WO2003050517A1 - Optisch transparentes trägersubstrat für eine maldi-messanordnung und dessen verwendung - Google Patents

Optisch transparentes trägersubstrat für eine maldi-messanordnung und dessen verwendung Download PDF

Info

Publication number
WO2003050517A1
WO2003050517A1 PCT/EP2002/013312 EP0213312W WO03050517A1 WO 2003050517 A1 WO2003050517 A1 WO 2003050517A1 EP 0213312 W EP0213312 W EP 0213312W WO 03050517 A1 WO03050517 A1 WO 03050517A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
carrier substrate
optically transparent
layer
maldi
analytes
Prior art date
Application number
PCT/EP2002/013312
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerhard M. Kresbach
Peter Oroszlan
Martin SCHÄR
Original Assignee
Zeptosens Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeptosens Ag filed Critical Zeptosens Ag
Priority to EP02804574A priority Critical patent/EP1454127A1/de
Priority to AU2002357547A priority patent/AU2002357547A1/en
Publication of WO2003050517A1 publication Critical patent/WO2003050517A1/de

Links

Classifications

    • HELECTRICITY
    • H01ELECTRIC ELEMENTS
    • H01JELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02Details
    • H01J49/04Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components
    • H01J49/0409Sample holders or containers
    • H01J49/0418Sample holders or containers for laser desorption, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI] plates or surface enhanced laser desorption/ionisation [SELDI] plates
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82NANOTECHNOLOGY
    • B82YSPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/251Colorimeters; Construction thereof
    • G01N21/253Colorimeters; Construction thereof for batch operation, i.e. multisample apparatus
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/41Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
    • G01N21/45Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length using interferometric methods; using Schlieren methods
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55Specular reflectivity
    • G01N21/552Attenuated total reflection
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/7703Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides
    • G01N21/774Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides the reagent being on a grating or periodic structure
    • G01N21/7743Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides the reagent being on a grating or periodic structure the reagent-coated grating coupling light in or out of the waveguide
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277Apparatus
    • B01J2219/00351Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00364Pipettes
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277Apparatus
    • B01J2219/00351Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00378Piezoelectric or ink jet dispensers
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277Apparatus
    • B01J2219/00351Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00387Applications using probes
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277Apparatus
    • B01J2219/00497Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527Sheets
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585Parallel processes
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00596Solid-phase processes
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061The surface being organic
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00617Delimitation of the attachment areas by chemical means
    • B01J2219/00619Delimitation of the attachment areas by chemical means using hydrophilic or hydrophobic regions
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659Two-dimensional arrays
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702Processes involving means for analysing and characterising the products
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00709Type of synthesis
    • B01J2219/00711Light-directed synthesis
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072Organic compounds
    • B01J2219/00722Nucleotides
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072Organic compounds
    • B01J2219/00725Peptides
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072Organic compounds
    • B01J2219/00729Peptide nucleic acids [PNA]
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072Organic compounds
    • B01J2219/00731Saccharides
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C40COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40BCOMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C40COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40BCOMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C40COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40BCOMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/12Libraries containing saccharides or polysaccharides, or derivatives thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C40COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40BCOMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the invention relates to an optically transparent carrier substrate for a MALDI measuring arrangement (MALDI-MS: “Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry”) at at least one irradiated excitation wavelength, characterized in that said carrier substrate sequentially carries out one or more optical and one or one or allows several mass spectrometric measurements, as well as the correspondingly carried out coupled optical and mass spectrometric detection methods and their use.
  • MALDI-MS “Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry”
  • the invention also relates to a carrier substrate for a MALDI measuring arrangement which is optically transparent at at least one irradiated excitation wavelength, characterized in that the material of said carrier substrate comprises a metal oxide or a mixture of metal oxides, and mass spectrometric and coupled detection methods carried out with this carrier substrate and their use.
  • MALDI-MS Microwave Assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry
  • the MALDI principle is based on the fact that the analyte, such as a peptide or protein, is embedded in a matrix of typically organic molecules of low molecular weight (eg sinapic acid) or is in contact with such a matrix.
  • the matrix material is selected so that it is highly absorbent at the excitation wavelength of a strong, stimulating laser pulse.
  • the sample matrix is evaporated into the vacuum of the MS apparatus.
  • the or embedded in the matrix associated analyte molecules are also converted into the gas phase and optionally also ionized by proton transfer from the sample matrix. In this way, even large molecules up to a molecular weight of several hundred thousand daltons can be converted into the gas phase.
  • time-of-flight (TOF) mass spectrometer In a typical mass spectrometric arrangement, the analyte ions are then accelerated for mass separation in an electrical field of a time-of-flight mass spectrometer ("time-of-flight (TOF) mass spectrometer").
  • TOF time-of-flight
  • a particular advantage of the MALDI method is that in the linear Little or no fragments of TOF-MS are detected, but they can be detected in a reflectron-TOF-MS, which can be used to determine both the molecular mass and structural elements of the measured compounds, which is a disadvantage of the fact that MALDI-MS predominantly only suitable for mass determination of larger molecules (with a molecular weight> 500 Da), whereas the presence of the sample matrix can have a disruptive effect in the range of small molecular weights.
  • the carrier or frame for the MALDI matrix traditionally consists of an electrically conductive material, i.e. H. a metallic plate or grid [see e.g. B. U.S. Patent No. 5,580,434].
  • a mass spectrometric apparatus based on the MALDI principle is referred to below as a "MALDI measuring arrangement".
  • MALDI like other mass spectrometric analysis methods, enables substances to be identified based on their molecular weight.
  • microarrays such as, for example, nucleic acid or protein microarrays
  • detection platforms are available all known as “biochips”.
  • biochips For this purpose, a large number of different biological or biochemical or synthetically producible recognition elements for the specific recognition and binding of the respective target analyte are immobilized in a two-dimensional arrangement on an essentially planar carrier.
  • the sample is then brought into contact with the analytes to be detected and, if appropriate, further reagents with the detection elements immobilized on the carrier surface in an assay comprising a single or several addition steps.
  • the qualitative and in many cases also quantitative detection of bound analyte molecules, from which their concentration in the sample under investigation is to be determined, can be carried out using a large number of different detection methods.
  • Fluorescence-based detection methods are widely used. Since the analyte molecules to be detected are only fluorescent in the rarest of cases, so-called fluorescence labels are generally used for fluorescence-based analyte detection, which are bound, for example, to the analyte or to one of its binding partners.
  • Arrays with a very high density of discrete measurement areas (“features”) are known based on simple glass or microscope plates. For example, US Pat. No. 5,445,934 describes and claims arrays of oligonucleotides with a density of more than 1000 features per square centimeter.
  • excitation and reading out of such arrays is based on classic optical arrangements and methods, and the entire array can be illuminated simultaneously with an expanded excitation light bundle, but this leads to a relatively low sensitivity since the excitation light intensities related to the area are relatively low under these conditions
  • confocal microscope measuring arrangements are often used and the various features sequ read out essentially by "scanning".
  • an analyte detection in the evanescent field of an optical waveguide in particular a thin-film waveguide: If a light wave is coupled into a planar thin-film waveguide , which is surrounded by optically thinner media, it is guided by total reflection at the interfaces of the waveguiding layer.
  • a planar thin-film waveguide consists of a three-layer system: carrier material, waveguiding layer, superstrate (or sample to be examined), the waveguiding layer having the highest refractive index. Additional intermediate layers can improve the effect of the planar waveguide.
  • the strength of the evanescent field depends very much on the thickness of the waveguiding layer itself, as well as on the ratio of the refractive indices of the waveguiding layer and the media surrounding it. With thin waveguides, ie layer thicknesses of the same or lower thickness than the wavelength to be guided, discrete modes of the guided light can be distinguished.
  • Different methods for the detection of analytes in the evanescent field of guided light waves in optical layer waveguides can be differentiated.
  • a distinction can be made, for example, between fluorescence or general luminescence methods on the one hand and refractive methods on the other.
  • methods for generating a surface plasmon resonance in a thin metal layer on a dielectric layer with a lower refractive index can be included in the group of refractive methods, provided that the resonance angle of the irradiated excitation light for generating the surface plasmon resonance serves as the basis for determining the measurement variable.
  • Surface plasmon resonance can also be used to enhance luminescence or to improve the signal-to-background ratio in a luminescence measurement.
  • the conditions for generating a surface plasmon resonance, as well as for combination with luminescence measurements, as well as with wave-guiding structures, are often described in the literature.
  • luminescence is used in this application to describe the spontaneous emission of photons in the ultraviolet to infrared range according to optical or non-optical, such as electrical or chemical or biochemical or thermal excitation.
  • chemiluminescence, bioluminescence, electroluminescence and in particular fluorescence and phosphorescence are included under the term “luminescence”. Fluorescence and phosphorescence are particularly preferred forms of luminescence.
  • the change in the so-called effective refractive index due to molecular adsorption or desorption on the waveguide is used to detect the analyte.
  • This change in the effective refractive index in the case of grating coupler sensors, is determined from the change in the coupling angle for the coupling in or out of light into or out of the grating coupler sensor, and in the case of interferometric sensors from the change in the phase difference between the a sensor arm and a reference arm of the interferometer-guided measurement light.
  • the refractive methods mentioned have the advantage that they can be used without the use of additional labeling molecules, so-called molecular labels.
  • the disadvantage of these label-free methods is, however, that the detection limits that can be achieved with them are limited to picosolar to nanomolar concentration ranges due to the low selectivity of the measurement principle, depending on the molecular weight of the analyte, which is not sufficient for many applications, for example for diagnostic applications.
  • luminescence-based methods appear more suitable due to the greater selectivity of the signal generation.
  • the luminescence excitation is limited to the depth of penetration of the evanescent field into the optically thinner medium, i.e. to the immediate vicinity of the wave-guiding region with a depth of penetration of the order of a few hundred nanometers into the medium. This principle is called evanescent luminescence excitation. This method of excitation is of great importance for analysis, since it can be used to minimize disruptive influences from the depth of the medium.
  • optical detection methods mentioned have been expanded in recent years from sensor platforms for determining individual analytes on platforms with hundreds to thousands of different detection elements immobilized in discrete measurement areas (“spots”) for determining a large number of different analytes on a common platform (“microarrays”).
  • spots discrete measurement areas
  • microarrays common platform
  • kinetics of the interactions between analytes and their immobilized recognition elements can be monitored in real time using surface-based detection methods, for example based on interactions in the evanescent field of a waveguide or a surface plasmon.
  • optical detection methods mentioned do not enable identification of the bound analyte molecules, which is necessary, for example, for screening applications.
  • a second, more elegant approach is based on the direct use of the SPR chip after completion of the optical (SPR) measurement as a carrier (“probe”) in the MALDI device.
  • the MALDI matrix was placed on the SPR Chip applied [RW Nelson, JW Jarvik, BE Taillon and KA Tubbs, "BIA / MS of epitope-tagged peptides directly from E. CoZ lysate: multiplex detection and proetin identification at low-femtomole to subfemtomole levels", Analytical Chemistry 71 (1999 ) 2858-2865].
  • the carrier material (SPR chip surface) was gold, ie an optically non-transparent material (in the sense of the definition below).
  • Optical transparency of the material or of a carrier substrate should be understood to mean that the run length of a light guided in said material or in said carrier substrate or in the (highly refractive) waveguiding film of a carrier substrate designed as an optical waveguide is at least a portion of the visible spectrum (between 400 nm and 750 nm) is larger than 2 mm, unless this run length is limited by structures for changing the direction of propagation of said light.
  • the run length of optically visible light ie the distance on the path of the Light in the corresponding material, until the light intensity decreases to a value 1 / e of the original intensity when light enters this material, in the order of a few centimeters (e.g.
  • the propagation length of a light guided in the waveguiding layer can be limited to a few micrometers by a coupling-out diffractive grating (formed in the waveguiding layer).
  • this limitation of the barrel length is due to the structuring and not the material properties of the structure.
  • such a grating waveguide structure should be referred to as “optically transparent”.
  • the propagation length of a thin metal film is due to the high absorption of the metal in question, that is to say due to the material, over distances limited in the order of magnitude of at most 100 ⁇ m to 200 ⁇ m. Accordingly, such an SPR structure, based on a thin metal film for producing a surface plasmon resonance, should be referred to as “optically non-transparent”.
  • US Pat. Nos. 5,770,860 and 6,287,872 describe sample carriers with the basic dimensions of a microtiter plate to enable high-throughput measurements for screening applications. However, no information is given about the carrier material and its optical properties.
  • US Pat. No. 6,043,031 describes "chips" as sample carriers for the mass spectrometric determination of nucleic acid sequences. Glass chip filters, glass and metal surfaces (steel, gold, silver, aluminum, copper and silicon) are used as “chip” materials ) and plastic (polyethylene, polypropylene, polyamide, polyvinylidene fluoride membranes or microtiter plates). Again, however, there is no indication of a combination of the mass spectrometric detection method with optical detection methods.
  • an optically transparent carrier substrate the surface of which comprises a metal oxide, preferably TiO 2 or Ta 2 O 5 or Nb O 5 , is very suitable for a MALDI measuring arrangement.
  • the first object of the invention is an optically transparent carrier substrate for a MALDI measuring arrangement at at least one irradiated excitation wavelength, characterized in that said carrier substrate allows sequential execution of one or more optical and one or more mass spectrometric measurements.
  • the carrier substrate can comprise a material from the group of glass, quartz, optically transparent ceramics, metal oxides, optically transparent plastics, in particular transparent thermoplastic plastics, such as, for example, polycarbonates, acrylates, polyacrylates, in particular polymethyl methacrylates and polystyrenes. It is preferred that said optically transparent plastics are moldable, embossable, sprayable and / or millable.
  • the invention also relates to a carrier substrate for a MALDI measuring arrangement which is optically transparent at at least one irradiated excitation wavelength, characterized in that the surface of said carrier substrate comprises a metal oxide or a mixture of metal oxides.
  • the material of an optically transparent carrier substrate according to the invention for a MALDI measuring arrangement comprises a metal oxide from the group formed by TiO 2 , ZnO, Nb 2 O 5 , Ta 2 O 5 , HfO, and ZrO 2 , wherein TiO 2 , Ta 2 O 5 and Nb 2 O 5 are particularly preferred.
  • a MALDI matrix consisting of molecules strongly absorbing at the wavelength of a laser pulse irradiated in the desorption step, is applied to the surface of a carrier substrate according to the invention, directly as the first layer or to further layers applied to the carrier substrate surface.
  • Said MALDI matrix preferably comprises compounds from the group of hydroxybenzoic acids, such as, for example, gallic acid, gentisic acid (2,5-hydroxybenzoic acid) and 2- (4-hydroxyphenylazo) benzoic acid, succinic acid, 3-hydroxy-picolinic acid, caffeic acid, ferulic acid, 4-nitroaniline , Anthranilic acid, salicylamide, isovanillin, dithranol, 3-aminoquinoline, 1-hydroxyisoquinoline, nicotinic acid, sinapic acid, trans-3-indolacrylic acid, cinnamic acid and their derivatives, such as trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxy-cinnamic acid as well as ⁇ -cyano-4-hydroxy-cinnamic acid, di- and trihydroxy-acetophenones (e.g., hydroxybenzoic acids, such as, for example, gallic acid, gentisic acid (2,5-hydroxybenzoic acid)
  • the MALDI matrix is designed as a self-assembled monolayer (“self-assembled monolayer”, SAM).
  • the analyte molecules to be determined by mass spectrometry can be embedded in the MALDI matrix. It is also possible for the MALDI matrix to be applied to the carrier substrate after the analyte molecules have been applied.
  • a likewise transparent adhesive layer is applied to said carrier substrate for immobilizing the analyte molecules, which preferably has a thickness of less than 200 nm, particularly preferably less than 20 nm.
  • an adhesion promoter layer compounds from the group of silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized passive or functionalized mono- or multilayers", alkyl phosphates and phosphonates and multifunctional block copolymers, such as, for example Poly (L) lysine / polyethylene glycols.
  • adhesion promoter layer comprises compounds from the group of organophosphoric acids of the general formula I (A)
  • B is an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, hetaryl or hetarylalkyl radical and Y is hydrogen or a functional group from the series hydroxyl, carboxy, amino, optionally mono- or substituted by lower alkyl Dialkylamino, thiol, or a negative acid group from the series consisting of ester, phosphate, phosphonate, sulfate, sulfonate, maleimide, succinimydyl, epoxy or acrylate, with B or Y being a biological, biochemical or synthetic producible recognition element can be docked by addition or substitution reaction, it also being possible to attach compounds which give the substrate surface resistance to protein adsorption and / or cell adhesion and in B in the chain optionally one or more ethylene oxide groups instead of one or more CH 2 groups can be included.
  • An important group of important embodiments of an optically transparent carrier substrate according to the invention is characterized in that biological or biochemical or synthetically producible recognition elements are immobilized on the surface of the carrier substrate or on the adhesion-promoting layer applied to the carrier substrate, for the recognition and binding of one or more analytes from one or more several samples which are brought into contact with said recognition elements.
  • analyte molecules prefferably be determined by mass spectrometry to be applied to the MALDI matrix located on the carrier substrate.
  • Biological or biochemical or synthetically producible recognition elements can also be immobilized on the MALDI matrix applied to the carrier substrate, for the recognition and binding of one or more analytes from one or more samples which are brought into contact with said recognition elements.
  • the MALDI matrix also has the function of an adhesion promoting layer or if an adhesion promoting layer applied to said carrier substrate has the function of a MALDI matrix.
  • a layer applied to the carrier substrate can also be present as a mixture of a MALDI matrix and an adhesion-promoting layer.
  • a mixture of the molecules to be formed and the one MALDI matrix is first Adhesion promoting layer to be formed molecules in liquid solution. This mixture solution is then applied to the carrier substrate, on which the mixed layer remains after the solvent has evaporated.
  • an optically transparent carrier substrate is therefore characterized in that the analyte molecules to be determined by mass spectrometry or the chemical or biological or synthetically producible detection elements are immobilized in discrete measurement areas (spots) on said carrier substrate or on an adhesion-promoting layer applied thereon or on the MALDI matrix are.
  • up to 1 000 000 measuring ranges can be arranged in a 2-dimensional arrangement.
  • a single measuring range can, for example, occupy an area of 0.001 - 6 mm 2 . It is preferred that in a 2-dimensional arrangement more than 100, preferably more than 1000, particularly preferably more than 10,000 measuring ranges are arranged per square centimeter.
  • the measuring ranges can therefore each comprise a multiplicity (i.e. two or more) of different types of analyte molecules to be determined by mass spectrometry or of (bio) chemical or biological or synthetically producible detection elements.
  • a special embodiment of an optically transparent carrier substrate according to the invention is characterized in that the surface thereof comprises pure or mixed oxides, nitrides or carbides of metals or semiconductors and then chemical structuring by local deposition of mono- or multilayers from organophosphates and / or organophosphonates (according to the preceding Description) is generated. It is preferred that the surface of said carrier substrate has a defined pattern with silicon oxide or transition metal oxides. For this embodiment, it is also advantageous if further mono- or multilayers composed of organophosphates and / or organophosphonates are applied to the silicon oxide regions by deposition from organic solvents.
  • an optically transparent carrier substrate according to the invention is characterized in that its surface comprises pure or mixed oxides, nitrides or carbides of metals or semiconductors and generates local hydrophobic or hydrophilic areas thereon by local deposition of mono- or multilayers from organophosphates and / or organophosphonates are and the surrounding substrate surface is covered with a terminally hydrophobic or hydrophilic monolayer.
  • said MALDI matrix or said adhesive layer or said monolayers or multilayers and / or said biological or biochemical or synthetically producible recognition elements are applied by means of a method which is selected from the group consisting of dipping, spraying, spreading, brushing, "inkjet spotting", mechanical spotting using a pen, Spring or capillary, "micro contact printing", fluidic contacting of the substrate surface with parallel or crossed microchannels, under the influence of pressure differences or electrical or electromagnetic potentials ", photolithographic immobilization methods etc. includes.
  • the biological or biochemical or synthetically producible recognition elements can be selected from the group consisting of nucleic acids (for example DNA, RNA, oligonucleotides) and nucleic acid analogs (for example PNA) and their derivatives with artificial bases, mono- or polyclonal antibodies, antibody fragments, Peptides, enzymes, aptamers, synthetic peptide structures, glycopeptides, glycoproteins, oligosaccharides, lectins, soluble, membrane-bound proteins isolated from a membrane, such as receptors, their ligands, antigens for antibodies (e.g. biotin for streptavidin), "histidine Tag components "and their complex formation partners, cavities generated by chemical synthesis for receiving molecular imprints, etc. is formed.
  • nucleic acids for example DNA, RNA, oligonucleotides
  • nucleic acid analogs for example PNA
  • the analyte molecules to be determined by mass spectrometry can be selected from the group consisting of nucleic acids (for example DNA, RNA, oligonucleotides) and nucleic acid analogs (for example PNA) and their derivatives with artificial bases, mono- or polyclonal antibodies, peptides, enzymes, Aptamers, synthetic peptide structures, glycopeptides, glycoproteins, oligosaccharides, lectins, soluble, membrane-bound proteins isolated from a membrane, such as receptors, their ligands, antigens for antibodies (e.g. biotin for streptavidin), "histidine tag components" and their complex formation partners are formed.
  • nucleic acids for example DNA, RNA, oligonucleotides
  • nucleic acid analogs for example PNA
  • both biological or biochemical or synthetically producible recognition elements and analyte molecules to be determined by mass spectrometry can each be selected from the group consisting of acetylenes, alkaloids (for example alkaloids with pyridines, pyperidines, tropanes, quinolines, isoquinolines, tropilidenes, imidazoles, indoles, purines, Ring structures containing fenantridines), alkaloid glycosides, amines, benzofurans, benzophenones, naphthoquinones, betaines, carbohydrates (e.g.
  • the recognition elements mentioned can be immobilized in isolated form or in an artificial or natural complex environment, for example as a component of cells, cell fragments, tissue (“tissue slices”) membranes etc.
  • areas between the spatially separated measuring areas are "passivated” to minimize non-specific binding of analytes or their detection substances, ie that between the spatially separated measuring areas (d) are "chemically” compared to the analyte neutral "connections are applied, preferably consisting for example of the Groups derived from albumins, in particular bovine serum albumin or human serum albumin, casein, non-specific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies (in particular for immunoassays) for the analyte (s) to be detected, detergents - such as from the Tween series, in particular Tween 20 - , not to be analyzed with polynucleotides that hybridize, fragmented natural or synthetic DNA, such as an extract of herring or salmon sperm (especially for polynucleotide hybridization assays), or also uncharged, but hydrophilic polymers, such as
  • a preferred embodiment of an optically transparent carrier substrate according to the invention is characterized in that it comprises an optical waveguide which is essentially planar.
  • Such an embodiment of an optically transparent carrier substrate is particularly preferred, which comprises an optical thin-film waveguide with a layer (a) which is transparent at at least one excitation wavelength on a layer (b) which is also transparent at at least this excitation wavelength and has a lower refractive index than layer (a).
  • the optically transparent layer (b) can comprise a material from the group consisting of silicates, e.g. B. glass or quartz, transparent thermoplastic or sprayable plastic, for example polycarbonates, polyimides, acrylates, in particular polymethyl methacrylates, or polystyrenes is formed.
  • the refractive index of the optically transparent layer (a) is preferably greater than 1.8.
  • the optically transparent layer (a)) be a material from the group of TiO, ZnO, Nb 2 O 5) Ta 2 ⁇ 5 , Hf0 2 , or ZrO 2 , but particularly preferably made of TiO or Ta 2 O 5 or Nb 2 O 5 .
  • the thickness of layer (a) is 40 nm - 1000 nm, preferably 100 nm - 300 nm.
  • Various methods for coupling an excitation light into a planar optical waveguide are known.
  • end face coupling using lenses placed in front of an end face of the waveguide, in particular cylindrical lenses is a widely used method.
  • a cylindrical lens which serves to couple light in can also itself be part of an end face of an optical waveguide.
  • Such a structure can be produced, for example, by injection molding a transparent plastic (such as polystyrene).
  • an optical waveguide and a coupling prism placed thereon can also be produced as a single component in a single production step by injection molding. It is more widespread that a prism, typically made of glass or a transparent plastic, is placed on a planar waveguide. In order to reduce reflections at the boundary layers and in particular the disturbance of air gaps between the waveguide and the prism, a liquid that adjusts the refractive index between the prism and the waveguide is often used. It is advantageous if the difference in the refractive indices of the liquid and the waveguiding layer is as small as possible.
  • the coupling of light using diffractive coupling gratings connected to the waveguiding layer is particularly advantageous.
  • An optically transparent carrier substrate which comprises an essentially planar optical waveguide and is characterized in that said carrier substrate comprises one or more optical coupling elements from the group of face-coupled cylindrical lenses or optical fibers as light guides, coupling prisms and optical coupling gratings preferred if said carrier substrate comprises one or more lattice structures (c) as coupling lattice, which as Surface relief grids are modulated in the optically transparent layer (a).
  • said carrier substrate comprises one or more optical coupling elements from the group of face-coupled cylindrical lenses or optical fibers as light guides, coupling prisms and optical coupling gratings preferred if said carrier substrate comprises one or more lattice structures (c) as coupling lattice, which as Surface relief grids are modulated in the optically transparent layer (a).
  • Such lattice structures (c) are advantageously mono- or multi-diffractive and have a depth of 2 nm - 100 nm, preferably of 10 nm - 30 nm, and a period of 200 nm - 1000 nm, preferably of 300 nm - 700 nm.
  • Another object of the invention is a coupled detection method for the qualitative and / or quantitative determination and mass spectrometric identification of one or more analytes, characterized in that an optically transparent carrier substrate according to the invention, according to one of the above-mentioned embodiments, with one or more samples with the detection therein Analyte is brought into contact and optical and mass spectrometric detection are carried out sequentially.
  • the characteristic of such an optical detection method according to the invention is that, as part of the optical method step for the simultaneous or sequential, qualitative and / or quantitative detection of one or more analytes in one or more samples, said samples and optionally further reagents with those on a carrier substrate (directly or mediated via one or more layers) of immobilized recognition elements for specific recognition and binding of said analytes are brought into contact and changes in optical or electronic signals resulting from the binding of these analytes or other detection substances used for analyte detection are measured.
  • the one or more samples are preincubated with a mixture of the various detection reagents to determine the analytes to be detected in said samples and these mixtures are then each in a single addition step with the immobilized recognition elements be brought into contact.
  • a preferred embodiment of a coupled detection method according to the invention is characterized in that the optical detection of one or several analytes is based on the determination of the change in the effective refractive index on the surface of the carrier substrate carrying the immobilized biological or biochemical or synthetically producible recognition elements, on the basis of molecular adsorption or deodorization.
  • a special embodiment of the coupled detection method is characterized in that the optical detection of the one or more analytes is based on the determination of the change in the phase difference between a light component of an incident detection light that interacts with the areas of the immobilized detection elements and a reference component.
  • Such a special embodiment can be carried out in such a way that the incident detection light is polychromatic and the optical detection of the one or more analytes is based on the determination of the change in the spectral distribution of interference maxima and minima, under a predetermined observation angle.
  • the method can also be carried out in such a way that the optical detection of the one or more analytes is based on the determination of the change in the spatial distribution of interference maxima and minima.
  • the incident detection light is monochromatic.
  • optical detection of the one or more analytes is based on the determination of the change in one or more luminescences.
  • the excitation light from one or more light sources is irradiated in an incident light excitation arrangement.
  • the excitation light from one or more light sources is irradiated in a transmission light excitation arrangement.
  • a particularly preferred embodiment of a coupled detection method according to the invention is characterized in that the biological or biochemical recognition elements, for the specific recognition and binding of one or more analytes, are immobilized on a preferably planar optical waveguide as a carrier substrate (directly or via one or more layers), immobilized that the one or more samples with the one or more analytes to be detected therein and possibly further detection reagents are brought into contact with said immobilized detection elements sequentially or after mixing with said samples in a single step and that the excitation light from one or more light sources is coupled into the optical waveguide with the help of one or more optical coupling elements from the group consisting of cylindrical lenses coupled to the end faces, optical fibers as Lic htleitern, coupling prisms and optical coupling grids is formed.
  • a possible variant was characterized in that the optical detection of the one or more analytes in the near field (evanescent field) of an optical layer waveguide as a carrier substrate, with a layer (a) transparent at least at one excitation wavelength on a layer which is also transparent at at least this excitation wavelength ( b) with a lower refractive index than layer (a), and over a grating structure (c) or (c ') which is pronounced in layer (a) of the optical layer waveguide, based on the biological immobilized on the analyte and / or other detection reagents or biochemical or synthetically producible detection elements, resulting changes in the resonance conditions for coupling an excitation light into the layer (a) of a carrier designed as a layer waveguide or for coupling out light carried in the layer (a).
  • Characteristic of a sub-variant is that the optical detection of the one or more analytes on the change in the coupling angle of an incident on a grating structure (c) embossed in the layer (a), essentially monochromatic detection light in layer (a), due to the binding of the analyte and / or further detection reagents, to whose biological or biochemical or synthetically producible detection elements immobilized in the area of this lattice structure.
  • “Essentially monochromatic” is understood to mean that the spectral bandwidth of an excitation light radiated onto the grating structure (c) is at most 20 nm, preferably at most 5 nm, particularly preferably at most 1 nm.
  • Essentially parallel is understood here to mean that the angle of convergence or divergence (opening angle) of an excitation light radiated onto the grating structure (c) is at most 5 °, preferably at most 1 °, particularly preferably at most 0.2 °.
  • the invention also relates to a coupled detection method, which is characterized in that the optical detection of the one or more analytes on a spatially resolved determination of changes in the resonance conditions for coupling an excitation light into the layer (a) or coupling out one in the layer ( a) based on a layer waveguide as the carrier substrate, with a two-dimensional array of at least four or more spatially separated measurement areas on this layer waveguide as the carrier substrate, with a first optically transparent layer (a) on a second optically transparent layer (b) with a lower refractive index than layer (a),
  • the density of the measurement areas on a common grid structure (c) being at least 10 measurement areas per square centimeter and said excitation light being simultaneously irradiated onto said array of measurement areas and the degree of fulfillment of the resonance condition for the light coupling into the layer (a) is measured simultaneously to said measuring ranges and crosstalk of excitation light carried in layer (a) from one measuring range to one or more adjacent measuring ranges by means of the coupling out of this excitation light in the middle ls the lattice structure (c) is prevented.
  • Another preferred object of the invention is a coupled detection method, wherein an optical waveguide is formed as a layer waveguide as a carrier substrate with a first optically transparent layer (a) on a second optically transparent layer (b) with a lower refractive index than layer (a), furthermore Excitation light with the aid of one or more grating structures (c) or (c '), which are pronounced in the optically transparent layer (a), is coupled into the optically transparent layer (a) and is guided as a guided wave to the measuring areas (d) located thereon, and wherein the luminescence of molecules capable of luminescence generated in the evanescent field of said guided wave is detected with one or more detectors and the relative amount or concentration of one or more analytes is determined from the intensity of these luminescence signals.
  • Such an embodiment of the coupled detection method according to the invention is particularly suitable for highly sensitive optical detection of one or more analytes in one or more samples, in that said samples with the analytes to be detected therein and optionally further detection reagents are added sequentially or after mixing with said samples in a single step on a planar optical waveguide as a carrier substrate (directly or via one or more layers) immobilized biological or biochemical or synthetically producible recognition elements, for specific recognition and binding of said analytes, and that the excitation light from one or more light sources in the optical Waveguide (ie the waveguiding layer (a)) is coupled in using one or more optical coupling elements (preferably using a grating structure (c) formed in layer (a)).
  • (1) the isotropically emitted luminescence or (2) luminescence coupled into the optically transparent layer (a) and coupled out via a lattice structure (c) or (c ') or luminescence of both portions (1) and (2) can be measured simultaneously.
  • the analyte molecules or the chemical or biological or synthetically producible recognition elements in discrete measurement areas (spots) on said carrier substrate or on an adhesion-promoting layer applied thereon or on the MALDI - Matrix are immobilized and that the light emanating from the discrete measuring areas is measured and recorded with one or more detectors in an imaging process.
  • Different or identical analytes or recognition elements can be used in different discrete measurement ranges Detection of different or the same analytes can be applied.
  • Several different analytes or detection elements for detecting different analytes can also be applied in a single measuring range.
  • an applied biological or biochemical or synthetically producible detection element typically serves for the specific detection of an individual analyte.
  • an immobilized recognition element can also be designed in such a way that it serves for the detection of several, ie of two or more, different analytes as a result of their binding to different discrete recognition regions of the recognition element.
  • discrete sections with different base sequences can serve to bind different (single-stranded) nucleic acids to be detected in a sample with sequences complementary to the discrete sections.
  • the data recorded in an (imaging) coupled detection method according to the invention are typically stored in a two-dimensional data matrix on a data carrier.
  • a luminescent dye or luminescent nanoparticle is used as the luminescent label, which is used at a wavelength between 300 nm and 1100 nm can be excited and emitted.
  • the luminescence label can be bound to the analyte or in a competitive assay to an analog of the analyte or in a multi-stage assay to one of the binding partners of the immobilized biological or biochemical or synthetically producible recognition elements or to the biological or biochemical or synthetically producible recognition elements.
  • a special embodiment of the method is characterized in that a second or even further luminescence label with the same or different one Excitation wavelength as the first luminescence label and the same or different emission wavelength can be used.
  • the second or even more luminescent label can be excited at the same wavelength as the first luminescent dye, but emit at other wavelengths.
  • a variant of the method consists in that charge or optical energy transfer from a first luminescence label serving as donor to a second luminescence label serving as acceptor is used to detect the analyte.
  • a further embodiment of the method is characterized in that, in addition to the determination of one or more luminescences, changes in the effective refractive index on the measurement areas are determined.
  • a further development of the method is characterized in that the one or more luminescences and / or determinations of light signals are carried out polarization-selectively at the excitation wavelength.
  • the one or more luminescences are measured with a different polarization than that of the excitation light.
  • a coupled detection method according to the invention according to one of the embodiments mentioned can be used for simultaneous or sequential, quantitative or qualitative determination of one or more analytes from the group of proteins, such as, for example, antibodies or antibody fragments, antigens, receptors and their ligands, chelators, with additional binding sites of functionalized proteins (“tag proteins”, such as “histidine tag proteins”) ) and their complex formation partners, natural or modified nucleic acids, such as oligonucleotides, DNA or RNA strands, DNA or RNA analogs, enzymes, enzyme cofactors or inhibitors, lectins and primary or secondary metabolites of biological processes.
  • proteins such as, for example, antibodies or antibody fragments, antigens, receptors and their ligands, chelators, with additional binding sites of functionalized proteins (“tag proteins”, such as “histidine tag proteins”)
  • tag proteins such as “histidine tag proteins”
  • nucleic acids such as oligonucleotides, DNA or RNA strands, DNA or
  • the method can also be used to determine substances from the group of acetylenes, alkaloids (for example alkaloids with pyridines, pyperidines, tropanes, quinolines, isoquinolines, tropilidenes, imidazoles, indoles, purines, fenantridines-containing ring structures), alkaloid glycosides, amines, benzofurans, Benzophenones, naphthoquinones, betaines, carbohydrates (e.g.
  • the samples to be examined can be aqueous solutions, in particular buffer solutions or naturally occurring body fluids such as blood, serum, plasma, lymph or urine or tissue fluids or, for example, egg yolk his.
  • a sample to be examined can also be an optically cloudy liquid, surface water, a soil or plant extract or a bio or synthesis process broth.
  • the samples can also be prepared from biological tissue parts or cell cultures.
  • Another object of the invention is a method for the mass spectrometric determination of one or more analytes, characterized in that a carrier substrate according to the invention according to one of the above-mentioned embodiments is used in a MALDI measuring arrangement, the carrier substrate having a metal oxide surface, preferably from the group comprising TiO 2 , ZnO , Nb 2 O 5 , Ta 2 O 5 , HfO 2 , and ZrO 2 .
  • the mass spectrometric determination method according to the invention is preferably carried out in such a way that the signals from ions with a low mass-to-charge quotient, in particular from the MALDI matrix, are minimized by means of time-delayed application of the acceleration voltage in the time-of-flight tube of the MALDI measuring arrangement after the laser-induced deodorization step can.
  • the metal oxide of the carrier substrate surface is selected from the group comprising TiO 2 , ZnO, Nb 2 O 5 , Ta 2 O 5 , HfO 2 , and ZrO 2 .
  • a coupled detection method is also part of the present invention, which is characterized in that a carrier substrate according to one of the above-mentioned embodiments is used for the part of the mass spectrometric detection of one or more analytes in a MALDI measuring arrangement.
  • a carrier substrate according to one of the above-mentioned embodiments is used for the part of the mass spectrometric detection of one or more analytes in a MALDI measuring arrangement.
  • analyte molecules immobilized on a MALDI matrix applied to the carrier substrate or analyte molecules bound to biological or biochemical or synthetically producible recognition elements within the scope of the optical detection are analyzed by mass spectrometry after completion of the optical detection step in a MALDI measuring arrangement.
  • a preferred embodiment is characterized in that after the completion of the optical detection step on the carrier substrate with directly on said carrier substrate or on an adhesion-promoting layer immobilized on the carrier substrate or with analyte molecules immobilized on directly on said carrier substrate or on a biochemically bonded adhesion-promoting layer or on the carrier substrate or synthetically producible recognition elements, a MALDI matrix is applied to the bound analyte molecules and the immobilized or bound analyte molecules are analyzed by mass spectrometry in a MALDI measuring arrangement.
  • the method is preferably carried out in such a way that the signals from ions with a low mass-to-charge quotient, in particular from the MALDI matrix, can be minimized by applying the acceleration voltage in the time-of-flight tube of the MALDI measuring arrangement after the laser-induced deodorization step.
  • the metal oxide of the carrier substrate surface is selected from the group comprising TiO 2 , ZnO, Nb 2 O 5 , Ta 2 O 5 , HfO 2 , and ZrO 2 .
  • analyte molecules or the chemical or biological or synthetically producible recognition elements with analyte molecules possibly attached to them, to be immobilized in discrete measurement areas (spots) on said carrier substrate or on an adhesion-promoting layer or on the MALDI matrix, and that discrete measuring areas can be analyzed sequentially in a MALDI measuring arrangement using mass spectrometry.
  • measuring areas to comprise a large number of different types of analyte molecules to be determined by mass spectrometry or of (bio) chemical or biological or synthetically producible detection elements, which with spatial resolution within said Measuring ranges in a MALDI measuring arrangement are analyzed by mass spectrometry.
  • up to 1 000 000 measuring ranges are arranged in a 2-dimensional arrangement and that a single measuring range occupies an area of 0.001 - 6 mm 2 , and that said measuring ranges are analyzed sequentially in a MALDI measuring arrangement by mass spectrometry.
  • more than 100, preferably more than 1000, particularly preferably more than 10,000 measurement areas per square centimeter are arranged in a 2-dimensional arrangement, and that said measurement areas are analyzed sequentially in a MALDI measurement arrangement by mass spectrometry.
  • the method according to the invention is suitable for the mass spectrometric determination of one or more analytes from the group of proteins, such as, for example, antibodies or antibody fragments, antigens, receptors and their ligands, chelators, with additional binding sites of functionalized proteins (“tag proteins”, such as, for example, “histidine proteins, Tag proteins ”) and their complex formation partners, natural or modified nucleic acids, such as oligonucleotides, DNA or RNA strands, DNA or RNA analogs, enzymes, enzyme cofactors or inhibitors, lectins. Carbohydrates and primary or secondary metabolites of biological processes.
  • the method can also be used for the mass spectrometric determination of one or more analytes from the group consisting of ring structures containing acetylenes, alkaloids (for example alkaloids with pyridines, pyperidines, tropanes, quinolines, isoquinolines, tropilidenes, imidazoles, indoles, purines, fenantridines) , Amines, benzofurans, benzophenones, naphthoquinones, betaines, carbohydrates (e.g.
  • sugar, starch and cellulose derivatives carbolines, cardenolides, catechols, chalcones, coumarins, cyclic peptides and polypeptides, depsipeptides, diketopethernavins, diphenene , Isoflavanones, flavonoid Alkaloids, furanoquinoline alkaloids, gallocatechins, glycosides, antrachinones, flavonoids, lactones, phenols, hydroquinones, indoles, indoloquinones, alginic acids, lipids (for example oils, waxes and other fatty acid derivatives), macrolides, oligopeptides, oloxidenidenphenphenglyphenol, peroxylphenyl, phenol glycosides, Polyethers, "polyether antibiotics", pterocaphins, pyranocoumarins, pyrroles, quassins, quinolines, saframycines,
  • Another object of the invention is the use of an optically transparent carrier substrate and / or a method according to one of the above-mentioned embodiments for quantitative or qualitative analyzes for determining or enriching or identifying chemical, biochemical or biological analytes in screening processes in pharmaceutical research (in particular high-throughput screening, "High Trough-Put Screening HTS"), clinical and preclinical development, real-time binding studies and the determination of kinetic parameters in affinity screening and research, qualitative and quantitative analyte determinations, in particular for DNA and RNA analysis, for the preparation of Toxicity studies and for the determination of gene or protein expression profiles as well as for the detection of antibodies, antigens, pathogens or bacteria in pharmaceutical product development and research, human and veterinary diagnostics, agrochemis Chen product development and research, symptomatic and presymptomatic plant diagnostics, for patient stratification in pharmaceutical product development and for therapeutic drug selection, for the detection of pathogens, pollutants and pathogens, especially of Salmonella, prions, viruses and bacteria, in food and environmental analysis.
  • Optically transparent carrier substrate with a metal oxide surface, for a MALDI measuring arrangement and detection method carried out with it
  • a solution of the peptide melittin (molecular weight 2846.5 Da) is mixed with sinapic acid (MALDI matrix).
  • a drop of the mixture (approx. 1 ⁇ l) is applied to the unstructured part of the tantalum pentoxide surface of the carrier substrate according to the invention.
  • a drop of the pure sinapic acid is applied to another point on the tantalum pentoxide surface. After the drops have dried to “spots”, each about 1 mm in diameter, mass spectra are recorded from the areas of the two spots.
  • experiment a) is repeated on a glass surface (AF 45, rear side of the optically transparent substrate described under a) and on a substrate with a gold surface, as is conventionally used as a MALDI substrate carrier.
  • the result is mass spectra of comparable but not better quality than that described under a) (FIG. 3). In the case of these surfaces, however, the signals of the sample matrix cannot be completely vanished by applying the acceleration voltage with a time delay.
  • Example 2 A similar carrier substrate as described at the beginning of Example 1 is used. Ten discrete measuring areas (spots) are applied to the tantalum pentoxide surface by applying 1 ⁇ l of an antibody solution (120 ⁇ g / ml anti-interleukin 4 antibodies in 1:10 diluted phosphate salt buffer ("1/10 PBS").
  • 2 reference spots without biochemical recognition elements for an analyte, are applied by applying 1 ⁇ l BSA solution in buffer (for passivation non-specific, free binding sites on the surface with bovine serum albumin (BSA), 1/10 PBS with 3% BSA, which is not binding for the analyte), the carrier substrate is incubated for one hour at room temperature with the applied droplets in a humidity chamber, then with 1/10 PBS buffer rinsed and then incubated again with passivation buffer for one hour.
  • BSA bovine serum albumin
  • sample solution with human interleukin 4 (h-IL 4, 1 ⁇ g / ml) in assay buffer (PBS / 10) are in contact with the entire surface of the carrier substrate brought and incubated for one hour. Then the surface of the carrier substrate is rinsed three times with 1 mL assay buffer and then extensively with water.
  • h-IL 4 human interleukin 4
  • MALDI matrix sinapic acid (3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid) in 50% AcCN / 0.1% TFA (acetonitrile / tri-fluoro-acetic acid) is applied to the substrate support.
  • Both the spots provided for the analyte detection and the spots provided as a reference are then analyzed by mass spectrometry using a MALDI measuring arrangement.
  • the mass spectra from the area provided for the analyte detection show clear signals at an (m / z) value of 15 kDa (corresponding to the molecular weight of h -IL 4), which demonstrates the selective detection and binding of the analyte in the intended measuring areas (spots) on the carrier substrate (FIG. 6).
  • the signals of the sample matrix can be completely suppressed by applying the acceleration voltage with a time delay, and the spectra quality can thus be significantly increased.
  • improved resolution of the spectra ie a reduced peak width and an improved signal-to-noise ratio, were observed.
  • the intensity of the incident laser pulses for laser-induced desorption can be reduced under these conditions.
  • the conditions of the MALDI measuring arrangement can be set for a carrier substrate according to the invention in such a way that the analytes bound in a bioaffinity assay can be selectively released during the deodorization step and identified by mass spectrometry, while their recognition elements immobilized as specific binding partners remain on the carrier substrate.
  • Example 2 Optically transparent carrier substrate for a MALDI measuring arrangement, which sequentially enables an optical and a mass spectrometric measurement to be carried out, and a coupled detection method performed therewith
  • two surface relief gratings with a grid period of 318 nm (with orientation of the grating lines parallel to the width of the plate) and a grating depth of (12 +/- 3) nm are structured at a distance of 9 mm, which are involved in the coating process transferred the tantalum pentoxide film on a scale of 1: 1 to its surface.
  • the length of these lattice structures (parallel to the length of the plate) is 0.5 mm in each case.
  • the binding of human interleukin 4 (h-IL 4, R&D Systems, 7) can be quantified and identified as an analyte.
  • the preparation of the carrier substrate, including the immobilization of the recognition elements, is carried out as described in example ld).
  • the sample solution with h-IL 4 to be detected is preincubated (60 minutes) with a biotinylated, secondary anti-h-IL 4 antibody and Cy5-labeled streptavidin (to generate a fluorescence signal).
  • the solution mixture thus produced is then applied in a single step to the carrier substrate with the immobilized primary anti-h-IL 4 antibodies.
  • the carrier substrate is then inserted into an optical measuring arrangement for the excitation and detection of fluorescence in a planar optical waveguide.
  • a suitable optical measuring arrangement is described, for example, in the application PCT / EP 01/10012, the content of which is considered to be a complete part of the present application.
  • Possible embodiments and the individual steps of the optical detection method are described, for example, in the application PCT / EP 01/05995, the content of which is also regarded as a complete part of the present application.
  • the excitation light of a laser (for example at 635 nm) is coupled into the highly refractive, wave-guiding tantalum pentoxide layer with the aid of the first coupling grating structured as a relief grating in the carrier substrate according to the invention and conducted there until it is coupled out again on the second grating strip.
  • Fluorescent molecules bound to the measuring areas (spots) are excited to fluoresce along the path of the light conduction of the guided light in the evanescent field (on the surface of the tantalum pentoxide film).
  • a MALDI matrix is again applied, as described under example ld), and the carrier substrate modified in this way is then analyzed in a MALDI measuring arrangement by mass spectrometry.
  • FIG. 1 shows the MALDI mass spectrum (positive ions) of the peptide melittin (Img / mL in H 2 O dist.)
  • a carrier substrate consisting of 150 nm tantalum pentoxide on AF45 glass.
  • Sinapic acid saturated solution in 50% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid
  • the time delay (“delay time”) between the laser-induced deodorization step and the application of the acceleration voltage of the MALDI time-of-flight tube was 100 nsec.
  • the mass calibration (m / z) of the MALDI measuring arrangement was used as a carrier substrate for a “normal” gold plate the (m / z) values measured with the optically transparent carrier substrate according to the invention changed slightly.
  • FIG. 2 shows a measurement of the same sample with a delay time increased to 800 nsec.
  • the signals of the sample matrix in the range of small (m / z) values, completely disappear under these conditions, and a higher spectral resolution in the form of a reduced peak width is observed.
  • FIG. 3 shows the MALDI mass spectrum (positive ions) of the peptide melittin (Img / mL in H 2 O dist.) On the gold surface of a conventional carrier substrate.
  • a MALDI matrix in which the peptide is embedded by mixing the solutions was used, sinapic acid (saturated solution in 50% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid). The delay time was 100 nsec.
  • the mass calibration (mz) of the MALDI measuring arrangement for a "normal" gold plate was used as the carrier substrate. As expected, the measured (m / z) value of 2848 agrees well with the literature value.
  • the mass spectrum is of a similar quality to the spectrum generated in FIG. 1 on a metal oxide surface.
  • FIG. 4 shows a MALDI mass spectrum (positive ions) from the range of reference spots, which by applying BSA solution in buffer (for passivation of non-specific, free binding sites) with bovine serum albumin, BSA, which is non-binding for an analyte, is diluted 1:10 in phosphate salt.
  • Buffer solution PBS / 10
  • Sinapic acid saturated solution in 50% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid
  • the delay time was 100 nsec.
  • the mass calibration (m / z) of the MALDI measuring arrangement for a "normal" gold plate was used as the carrier substrate. Taking into account an expected shift in the measured absolute (m / z) values due to the calibration for another carrier material, the measured spectrum corresponds to the signals characteristic of BSA.
  • FIG. 5 shows a section of the spectrum from FIG. 4 for the (m / z) range from 10,000 to 20,000 (corresponding to FIG. 6).
  • FIG. 6 shows a MALDI mass spectrum (positive ions) from the range of the measuring ranges (spots) for the detection of human interleukin 4 (h-IL 4) after carrying out the assay: anti-h-IL 4 antibodies were found on the metal oxide surface of a carrier substrate according to the invention, consisting of a tantalum pentoxide layer on AF45 glass, immobilized in discrete measurement areas (spots). After passivating free, non-specific binding sites on the metal oxide surface, the carrier substrate surface was incubated for one hour with a solution of h-IL 4 (1 ⁇ g / ml) as the analyte to be detected in buffer (PBS / 10), then with buffer and subsequently with water washed.
  • a carrier substrate according to the invention consisting of a tantalum pentoxide layer on AF45 glass, immobilized in discrete measurement areas (spots).
  • the carrier substrate surface was incubated for one hour with a solution of h-IL 4 (1
  • the matrix was then applied with sinapic acid (saturated solution in 50% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid). The delay time was 100 nsec.
  • the mass calibration (m / z) of the MALDI measuring arrangement for a "normal" gold plate was used as the carrier substrate. Taking into account an expected shift in the measured absolute (m / z) values due to the calibration for another carrier material, the measured peak at approximately (m / z) corresponding to 15 kDa corresponds to a signal of hH 4 that may be expected at this point. The signal at around 13 kDa is due to an unknown component that is frequently observed for BSA samples.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägersubstrat sequentiell die Durchführung einer oder mehrerer optischer und einer oder mehrerer massenspektrometrischer Messungen ermöglicht, sowie die entsprechend ausgeführten gekoppelten optischen und massenspektrometrischen Nachweisverfahren und deren Verwendung. Die Erfindung betrifft auch ein bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung, dadurch gekennzeichnet, dass das Material besagten Trägersubstrats ein Metalloxid oder ein Gemisch von Metalloxiden umfasst sowie mit diesem Trägersubstrat ausgeführte massenspektrometrische und gekoppelte Nachweisverfahren sowie deren Verwendung.

Description

Optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI- Messanordnung und dessen Verwendung
Die Erfindung betrifft ein bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung (MALDI- MS:„Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry" ), dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägersubstrat sequentiell die Durchführung einer oder mehrerer optischer und einer oder mehrerer massenspektrometrischer Messungen ermöglicht, sowie die entsprechend ausgeführten gekoppelten optischen und massenspektrometrischen Nachweisverfahren und deren Verwendung.
Die Erfindung betrifft auch ein bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI- Messanordnung, dadurch gekennzeichnet, dass das Material besagten Trägersubstrats ein Metalloxid oder ein Gemisch von Metalloxiden umfasst, sowie mit diesem Trägersubstrat ausgeführte massenspektrometrische und gekoppelte Nachweisverfahren sowie deren Verwendung.
„Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry" (MALDI-MS) wurde 1988 von Karas und Hillenkamp eingeführt und hat sich seitdem als eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der Massen von Biopolymeren und anderen biologischen oder biochemischen Substanzen, wie beispielsweise Nukleinsäuren, Peptiden, Proteinen und DNA und deren Fragmenten, bewährt.
Das MALDI-Prinzip beruht darauf, dass der Analyt, wie beispielsweise ein Peptid oder Protein, in eine Matrix aus typischerweise organischen Molekülen niedrigen Molekulargewichts (z. B. Sinapinsäure) eingebettet wird oder zu einer solchen Matrix in Kontakt steht. Das Matrixmaterial wird dabei so ausgewählt, dass es bei der Anregungswellenlänge eines starken, anregenden Laserpulses stark absorbierend ist. Bei Einstrahlung eines solchen Laserpulses wird die Probenmatrix in das Vakuum der MS-Apparatur verdampft. Gleichzeitig werden die in der Matrix eingebetteten oder damit verbundenen Analytmoleküle ebenfalls in die Gasphase überführt und gegebenenfalls zusätzlich durch Protonenübertragung von der Probenmatrix ionisiert. Auf diese Weise können auch grosse Moleküle, bis zu einem Molekulargewicht von etlichen hunderttausend Dalton, in die Gasphase überführt werden. In einer typischem massenspektrometrischen Anordnung werden die Analyt-Ionen dann zur Massenauftrennung in einem elektrischen Feld eines Flugzeit-Massenspektrometers („time-of-flight (TOF) mass spectrometer") beschleunigt. Ein besonderer Vorteil des MALDI- Verfahrens besteht darin, dass im linearen TOF-MS wenig bis keine Fragmente detektiert werden, in einem Reflektron-TOF-MS diese aber nachgewiesen werden können. Damit können sowohl die Molekularmasse als auch gegebenenfalls Strukturelemente der gemessenen Verbindungen bestimmt werden. Dem steht als Nachteil entgegen, dass sich MALDI-MS vorwiegend nur zur Massenbestimmung grösserer Moleküle (mit Molekulargewicht > 500 Da) eignet, während sich im Bereich kleiner Molekulargewichte die Anwesenheit der Probenmatrix störend auswirken kann.
Der Träger oder Rahmen für die MALDI-Matrix besteht traditionell aus einem elektrisch leitenden Material, d. h. einer metallischen Platte oder einem metallischen Gitter [siehe z. B. US-Patent Nr. 5,580,434].
Eine massenspektrometrische Apparatur, basierend auf dem MALDI-Prinzip, wird nachfolgend als eine „MALDI-Messanordnung" bezeichnet.
MALDI ermöglicht, ebenso wie andere massenspektrometrische Analysemethoden, eine Identifikation von Substanzen aufgrund ihres Molekulargewichtes. Eine absolute oder relative quantitative Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe oder der quantitative Vergleich der Affinitäten zwischen einer Vielzahl von Analyten in einer Probe und entsprechenden, auf einem Träger immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen, basierend auf der Anzahl gebundener Analytmoleküle, ist jedoch mittels MALDI schwierig und nur in speziellen Fällen verlässlich, da Wechselwirkungen zwischen der MALDI-Matrix und den Analytmolekülen, unterschiedliche Ionisationsquerschnitte der Analytmoleküle, Massenabhängigkeit des Detektorsignals und Transmissionseigenschaften des Massenspektrometers einen zusätzlichen Einfluss auf die Signalhöhen im Massenspektrum haben.
Für quantitative oder semi-quantitative Analysen des spezifischen molekularen Bindungs Verhaltens sind daher solche Methoden besser geeignet, welche keine Aufbringung einer zusätzlichen molekularen Matrix erfordern.
In den vergangenen Jahren sind sogenannte „Mikroarrays", wie beispielsweise Nukleinsäure- oder Protein-Mikroarrays, bekannt geworden, welche beispielsweise, mit teilweise hoher Genauigkeit, den Nachweis einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten aus einer einzelnen Probe auf einem gemeinsamen Träger ermöglichen. Derartige Nachweisplattformen sind vor allem unter der Bezeichnung „Biochips" bekannt geworden. Dazu werden in einer zweidimensionalen Anordnung auf einem im wesentlichen planaren Träger eine Vielzahl unterschiedlicher biologischer oder biochemischer oder synthetisch herstellbarer Erkennungselemente, für die spezifische Erkennung und Bindung des jeweiligen Zielanalyten, immobilisiert.
Danach werden in einem einen einzelnen oder mehrere Zugabeschrittte umfassenden Assay die Probe mit den nachzuweisenden Analyten und gegebenenfalls weitere Reagentien mit den auf der Trägeroberfläche immobilisierten Erkennungselementen in Kontakt gebracht. Der qualitative und in vielen Fällen auch quantitative Nachweis gebundener Analytmoleküle, aus denen deren Konzentration in der untersuchten Probe bestimmt werden soll, kann mithilfe einer Vielzahl unterschiedlicher Detektionsmethoden erfolgen.
Vielfach verbreitet sind fluoreszenzbasierende Nachweismethoden. Da die nachzuweisenden Analytmoleküle nur in den seltensten Fällen selbst fluoreszent sind, werden für einen fluoreszenzbasierenden Analytnachweis im allgemeinen sogenannte Fluoreszenzlabel verwendet, welche beispielsweise an den Analyten oder an einen seiner Bindungspartner gebunden werden. Basierend auf einfachen Glas- oder Mikroskop-Plättchen, sind Arrays mit einer sehr hohen Dichte von diskreten Messbereichen („Features") bekannt. Beispielsweise werden in der US 5,445,934 Arrays von Oligonukleotiden mit einer Dichte von mehr als 1000 Features pro Quadratzentimeter beschrieben und beansprucht. Die Anregung und das Auslesen solcher Arrays beruht auf klassischen optischen Anordnungen und Methoden. Es kann das ganze Array gleichzeitig mit einem aufgeweiteten Anregungslichtbündel beleuchtet werden, was jedoch zu einer relativ geringen Empfindlichkeit führt, da die auf die Fläche bezogenen Anregungslichtintensitäten unter diesen Bedingungen relativ gering sind. Zur Erreichung höherer Anregungslichtintensitäten und zur Einschränkung des Fokusbereichs des Anregungslichts und der Erfassung des Emissionslichts vor und nach der Ebene der immobilisierten Erkennungselemente werden vielfach konfokale Mikroskop- Messanordnungen eingesetzt und die verschiedenen Features sequentiell mittels "Scannen" ausgelesen..
Eine noch stärkere Beschränkung von Signalerzeugung und Detektion auf die Ebene, an der die Wechselwirkung zwischen den Analyten und den Erkennungselementen stattfindet, wird durch einen Analytnachweis im evaneszenten Feld eines optischen Wellenleiters, insbesondere eines Dünnschichtwellenleiters, ermöglicht: Koppelt man eine Lichtwelle in einen planaren Dünnschichtwellenleiter ein, der von optisch dünneren Medien umgeben ist, so wird sie durch Totalreflexion an den Grenzflächen der wellenleitenden Schicht geführt. Ein planarer Dünnschichtwellenleiter besteht im einfachsten Fall aus einem Drei Schichtsystem: Trägermaterial, wellenleitende Schicht, Superstrat ( bzw. zu untersuchende Probe), wobei die wellenleitende Schicht den höchsten Brechungsindex besitzt. Zusätzliche Zwischenschichten können die Wirkung des planaren Wellenleiters noch verbessern.
In die optisch dünneren Medien tritt dabei ein Bruchteil der elektromagnetischen Energie ein. Diesen Anteil bezeichnet man als ein evaneszentes oder quergedämpftes Feld. Die Stärke des evaneszenten Feldes ist sehr stark abhängig von der Dicke der wellenleitenden Schicht selbst, sowie vom Verhältnis der Brechungsindices der wellenleitenden Schicht und der sie umgebenden Medien. Bei dünnen Wellenleitern, d. h. Schichtdicken von derselben oder niedrigerer Dicke als der zu führenden Wellenlänge, können diskrete Moden des geleiteten Lichts unterschieden werden.
Es sind verschiedene Verfahren für die Einkopplung von Anregungslicht in einen planaren Wellenleiter bekannt. Die am frühesten benutzten Verfahren beruhten auf Stirnflächenkopplung oder Prismenkopplung, wobei zur Verminderung von Reflexionen infolge von Luftspalten im allgemeinen eine Flüssigkeit zwischen Prisma und Wellenleiter aufgebracht wird. Diese beiden Methoden sind vor allem in Verbindung mit Wellenleitern relativ grosser Schichtdicke, d. h. insbesondere selbsttragenden Wellenleitern, sowie bei einem Brechungsindex des Wellenleiters von deutlich unter 2 geeignet. Zur Einkopplung von Anregungslicht in sehr dünne, hochbrechende wellenleitende Schichten ist demgegenüber die Verwendung von Koppelgittern eine wesentlich elegantere Methode.
Es können verschiedene Methoden zum Analytnachweis im evaneszenten Feld geführter Lichwellen in optischen Schichtwellenleitern unterschieden werden. Aufgrund des eingesetzten Messprinzips kann man beispielsweise zwischen Fluoreszenz- oder allgemeiner Lumineszenzmethoden auf der einen Seite und refraktiven Methoden andererseits unterscheiden. Hierbei können Verfahren zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz in einer dünnen Metallschicht auf einer dielektrischen Schicht mit niedrigerem Brechungsindex in die Gruppe der refraktiven Methoden mit einbezogen werden, sofern als Basis zur Bestimmung der Messgrösse der Resonanzwinkel des eingestrahlten Anregungslichts zur Erzeugung des Oberflächenplasmonenresonanz dient. Die Oberflächenplasmonenresonanz kann aber auch zur Verstärkung einer Lumineszenz oder zur Verbesserung des Signal-zuHintergrund-Verhältnissen in einer Lumineszenzmessung verwendet werden. Die Bedingungen zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz, sowie zur Kombination mit Lumineszenzmessungen, sowie mit wellenleitenden Strukturen sind vielfach in der Literatur beschrieben.
Mit dem Begriff "Lumineszenz" wird in dieser Anmeldung die spontane Emission von Photonen im ultravioletten bis infraroten Bereich nach optischer oder nichtoptischer, wie beispielsweise elektrischer oder chemischer oder biochemischer oder thermischer Anregung, bezeichnet. Beispielsweise sind Chemilumineszenz, Biolumineszenz, Elektrolumineszenz und insbesondere Fluoreszenz und Phosphoreszenz unter dem Begriff "Lumineszenz" mit eingeschlossen. Dabei sind Fluoreszenz und Phosphoreszenz besonders bevorzugte Formen der Lumineszenz.
Bei den refraktiven Messmethoden wird die Änderung des sogenannten effektiven Brechungsindex aufgrund molekularer Adsorption oder Desorption auf dem Wellenleiter zum Nachweis des Analyten benutzt. Diese Änderung des effektiven Brechungsindex wird, im Falle von Gitterkoppler-Sensoren, bestimmt aus der Änderung des Koppelwinkels für die Ein- oder Auskopplung von Licht in oder aus dem Gitterkoppler-Sensor, und im Falle von interferometrischen Sensoren aus der Änderung der Phasendifferenz zwischen dem in einem Sensorarm und einem Referenzarm des Interferometers geführten Messlichts.
Die genannten refraktiven Methoden haben den Vorteil, dass sie ohne Verwendung zusätzlicher Markierungsmoleküle, sogenannter molekularer Labels, eingesetzt werden können. Der Nachteil dieser labelfreien Methoden ist jedoch, dass die damit erzielbaren Nachweisgrenzen aufgrund der geringen Selektivität des Messprinzips, in Abhängigkeit von dem Molekulargewicht des Analyten auf pico- bis nanomolare Konzentrationsbereiche beschränkt sind, was für viele Anwendungen, beispielsweise für diagnostische Applikationen, nicht ausreichend ist.
Zur Erreichung tieferer Nachweisgrenzen erscheinen lumineszenzbasierende Methoden aufgrund grösserer Selektivität der Signalerzeugung besser geeignet. Dabei ist die Lumineszenzanregung auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in das optisch dünnere Medium, also auf die unmittelbare Umgebung des wellenleitenden Bereichs mit einer Eindringtiefe in der Grössenordnung von einigen hundert Nanometern ins Medium beschränkt. Dieses Prinzip wird evaneszente Lumineszenzanregung genannt. Für die Analytik ist diese Anregungsmethode von grosser Bedeutung, da hiermit störende Einflüsse aus der Tiefe des Mediums minimiert werden können. Die genannten optischen Nachweismethoden sind in den vergangenen Jahren ausgedehnt worden von Sensorplattformen zur Bestimmung einzelner Analyten auf Plattformen mit Hunderten bis Tausenden verschiedener, in diskreten Messbereichen („Spots") immobilisierten Erkennungselementen zur Bestimmung einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten auf einer gemeinsamen Plattform („Mikroarrays"). Es wurde in der Vergangenheit vielfach demonstriert, dass derartige optische Nachweisverfahren eine verlässliche quantitative Bestimmung der Analytkonzentrationen in einer zugeführten Probe, basierend auf der Anzahl an die Erkennungselemente gebundener Analytmoleküle und der daraus resultierenden Signaländerung, ermöglichen. Ausserdem kann mithilfe oberflächengebundener Nachweisverfahren, beispielsweise basierend auf Wechselwirkungen im evaneszenten Feld eines Wellenleiters oder eines Oberflächenplasmons, die Kinetik der Wechselwirkungen zwischen Analyten und ihren immobilisierten Erkennungselementen, in Echtzeit verfolgt werden.
Die genannten optischen Nachweismethoden ermöglichen jedoch keine Identifikation der gebundenen Analytmoleküle, was beispielsweise für Screening-applikationen erforderlich ist.
Daher besteht ein Bedürfnis nach einer einfachen Kombination optischer Nachweisverfahren, insbesondere mit Mikroarrays, mit massenspektrometrischen Nachweisverfahren, insbesondere mit MALDI.
Bekannt ist die Kopplung der optischen Methode des Analytnachweises mitttels Oberflächenplasmonenresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR) mit MALDI. Dabei wurden zwei verschiedene Wege beschritten [S. R. Weinberger, T. S. Morris, M. Pawlak, „Recent trends in protein biochip technology", Pharmacogenomics 1 (2000), 395 - 416]. Der ersten Methode folgend wurden die in einer Affinitätsreaktion der nachzuweisenden Analytmoleküle mit immobilisierten Erkennungselementen oberflächengebundenen Moleküle nach deren Nachweis in einem SPR-Reader („Biacore") eluiert und anschliessend auf einen regulären MALDI-Träger (, .MALDI probe") aufgebracht [R. W. Nelson, J. W. Jarvik, B. E. Taillon und K. A. Tubbs, „B1A/MS of epitope-tagged peptides directly from E. Colüysate: multiplex detection and proetin identification at low-femtomole to subfemtomole levels", Analytical Chemistry 71 (1999) 2858 - 2865; R. W. Neslson, D. Nedelkov, K.A. Tubbs, „Biosensor chip mass spectrometry: a chip-based proteomics approach", Electrophoresis 21 (2000) 1155 - 1163]. Dieser Ansatz zur Kopplung einer optischen, biospezifischen Nachweismethode mit einer massenspektrometrischen Messung erforderte also die Übertragung der (gebundenen) Analytmoleküle von einem ersten Träger (SPR-Chip, typischerweise Biacore-Chip) auf einen zweiten Träger. Ein zweiter, eleganterer Ansatz beruht auf der direkten Verwendung des SPR-Chips nach Vollendung der optischen (SPR-) Messung als Träger („probe") im MALDI-Gerät. Dazu wurde nach Abschluss der optischen Messung die MALDI-Matrix auf den SPR- Chip aufgetragen [R. W. Nelson, J. W. Jarvik, B. E. Taillon und K. A. Tubbs, „BIA/MS of epitope-tagged peptides directly from E. CoZ lysate: multiplex detection and proetin identification at low-femtomole to subfemtomole levels", Analytical Chemistry 71 (1999) 2858 - 2865]. Das Träger-Material (SPR-Chip-Oberfläche) war dabei Gold, d.h. ein optisch nicht transparentes Material (im Sinne der nachfolgenden Definition).
Unter „optischer Transparenz" des Materials beziehungsweise eines Trägersubstrats (für eine MALDI-Messanordnung) soll dabei verstanden werden, dass die Lauflänge eines in besagtem Material oder in besagtem Trägersubstrat oder im (hochbrechenden) wellenleitenden Film eines als optischer Wellenleiter ausgebildeten Trägersubstrats geführten Lichts in mindestens einem Teilbereich des sichtbaren Spektrums (zwischen 400 nm und 750 nm) grosser als 2 mm ist, sofern diese Lauflänge nicht durch Strukturen zur Änderung der Ausbreitungsrichtung besagten Lichts begrenzt wird. Beispielsweise kann die Lauflänge von optisch sichtbarem Licht, d. h. die Strecke auf dem Weg des Lichts im entsprechenden Material, bis zur Abnahme der Lichtintensität auf einen Wert 1/e der Urspungsintensität beim Eintritt des Lichts in dieses Material, in der Grössenordnung von etlichen Zentimetern (z. B. in Dünnschichtwellenleitern) bis zu Metern oder Kilometern (im Falle von Lichtleitern für die optische Signalübermittlung) liegen. Im Falle einer Gitter- Wellenleiter-Struktur, basierend auf einem Dünnschichtwellenleiter, kann die Ausbreitungslänge eines in der wellenleitenden Schicht geführten Lichts durch ein auskoppelndes diffraktives Gitter (ausgebildet in der wellenleitenden Schicht) auf wenige Mikrometer begrenzt werden. Diese Begrenzung der Lauflänge ist dann jedoch durch die Strukturierung, und nicht durch die Materialeigenschaften der Struktur, bedingt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung soll eine solche Gitter- Wellenleiter-Struktur als „optisch transparent" bezeichnet werden. Demgegenüber ist die Ausbreitungslänge eines in einem dünnen Metallfilm (beispielsweise aus Gold oder Silber) aufgrund der hohen Absorption des betreffenden Metalls, also materialbedingt, auf Strecken in der Grössenordnung von höchstens 100 μm bis 200 μm begrenzt. Entsprechend soll eine solche SPR-Struktur, basierend auf einem dünnen Metallfilm zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz, als „optisch nicht transparent" bezeichnet werden.
Ein bei der Wellenlänge des Lasers transparenter Probenträger wird in US-Patent 5,828,063 beschrieben. Die Transparenz des Trägers wird gefordert, um den Laserstrahl zur Desorption der Analytmoleküle durch die Rückseite des Trägers, auf die Probenmatrix mit darauf aufgebrachten Analytmolekülen zu richten. In dem US- Patent 6,1 11,251 wird eine Anordnung beschrieben, in der das Anregungslicht zur Probendesorption durch eine optische Faser geleitet wird, welche auf der Rückseite eines transparenten Trägers angeordnet ist. Es wird jedoch in beiden Patenten keinerlei Bezug zu anderen analytischen Techniken, insbesondere also nicht zu optischen Nachweisverfahren, hergestellt.
In den US-Patenten Nr. 5,770,860 und 6,287,872 werden Probenträger mit den Grundabmessungen einer Mikrotiterplatte beschrieben, um Hochdurchsatzmessungen für Screening-Applikationen zu ermöglichen. Es werden jedoch keinerlei Angaben über das Trägermaterial und seine optischen Eigenschaften gemacht. Für die massenspektrometrische Bestimmung von Nukleinsäuresequenzen werden in dem US-Patent Nr. 6,043,031 u. a. „Chips" als Probenträger beschrieben. Als „Chip"- Materialien werden Glasfaser-Filter, Glas- und Metalloberflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Kupfer und Silicium) und Plastik (Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinyliden-Fluorid-Membranen oder Mikrotiterplatten) benannt. Wiederum wird jedoch kein Hinweis zu einer Kombination der massenspektrometrischen Nachweismethode mit optischen Nachweisverfahren gegeben.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass es möglich ist, mit einem optisch transparenten Trägersubstrat sequentiell einen hochempfindlichen optischen Analytnachweis und nachfolgend, nach Aufbringung einer MALDI-Matrix, ein hochauflösendes Massenspektrum der oberflächengebundenen Analytmoleküle zu erhalten. Diese Kombination ermöglicht insbesondere sequentiell die optische und massenspektrometrische Analyse von Mikroarrays.
Es wurde ausserdem überraschend gefunden, dass ein optisch transparentes Trägersubstrat, dessen Oberfläche ein Metalloxid, vorzugsweise TiO2 oder Ta2O5 oder Nb O5, umfasst, sehr gut geeignet ist für eine MALDI-Messanordnung.
Erster Gegenstand der Erfindung ist ein bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI- Messanordnung, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägersubstrat sequentiell die Durchführung einer oder mehrerer optischer und einer oder mehrerer massenspektrometrischer Messungen ermöglicht. Das Trägersubstrat kann ein Material aus der Gruppe von Glas, Quarz, optisch transparenten Keramiken, Metalloxiden, optisch transparenten Kunststoffen, insbesondere transparenten thermoplastischen Kunststoffen, wie beispielsweise Polycarbonaten, Acrylaten, Polyacrylaten, insbesondere Polymethylmethacrylaten und Polystyrolen, umfassen. Dabei wird bevorzugt, dass besagte optisch transparente Kunststoffe form-, präg-, spritz- und / oder fräsbar sind. Gegenstand der Erfindung ist auch ein bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI- Messanordnung, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche besagten Trägersubstrats ein Metalloxid oder ein Gemisch von Metalloxiden umfasst.
Es wird bevorzugt, dass das Material eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats für eine MALDI-Messanordnung ein Metalloxid aus der Gruppe umfasst, die von TiO2, ZnO, Nb2O5, Ta2O5, HfO , und ZrO2 gebildet wird, wobei TiO2, Ta2O5 und Nb2O5 besonders bevorzugt werden.
Um insbesondere makromolekulare Verbindungen in die Gasphase überführen zu können, um sie dann in einem Flugzeit-Massenspektrometer einer MALDI- Messanordnung nachweisen zu können, ist der Kontakt dieser nachzuweisenden Moleküle zu einer MALDI-Matrix erforderlich, deren (im allgemeinen) niedermolekularen Komponenten infolge eines eingestrahlten Laserpulses desorbiert werden, wobei damit in Kontakt stehende höhermolekular Komponenten mitgerissen und zugleich ionisiert werden. Daher wird bevorzugt, dass auf der Oberfläche eines erfindungsgemässen Trägersubstrats, direkt als erste Schicht oder auf weiteren auf der Trägersubstratoberfläche aufgebrachten Schichten, eine MALDI-Matrix, bestehend aus bei der Wellenlänge eines im Desorptionsschritt eingestrahlten Laserpulses stark absorbierenden Molekülen, aufgebracht ist. Vorzugsweise umfasst besagte MALDI- Matrix Verbindungen aus der Gruppe von Hydroxybenzoesäuren, wie beispielsweise Gallussäure, Gentisinsäure (2,5-Hydroxybenzoesäure) und 2-(4- Hydroxyphenylazo)benzoesäure, Bernsteinsäure, 3-Hydroxy-Picolinsäure, Kaffeesäure, Ferulasäure, 4-Nitroanilin, Anthranil säure, Salicylamid, Isovanillin, Dithranol, 3-Aminochinolin, 1-Hydroxy-Isochinolin, Nikotinsäure, Sinapinsäure, trans-3-Indolacrylsäure, Zimtsäure und deren Derivaten, wie beispielsweise trans-3,5- Dimethoxy-4-hydroxy-Zimtsäure sowie α-Cyan-4-hydroxy-zimtsäure, Di- und Trihydroxy-acetophenone (z. B. 2, 6-Dihydroxyacetophenon und 2,4,6- Trihydroxyacetophenon) und Mischungen mit 5-Methoxy-salicylsäure, etc. Vorteilhaft ist, wenn die MALDI-Matrix als eine selbstorganisierte Monoschicht („self-assembled monolayer", SAM) ausgebildet ist.
Die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle können in die MALDI- Matrix eingebettet sein. Es ist auch möglich, dass die MALDI-Matrix nach Aufbringung der Analytmoleküle auf dem Trägersubstrat aufgebracht wird.
Zur Verbesserung der Haftung der Analytmoleküle auf dem Trägersubstrat kann es von Vorteil sein, wenn zur Immobilisierung der Analytmoleküle eine ebenfalls transparente Haftvermittlungsschicht auf besagtem Trägersubstrat aufgebracht ist, welche vorzugsweise eine Dicke von weniger als 200 nm, besonders bevorzugt von weniger als 20 nm hat. Dabei wird bevorzugt, dass eine solche Haftvermittlungsschicht Verbindungen aus der Gruppe von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren und "selbstorganisierten passiven oder funktionalisierten Mono- oder Mehrfachschichten", Alkylphosphaten und -phosphonaten und multifunktionellen Block-Copolymeren, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycolen, umfasst.
Vorteilhaft ist auch, wenn besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Gruppe von Organophosphorsäuren der allgemeinen Formel I (A)
Y-B-OP03 H2 (IA)
oder von Organophosphonsäuren der allgemeinen Formel I (B)
Y-B-PO3 H2 (IB)
und deren Salzen, in denen B einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Hetaryl- oder Hetarylalkylrest und Y Wasserstoff oder eine funktionelle Gruppe aus der Reihe Hydroxy, Carboxy, Amino, gegebenfalls durch Niederalkyl substituiertes Mono-oder Dialkylamino, Thiol, oder eine negative Säuregruppe aus der Reihe Ester, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Maleimid, Succinimydyl, Epoxy oder Acrylat bedeutet, wobei an B oder Y ein biologisches, biochemisches oder synthetisch herstellbares Erkennungselement durch Additions- oder Substitutionsreaktion angedockt sein kann, wobei auch Verbindungen angelagert sein können, die der Substratoberfläche eine Resistenz gegen Proteinadsorption und/oder Zelladhäsion verleihen und in B in der Kette gegebenenfalls anstelle einer oder mehrerer-CH2- Gruppen eine oder mehrere Ethylenoxidgruppen enthalten sein können. Derartige Verbindungen und Verfahren zu deren Aufbringung auf Metalloxid-Oberflächen sind in der PCT/EP 01/10077 beschrieben, deren Inhalt ebenfalls vollumfänglich Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist.
Eine wichtige Gruppe von wichtigen Ausführungsformen eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats ist dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche des Trägersubstrats oder auf der auf dem Trägersubstrat aufgebrachten Haftvermittlungsschicht biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente immobilisiert sind, zur Erkennung und Bindung eines oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren Proben, welche mit besagten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden.
Es ist auch möglich, dass die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle auf der auf dem Trägersubstrat befindlichen MALDI-Matrix aufgebracht sind. Ebenso können auf der auf dem Trägersubstrat aufgebrachten MALDI-Matrix biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente immobilisiert sein, zur Erkennung und Bindung eines oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren Proben, welche mit besagten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden.
Vorteilhaft ist, wenn die MALDI-Matrix zugleich die Funktion einer Haftvermittlungsschicht hat oder wenn eine auf besagtem Trägersubstrat aufgebrachte Haftvermittlungsschicht die Funktion einer MALDI-Matrix hat.
Eine auf dem Trägersubstrat aufgebrachte Schicht kann auch als Mischung einer MALDI-Matrix und einer Haftvermittlungsschicht vorliegen. Dazu wird zunächst eine Mischung der eine MALDI-Matrix zu bildenden Moleküle und der eine Haftvermittlungsschicht zu bildenden Moleküle in flüssiger Lösung hergestellt. Diese Mischungslösung wird dann auf dem Trägersubstrat aufgetragen, auf welchem nach Verdampfen des Lösungsmittels die gemischte Schicht verbleibt.
Für eine Vielzahl von Anwendungen ist erwünscht, nicht nur einen einzelnen Analyten zu bestimmen oder eine einzelne Probe zu analysieren, sondern solche Analysen für eine Vielzahl von Proben und / oder Analyten gleichzeitig oder sequentiell auf einem gemeinsamen Probenträger durchzuführen. Daher ist eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats dadurch gekennzeichnet, dass die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle oder die chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente in diskreten Messbereichen (Spots) auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI-Matrix immobilisiert sind. Dabei können in einer 2- dimensionalen Anordnung bis zu 1 000000 Messbereiche angeordnet sein. Ein einzelner Messbereich kann beispielsweise eine Fläche von 0.001 - 6 mm2 einnehmen. Es wird bevorzugt, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung mehr als 100, bevorzugt mehr als 1000, besonders bevorzugt mehr als 10 000 Messbereiche pro Quadratzentimeter angeordnet sind.
Es ist auch möglich, eine Vielzahl unterschiedlicher Analyten innerhalb eines einzelnen, flächig (z. B. in der Grössenordnung von Quadratmillimetern bis Quadratzentimetern) mittels ortauflösender optischer und massenspektrometrischer Methoden nachzuweisen. Letzgenannte orstauflösende massenspektrometrische Nachweisverfahren sind auch als „Molecular Scanner" bekannt geworden. Dazu werden auf einer oder mehreren Flächen geeigneter Grosse (z. B. in der Grössenordnung von Quadratmillimetern bis Quadratzentimetern) auf einem erfindungsgemässen Trägersubstrat ein oder mehrere Proben mit den darin nachzuweisenden Analyten oder verschiedene chemische oder biologische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI-Matrix aufgebracht. Die OrtsauflsÖung des massenspektrometrischen Nachweises in einer MALDI-Messanordnung wird dabei im wesentlichen von der Grosse des Laserspots auf dem Trägersubstrat bestimmt und liegt daher typischerweise in der Grössenordnung von Quadratmikrometern.
Die Messbereiche können daher jeweils eine Vielzahl (d.h. zwei oder mehr) verschiedener massenspektrometrisch zu bestimmende Arten von Analytmolekülen oder von (bio)chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen umfassen.
Eine spezielle Ausführungsform eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats ist dadurch gekennzeichnet, dass dessen Oberfläche reine oder gemischte Oxide, Nitride oder Carbide von Metallen oder Halbleitern umfasst und darauf eine chemische Strukturierung durch lokale Abscheidung von Mono- oder Mehrfachschichten aus Organophosphaten und / oder Organophosphonaten (gemäss vorangehender Beschreibung) erzeugt ist. Dabei wird bevorzugt, dass die Oberfläche besagten Trägersubstrats ein definiertes Muster mit Siliziumoxid bzw. Übergangsmetalloxiden aufweist. Für diese Ausführungsform ist es ausserdem von Vorteil, wenn auf den Siliziumoxidbereichen weitere Mono- oder Mehrfachschichten aus Organophosphaten und / oder Organophosphonaten durch Abscheidung aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht sind.
Eine andere Variante eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats ist dadurch gekennzeichnet, dass dessen Oberfläche reine oder gemischte Oxide, Nitride oder Carbide von Metallen oder Halbleitern umfasst und darauf lokale hydrophobe oder hydrophile Bereiche durch lokale Abscheidung von Mono- oder Mehrfachschichten aus Organophosphaten und / oder Organophosphonaten erzeugt sind und deren umgebende Substratoberfläche mit einer endständig hydrophoben beziehungsweise hydrophilen Monoschicht abgedeckt ist.
Für die Aufbringung der verschiedenen genannten Schichten oder Teilbeschichtungen gibt es eine Vielzahl möglicher Verfahren. Ohne Einschränkung der Allgemeinheit wird bevorzugt, dass besagte MALDI-Matrix oder besagte Haftvermittlungsschicht oder besagte Mono- oder Mehrfachschichten und / oder besagte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente mittels eines Verfahrens aufgebracht sind, welches ausgewählt ist aus aus der Gruppe, welche Tauchen, Aufsprühen, Aufstreichen, Aufpinseln, "InkJet spotting", mechanischem Spotting mittels Stift, Feder oder Kapillare, "micro contact printing", fluidischer Kontaktierung der Substratoberfläche mit parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen", photolithographischen Immobilisierungsmethoden etc. umfasst.
Die biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente können ausgewählt sein aus der Gruppe, die von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotiden) und Nukleinsäureanalogen (z. B. PNA) sowie deren Derivaten mit künstlichen Basen, mono- oder polyklonalen Antikörpern, Antikörperfragmenten, Peptiden, Enzymen, Aptameren, synthetischen Peptidstrukturen, Glycopeptiden, Glycoproteinen, Oligosacchariden, Lektinen, löslichen, membrangebundenen und aus einer Membran isolierten Proteinen, wie beispielsweise Rezeptoren, deren Liganden, Antigenen für Antikörper (z. B. Biotin für Streptavidin), "Histidin-Tag-Komponenten" und deren Komplexbildungspartnern, durch chemische Synthese erzeugten Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, etc. gebildet wird.
Ebenso können die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle ausgewählt sein aus der Gruppe, die von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotiden) und Nukleinsäureanalogen (z. B. PNA) sowie deren Derivaten mit künstlichen Basen, mono- oder polyklonalen Antikörpern, Peptiden, Enzymen, Aptameren, synthetischen Peptidstrukturen, Glycopeptiden, Glycoproteinen, Oligosacchariden, Lektinen, löslichen, membrangebundenen und aus einer Membran isolierten Proteinen, wie beispielsweise Rezeptoren, deren Liganden, Antigenen für Antikörper (z. B. Biotin für Streptavidin), "Histidin-Tag-Komponenten" und deren Komplexbildungspartnern gebildet wird. Ausserdem können sowohl biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente als auch massenspektrometrisch zu bestimmende Analytmoleküle jeweils ausgewählt sein aus der Gruppe, die von Acetylenen, Alkaloiden (beispielsweise Alkaloide mit Pyridinen, Pyperidinen, Tropanen, Chinolinen, Isochinolinen, Tropilidenen, Imidazolen, Indolen, Purinen, Fenantridinen enthaltenden Ringstrukturen), Alkaloidglycosiden, Aminen, Benzofuranen, Benzophenonen, Naphthochinonen, Betainen, Kohlenhydraten (z. B. Zucker-, Stärke- und Cellulosederivaten), Carbolinen, Cardenoliden, Catecholen, Chalkonen, Cumarinen, zyklischen Peptiden und Polypeptiden, Depsipeptiden, Diketopiperazinen, Diphenylethern, Flavenen, Flavonen, Isoflavanonen, Flavonoid- Alkaloiden, Furanochinolin-Alkaloiden, Gallocatechinen, Glycosiden, Antrachinonen, Flavonoiden, Lactonen, Phenolen, Hydrochinonen, Indolen, Indolochinonen, Alginsäuren, Lipiden (zum Beispiel Ölen, Wachsen und anderen Fettsäurederivaten), Macroliden, Oligopeptiden, Oligostilbenen, Peroxiden, Phenylglycosiden, Phloroglucinen, Polyethern, "Polyether-Antibiotica", Pterocarpinen, Pyranocumarinen, Pyrrolen, Quassinen, Chinolinen, Saframycinen, Terpenen (Mono-, Di-, und Triterpenen), Sesquite enen, Sesquiteφen-Dimeren, Sesquiterpen- Lactonen, Sesquiterpen-Chinonen, Sesterteφenen, Staurosporinen, Steroiden (wie beispielsweise Steroid-Hormonen, Sterolen, Gallensäuren), Sulfolipiden, Tanninen (z. B. Catechol und Pyrogallol), Vitaminen, ätherischen Ölen und Xanthonen (z. B. 9- Oxoxanthenon) gebildet wird.
Die genannten Erkennungselemente können in isolierter Form oder in einer künstlichen oder natürlichen komplexen Umgebung, zum Beispiel als Bestandteil von Zellen, Zellfragmenten, Gewebe („Tissue Slices") Membranen etc. immobilisiert sein.
Insbesondere für die Kombination von massenspektrometrischen und optischen Nachweismethoden ist es von Vorteil, wenn Bereiche zwischen den räumlich getrennten Messbereichen zur Minimierung unspezifischer Bindung von Analyten oder deren Nachweissubstanzen "passiviert werden", d.h. dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen (d) gegenüber dem Analyten "chemisch neutrale" Verbindungen aufgebracht sind, vorzugsweise beispielsweise bestehend aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Analyten unspezifischen Antiköφern (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise aus der Tween-Reihe, insbesondere Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynu leotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycole oder Dextrane, gebildet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats ist dadurch gekennzeichnet, dass dieses einen optischen Wellenleiter umfasst, welcher im wesentlichen planar ist. Besonders bevorzugt wird dabei eine solche Ausführungsform eines optisch transparenten Trägersubstrats, welche einen optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst. Dabei kann die optisch transparente Schicht (b) ein Material aus der Gruppe umfassen, die von Silikaten, z. B. Glas oder Quarz, transparenten thermoplastischen oder spritzbaren Kunststoff, beispielsweise Polycarbonaten, Polyimiden, Acrylaten, insbesondere Polymethylmethacrylaten, oder Polystyrolen gebildet wird. Vorzugsweise ist der Brechungsindex der optisch transparenten Schicht (a) grosser als 1.8. Ausserdem wird bevorzugt, dass die optisch transparente Schicht (a)) ein Material aus der Gruppe von TiO , ZnO, Nb2O5)Ta2θ5, Hf02, oder ZrO2, besonders bevorzugt jedoch aus TiO oder Ta2O5 oder Nb2O5 umfasst. Darüber hinaus wird bevorzugt, dass die Dicke der Schicht (a) 40 nm - 1000 nm, bevorzugt 100 nm - 300 nm, beträgt.
Es sind verschiedene Methoden zur Einkopplung eines Anregungslichts in einen planaren optischen Wellenleiter bekannt. Für optische Wellenleiter mit einer relativ dicken wellenleitenden Schicht, beispielsweise in der Grössenordnung von etlichen Mikrometern bis zu Millimetern, ist Stirnflächenkopplung mithilfe von vor einer Stirnfläche des Wellenleiters plazierten Linsen, insbesondere Zylinderlinsen, eine vielfach verwendete Methode. Insbesondere kann eine der Lichteinkopplung dienende Zylinderlinse auch selbst Teil einer Stirnfläche eines optischen Wellenleiters sein. Eine solche Struktur kann beispielsweise durch Spritzguss eines transparenten Plastik (wie beispielsweise Polystyrol) erzeugt werden.
Eine weitere bekannte Methode ist die Lichteinkopplung mithilfe von auf dem Wellenleiter aufgebrachten Prismen. Beispielsweise können ebenfalls durch Spritzguss ein optischer Wellenleiter und ein darauf plaziertes Koppelprisma in einem einzigen Herstellungsschritt als eine einzige Komponente erzeugt werden. Weiter verbreitet ist es, dass ein Prisma, typi schwerweise aus Glas oder aus einem transparenten Kunststoff, auf einen planaren Wellenleiter aufgesetzt wird. Zur Verminderung von Reflexionen an den Grenzschichten und insbesondere der Störung von Luftspalten zwischen Wellenleiter und Prisma wird dabei häufig eine brechnungsindexanpassende Flüssigkeit zwischen Prisma und Wellenleiter verwendet. Dabei ist es vorteilhaft, wenn der Unterschied der Brechungsindices von Flüssigkeit und wellenleitender Schicht möglichst gering ist.
Im Falle von Dünnschichtwellenleitern, insbesondere wenn die Dicke der wellenleitenden Schicht von gleicher Grössenordnung oder kleiner als die Wellenlänge des einzukoppelnden Lichts ist, ist die Lichteinkopplung mithilfe von mit der wellenleitenden Schicht verbundenen diffraktiven Koppelgittern besonders vorteilhaft.
Bevorzugt wird dabei ein erfindungsgemässes optisch transparentes Trägersubstrat, welches einen im wesentlichen planaren optischen Wellenleiter umfasst und dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägersubstrat ein oder mehrere optische Koppelemente aus der Gruppe von stirnflächengekoppelten Zylinderlinsen oder optischen Fasern als Lichtleitern, Koppelprismen und optischen Koppelgittern umfasst.Dabei wird besonders bevorzugt, wenn besagtes Trägersubstrat ein oder mehrere Gitterstrukturen (c) als Koppelgitter umfasst, welche als Oberflächenreliefgitter in der optisch transparenten Schicht (a) moduliert sind. Vorteilhafterweise sind solche Gitterstrukturen (c) mono- oder multidiffraktiv und haben eine Tiefe von 2 nm - 100 nm, bevorzugt von 10 nm - 30 nm, sowie eine Periode von 200 nm - 1000 nm, bevorzugt von 300 nm - 700 nm.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein gekoppeltes Nachweisverfahren zur qualitativen und / oder quantitativen Bestimmung und massenspektrometrischen Identifikation eines oder mehrerer Analyten, dadurch gekennzeichnet, dass ein erfindungsgemässes optisch transparentes Trägersubstrat, nach einer der genannten Ausführungsformen, mit einer oder mehreren Proben mit darin enthaltenen, nachzuweisenden Analyten in Kontakt gebracht wird und sequentiell ein optischer und ein massenspektrometrischer Nachweis durchgeführt werden.
Kennzeichen eines solchen erfindungsgemässen optischen Nachweisverfahrens ist, dass als Teil des optischen Verfahrensschritts zum gleichzeitigen oder sequentiellen, qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben besagte Proben und gegebenenfalls weitere Reagentien mit den auf einem Trägersubstrat (direkt oder vermittelt über eine oder mehrere Schichten) immobilisierten Erkennungselementen, zur spezifischen Erkennung und Bindung besagter Analyten, in Kontakt gebracht werden und aus der Bindung dieser Analyten oder weiterer zum Analytnachweis eingesetzter Nachweissubstanzen resultierende Änderungen von optischen oder elektronischen Signalen gemessen werden.
Vielfach, beispielsweise zur Vermeidung vieler sequentieller Inkubationsschritte, ist es von Vorteil, wenn die eine oder mehreren Proben mit einer Mischung aus den verschiedenen Nachweisreagentien zur Bestimmung der in besagten Proben nachzuweisenden Analyten vorinkubiert werden und diese Mischungen dann jeweils in einem einzigen Zugabeschritt mit den immobilisierten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemässen gekoppelten Nachweisverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung des effektiven Brechungsindex an der die immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente tragenden Oberfläche des Trägersubstrats, aufgrund molekularer Adsoφtion oder Desoφtion, beruht. Dabei ist eine spezielle Ausführungsform des gekoppelten Nachweisverfahrens dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung der Phasendifferenz zwischen einem Lichtanteil eines eingestrahlten Nachweislichts, welcher mit den Bereichen der immobilisierten Erkennungselemente wechselwirkt, und einem Referenzanteil beruht. Eine solche spezielle Ausführungsform kann so durchgeführt werden, dass das eingestrahlte Nachweislicht polychromatisch ist und der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung der spektralen Verteilung von Interferenzmaxima und -minima, unter einem vorgegebenen Beobachtungswinkel, beruht. Das Verfahren kann auch so durchgeführt werden, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung der räumlichen Verteilung von Interferenzmaxima und -minima beruht.
Für andere Varianten der bevorzugten speziellen Ausführungsform des gekoppelten Nachweisverfahrens ist das eingestrahlte Nachweislicht monochromatisch.
Andere bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen gekoppelten Nachweisverfahrens sind dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung einer oder mehrerer Lumineszenzen beruht.
Es ist möglich, dass, für den optischen Nachweis des einen oder mehrerer Analyten, das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in einer Auflichtanregungsanordnung eingestrahlt wird. Eine andere mögliche Konfiguration besteht darin, dass, für den optischen Nachweis des einen oder mehrerer Analyten, das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in einer Transmissionslichtanregungsanordnung eingestrahlt wird. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemässen gekoppelten Nachweisverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen oder biochemischen Erkennungselemente, zur spezifischen Erkennung und Bindung einer oder mehrerer Analyten, auf einem vorzugsweise planaren optischen Wellenleiter als Trägersubstrat (direkt oder vermittelt über eine oder mehrere Schichten) immobilisierten Erkennungselementen, immobilisiert sind, dass die eine oder mehrere Proben mit dem einen oder den mehreren darin nachzuweisenden Analyten und gegebenenfalls weitere Nachweisreagentien sequentiell oder nach Mischung mit besagten Proben in einem einzigen Schritt mit besagten immobilisierten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden und dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in den optischen Wellenleiter eingekoppelt wird mithilfe eines oder mehrerer optischer Koppelelemente aus der Gruppe, die von stirnflächengekoppelten Zylinderlinsen, optischen Fasern als Lichtleitern, Koppelprismen und optischen Koppelgittern gebildet wird.
Eine mögliche Variante zeichnte sich dadurch aus, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten im Nahfeld (evaneszenten Feld) eines optischen Schichtwellenleiters als Trägersubstrat, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), und über einer in der Schicht (a) dess optischen Schichtwellenleiters ausgeprägten Gitterstruktur (c) oder (c') anhand der aus der Bindung des Analyten und / oder weiterer Nachweisreagentien, an deren immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente, resultierenden Änderungen der Resonanzbedingungen zur Einkopplung eines Anregungslichts in die Schicht (a) eines als Schichtwellenleiter ausgebildeten Trägers oder zur Auskopplung von in der Schicht (a) geführten Lichts erfolgt.
Kennzeichen einer Untervariante ist dabei, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Änderung des Einkoppelwinkels eines auf eine in der Schicht (a) ausgeprägten Gitterstruktur (c) eingestrahlten, im wesentlichen monochromatischen Nachweislichts in die Schicht (a), aufgrund der Bindung des Analyten und / oder weiterer Nachweisreagentien, an deren im Bereich dieser Gitterstruktur immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente, beruht. Unter „im wesentlichen monochromatisch" wird dabei verstanden, dass die spektrale Bandbreite eines auf die Gitterstruktur (c) eingestrahlten Anregungslichts maximal 20 nm, bevorzugt maximal 5 nm, besonders bevorzugt maximal 1 nm beträgt.
Die Erfüllung der Resonanzbedingung zur Einkopplung eines Anregunsglichts bei einer konstanten Anregungswellenlänge im Falle der Übereinstimmung des Einstrahlwinkels mit dem Resonanzwinkel zur Einkopplung ist äquivalent mit der Übereinstimmung der eingestrahlten Wellenlänge, bei konstantem Einstrahlwinkel, mit der Resonanzwellenlänge. Eine andere Untervariante ist daher dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Änderung der Resonanzwellenlänge zur Einkopplung eines auf eine in der Schicht (a) ausgeprägten Gitterstruktur (c) eingestrahlten, im wesentlichen parallelen Nachweislichtbündels in die Schicht (a), aufgrund der Bindung des Analyten und / oder weiterer Nachweisreagentien, an deren im Bereich dieser Gitterstruktur immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente, beruht. Unter „im wesentlichen parallel" wird dabei verstanden, dass der Konvergenz- oder Divergenzwinkel (Öffnungswinkel) eines auf die Gitterstruktur (c) eingestrahlten Anregungslichts maximal 5°, bevorzugt maximal 1°, besonders bevorzugt maximal 0.2° beträgt.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein gekoppeltes Nach weis verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf einer ortsaufgelösten Bestimmung von Änderungen der Resonanzbedingungen zur Einkopplung eines Anregungslichts in die Schicht (a) oder Auskopplung eines in der Schicht (a) eines Schichtwellenleiters als Trägersubstrat geführten Lichts beruht, mit einem zweidimensionalen Array aus mindestens vier oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen auf diesem Schichtwellenleiter als Trägersubstrat, - mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a),
- mit einer oder mehrereren Gitterstrukturen (c) zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen oder Auskopplung von in der Schicht (a) geführtem Licht im Bereich des Messbereiche
- mit mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen auf der einen oder den mehreren Gitterstrukturen (c), wobei in diesen Messbereichen gleichen oder unterschiedliche biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselementen zum qualitativen und / oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe immobilisiert sind, wobei die Dichte der Messbereiche auf einer gemeinsamen Gitterstruktrur (c) mindestens 10 Messbereiche pro Quadratzentimeter beträgt und wobei besagtes Anregungslicht gleichzeitig auf besagtes Array von Messbereichen eingestrahlt wird und der Grad der Erfüllung der Resonanzbedingung für die Lichteinkopplung in die Schicht (a) zu besagten Messbereichen gleichzeitig gemessen wird und ein Übersprechen von in der Schicht (a) geführtem Anregungslicht von einem Messbereich zu einem oder mehreren benachbarten Messbereichen durch Wiederauskopplung dieses Anregungslichts mittels der Gitterstruktur (c) verhindert wird.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein gekoppeltes Nachweisverfahren, wobei als Trägersubstrat ein optischer Wellenleiter als Schichtwellenleiter ausgebildet ist mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), wobei weiterhin Anregungslicht mithilfe einer oder mehrerer Gitterstrukturen (c) oder (c'), welche in der optisch transparenten Schicht (a) ausgeprägt sind, in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelt und zu darauf befindlichen Messbereichen (d) als geführte Welle geleitet wird, und wobei weiterhin die im evaneszenten Feld besagter geführter Welle erzeugte Lumineszenz von lumineszenzfähigen Molekülen mit einem oder mehreren Detektoren erfasst und die relative Menge oder Konzentration eines oder mehrerer Analyten aus der Intensität dieser Lumineszenzsignale bestimmt wird.
Eine solche Ausführungsform des erfindungsgemässen gekoppelten Nachweisverfahrens eignet sich insbesondere für einen hochempfindlichen optischen Nachweis von einem oder mehreren Analyten in einer oder mehreren Proben, indem besagte Proben mit den darin nachzuweisenden Analyten und gegebenenfalls weitere Nachweisreagentien sequentiell oder nach Mischung mit besagten Proben in einem einzigen Schritt mit auf einem planaren optischen Wellenleiter als Trägersubstrat (direkt oder vermittelt über eine oder mehrere Schichten) immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente, zur spezifischen Erkennung und Bindung besagter Analyten, in Kontakt gebracht werden und dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in den optischen Wellenleiter (d.h. die wellenleitende Schicht (a)) eingekoppelt wird mithilfe eines oder mehrerer optischer Koppelelemente (vorzugsweise mithilfe einer in der Schicht (a) ausgebildeten Gitterstruktur (c)).
Bei der Bestimmung der im evaneszenten Feld der wellenleitenden Schicht (a) angeregten Lumineszenz können (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über eine Gitterstruktur (c) oder (c') ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.
Zur gleichzeitigen Bestimmung einer Vielzahl von Analyten und / oder gleichzeitigen Untersuchung einer Vielzahl von Proben wird bevorzugt, dass die Analytmoleküle oder die chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente in diskreten Messbereichen (Spots) auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI- Matrix immobilisiert sind und dass das von den diskreten Messbereichen ausgehende Licht mit einem oder mehreren Detektoren in einem bildgebenden Verfahren gemessen und aufgezeichnet wird. Dabei können in unterschiedlichen diskreten Messbereichen verschiedene oder gleiche Analyten bzw. Erkennungselemente zum Nachweis verschiedener bzw. gleicher Analyten aufgebracht sein. In einem einzelnen Messbereich können auch mehrere verschiedene Analyten bzw. Erkennungselemente zum Nachweis verschiedener Analyten aufgebracht sein. Ein aufgebrachtes biologisches oder biochemisches oder synthetisch herstellbares Erkennungselement dient typischerweise dem spezifischen Nachweis eines einzelnen Analyten. Ein immobilisiertes Erkennungselement kann aber auch so ausgebildet sein, dass es dem Nachweis mehrerer, d.h. von zwei oder mehr, unterschiedlichen Analyten infolge von deren Bindung an verschiedene diskrete Erkennungsregionen des Erkennungselements dient. Im Falle von (einzelsträngigen) Nukleinsäuren als immobilisierten Erkennungselementen können beispielsweise diskrete Abschnitte mit unterschiedlichen Basensequenzen der Bindung von verschiedenen in einer Probe nachzuweisenden (einzelsträngigen) Nukleinsäuren mit zu den diskreten Abschnitten komplementären Sequenzen dienen.
Typischerweise werden die in einem erfindungsgemässen (bildgebenden) gekoppelten Nachweisverfahren aufgezeichneten Daten in einer zweidimensionalen Datenmatrix auf einem Datenträger gespeichert.
Es wird bevorzugt, dass für Ausführungsformen des erfindungsgemässen gekoppelten Nachweisverfahrens mit einem optischen Analytnachweis durch die Änderung von ein oder mehreren Lumineszenzen infolge von dessen Erkennung und Bindung zur Erzeugung besagter Lumineszenz ein Lumineszenzfarbstoff oder lumineszentes Nanopartikel als Lumineszenzlabel verwendet wird, das bei einer Wellenlänge zwischen 300 nm und 1100 nm angeregt werden kann und emittiert. Dabei kann das Lumineszenzlabel an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen oder an die biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente gebunden sein.
Eine spezielle Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites oder noch weitere Lumineszenzlabel mit gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden.
Dabei wird bevorzugt, dass das zweite oder noch weitere Lumineszenzlabel bei der gleichen Wellenlänge wie der erste Lumineszenzfarbstoff angeregt werden können, aber bei anderen Wellenlängen emittieren.
Für andere Anwendungen ist es von Vorteil, wenn die Anregungsspektren und Emissionsspektren der eingesetzten Lumineszenzlabel nur wenig oder gar nicht überlappen.
Eine Variante des Verfahrens besteht darin, dass zum Nachweis des Analyten Ladungs- oder optischer Energietransfer von einem als Donor dienenden ersten Lumineszenzlabel zu einem als Akzeptor dienenden zweiten Lumineszenzlabel verwendet wird.
Es ist auch möglich, dass das Ausmass der Löschung ("Quenching") einer oder mehrerer Lumineszenzen bestimmt wird.
Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden.
Eine Weiterentwicklung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden.
Es wird bevorzugt, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
Ein erfindungsgemässes gekoppeltes Nach weis verfahren nach einer der genannten Ausführungsformen kann eingesetzt werden zur gleichzeitigen oder sequentiellen, quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Proteinen, wie beispielsweise Antiköφern oder Antiköφerfragmenten, Antigenen, Rezeptoren und deren Liganden, Chelatoren, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag-Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag-Proteinen") und deren Komplexbildungspartnern, natürlichen oder veränderten Nukleinsäuren, wie beispielsweise Oligonukleotiden, DNA- oder RNA- Strängen, DNA- oder RNA-Analoga, Enzymen, Enzymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen sowie primären oder sekundären Metabolyten biologischer Prozesse.
Das Verfahren kann auch eingesetzt werden zur Bestimmung von Stoffen aus der Gruppe von Acetylenen, Alkaloiden (beispielsweise Alkaloide mit Pyridinen, Pyperidinen, Tropanen, Chinolinen, Isochinolinen, Tropilidenen, Imidazolen, Indolen, Purinen, Fenantridinen enthaltenden Ringstrukturen), Alkaloidglycosiden, Aminen, Benzofuranen, Benzophenonen, Naphthochinonen, Betainen, Kohlenhydraten (z. B. Zucker-, Stärke- und Cellulosederivaten), Carbolinen, Cardenoliden, Catecholen, Chalkonen, Cumarinen, zyklischen Peptiden und Polypeptiden, Depsipeptiden, Diketopiperazinen, Diphenylethern, Flavenen, Flavonen, Isoflavanonen, Flavonoid- Alkaloiden, Furanochinolin-Alkaloiden, Gallocatechinen, Glycosiden, Antrachinonen, Flavonoiden, Lactonen, Phenolen, Hydrochinonen, Indolen, Indolochinonen, Alginsäuren, Lipiden (zum Beispiel Ölen, Wachsen und anderen Fettsäurederivaten), Macroliden, Oligopeptiden, Oligostilbenen, Peroxiden, Phenylglycosiden, Phloroglucinen, Polyethern, "Polyether-Antibiotica", Pterocaφinen, Pyranocumarinen, Pyπolen, Quassinen, Chinolinen, Saframycinen, Teφenen (Mono-, Di-, und Triteφenen), Sesquiteφenen, Sesquiteφen-Dimeren, Sesquiteφen- Lactonen, Sesquiteφen-Chinonen, Sesterteφenen, Staurosporinen, Steroiden (wie beispielsweise Steroid-Hormonen, Sterolen, Gallensäuren), Sulfolipiden, Tanninen (z. B. Catechol und Pyrogallol), Vitaminen, ätherischen Ölen und Xanthonen (z. B. 9- Oxoxanthenon).
Die zu untersuchenden Proben können wässrige Lösungen, insbsondere Pufferlösungen oder natürlich vorkommende Köφerflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Gewebeflüssigkeiten oder auch beispielsweise Eigelb sein. Bei einer zu untersuchenden Probe kann es sich auch um eine optisch trübe Flüssigkeit, Oberflächenwasser, einen Boden- oder Pflanzenextrakt oder eine Biooder Syntheseprozessbrühe handeln. Die Proben können auch aus biologischen Gewebeteilen oder Zellkulturen präpariert sein.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur massenspektrometrischen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten, dadurch gekennzeichnet, dass in einer MALDI-Messanordnung ein erfindungsgemässes Trägersubstrat nach einer der genannten Ausführungsformen verwendet wird, wobei das Trägersubstrat eine Metalloxidoberfläche, vorzugsweise aus der Gruppe umfassend TiO2, ZnO, Nb2O5, Ta2O5, HfO2, und ZrO2, umfasst.
Bevorzugt wird das erfindungsgemässe massenspektrometrische Bestimmungsverfahren so ausgeführt, dass die Signale von Ionen mit niedrigem Masse-zu-Ladungs-Quotienten, insbesondere von der MALDI-Matrix, mittels zeitverzögerten Anlegens der Beschleunigungsspannung im Flugzeitrohr der MALDI- Messanordnung, nach dem laserinduzierten Desoφtionsschritt, minimiert werden können. Hierfür ist es von besonderem Vorteil, wenn das Metalloxid der Trägersubstratoberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend TiO2, ZnO, Nb2O5, Ta2O5, HfO2, und ZrO2.
Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist auch ein gekoppeltes Nachweis verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass für den Teil des massenspektrometrischen Nachweises eines oder mehrerer Analyten in einer MALDI-Messanordnung ein erfindungsgemässes Trägersubstrat nach einer der genannten Ausführungsformen verwendet wird. Dabei werden auf einer auf dem Trägersubstrat aufgebrachten MALDI-Matrix immobilisierte Analytmoleküle oder im Rahmen des Teils des optischen Nachweis an biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente gebundene Analytmoleküle nach Abschluss des optischen Nachweisschrittes in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert. Kennzeichen einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei, dass nach Abschluss des optischen Nachweisschrittes auf das Trägersubstrat mit direkt auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer auf dem Trägersubstrat aufgebrachten Haftvermitllungsschicht immobilisierten Analytmolekülen oder mit an direkt auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer auf dem Trägersubstrat aufgebrachten Haftvermitllungsschicht immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen gebundenen Analytmolekülen eine MALDI-Matrix aufgebracht wird und die immobilisierten oder gebundenen Analytmoleküle massenspektrometrisch in einer MALDI-Messanordnung analysiert werden.
Vorzugsweise wird das Verfahren so ausgeführt, dass die Signale von Ionen mit niedrigem Masse-zu-Ladungs-Quotienten, insbesondere von der MALDI-Matrix, mittels zeitverzögerten Anlegens der Beschleunigungsspannung im Flugzeitrohr der MALDI-Messanordnung, nach dem laserinduzierten Desoφtionsschritt, minimiert werden können. Hierfür ist es wiederum von Vorteil, wenn das Metalloxid der Trägersubstratoberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend TiO2, ZnO, Nb2O5, Ta2O5, HfO2, und ZrO2.
Es ist auch möglich, dass die Analytmoleküle oder die chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente, mit gegebenenfalls daran gebundenen Analytmolekülen, in diskreten Messbereichen (Spots) auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI-Matrix immobilisiert sind und dass die diskreten Messbereiche sequentiell in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.
Es ist auch wiederum möglich, dass Messbereiche eine Vielzahl verschiedener massenspektrometrisch zu bestimmender Arten von Analytmolekülen oder von (bio)chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen umfassen, welche mit Ortsauflösung innerhalb besagter Messbereiche in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.
Es wird bevorzugt, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung bis zu 1 000000 Messbereiche angeordnet sind und ein einzelner Messbereich eine Fläche von 0.001 - 6 mm2 einnimmt, und dass besagte Messbereiche sequentiell in einer MALDI- Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.
Ausserdem wird bevorzugt, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung mehr als 100, bevorzugt mehr als 1000, besonders bevorzugt mehr als 10000 Messbereiche pro Quadratzentimeter angeordnet sind, und dass besagte Messbereiche sequentiell in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich zur massenspektrometrischen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Proteinen, wie beispielsweise Antiköφern oder Antiköφerfragmenten, Antigenen, Rezeptoren und deren Liganden, Chelatoren, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag-Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag-Proteinen") und deren Komplexbildungspartnern, natürlichen oder veränderten Nukleinsäuren, wie beispielsweise Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA- Analoga, Enzymen, Enzymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen. Kohlehydraten sowie primären oder sekundären Metabolyten biologischer Prozesse.
Das Verfahren kann auch eingesetzt werden zur massenspektrometrischen Bestimmung eines oder mehrere Analyten aus der Gruppe, die von Acetylenen, Alkaloiden (beispielsweise Alkaloide mit Pyridinen, Pyperidinen, Tropanen, Chinolinen, Isochinolinen, Tropilidenen, Imidazolen, Indolen, Purinen, Fenantridinen enthaltenden Ringstrukturen), Alkaloidglycosiden, Aminen, Benzofuranen, Benzophenonen, Naphthochinonen, Betainen, Kohlenhydraten (z. B. Zucker-, Stärke- und Cellulosederivaten), Carbolinen, Cardenoliden, Catecholen, Chalkonen, Cumarinen, zyklischen Peptiden und Polypeptiden, Depsipeptiden, Diketopiperazinen, Diphenylethern, Flavenen, Flavonen, Isoflavanonen, Flavonoid- Alkaloiden, Furanochinolin-Alkaloiden, Gallocatechinen, Glycosiden, Antrachinonen, Flavonoiden, Lactonen, Phenolen, Hydrochinonen, Indolen, Indolochinonen, Alginsäuren, Lipiden (zum Beispiel Ölen, Wachsen und anderen Fettsäurederivaten), Macroliden, Oligopeptiden, Oligostilbenen, Peroxiden, Phenylglycosiden, Phloroglucinen, Polyethern, "Polyether-Antibiotica", Pterocaφinen, Pyranocumarinen, Pyrrolen, Quassinen, Chinolinen, Saframycinen, Teφenen (Mono-, Di-, und Triteφenen), Sesquiteφenen, Sesquiteφen-Dimeren, Sesquiteφen- Lactonen, Sesquiteφen-Chinonen, Sesterteφenen, Staurosporinen, Steroiden (wie beispielsweise Steroid-Hormonen, Sterolen, Gallensäuren), Sulfolipiden, Tanninen (z. B. Catechol und Pyrogallol), Vitaminen, ätherischen Ölen und Xanthonen (z. B. 9- Oxoxanthenon) gebildet wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines optisch transparenten Trägersubstrats und / oder eines Verfahrens nach einer der genannten Ausführungsformen zu quantitativen oder qualitativen Analysen zur Bestimmung oder Anreicherung oder Identifikation chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung (insbesondere Hochdurchsatz-Screening, „High Trough-Put Screening HTS"), der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Gen- oder Protein-Expressionsprofilen sowie zum Nachweis von Antiköφern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Produktentwicklung und -forschung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktentwicklung und -forschung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen erläutert. Beispiele
1. Optisch transparentes Trägersubstrat, mit einer Metalloxidoberfläche, für eine MALDI-Messanordnung und damit ausgeführtes Nachweisverfahren
Als optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung dient ein Plättchen aus AF45-Glas, mit den äusseren Abmessungen 57 mm Breite x 14 mm Länge x 0.7 mm Dicke mit einer darauf aufgebrachten, 150 nm dünnen Schicht aus Tantalpentoxid.
a) Eine Lösung des Peptids Melittin (Molekulargewicht 2846.5 Da) wird mit Sinapinsäure (MALDI-Matrix) gemischt. Ein Tropfen der Mischung (ca. 1 μl) wird auf dem unstrukturierten Teil der Tantalpentoxidoberfläche des erfindungsgemässen Trägersubstrats aufgetragen. Zu Vergleichszwecken wird auf einer anderen Stelle der Tantalpentoxidoberfläche ein Tropfen der reinen Sinapinsäure aufgebracht. Nach Eintrocknen der Tropfen zu „Spots" von jeweils ca. 1 mm Durchmesser werden Massenspektren aus den Bereichen der beiden Spots aufgenommen.
Während sich für das Massenspektrum des Sinapinsäure-Spots erwartungsgemäss nennenswerte Signale nur bei sehr niedrigen Molekulargewichten bzw. (Mass/Ladung, m/z-Werten), im Bereich von etwa 200 Da - 300 Da, ergeben, zeigt sich überraschend im Massenspektrum des zweiten Spots, aus der Mischung von Melittin mit Sinapinsäure, ein deutliches Signal bei etwa 2870 Da (Figur 1). Für die in diesem wie in den nachfolgenden Beispielen aufgeführten (m/z)-Werte ist zu berücksichtigen, dass stets die Kalibration der MALDI-Messanordnung für Goldoberflächen als Oberfläche eines „regulären" MALDI-Substratträgers verwendet wurde. Aufgrund anderer Feldverteilungen über den erfindungsgemässen optischen Trägersubstraten ergeben sich demzufolge veränderte (m/z)-Werte, so dass für eine absolute Massenbestimmung eine neue Kalibration erforderlich wäre.
Als ein nächster Abschnitt dieses Experiments wird schrittweise eine wachsende Zeitverzögerung („delay time") zwischen dem laserinduzierten Desoφtionsschritt und dem Anlegen der Beschleunigungsspannung des MALDI-Flugzeitrohres durchgeführt. Überraschenderweise verschwinden bei einer Zeitverzögerung von 800 nsec die Signale der Probenmatrix, im Bereich kleinerer gemessener Molekulargewichte, vollständig (Figur 2). Zugleich wird unter diesen Bedingungen eine verbesserte Auflösung der Spektren, d.h. eine verringerte Peakbreite und eine erhöhte Signalintensität und damit ein verbessertes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis beobachtet. Die Intensität der eingestrahlten Laseφulse zur laserinduzierten Desoφtion konnte unter diesen Bedingungen auch verringert werden.
b) Das Experiment a) wird zu Vergleichszwecken wiederholt auf einer Glasoberfläche (AF 45, Rückseite des unter a) beschriebenen, optisch transparenten Substrats) sowie auf einem Substrat mit einer Goldoberfläche, wie es klassisch als MALDI- Substratträger Verwendung findet. Er ergeben sich Massenspektren von vergleichbarer, aber nicht besserer Qualität wie unter a) beschrieben (Figur 3). Die Signale der Probenmatrix können im Falle dieser Oberflächen jedoch durch zeitverzögertes Anlegen der Beschleunigungsspannung nicht vollständig zum Verschwinden gebracht werden.
c) Ein Tropfen Melittin-Lösung wird auf die Tantalpentoxidoberfläche aufgebracht. Nach Eintrocknen zu einem Spot wird dieser massenspektrometrisch in der MALDI-Messanordnung untersucht. - Proteinsignale können nicht festgestellt werden.
Nach Herausnahme des Trägers aus der MALDI-Messanordnung wird auf denselben Spot ein Tropfen Sinapinsäure aufgebracht. Nach Eintrocknen dieses Tropfens wird der Spot erneut massenspektrometrisch analysiert. - Es ergibt sich ein Massenspektrum mit einem deutlichen Protein-Signal, mit ähnlicher Qualität wie unter a) beschrieben.
d) Es wird ein gleichartiges Trägersubstrat, wie zu Beginn von Beispiel 1 beschrieben, verwendet. Auf der Tantalpentoxidoberfläche werden zehn diskrete Messbereiche (Spots) mittels Auftragens von je 1 μl einer Antiköφerlösung (120 μg/ml anti-Interleukin 4 Antiköφer in 1:10 verdünntem Phosphatsalzpuffer („1/10 PBS") erzeugt. Zusätzlich werden 2 Referenzsspots, ohne biochemische Erkennungselemente für einen Analyten, durch Auftragen von je 1 μl BSA-Lösung in Puffer (zur Passivierung unspezifischer, freier Bindungsstellen auf der Oberfläche mit für den Analyten nichtbindendem Rinderserumalbumin (BSA), 1/10 PBS mit 3 % BSA) erzeugt. Das Trägersubstrat wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit den aufgebrachten Tröpfchen in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert, anschliessend mit 1/10 PBS-Puffer gespült und dann nochmals eine Stunde lang mit Passivierungspuffer inkubiert.
Im nachfolgenden Assay, als Beispiel für den Nachweis eines Analyten in einer Probe, werden 120 μl Probenlösung mit Human-Interleukin 4 (h-IL 4, 1 μg/ml) in Assay-Puffer (PBS/10) mit der gesamten Trägersubstratoberfläche in Kontakt gebracht und eine Stunde lang inkubiert. Danach wird die Trägersubstratoberfläche dreimal mit je 1 mL Assay-Puffer und anschliessend extensiv mit Wasser gespült.
Nach Abschluss des Analytbindungsschrittes und der nachfolgenden Spülschritte wird auf den Substratträger MALDI-Matrix (Sinapinsäure (3,5-Dimethoxy-4- Hydroxyzimtsäure) in 50 % AcCN / 0.1 % TFA (Acetonitril / Tri-Fluor-Essigsäure) aufgetragen.
Sowohl die für den Analytnachweis als auch die als Referenz vorgesehenen Spots werden dann massenspektrometrisch mit einer MALDI-Messanordnung analysiert.
Es werden folgende Ergebnisse festgestellt:
- In den Massenspektren aus dem Bereich der Referenzspots sind deutlich für BSA charakteristische Signale (bei m/z-Werten von etwa 22.5, 34, 45, 67.5 kDa für einfach und mehrfach geladene BSA-Moleküle und deren Dimere) sowie ein unbekanntes, in BSA-Proben aber häufig detektiertes Signal bei einem m/z- Wert von 13 .- 14 kDa zu erkennen (Figur 4 und Ausschnittsvergrösserung für den (m/z)-Bereich von 10000 bis 20000 in Figur 5). In den Massenspektren aus dem Bereich der für den Analytnachweis vorgesehenen Spots sind zusätzlich zu einem unbekannten Signal bei einem (m/z)-Wert von 13 kDa deutliche Signale bei einem (m/z)-Wert von 15 kDa (entsprechend dem Molekulargewicht von h-IL 4) zu erkennen, was die selektive Erkennung und Bindung des Analyten in den vorgesehenen Messbereichen (Spots) auf dem Trägersubstrat demonstriert (Figur 6).
e) Zur Untersuchung der Einheitlichkeit der Signalhöhen und der gemessenen m/z-Werte für einen bestimmten Analyten wird eine l:l-Mischung von Ubiquitin (Molekulargewicht 8565.8 Da) (0.5 mg/ml) in Wasser und der MALDI-Matrixlösung in 9 über die Oberfläche des Trägersubstrats verteilten Spots aufgebracht. Anschliessend werden diese Spots wiederum massenspektrometrisch analysiert.
Hinsichtlich der Signalhöhen (bezogen auf den Quotienten aus der absoluten Signalhöhe und des Signalrauschens) und des m z -Quotienten ergibt sich eine statistische Verteilung über die Oberfläche des erfindungsgemässen Trägersubstrats. Dieses deutet auf eine relativ homogene Verteilung des Beschleunigungsfeldes über einem erfindungsgemässen Trägersubstrat in einer MALDI-Messanordnung hin.
Mit den Experimenten zu Beispiel 1. konnte gezeigt werden:
Optisch transparente Trägersubstrate aus Glas und insbesondere aus einem Metalloxid, bevorzugt aus Tantalpentoxid, sind ähnlich gut geeignet für MALDI- Messanordnungen wie bekanntermassen metallische Trägersubstrate, beispielsweise aus Gold.
Im Falle von erfindungsgemässen Trägersubstraten mit einer Metalloxidoberfläche, vorzugsweise aus Tantalpentoxid, können die Signale der Probenmatrix vollständig durch ein zeitverzögertes Anlegen der Beschleunigungsspannung unterdrückt werden und damit die Spektrenqualität deutlich gesteigert werden. Zugleich wird unter diesen Bedingungen eine verbesserte Auflösung der Spektren, d.h. eine verringerte Peakbreite und ein verbessertes Signal-zu-Rauschen- Verhältnis, beobachtet. Die Intensität der eingestrahlten Laseφulse zur laserinduzierten Desoφtion kann unter diesen Bedingungen verringert werden.
Die Bedingungen der MALDI-Messanordnung können für einen erfindungsgemässes Trägersubstrat so eingestellt werden, dass selektiv die in einem Bioaffmitätsassay gebundenen Analyten beim Desoφtionsschritt freigesetzt und massenspektrometrisch identifiziert werden können, während ihre als spezifische Bindungspartner immobilisierten Erkennungselemente auf dem Trägersubstrat verbleiben.
Beispiel 2: Optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI- Messanordnung, welches sequentiell die Durchführung einer optischen und einer massenspektrometrischen Messung ermöglicht, und damit durchgeführtes gekoppeltes Nachweisverfahren
Als optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung dient ein Plättchen aus AF45-Glas, mit den äusseren Abmessungen 57 mm Breite x 14 mm Länge x 0.7 mm Dicke mit einer darauf aufgebrachten, 150 nm dünnen Schicht aus Tantalpentoxid.
In dem Glasplättchen sind im Abstand von 9 mm zwei Oberflächenreliefgitter mit einer Gitteφeriode von 318 nm (mit Orientierung der Gitterlinien parallel zu der Breite des Plätchens) und einer Gittertiefe von (12 +/- 3) nm strukturiert, welche sich beim Prozess der Beschichtung mit dem Tantalpentoxidfilm etwa im Masstab 1 : 1 auf dessen Oberfläche übertragen haben. Die Länge dieser Gitterstrukturen (parallel zu der Länge des Plättchens) beträgt jeweils 0.5 mm.
In dem durchzuführenden gekoppelten Nachweisverfahren soll beispielhaft sequentiell in einem fluoreszenzbasierenden, optischen Nachweisverfahren und in einem nachfolgenden massenspektrometrischen Nachweisverfahren die Bindung von Human-Interleukin 4 (h-IL 4, R&D Systems, ...) als Analyt quantifiziert und identifiziert werden.
Die Vorbereitung des Trägersubstrats, einschliesslich der Immobilisierung der Erkennungselemente, erfolgt wie unter Beispiel ld) geschildert. Für den optischen Analytnachweis wird die Probenlösung mit nachzuweisenden h-IL 4 mit einem biotinylierten, sekundären anti-h-IL 4 Antiköφer und Cy5-markiertem Streptavidin (zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals) vorinkubiert (60 Minuten). Dann wird die so erzeugte Lösungsmischung in einem einzigen Schritt auf das Trägersubstrat mit den immobilisierten primären anti-h-IL 4- Antiköφern aufgebracht. Anschliessend wird das Trägersubstrat in eine optische Messanordnung, zur Anregung und Detektion von Fluoreszenz in einem planaren optischen Wellenleiter, eingesetzt. Eine geeignete optische Messanordnung ist beispielsweise in der Anmeldung PCT/EP 01/10012 beschrieben, deren Inhalt als vollständiger Bestandteil der vorliegenden Anmeldung angesehen wird. Mögliche Ausführungsformen und die einzelnen Schritte des optischen Nachweisverfahrens sind beispielsweise in der Anmeldung PCT/EP 01/05995 beschrieben, deren Inhalt ebenfalls als vollständiger Bestandteil der vorliegenden Anmeldung angesehen wird.
Wie in der genannten internationalen Anmeldung beschrieben, wird das Anregungslicht eines Lasers (beispielsweise bei 635 nm) mithilfe des ersten in dem erfindungsgemässen Trägersubstrat als Reliefgitter strukturierten Koppelgitter in die hochbrechende, wellenleitende Tantalpentoxidschicht eingekoppelt und dort geleitet, bis es am zweiten Gitterstreifen wieder ausgekoppelt wird. Auf den Messbereichen (Spots) gebundene fluoreszenzfähige Moleküle werden längs der Strecke der Lichtleitung des geführten Lichts im evaneszenten Feld (an der Oberfläche des Tantalpentoxidfilms) zur Fluoreszenz angeregt. - Der mehr oder minder isotrop in den Raum (in das Fernfeld) abgestrahlte Anteil dieses Fluoreszenzlichts wird mit einem optischen System, wie es in der PCT/EP 01/10012 beschrieben ist, erfasst und als Bild mit einer CCD-Kamera delektiert. Selektiv im Bereich der analytspezifischen Spots werden Fluoreszenzsignale beobachtet, deren Intensität bei sachgerecht gestalteteten Assaybedingungen beispielsweise im wesentlichen proportional zur Analytkonzentration ist.
Nach einem oder mehreren Spülschritten zur Entfernung ungebundener Analytmoleküle oder anderer, im Vorinkubationsschritt hinzugegebener Bindungspartner wird, wie unter Beispiel ld) beschrieben, wiederum eine MALDI- Matrix aufgetragen und das dermassen modifizierte Trägersubstrat dann in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert.
Beschreibung der Figuren:
Figur 1 zeigt das MALDI-Massenspektrum (positive Ionen) des Peptids Melittin (Img/mL in H2O dest.) auf der Metalloxidoberfläche eines Trägersubstrats bestehend aus 150 nm Tantalpentoxid auf AF45-Glas. Als MALDI-Matrix, in die das Peptid durch Mischung der Lösungen eingebettet wurde, diente Sinapinsäure (gesättigte Lösung in 50% Acetonitril, 0.1% Trifluoressigsäure). Die Zeitverzögerung („Delay Time") zwischen dem laserinduzierten Desoφtionsschritt und dem Anlegen der Beschleunigungsspannung des MALDI-Flugzeitrohres betrug 100 nsec. Es wurde die Massenkalibration (m/z) der MALDI-Messanordnung für eine "normale" Goldplatte als Trägersubstrat verwendet. Daher sind die mit dem erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrat gemessenen (m/z)-Werte leicht verändert.
Figur 2 zeigt eine Messung der gleichen Probe bei einer auf 800 nsec vergrösserten Delay Time. Die Signale der Probenmatrix, im Bereich kleiner (m/z)-Werte, verschwinden unter diesen Bedingungen vollständig, und es wird eine höhere Spektrenauflösung in Form einer verringerten Peakbreite beobachtet.
Figur 3 zeigt das MALDI-Massenspektrum (positive Ionen) des Peptids Melittin (Img/mL in H2O dest.) auf der Goldoberfläche eines konventionellen Trägersubstrats. Als MALDI-Matrix, in die das Peptid durch Mischung der Lösungen eingebettet wurde, diente Sinapinsäure (gesättigte Lösung in 50% Acetonitril, 0.1% Trifluoressigsäure). Die Delay Time betrug 100 nsec. Es wurde die Massenkalibration (m z) der MALDI-Messanordnung für eine "normale" Goldplatte als Trägersubstrat verwendet. Erwartungsgemäss stimmt daher der gemessene (m/z)-Wert von 2848 gut mit dem Literaturwert überein. Das Massenspektrum ist von ähnlicher Qualität wie das in Figur 1, auf einer Metalloxidoberfläche erzeugte Spektrum.
Figur 4 zeigt ein MALDI-Massenspektrum (positive Ionen) aus dem Bereich von Referenzspots, welche durch Auftragung von BSA-Lösung in Puffer (zur Passivierung unspezifischer, freier Bindungsstellen) mit für einen Analyten nichtbindendem Rinderserumalbumin, BSA, in 1: 10 verdünnter Phosphatsalz- Pufferlösung (PBS/10) auf der Trägersubstratoberfläche (Tantalpentoxid auf AF45- Glas) erzeugt wurden. Als MALDI-Matrix wurde anschliessend Sinapinsäure (gesättigte Lösung in 50% Acetonitril, 0.1% Trifluoressigsäure) aufgetragen. Die Delay Time betrug 100 nsec. Es wurde die Massenkalibration (m/z) der MALDI- Messanordnung für eine "normale" Goldplatte als Trägersubstrat verwendet. Unter Berücksichtigung einer erwarteten Verschiebung der gemessenen absoluten (m/z)- Werte aufgrund der Kalibration für ein anderes Trägermaterial entspricht das gemessene Spektrum den für BSA charakteristischen Signalen.
Figur 5 zeigt einen Ausschnitt des Spektrums von Figur 4 für den (m/z)-Bereich von 10000 bis 20000 (übereinstimmend mit Figur 6).
Figur 6 zeigt ein MALDI-Massenspektrum (positive Ionen) aus dem Bereich der Messbereiche (Spots) für den Nachweis von Human-Interleukin 4 (h-IL 4) nach Durchführung des Assays: Anti-h-IL 4-Antiköφer wurden auf der Metalloxidoberfläche eines erfindungsgemässen Trägersubstrats, bestehend aus einer Tantalpentoxidschicht auf AF45-Glas, in diskreten Messbereichen (Spots) immobilisiert. Die Trägersubstratoberfläche wurde, nach Passivierung freier, unspezifischer Bindungsstellen auf der Metalloxidoberfläche, mit einer Lösung von h- IL 4 (1 μg/ml) als nachzuweisendem Analyten in Puffer (PBS/10) eine Stunde lang inkubiert, dann mit Puffer und nachfolgend mit Wasser gewaschen. Als MALDI- Matrix wurde anschliessend Sinapinsäure (gesättigte Lösung in 50% Acetonitril, 0.1% Trifluoressigsäure) aufgetragen. Die Delay Time betrug 100 nsec. Es wurde die Massenkalibration (m/z) der MALDI-Messanordnung für eine "normale" Goldplatte als Trägersubstrat verwendet. Unter Berücksichtigung einer erwarteten Verschiebung der gemessenen absoluten (m/z)-Werte aufgrund der Kalibration für ein anderes Trägermaterial entspricht der gemessene Peak bei etwa (m/z) entsprechend 15 kDa einem an dieser Stelle gegebenenfalls zu erwartenden Signal von h-H 4. Das Signal bei etwa 13 kDa ist auf eine unbekannte, aber für BSA-Proben häufig zu beobachtende Komponente zurückzuführen.

Claims

Patentansprüche
1. Bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-MS-Messanordnung („Matrix Assisted Laser Desoφtion / Ionization Mass Spectrometry": MALDI-MS), dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägersubstrat sequentiell die Durchführung einer oder mehrerer optischer und einer oder mehrerer massenspektrometri scher Messungen ermöglicht.
2. Optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägersubstrat ein Material aus der Gruppe von Glas, Quarz, optisch transparenten Keramiken, Metalloxiden, optisch transparenten Kunststoffen, insbesondere transparenten thermoplastischen Kunststoffen, wie beispielsweise Polycarbonaten, Acrylaten, Polyacrylaten, insbesondere Polymethylmethacrylaten und Polystyrolen, umfasst.
3. Optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass besagte optisch transparente Kunststoffe form-, präg-, spritz- und / oder fräsbar sind.
4. Bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche besagten Trägersubstrats ein Metalloxid oder ein Gemisch von Metalloxiden umfasst.
5. Bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Material besagten Trägersubstrats ein Metalloxid aus der Gruppe umfasst, die von TiO2, ZnO, Nb2O5, Ta2O5, HfO , und ZrO gebildet wird, wobei TiO2, Ta2O5 und Nb2O5 besonders bevorzugt werden.
6. Optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche besagten Trägersubstrats, direkt als erste Schicht oder auf weiteren auf der Trägersubstratoberfläche aufgebrachten Schichten, eine MALDI-Matrix, bestehend aus bei der Wellenlänge eines im Desoφtionsschritt eingestrahlten Laseφulses stark absorbierenden Molekülen, aufgebracht ist.
7. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass besagte MALDI-Matrix Verbindungen aus der Gruppe von Hydroxybenzoesäuren, wie beispielsweise Gallussäure, Gentisinsäure (2,5- Hydroxybenzoesäure) und 2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoesäure, Bernsteinsäure, 3- Hydroxy-Picolinsäure, Kaffeesäure, Ferulasäure, 4-Nitroanilin, Anthranilsäure, Salicylamid, Isovanillin, Dithranol, 3-Aminochinolin, 1-Hydroxy-Isochinolin, Nikotinsäure, Sinapinsäure, trans-3-Indolacrylsäure, Zimtsäure und deren Derivaten, wie beispielsweise trans-3,5-Dimethoxy-4-hydroxy-Zimtsäure sowie α-Cyan-4- hydroxy-zimtsäure, Di- und Trihydroxy-acetophenone (z. B. 2, 6- Dihydroxyacetophenon und 2,4,6-Trihydroxyacetophenon) und Mischungen mit 5- Methoxy-Salicylsäure, etc. umfasst.
8. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 6 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die MALDI-Matrix als eine selbstorganisierte Monoschicht („self-assembled monolayer", SAM) ausgebildet ist.
9. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 6 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle in die MALDI-Matrix eingebettet sind.
10. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 6 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass die MALDI-Matrix nach Aufbringung der Analytmoleküle auf dem Trägersubstrat aufgebracht wird.
11. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immobilisierung der Analytmoleküle eine ebenfalls transparente Haftvermittlungsschicht auf besagtem Trägersubstrat aufgebracht ist, welche vorzugsweise eine Dicke von weniger als 200 nm, besonders bevorzugt von weniger als 20 nm hat
12. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 1 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Gruppe von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren und "selbstorganisierten passiven oder funktionalisierten Mono- oder Mehrfachschichten", Alkylphosphaten und - phosphonaten, multifunktionellen Block-Copolymeren, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycolen.
13. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Gruppe von Organophosphorsäuren der allgemeinen Formel I (A)
Y-B-OP03 H2 (IA)
oder von Organophosphonsäuren der allgemeinen Formel I (B)
Y-B-P03 H2 (IB)
und deren Salzen, in denen B einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Hetaryl- oder Hetarylalkylrest und Y Wasserstoff oder eine funktioneile Gruppe aus der Reihe Hydroxy, Carboxy, Amino, gegebenfalls durch Niederalkyl substituiertes Mono-oder Dialkylamino, Thiol, oder eine negative Säuregruppe aus der Reihe Ester, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Maleimid, Succinimydyl, Epoxy oder Acrylat bedeutet, wobei an B oder Y ein biologisches, biochemisches oder synthetisch herstellbares Erkennungselement durch Additions- oder Substitutionsreaktion angedockt sein kann, wobei auch Verbindungen angelagert sein können, die der Substratoberfläche eine Resistenz gegen Proteinadsoφtion und/oder Zelladhäsion verleihen und in B in der Kette gegebenenfalls anstelle einer oder mehrerer-CH2- Gruppen eine oder mehrere Ethylenoxidgruppen enthalten sein können.
14. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 6 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche des Trägersubstrats oder auf der auf dem Trägersubstrat aufgebrachten Haftvermittlungsschicht biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente immobilisiert sind, zur Erkennung und Bindung eines oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren Proben, welche mit besagten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden.
15. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 6 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle auf der auf dem Trägersubstrat befindlichen MALDI-Matrix aufgebracht sind.
16. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 6 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass auf der auf dem Trägersubstrat aufgebrachten MALDI-Matrix biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente immobilisiert sind, zur Erkennung und Bindung eines oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren Proben, welche mit besagten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden
17. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 15 - 16, dadurch gekennzeichnet, dass die MALDI-Matrix zugleich die Funktion einer Haftvermittlungsschicht hat oder eine auf besagtem Trägersubstrat aufgebrachte Haftvermittlungsschicht die Funktion einer MALDI-Matrix hat..
18. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 15 - 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine auf besagtem Trägersubstrat aufgebrachte Schicht als Mischung einer MALDI-Matrix und einer Haftvermittlungsschicht vorliegt.
19. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 9 - 18, dadurch gekennzeichnet, dass die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle oder die chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente in diskreten Messbereichen (Spots) auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI- Matrix immobilisiert sind.
20. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 9 - 19, dadurch gekennzeichnet, dass Messbereiche eine Vielzahl verschiedener massenspektrometrisch zu bestimmender Arten von Analytmolekülen oder von (bio)chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen umfassen.
21. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung bis zu 1 000000 Messbereiche angeordnet sind und ein einzelner Messbereich eine Fläche von 0.001 - 6 mm2 einnimmt.
22. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung mehr als 100, bevorzugt mehr als 1000, besonders bevorzugt mehr als 10000 Messbereiche pro Quadratzentimeter angeordnet sind.
23. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 1 - 22, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Oberfläche reine oder gemischte Oxide, Nitride oder Carbide von Metallen oder Halbleitern umfasst und darauf eine chemische Strukturierung durch lokale Abscheidung von Mono- oder Mehrfachschichten aus Organophosphaten und / oder Organophosphonaten (gemäss Anspruch 12) erzeugt ist.
24. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 1 - 23, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Oberfläche ein definiertes Muster mit Siliziumoxid bzw. Übergangsmetalloxiden aufweist.
25. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 24, dass auf den Siliziumoxidbereichen weitere Mono- oder Mehrfachschichten aus Organophosphaten und / oder Organophosphonaten durch Abscheidung aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht sind.
26. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 1 - 25, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Oberfläche reine oder gemischte Oxide, Nitride oder Carbide von Metallen oder Halbleitern umfasst und darauf lokale hydrophobe oder hydrophile Bereiche durch lokale Abscheidung von Mono- oder Mehrfachschichten aus Organophosphaten und / oder Organophosphonaten erzeugt sind und deren umgebende Substratoberfläche mit einer endständig hydrophoben beziehungsweise hydrophilen Monoschicht abgedeckt ist.
27. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 6 - 26, dadurch gekennzeichnet, dass besagte MALDI-Matrix oder besagte Haftvermittlungsschicht oder besagte Mono- oder Mehrfachschichten und / oder besagte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente mittels eines Verfahrens aufgebracht sind, welches ausgewählt ist aus aus der Gruppe, welche Tauchen, Aufsprühen, Aufstreichen, Aufpinseln, "Ink jet spotting", mechanischem Spotting mittels Stift, Feder oder Kapillare, "micro contact printing", fluidischer Kontaktierung der Substratoberfläche mit parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen", photolithographischen Immobilisierungsmethoden etc. umfasst.
28. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 14 oder 16 - 27, dadurch gekennzeichnet, dass besagte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente ausgewählt sind aus der Gruppe, die von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotiden) und Nukleinsäureanalogen (z. B. PNA) sowie deren Derivaten mit künstlichen Basen, mono- oder polyklonalen Antiköφern, Antiköφerfragmenten, Peptiden, Enzymen, Aptameren, synthetischen Peptidstrukturen, Glycopeptiden, Glycoproteinen, Oligosacchariden, Lektinen, löslichen, membrangebundenen und aus einer Membran isolierten Proteinen, wie beispielsweise Rezeptoren, deren Liganden, Antigenen für Antiköφer (z. B. Biotin für Streptavidin), "Histidin-Tag-Komponenten" und deren Komplexbildungspartnern, durch chemische Synthese erzeugten Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, etc. gebildet wird.
29. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 14 oder 16 - 27, dadurch gekennzeichnet, dass besagte biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente ausgewählt sind aus der Gruppe, die von Acetylenen, Alkaloiden (beispielsweise Alkaloide mit Pyridinen, Pyperidinen, Tropanen, Chinolinen, Isochinolinen, Tropilidenen, Imidazolen, Indolen, Purinen, Fenantridinen enthaltenden Ringstrukturen), Alkaloidglycosiden, Aminen, Benzofuranen, Benzophenonen, Naphthochinonen, Betainen, Kohlenhydraten (z. B. Zucker-, Stärke- und Cellulosederivaten), Carbolinen, Cardenoliden, Catecholen, Chalkonen, Cumarinen, zyklischen Peptiden und Polypeptiden, Depsipeptiden, Diketopiperazinen, Diphenylethern, Flavenen, Flavonen, Isoflavanonen, Flavonoid-Alkaloiden, Furanochinolin-Alkaloiden, Gallocatechinen, Glycosiden, Antrachinonen, Flavonoiden, Lactonen, Phenolen, Hydrochinonen, Indolen, Indolochinonen, Alginsäuren, Lipiden (zum Beispiel Ölen, Wachsen und anderen Fettsäurederivaten), Macroliden, Oligopeptiden, Oligostilbenen, Peroxiden, Phenylglycosiden, Phloroglucinen, Polyethern, "Polyether-Antibiotica", Pterocaφinen, Pyranocumarinen, Pyrrolen, Quassinen, Chinolinen, Saframycinen, Teφenen (Mono-, Di-, und Triteφenen), Sesquiteφenen, Sesquiteφen-Dimeren, Sesquiteφen-Lactonen, Sesquiteφen-Chinonen, Sesterteφenen, Staurosporinen, Steroiden (wie beispielsweise Steroid-Hormonen, Sterolen, Gallensäuren), Sulfolipiden, Tanninen (z. B. Catechol und Pyrogallol), Vitaminen, ätherischen Ölen und Xanthonen (z. B. 9-Oxoxanthenon) gebildet wird.
30. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 9 - 27, dadurch gekennzeichnet, dass besagte massenspektrometrisch zu bestimmende Analytmoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe, die von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotiden) und Nukleinsäureanalogen (z. B. PNA) sowie deren Derivaten mit künstlichen Basen, mono- oder polyklonalen Antiköφern, Peptiden, Enzymen, Aptameren, synthetischen Peptidstrukturen, Glycopeptiden, Glycoproteinen, Oligosacchariden, Lektinen, löslichen, membrangebundenen und aus einer Membran isolierten Proteinen, wie beispielsweise Rezeptoren, deren Liganden, Antigenen für Antiköφer (z. B. Biotin für Streptavidin), "Histidin-Tag-Komponenten" und deren Komplexbildungspartnern gebildet wird.
31. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 9 - 27, dadurch gekennzeichnet, dass besagte massenspektrometrisch zu bestimmende Analytmoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe, die von Acetylenen, Alkaloiden (beispielsweise Alkaloide mit Pyridinen, Pyperidinen, Tropanen, Chinolinen, Isochinolinen, Tropilidenen, Imidazolen, Indolen, Purinen, Fenantridinen enthaltenden Ringstrukturen), Alkaloidglycosiden, Aminen, Benzofuranen, Benzophenonen, Naphthochinonen, Betainen, Kohlenhydraten (z. B. Zucker-, Stärke- und Cellulosederivaten), Carbolinen, Cardenoliden, Catecholen, Chalkonen, Cumarinen, zyklischen Peptiden und Polypeptiden, Depsipeptiden, Diketopiperazinen, Diphenylethern, Flavenen, Flavonen, Isoflavanonen, Flavonoid- Alkaloiden, Furanochinolin-Alkaloiden, Gallocatechinen, Glycosiden, Antrachinonen, Flavonoiden, Lactonen, Phenolen, Hydrochinonen, Indolen, Indolochinonen, Alginsäuren, Lipiden (zum Beispiel Ölen, Wachsen und anderen Fettsäurederivaten), Macroliden, Oligopeptiden, Oligostilbenen, Peroxiden, Phenylglycosiden, Phloroglucinen, Polyethern, "Polyether-Antibiotica", Pterocaφinen, Pyranocumarinen, Pyrrolen, Quassinen, Chinolinen, Saframycinen, Teφenen (Mono-, Di-, und Triteφenen), Sesquiteφenen, Sesquiteφen-Dimeren, Sesquiteφen-Lactonen, Sesquiteφen-Chinonen, Sesterteφenen, Staurosporinen, Steroiden (wie beispielsweise Steroid-Hormonen, Sterolen, Gallensäuren), Sulfolipiden, Tanninen (z. B. Catechol und Pyrogallol), Vitaminen, ätherischen Ölen und Xanthonen (z. B. 9- Oxoxanthenon)gebildet wird.
32. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 13 oder 15 - 231, dadurch gekennzeichnet, dass Bereiche zwischen den räumlich getrennten Messbereichen zur Minimierung unspezifischer Bindung von Analyten oder deren Nachweissubstanzen "passiviert werden", d.h. dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen (d) gegenüber dem Analyten "chemisch neutrale" Verbindungen aufgebracht sind, vorzugsweise beispielsweise bestehend aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Analyten unspezifischen Antiköφern (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise aus der Tween-Reihe, insbesondere Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycole oder Dextrane, gebildet werden.
33. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 1 - 32, dadurch gekennzeichnet, dass dieses einen optischen Wellenleiter umfasst, welcher im wesentlichen planar ist.
34. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass dieses einen optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst.
35. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die optisch transparente Schicht (b) ein Material aus der Gruppe umfasst, die von Silikaten, z. B. Glas oder Quarz, transparenten thermoplastischen oder spritzbaren Kunststoff, beispielsweise Polycarbonaten, Polyimiden, Acrylaten, insbesondere Polymethylmethacrylaten, oder Polystyrolen gebildet wird.
36. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass der Brechungsindex der optisch transparenten Schicht (a) grosser als 1.8 ist.
37. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die optisch transparente Schicht (a) ein Material aus der Gruppe von TiO2, ZnO, Nb2Os, Ta2O5, HfO2, oder ZrO2, besonders bevorzugt aus TiO2 oder Ta2O5 oder Nb O5 umfasst.
38. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 34 - 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Schicht (a) 40 nm - 1000 nm, bevorzugt 100 nm - 300 nm, beträgt.
39. Optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 33 - 38, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägersubstrat ein oder mehrere optische Koppelemente aus der Gruppe von stirnflächengekoppelten Zylinderlinsen oder optischen Fasern als Lichtleitern, Koppelprismen und optischen Koppelgittern umfasst.
40. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägersubstrat ein oder mehrere Gitterstrukturen (c) als Koppelgitter umfasst, welche als Oberflächenreliefgitter in der optisch transparenten Schicht (a) moduliert sind.
41. Optisch transparentes Trägersubstrat nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Gitterstrukturen (c) mono- oder multidiffraktiv sind und eine Tiefe von 2 nm - 100 nm, bevorzugt von 10 nm - 30 nm, haben sowie eine Periode von 200 nm - 1000 nm, bevorzugt von 300 nm - 700 nm, haben.
42. Gekoppeltes Nachweisverfahren zur qualitativen und / oder quantitativen Bestimmung und massenspektrometrischen Identifikation eines oder mehrerer Analyten, dadurch gekennzeichnet, dass ein optisch transparentes Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 1 - 41 mit einer oder mehreren Proben mit darin enthaltenen, nachzuweisenden Analyten in Kontakt gebracht wird und sequentiell ein optischer und ein massenspektrometrischer Nachweis durchgeführt werden.
43. Gekoppeltes Nach weis verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass als Teil des optischen Verfahrensschritts zum gleichzeitigen oder sequentiellen, qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben besagte Proben und gegebenenfalls weitere Reagentien mit den auf einem Trägersubstrat (direkt oder vermittelt über eine oder mehrere Schichten) immobilisierten Erkennungselementen, zur spezifischen Erkennung und Bindung besagter Analyten, in Kontakt gebracht werden und aus der Bindung dieser Analyten oder weiterer zum Analytnachweis eingesetzter Nachweissubstanzen resultierende Änderungen von optischen oder elektronischen Signalen gemessen werden.
44. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 42 - 43, dadurch gekennzeichnet, dass die eine oder mehreren Proben mit einer Mischung aus den verschiedenen Nachweisreagentien zur Bestimmung der in besagten Proben nachzuweisenden Analyten vorinkubiert werden und diese Mischungen dann jeweils in einem einzigen Zugabeschritt mit den immobilisierten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden.
45. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 42 - 44, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung des effektiven Brechungsindex an der die immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente tragenden Oberfläche des Trägersubstrats, aufgrund molekularer Adsoφtion oder Desoφtion, beruht.
46. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung der Phaseήdifferenz zwischen einem Lichtanteil eines eingestrahlten Nachweislichts, welcher mit den Bereichen der immobilisierten Erkennungselemente wechselwirkt, und einem Referenzanteil beruht.
47. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass das eingestrahlte Nachweislicht polychromatisch ist und der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung der spektralen Verteilung von Interferenzmaxima und -minima, unter einem vorgegebenen Beobachtungswinkel, beruht.
48. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung der räumlichen Verteilung von Interferenzmaxima und -minima beruht.
49. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass das eingestrahlte Nachweislicht monochromatisch ist.
50. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 42 - 44, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung einer oder mehrerer Lumineszenzen beruht.
51. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass, für den optischen Nachweis des einen oder mehrerer Analyten, das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in einer Auflichtanregungsanordnung eingestrahlt wird.
52. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass, für den optischen Nachweis des einen oder mehrerer Analyten, das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in einer Transmissionslichtanregungsanordnung eingestrahlt wird.
53. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet,dass die biologischen oder biochemischen Erkennungselemente, zur spezifischen Erkennung und Bindung einer oder mehrerer Analyten, auf einem vorzugsweise planaren optischen Wellenleiter als Trägersubstrat (direkt oder vermittelt über eine oder mehrere Schichten) immobilisierten Erkennungselementen, immobilisiert sind, dass die eine oder mehrere Proben mit dem einen oder den mehreren darin nachzuweisenden Analyten und gegebenenfalls weitere Nachweisreagentien sequentiell oder nach Mischung mit besagten Proben in einem einzigen Schritt mit besagten immobilisierten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden und dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in den optischen Wellenleiter eingekoppelt wird mithilfe eines oder mehrerer optischer Koppelelemente aus der Gruppe, die von stirnflächengekoppelten Zylinderlinsen, optischen Fasern als Lichtleitern, Koppelprismen und optischen Koppelgittern gebildet wird.
54. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten im Nahfeld (evaneszenten Feld) eines optischen Schichtwellenleiters als Trägersubstrat, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), und über einer in der Schicht (a) dess optischen Schichtwellenleiters ausgeprägten Gitterstruktur (c) oder (c') anhand der aus der Bindung des Analyten und / oder weiterer Nachweisreagentien, an deren immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente, resultierenden Änderungen der Resonanzbedingungen zur Einkopplung eines Anregungslichts in die Schicht (a) eines als Schichtwellenleiter ausgebildeten Trägers oder zur Auskopplung von in der Schicht (a) geführten Lichts erfolgt.
55. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Änderung des Einkoppelwinkels eines auf eine in der Schicht (a) ausgeprägten Gitterstruktur (c) eingestrahlten, im wesentlichen monochromatischen Nachweislichts in die Schicht (a), aufgrund der Bindung des Analyten und / oder weiterer Nachweisreagentien, an deren im Bereich dieser Gitterstruktur immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente, beruht.
56. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Änderung der Resonanzwellenlänge zur Einkopplung eines auf eine in der Schicht (a) ausgeprägten Gitterstruktur (c) eingestrahlten, im wesentlichen parallelen Nachweislichtbündels in die Schicht (a), aufgrund der Bindung des Analyten und / oder weiterer Nachweisreagentien, an deren im Bereich dieser Gitterstruktur immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente, beruht.
57. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 54 - 56, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf einer ortsaufgelösten Bestimmung von Änderungen der Resonanzbedingungen zur Einkopplung eines Anregungslichts in die Schicht (a) oder Auskopplung eines in der Schicht (a) eines Schichtwellenleiters als Trägersubstrat geführten Lichts beruht, mit einem zweidimensionalen Array aus mindestens vier oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen auf diesem Schichtwellenleiter als Trägersubstrat, mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), mit einer oder mehrereren Gitterstrukturen (c) zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen oder Auskopplung von in der Schicht (a) geführtem Licht im Bereich des Messbereiche mit mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen auf der einen oder den mehreren Gitterstrukturen (c), wobei in diesen Messbereichen gleichen oder unterschiedliche biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselementen zum qualitativen und / oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe immobilisiert sind, wobei die Dichte der Messbereiche auf einer gemeinsamen Gitterstruktrur (c) mindestens 10 Messbereiche pro Quadratzentimeter beträgt und wobei besagtes Anregungslicht gleichzeitig auf besagtes Array von Messbereichen eingestrahlt wird und der Grad der Erfüllung der Resonanzbedingung für die Lichteinkopplung in die Schicht (a) zu besagten Messbereichen gleichzeitig gemessen wird und ein Übersprechen von in der Schicht (a) geführtem Anregungslicht von einem Messbereich zu einem oder mehreren benachbarten Messbereichen durch Wiederauskopplung dieses Anregungslichts mittels der Gitterstruktur (c) verhindert wird.
58. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass besagter optischer Wellenleiter als optischer Schichtwellenleiter ausgebildet ist mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), dass weiterhin Anregungslicht mithilfe einer oder mehrerer Gitterstrukturen (c) oder (c'), welche in der optisch transparenten Schicht (a) ausgeprägt sind, in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelt und zu darauf befindlichen Messbereichen (d) als geführte Welle geleitet wird, und dass weiterhin die im evaneszenten Feld besagter geführter Welle erzeugte Lumineszenz von lumineszenzfähigen Molekülen mit einem oder mehreren Detektoren erfasst und die relative Menge oder Konzentration eines oder mehrerer Analyten aus der Intensität dieser Lumineszenzsignale bestimmt wird.
59. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über eine Gitterstruktur (c) oder (c') ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.
60. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 45 - 59, dadurch gekennzeichnet, dass die Analytmoleküle oder die chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente in diskreten Messbereichen (Spots) auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI-Matrix immobilisiert sind und dass das von den diskreten Messbereichen ausgehende Licht mit einem oder mehreren Detektoren in einem bildgebenden Verfahren gemessen und aufgezeichnet wird.
61. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, dass Messbereiche eine Vielzahl verschiedener massenspektrometrisch zu bestimmender Arten von Analytmolekülen oder von (bio)chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen umfassen.
62. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 60 oder Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass die aufgezeichneten Daten in einer zweidimensionalen Datenmatrix auf einem Datenträger gespeichert werden.
63. Gekoppeltes Nach weis verfahren nach einem der Ansprüche 58 - 62, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung der Lumineszenz ein Lumineszenzfarbstoff oder lumineszentes Nanopartikel als Lumineszenzlabel verwendet wird, das bei einer Wellenlänge zwischen 300 nm und 1100 nm angeregt werden kann und emittiert.
64. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzlabel an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen oder an die biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente gebunden ist.
65. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 63 - 64, dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites oder noch weitere Lumineszenzlabel mit gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden.
66. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite oder noch weitere Lumineszenzlabel bei der gleichen Wellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel angeregt werden können, aber bei anderen Wellenlängen emittieren.
67. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungsspektren und Emissionsspektren der eingesetzten Lumineszenzlabel nur wenig oder gar nicht überlappen.
68. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, dass zum optischen Nachweis des Analyten Ladungs- oder optischer Energietransfer von einem als Donor dienenden ersten Lumineszenzlabel zu einem als Akzeptor dienenden zweiten Lumineszenzlabel verwendet wird.
69. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 58 - 68, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden.
70. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 45 - 69, dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden.
71. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 58 - 70, dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
72. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 42 - 71 zur gleichzeitigen oder sequentiellen, quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Proteinen, wie beispielsweise Antiköφern oder Antiköφerfragmenten, Antigenen, Rezeptoren und deren Liganden, Chelatoren, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag- Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag-Proteinen") und deren Komplexbildungspartnern, natürlichen oder veränderten Nukleinsäuren, wie beispielsweise Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA- Analoga, Enzymen, Enzymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen sowie primären oder sekundären Metabolyten biologischer Prozesse.
73. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 42 - 71 zur gleichzeitigen oder sequentiellen, quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Acetylenen, Alkaloiden (beispielsweise Alkaloide mit Pyridinen, Pyperidinen, Tropanen, Chinolinen, Isochinolinen, Tropilidenen, imidazolen, Indolen, Purinen, Fenantridinen enthaltenden Ringstrukturen), Alkaloidglycosiden, Aminen, Benzofuranen, Benzophenonen, Naphthochinonen, Betainen, Kohlenhydraten (z. B. Zucker-, Stärke- und Cellulosederivaten), Carbolinen, Cardenoliden, Catecholen, Chalkonen, Cumarinen, zyklischen Peptiden und Polypeptiden, Depsipeptiden, Diketopiperazinen, Diphenylethern, Flavenen, Flavonen, Isoflavanonen, Flavonoid- Alkaloiden, Furanochinolin-Alkaloiden, Gallocatechinen, Glycosiden, Antrachinonen, Flavonoiden, Lactonen, Phenolen, Hydrochinonen, Indolen, Indolochinonen, Alginsäuren, Lipiden (zum Beispiel Ölen, Wachsen und anderen Fettsäurederivaten), Macroliden, Oligopeptiden, Oligostilbenen, Peroxiden, Phenylglycosiden, Phloroglucinen, Polyethern, "Polyether-Antibiotica", Pterocaφinen, Pyranocumarinen, Pyrrolen, Quassinen, Chinolinen, Saframycinen, Teφenen (Mono-, Di-, und Triteφenen), Sesquiteφenen, Sesquiteφen-Dimeren, Sesquiteφen- Lactonen, Sesquiteφen-Chinonen, Sesterteφenen, Staurosporinen, Steroiden (wie beispielsweise Steroid-Hormonen, Sterolen, Gallensäuren), Sulfolipiden, Tanninen (z. B. Catechol und Pyrogallol), Vitaminen, ätherischen Ölen und Xanthonen (z. B. 9- Oxoxanthenon).
74. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 42 - 73, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Proben wässrige Lösungen, insbsondere Pufferlösungen oder natürlich vorkommende Köφerflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Gewebeflüssigkeiten oder Eigelb sind.
75. Gekoppeltes Nach weis verfahren nach einem der Ansprüche 42 - 73, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende Probe eine optisch trübe Flüssigkeit, Oberflächenwasser, ein Boden- oder Pflanzenextrakt, eine Bio- oder Syntheseprozessbrühe ist.
76. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 42 - 73, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Proben aus biologischen Gewebeteilen oder Zellkulturen präpariert sind.
77. Verfahren zur massenspektrometrischen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten, dadurch gekennzeichnet, dass in einer MALDI-Messanordnung ein Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 4 - 41 verwendet wird, wobei das Trägersubstrat eine Metalloxidoberfläche, vorzugsweise aus der Gruppe umfassend TiO2, ZnO, Nb2O5, Ta2O5, HfO2, und ZrO2, umfasst.
78. Verfahren nach Anspruch 77, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale von Ionen mit niedrigem Masse-zu-Ladungs-Quotienten, insbesondere von der MALDI- Matrix, mittels zeitverzögerten Anlegens der Beschleunigungsspannung im Flugzeitrohr der MALDI-Messanordnung, nach dem laserinduzierten Desoφtionsschritt, minimiert werden können.
79. Verfahren nach Anspruch 78, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale von Ionen mit niedrigem Masse-zu-Ladungs-Quotienten, insbesondere von der MALDI- Matrix, mittels zeitverzögerten Anlegens der Beschleunigungsspannung im Flugzeitrohr der MALDI-Messanordnung, nach dem laserinduzierten Desoφtionsschritt, mit Trägersubstraten mit einer Metalloxidoberfläche nahezu vollständig eliminiert werden können, wobei das Metalloxid vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend TiO2, ZnO, Nb2Os, Ta2O5, HfO2, und ZrO2.
80. Gekoppeltes Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 42 - 76, dadurch gekennzeichnet, dass für den Teil des massenspektrometrischen Nachweises eines oder mehrerer Analyten in einer MALDI-Messanordnung ein Trägersubstrat nach einem der Ansprüche 1 - 41 verwendet wird.
81. Gekoppeltes Nachweis verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass auf einer auf dem Trägersubstrat aufgebrachten MALDI-Matrix immobilisierte Analytmoleküle oder im Rahmen des Teils des optischen Nachweises an biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente gebundene Analytmoleküle nach Abschluss des optischen Nachweisschrittes gemäss einem der Ansprüche 43 -76 in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.
82. Gekoppeltes Nachweisverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass nach Abschluss des optischen Nachweisschrittes nach einem der Ansprüche 43 - 76 auf das Trägersubstrat mit direkt auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer auf dem Trägersubstrat aufgebrachten Haftvermitllungsschicht immobilisierten Analytmolekülen oder mit an direkt auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer auf dem Trägersubstrat aufgebrachten Haftvermitllungsschicht immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen gebundenen Analytmolekülen eine MALDI-Matrix aufgebracht wird und die immobilisierten oder gebundenen Analytmoleküle massenspektrometrisch in einer MALDI-Messanordnung analysiert werden.
83. Verfahren nach einem der Ansprüche 81 - 82, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale von Ionen mit niedrigem Masse-zu-Ladungs-Quotienten, insbesondere von der MALDI-Matrix, mittels zeitverzögerten Anlegens der Beschleunigungsspannung im Flugzeitrohr der MALDI-Messanordnung, nach dem laserinduzierten Desoφtionsschritt, minimiert werden können.
84. Verfahren nach einem der Ansprüche 81 - 82, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale von Ionen mit niedrigem Masse-zu-Ladungs-Quotienten, insbesondere von der MALDI-Matrix, mittels zeitverzögerten Anlegens der Beschleunigungsspannung im Flugzeitrohr der MALDI-Messanordnung, nach dem laserinduzierten Desoφtionsschritt, mit Trägersubstraten mit einer Metalloxidoberfläche nahezu vollständig eliminiert werden können, wobei das Metalloxid vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend TiO2, ZnO, Nb2O5, Ta2O5, HfO2, und ZrO2.
85. Verfahren nach einem der Ansprüche 80 - 84, dadurch gekennzeichnet, dass die Analytmoleküle oder die chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente, mit gegebenenfalls daran gebundenen Analytmolekülen, in diskreten Messbereichen (Spots) auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI- Matrix immobilisiert sind und dass die diskreten Messbereiche sequentiell in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.
86. Verfahren nach Anspruch 85, dadurch gekennzeichnet, dass Messbereiche eine Vielzahl verschiedener massenspektrometrisch zu bestimmender Arten von Analytmolekülen oder von (bio)chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen umfassen, welche mit Ortsauflösung innerhalb besagter Messbereiche in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.
87. Verfahren nach Anspruch 85, dadurch gekennzeichnet, dass in einer 2- dimensionalen Anordnung bis zu 1 000000 Messbereiche angeordnet sind und ein einzelner Messbereich eine Fläche von 0.001 - 6 mm einnimmt, und dass besagte Messbereiche sequentiell in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.
88. Verfahren nach Anspruch 85, dadurch gekennzeichnet, dass in einer 2- dimensionalen Anordnung mehr als 100, bevorzugt mehr als 1000, besonders bevorzugt mehr als 10000 Messbereiche pro Quadratzentimeter angeordnet sind, und dass besagte Messbereiche sequentiell in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.
89. Verfahren nach einem der Ansprüche 77 - 88 zur massenspektrometrischen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Proteinen, wie beispielsweise Antiköφern oder Antiköφerfragmenten, Antigenen, Rezeptoren und deren Liganden, Chelatoren, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag-Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag-Proteinen") und deren Komplexbildungspartnern, natürlichen oder veränderten Nukleinsäuren, wie beispielsweise Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA- Analoga, Enzymen, Enzymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen. Kohlehydraten sowie primären oder sekundären Metabolyten biologischer Prozesse.
90. Verfahren nach einem der Ansprüche 77 - 88 zur massenspektrometrischen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe, die von Acetylenen, Alkaloiden (beispielsweise Alkaloide mit Pyridinen, Pyperidinen, Tropanen, Chinolinen, Isochinolinen, Tropilidenen, Imidazolen, Indolen, Purinen, Fenantridinen enthaltenden Ringstrukturen), Alkaloidglycosiden, Aminen, Benzofuranen, Benzophenonen, Naphthochinonen, Betainen, Kohlenhydraten (z. B. Zucker-, Stärke- und Cellulosederivaten), Carbolinen, Cardenoliden, Catecholen, Chalkonen, Cumarinen, zyklischen Peptiden und Polypeptiden, Depsipeptiden, Diketopiperazinen, Diphenylethern, Flavenen, Flavonen, Isoflavanonen, Flavonoid- Alkaloiden, Furanochinolin-Alkaloiden, Gallocatechinen, Glycosiden, Antrachinonen, Flavonoiden, Lactonen, Phenolen, Hydrochinonen, Indolen, Indolochinonen, Alginsäuren, Lipiden (zum Beispiel Ölen, Wachsen und anderen Fettsäurederivaten), Macroliden, Oligopeptiden, Oligostilbenen, Peroxiden, Phenylglycosiden, Phloroglucinen, Polyethern, "Polyether-Antibiotica", Pterocaφinen, Pyranocumarinen, Pyπolen, Quassinen, Chinolinen, Saframycinen, Teφenen (Mono-, Di-, und Triteφenen), Sesquiteφenen, Sesquiteφen-Dimeren, Sesquiteφen-Lactonen, Sesquiteφen-Chinonen, Sesterteφenen, Staurosporinen, Steroiden (wie beispielsweise Steroid-Hormonen, Sterolen, Gallensäuren), Sulfolipiden, Tanninen (z. B. Catechol und Pyrogallol), Vitaminen, ätherischen Ölen und Xanthonen (z. B. 9-Oxoxanthenon) gebildet wird.
91. Verwendung eines optisch transparenten Trägersubstrats nach einem der Ansprüche 1 - 41 oder eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 42 - 90 zu quantitativen oder qualitativen Analysen zur Bestimmung oder Anreicherung oder Identifikation chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung (insbesondere Hochdurchsart- Sccreening, „High Through-Put Sccreening HTS"), der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA-Analytik, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Gen- oder Protein- Expressionsprofilen sowie zum Nachweis von Antiköφern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Produktentwicklung und -forschung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktentwicklung und - forschung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
PCT/EP2002/013312 2001-12-13 2002-11-26 Optisch transparentes trägersubstrat für eine maldi-messanordnung und dessen verwendung WO2003050517A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02804574A EP1454127A1 (de) 2001-12-13 2002-11-26 Optisch transparentes trägersubstrat für eine maldi-messanordnung und dessen verwendung
AU2002357547A AU2002357547A1 (en) 2001-12-13 2002-11-26 Optically transparent substrate for a maldi measuring system and the use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH2296/01 2001-12-13
CH22962001 2001-12-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003050517A1 true WO2003050517A1 (de) 2003-06-19

Family

ID=4568440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2002/013312 WO2003050517A1 (de) 2001-12-13 2002-11-26 Optisch transparentes trägersubstrat für eine maldi-messanordnung und dessen verwendung

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1454127A1 (de)
AU (1) AU2002357547A1 (de)
WO (1) WO2003050517A1 (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006114249A1 (de) * 2005-04-26 2006-11-02 Bayer Technology Services Gmbh Neue apparatur und verfahren zur beschichtung von trägersubstraten für einen analytnachweis mittels affinitäts-nachweisverfahren
WO2014048117A1 (zh) * 2012-09-27 2014-04-03 广州高通生物技术有限公司 一种芯片、制备方法、用途及筛选药物的方法
EP2730918A1 (de) * 2011-07-08 2014-05-14 Kyushu University National University Corporation Matrix für die maldi-massenspektrometrie
CN110108780A (zh) * 2019-05-15 2019-08-09 浙江大学 3-肼基苯甲酸衍生化葡聚糖在maldi-tof-ms质量校准中的应用
DE102021105327B3 (de) 2021-03-05 2022-05-12 Bruker Daltonics GmbH & Co. KG Desorptions-Ionenquelle mit Postdesorptions-Ionisierung in Transmissionsgeometrie

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001092870A2 (de) * 2000-06-02 2001-12-06 Zeptosens Ag Kit und verfahren zur multianalytbestimmung
WO2002020873A2 (de) * 2000-09-05 2002-03-14 Zeptosens Ag Verfahren zur abscheidung von mono- und mehrfachschichten von organophosphor- und -phosphonsäuren und deren salzen sowie deren verwendung

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001092870A2 (de) * 2000-06-02 2001-12-06 Zeptosens Ag Kit und verfahren zur multianalytbestimmung
WO2002020873A2 (de) * 2000-09-05 2002-03-14 Zeptosens Ag Verfahren zur abscheidung von mono- und mehrfachschichten von organophosphor- und -phosphonsäuren und deren salzen sowie deren verwendung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NELSON R W ET AL: "Biosensor chip mass spectrometry: a chip based proteomics approach", ELECTROPHORESIS, vol. 21, no. 6, April 2000 (2000-04-01), ISSN 0173-0835, pages 1155 - 1163, XP002238873 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006114249A1 (de) * 2005-04-26 2006-11-02 Bayer Technology Services Gmbh Neue apparatur und verfahren zur beschichtung von trägersubstraten für einen analytnachweis mittels affinitäts-nachweisverfahren
US9050615B2 (en) 2005-04-26 2015-06-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Apparatus and method for coating substrates for analyte detection by means of an affinity assay method
EP2730918A1 (de) * 2011-07-08 2014-05-14 Kyushu University National University Corporation Matrix für die maldi-massenspektrometrie
EP2730918A4 (de) * 2011-07-08 2014-12-17 Univ Kyushu Nat Univ Corp Matrix für die maldi-massenspektrometrie
WO2014048117A1 (zh) * 2012-09-27 2014-04-03 广州高通生物技术有限公司 一种芯片、制备方法、用途及筛选药物的方法
CN110108780A (zh) * 2019-05-15 2019-08-09 浙江大学 3-肼基苯甲酸衍生化葡聚糖在maldi-tof-ms质量校准中的应用
DE102021105327B3 (de) 2021-03-05 2022-05-12 Bruker Daltonics GmbH & Co. KG Desorptions-Ionenquelle mit Postdesorptions-Ionisierung in Transmissionsgeometrie

Also Published As

Publication number Publication date
EP1454127A1 (de) 2004-09-08
AU2002357547A1 (en) 2003-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1274986B1 (de) Vorrichtung und verfahren zur multianalytbestimmung
EP1556695B1 (de) Analytische plattform und nachweisverfahren mit gegebenenfalls nach fraktionierung in einer probe nachzuweisenden analyten als immobilisierten spezifischen bindungspartnern
DE19725050C2 (de) Anordnung zur Detektion biochemischer oder chemischer Substanzen mittels Fluoreszenzlichtanregung und Verfahren zu deren Herstellung
DE112005001895B4 (de) Methoden und Systeme für die Detektion biomolekularer Bindung mithilfe von Terahertz-Strahlung
WO2001092870A2 (de) Kit und verfahren zur multianalytbestimmung
WO2000075644A9 (de) Sensorplatform und verfahren zur multianalytbestimmung
WO2007048436A1 (de) Verfahren zur bestimmung eines oder mehrerer analyten in komplex zusammengesetzten proben biologischen ursprungs und dessen verwendung
WO2001055691A2 (de) Wellenleiterplatte sowie darauf basierende sensorplattformen, anordnungen von probenbehältnissen und nachweisverfahren
DE10012793C2 (de) Sensorelement zur optischen Detektion von chemischen oder biochemischen Analyten
EP1334361A2 (de) Kit und verfahren zur multianalytbestimmung, mit vorkehrungen zur referenzierung der dichte immobilisierter erkennungselemente
EP1506403A2 (de) Kit for the development of analysis in parallel
EP1057008A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur lumineszenzmessung
EP1257809A1 (de) Spr-sensor und spr-sensoranordnung
EP1272829A1 (de) Gitter-wellenleiter-struktur zur verstärkung eines anregungsfeldes und deren verwendung
DE10126152A1 (de) Ortsaufgelöste Ellipsometrie-Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Probenänderungen, Biochip und Meßanordnung
WO2002046756A1 (de) Kit und verfahren zur multianalytbestimmung, mit vorkehrungen zur ortsaufgelösten referenzierung einer anregungslichtintensitaet
WO2004023142A1 (de) Analytische plattform und nachweisverfahren mit den in einer probe nachzuweisenden analyten als immobilisierten spezifischen bindungspartnern
EP0872735B1 (de) Verfahren zum Aufbringen von Reagenzspots
EP1807699B1 (de) Strukturierte copolymere träger für die spektrometrie oder spektroskopie
WO2003050517A1 (de) Optisch transparentes trägersubstrat für eine maldi-messanordnung und dessen verwendung
EP1024363A2 (de) Quantitative Bestimmung von Analyten in einem heterogenen System
DE10210737A1 (de) Einkanal-Mehrfarben-Korrelationsanalyse
WO1999054497A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur konzentrationsbestimmung, bestimmung von adsorbtions- und bindungskinetiken und gleichgewichts- und bindungskonstanten von molekülen durch lumineszenz-messungen
EP0784794A1 (de) Bindematrix und analysenelement zur simultananalyse verschiedener analyte
EP2112501A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Lumineszenzmessung

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002804574

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002804574

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP