に沿ってアレイに照射される光ビームの光度を表す出力信号 を創出するであろう。あるいは、光ビームの一部のみを検出する単一の小検出器 を配置し、その幅方向に沿ってビームを通過させて移動させ、移動しながら光度 を測定させることも可能である。

図５は図４と同じ原理を示しているが、それを本発明のシステムにさらに直接的 に関連付けている。よって、光ビームは多数の平行光線２５として考えられる。

サンプルチャンバー内のサンプル内で現出するであろう類似したガウス密度グラ ジェントによって創出されるガウスの屈折率グラジェントは略図的に曲線２６に よって示されている。線２７は光ビームがサンプルを通過するサンプルチャンバ ーの平面と、屈折率グラジェント曲線２６に対するサンプルチャンバーに沿った 長さを示す軸との両方を示している。軸ｎはサンプルチャンバー内のサンプルの 屈折率を示している。線２８は検出器平面と、屈折率グラジェントが存在しない ときにサンプルチャンバーを直線的に通過する光の光度を表す軸をもまた表す。

曲線２９は検出器平面に到達する光の光度Ｉを表す。光ビームがサンプルチャン バーを通過するとき、個々の光！２５は屈折し、サンプルチャンバー内の密度グ ラジェントによって創出される屈折率グラジェント２６と遭遇するときに本来の 通路から曲がって外れる。各光線の光度が１０で一定の場合には、検出器平面の 光度の相対的変化は以下の式でめられる。

ここで、Ｘはサンプルチャンバーに沿った方向であり、２は光ビームに沿った方 向であり、ｎはサンプルチャンバー内の屈折率であり、ｄはサンプルチャンバー の直径であり、Ｌはサンプルチャンバーと検出器平面との間の距離である。この 等式で、［１／ｎ　（ｘ）］　ｄｎ／ｄｘは光ビーム屈折角に対応し、小さい。

等式の第１工ｎとの比較で第２項の高次数は無視することが可能である。従って 、となる。これは検出器平面のプローブビーム光度の相対的変化が毛管内の屈折 率の第２プリバチイブと対応したものであることを示している。屈折率変化とサ ンプルの密度との大きさ間の関係はだいたい一次的である。従って、検出器平面 のプローブビーム光度の相対的変化もまた毛管内のサンプルの密度の第２プリバ チイブと対応することが予期される。

図６と図７は本発明の毛管電気泳動装置を示す。図示のごとくに、毛管チューブ ３５は好適にはガラスであり、毛管通路３６を内部に有している。オープン容器 ３７と３８はタンク３９と４０をそれぞれに形成し、毛管チューブ３５の端部に 固定し、毛管通路３６がタンク３９と４０とに通じるようにしている。このアセ ンブリは部材４１によって一体のユニットとしてまとめられており、毛管チュー ブ３５と容器３７と３８は部材４１に固定されている。もし、毛管チューブがガ ラスであれば、部材４１もまたガラスであり、毛管はエポキシ系の樹脂で固定さ れており、屈折インターフェースが２者間に発生しないようにしている。容器３ ７と３８は、例えば、ポリエチレン等の適当な材料製で構わず、例えば、エポキ シ等の適当な接着剤によって部材４１に固定される。容器３７と３８にはそれぞ れトップ部４２と４３が提供され、それぞれタンク３９と４０内に配置された電 極４４と４５を保持している。チューブ４６と４７はそれぞれトップ部４２と４ ３を通って延びており、それぞれタンク３９と４０の底部付近で開いている。

それぞれのトップ部を通過するチューブ４６と４７のトップ部のフィッティング 部４８と４９はタンクに加えられたり、抜き出されたりする液体の液源からのチ ューブ、あるいはその液体の受け具を受け入れるように構成されている。このよ うな手段は、適当なフィッティング部４８あるいは４９との接続を仲介している チューブ５１を有した、参照番号５０で略図的に示されているもののごときスポ イトの形状であることが便利である。スポイトは手動でも、電動でもよく、また 、他のタイプのポンプあるいは搬送システムでも構わない。もちろん、電極４４ と４５、並びにチューブ４６と４７は他の種々な手段にてタンク内に配置可能で あり、容器３７と３８は開いたトップ部を有したままでも可能である。容器３７ と３８にトップ部を提供すること、並びに、トップ部に容器を封印させることの 利点は、容器の内部の圧力が制御可能となるからである。従って、スポイトある いは他の搬送システムはタンクの圧力を高めて、液体を強制的に毛管通路に送る ために使用することが可能であり、あるいは、タンク内の圧力を下げて液体を反 対側のタンクから毛管通路に引き出すように使用することもできる。前記のユニ ットはベース部５２に搭載することも可能である。

前述のユニットにおいて、毛管チューブの長さを適当に変更することも可能であ るが、チューブの長さが３ｃｍから１５ｃｍが多様なタイプの毛管電気泳動には 適していることが発見されている。さらに、毛管通路の直径も適当に変更可能で はあるが、直径が１０μｍから１００μｍが適していることが発見されている。

丸型でも正方形の角型の毛管通路でも構わないが、角型通路が本発明の検出器及 び検出方法には特に好適であることが発見されている。角型毛管が使用されたと き、毛管の直径とは一辺の長さを言う。タンクのサイズはさほど重要ではないが 、タンクの容積は充分大きくて、毛管通路が毛管を満たすのに使用される特定の 方法によって満たされなければならない。さらに、電極はタンク内の液体と接触 していなければならない。よって、タンクの容積はその間に延びている毛管通路 の容積よりも一般的に大きい。例えば、図６と図７に示す形状では、各々約０． ２ｍｌの容積を有したタンクは、例えば、２０μｍの直径を有した長さが１５ｃ ｍの通路のような多様なサイズの毛管通路に適していることが発見されている。

電極４４と４５はそれぞれワイヤー５３と５４によって高電圧（図示せず）の液 源と接続されている。その電圧は５ＫＶからｌ０ＫＶの範囲であることが望まし く、使用される分離タイプによって異なる。一般的に高い電圧は速い分離を可能 にするが、サンプルに熱を発生させる毛管通路内のサンプルを通過する電流によ って限定を受ける。加熱は毛管チューブを介して容易に発散するレベル以下に押 さえられなければならず、さもなければ毛管チューブが破裂する危険性がある。

電流は一般的に陰極から流れるが、電極内の電流をモニターすることで一般的に モニターされる。このようなモニターは図示されていないが電流計で行われる。

図示されている電気泳動装置は周知の様々な電気泳動分離技術の全てを使用した 電気泳動分離を可能にする。これらの技術は毛管ゾーン電気泳動、移動境界毛管 電気泳動、毛管等速泳動、及び毛管等電フォーカス処理である。電流電気泳動機 器を有した分離装置は各技術に必要とされるが、前記の装置は事実上汎用であっ て、それらのどの技術に対しても利用が可能である。異なる方法はサンプルの異 なる特性に頼るものであり、場合によっては、複数の方法を使用してサンプルを 評価することは利点となり得る。例えば、毛管ゾーン電気泳動と移動境界毛管電 気泳動は各成分の移動の差に基づいてサンプル成分を分離する。等電フォーカス 処理は各成分の異なる等電点に基づいて成分を分離する。

毛管ゾーン電気泳動は一般的に本発明の装置を使用して３ステツプのみを必要と するだけである。第１ステツプは緩衝液で毛管通路を満たすことである。一般的 に、両タンクが緩衝液で満たされる。毛管通路は１タンクを他方のものよりも高 いレベルに満たし、緩衝液を高い方のタンクから低い方のタンクへ流入させ、液 レベルを等しくさせることで流体力学的に満たされる。あるいは、一方のタンク が充分に密閉されたものなら、そのタンクに圧力をかけて緩衝液が毛管通路に流 入するようにすることもできる。両タンク内と毛管通路内に緩衝液を入れ、緩＆ をン１を陽極のタンクから、すなわち陽極あるいは正電極を有したタンクから移 動させ、サンプル清で交換する。高電圧が印加され、サンプルは動電学的、すな わち、毛管通路にかかる電圧の作用で毛管内に引き入れられる。毛管に引き入れ られたサンプルプラグの長さは、サンプル液がタンク内に残る時間と、電極にか かる電圧によって制御される。望ましいサンプルプラグが毛管通路に導入された とき、す〉プル液は夕〉りから取り出され、緩衝液はタンクに戻される。電圧は 電極にかかったままである。サンプル分離と毛管通路内の移動は電圧の影響下で 継続する。サンプルが通路を移動した後に、電圧は切断可能となる。

移動境界毛管電気泳動モードでの操作も同様である。当初、両タンクと毛管は緩 衝液で満たされる。この方法では、高電圧はこの時点で印加される。緩衝液は陽 極タンクから取り出され、サンプル液と交換される。サンプル液は動電ノｊ学的 に毛管通路内へ引き入れられる。望ましい量のサンプルが毛管通路内に存在する とき、サンプル液はタンクから引き出され、緩衝γ夜が再度タンク内に入れられ る。

この全プロセスはコンピュータによって制御される２体のスポイトポンプを使用 することで自動化が可能である。各ポンプは図６と図７に示すチューブ４６と同 様で、タンク体に延びているそれ自体のチューブを有することができ、あるいは ポンプはタンク内の単一チューブに自動制御バルブでバルブ付けすることもでき 毛管等速処理においては、第１あるいは先頭の電解液は毛管通路に流体力学的に 導入可能である。この後に毛管通路内へのサンプルプラグの流体力学的導入が続 く。これは先頭の電解液を陽極タンクから取り出し、タンクを陰極タンク内の液 体よりも高いレベルまで満たずことで達成されるであろう。望むサンプルプラグ が毛管通路内に流入するとき、サンプルは取り出され、第２すなわち後尾電解液 は陽極タンクと毛管通路内へ導入される。毛管通路は先頭と後尾電解液間でサン プルプラグを含む。高電圧が電極に接続され、分離を行う。

前記の３分離モード、すなわち、毛管ゾーン電気泳動、移動境界毛管電気泳動、 及び毛管等速泳動の各々で分離が行われている際に、サンプルは陽極端部から陰 極端部へと毛管通路を通過して自然に移る。

前記の装置を使用した毛管等電フォーカス処理においては、分離対象のサンプル と担体両性体（ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）とを含むサンプルは毛管 通路内に導入される。これは流体力学的に、あるいはサンプル液を１タンクの圧 力にさらすことで行うことが可能である。サンプルが通路に導入された後に、陽 極タンクはアナライト（ａｎａｌｙｔｅ）で満たされ、陰極タンクはキャソライ ト（ｃａｔｈｏｌｙｔｅ）で満たされる。その後に高ｄｃｆｔ圧が接続される。

電界の影響で、両性体は陽極から陰極への等電点を増加させる目的でそれらの等 電点によってアレンジされる。サンプル成分はそれらの等を点が両性体によって 確立されたｐＨと等しい毛管通路のポイントへ移動し、サンプル成分の狭いゾー ンを創出するであろう。図８に示すように、成分５５ａ、５５ｂ、５５ｃは毛管 チューブ５６の毛管通路内の溶質溶液５５ｄ内のシャープで狭いゾーン内にフォ ーカスされる。分離が完成したとき、分離は電圧が残るかぎり継続する。分離プ 「〕セスは毛管通路を通過する電流をモニターすることでモニター可能である。

電にｊｌ、を最低点に到達し、分離が達成されたときにその最低点で安定状態に 入る。実際の分離は通常約４分から７分で生じる。

説明したように、等電フォーカス処理はサンプル成分を非常に狭いバンドに分離 する。これらの狭いバンドは非常に高密度のグラジェントをそれらの境界線に形 成する。従って、等電フォーカス処理は、非常に低密度のサンプル成分に対して さえも毛管内に非常に高密度のグラジェントを形成する。密度の検出ではなくて 密度グラジェントの検出は等電フォーカス処理に対してユニークに適用すること が可能であり、高精度の検出と高解析度を提供する。密度グラジェント検出に基 づく検出器の精度と、密度検出に基づく検出器の精度との比はゾーンあるいは境 界幅δＸの関数として表される。

式中、δＸはゾーンあるいは境界内での密度配分のガウス標準偏差である。この 等式は、密度グラジェント検出器の精度は、密度検出に基づく検出器の精度より も、減少するゾーンでさらに素早く増加し、密度グラジェント検出器は、自己濃 縮及びフォーカス特性を有する等電フォーカス処理に対する密度検出に基づく検 出器よりもさらに適していることを示している。

毛管通路内でフォーカスしているサンプルを移動させることが望まれるなら、キ ャリライトは陰極タンクから引き出され、異なるｐＨの溶液と交換される。これ により分離したサンプルは通路を通過して移動する。

多様な密度グラジェント検出器を前述の電気泳動装置と共に使用することが可能 である。電気泳動分離によって引き起こされた密度グラジェントを光ビームが通 過する際に、光ビームの屈折を４測するために、通路の１端部で毛管通路を通過 してフォーカスされた単一光ビームは好都合であり、他の先行技術の検出器より もずっと良好な解析度を提供する。これは、単に密度よりも密度グラジェントγ 計測されている理由による。しかし、毛管通路の該当部の長さ方向の分離を計測 することができ、毛管通路内の分離サンプルの移動を必要としない検出器は、等 電フォーカス処理を使用したときには望ましい検出器であり、そのような検出器 は分離したサンプルの移動を要しない。分離したサンプルの移動を要しない等電 フォーカスによって分離されたサンプルを検出することで、結果はさらにずっと 素早く入手できる。フォーカスそのものは一般的に約４分から７分の時間を要す るが、移動は通常は追加的１５分から４５分の間である。固定したサンプルのモ ニターと検出とによって、結果はフォーカスが生じるのと同様に素早く得られる 。さらに、この解析は移動を介して失われたり、歪められたりはしないため、非 常にすばらしい高解析度がサンプル成分間に維持される。

本発明の検出器の基本的概念は、分離が毛管チューブに発生する毛管チューブの 関係する全長を対象とする光ビームをフォーカスすることであり、光ビームは対 象となる分離物を含むサンプルの長さ方向に沿ってサンプルを通過するものであ る。これは毛管チューブに沿った２ｃｍの長さから１０ｃｍ以上の長さの範囲で ある。サンプルを通過した後のビームの光度は、サンプルの望む長さを通過した ビームの幅方向に沿った光度の変化が決定されるようにセンサーあるいは検出さ れる。従って、ビームの幅は望む出力データを提供するために各個々に検出され る多数の小さな部分に分割されなければならない。本発明の好適形状においては 、図９の幅は広いが薄い光ビーム５９が発生され、毛管通路にフォーカスされ、 ビームＷの幅は対象の分離が生じた毛管通路に沿った長さを分析するものであり 、ビームｈの高さは好適には毛管通路の直径よりも小さいものである。従って、 図９に示されているビームの高さｈは図示の目的でいくらか誇張されている。そ のような光ビームを発生するにはいくつかの方法が存在し、レンズの使用やマス ク、すなわち、スリットが入った不透明なシートの使用も含まれている。さらに 、光ビームの光はレーザー、光発生ダイオード（ＬＥＤ）　、レーザーダイオー ド、あるいはＬＥＤまたはレーザーダイオードアレイによって発生させることも 可能である。

本発明の好適な検出機は図７及び図１０から図１２において示されている。図示 のごとくに、レーザーあるいはレーザーダイオードのごとき光源６０は、必要に 応じた適当なレンズと共に円形断面の光ビーム６１を毛管通路３６に方向付ける ようにアレンジされている。光ビーム６１の通路内の筒状レンズ６２は円形ビー ムを、幅が円形ビームの幅とだいたい等しい薄い光ビームすなわち光シートにフ ォーカスする。この光シートは毛管通路３６とアラインされ、その上にフォーカ スされている。ビームの幅が毛管通路の全長よりも薄ければ、ビームは対象の分 剤が行われると予期される通路の長さに沿って通過するようにセットされる。

ビーム６３は毛管通路から検出器に直接的に通過することができ、あるいは毛管 通路からビーム６３が検出器に到達する前にビームにまで広がるレンズ６４まで 通過することもできる。広がったビームは６５で示されている。そのような広が りは検出の解析度を増大させ、特に検出の増分（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）が思う ように小さくないところで増大させる。

本発明の好適形態は２つの交互検出あるいはセンサー技術を利用する。１つはビ ーム６５の幅方向に沿って直線的に移動するように搭載された光ダイオード６６ のごとき単一検出器であり、光ダイオード６６の直線的ポジションのファンクシ ョンどして光ビーム６５内の光度をセンサーする。センサーされている光ビーム はＪｌ−常に薄く、光度の変化は実質的に単一方向に生じるので、すなわち、ビ ームの幅方向に生じるので、ビームの高さの観点からは光ダイオード６６とビー ムとの正確なアラインメントは必要がない。

九ダイイオード６６は多様な方法でビーム６３の幅方向に沿って移動することが 可能であり、その移動方法はさほどπ要ではない。光ダイオードを移動する装置 は、ダイオードの直線的ポジションの記録をとるものであればどのようなもので も使用可能である。これは、開始した後に対象の全長を一定の速度で移動する手 段であっても構わない。移動ダイオード６６のための装置の例は図７と図１０に 示されている。ｌ・ラック７０はベース５２に搭載され、キャリエツジアセンブ リ７１を受け入れる。キャリエツジアセンブリ７１はテフロンあるいは同様なプ ラスチックベアリング７２を含み、それらは）・ラック７０に対して回り、摩擦 を３１、少し、さらに、ネジ式シャフト７４を受け入れるネジ入り部材７３を含 む。ブラケット７６と光ダイオード６６を搭載したプラットフォーム７５はキャ リエツジ７１に固定されている。図７のシャフト７４はスリーブ７８を介してス テッパーモータ８０の出力シャフト７９にカプリングされている。ネジ式シャフ ト７４がステッパーモータ８０によって回転されるとき、キャリエツジ７１、プ ラットフォーム７５、及び光ダイオード６６はトラック７０に沿って移動する。

移動の方向はステッパーモータの回転方向により、移動の速度はステッパーモー タの回転速度による。ステッパーモータの回転、方向、及び回転量は現在の技術 で正確に制御可能であり、モータの回転と光ビーム６５の幅方向の光ダイオード ６６の移動は正確にモニターして制御することが可能である。光ビーム６５の幅 方向の光ダイオード６６のスキャニング中に、光ダイオード６６は光ダイオード ６６に照射するビーム６５の光度に対応した出力信号、すなわち、光ダイオード の移動通路に沿った光ビーム内の全ポイントにて光度に対応した信号を創出する であろう。光ダイオード６６によってセンサーされる部分の幅をさらに制限する には、シールド８１を図７に示す望む幅のスリット８２を入れて光ダイオード６ ６の前方に搭載する。光ダイオードの出力はリード８３を通過する。使用される 検出器用電子機器は標準的で周知なものである。

代用の検出器は図１１に示されており、図７と図１０の移動光ダイオード検出器 に代わるものである。図１１の検出器はサンプルを通過した後の光ビーム６３の 通路、あるいは広がった光ビーム６５の通路内に搭載される光ダイオードアレイ ８５である。多くの１次元的、あるいは２次元的光ダイオードアレイが使用可能 であり、望む解析度に対して見合うアレイのコストにすることが可能である。

好適なアレイはアレイの幅に沿って間隔が開けられた非常に小さなセンサー要素 を有したものである。例えば、１０００分の１インチの大きさのセンサー要素を 有したテレビやビデオカメラ内に使用されるチャージカップルされた装置のアレ イは簡単に人手できるが、大きなものや、高級なものは高価である。それ以」二 に小さなセンサー要素を有したアレイも入手可能になってきた。そのようなアレ イはｌディメンション内に１０２４もの要素を有している。従って、アレイの幅 や光ビームの幅は１０２４の個々に検知するポジションに分割できるであろう。

アレイをスキャンするための電子機器は標準的で周知なものである。電子機器と アレイの接続は８６で略式に示されたワイヤーによる。

検出器システムの全体的なブロック図が図１２に示されている。光源はブロック ９０で表されており、レーザーやレンズ等の必要な部品を含み、破線９１で示さ れる必要な光シートを創出する。光ビーム９１は毛管サンプルチャンバー９２を 通過して、サンプルを通った後のビームの光度プロファイルを計測する検出器９ ３に至る。検出器の出力は、検出器からの信号を有し、それらをコンピュータ９ ５に送る必要なインターフェース電子機器９４に向かう。検出器を制御するのに 必要な、例えば、スキャニング信号やモータ制御信号、あるいは他の制御信号の ごとき検出器からの信号はコンピュータ９５からインターフェース電子機器９４ を通って検出器９３に送られる。このようなシステムで、入手された光度情報は リアルタイムでコンピュータモニターに表示され、後の表示あるいは処理のため にメモリに保存される。コンピュータ９５はインターフェース電子機器９６を介 しても操作可能であり、ブロック９７で示されたとの試薬ポンプ、電圧供給源、 あるいは他の装置を操作することもでき、毛管サンプル通路内で実施される毛管 を気泳動分離を自動化する。これで検出された結果に基づいてサンプルチャンバ ー内で生じる毛管電気泳動の条件間のコープイネ−ジョンが可能となる。

検出器の標準型では、１００μｍの直径、６．５ｃｍ平方の毛管通路が等塩フォ ーカス処理において示された装置に使用された。毛管チューブはガラス製であり 、２枚のガラススライド間をエポキシで接着した。毛管通路壁は非交差結合アク リルアミドでコートされており、電気浸透を排除した。タンクを形成している容 器はポリエチレン製であった。装置は２軸ステージに搭載され、水平及び垂直弔 面内のｌ１ｌｌｌ斜角はプローブ光ビームと毛管通路とのアラインメントを助け るように調整可能であった。カリフォルニア州のサンノゼ市のユニフェーズ社が 製造するＨｅ−Ｎｅレーザーが使用され、プローブ光ビームを発生させた。レー ザーからのビームは２ｃｍ直径のビームに広げられ、３軸ステージに搭載された ６ｍｍ焦点距離筒状レンズによって毛管通路内にフォーカスされた。筒状レンズ は幅が約２ｃｍの尤シートを創出した。毛管通路を通過した後に２ｃｍビームは 毛管チューブの背後に搭載された２５ｍｍ焦点距離レンズによって検出器平面内 で２０ｃｍビームに広げられた。このようにして、検出器平面の１ｃｍの幅は毛 管通路の１ｍｍの長さに対応した。このことによってビームの光度プロファイル の計測が容易になる。いくらかの実験では、０．１ｍｍのスリットが入ったシー ルドを有した単一の光ダイオードはマサチュセッッのオライオンリサーチ社（Ｏ ｒｉ。

ｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　Ｉｎｃ、）によって製造された３４１Ｂ型スポイトポ ンプの移動部分によって駆動された１軸ステージ上に搭載された。これは光ダイ オードが検出器平面でスキャンされるように配置されたものである。そのように 搭載された光ダイオードのスキャン距離は約１５０ｍｍであり、毛管通路の１５ ｍｍに対応するものであった。他の実験では、１次元的な１２８要素光ダイオー ドアレイが使用され、検出器平面のビームの光度をモニターした。このアレイは 毛管通路の３ｍｍをモニターできた。全システムは振動隔離台上に搭載された。

検出器によって得られたデータは、ニューヨーク州ロチェスター市のアシストソ フトウェア−テクノロジー社（Ａｓｙｓｔ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌ 。

ｇＬ　Ｉｎｃ、）によって供給されたＡＳＹＳＴソフトを使用してＰＣ−ＡＴパ ソコン内のＩＢＭ　ＤＡＣＡボードを介して回収された。

このシステムのテストにおいて、全試薬は試薬グレードであり、溶液は脱イオン 水を使用して準備された。１０　ｍＭ　Ｈｓ　Ｐ　Ｏ、と２０ｍＭ　ＮａＯＨは それぞれアノライトとキャソライトとして使用された。ＮａＯＨ溶液は使用前に ヘリウムを曝気してガス抜きした。使用されたサンプルは、アルファーキモトリ プシン（ＩＩ型、シグマ社）、ホスホリラーゼ　ｂ（シグマ社）、及びオボアル ブミン（グレード　■、シグマ社）が含まれる。サンプルは、両性体（ファーマ ライト（ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）ｐＨ３−１０、シグマ社）溶液と混合して、終 濃度２％両性体の溶液とした。溶液は０．２μｍ孔のセルロース　アセテート膜 （トイ・人ゴチンゲン、サルトリウス社製）を使用してフィルターした。毛管に 導入されたサンプル濃度は０．５ｍｇ／ｍＬからＩｍｇ／ｍＬの範囲であった。

サンプルはスポイトによって発生された圧力によって毛管通路内に導入された。

毛管の陽極端部のタンク内の１％アガローズ　ゲルのプラグ（アノライト１０ｍ Ｍ　Ｈ３Ｐ０’で調整）が使用され、１００μｍ径の毛管内の流体力学作用を及 ぼす流れが回避された。サンプルが毛管通路に導入された後に、５ＫＶ　ｄｃ電 圧が供給され、毛管を通過する電流がモニターされてフォーカス処理が実施され た。

典型的には、電流は１５μＡから約２．５μＡに４分から７分で落ち、その後に 数時間安定した。この最低電流は等塩フォーカス処理が完了したことを示す。

図１３は陽極端部から３．５ｃｍから５ｃｍの距離で位置している毛管の部分を 通過するプローブビームを横断してスキャンされる単一光ダイオードによって検 出されるビーム光度プロファイルを示す。２つのシャープで、高いピークである １００と１０１は図１３に示されるプローブビーム光度プロファイル内で観測さ れ、それぞれ、フォーカスされたホスホリラーゼ　ｂの予期される位置（等電点 ６．３）とオボアルブミンの予期される位置（等電点４．７）に対応する。アナ ライトの濃度は各約１ｍｇ／ｍＬである、この結果は毛管内のフォーカスされた タンパク質がこの単純な造画システムによって検出可能であることを証明してい る。ホスホリアーゼ　ｂのフォーカスされたゾーンに対応する信号ピーク１００ とその積分値は図１４に図示されており、検出された信号１００の第２プリバチ イブ持性を明瞭に示す。この造画システムはオンライン検出器であるため、等電 フォーカス処理自体がモニター可能である。図１５はホスホリラーゼ　ｂとオボ アルブミンのフォーカス処理を示す。サンプルの濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであり 、６．５ｃｍ平方の毛管内に注入されたホスホリラーゼ　ｂの３．４ｐｍｏｌｅ と、オボアルブミンの７．２ｐｍｏｌｅに対応する。図１５の曲線によって示さ れるようにフォーカス処理の開始時（ＯＭｉｎ、）ではシャープなピークは？ｆ 在しない。検出された信号は、毛管を通過した後のプローブビーム光度プロファ イルである。図１５の多数のピークは毛管壁内の屈折率欠陥、あるいは毛管の内 壁内のコーティング材料によって引き起こされ、それらは図１５の曲線ａ、　ｂ 及びＣで観測可能である。曲線すとＣにおいて、２つの第２プリバチイブビーク １０２と１０３が現れ、フォーカス時間が長くなると高くなり、フォーカスされ たホスホリラーゼ　ｂとオボアルブミンに対応する。これらの２つの高いピーク に加えて、他の小さなピークが観測され、図１５の曲線すとＣ内で時間と共に高 くなる。これらのピークはサンプルのマイナーな成分に関係する。キャリヤー両 性体の成分によって発生される密度グラジェントもまた検出器の普遍性のために 検出されることは注目に値する。キャリヤー両性体によって創出される屈折率の 変動は図１４に示される検出された信号の総体内で発見される。しかし、画像検 出器の第２プリバチイブ特性はキャリヤー両性体の幅広バンドによって発生され る低周波数幅広信号の大きさを効果的に減少させる。図１３に示すごとく、高い 信号ピークは狭いタンパク質ゾーンの境界で創出された高密度グラジェントにお いて観測されるだけである。

図１３と図１５は移動単一光ダイオード検出器で入手された。図１６はアルファ ーキモトリプシンサンプルに対するフォーカス処理を示し、３ｍｍ長の毛管通路 をカバーしている。図１６の曲線は前述の１２８要素−次的光ダイオードアレイ を使用して入手された。このことは本発明の検出器内でのセンサーアレイ使用の 実用性を明瞭に示している。さらに、得られた結果は本発明の検出器がサンプル 内のフォーカスされたアナライトを検出するのみならず、毛管通路内の等塩フォ ーカス処理の力学特性をモニター及び研究するのにも使用可能であることを示し ている。

図１７は本発明の等電泳動装置におけるサンプルチャンバーの第２実施例を示す 。血清サンプルのごときいくらかのサンプル溶液は高レベルの塩分を含んでいる 。これによりサンプルは高レベルの導電性を有する。もしそのようなサンプルが 毛管通路内に導入されたならば、分離のために適用された電圧はサンプルを通じ て過剰な電流を発生させ、毛管チューブの破裂を引き起こし得る。従って、塩分 を取り除くサンプル準備は毛管電気泳動分離以前に必要である。図１７に示され る装置は全体的な処理の一部としての電気泳動のためのサンプル準備に使用が可 能である。

図１７に示されるように、装置の改良は第２容器１２２内にサンプルタンク１２ １を形成する容器１２０を提供することである。サンプル容器１２０は、セルロ ース　アセテート膜材料のごとき孔質膜材料で製造される。あるいは、容器１２ ０は孔質膜材料と、例えば、孔質膜材料を有したポリエチレン容器等地の材料と の組合せでも構わない。容器１２２はポリエチレンあるいはガラスのような通常 の非孔質材料で作成されている。毛管通路１２３は毛管通路１２４がサンプルタ ンク１２１と連絡するように密封され、サンプル容器１２０に固定された容器１ ２２の壁を通過する。一般的に、図示された構成は図６の装置において示された タンクの１つのみ、普通は陽極タンクのみを必要とするだけであろう。サンプル １２５はサンプルタンク１２１内に導入されるが、当初は毛管チューブ１２４内 に流入しない。望ましい両性体を含み得る水は容器１２２内の溶液１２６として 配置され、容器１２０の一部を囲む。水−両性体温液を容器１２２を通過させて 連続的に流すことが好ましく、その目的で、水−両性体温液源からのインレット チューブ１２７はそのような溶液を容器１２２に導入させるように提供可能であ り、アウトレット１２８は溶液が容器１２２から流れるように提供可能である。

サンプルタンク１２１内のサンプル１２５で、内部の塩分は孔質膜を通過して容 器１２２内の水溶液１２６内に流れ込む。同時に、もし水が両性体を含むなら、 両性体は膜を通ってサンプルに入る。このように、サンプルはサンプルタンク内 で塩分の除去と両性体の追加によって準備可能である。サンプル１２５はサンプ ルタンク１２１内に、膜を通過してサンプルから水への塩分の交換と、水溶液か らサンプルへの両性体の交換に必要な時間だけ留まる。サンプルが適正に準備さ れたとき、サンプルはサンプルタンク１２１への圧力等により毛管通路内へと移 動されるであろう。サンプルタンクは封印されたトップ１２９を含み、タンクに 圧ツノをかけ、サンプルを毛管通路、を極１３０、及びチューブ１３１に図６の 装置のごとくに流入させる。

本発明はさらに毛管等電フォーカス処理では通常はフォーカス処理されて検出さ れないような等電点を有しない特定の成分の存在あるいは密度を決定する方法を も含む。その方法は充分に定義された等を点を有し、検出対象の成分に対して高 レベルの特殊性を有した試薬をその成分を含むかも知れないサンプルに、試薬と 成分が試薬自体の等重点とは異なる等電点を含むそれらの組合せ体あるいは複合 体を形成する条件丁で加え、その複合体の存在を等電フォーカス処理で検出する ステップを含む。

この方法は体液等のサンプル内でトキシン（ｔｏｘｉｎ）等の成分の存在を検出 するのに適した場合に有効であるが、トキシンは等電点を有していない可能性が あり、通常は等電フォーカス処理では分離と検出ができないものである。本発明 の方法においては、対象の成分あるいはアナライトに対する高い特異性を有した 試薬が使用される。この試薬は充分に定義された等電点を有しており、毛管等電 フォーカス処理と、本発明の検出器でガウスの第２プリバチイブとして容易に検 出可能なシャープなバンドを毛管内に形成する。このことは図１８の曲線ａ１ｂ 及びＣ内の信号１３５によって示される。例えば、試薬はタンパク質であり、捜 されているトキシンの抗体であり、あるいは、例えば合成キャビティリガンド（ ｌｉｇａｎｄ）のようなコンピュータによってデザインされ、研究所で合成され た有機分子（ｍｏｌｅｃｕｌｅ）でも有り得る。捜されている成分はトキシンあ るいは一般的に等電点を有していない他の分子でも有り得る。試薬Ｒは、標的成 分あるいはアナライｌ−Ａと特異的に及び強く相互化学作用するものが選択され 、例えば、以下の生成物を形成する。

Ｒ＋Ａ＝ＲＡ 化学処理による生成物ＲＡは異なる等電点を有しており、よって毛管の異なる部 分と試薬Ｒにフォーカスする。従って、生成物は図１８の曲線Ｂ内のビーク１３ ６として示される。さらに、対応する信号１３６の高さは存在する対象成分の量 に対応するものである。試薬もまたいくつかの対象アナライトと反応するように デザイン可能であり、いくつかの異なった製品を作り出す。このような場合には 、いくつかの対応する信号１３６．１３７及び１３８は図１８の曲線Ｃ内に示さ れるように入手され得る。通常、サンプル内に存在する全成分が試薬と反応する ように、サンプルに加えられる余剰な試薬を存在させることは望ましいことであ る。このようにして、成分−試薬製品を表す信号、すなわち、ビーク１３６．１ ３７、あるいは１３８はサンプル内の成分の密度に対応するであろう。試薬に対 するビーク１３５の存在と製品に対するビークの存在はこの余剰を示す。

探索されるサンプルの成分に対する非常に高い特異性を有する試薬は正確な検出 と密度の情報を提供するので、単純で比較的安価な本発明の検出器を使用する前 述の方法は多くの長い分析工程と高価な機器に置き替わる可能性を秘めている。

前述のように、本発明の電気泳動分離装置は、毛管通路の１端部に位置したビー ムを有し、毛管と検出ビームを通過して流れるように等電フォーカス処理にて得 られたサンプル分離を活用する前記の発明に示されるものと同様な検出器と共に 使用することが可能である。図１９は前記のものと同様な毛管電気泳動装置を、 １２ｃｍの長さの毛管チューブ内の２０μｍ径毛管通路の１端部を通過した光ビ ームに対する光源としてレーザーダイオードと共に使用して得られた結果を示す 。

使用されたサンプルは１２０ｆｍｏｌのヒトのヘモグロビンを含んでおり、ビー ク１４０で示されており、２７０ｆｍｏｌのヒト　カルボニックアンヒドラーゼ （ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ）はビーク１４３で示され、４１０ｆ ｍｏｌのＢ−ラクトグロブリン（ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）はビーク１４４ で示される。サンプル濃度は０．２ｍｇ／ｍＬであった。

図２０と２１は毛管ゾーン電気泳動、移動境界毛管電気泳動、及び等ｔフォーカ ス処理によるサンプルの分離の相違を示している。図２０と図２１は３種の分離 法によって分離されたオボアルブミンの電気泳動図（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏ ｇｒａｍｓ）を示している。オボアルブミンはサンプル移動性の相違に基づくス ラブゾーン電気泳動処理で製造業者によって純化された。予期されたように、毛 管ゾーン電気泳動分離の電気泳動図である図２０の曲線ａは１つのビーク１５０ のみを示す。移動境界毛管電気泳動分離の電気泳動図である図２０の曲線すもま たビーク１５１を示す。これは毛管ゾーン電気泳動と同様に同一の分離の原理、 成分移動性の相違に基づくからである。しかし、図２１の等電フォーカス処理に よって分離された同一サンプルの電気泳動図は４つ以上のビークを示す。最も高 いビーク１５２はオボアルブミンに対応し、他のビークはオボアルミンとほとん ど等しい移動性を有したサンプル内の汚染物あるいはマイナーな成分のためであ るが、オボアルブミンとは異なる等電点を有している。示される電気泳動図ある いは曲線は、その端部に検出器を有した装置を使用し、等電フォーカス処理で得 られたサンプル分離を活用することで得られた。このことは、等電フォーカス処 理を使用することで、分離と感度において相当に異なり、改良されたものが得ら れることを示している。

本発明の検出器はさらに吸光度画像検出器としても使用可能であり、密度グラジ ェントを、１１測しないで直接的に分離されたサンプル成分の密度を検出する。

この場合の唯一の相違は、サンプル成分に吸収される周波数の光を提供する光ビ ームの特質だけである。この光ビームは、例えばハロゲンランプのようなコヒー ｌ／シトではない光源によって発生可能である。あるいはレーザー、または可変 周波数レーザーによって発生可能である。毛管通路に沿って分離されるときにサ ンプルの成分は光のいくらかを吸収し、光度は光ビームの幅方向に沿って変化す る。

前述のごとき検出器は、光ビームの幅方向に沿って光度の変化を検出する。

吸光度画像検出器の１例においては、光ビーム源はハロゲンランプであった。

ランプからの光は光を鏡に反射するパラボラ反射器によって集光された。光ビー ムは、４００ｎｍから６００ｎｍの波長範囲で透明な色フィルターでフィルター された。その後に光ビームは２００μｍ幅のスリット内にフォーカスされ、２０ ０μｍ径毛管チューブにフォーカスされた。光ビームによって照射された毛管の 画像は、１０ｃｍ焦点距離のレンズを介して１０２４の画素あるいは日本の浜松 布の浜松によって製造される２５ｍｍＸ０．５ｍｍセンサー部位を有した５３９ ０３−１０２４Ｑのごときセンサー要素のチャーシーカプル装３！　（ＣＣＤ） 上に投射された。毛管内の屈折グラジェントによる光ビーム光度プロファイルの 変化は、毛管の画像を検出器平面、すなわちセンサー上にフォーカスすることで 排除された。データはＰＣ−ＡＴパソコン内でＩＢＭ　ＤＡＣＡボードによって 収集された。ある平均法がランダムノイズを減少させるために適用された。各計 測に対して、ＣＣＤは１秒に１０回スキャンされ、これらのスキャンは平均され た。

フォーカス電圧が入れられる前に記録された背景画像は、まずサンプル画像から 取り除かれ、サンプル画像は背景画像によってノーマル化され、ソースビーム光 度配分によって創出された変動が排除された。７５％のメテモグロビン（ｍｅｔ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）を含み、主にオキシヘモグロビン（ｏｘｙｈｅｍｏｇｌ ｏｂｉｎ）でバランスされたシグマケミカル社からのヒトのヘモグロビンサンプ ルは等電フォーカス処理で分離された。得られた電気泳動図は図２２に示されて いる。ビーク１６０と１６１はヘモグロビンの２つの異形物（ｖａ、ｒｉａｎｔ ）であるメテモグロビン（ｐ１７．２、サンプルの７５％）とオキシヘモグロビ ン（ｐ１７．０、サンプルの２５％以下）にそれぞれ対応する。他のビークはヘ モグロビンの他の異形物に対応する。この結果は吸光度検出処理を介した効果的 な検出処理を示す。

図２３は図２２のものと同じヘモグロビンサンプルの電気泳動図を示しており、 これは１００μｍ径毛管にフォーカスされており、密度グラジェント造画法を用 いて検出されるものである。図２に示される密度グラジェント造画法の解析度は 、幅広バンドと変動を排除する密度グラジェント造画法の第２プリバチイブ特性 のために、吸光度造画法のものよりも良い。さらに、吸光度検出においてコヒー レントではない光源を使用するときには、細い毛管の使用は制限される。１００ μｍｆｌ以下の毛管のように細い毛管を使用した吸光度造画法に対しては、調整 可能波長レーザーが必要であり、タンパク質検出に使用するにはＵＶ範囲で有効 な調整可能波長レーザーが必要となる。これはたいていのタンパク質がＵＶ範囲 の吸光度バンドのみを有しているからである。従って、密度グラジェント造画法 は細い毛管チューブに対して実用的であるように思われる。しかし、太い毛管チ ューブに対しては、吸光度造画法は優れた結果をもたらす。

現在最良と考えられる態様の実施例を利用して以上解説した本発明を異なる実施 形態に採用する場合には、本明細書及び請求項に記載された本発明の概念と範囲 を逸脱せずに多様に変更することが可能であることは理解されるべきである。

図面の簡単な説明 本発明の現在考えられる最良の実施態様は添付の図面にて示されている。

図１はグラジェントを通過する光ビームの略図である。

図２はサンプルチャンバーを通過する光ビームの略図であり、チャンバー内の屈 折率グラジェントの存在により創出された屈折角を示している。

図３は密度グラジェントを有したサンプルを通過する光ビームの第２略図である 。

図４は図２に類似したサンプルチャンバーを通過する光ビームの略図であるが、 ビームの一部にグラジェントを有した幅広ビームを示している。

図５はビームの一部に密度グラジェントを有したサンプルチャンバーを通過する 幅広光ビームの別略図である。

図６は本発明の電気泳動装置の毛管通路を通る垂直断面図である。

図７は図６の７−７線を通る部分的水平断面図であるが、平面図にて光源、レン ズ、及び検出器を示している。

図８は毛管チューブを通る部分的垂直断面図であり、等電フォーカス処理の結果 のサンプル成分分離を示している。

図９は本発明の装置によって形成された光ビームを通過する垂直断面図である。

図１０は図７の１０−４０線を通る部分的垂直断面図である。

図１１は本発明の代用検出器の部分的平面図である。

図１２は本発明の検出器のブロック図である。

図１３は本発明の装置内で等電フォーカス処理によって分離され、移動検出器に よる出力信号どして創出されるサンプルを通過するプローブ光ビームの光度プロ ファイルの曲線である。

図１４は図１３の曲線の積分曲線である。

図１５は本発明の装置内で等電フォーカス処理による分離中で、移動検出器によ る出力信号として創出されるサンプルを通過するプローブ光ビームの光度プロフ ァイルの３曲線である。

図１６は本発明の装置内で等電フォーカス処理による分離中で、ダイオードアレ イ検出器による出力信号として創出されるサンプルを通過するプローブ光ビーム の光度プロファイルの３曲線である。

図１７は図６と図７の装置で使用可能なタンクを受領する別サンプルの部分的垂 直断面図である。

図１８は光度プロファイルの略図であり、本発明の方法で得られた分離を示して いる。

図１９は本発明の装置内で分離され、検出器を通過して移動するように可動であ り、検出器による出力信号として創出されるサンプルの密度プロファイルの曲線 である。

図２０は毛管ゾーン電気泳動と移動境界毛管電気泳動を使用して分離される同一 サンプルの密度グラジェントプロファイルの曲線である。

図２１は図２０に使用されたものと同一のサンプルの密度グラジェントプロファ イルの曲線であり、等電フォーカス処理により分離されるサンプルを示している 。

図２２は本発明の装置内で等電フォーカスにより分離中のヘモグロビンサンプル を通過する、サンプル成分の密度を表すプローブ光ビームの光度プロファイルの 曲線である。

図２３は図２２のものに類似したヘモグロビンサンプルを通過する、サンプル成 分の密度グラジェントを表すプローブ光ビームの光度プロファイルの曲線である 。

ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、１Ｉ ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　１２ ＦＩＧ、　１３ ＦＩＧ、　＋７ 「 Ｔｉｍｅ　（ｓ） ＦＩＧ、　２０ Ｔｉｍｅ　（ｓ） ＦＩＧ、　２１ ｍ ＦＩＧ、　２２ ｍ ＦＩＧ、　２３ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、ＳＥ ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ 、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、、ＬＵ 、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎ。

、　ＮＺ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＫ、　ＵＡ。

Ｓ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．毛管電気泳動装置であって、内部で密度グラジエントが形成される毛管通路 を有した透明な毛管チューブと、該毛管チューブに沿って所定の距離を広がるの に充分な幅を有した光ビームを発生させるための手段と、前記毛管通路内に存在 し、対象であるいかなる密度グラジエントをも含むような該通路の所定の長さを 前記光ビームが通過するように、該毛管通路上に該光ビームをフォーカスさせる ための手段と、前記毛管通路の所定の長さに沿った複数の位置で密度グラジエン トを示す光度を検出し、該所定の長さに沿った該光度を表す出力を提供するため に、前記毛管通路を通過した後の光ビームの光路内に位置する検出手段と、を含 んでいることを特徴とする毛管電気泳動装置。
2. ２．光ビームを発生させる前記手段は、前記毛管チューブに沿って所定の距離を 広がるのに充分な橿を有した光ビームを発生させるが、その高さは前記毛管通路 の直径よりも小さく、毛管に沿った前記所定の距離は該毛管通路の直径よりも相 当に長いものであることを特徴とする請求項１記載の毛管電気泳動装置。
3. ３．前記毛管通路の直径は１０から１００ミクロンの範囲であることを特徴とす る請求項２記載の毛管電気泳動装置。
4. ４．前記検出手段は光検出アレイであることを特徴とする請求項１記載の毛管電 気泳動装置。
5. ５．前記検出手段は光ダイオードアレイであることを特徴とする請求項４記載の 毛管電気泳動装置。
6. ６．前記検出手段は、前記光ビームの幅と比して狭いセンサー部位を有した検出 器と、該検出器を前記通路の所定の長さに沿って移動させる手段とを含んでいる ことを特徴とする請求項１記載の毛管電気泳動装置。
7. ７．前記検出器は、光ダイオードであることを特徴とする請求項６記載の毛管電 気泳動装置。
8. ８．前記光ダイオードと、該光ダイオードと共に移動する前記毛管通路との間に シールドが提供され、該シールド内には該光ダイオードのセンサー部位を定義す る開口部が提供されていることを特徴とする請求項７記載の毛管電気泳動装置。
9. ９．光ビームを発生させる前記手段は、光ビームを発生させるレーザーと、該光 ビームを形状化する筒状レンズとであることを特徴とする請求項１記載の毛管電 気泳動装置。
10. １０．前記毛管通路を通過した後の前記光ビームを広げるために、該毛管通路と 前記検出器との間に位置するレンズを含んでいることを特徴とする請求項１記載 の毛管電気泳動装置。
11. １１．毛管電気泳動装置であって、第１タンクと、第２タンクと、該第１タンク と第２タンクとを一体的に固定し、該一体化された第１タンク及び第２タンクと 接続された毛管通路を形成する手段とを含んでおり、該両タンクはそれぞれの内 部に電極の取り付けが可能であり、該両タンクの少なくとも一方はその内部に液 体を加えたり、その内部から液体を取り出したりする手段と協調作用するように 構成されていることを特赦とする毛管電気泳動装置。
12. １２．前記両タンクは、それぞれ内部に位置する電極をさらに含んでいることを 特徴とする請求項１１記載の毛管電気泳動装置。
13. １３．前記両タンクの１つと協調作用可能であり、そのタンクに液体を加えたり 、そのタンクから液体を取り出したりするための手段をさらに含んでいることを 特徴とする請求項１２記載の毛管電気泳動装置。
14. １４．液体を加えたり、そのタンクから液体を取り出したりするための前記手段 は、スポイド手段と、該スポイド手段に固定され、前記タンク内に延び出ている チューブとであることを特徴とする請求項１３記載の毛管電気泳動装置。
15. １５．前記毛管通路は１０ミクロンから１００ミクロンの範囲の直径を有してい ることを特徴とする請求項１１記載の毛管電気泳動装置。
16. １６．前記毛管通路は１０ｃｍの長さであることを特徴とする請求項１１記載の 毛管電気泳動装置。
17. １７．前記両タンクを結合し、前記毛管通路を形成する前記手段はそれに毛管チ ューブが固定されているガラス製であることを特徴とする請求項１１記載の毛管 電気泳動装置。
18. １８．アナうイトが等電点を有していない場合に等電フォーカス処理によってサ ンプル内のアナライトの存在を判定する方法であって、アナライトの存在を確認 するための試験に供されるサンプルを取得するステップと、該サンプル内に存在 するならば前記アナライトと反応し、等電点を有した化合物を形成させる試薬を 該サンプル内に加えるステップと、該試薬が加えられた該サンプルを等電フォー カス処理に供し、該サンプル内に前記反応が存在するかとうかを判定するために 前記等電フォーカス処理の結果を検出するステップとを含んでおり、前記化合物 の存在はそのアナライトの存在を示すものであることを特徴とする判定方法。
19. １９．前記サンプル内の予期される全アナライトと反応させるのに充分である以 上の試薬を該サンプルに加え、前記等電フォーカス処理により検出された結果は 該サンプル内にアナライトが存在することの判定とともに、存在するアナライト の濃度を表すようにすることを特徴とする請求項１８記載の判定方法。
20. ２０．前記試薬は等電点を有しており、該等電点は該試薬とアナライトとの化合 物の等電点とは異なるものであり、該化合物及び前記試薬両方の検出は余剰試薬 の存在を確認させるものであることを特徴とする請求項１９記載の判定方法。
21. ２１．毛管電気泳動装置であって、その内部でサンプル成分の分離が行われる毛 管通路を挿通状態に有する透明毛管チューブと、該毛管チューブに沿って所定の 距離だけ広がるのに充分な幅を有した光ビームを発生させる手段と、前記通路内 に存在し、対象であるいかなる分離をも含むような前記光ビームが該通路の所定 の長さを通過するように該毛管通路に前記光ビームを導く手段と、前記毛管通路 の所定の長さに沿った複数の位置で光度を検出し、該所定の長さに沿った該光度 を表す出力を提供するために、前記毛管通路を通過した後の光ビームの光路内に 位置する検出手段とを含んでおり、前記光度は前記通路の長さ方向に沿ったサン プル分離を表すものであることを特徴とする毛管電気泳動装置。