WO2003073464A1 - Massenspektrometrisches verfahren zur analyse von substanzgemischen - Google Patents

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WO2003073464A1
WO2003073464A1 PCT/EP2003/001274 EP0301274W WO03073464A1 WO 2003073464 A1 WO2003073464 A1 WO 2003073464A1 EP 0301274 W EP0301274 W EP 0301274W WO 03073464 A1 WO03073464 A1 WO 03073464A1
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mass
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quadrupole
analysis
substances
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PCT/EP2003/001274
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Tilmann B. Walk
Martin Dostler
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Metanomics Gmbh & Co. Kgaa
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    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/004—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn
    • H01J49/0045—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn characterised by the fragmentation or other specific reaction
    • H01J49/005—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn characterised by the fragmentation or other specific reaction by collision with gas, e.g. by introducing gas or by accelerating ions with an electric field
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    • H01J49/4205—Device types
    • H01J49/421—Mass filters, i.e. deviating unwanted ions without trapping

Definitions

  • the present invention relates to a mass spectrometric method for analyzing substance mixtures using a triple quadrupole mass spectrometer.
  • the samples can be used for the aforementioned analyzes and individual substances in selected samples can be identified and quantified.
  • HTS high-throughput screening
  • the advantage of very precise methods such as NMR or IR spectroscopy is that they provide information about both the structure and, if appropriate, the quantity of a substance.
  • High molecular weight materials such as coal tar, humic acid, fulvic acid or kerogens can also be analyzed (Zenobie and Knochenmuss, Mass Spec. Rev., 1998, 17, 337 - 366). Both the identity and the structure of substances can be determined, although the structural analysis is not always clear, so that it has to be confirmed using other methods, for example NMR.
  • G. Hopfgartner and F. Vilbois describe a method for screening with the aid of LC / MS of metabolites of structurally known compounds which are formed in vitro or in vivo and which are known as Active ingredients are in different phases of drug development. This process takes place in two steps. In the first search step, interesting ions are detected in a rapid "fill scan mode", which can be considered as candidates for further investigations. men. These can be ions which correspond to ions of particularly high intensity or can be considered as candidates for possible degradation products or metabolites of the active ingredients. These ions are used in a second scan to identify the chemical structure of these ions or compounds after fragmentation in a collision chamber of the mass spectrometer.
  • the collision chamber constantly contains collision gas in order to enable a rapid elucidation of the ion or metabolite structure.
  • a disadvantage of the structure determination is that a known mass of a precursor ion, a fragment or an ion adduct is required.
  • the starting structure of the substance to be investigated for HPLC / MS should advantageously be known in these experiments. Since HPLC / MS alone is not suitable for the absolute structure determination. However, if the structure of the parent compound is known, statements can be made about the structure of any metabolites. Since the structure of the substance to be developed as an active ingredient is known, statements about the structure of the unknown metabolites of the active ingredient can be made with some certainty. However, the statement is made more difficult or prevented by possible superimposition of compounds of the same mass other than impurities. A quantification of the compounds is not possible with this method.
  • steps (a) to (c) and step (d) can also be carried out in the reverse order.
  • Substance mixtures in the sense of the invention are in principle all mixtures which contain more than one substance, for example complex reaction mixtures of chemical syntheses such as synthesis products from combinatorial chemistry or mixtures of substances of biological origin such as fermentation broths of an aerobic or anaerobic fermentation, body fluids such as blood, lymph, Urine or stool, reaction products a biotechnological synthesis with one or more free or bound enzymes, extracts of animal material such as extracts from various organs or tissues or plant extracts such as extracts of the entire plant or individual organs such as roots, stems, leaves, flowers or seeds or their mixtures.
  • Mixtures of substances of biological origin, such as extracts of animal or vegetable origin, advantageously of vegetable origin are advantageously analyzed in this method.
  • the mass spectrometers that can be used in the method usually consist of a sample inlet system, an ionization chamber, an interface, ion optics, one or more mass filters and a detector.
  • ion sources known to the person skilled in the art can be used to generate ions in the process.
  • these ion sources are coupled via a so-called interface to the following components of the mass spectrometer, for example the ion optics, the mass filter (s) or the detector.
  • Interposing an interface has the advantage that the analysis can be carried out without delay.
  • the ion source cannot volatile and / or volatile, preferably non-volatile substances are brought directly into the gas phase.
  • pre-purifications of substance mixtures can also be carried out via an advantageous chromatographic separation, which have material flows of different widths in the analysis, since these material flows can be processed via the interface.
  • the samples to be analyzed or the substances contained therein can also be enriched as a result.
  • a wide range of solvents can be processed with the least loss of sample.
  • EI electron impact ionization
  • CI chemical ionization
  • Typical reactant gases are, for example, methane, isobutane, ammonium, argon or hydrogen.
  • the substance mixtures are vibrationally excited by incident energy-rich particles (radioactive decay, UV, IR photons, Ar + or Cs + ions, laser beams) in a collision cascade and thereby ionized.
  • incident energy-rich particles radioactive decay, UV, IR photons, Ar + or Cs + ions, laser beams
  • Electrospray ionization is a very gentle method. Ions are continuously formed at ESI. This continuous ion formation has the advantage that it can be easily connected to almost any type of analyzer and that it can be easily combined with a chromatographic see separation such as separation via capillary electrophoresis (CE), liquid chromatography (LC) or high pressure liquid chromatography (HPLC), since it has a good tolerance for high flow rates up to 2 ml / min eluate.
  • CE capillary electrophoresis
  • LC liquid chromatography
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • the spraying of the eluent is pneumatically supported by a so-called nebulizing gas, for example nitrogen.
  • the gas is blown out of a capillary under a pressure of up to 4 bar, advantageously up to 2 bar, which encloses the inlet capillary of the eluent.
  • so-called normal phase e.g. silica gel, aluminum oxide, aminodeoxyhexite, aminodeoxy-d-glucose, triethylenetetramine, polyethylene oxide or aminodicarboxy columns
  • / or reversed-phase columns are preferably reversed-phase columns
  • Columns such as columns with a C 4 Cg or Cis stationary phase are preferred.
  • the electrospray technique leads to the (quasi) molecular ion due to the extremely gentle ionization. These are usually adducts with ions already present in the sample solution (eg protons, alkali and / or ammonium ions). Another advantage is that multiply charged ions can also be detected, so that ions with a molecular weight of up to a hundred thousand daltons can be detected. In the method according to the invention, molecular weights in a range from 1 to 10,000 daltons, preferably in a range, can advantageously be detected from 50 to 8000 daltons, particularly preferably in a range from 100 to 4000 daltons. Ion spray ionization, atmospheric pressure ionization (APCI) or thermoset ionization may be mentioned as further exemplary methods.
  • APCI atmospheric pressure ionization
  • thermoset ionization may be mentioned as further exemplary methods.
  • the ionization process takes place under atmospheric pressure and is essentially divided into three phases:
  • the solution to be analyzed is in a strong electrostatic field, which is advantageous by generating a potential difference of 2-10 kV, 2-6 kV , is generated between the inlet capillary and a counter electrode.
  • An electrical field between the inlet capillary tip and the mass spectrometer penetrates the analyte solution and separates the ions in an electrical field.
  • Positive ions are drawn to the surface of the liquid in the so-called positive mode, negative ions in the opposite direction or vice versa in measurements in the so-called positive mode.
  • the positive ions accumulated on the surface are then pulled further towards the cathode.
  • An aerosol is formed, which consists of analyte and solvent.
  • the desolvation of the drops formed takes place in the following stage, which leads to the successive reduction in the drop size.
  • the evaporation of the solvent is controlled by thermal action, e.g. by supplying hot inert gas. Evaporation in conjunction with the electrostatic forces increases the charge density on the surface of the sprayed substance mixture droplets. If the charge density or its charge repulsion forces then exceeds the surface tension of the droplets (so-called Raleigh limit), these droplets explode (Coulomb explosion) into smaller partial droplets. This process "solvent evaporation / Coulomb explosion” is repeated several times until the ions finally pass into the gas phase. To good ones
  • the gas flow in the interface, the heating temperature applied, the flow rate of the heating gas, the pressure of the nebulizing gas and the capillary voltage must be precisely monitored and controlled.
  • the different ionization processes can be used to generate single or multiple charged ions.
  • ES electrospray
  • APCI atmospheric pressure chemical ionization
  • the ionization takes place in a so-called coronna discharge.
  • the thermospray or electrospray method is preferred, and the electrospray method is particularly preferred.
  • the ionization space is connected to the following mass spectrometer via an interface, that is to say via a micro-opening (100 ⁇ m).
  • curtain gas for example nitrogen
  • curtain gas for example nitrogen
  • the nitrogen collides with the ions generated, for example, by electrospray, which were generated in the substance mixture.
  • Blowing in the curtain gas advantageously prevents neutral particles from being sucked into the high vacuum of the subsequent mass spectrometer. Furthermore, the desolvation of the ions is supported by the curtain gas.
  • the method according to the invention can be carried out with all quadrupole mass spectrometers known to the person skilled in the art, such as the triple quadrupole mass spectrometers.
  • Triple quadrupole instruments are the standard instruments for low-energy collision activation studies.
  • These devices usually consist of a first quadrupole, which is suitable for analyzing the mass / charge quotient (m / z) of the ions contained in the substance mixture after ionization in high vacuum (approx. 10 ⁇ 5 Torr), the mass ( n) individual ions, several or all ions can be measured.
  • so-called "cones" lenses or lens systems can also be used to focus and introduce the ions into the first analytical quadrupole. Combinations of quadrupoles and cones can also be implemented and used.
  • the ions are advantageously fragmented in it by applying a fragmentation voltage.
  • ionization potentials in the range of 5-11 electron volts (eV), preferably 8-11 electron volts (eV), are applied.
  • Q2 is also filled with a collision gas such as a noble gas such as argon or helium or another gas such as CO or nitrogen or mixtures of these gases such as argon / helium or argon / nitrogen for the fragmentation in the process according to the invention.
  • Argon and / or nitrogen is preferred for reasons of cost.
  • the collision gas is present in the process according to the invention with a pressure of 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -1 Torr, preferably 10 ⁇ 2 . Nitrogen is particularly preferred. Even without the application of a fragmentation voltage, the ions in the collision chamber may be fragmented in the presence of a collision gas. Between the qua- drupol Q1 and Q2 may have additional quadrupoles or cones for guiding the ions.
  • this Q3 either the m / z quotients of individually selected fragments, several or all of the m / z quotients present in the substance mixtures after ionization (for the sake of simplicity referred to as mass or masses in this application) can be determined 10. Additional quadrupoles or cones can also be present between the quadrupole Q2 and Q3 to direct the ions.
  • Collection of ions can also be operated as ion traps
  • the ions generated can be held or directed. They usually consist of 4, 6 or 8 rods or rods with the help of which an oscillating electric field is generated, with opposite rods being electrically connected.
  • the designations quadrupole the designations hexa-
  • the mass of at least one ion present in the substance mixture after ionization in Ql is analyzed and selected.
  • This selected ion is then fragmented in Q2 in the presence of collision gas and a fragmentation voltage and then one of the fragment ions formed is identified in a further analytical quadrupole Q3 and advantageously also quantified.
  • the fragment ion to be analyzed is selected in such a way that this ion is advantageous has a high intensity, an easily identifiable characteristic mass and, in an advantageous embodiment of the method, enables easy quantification.
  • process step (d) the masses of all ions present in the substance mixture after ionization are analyzed, the quadrupole Q2 used as the collision chamber being always filled with collision gas, but in process step (d) no fragmentation voltage being present at Q2.
  • this analysis can be carried out both with Q1 and with Q3, but it is more advantageous to carry out the analysis with Q3, since Q2 lies between Q1 and the quadrupole Q2 used as a collision chamber as a collision chamber. If a fragmentation occurs in Q2 despite the absence of a fragmentation voltage, this has no influence on a possible detection of the ion masses at the detector. In the case of a mass analysis with Q1, such a question in Q2 would lead to incorrect conclusions in the detection. Mass detection with Q3 is therefore preferred because possible sources of error are eliminated or are negligible.
  • FIG. 1 shows the sequence of the method according to the invention.
  • process steps (b) to (d) and (e) are advantageously carried out at least once within 0.1 to 10 seconds, preferably at least once within 0.2 to 6 seconds, particularly preferably within 0.2 to 2 Seconds, very particularly preferably at least once within 0.3 to less than 2 seconds.
  • the process steps are carried out two to three times, preferably three times, within 0.2 to 6 seconds.
  • the quadrupole Q2 which acts as a collision chamber, is constantly filled with collision gas in order to enable measurements of this type which follow one another rapidly and quickly. As our own measurements showed, this has no negative impact on the reproducibility of the measurements.
  • At least 20 m / z quotients, preferably at least 40 m / z quotients, particularly preferably at least 60 m / z quotients, very particularly preferably at least 80 m / z quotients, are advantageous different ions or more identified and / or quantified.
  • chromatographic methods Purification by methods known to those skilled in the art, such as chromatographic methods, is, however, advantageous.
  • a purification and / or pre-purification of the substance mixtures can be coupled very easily to the mass spectrometric analysis, for example by means of chromatography.
  • All separation methods known to the person skilled in the art, such as LC, HPLC or capillary electrophoresis, can be used as the chromatographic method. Separation methods based on adsorption, gel permeation, ion pair, ion exchange, exclusion, affinity, normal phase or reversed phase chromatography, to name just a few, can be used.
  • Chromatographs based on normal phase and / or reversed phase, preferably reversed-phase columns with different hydrophobic modified materials such as C 4 -, Cs ⁇ or C ⁇ s ⁇ phases are advantageously used.
  • a coupling of purification methods is advantageous from chromatography methods with a flow rate of the eluent (analyte + solvent) advantageously between 1 ⁇ l / min to 2000 ⁇ l / min, preferably between 5 ⁇ l / min to 600 ⁇ l / min, particularly preferably between 10 ⁇ l / min up to 500 ⁇ l / min possible, for example.
  • a flow rate of the eluent analyte + solvent
  • protic or aprotic polar or non-polar solvents can be used as solvents for the purification process, which can be used with the subsequent analysis. are compatible.
  • Suitable solvents are, for example, solvents that carry little or no charges, such as aprotic apolar solvents, which have a low dielectric constant (E ⁇ ⁇ 15), low dipole moments ( ⁇ ⁇ 2.5D) and low E T N values (0.0 - 0.5) are characterized.
  • Dipolar organic solvents or mixtures thereof are also suitable as solvents for the process according to the invention.
  • suitable solvents are methanol, ethanol, acetonitrile, ether and heptane.
  • Weak acidic solvents such as 0.01-0.1% formic acid, acetic acid or trifluoroacetic acid are also suitable.
  • Weakly basic solvents such as 0.01-0.1% triethylamine or ammonia are also suitable.
  • Strongly acidic or strongly basic solvents such as 5% HCL or 5% triethylamine are also suitable in principle as solvents. Mixtures of the abovementioned solvents are also advantageous.
  • the buffers customary in biochemistry are also suitable as solvents, advantageously buffers ⁇ 200 mM, preferably ⁇ 100 mM, particularly preferably ⁇ 50 mM, very particularly preferably ⁇ 20 mM. It is also advantageous, if buffers> 100 mM are used for the preparation of the substance mixture, that the buffers are completely or partially removed, for example by dialysis. Acetate, formate, phosphate, tris, MOPS, HEPES or mixtures thereof may be mentioned as buffers. High buffers and / or salt concentrations negatively influence the ionization processes and should be avoided if necessary.
  • the substance mixtures for the method according to the invention which are otherwise only poorly or not at all detectable, can be derivatized before the analysis and thus ultimately analyzed.
  • Derivatization is particularly advantageous in cases in which hydrophilic groups are introduced into hydrophobic or volatile compounds, such as esters, amides, lactones, aldehydes, ketones, alcohols, etc., which advantageously also carry an ionizable functionality.
  • Examples of such derivatizations are reactions of aldehydes or ketones to oximes, hydrazone or their derivatives or alcohols to esters, for example with symmetrical or mixed anhydrides.
  • an internal standard such as e.g. Peptides, amino acids, coenzymes, sugars, alcohols, conjugated alkenes, organic acids or bases are added.
  • This internal standard advantageously enables the quantification of the compounds in the mixture. In this way, substances contained in the substance mixture can be more easily analyzed and ultimately quantified.
  • Labeled substances are advantageously used as the internal standard, but in principle non-labeled substances are also suitable as the internal standard.
  • Such similar chemical compounds are advantageously used as the internal standard, but in principle non-labeled substances are also suitable as the internal standard.
  • 15 bonds are, for example, so-called compounds of a homologous series, the members of which differ only by, for example, an additional methylene group.
  • at least one isotope is preferably selected from the group 2 H, "c, 15 N ,” 0, 18 0, 33 S, 3 S, 36 S, 35 cl, 37 C1, 2 S ⁇ ,
  • a substance is selected that has the highest possible homology to the substances to be analyzed in the mixture, that is to say structural similarity, to the chemical compound to be measured.
  • structural similarity to the chemical compound to be measured. The higher the structural similarity, the better the knife
  • a ratio of analyte to is advantageous
  • the substance mixture samples in the method according to the invention can be prepared manually or advantageously automatically using conventional laboratory robots. Analysis with the mass spectrometer after any chromatographic separation can also be carried out manually or advantageously be carried out automatically.
  • mass spectrometry can advantageously be used for the rapid screening of various substance mixtures, for example plant extracts, in what is known as high-throughput screening.
  • the method according to the invention is characterized by high sensitivity, good quantifiability, excellent reproducibility, and the lowest sample consumption.
  • mixtures of biological origin for example, new mutants of known or unknown enzymatic activities can be quickly obtained after a mutagenesis, for example after a classic mutagenesis with chemical agents such as NTG, radiation such as UV radiation or X-rays or after a so-called site-directed mutagenesis, PCR Mutagenesis, transposon mutagenesis or the so-called gene shuffling.
  • FIG. 2 shows the total ion chromatogram of an MRM + fill scan measurement
  • MRM multiple reaction monitoring
  • FS fill scan
  • TIC total ion chromatogram
  • XIT sum of several total ion chromatograms.
  • the representation of the measurement selected in FIG. 2 shows the summation of the intensities (y-axis) measured on the detector at the respective times (x-axis) from the two mass spectrometric experiments of multiple reaction monitoring (MRM). and the fill scan (FS).
  • MRM multiple reaction monitoring
  • FS fill scan
  • FIG. 3 shows the total ion chromatogram of the MRM experiment from an MRM + FS measurement.
  • the representation of the MRM measurement selected in FIG. 3 shows the summation of the intensities (y axis) measured on the detector at the respective times (x axis) from all predefined mass transitions of the MRM experiment.
  • the representation selected in FIG. 4 shows the respective measurement results of each individual mass transition (here 30 pieces) in a coordinate cross.
  • the FS experiment measured in alternation to the MRM experiment is shown in the TIC in FIG. 5.
  • FIG. 6 shows the TIC of the FS experiment.
  • FIG. 8 A total ion chromatogram of an MRM + fill scan measurement is shown in FIG. 8 as in FIG. A calibration sample was measured.
  • the representation of the measurement selected in FIG. 8 shows the summation of the intensities (y-axis) measured on the detector at the respective times (x-axis) from the mass spectrometric experiment of multiple reaction monitoring.
  • FIG. 9 shows an extracted chromatogram in which coenzyme Q 10 was identified.
  • FIG. 10 and FIG. 11 show the identification of capsanthin and bixin, respectively.
  • FIG. 12 shows a total ion chromatogram of a filling scan of a plant extract.
  • FIGS. 13 to 15 show the masses of different analytes in the extracted chromatogram, the assignment of which to a specific structure still has to be made.

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Abstract

Massenspektrometrisches Verfahren zur Analyse von Substanzgemischen mit einem Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer, wobei die Substanzgemische vor der Analyse ionisiert wurden, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Auswählen eines Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) eines durch Ionisation entstandenen Ions in einem ersten analytischen Quadrupol (I) des Massenspektrometers, b) Fragmentieren des unter (a) ausgewählten Ions unter Anlegung einer Beschleunigungsspannung in einem weiteren folgenden Quadrupol (II), das mit einem Kollisionsgas gefüllt ist und als Kollisionskammer fungiert, c) Auswählen eines Masse/Ladungs-Quotient eines durch die Fragmentierung (b) entstandenen Ions in einem weiteren nachfolgenden Quadrupol (III), wobei die Verfahrensschritte (a) bis (c) mindestens einmal durchlaufen werden und d) Analysieren der Masse/Ladungs-Quotienten aller im Substanzgemisch durch die Ionisation vorhandenen Ionen, wobei das Quadrupol (II) mit Kollisionsgas gefüllt ist, jedoch während der Analyse keine Beschleunigungsspannung angelegt ist; wobei die Schritte (a) bis (c) und der Schritt (d) auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden können.

Description

Massenspektrometrisches Verfahren zur Analyse von Substanzgemischen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein massenspektrometrisches Verfahren zur Analyse von Substanzgemisehen mit einem Tripel- Quadrupol-Massenspektrometer .
Bei der Analyse komplexer Substanzgemische biologischen und/oder chemischen Ursprungs stellt sich dem Analytiker neben der Aufgabe der Identifizierung der Struktur einzelner im Gemisch enthaltenden Substanzen immer wieder das Problem alle im Gemisch vorhande- nen Substanzen zu erfassen und möglichst zu quantifizieren. Dies sollte möglichst rasch und mit einer hohen Genauigkeit, das heißt mit einer geringen Fehlerabweichung erfolgen. Dies wird um so wichtiger, wenn Informationen über ein biologisches System beispielsweise über ein unter bestimmten Fermentationsbedingungen angezogenen Mikroorganismus oder über eine unter verschiedenen Umweltbedingungen angewachsene Pflanze oder über einen Wildtyp- Organismus wie einem Mikroorganismus oder einer Pflanze im Vergleich zu deren genetisch veränderten Mutante gewonnen werden sollen. Derartige Vergleiche sind erforderlich, um eine Zuordnung von Mutationen unbekannter Gene im Genom dieser Organismen zu einem bestimmten metabolischen Phänotyp zu ermöglichen.
Der Erfolg bei der Analyse dieser Substanzgemisehe beispielsweise chemischer Syntheseansätze aus der kombinatorischen Chemie oder aus Extrakten von Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenteile hängt dabei im großen Ausmaß vom der Schnelligkeit und Reproduzierbarkeit der verwendeten Analytik ab. In einem solchen Scree- ning müssen eine Vielzahl von Proben durchgemustert werden, es sind daher schnelle, einfache, hochempfindliche und hochspezifi- sehe Analysenverfahren erforderlich.
Ein Hauptproblem dieser Analytik ist die rasche, einfache, reproduzierbare und quantifizierbare Identifizierung der in den Gemischen enthaltenen Substanzen. In der Regel werden zur Analyse der Produkte Trennverfahren wie die Dünnschichtchromatographie (= DC) , die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (= HPLC) oder die Gaschromatographie (= GC) verwendet. Mit Hilfe dieser chromatographischen Verfahren kann allerdings nicht rasch und einfach eine breite Palette von Substanzen identifiziert und quantifi- ziert werden. Auch Verfahren wie NMR oder Massenspektrometrie werden für diese Aufgabe beschrieben. In der Regel ist jedoch eine gewisse Vorbereitung der Proben für diese Analyseverfahren 2 erforderlich, wie Aufarbeitung über zum Beispiel Salzfällung und/ oder anschließender Chromatographie, Aufkonzentrierung, Entsalzung der Proben, Pufferaustausch oder Entfernung eventuell in der Probe enthaltener Detergentien. Nach dieser Vorbehandlung sind die Proben für die vorgenannten Analytiken verwendbar und es können einzelne Substanzen in ausgesuchten Proben identifiziert und quantifiziert werden. Diese Verfahren sind jedoch zeitaufwendig und lassen nur einen beschränkten Probendurchsatz zu, so daß derartige Analysenverfahren im sogenannten High-Throughput-Screening (= HTS) oder dem breiten Screening von Substanzgemischen in biologischen oder chemischen Proben keine Anwendung finden. Von Vorteil bei sehr präzisen Methoden wie der NMR- oder IR-Spektrosko- pie ist, daß sie Informationen sowohl über die Struktur als auch gegebenenfalls über die Quantität einer Substanz liefern.
Um einen höheren Probendurchsatz im HTS zu ermöglichen, werden vielfach indirekte, leicht messbare Verfahren wie Farbreaktionen im sichtbaren Bereich, Trübungsmessungen, Fluoreszenz, Leitfähig- keitsmessungen etc. verwendet. Diese sind zwar im Prinzip sehr empfindlich, aber auch störanfällig. Von Nachteil hierbei ist vor allem, daß bei diesem Vorgehen viele falsch positive Proben analysiert werden und da es sich um indirekte Nachweisverfahren handelt, keine Informationen über die Struktur und/oder die Quantität einer Verbindung vorliegen. Um diese falsch Positiven beim weiteren Vorgehen ausschließen zu können, werden in der Regel weitere Analysenverfahren nach einer ersten raschen Analyse wie beispielsweise NMR, IR, HPLC/MS oder GC/MS verwendet. Dies ist wiederum sehr zeitaufwendig.
Generell kann gesagt werden, daß die Verbesserung der Empfindlichkeit und der Aussagekraft der Detektionsverfahren zu einer Verlangsamung in der Geschwindigkeit einer Analytik führt.
Bei der Arbeit mit komplexen biologischen Gemischen wie bei- spielsweise Extrakten aus Mikroorganismen, Pflanzen und/oder Tieren ist außerdem zu beachten, dass einzelne Verbindungen in den Gemischen nur in sehr geringen Mengen vorhanden sind bzw. nur geringe Mengen der einzelnen Probe selbst für die Analytik zur Verfügung stehen, so dass die verwendete Methode eine Hohe Sensiti- vität besitzen muss. Weiterhin stellen für einige Analysenmethoden die häufig in biologischen Proben vorhandenen nicht flüchtigen Puffer und/oder Salze ein Problem dar, da diese die Sensiti- vität der Methoden oder deren Verwendung überhaupt negativ beeinflussen. Gleiches gilt für die Anwesenheit von Detergentien in diesen Proben. Zur Analyse komplexer Probengemische sind aus dem Stand der Technik massenspektrometrische Verfahren bekannt, die beispielsweise von der Analyse von Proben der synthetischen Chemie, der Petro- chemie, von Umweltproben und biologischen Material reichen. Diese Methoden werden jedoch nur für die Analyse einzelner bekannter Verbindungen in diesen Proben eingesetzt. Breite Messreihen beispielsweise im Rahmen eines HTS oder in der Identifizierung und Quantifizierung einer Vielzahl von Verbindungen in diesen Proben werden nicht beschrieben.
Anwendung findet dabei die Kopplung von Gaschromatographie und Massenspektrometrie (= GC/MS) für Substanzen, die aus den Substanzgemischen extrahierbar und leicht flüchtig sind. Für die Analyse von Substanzen bzw. Analyten, die nicht einfach oder nur schwer in die Gasphase überführt werden können und bei denen dabei ein großer Überschuss an vorliegenden Lösungsmittel entfernt werden muss, wird die sogenannte Liquid-Chromatography- oder High-Pressure-Liquid-Chromatography-Mass-Spectrometry (= HPLC/MS) verwendet. Eine Übersicht über die verschiedenen LC/MS-Methoden und ihr Equipment ist der Veröffentlichung von Niessen et al. (Journal of Chromatography A, 703, 1995: 37 - 57) zu entnehmen. In den US-Schriften US 4,540,884 und US 5,397,894 werden Massen- spektrometer und ihr Aufbau beschrieben und beansprucht.
Mit Hilfe der vorgenannten Methoden lassen sich Substanzen in einem Molekulargewichtsbereich von bis zu 100 KD (= 'KiloDalton) bestimmen, das heißt es läßt sich eine breite Palette von Substanzen beispielsweise in einem unteren Massenbereich von bis etwa 5000 D (= Dalton) wie Fettsäuren, Aminosäuren, Carbonsäuren, Oligo- oder Polysaccharide, Steroide etc. und/oder in einem höheren Massenbereich über 5000 D wie Peptide, Proteine, Oligonukleo- tide und Oligosaccharide oder sonstigen Polymere bestimmen. Auch hochmolekulare Materialien wie Kohleteer, Huminsäure, Fulvinsäure oder Kerogene lassen sich analysieren (Zenobie and Knochenmuss, Mass Spec. Rev. , 1998, 17, 337 - 366). Es lassen sich sowohl die Identität als auch die Struktur von Substanzen bestimmen, wobei die Strukturanalyse jedoch nicht immer eindeutig ist, so dass sie mit anderen Methoden beispielsweise NMR bestätigt werden muss .
Von G. Hopfgartner und F. Vilbois (Analusis, 2001, 28, No. 10, 906 - 914) wird ein Verfahren zum Screenen mit Hilfe der LC/MS von in vitro oder in vivo entstandenen Metaboliten von strukturell bekannten Verbindungen beschrieben, die als Wirkstoffe in verschiedenen Phasen der Wirkstoffentwicklung sind. Dieses Ver- fahren läuft in zwei Schritten ab. Im ersten Suchschritt werden in einem raschen "Füll Scan-Modus" interessante Ionen erfasst, die als Kandidaten für die weiteren Untersuchungen in Frage ko - men. Dabei kann es sich um Ionen handeln, die Ionen besonders hoher Intensität entsprechen oder als Kandidaten möglicher Abbauprodukte bzw. Metabolite der Wirkstoffe in Frage kommen. Diese Ionen werden in einem zweiten Scan zur Identifizierung der chemi- sehen Struktur dieser Ionen bzw. Verbindungen nach einer Fragmentierung in einer Kollisionskammer des Massenspektrometers verwendet. Um eine rasche Aufklärung der Ionen- bzw. Metabolitstruktur zu ermöglichen, enthält die Kollisionskammer ständig Kollisionsgas. Von Nachteil bei der Strukturermittlung ist, dass eine be- kannte Masse eines Vorläuferions, eines Fragments oder eines Ionenaddukts erforderlich ist . Vorteilhaft sollte die Ausgangsstruktur der zu untersuchenden Substanz für die HPLC/MS in diesen Experimenten bekannt sein. Da die HPLC/MS allein nicht für die absolute Strukturbestimmung geeignet ist. Ist jedoch die Struktur der AusgangsVerbindung bekannt, lassen sich Aussagen über die Struktur eventueller Metabolite machen. Da die Struktur des Substanz, die als Wirkstoff entwickelt werden soll, bekannt ist, lassen sich Aussagen über die Struktur der unbekannten Metabolite des Wirkstoffs mit einiger Sicherheit machen. Allerdings wird die Aussage durch mögliche Überlagerungen anderen als Verunreinigungen vorhandener Verbindungen gleicher Masse erschwert bzw. verhindert. Eine Quantifizierung der Verbindungen ist mit dieser Methode nicht möglich.
Eine Identifizierung und Quantifizierung einer Vielzahl oder aller Einzelkomponenten in einem Substanzgemisch ohne zur Verfügung stehende Reinsubstanzen stellt auch heute noch ein ungelöstes Problem in der Massenspektrometrie dar.
Es bestand daher die Aufgabe ein Verfahren zur Analyse einer
Vielzahl von Verbindungen und bevorzugt deren Quantifizierung zu entwickeln.
Diese Aufgabe wurde gelöst durch ein massenspektrometrisches Ver- fahren zur Analyse von Substanzgemischen mit einem Tripel-Quadru- pol-Massenspektrometer, wobei die Substanzgemische vor der Analyse ionisiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfaßt :
a) Auswählen eines Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) eines durch Ionisation entstandenen Ions in einem ersten analytischen Quadrupol (I) des Massenspektrometers, b) Fragmentieren des unter (a) ausgewählten Ions unter Anlegung einer Beschleunigungsspannung in einem weiteren folgenden Quadrupol (II) , das mit einem Kollisionsgas gefüllt ist und als Kollisionskammer fungiert,
c) Auswählen eines Masse/Ladungs-Quotient eines durch die Fragmentierung (b) entstandenen Ions in einem weiteren nachfolgenden Quadrupol (III) , wobei die Verfahrensschritte (a) bis (c) mindestens einmal durchlaufen werden und
d) Analysieren der Masse/Ladungs-Quotienten aller im Substanzgemisch durch die Ionisation vorhandenen Ionen, wobei das Quadrupol (II) mit Kollisionsgas gefüllt ist, jedoch während der Analyse keine BeschleunigungsSpannung angelegt ist;
wobei die Schritt (a) bis (c) und der Schritt (d) auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden können.
Unter Substanzgemische im Sinne der Erfindung sind prinzipiell alle Gemische, die mehr als eine Substanz enthalten zu verstehen, wie beispielsweise komplexe Reaktionsmischungen chemischer Synthesen wie Syntheseprodukte aus der kombinatorischen Chemie oder Substanzgemisehe biologischen Ursprungs wie Fermentationsbrühen einer aeroben oder anaeroben Fermentation, Körperflüssigkeiten wie Blut, Lymphe, Urin oder Stuhl, Reaktionsprodukte eine biotechnologischen Synthese mit einem oder mehreren freien oder gebundenen Enzymen, Extrakte tierischen Materials wie Extrakte aus verschiedenen Organen oder Geweben oder pflanzliche Extrakte wie Extrakte der gesamten Pflanze oder einzelner Organe wie Wurzel, Stiel, Blatt, Blüte oder Samen oder deren Mischungen. Vorteilhaft werden in diesem Verfahren Substanzgemische biologischen Ursprungs wie Extrakte tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, vorteilhaft pflanzlichen Ursprungs analysiert.
Die im Verfahren verwendbaren Massenspektrometer setzen sich in der Regel aus einem Probeneinlass-System, einem Ionisationsraum, einem Interface, einer lonenoptik, einem oder mehreren Massefilter und einem Detektor zusammen.
Zur Erzeugung von Ionen im Verfahren können prinzipiell alle dem Fachmann bekannten Ionenquellen verwendet werden. Diese Ionenquellen werden je nach verwendeter lonenquelle über ein sogenanntes Interface an die folgenden Komponenten des Massenspektrometers beispielsweise der Ionenoptik, dem oder den Massefiltern oder dem Detektor gekoppelt. Die Zwischenschaltung eines Interfaces hat den Vorteil, dass die Analyse ohne Verzögerung durchgeführt werden kann. Weiterhin können durch die Ionenquelle nicht- flüchtige und/oder flüchtige bevorzugt nichtflüchtige Substanzen direkt in die Gasphase gebracht werden. Es können dadurch auch Vorreinigungen von Substanzgemisehen über eine vorteilhafte chromatographische Auftrennung durchgeführt werden, die unterschied- lieh breite Stoffflüsse in der Analytik aufweisen, da über das Interface diese Stoffflüsse verarbeitet werden können. Die zu analysierenden Proben bzw. die darin enthaltenen Substanzen können dadurch außerdem angereichert werden. Weiterhin kann eine breite Palette von Lösungsmitteln bei geringstem Verlust an Probe verarbeitet werden.
Bei der Ionisation werden im wesentlichen drei Prozesse zur Erzeugung der geladenen Teilchen (Ionen) verwendet:
a) Verdampfung der Substanzgemische und Ionisation der Moleküle bzw. des Substanzgemisches in der Gasphase, beispielsweise wie bei der Elektronenstoss-Ionisation (EI) , bei der die Moleküle mit einem Elektronenstrahl in einer Ionisationskammer bei niedrigem Druck (<10~2 Pa) verdampft werden oder wie bei der chemischen Ionisation (CI) mit einem Reaktandgas bei die Ionen bei einem erhöhtem Druck ca. 100 Pa erzeugt werden. Typische Reaktandgase sind beispielsweise Methan, Isobutan, Ammonium, Argon oder Wasserstoff. Wird die chemische Ionisation bei Atmosphärendruck durchgeführt, so spricht man von der sogenannten "Atmospheric-Pressure Chemical Ionization (APCI) .
b) Desorption der Substanzgemische von einer Oberfläche beispielsweise wie bei der Plasma Desorption (PD) , der Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry (LSIMS) , dem Fast Atom Bom- bardment (FAB) , der Laser Desorption (LD) oder dem Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) . Bei all diesen Methoden werden die Substanzgemische durch einfallende energiereiche Partikel (radioaktiver Zerfall, UV-, IR-Photonen, Ar+- oder Cs+-Ionen, Laserstrahlen) in einer Kollisionskaskade vibratorisch angeregt und dadurch ionisiert.
c) Zerstäubung der Substanzgemische im elektrischen Feld, wie bei der Electrospray-Ionisation (ESI) . Bei der Zerstäubung der Substanzgemische im elektrischen Feld werden die Proben bei Atmosphärendruck zerstäubt.
Die Electrospray-Ionisation ist eine sehr schonende Methode. Bei der ESI werden kontinuierlich Ionen gebildet. Diese kon- tinuierliche Ionenbildung hat den Vorteil, dass sie mühelos in Verbindung mit fast jedem Analysatortyp gekoppelt werden kann und dass sie sich problemlos mit einer chromatographi- sehen Auftrennung wie einer Auftrennung über Kapillar-Elek- trophorese (CE) , Liquid Chromatography (LC) oder High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) verbinden läßt, da sie eine gute Toleranz für hohe Flussraten bis zu 2 ml/min Eluat hat. Dabei wird das Versprühen des Eluenten pneumatisch durch ein sogenanntes Vernebelungsgas beispielsweise Stickstoff unterstützt . Hierzu wird das Gas unter einem Druck von bis zu 4 bar, vorteilhaft bis zu 2 bar aus einer Kapillare ausgeblasen, die die Einlasskapillare des Eluenten umschließt. Auch höhere Drücke sind prinzipiell möglich. Bei der vorgeschalteten chromatographischen Auftrennung sind sogenannte Normalphasen- (z.B. Kieselgel-, Aluminiumoxid-, Aminodesoxyhexit-, Aminodesoxy-d-glucose-, Triethylentetramin-, Polyethylenoxid- oder Aminodicarboxy-Säulen) und/oder Reversed-Phase-Säulen bevorzugt Reversed-Phase-Säulen wie Säulen mit einer C4 Cg oder Cis stationären Phase bevorzugt. Unter Standardbedingungen führt die Electrospray-Technik aufgrund der äußerst schonenden Ionisierung zum (Quasi-) Molekülion. Meist sind dies Addukte mit bereits in der Probenlösung vorhandenen Ionen (z.B. Protonen, Alkali- und/oder Ammoniumionen). Weiterhin von Vorteil ist, dass sich auch mehrfach geladene Ionen detektieren lassen, so dass Ionen mit einem Molekulargewicht von bis zu hunderttausend Dalton detektieren lassen, vorteilhaft lassen sich im erfindungsgemäßen Verfahren Molekularge- wichte in einem Bereich von 1 bis 10000 Dalton, bevorzugt in einem Bereich von 50 bis 8000 Dalton, besonders bevorzugt in einem Bereich von 100 bis 4000 Dalton detektieren. Als weitere beispielhafte Methoden sei die Ionenspray-Ionisation, die Atmospheric Pressure Ionisation (APCI) oder die Thermos- pray-Ionisation genannt.
Bei den vorgenannten Ionisierungsmethoden läuft der Ionisierungsprozeß unter Atmosphärendruck ab und gliedert sich im wesentlichen in drei Phasen: Zunächst wird die zu analysie- rende Lösung in einem starken elektrostatischen Feld, das durch Erzeugen einer Potentialdifferenz von 2-10 kV, vorteilhaft von 2-6 kV, zwischen der Einlasskapillare und einer Gegenelektrode erzeugt wird, versprüht. Ein elektrisches Feld zwischen der Einlasskapillarspitze und dem Massenspektrometer durchdringt dabei die Analytlösung und trennt dabei die Ionen in einem elektrischen Feld auf. Positive Ionen werden dabei im sogenannten positive Mode an die Oberfläche der Flüssigkeit gezogen, negative Ionen in die Gegenrichtung oder umgekehrt bei Messungen im sogenannten positiv Mode. Die an der Oberfläche akkumulierten positiven Ionen werden im folgenden weiter in Richtung der Kathode gezogen. Bei der Verwendung von Sprühkappilaren (NanoSpray) , in denen die zu unter- suchende Lösung nicht durch das Anlegen von Druck aus der Kapillare gepresst wird, bildet sich ein Flüssigkeitskonus, der sog. Taylor-Konus aus, da die Oberflächenspannung der Flüssigkeit dem elektrischen Feld entgegen wirkt. Ist das elektrische Feld stark genug, ist der Konus stabil und emittiert an seiner Spritze kontinuierlich einen Flüssigkeitsstrom. Beim druckunterstützten Versprühen der zu untersuchenden Lösung (z.B. mit HPLC) ist der Taylor-Konus nicht so ausgeprägt .
Dabei bildet sich jeweils ein Aerosol aus, das aus Analyt und Lösungsmittel besteht. Im folgenden Stadium findet die Desol- vatisierung der gebildeten Tropfen statt, was zur sukzessiven Verringerung der Tropfengröße führt . Die Verdampfung des Lösungsmittels wird durch thermische Einwirkung, z.B. durch Zuführung heißen Inertgases, erreicht. Durch die Verdampfung in Zusammenwirken mit den elektrostatischen Kräften steigt die Ladungsdichte an der Oberfläche der eingesprühten Substanzgemischtröpfchen ständig. Überschreitet dabei schließ- lieh die Ladungsdichte bzw. deren Ladungsrepulsionskräfte die Oberflächenspannung der Tröpfchen (sogenannte Raleigh- Grenze) , so explodieren (Coulomb-Explosion) diese Tröpfchen in kleinere Teiltröpfchen. Dieser Prozess "Lösungsmittel-Verdampfung/Coulomb-Explosion" wird mehrfach durchlaufen bis schließlich die Ionen in die Gasphase übertreten. Um gute
Messergebnisse zu erhalten, müssen der Gasfluss im Interface, die angelegte Heiztemperatur, die Flussrate des Heizgases, der Druck des Vernebelungsgases und die Kapillarspannung genau überwacht und gesteuert werden.
Mit den verschiedenen Ionisiationsverfahren können einfach oder mehrfach geladene Ionen erzeugt werden. Für das erfindungsgemäße Verfahren werden als Ionisationsverfahren Verfahren zur Zerstäubung des Substanzgemisches im elektrischen Feld wie das Thermo- spray-, das Electrospray- (= ES) oder das Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (= APCI) -Verfahren vorteilhaft verwendet. Bei der APCI-Ionisation erfolgt die Ionisierung in einer sogenannten Coronna-Entladung. Bevorzugt wird das Thermospray- oder Electrospray-Verfahren, besonders bevorzugt ist das Electrospray-Verfah- ren. Der Ionisationsraum steht über ein Interface, das heißt über einer MikroÖffnung (100 μm) mit dem folgenden Massenspektrometer in Verbindung. Auf der Seite der Ionisierungskammer ist noch eine Interface-Platte mit einer größeren Öffnung angebracht. Zwischen dieser Platte und dem sogenannten "orifice" wird ein aufgeheiztes Trägergas (= Curtain-Gas) beispielsweise Stickstoff eingeblasen. Der Stickstoff kollidiert dabei mit den beispielsweise durch Electrospray erzeugten Ionen, die im Substanzgemisch erzeugt wur- den. Durch Einblasen des Curtain-Gas wird vorteilhaft verhindert, dass Neutralteilchen in das Hochvakuum des nachfolgenden Massen- spektrometer gesaugt werden. Weiterhin wird durch das Curtain-Gas die Desolvatisierung der Ionen unterstützt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit allen dem Fachmann bekannten Quadrupolmassenspektrometern wie den Tripel-Quadrupol- Massenspektrometern durchgeführt werden. In US 2,939,952 beschreibt und beansprucht Paul et al. ein erstes derartiges Gerät. Diese Geräte haben einen vorteilhaften Massenbereich bis etwa m/z = 4000 und erzielen Auflösungswerte zwischen 500 und etwa 5000. Sie verfügen über eine hohe Ionentransmission von der Quelle bis zum Detektor, sind leicht zu fokussieren und zu kalibrieren und verfügen vorteilhaft über eine große Stabilität der Kalibrierung im Dauerbetrieb. Tripel-Quadrupol-Instrumente bilden die Standard-Instrumente für Niedrigenergie-Kollisionsaktivierungsstu- dien. Üblicherweise bestehen diese Geräte aus einem ersten Quadrupol, das zur Analyse des Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) der in dem Substanzgemisch nach Ionisation enthaltenen Ionen im Hoch- Vakuum (ca. 10~5 Torr) geeignet ist, wobei die Masse (n) einzelner Ionen, mehrerer oder aller Ionen gemessen werden können. Diesem ersten analytischen Quadrupol (= I oder Ql) können ein oder mehrere Quadrupole (= Q0) vorgeschaltet sein, die in der Regel zur Fokussierung der Ionen verwendet werden. Anstelle dieses oder dieser vorgeschalteten Quadrupole können auch sogenannte "Cones" Linsen oder Linsensysteme zur Fokussierung und Einbringung der Ionen in das erste analytische Quadrupol verwendet werden. Auch Kombinationen aus Quadrupolen und Cones sind realisiert und verwendbar .
Ein weiteres Ql folgendes Quadrupol (= II oder Q2) dient als Kollisionskammer. In ihm werden die Ionen vorteilhaft unter Anlegung einer FragmentierungsSpannung fragmentiert. Zur Fragmentierung werden Ionisierungspotenziale im Bereich von 5-11 Elektronenvolt (eV) , bevorzugt von 8-11 Elektronenvolt (eV) angelegt. Q2 ist außerdem für die Fragmentierung im erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Kollisionsgas wie einem Edelgas wie Argon oder Helium oder einem anderen Gas wie C0 oder Stickstoff oder Mischungen dieser Gase wie Argon/Helium oder Argon/Stickstoff gefüllt. Aus kostengründen ist Argon und/oder Stickstoff bevorzugt . In der Kollisionskammer liegt das Kollisionsgas im erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Druck von 1 x 10~5 bis 1 x 10-1 Torr, bevorzugt 10~2 vor. Besonders bevorzugt ist Stickstoff. Auch ohne die Anlegung einer FragmentierungsSpannung kann es zu einer vereinzelten Fragementierung der Ionen in der Kollisionskammer bei Anwesenheit eines Kollisionsgases kommen. Zwischen dem Qua- drupol Ql und Q2 können weitere Quadrupole oder Cones zur Lenkung der Ionen vorhanden sein.
An das Quadrupol Q2, das als Kollisionskammer dient, schließt 5 sich schließlich ein weiteres Quadrupol (= III oder Q3) an. In diesem Q3 können entweder die m/z-Quotienten einzelner ausgewählter Fragemente, mehrerer oder aber aller in den Substanzgemischen nach Ionisation vorhandenen m/z-Quotienten (in dieser Anmeldung der einfachheithalber als Masse oder Massen bezeichnet) bestimmt 10 werden. Auch zwischen dem Quadrupol Q2 und Q3 können weitere Quadrupole oder Cones zur Lenkung der Ionen vorhanden sein.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können einzelne Quadrupole zur
Sammlung von Ionen auch als Ionenfallen betrieben werden, aus
15 denen dann die Ionen nach einiger Zeit wieder zur Analyse freigegeben werden.
Die in den Tripel-Quadrupol-Massenspektrometern verwendeten Quadrupole erzeugen ein dreidimensionales elektrisches Feld in dem
20 die erzeugten Ionen gehalten bzw. gelenkt werden können. Sie bestehen in der Regel aus 4, 6 oder 8 Stäben oder Stangen mit deren Hilfe wird ein oszillierendes elektrisches Feld erzeugt wird, wobei gegenüberliegende Stäbe elektrisch verbunden sind. Neben der Bezeichnung Quadrupol werden auch die Bezeichnungen Hexa-
25 oder Octapol verwendet. In der vorliegenden Anmeldung sollen diese Bezeichnungen mit umfasst sein, wenn der Begriff Quadrupol verwendet wird. Vorteilhaft sind in den Quadrupolen des Tripel- Quadrupol-Massenspektrometer zur Lenkung der Ionen nur geringe Beschleunigungsspannungen von wenigen Volt bevorzugt von einigen
30 10 V erforderlich.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorteilhaft Substanzgemische wie tierische oder pflanzliche Extrakte, bevorzugt pflanzliche Extrakte verwendet. 35
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden nach der Ionisierung der Substanzgemische die weitern Verfahrensschritte durchlaufen
I) In den Verfahrensschritten (a) bis (c) wird die Masse minde- 40 stens eines im Substanzgemisch nach Ionisation in Ql vorhandenen Ions analysiert und ausgewählt . Dieses ausgewählte Ion wird anschließend in Q2 in Gegenwart von Kollisionsgas und einer FragmentierungsSpannung fragmentiert und danach wird eines der entstandenen Fragment-Ionen in einem weiteren ana- 45 lytischen Quadrupol Q3 identifiziert und vorteilhaft auch quantifiziert. Dabei erfolgt die Auswahl des zu analysierenden Fragment-Ions in der Weise, dass diese Ion vorteilhaft eine hohe Intensität, eine leicht identifizierbare charakteristische Masse hat und in einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens eine leichte Quantifizierung ermöglicht.
II) Anschließend werden im Verfahrensschritt (d) die Massen aller im Substanzgemisch nach Ionisation vorhandenen Ionen analysiert, wobei das als Kollisionskammer benutzte Quadrupol Q2 immer mit Kollisionsgas gefüllt ist, jedoch in Verfahrensschritt (d) keine Fragmentierungsspannung an Q2 anliegt. Diese Analyse kann prinzipiell sowohl mit Ql und als auch mit Q3 erfolgen, vorteilhafter ist es jedoch die Analyse mit Q3 durchzuführen, da zwischen Ql und dem an das Massenspektro- meter anschließenden Detektor als Kollisionskammer verwendete Quadrupol Q2 liegt. Sollte in Q2 eine Fragmentierung trotz dem fehlen anliegender FragmentierungsSpannung auftreten, so hat dies keinen Einfluss auf eine mögliche Erfassung der Ionenmassen am Detektor. Im Falle einer Massenanalyse mit Ql würde eine solche Frage entation in Q2 jedoch zu Fehlschlüssen bei der Detektion führen. Deshalb ist eine Massendetek- tion mit Q3 bevorzugt, da mögliche Fehlerquellen eliminiert werden bzw. vernachlässigbar sind.
Die oben aufgeführten Prozessschritte (I) bzw. (II) können auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden. Figur 1 ist der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahren zu entnehmen. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Verfahrensschritte (b) bis (d) und (e) vorteilhaft innerhalb von 0,1 bis 10 Sekunden mindestens einmal durchlaufen bevorzugt innerhalb von 0,2 bis 6 Sekunden mindestens einmal, besonders bevorzugt innerhalb von 0,2 bis 2 Sekunden, ganz besonders bevorzugt mindestens einmal innerhalb von 0,3 bis unter 2 Sekunden. Um eine vorteilhafte statistische Auswertung der Messungen zu ermöglichen werden die Verfahrens- schritte innerhalb von 0,2 bis 6 Sekunden zwei- bis dreimal bevorzugt dreimal durchlaufen. Um derartige rasche schnell hin- tereinander folgende Messungen zu ermöglichen, ist das als Kollisionskammer fungierende Quadrupol Q2 ständig mit Kollisionsgas gefüllt. Wie die eigenen Messungen zeigten, hat dies keinen negativen Einfluss auf die Reproduzierbarkeit der Messungen.
Während einer Analyse können im erfindungsgemäßen Verfahren zwischen 1 und 100 Masse/Ladungs-Quotienten verschiedener in Schritt (a) entstandener und ausgewählter Ionen analysiert werden. Vorteilhaft werden mindestens 20 m/z-Quotienten, bevorzugt mindestens 40 m/z-Quotienten, besonders bevorzugt mindestens 60 m/z- Quotienten, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 m/z-Quotienten unterschiedlicher Ionen oder mehr identifiziert und/oder quantifiziert.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können vorteilhaft neben der Analyse aller in einem Substanzgemisch vorhandenen Massen auch einzelne Substanzen bzw. deren Massen analysiert und vorteilhaft quantifiziert werden.
Eine Reinigung der Substanzgemische ist im erfindungsgemäßen Ver- fahren prinzipiell nicht erforderlich. Die Substanzgemische können direkt nach Einbringung in eine Ionenquelle gemessen werden. Dies gilt auch für komplexe Substanzgemische. Auch müssen den Substanzgemischen als interne Standards keine markierten oder unmarkierten Reinsubstanzen möglicher in den Gemischen enthaltenden Substanzen zugesetzt werden obwohl dies natürlich möglich ist und eine anschließende Quantifizierung der in den Gemischen enthaltenden Substanzen vereinfacht.
Eine Aufreinigung über dem Fachmann bekannte Verfahren wie chro- matographische Verfahren ist jedoch von Vorteil. Aufgrund der im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugten Ionisationsmethode über eine Zerstäubung der Substanzgemische im elektrischen Feld läßt sich eine Auf- und/oder Vorreinigung der Substanzgemische beispielsweise über eine Chromatographie sehr einfach an die massen- spektrometrische Analyse ankoppeln. Als chromatographische Verfahren können dabei alle dem Fachmann bekannte Trennmethoden wie LC-, HPLC- oder Kapillarelektrophorese- verwendet werden. Trennverfahren, die auf der Adsorptions-, Gelpermeations-, Ionenpaar-, Ionenaustausch-, Ausschluss-, Affinitäts-, Normalphasen- oder Re- versed Phase-Chromatographie basieren, um nur einige mögliche zu nennen, können verwendet werden. Vorteilhaft werden Normalphasen- und/oder Reversed-Phase basierende Chromatographien, bevorzugt Reversed-Phase-Säulen mit unterschiedlichen hydrophobe modifizierten Materialien wie C4-, Cs~ oder Cιs~ Phasen verwendet.
Im erfindungsgemäßen Verfahren ist eine Kopplung von Aufreinigungsmethoden vorteilhaft von Chromatographiemethoden mit einer Fließgeschwindigkeit des Eluenten (Analyten + Lösungsmittel) vorteilhaft zwischen 1 μl/min bis 2000 μl/min, bevorzugt zwischen 5 μl/min bis 600 μl/min, besonders bevorzugt zwischen 10 μl/min bis 500 μl/min beispielsweise möglich. Auch geringere oder höhere Fließgeschwindigkeiten können ohne Schwierigkeiten im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Als Lösungsmittel für das Aufreinigungsverfahren können prinzipiell alle protischen oder aprotisσhen polaren oder unpolaren Lösungsmittel verwendet werden, die mit der anschließenden Analy- tik kompatibel sind. Ob ein Lösungsmittel mit der Massenspektro- metrie kompatibel ist, kann der Fachmann durch einfache Stichversuche leicht ermitteln. Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Lösungsmittel, die keine oder wenig Ladungen tragen, wie aprotische apolare Lösungsmittel, die durch eine niedrige Dielektrizitätskonstanten (Eτ<15) , niedrige Dipolmomente (μ<2,5D) und niedrige ET N-Werte (0,0 - 0,5) charakterisiert sind. Aber auch dipolare organische Lösungsmittel oder deren Mischungen sind als Lösungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Als geeignete Lösungsmittel sind seien hier beispielhaft Methanol, Ethanol, Acetonitril, Ether, Heptan genannt. Auch schwache saure Lösungsmittel wie 0,01 - 0,1 % Ameisensäure, Essigsäure oder Tri- fluoressigsäure sind geeignet. Weiterhin sind auch schwach basische Lösungsmittel wie 0,01 - 0,1 % Triethylamin oder Ammoniak geeignet. Auch stark saure oder stark basische Lösungsmittel wie 5%ige HCL oder 5%iges Triethylamin sind prinzipiell als Lösungsmittel geeignet. Auch Mischungen der vorgenannten Lösungsmittel ,sind vorteilhaft. Auch die in der Biochemie üblichen Puffer sind als Lösungsmittel geeignet, wobei vorteilhaft Puffer < 200 mM, bevorzugt < 100 mM, besonders bevorzugt < 50 mM, ganz besonders bevorzugt < 20 mM verwendet werden. Ebenfalls vorteilhaft ist es, wenn Puffer > 100 mM für die Herstellung der Substanzgemisehe verwendet werden, dass die Puffer beispielsweise über eine Dialyse ganz oder teilweise entfernt werden. Als Puffer seien beispielsweise Acetat-, Formiat-, Phosphat-, Tris-, MOPS-, HEPES- oder deren Mischungen genannt. Hohe Puffer und/oder Salzkonzentrationen beeinflussen die Ionisationsprozesse negativ und sind gegebenenfalls zu vermeiden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Moleküle, die in den Substanzgemischen enthalten sind, von 100 Dalton (= D) bis 100 Kilodalton (= kD) , bevorzugt von 100 D bis 20 kD, besonders bevorzugt von 100 D - 10 kD, ganz besonders bevorzugt von 100 D bis 2000 D nachweisen, das heißt identifizieren und gegebenen- falls auch quantifizieren.
Vorteilhaft können die Substanzgemische für das erfindungsgemäße Verfahren, die sonst nur schlecht oder gar nicht nachweisbar sind vor der Analyse derivatisiert werden und so schließlich analy- siert werden. Eine Derivatisierung ist besonders vorteilhaft in Fällen, in denen in hydrophobe bzw. flüchtige Verbindungen beispielsweise wie Ester, Amide, Lactone, Aldehyde, Ketone, Alkohole etc. hydrophile Gruppen eingeführt werden, die vorteilhaft noch eine ionisierbare Funktionalität tragen. Beispiele für derartige Derivatisierungen sind Umsetzungen von Aldehyden oder Ketonen zu Oximen, Hydrazonen oder deren Derivate oder Alkoholen zu Estern beispielsweise mit symmetrischen oder gemischten Anydriden. Da- durch kann das NachweisSpektrum des Verfahrens vorteilhaft erweitert werden.
Vorteilhaft wird im erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse der 5 Substanzgemische ein interner Standard wie z.B. Peptide, Aminosäuren, Coenzyme, Zucker, Alkohole, konjugierte Alkene, organische Säuren oder Basen zugesetzt . Dieser interne Standard ermöglicht vorteilhaft die Quantifizierung der Verbindungen im Gemisch. Im Substanzgemisch enthaltende Substanzen können so leich- 10 ter analysiert und letztlich quantifiziert werden.
Als internen Standard werden vorteilhaft markierte Substanzen verwendet, prinzipiell sind aber auch nicht markierte Substanzen als interner Standard geeignet. Derartige ähnliche chemische Ver-
15 bindungen sind beispielsweise sogenannten Verbindungen einer homologen Reihe, deren Mitglieder sich nur durch beispielsweise eine zusätzliche Methylengruppe unterscheiden. Als interner Standard werden bevorzugt durch mindestens ein Isotop ausgewählt aus der Gruppe 2H, "c, 15 N, "0, 180, 33S, 3 S, 36S, 35cl, 37C1, 2 S± ,
20 30Si, 7 Se oder deren Mischungen markierte Substanzen verwendet. Bevorzugt wird aus Kostengründen und aus Gründen der Zugänglichkeit 2H oder 13C als Isotop verwendet. Diese internen Standard brauchen für die Analyse nicht komplett, das heißt vollmarkiert zu sein. Eine Teilmarkierung ist völlig ausreichend. Vorteilhaft
25 wird auch im Falle eines markierten internen Standards eine Substanz gewählt, die eine möglichst hohe Homologie zu den im Gemisch zu analysierenden Substanzen, das heißt strukturelle Ähnlichkeit, zu der zu messenden chemischen Verbindung hat. Je höher die strukturelle Ähnlichkeit ist, desto besser sind die Messer-
30 gebnisse und desto genauer kann eine Quantifizierung der Verbindung erfolgen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren und besonders für die Quantifizierung der im Gemisch vorhandenen Substanzen ist es vorteil-
35 haft den internen Standard in einem günstigen Verhältnis zu der zu messenden Substanz einzusetzen. Verhältnisse von Analyt (= zu bestimmende Verbindung) zu internem Standard größer 1:15 führen zu keiner Verbesserung der Messergebnisse, sind jedoch prinzipiell möglich. Vorteilhaft wird ein Verhältnis von Analyt zu
40 internem Standard in einem Bereich von 10:1 bis 6:1 eingestellt, bevorzugt in einem Bereich von 6:1 bis 4:1, besonders bevorzugt in einem Bereich von 2:1 bis 1:1.
Die Substanzgemischproben im erfindungsgemäßen Verfahren können 5 manuell oder vorteilhaft automatisch mit üblichen Laborrobotern vorbereitet werden. Auch die Analyse mit dem Massenspektrometer nach gegebenenfalls chromatographischer Auftrennung kann manuell oder vorteilhaft automatisch durchgeführt werden. Durch die Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Massenspek- trometrie vorteilhaft zum schnellen Screening von verschiedenen Substanzgemischen beispielsweise Pflanzenextrakten im sogenannten High-Throughput-Screening verwendet werden. Dabei zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch eine hohe Empfindlichkeit, eine gute Quantifizierbarkeit , einer hervorragenden Reproduzierbarkeit, bei geringstem Probenverbrauch aus. Mit der Methode können also rasch Gemische biologischen Usprungs beispielsweise neue Mutanten bekannter oder unbekannter enzymatischer Aktivitäten nach einer Mutagenese beispielsweise nach einer klassischen Muta- genese mit chemischen Agentien wie NTG, Strahlung wie UV-Strahlung oder Röntgenstrahlung oder nach einer sogenannten site- direkted mutagenesis, PCR-Mutagenese, Transposon-Mutagenese oder dem sogenannten gene shuffling gefunden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Analyse einer breiten Palette von Substanzen in einem weiten Messbereich, bei guter bis sehr guter Auflösung, bei einer hohen Ionentransmission von der Quelle zum Detektor, einer hohen Scan-Geschwindigkeit sowohl im Füll Scan-Modus aller Substanzen in den Substanzgemischen als auch im multiple reaction monitoring-Modus [= MRM, Verfahrensschritte (a) bis (c) ] . Weiterhin hat das Verfahren eine sehr hohe Aufnahmeempflindlichkeit und eine hervorragende Kallibrierungs- Stabilität. Weiterhin ist es für den Dauerbetrieb und damit für die Anwendung in einem HTS-Screening ausgezeichnet geeignet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiele
1. Beispiele MRM + FS-Messungen
a) TIC der MRM + FS-Messung
In Figur 2 ist das Total Ion Chromatogram einer MRM + Füll Scan- Messung [MRM = Multiple Reaction Monitoring, FS = Füll Scan, TIC = Total Ion Chromatogram, XIT = Summe mehrerer Total Ion Chroma- togramme] dargestellt. Gemessen wurde ein Qualitätskontrollprobe. Diese Art von Probe enthält eine definierte Anzahl an Analyten. Diese Analyten wurden käuflich erworben und in bekannten Konzentrationen in geeignetem Lösungsmittel gelöst.
Die in Figur 2 gewählte Darstellung der Messung zeigt die Aufsum- mierung der am Detektor zu den jeweiligen Zeitpunkten (x-Achse) gemessenen Intensitäten (y-Achse) aus den beiden massenspektro- metrischen Experimenten des Multiple Reaction Monitoring (MRM) und des Füll Scan (FS) . Das Chromatogram in Figur 2 stellt also die Summe der TIC-Chromatogramme der beiden o.g. genannten mas- senspektrometrischen Experimenten dar.
b) TIC des MRM-Experiment und TIC des FS-Experiment
In Figur 3 ist das Total Ion Chromatogram des MRM-Experiments aus einer MRM + FS-Messung dargestellt .
Die in Figur 3 gewählte Darstellung der MRM-Messung zeigt die Aufsummierung der am Detektor zu den jeweiligen Zeitpunkten (x-Achse) gemessenen Intensitäten (y-Achse) aus allen vordefinierten Massenübergängen des MRM-Experiments . Die in Figur 4 gewählte Darstellung zeigt die jeweiligen Messergebnisse jedes einzelnen Massenübergangs (hier 30 Stück) in einem Koordinatenkreuz .
c) TIC des FS-Experiment
Das im Wechsel zum MRM-Experiment gemessene FS-Experiment ist im TIC in Figur 5 dargestellt.
In Figur 6 ist der TIC des FS-Experiments dargestellt. Die Auf- summierung aller FS-Massenspektren, die in dem schraffiert darge- stellten Zeitfenster aufgenommen wurden sind in Figur 7 dargestellt.
d) TIC eines MRM-Experiments
In Figur 8 ist wie in Figur 2 ein Total Ion Chromatogram einer MRM + Füll Scan-Messung dargestellt . Gemessen wurde eine Kalibrierungsprobe .
Die in Figur 8 gewählte Darstellung der Messung zeigt die Aufsummierung der am Detektor zu den jeweiligen Zeitpunkten (x-Achse) gemessenen Intensitäten (y-Achse) aus dem massen- spektrometrischen Experiment des Multiple Reaction Monitoring.
Figur 9 gibt ein extrahiertes Chromatogram wieder, in dem Coenzym Q 10 identifiziert wurde.
Figur 10 und Figur 11 geben die Idendifizierung von jeweils Capsanthin und Bixin wieder.
Figur 12 gibt ein Total Ion Chromatogram eines Füll Scan eines Pflanzenextraktes wieder. Die Figuren 13 bis 15 zeigen die Massen verschiedener Analyten im extrahierten Chromatogram, deren Zuordnung zu einer spezifische Struktur noch erfolgen muss .
In dem beschriebenen Verfahren ließen sich bisher 200 weitere Analyten selektiv nachweisen.

Claims

Patentansprüche
1. Massenspektrometrisches Verfahren zur Analyse von Substanz- gemischen mit einem Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer, wobei die Substanzgemische vor der Analyse ionisiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfaßt :
a) Auswählen eines Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) eines durch Ionisation entstandenen Ions in einem ersten analytischen Quadrupol (I) des Massenspektrometers,
b) Fragmentieren des unter (a) ausgewählten Ions unter Anlegung einer Beschleunigungsspannung in einem weiteren folgenden Quadrupol (II) , das mit einem Kollisionsgas gefüllt ist und als Kollisionskammer fungiert,
c) Auswählen eines Masse/Ladungs-Quotient eines durch die Fragmentierung (b) entstandenen Ions in einem weiteren nachfolgenden Quadrupol (III) , wobei die Verfahrensschritte (a) bis (c) mindestens einmal durchlaufen werden und
d) Analysieren der Masse/Ladungs-Quotienten aller im
Substanzgemisch durch die Ionisation vorhandenen Ionen, wobei das Quadrupol (II) mit Kollisionsgas gefüllt ist, jedoch während der Analyse keine Beschleunigungsspannung angelegt ist;
wobei die Schritt (a) bis (c) und der Schritt (d) auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden können. . Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionisation des Substanzgemisches eine chromatographische
Auftrennung vorgeschaltet ist. . Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der chromatographischen Auftrennung um eine HPLC-Auftrennung handelt. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (a) bis (d) innerhalb von 0,1 bis 10 Sekunden mindestens einmal durchlaufen werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (a) bis (d) innerhalb von 0,2 bis 2 Sekunden mindestens einmal durchlaufen werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeich- net, dass die Ionisation durch Verdampfung des Substanzgemisches und Ionisation in der Gasphase, durch Desorption des Substanzgemisches an einer Oberfläche oder durch Zerstäubung des Substanzgemisches im elektrischen Feld erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionisation durch Zerstäubung des Substanzgemisches im elektrischen Feld erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeich- net, dass in Schritt (a) zwischen 1 und 100 Masse/Ladungs- Quotienten verschiedener durch Ionisation entstandener und ausgewählter Ionen analysiert wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeich- net, dass das Substanzgemisch biologischen oder chemischen
Ursprungs ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzgemische vor der Analyse oder vor der chromatographischen Auftrennung nach Anspruch 2 oder 3 deri- vatisiert werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren manuell oder automatisch durchgeführt wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einem High Throughput Screening verwendet wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt (c) analysierte Fragmention und die in Schritt (d) analysierten (m/z) -Quotienten aller im Substanzgemisch vorhandenen Ionen oder das in Schritt (c) analy- sierte Fragmention oder die in Schritt (d) analysierten
(m/z) -Quotienten aller im Substanzgemisch vorhandenen Ionen quantifiziert werden.
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