WO2003074060A2 - Combinaison chimiothérapie et antisens de la dna déméthylase - Google Patents

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WO2003074060A2
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Pascal Bigey
Marie-Angès IVANOV
Daniel Scherman
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a combination product comprising an antisense of the gene coding for demethylase MBD2 and at least one agent used in antitumor chemotherapy, in particular bleomycin, for simultaneous, separate or spread over time use for the treatment of proliferative and inflammatory diseases, in particular for the treatment of cancer.
  • DNA methylation is an important epigenetic mechanism that regulates gene expression (1-4).
  • One of the characteristics of cancer cells is an aberrant pattern of methylation (5).
  • Two contradictory changes in the methylation scheme have been previously documented, namely hypermethylation of selected genes (6) and global hypomethylation (7).
  • the DNA methylation machinery consists of DNA methyltransferase (9), demethylases (10), (11) and (12), and methylated DNA binding proteins (MBD) which interpret the signal DNA methylation (13).
  • MBD methylated DNA binding proteins
  • Methylated cytosines are specifically recognized by MBDs (13) and (19-21), which associate with co-depressants such as Sin3A, recruit histone deacetylases for methylated genes (22-26) and can be found in known transcription repression complexes, such as Mi2 (27).
  • Mecp2 which is the best characterized member of the family, is probably not very important in silencing genes during transformation, as it is not expressed in cancer cells (20). Other candidate proteins must be brought into play.
  • a recently characterized methylated DNA binding protein, MBD2 is an interesting candidate for the reasons explained below.
  • MBD2 cDNA was cloned from a cancer cell line cDNA library (28), and has been shown to be expressed in samples and lines breast cancer cells (29).
  • the protein is involved not only in gene suppression by a mechanism analogous to that presented for Mecp2 (24) and (27), but it has also been found to also carry demethylase activity ( 28).
  • Demethylase activity has previously been purified from a non-small human lung cancer cell line A549 (12), and so has transfection of the PI embryo cell line 9 by the proto-oncogenic Ha-Ras leads to an increase in demethylase activity (30). It is not impossible that an increased demethylase activity is associated with tumorigenesis, and that it could be partly responsible for the overall hypomethylation observed in cancer cells (17). Thus, Mbd2 / demethylase could be part of the machinery involved in mediating or interpreting the two contradictory changes associated with the DNA methylation scheme in cancer cells, namely hypermethylation and hypomethylation.
  • Mbd2b / demethylase obtained by recombination expressed in a heterologous SF-9 cell line, exhibits demethylase activity.
  • the co-transfection of Mbd2b / demethylase and methylated plasmids causes demethylation of these plasmids and the forced expression of Mbd2b / demethylase in PANC-1 cells leads to demethylation and induction of the endogenous promoter MUC-2.
  • the present invention provides the elements demonstrating that Mbd2 / demethylase is effectively expressed in cancer cells, and that it is essential for the growth of tumor cells in culture and in vivo.
  • the main advantage of the invention is therefore its surprising effectiveness, since, if we consider the complete cure rate for tumors, it is 10% using genotherapy by electrotransfer of the MBD2 demethylase gene alone, and also 10% with bleomycin chemotherapy alone, and this rate rises to 40% using the combination of the two treatments: geno- and chemotherapy.
  • the present invention relates to a combination product comprising at least one antisense oligonucleotide of the gene coding for demethylase MBD2 and at least one agent used in antitumor chemotherapy for simultaneous, separate or spread over time use intended for the treatment of diseases proliferative and inflammatory.
  • the antisense of the gene coding for demethylase MBD2 comprises at least 15 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1 or of its complementary sequence or of SEQ ID No. 2.
  • SEQ ID NO 1 corresponds to the sequence described in GENEBANK under accession number AF 072242 (Homo sapiens methyl-CpG binding protein MBD2 (MBD2) mRNA, complete cds).
  • sequence SEQ ID No. 2 which corresponds to the whole messenger RNA of demethylase in the antisense orientation: cgcatgcatgcataagcttgctcgagtctagaltttUltUUUtgtctgtgaatataatcarttatttgtctttacagtgatgatggaa gaatgtacaggtgtccccttttcaataaagtataaaaatatgtttatatacagtgaagtcacaataatcrttaactgggaaatitatttt agaattcctgatctgttcttattaaaactgtgggggaaacaaatgtttttacgtaagtgctacatttccagtagattgcacctggcat caaaagcttcatcttagggtc
  • the invention relates to a combination product as mentioned above in which the antisense comprises at least: a) 15 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No 1 or of its complementary sequence or of the sequence SEQ ID No 2, or b) a sequence capable of hybridizing selectively to one of the sequences defined in a).
  • sequence capable of hybridizing selectively is meant the sequences which hybridize with the sequences mentioned above at a level significantly above the background noise.
  • the background noise can be linked to the hybridization of other DNA sequences present, in particular other mRNAs present in the targeted tumor cells.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of selective hybridization and the sequences defined by SEQ ID NO 1 to 2 above is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of l interaction of other DNA sequences generating background noise.
  • the level of interaction can be measured, for example, by labeling the sequence used as a probe with radioactive elements, such as 32 P.
  • Hybridization is generally obtained by using very harsh environmental conditions (for example NaCl 0, 03 M and 0.03 M sodium citrate at about 50 ° C-60 ° C). Hybridization can be carried out according to the usual methods of the prior art (in particular Sambrook & al., 1989, Molecular Cloning: A Labratory Manual).
  • an “agent used in antitumor chemotherapy” one intends to designate antineoplastic agents. Among these agents, we can cite:
  • cytolytics such as dacarbazine, hydroxycarbamide, Pasparaginase, mitoguazone and plicamycin
  • methylating agents such as streptozotocin (2-deoxy-2- (3-methyl-3 nitrosoureido) -D-glucopyranose), procarbazine (N- (l-methylethyl) -4 - [(2- methylhydrazino) methyl] benzamide), dacarbazine or DTIC (5- (3,3-dimethyl-l-triazenyl) -lH-imidazole-4-carboxamide), and Temozolomide (8-carbamoyl-3-methylimidazo [5.1 -d] - 1,2,3,5-tetrazin-4- (3H) -one).
  • chloroethylating agents such as HECNU (l- (2-chloroethyl) -3- (2- hydroxyethyl) -l-nitrosourea), BCNU (l, 3-bis (2-chloroethyl) -l-nitrosourea or carmustine, Bristol -Myers), ACNU (l- (2-chloroethyl) -3- (4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl) methyl-l-nitrosourea), CCNU (l- (2-chloroethyl) -3-cyclohexyl- l- nitrosourea or lomustine), MeCCNU (- (2-chloroethyl) -3- (4- methylcyclohexyl) -l-nitrosourea or semustine), fotemustine (l- [N- (2- chloroethyl) -N-nitrosoureido] ethylphosphonic acid
  • pro-apoptotic agents selected from glucocorticoid derivatives, topoisomerase inhibitors such as topoisomerase 2 inhibitors, for example anthracyclines, epipodophyllotoxin such as etoposide, topoisomerase 1 inhibitors, for example camptothecin derivatives,
  • antifolates for example methotrexate
  • antipurines for example 6-mercaptopurine
  • antipyrimides for example 5-fluorouracil
  • antimitotics such as vinca alkaloids, taxoids such as taxotere,
  • the invention relates to a combination product as defined above, in which the agent is selected from compounds belonging to the bleomycin family, in particular bleomycin.
  • the invention relates to a combination product mentioned above, in which the antisense oligonucleotide of the gene coding for demethylase MBD2 is carried by a vector comprising a promoter allowing its efficient expression in a cell eukaryote.
  • This vector may also include a poly A transcription termination sequence.
  • the vector consists of a plasmid.
  • the use of a plasmid is more economical and safer than the use of viruses.
  • this embodiment of the invention allows re-administration without triggering an immune response.
  • This plasmid advantageously comprises a promoter, the antisense sequence according to the invention and a transcription terminator sequence.
  • the antisense sequence is inserted into the plasmid pcDNA3.1HisA from the company InVitrogen.
  • the product according to the invention may also comprise one or more pharmaceutically acceptable vehicle (s). It is intended in particular for simultaneous, separate or spread over time intended for the treatment of cancer. In this sense, in a preferred mode, the formulations are suitable for administration by intratumoral injection.
  • AD ⁇ is associated with compounds intended to promote its transfection, such as proteins, liposomes, charged lipids or cationic polymers such as polyethylenimine, which are good agents for in vitro transfection (Behr et al. Proc. ⁇ atl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989; Felgner et al. Proc. ⁇ atl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7, 1987; Boussif et al. Proc. Latl. Acad. Sci. USA 92, 7297-301, 1995).
  • compounds intended to promote its transfection such as proteins, liposomes, charged lipids or cationic polymers such as polyethylenimine
  • the antisense can also be transferred in the form of double-stranded DNA or of a plasmid as mentioned above in combination or not with a molecule promoting transfer and / or by using a weak electric field.
  • the invention also extends to any application making it possible to treat cancer, comprising the use of a combination product mentioned above and a third active substance used in the context of the treatment of cancer.
  • the invention covers tri-therapy comprising the administration of the combination product according to the invention and a third active substance.
  • Mbd2 / demethylase is expressed in tumors in vivo and is overexpressed in a significant percentage of tumor in a manner analogous to Dmntl. While our analysis of a limited number of tumors does not prove that Mbd2 / demethylase is generally deregulated in cancer cells, our data are compatible with this model.
  • Mbd2 / demethylase can either repress or demethylate methylated genes, it is possible that a number of genes are affected by either of these processes.
  • the inhibition of the repression, mediated by Mbd2 / demethylase, of the activity of methylated genes could result in the activation of a certain number of tumor suppressors.
  • demethylase activity may be required to inhibit aberrant methylation of genes that are critical for the transformed phenotype. Inhibition of demethylase could lead to ectopic methylation, with critical genes being silenced in a stochastic manner.
  • the inhibition of Mbd2 / demethylase results in repression and in an induction of the expression of the genes involved in the tumor process, but does not present any disadvantage for a therapeutic application.
  • Changes in gene expression after treatment with the Mbd2 / demethylase antisense appear to be limited, but these changes, reinforced by an alkylating agent, are responsible for the strong inhibition of tumorigenesis in vitro.
  • the invention proposes to use Mbd2 / demethylase jointly as an anti-cancer target and a DNA alkylating agent.
  • Mbd2 / demethylase jointly as an anti-cancer target and a DNA alkylating agent.
  • the inhibition of Mbd2 / demethylase could have a therapeutic effect on two levels, one in restoring the normal state of genomic methylation by inhibition of an aberrantly overregulated demethylase, and another, which prevents that become silent poorly methylated tumor suppressor genes, which are essential for maintaining proper regulation of cell growth.
  • Example 1 Combination of gene therapy (intratumoral electrotransfer of plasmids coding for the DNA Demethylase antisense) and chemotherapy (intramuscular injection of bleomycin)
  • mice Two series of experiments were carried out in the nude mouse weighing 18 to 20 g.
  • the mice were implanted mono-laterally with grafts of H 1299 tumors (non-small cell human lung tumors) of approximately 20 mm 3.
  • the tumors have grown to reach a volume of 20 to 150mm3.
  • the mice were anesthetized with a Ketamine, Xylazine mixture.
  • Control tumors a series of tumors did not undergo any treatment.
  • the plasmid solution was injected longitudinally at the periphery of the tumor using a Hamilton syringe.
  • the lateral faces of the tumors were coated with conductive gel and the tumors were placed between 2 flat stainless steel electrodes 0.4 to 0.7 cm apart.
  • the plasmids were electrotransfered using a commercial (square) electric pulse generator (PS 15 Jouan electropulser). Each tumor was subjected to 500V / cm delivered in 8 pulses with a duration of 20 msec at a frequency of 1 Hertz.
  • the tumor volumes were measured individually for each tumor using an electronic caliper with digital display according to the formula (length X width X thickness) / 2.
  • the median of tumor volumes has been plotted as a function of time.
  • Tumors treated with bleomycin alone Twenty five ⁇ g of bleomycin / animal in 50 ⁇ L of 150 mM NaCl were injected bilaterally into the tibialis cranialis muscle and 30 minutes later, each tumor was injected with 80 ⁇ l of 150 mM NaCL and subjected to an electrotransfer. Four other electrotransferts of 80 ⁇ L 150 mM NaCl were then carried out in the tumors on the days indicated by the arrows.
  • Tumors treated with a combination of the 2 treatments Twenty five ⁇ g of bleomycin / animal in 50 ⁇ L of 150 mM NaCl were injected bilaterally into the tibialis cranialis muscle and 30 minutes later, an electrotransfer of 50 ⁇ g of plasmid antisense in 80 ⁇ L 150mM NaCl was produced. Four other electrotransfer of 50 ⁇ g of antisense plasmid in 80 ⁇ L 150 mM NaCl were then carried out in the tumors on the days indicated by the arrows.
  • the tumor volumes were measured individually for each tumor using an electronic caliper with digital display according to the formula (length X width X thickness) / 2.
  • the median of tumor volumes has been plotted as a function of time.
  • cured tumors are tumors that are no longer measurable

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Abstract

La présente invention concerne un produit de combinaison comprenant un oligonucléotide antisens du gène codant pour la déméthylase MBD2 et au moins un agent utilisé en chimiothérapie antitumorale, en particulier la bléomycine, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement des maladies prolifératives et inflammatoires, en particulier pour le traitement du cancer.

Description

Combinaison chimiothérapie et antisens de la DNA déméthylase
La présente invention se rapporte à un produit de combinaison comprenant un antisens du gène codant pour la déméthylase MBD2 et au moins un agent utilisé en chimiothérapie antitumorale, en particulier la bléomycine, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement des maladies prolifératives et inflammatoires, en particulier pour le traitement du cancer.
La méthylation de l'ADN est un mécanisme épigénétique important qui régule l'expression des gènes (1-4). L'une des caractéristiques des cellules cancéreuses réside dans un schéma aberrant de méthylation (5). Deux changements contradictoires du schéma de méthylation ont été antérieurement documentés, à savoir l'hyperméthylation de gènes sélectionnés (6) et l'hypométhylation globale (7).
A l'heure actuelle, on ne sait pas parfaitement quels sont les mécanismes responsables des changements observés dans la méthylation de l'ADN. Il est possible que ces changements soient une conséquence de la dérégulation de l'expression des différents composants de la machinerie de méthylation de l'ADN (8). La machinerie de méthylation de l'ADN est composée d'ADN-méthyltransférase (9), de déméthylases (10), (11) et (12), et de protéines de liaison de l'ADN méthylé (MBD) qui interprètent le signal de méthylation de l'ADN (13). Un certain nombre d'observations étayent l'hypothèse selon laquelle la dérégulation de l'ADN-méthyltransférase d'entretien DNMTl joue un rôle important dans la tumorigenèse (14), (15) et (16). Une question importante est donc de savoir si d'autres composants de la machinerie de méthylation de l'ADN présentent eux aussi un caractère critique pour la transformation cellulaire (8) et (17). Il a été proposé que l'hyperméthylation des gènes suppresseurs de tumeur servirait de mécanisme pour rendre silencieux des gènes critiques, qui inhibent différentes étapes de la tumorigenèse. Cette hyperméthylation aurait pour conséquence de favoriser le processus conduisant à la transformation des cellules (18). Des cytosines méthylées sont spécifiquement reconnues par les MBD (13) et (19-21), qui s'associent à des corépresseurs tels que le Sin3A, recrutent des histone-désacétylases pour des gènes méthylés (22-26) et peuvent être trouvées dans des complexes connus de répression de la transcription, tels que le Mi2 (27).
Le Mecp2, qui est le membre le mieux caractérisé de la famille, n'est probablement pas très important pour ce qui est de rendre les gènes silencieux pendant la transformation, car il n'est pas exprimé dans les cellules cancéreuses (20). D'autres protéines candidates doivent être mises en jeu. Une protéine de liaison de l'ADN méthylé récemment caractérisée, la MBD2, est un candidat intéressant pour les raisons exposées ci-après.
Tout d'abord, l'ADNc de MBD2 a été clone à partir d'une banque d'ADNc d'une lignée de cellules cancéreuses (28), et il s'est avéré qu'il est exprimé dans des échantillons et des lignées cellulaires de cancer du sein (29). Deuxièmement, la protéine est impliquée non seulement dans la suppression du gène par un mécanisme analogue à celui qui est présenté pour le Mecp2 (24) et (27), mais il s'est aussi avéré qu'elle porte également une activité de déméthylase (28).
L'activité de déméthylase a été antérieurement purifiée à partir d'une lignée de cellules humaines non-petites de cancer du poumon A549 (12), et il s'est de même avéré que la transfection de la lignée de cellule d'embryon PI 9 par le Ha-Ras proto-oncogène conduit à une augmentation de l'activité de déméthylase (30). Il n'est pas impossible qu'une activité accrue de déméthylase soit associée à une tumorigenèse, et qu'elle pourrait être en partie responsable de l'hypométhylation globale observée dans les cellules cancéreuses (17). Ainsi, la Mbd2/déméthylase pourrait faire partie de la machinerie impliquée dans la médiation ou l'interprétation des deux changements contradictoires associés au schéma de méthylation de l'ADN dans les cellules cancéreuses, à savoir l'hyperméthylation et l'hypométhylation.
Bien que cette activité de déméthylase a été contestée par certains groupes (24), il a été montré que la Mbd2b/déméthylase obtenue par recombinaison, exprimée dans une lignée cellulaire SF-9 hétérologue, présente une activité de déméthylase. En outre, la co-transfection de la Mbd2b/déméthylase et des plasmides méthylés provoque une déméthylation de ces plasmides et l'expression forcée de la Mbd2b/déméthylase dans les cellules PANC-1 conduit à une déméthylation et à l'induction du promoteur endogène MUC-2.
La présente invention apporte les éléments démontrant que la Mbd2/déméthylase est effectivement exprimée dans les cellules cancéreuses, et qu'elle est essentielle à la croissance de cellules tumorales en culture et in vivo.
Aucune combinaison de génothérapie et de chimiothérapie, consistant à associer un agent utilisé en chimiothérapie antitumorale avec une génothérapie sur la base d'un antisens d'un gène impliqué dans le niveau de méthylation de l'ADN comme celui de la MBD2/déméthylase, n'a été décrite dans l'état de la technique.
Or, en combinant une chimiothérapie utilisant la bléomycine et l' électrotransfert intratumoral d'un plasmide codant pour l'antisens génétique de l'ADN déméthylase humaine MBD2, on obtient un effet synergique puissant dans le traitement des tumeurs. Le principal avantage de l'invention est donc sa surprenante efficacité, puisque, si l'on considère le taux de guérison complète des tumeurs, il est de 10% en utilisant la génothérapie par électrotransfert du gène MBD2 déméthylase seul, et aussi de 10 % avec la chimiothérapie bléomycine seule, et ce taux monte à 40 % en utilisant la combinaison des deux traitements : géno- et chimiothérapie. Description
Ainsi, la présente invention se rapporte à un produit de combinaison comprenant au moins un oligonucleotide antisens du gène codant pour la déméthylase MBD2 et au moins un agent utilisé en chimiothérapie antitumorale pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement des maladies prolifératives et inflammatoires.
Dans un mode de réalisation particulier, l'antisens du gène codant pour la déméthylase MBD2 comprend au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l ou de sa séquence complémentaires ou de la SEQ ID N°2.
La SEQ ID NO 1 correspond à la séquence décrite dans GENEBANK sous le numéro d'accession AF 072242 (Homo sapiens methyl-CpG binding protein MBD2 (MBD2) mRNA, complète cds).
SEQ ID No 1 : gggggcgtggccccgagaaggcggagacaagatggccgcccatagcgcttggaggacctaagaggcggtggccggg gccacgccccgggcaggagggccgctctgtgcgcgcccgctctatgatgcttgcgcgcgtcccccgcgcgccgcgctgc gggcggggcgggtctccgggattccaagggctcggttacggaagaagcgcagcgccggctggggagggggctggatg cgcgcgcacccggggggaggccgctgctgcccggagcaggaggagggggagagtgcggcgggcggcagcggcgct ggcggcgactccgccatagagcaggggggccagggcagcgcgctcgccccgtccccggtgagcggcgtgcgcaggg aaggcgctcggggcggcggccgtggccgggggcggtggaagcaggcgggccggggcggcggcgtctgtggccgtg gccggggccggggccgtggccggggacggggacggggccggggccggggccgcggccgtcccccgagtggcggc agcggccttggcggcgacggcggcggctgcggcggcggcggcagcggtggcggcggcgccccccggcgggagccg gtccctttcccgtcggggagcgcggggccggggcccaggggaccccgggccacggagagcgggaagaggatggattg cccggccctcccccccggatggaagaaggaggaagtgatccgaaaatctgggctaagtgctggcaagagcgatgtctact acttcagtccaagtggtaagaagttcagaagcaagcctcagttggcaaggtacctgggaaatactgttgatctcagcagttttg acttcagaactggaaagatgatgcctagtaaattacagaagaacaaacagagactgcgaaacgatcctctcaatcaaaataa gggtaaaccagacttgaatacaacattgccaattagacaaacagcatcaattttcaaacaaccggtaaccaaagtcacaaatc atcctagtaataaagtgaaatcagacccacaacgaatgaatgaacagccacgtcagcttttctgggagaagaggctacaag gacttagtgcatcagatgtaacagaacaaattataaaaaccatggaactacccaaaggtcttcaaggagrtggtccaggtagc aatgatgagacccttttatctgctgttgccagtgctttgcacacaagctctgcgccaatcacagggcaagtctccgctgctgt ggaaaagaaccctgctgtttggcttaacacatctcaacccctctgcaaagcttttattgtcacagatgaagacatcaggaaaca ggaagagcgagtacagcaagtacgcaagaaattggaagaagcactgatggcagacatcttgtcgcgagctgctgatacag aagagatggatartgaaatggacagtggagatgaagcctaagaatatgatcaggtaactttcgaccgactttccccaagrgaa aattcctagaaattgaacaaaaatgittccactggcτtttgcctgtaagaaaaaaaatgtacccgagcacatagagctttttaata gcactaaccaatgcctttttagatgtatMgatgtatatatctattattcaaaaaatcatgtttattttgagt^ agtcttttgtaatatcaagcaggaccctaagatgaagctgagcttttgatgccaggtgcaatctactggaaatgtagcacttacg taaaacatttgtttcccccacagttttaataagaacagatcaggaattctaaataaatttcccagttaaagattattgtgacttcact gtatataaacatatttttatactttattgaaaggggacacctgtacattcttccatcatcactgtaaagacaaataaatgattatattc acaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Parmi les séquences antisens préférées de l'invention on note plus particulièrement la séquence SEQ ID No 2, qui correspond à l'ARN messager entier de la déméthylase dans l'orientation antisens : cgcatgcatgcataagcttgctcgagtctagaltttUltUUUtgtctgtgaatataatcarttatttgtctttacagtgatgatggaa gaatgtacaggtgtcccctttcaataaagtataaaaatatgtttatatacagtgaagtcacaataatcrttaactgggaaatitattt agaattcctgatctgttcttattaaaactgtgggggaaacaaatgttttacgtaagtgctacatttccagtagattgcacctggcat caaaagctcagcttcatcttagggtcctgcttgatattacaaaagactaattttaagtcctaggactcaaaataaacatgatttttt gaataatagatatatacatcaaaaatacatctaaaaaggcattggttagtgctattaaaaagctctatgtgctcgggtacattttttt tcttacaggcaaaagccagtggaaacatttrtgttcaatttctaggaattttcycttggggaaagtcggtcgaaagttacct atattcttaggcttcatctccactgtccatttcaatatccatctcttctgtatcagcagctcgcgacaagatgtctgccatcagtgct tcttccaatttcttgcgtacttgctgtactcgctcttcctgtttcctgatgtcttcatctgtgacaataaaagctttgcagaggggtt agatgtgttaagccaaacagcagggttcttttccacagcagcggagacttgccctgtgattggcgcagagcttgtgtgcaaag cactggcaacagcagataaaagggtctcatcattgctacctggaccaactccttgaagacctttgggtag^ccatggtttttat aatttgttctgttacatctgatgcactaagtccttgtagcctcttctcccagaaaagctgacgtggctgttcattcattcgttgtggg tctgatttcactttattactaggatgatτtgtgactttggttaccggttgrttgaaaattgatgctgtttgtctaa caagtctggtttacccttattttgattgagaggatcgtttcgcagtctctgtttgttcttctgtaatttactaggcatcatcttt^ ctgaagtcaaaactgctgagatcaacagtatttcccaggtaccttgccaactgaggcttgcttctgaacttcttaccacttggact gaagtagtagacatcgctcttgccagcacttagcccagattttcggatcacttcctccttcttccatccgggggggagggccg ggcaatccatcctcttcccgctctccgtggcccggggtcccctgggccccggccccgcgctccccgacgggaaagggac cggctccgtcgacgcggcc Cette séquence antisens a été utilisée dans le cadre des expériences présentées dans l'exemple 1.
Ainsi, l'invention vise un produit de combinaison tel que mentionné précédemment dans lequel l'antisens comprend au moins : a) 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l ou de sa séquence complémentaire ou de la séquence SEQ ID No 2, ou b) une séquence capable de s'hybrider de manière sélective à l'une des séquences définies en a).
Par « séquence capable de s'hybrider de manière sélective », on entend les séquences qui s'hybrident avec les séquences évoquées ci-dessus à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridation d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ARNm présents dans les cellules tumorales ciblées. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquence définies par les SEQ ID NO 1 à 2 ci-dessus est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple, par marquage de la séquence utilisée comme sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50°C-60°C). L'hybridation peut être effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambrook & al., 1989, Molecular Cloning : A Labratory Manual). Par un « agent utilisé en chimiothérapie antitumorale », on entend désigner des agents antinéoplastiques. Parmi ces agents, on peut citer :
- les composés appartenant à la famille des bléomycines (Mueller et al., Cancer, Vol. 40, p. 2787 (1977), Umezawa et al., Journal of Antibiotics, 19A, p. 210
(1966), US 4.472,304, FR2530639, et US 3,922,262), en particulier la bléomycine,
- les cytolytiques divers tels que la dacarbazine, l'hydroxycarbamide, Pasparaginase, la mitoguazone et la plicamycine,
- les agents méthylants, tels que la streptozotocine (2-deoxy-2-(3-methyl-3- nitrosoureido)-D-glucopyranose), la procarbazine (N-(l-methylethyl)-4-[(2- methylhydrazino)methyl]benzamide), la dacarbazine ou DTIC (5-(3,3- dimethyl-l-triazenyl)-lH-imidazole-4-carboxamide), et la Temozolomide (8- carbamoyl-3-methylimidazo[5.1 -d]-l ,2,3,5-tetrazin-4-(3H)-one).
- les agents chloroethylants, tels que HECNU (l-(2-chloroethyl)-3-(2- hydroxyethyl)-l-nitrosourea), BCNU (l,3-bis(2-chloroethyl)-l-nitrosourea ou carmustine, Bristol-Myers), ACNU (l-(2-chloroethyl)-3-(4-amino-2-methyl-5- pyrimidinyl)methyl-l-nitrosourea), CCNU (l-(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-l- nitrosourea ou lomustine), MeCCNU (-(2-chloroethyl)-3-(4- methylcyclohexyl)-l-nitrosourea ou semustine), la fotemustine (l-[N-(2- chloroethyl)-N-nitrosoureido]ethylphosphonic acid diethyl ester) et la clomesone (2-chloroethylmethylsulfonylmethanesulfonate) (Pegg et al., Prog.
Nucleic Acid Research Molec. Biol. 51 : 167-223 (1995)). Ces agents sont davantage décrits dans Colvin and Chabner. Alkylating Agents. In: Cancer.
- d'autres composés alkylants tels que les agents du type Ecteinascidin 743, les duocarmycines (Boger et al. J. Org. Chem. 1990, 55, 4499; Boger et al. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 8961; Boger et al. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 6645; Boger et al. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 9872; Boger et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1992, 2, 759).
- les agents pro-apoptotiques sélectionnés parmi les dérivés des glucocorticoïdes, les inhibiteurs des topoisomérases tels que les inhibiteurs de la topoisomérase 2, par exemple les anthracyclines, l'epipodophyllotoxine tel que l'étoposide, les inhibiteurs de la topoisomérase 1, par exemple les dérivés de la camptothecine,
- les antimétabolites tels que les antifolates, par exemple le méthotrexate, les antipurines, par exemple la 6-mercaptopurine, les antipyrimidiques, par exemple la 5-fluorouracile,
- parmi les antimitotiques tels que les vinca-alcaloïdes, les taxoïdes tel que le taxotere,
Ces agents antinéoplastiques sont décrits dans Actualité Pharmaceutiques n°302 (Oct 1992) pages 38 à 39 et 41 à 43.
Dans un aspect préféré, l'invention vise un produit de combinaison tel que défini ci- dessus, dans lequel l'agent est sélectionné parmi les composés appartenant à la famille des bléomycines, en particulier la bléomycine.
Dans un autre mode particulier de réalisation, l'invention porte sur un produit de combinaison mentionné ci-dessus, dans lequel l 'oligonucleotide antisens du gène codant pour la déméthylase MBD2 est porté par un vecteur comportant un promoteur permettant son expression efficace dans une cellule eucaryote. Ce vecteur peut également comporter une séquence poly A de terminaison de transcription. De préférence, le vecteur consiste en un plasmide. En effet, l'utilisation d'un plasmide est plus économique et plus sûr que l'utilisation des virus. De plus, ce mode de réalisation de l'invention permet la réadministration sans déclencher de réponse immunitaire. Ce plasmide comprend avantageusement un promoteur, la séquence antisens selon l'invention et une séquence terminateur de la transcription. De préférence, la séquence de l'antisens est insérée dans le plasmide pcDNA3.1HisA de la compagnie InVitrogen.
Le produit selon l'invention peut comporter en outre un ou plusieurs véhicule(s) pharmaceutiquement acceptable(s). Il est destiné en particulier pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement du cancer. En ce sens, dans un mode préféré, les formulations sont adaptées à une administration par injection intratumorale.
Les techniques permettant le transfert du plasmide dans les cellules cibles sont bien connues de l'homme du métier. En particulier, on se référera aux techniques d'électrotransfert dans les cellules eucaryotes décrites dans WO 99/01157 et Bettan et al, Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 2000, 52 :83-90. Dans WO 99/01157, une méthode pour transfert in vivo des acides nucléiques est proposée en utilisant des champs électriques faibles compris entre 1 et 600 N/cm. D'autres approches sont décrites dans Wolf et al. Science 247, 1465-68, 1990 ; Davis et al. Proc. Νatl. Acad. Sci. USA 93, 7213-18, 1996) dans lesquelles l'ADΝ est associé à des composés destinés à favoriser sa transfection, comme des protéines, des liposomes, des lipides chargés ou des polymères cationiques tels que le polyéthylènimine, qui sont de bons agents de transfection in vitro (Behr et al. Proc. Νatl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989 ; Felgner et al. Proc. Νatl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7, 1987 ; Boussif et al. Proc. Νatl. Acad. Sci. USA 92, 7297-301, 1995).
Ainsi, conformément à l'invention, l'antisens peut également être transféré sous la forme d'ADN double brin ou d'un plasmide tel que mentionné ci-dessus en association ou non avec une molécule favorisant le transfert et/ou en utilisant un faible champs électrique.
L'invention s'étend également à toute application permettant de traiter le cancer comprenant l'utilisation d'un produit de combinaison mentionné ci-dessus et une troisième substance active utilisée dans le cadre du traitement du cancer. A ce titre, l'invention couvre la tri-thérapie comportant l'administration du produit de combinaison selon l'invention et une troisième substance active.
La Mbd2/déméthylase est exprimée dans des tumeurs in vivo et est surexprimée dans un pourcentage significatif de tumeur d'une manière analogue à Dmntl. Alors que notre analyse d'un nombre limité de tumeurs ne prouve pas que la Mbd2/déméthylase est généralement dérégulée les cellules cancéreuses, nos données sont compatibles avec ce modèle. Deuxièmement, nous montrons que l'inhibition médiée antisens de la Mbd2/déméthy-lase conduit à des changements de la méthylation génomique et à une inhibition de la tumorigenèse in vitro. Différentes méthodes d'expression d'antisens ont été utilisées pour exclure la possibilité que les changements observés reflètent une certaine propriété idiosyncrasique du vecteur. Une expression transitoire de l'antisens est suffisante pour inhiber la croissance inhibée par un ancrage et un contact, ce qui indique que la Mbd2/démé-thylase est nécessaire pour le maintien de l'état transformé, et que son inhibition a des effets immédiats sur la croissance des cellules cancéreuses.
De même, l'introduction d'un vecteur exprimant l'antisens de la Mbd2/ déméthylase dans des tumeurs humaines que l'on a fait passer sous forme de xénogreffes chez des souris nues a provoqué une réduction de la croissance de la tumeur, ce qui montre que la Mbd2/ déméthylase est nécessaire pour le maintien de l'état transformé. Alors que l'expression de l'antisens de la Mbd2/déméthylase inhibe considérablement la tumorigenèse in vitro, elle a un effet limité sur les tumeurs in vivo. Cela pourrait refléter la difficulté qu'il y a à délivrer et exprimer d'une manière efficace les vecteurs antisens dans toutes les cellules d'une tumeur in vivo, plutôt qu'une indication de l'impact limité de l'inhibition de la cible.
Comme la Mbd2/ déméthylase peut soit réprimer, soit déméthyler les gènes méthylés, il est possible qu'un certain nombre de gènes soit affecté par l'un ou l'autre de ces processus. L'inhibition de la répression, médiée par la Mbd2/déméthylase, de l'activité de gènes méthylés pourrait se traduire par une activation d'un certain nombre de suppresseurs tumoraux. Par ailleurs, l'activité de déméthylase pourrait être requise pour inhiber une méthylation aberrante des gènes qui sont critiques pour le phénotype transformé. Une inhibition de la déméthylase pourrait conduire à une méthylation ectopique, des gènes critiques étant rendus silencieux d'une manière stochastique.
Comme les deux activités de Mbd2/déméthylase doivent affecter une large gamme de gènes, un résultat possible pourrait avoir été un effondrement du programme d'expression des gènes. Une telle possibilité devrait avoir limité le potentiel thérapeutique de l'inhibition de la Mbd2/déméthylase. Cependant, l'analyse du schéma génique des cellules dans lesquelles la Mbd2/déméthylase est inhiber n'étaye pas cette hypothèse.
Ainsi, l'inhibition de la Mbd2/ déméthylase se traduit par une répression et par une induction de l'expression des gènes impliqués dans le processus tumorales, mais ne présente pas d'inconvénient pour une application thérapeutique. Des changements de l'expression des gènes après traitement par l'antisens de Mbd2/déméthylase apparaissent limités, or ces changements, renforcés par un agent alkylant, sont responsables de la forte inhibition de la tumorigenèse in vitro.
Ainsi, l'invention propose d'utiliser conjointement la Mbd2/déméthylase comme cible anti-cancéreuse et un agent alkylant de l'ADN. Le fait que le cycle cellulaire des cellules normales ne soit pas affecté par ce traitement, et le fait que ce traitement ne provoque pas de changements massifs de l'expression des gènes, augmentent l'intérêt de cette cible. L'inhibition de la Mbd2/déméthylase pourrait avoir un effet thérapeutique à deux niveaux, l'un dans le rétablissement de l'état normal de méthylation génomique par inhibition d'une déméthylase à surrégulation aberrante, et un autre, qui empêche que deviennent silencieux des gènes suppresseurs de tumeur mal méthylés, qui sont essentiels au maintien d'une régulation appropriée de la croissance cellulaire.
Exemple 1 : Combinaison de thérapie génique (électrotransfert intratumoral de plasmides codant pour l'antisens de la DNA Déméthylase) et de chimiothérapie (injection intramusculaire de bléomycine)
Deux séries d'expérience ont été réalisées chez la souris nude de 18 à 20g. Les souris ont été implantées mono-latéral ement avec des greffons de tumeurs H 1299 (tumeurs pulmonaires humaines non à petites cellules) d'environ 20mm3. Les tumeurs se sont développées pour atteindre un volume de 20 à 150mm3. Les souris ont été triées en fonction de la taille des tumeurs et réparties en lots homogènes atteignant des volumes tumoraux de 50 à 80mm3 (n=10 à 13). Les souris ont été anesthésiées avec un mélange Kétamine, Xylazine.
1.1 Expérience 1 : Effet sur la croissance tumorale
Les résultats sont illustrés à la figure 1 et l'analyse statistique est présentée à la table 1 ci-dessous.
TABLE 1
ANALYSE STATISTIQUE Expérience 1
Figure imgf000013_0001
1.1.1 Tumeurs contrôles : une série de tumeurs n'a subi aucun traitement.
1.1.2 Tumeurs traitées avec le gène codant pour l'antisens de la DNA Déméthylase seul :
Cinq électrotransferts de 50μg de plasmide dans 80μL NaCl 150mM ont été réalisés dans les tumeurs aux jours indiqués par les flèches. La solution de plasmide a été injectée longitudinalement en périphérie de la tumeur à l'aide d'une seringue Hamilton. Les faces latérales des tumeurs ont été enduites de gel conducteur et les tumeurs ont été placées entre 2 électrodes plates en acier inoxydable distantes de 0.4 à 0.7 cm. Vingt à 30 sec après l'injection, les plasmides ont été électrotransférés en utilisant un générateur d'impulsions électriques (carrées) du commerce (Electropulsateur PS 15 Jouan) . Chaque tumeur a été soumise à 500V/cm délivrés en 8 puises d'une durée de 20msec à une fréquence de 1 Hertz .
1.1.3 Tumeurs traitées à la bléomycine seule :
Vingt-cinq μg de bléomycine/animal dans 50μL de NaCl 150mM ont été injectés en bilatéral dans le muscle tibialis cranialis et 30 minutes après, chaque tumeur a été soumise à 1 électrotransfert comme explicité ci-dessus.
1.1.4 Tumeurs traitées avec une combinaison des 2 traitements (antisens et bléomycine) :
Vingt-cinq μg de bléomycine/animal dans 50μL de NaCl 150mM ont été injectés en bilatéral dans le muscle tibialis cranialis et 30 minutes après, 50μg de plasmide antisens dans 80μL NaCl 150mM ont été injectés et électrotransférés. Quatre autres électrotransferts de 50μg de plasmide antisens dans 80μL NaCl 150mM ont ensuite été réalisés dans les tumeurs aux jours indiqués par les flèches.
Les volumes tumoraux ont été mesurés individuellement pour chaque tumeur à l'aide d'un pied à coulisse électronique à affichage digital suivant la formule (longueur X largeur X épaisseur )/2. La médiane des volumes tumoraux a été reportée en graphique, en fonction du temps.
1.2 Expérience 2 : Effet sur la croissance tumorale
10
Les résultats sont illustrés à la figure 2 et l'analyse statistique est présentée à la table 2 ci-dessous.
TABLE 2
ANALYSE STATISTIQUE Expérience 2
Figure imgf000015_0001
# nombre de jours pour atteindre 1000 mm3 volume tumoral
5 1.2.1 Tumeurs contrôles : Cinq électrotransferts de 80μL NaCl 150mM ont été réalisés dans les tumeurs aux jours indiqués par les flèches.
1.2.2 Tumeurs traitées avec le gène codant pour l'antisens de la DNA Déméthylase seul : Cinquante μL de NaCl 150mM ont été injectés en bilatéral dans le muscle 0 tibialis cranialis et 30 minutes après, un électrotransfert de 50μg de plasmide antisens dans 80μL NaCl 150mM a été réalisé. Quatre autres électrotransfert de 50μg de plasmide antisens dans 80μL NaCl 150mM ont ensuite été réalisés dans les tumeurs aux jours indiqués par les flèches.
1.2.3 Tumeurs traitées à la bléomycine seule : Vingt cinq μg de bléomycine/animal dans 50μL de NaCl 150mM ont été injectés en bilatéral dans le muscle tibialis cranialis et 30 minutes après, chaque tumeur a été injectée avec 80μl de NaCL 150mM et soumise à un électrotransfert. Quatre autres électrotransferts de 80μL NaCl 150mM ont ensuite été réalisés dans les tumeurs aux jours indiqués par les flèches.
1.2.4 Tumeurs traitées avec une combinaison des 2 traitements (antisens et bléomycine) : Vingt cinq μg de bléomycine/animal dans 50μL de NaCl 150mM ont été injectés en bilatéral dans le muscle tibialis cranialis et 30 minutes après, un électrotransfert de 50μg de plasmide antisens dans 80μL NaCl 150mM a été réalisé. Quatre autres électrotransfert de 50μg de plasmide antisens dans 80μL NaCl 150mM ont ensuite été réalisés dans les tumeurs aux jours indiqués par les flèches.
Les volumes tumoraux ont été mesurés individuellement pour chaque tumeur à l'aide d'un pied à coulisse électronique à affichage digital suivant la formule (longueur X largeur X épaisseur )/2.
La médiane des volumes tumoraux a été reportée en graphique, en fonction du temps.
1.3 Résultats et conclusion
La combinaison de thérapie génique avec le gène codant pour l'antisens de la DNA Déméthylase humaine et de chimiothérapie à la bléomycine permet d'induire un délai cumulé de 31 à 38 jours dans la croissance des tumeurs H1299. Un tel délai de croissance tumoral n'a jamais été atteint par les traitements administrés isolément tels que la thérapie génique seule (15 à 18 jours) ou la chimiothérapie seule. (17 à 30 jours) (Table 3 ci-dessous). TABLE 3
Combinaison de la thérapie génique et de la chimiothérapie
Effect de multiple electrotransferts intratumoraux de plasmides codant pour l'antisens de la DNA Déméthylase humaine associés avec un traitement à la bléomycine, sur la croissance des tumeurs H1299 a) Délais de croissance tumorale
Figure imgf000017_0001
J1000* = nombre de jours nécessaires pour atteindre un volume tumoral de 1000mm
La combinaison de la thérapie génique et de la chimiothérapie induit un effet synergique sur la guérison des tumeurs puisque 30 à 40% des guérisons de tumeurs ont été obtenues avec le traitement combiné, comparativement à 10% seulement avec les traitements administrés isolément. (Table 4 ci-dessous).
TABLE 4
Combinaison de thérapie génique et de chimiothérapie b) Guérison de tumeurs
Figure imgf000017_0002
Rem: les tumeurs guéries sont des tumeurs qui ne sont plus mesurables
Jx: absence de tumeurs jusqu'au jour indiqué au delà duquel la souris est décêdée REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Produit de combinaison comprenant au moins un oligonucleotide antisens du gène codant pour la déméthylase MBD2 et au moins un agent utilisé en chimiothérapie antitumorale pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement des maladies prolifératives et inflammatoires.
2. Produit de combinaison selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antisens du gène codant pour la déméthylase MBD2 comprend au moins : a) 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l ou de sa séquence complémentaire ou de la séquence SEQ ID No 2, ou b) une séquence capable de s'hybrider de manière sélective à l'une des séquences définies en a).
3. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'agent utilisé en chimiothérapie antitumorale est sélectionné parmi les composés appartenant à la famille des bléomycines, en particulier la bléomycine.
4. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'agent utilisé en chimiothérapie antitumorale est sélectionné parmi les agents antinéoplastiques capables de méthyler l'ADN, notamment parmi les agents méthylants, tels que la streptozotocine, la procarbazine, la dacarbazine et la Temozolomide.
5. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'agent utilisé en chimiothérapie antitumorale est sélectionné parmi les agents chloroéthylants, les agents chloroethylants, notamment : 1 -(2-chloroethyl)-3-(2-hydroxyethyl)-l -nitrosourea, 1 ,3-bis(2-chloroethyl)- 1 -nitrosourea,
1 -(2-chloroethyl)-3 -(4-amino-2-methyl-5 -pyrimidinyl)methyl- 1 -nitrosourea, 1 -(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-l -nitrosourea, 1 -(2-chloroethyl)-3 -(4-methylcyclohexyl)- 1 -nitrosourea, l-[N-(2-chloroethyl)-N-nitrosoureido]ethylphosphonic acid diethyl ester, 2-chloroethylmethylsulfonylmethanesulfonate.
6. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'agent utilisé en chimiothérapie antitumorale est sélectionné parmi : - les cytolytiques divers tels que la dacarbazine, l'hydroxycarbamide, l'asparaginase, la mitoguazone et la plicamycine,
- les agents pro-apoptotiques sélectionnés parmi les dérivés des glucocorticoïdes, les inhibiteurs des topoisomérases tels que les inhibiteurs de la topoisomérase 2, par exemple les anthracyclines, Fepipodophyllotoxine tel que l'étoposide, les inhibiteurs de la topoisomérase 1, par exemple les dérivés de la camptothecine,
- les antimétabolites tels que les antifolates, par exemple le méthotrexate, les antipurines, par exemple la 6-mercaptopurine, les antipyrimidiques, par exemple la 5-fluorouracile,
- parmi les antimitotiques tels que les vinca-alcaloïdes, les taxoïdes tel que le taxotere,
7. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l' oligonucleotide antisens du gène codant pour la déméthylase MBD2 est porté par vecteur comportant un promoteur permettant son expression efficace dans une cellule eucaryote.
8. Produit de combinaison selon l'une des revendications 7, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence poly A de terminaison de transcription.
9. Produit de combinaison selon la revendication 7, caractérisé en ce que le vecteur consiste en un plasmide.
10. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l' oligonucleotide antisens est un ADN double brin.
11. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un ou plusieurs éléments favorisant le transfert de l' oligonucleotide antisens dans les cellules cibles.
12. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l' oligonucleotide antisens est adapté à une administration in vivo par électro transfert, de préférence en utilisant des champs électriques faibles compris entre 1 et 600 V/cm.
13. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un ou plusieurs véhicule(s) pharmaceutiquement acceptable(s).
14. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 13, particulier pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement du cancer.
15. Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il est adapté à une administration par injection intratumorale.
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