WO2003031616A2 - Methoden zur dna-mutagenese und dna-klonierung - Google Patents

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WO2003031616A2
WO2003031616A2 PCT/EP2002/011086 EP0211086W WO03031616A2 WO 2003031616 A2 WO2003031616 A2 WO 2003031616A2 EP 0211086 W EP0211086 W EP 0211086W WO 03031616 A2 WO03031616 A2 WO 03031616A2
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oligonucleotides
dna
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Thomas Rudel
Nikolaus Machuy
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to methods and reagent kits for DNA manipulation, in particular for site-specific mutagenesis or for cloning.
  • nucleic acids For the investigation of structure-function relationships, e.g. the kinase function depending on certain amino acids or the promoter function of DNA segments depending on their sequence, it is often necessary to carry out a targeted mutagenesis of nucleic acids.
  • Hutchison et al. (Hutchison et al., 1 978) describe a site-directed mutagenesis in which single-stranded DNA is hybridized with an oligonucleotide which, except for the base to be mutagenized, is complementary to the template DNA. After extending the oligonucleotide, i.e. creating a double strand with a DNA polymerase, closing the synthesized strand with a ligase and transforming it into E. coli, should actually contain 50% of the clones mutated DNA. In practice, however, this rate is significantly lower (Kramer et al., 1 984).
  • mutagenesis is carried out similarly to the method described above, with the difference that, together with the mutagenesis oligonucleotide, two more
  • Hybridize primers that activate the Amp R gene and inactivate the Tet R gene (Kleina et al., 1990; Normanly et al., 1 990).
  • the Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit from Clontech uses a second oligonucleotide to be hybridized, which is used to destroy a restriction site that is unique in the starting construct (Deng and Nickoloff, 1 992; Zhü, 1 996). After hybridization and oligonucleotide extension, only the non-mutated plasmids are cut by digestion with this restriction enzyme, which plasmids can therefore no longer be transformed. This method also uses repair-deficient strains. In addition, two successive transformations are necessary, which significantly increases the duration of the mutagenesis.
  • the DNA section to be mutated is amplified in two separate PCRs in such a way that the products overlap at the mutation site by approximately 20 bases and already contain the mutated sequence (Lott Tips, F. and Zorbas, 1 998).
  • the two products are mixed and in a third PCR with oligonucleotides that allow cloning into the desired vector, the entire DNA is amplified.
  • the disadvantage of this method is that three PCRs are necessary.
  • Another mutagenesis method starts with two PCRs (Cooney, 1 998).
  • the two products overlap at the mutation site, but not 20 bases, but only so many that complementary ⁇ 'overhangs are produced by a T 4 DNA polymerase trimming reaction.
  • the outer ends of the PCR products are treated with restriction enzymes. Both products and the vector are mixed for ligation.
  • the disadvantages of this method are both the need to take into account restriction sites within the fragments and the ligation of three DNA fragments.
  • a first aspect of the present application is the subject of claim 1 and relates to a method for mutagenizing
  • Nucleic acids in particular double-stranded DNA fragments, comprising the steps:
  • nucleic acid template to be mutagenized, for example a plasmid vector
  • oligonucleotides which (i) each hybridize with a strand of the nucleic acid template and (ii) in the region of its 5 'ends a short, preferably 2-4
  • Base pairs have a long, complementary section
  • target sequence which is preferably in the range of 5'-
  • oligonucleotides are produced which, for example, contain the mutated DNA sequences at the ⁇ 'ends and which preferably have an overlap of 2-3 base pairs in length (here AA or TT).
  • the length of the oligonucleotides is chosen so that they can bind to the template with sufficient efficiency under suitable hybridization conditions.
  • the length of the oligonucleotides is usually, for example, 1 to 50 bases.
  • the rate of mutagenesis can be additionally increased by means of p? l digestion, whereby only methylated DNA is cut.
  • a negative control a ligation approach without
  • the approach without ligase cannot deliver transformants.
  • the mutation can be checked after transformation of the mutagenized
  • PCR control is carried out using an oligonucleotide that only leads to a product with mutated DNA. The first ten with this
  • the mutagenesis method according to the invention in particular carries out DNA manipulations, selected from the group: point mutations, an exchange or substitution of one or more individual nucleotides taking place; Insertions, in which one or more individual nucleotides are additionally inserted into the sequence; Inversions, one or more sequences of at least two bases, e.g. two, three or four bases, can be turned over; Deletions, where one or more individual bases are removed; and any combinations of the mutagenesis options mentioned, e.g. two or more combinations of point mutation, insertion, inversion and / or deletion in a single step or insertion of several point mutations with a maximum distance, corresponding to the length of the oligonucleotides used, e.g. 50 bases in one step.
  • the advantage of the method according to the invention over other mutagenesis methods is the extremely high mutagenesis rate of 95%.
  • the Generation of stepped ends by trimming, for example by means of a T 4 DNA polymerase reaction means that only accurately trimmed products can religion. In contrast to this, reading frame shifts due to an additional base, for example an adenine, can occur during the religation of untrimmed amplification products. In contrast to many commercially available systems, one is not dependent on the existence of singular restriction interfaces as well as certain antibiotic resistance.
  • Another advantage of the process is its speed. On the first day, PCR, T 4 DNA polymerase reaction, ligation, Dpnl digestion and transformation can be carried out. On the second day the colonies are analyzed by PCR and cultures for plasmid preparation are set up. The mutated DNA can be isolated and used in experiments on the third day.
  • this first aspect of the invention also relates to a reagent kit, in particular for carrying out the mutagenesis method described above, comprising: (a) means for nucleic acid amplification, (b) means for trimming double-stranded nucleic acids to produce stepped ends, that are complementary to each other,
  • the components of the reagent kit can be obtained together or from different sources.
  • the kit can also contain customary buffer and auxiliary reagents for carrying out the reactions as well as a written description of the process.
  • a second aspect of the invention relates to a new cloning method, with which the difficulties associated with the formation of multimers in both cloning doubles are more difficult Nucleic acid fragments, for example oligonucleotides with a length of preferably up to 200 bp, particularly preferably from 1 5-100 bp, or also longer PCR fragments, can be removed.
  • Nucleic acid fragments for example oligonucleotides with a length of preferably up to 200 bp, particularly preferably from 1 5-100 bp, or also longer PCR fragments, can be removed.
  • two complementary oligonucleotides are usually used which, after hybridization, have complementary overhangs to a vector opened with corresponding restriction enzymes and can be ligated therein.
  • the problem often arises that the double-stranded oligonucleotides form multimers and therefore either cannot be cloned at all or integrate them into the vector as multimers. This problem can be avoided by the method according to the invention.
  • the vector is opened with two different restriction enzymes and one or two nucleotides are filled in at the DNA ends using the Klenow polymerase. This creates different stepped ends that are not complementary to each other and not complementary to themselves ( Figure 2). The ends of the oligonucleotides are selected so that they are complementary to the filled-in vector ends.
  • the part into which the fragment to be cloned is to be inserted is amplified, for example by means of PCR. Then, by trimming, for example using T 4 DNA polymerase, using certain stop nucleotides, stepped ends are produced which are not complementary to themselves and not complementary to one another. To achieve this, the design of the oligonucleotides suitable bases are provided at the 5 'ends.
  • Variant 2 allows the insertion of double-stranded oligonucleotides at any position in a vector, for example a plasmid.
  • oligonucleotides To produce double-stranded oligonucleotides, equivalent amounts of the single-stranded oligonucleotides are hybridized with one another under suitable conditions, for example by mixing in the presence of MgCl 2 , heating and slow cooling from 95 ° C. to room temperature.
  • the ends of the hybridized oligonucleotides preferably have 5 'overhangs which are complementary to the 5' overhangs of the prepared vectors. Since the 5 'overhangs of the double-stranded DNA thus formed are not complementary to one another and to themselves, no multimers can be formed. This leads to an enormous increase in the efficiency of the cloning of oligonucleotides.
  • the incorporation of the oligonucleotides can be checked by PCR or / and restriction digestion and sequencing.
  • Another aspect of the invention is the subject of claim 8 and relates to a method for cloning nucleic acid fragments into a vector according to variant 1 comprising the steps:
  • this embodiment relates to a reagent kit, in particular for carrying out the cloning process, comprising:
  • Nucleoside triphosphates the ends of which are not complementary to one another and not complementary to themselves, and
  • (c) means for ligating nucleic acids.
  • the reagent kit can also contain customary buffer and auxiliary reagents as well as a written description of the process.
  • Yet another aspect of the invention is the subject of claim 1 3 and relates to a method for cloning nucleic acid fragments into a vector according to variant 2, comprising the steps:
  • Preferred embodiments of this method are the subject of claims 1 4 to 1 5.
  • this embodiment relates to a
  • Reagent kit especially for performing the aforementioned
  • (c) means for ligating nucleic acids.
  • the reagent kit can also contain conventional buffer and auxiliary reagents and a description of the process.
  • Another new possibility in connection with open vectors or plasmid parts produced according to variant 2 is to insert amplification products trimmed with T 4 DNA polymerase, for example PCR products.
  • cloning with this method is independent of restriction sites.
  • the stepped ends of the PCR products to be inserted must be complementary to the vector ends. This makes it possible to insert certain DNA sections very precisely and without additional, sometimes disturbing bases. This is particularly helpful if the fusion proteins are composed, for example, of a signal peptide and the protein to be examined. Furthermore, functional domains can be exchanged between different proteins at will.
  • Yet another aspect of the invention is the subject of claim 1 7 and relates to a method for cloning nucleic acid fragments into a vector, comprising the steps:
  • this embodiment relates to a reagent kit, in particular for carrying out the aforementioned cloning process, comprising:
  • (c) means for trimming double stranded nucleic acids to produce stepped ends which are not complementary to each other and not complementary to themselves, and
  • (d) means for ligating nucleic acids.
  • the reagent kit can also contain conventional buffer and auxiliary reagents and a description of the process.
  • the preferred annealing temperature of the oligonucleotides is specified and determined according to the 4 + 2 rule (2 ° C. for each adenine and thymine nucleotide; 4 ° C. for each guanine and cytosine nucleotide) using the base sequence of the oligonucleotide.
  • the difference in the annealing temperature of the two oligonucleotides should preferably be at most 2 ° C.
  • the base thymidine should preferably be avoided at the 3 'end of the oligonucleotides.
  • Ends of the amplification products are said to be phosphorylated.
  • Either the desired mutation is specified, e.g. on
  • Amino acid exchange, and the bases to be changed are determined by the algorithm, or only the desired mutation, e.g. a base exchange is specified. In both cases, additional silent mutations can be inserted.
  • the preparation of the vector by restriction digestion and subsequent filling reaction e.g. by the Klenow enzyme, the following algorithm applies:
  • Possible restriction interfaces are specified.
  • the program is designed to determine an interface combination with a nucleotide specification for the Klenow reaction. Furthermore, the 5 ' overhangs of the double-stranded oligonucleotides to be inserted, the must be complementary to the vector ends, but must not be complementary to themselves.
  • the exact insertion point is specified. This can also include a deletion.
  • T 4 - DNA polymerase reaction the ends of the PCR products must not be complementary to each other or to themselves.
  • the oligonucleotides used for the PCR must be phosphorylated at their 5 'ends.
  • a sequence should be sought starting from the specified insertion point, which will generate the desired properties both in the Vector as well as allowed at the ends of the oligonucleotides to be inserted.
  • the ends of the oligonucleotides for PCR or insertion are lengthened or shortened accordingly. It is also possible to introduce the bases necessary for the cloning via the oligonucleotide.
  • the length of the oligonucleotides to be inserted is arbitrary and is only limited by the given possibilities of oligonucleotide synthesis.
  • the stepped ends of the double-stranded oligonucleotides to be inserted during the dimerization must be complementary to the vector ends. On the other hand, they must not be complementary to themselves.
  • Figure 1 shows an example of the implementation of the mutagenesis method according to the invention.
  • Figure 1A shows the mutagenesis to be carried out (replacement of G / C with A / T, combined with an amino acid exchange Asp according to Asn).
  • Figure 1 B shows the schematic implementation of the process.
  • the starting construct to be mutagenized is amplified, for example by PCR.
  • the 5 'ends of the oligonucleotides used as primers contain the mutated sequence.
  • a T 4 DNA polymerase trim reaction produces staged complementary ends that can be ligated together.
  • the positive clones can be identified by suitable measures, such as PCR and / or sequencing.
  • Figure 2 shows the cloning of oligonucleotides according to variant 1 of the cloning method according to the invention.
  • the circular vector is for this purpose with 2 restriction enzymes, e.g. Nhel and BamHI, which do not result in complementary stepped ends, are cut.
  • the stepped ends are partially filled by treatment with Klenow enzymes.
  • the sequence of the oligonucleotides or amplification products to be cloned into the vector is defined such that they have 5 'overhangs which are complementary to the vector as a double-stranded fragment and can be ligated with the vector.
  • the conditions for the PCR were chosen according to the table below. Since the amplification of an entire plasmid leads to long PCR products, the reaction batches were supplemented with 5% by volume glycerol and 2-5% by volume DMSO. In addition, both the amount of template DNA ( ⁇ 10 ng) and the number of PCR cycles ( ⁇ 25) were kept as small as possible.
  • the cloning vectors were opened at the appropriate sites with the aid of restriction enzymes. Since not all enzymes cut in the same buffer and some enzymes work very poorly near the DNA ends, the following conditions were met : Conditions for restriction digestion after the choice of the enzymes. The conditions for cutting with Hin ⁇ ⁇ and Bam ⁇ are given below. First about 7 ⁇ g of the vector were digested for one hour with 10 U Hin ⁇ ⁇ in 30 ⁇ l 1 x buffer A (Röche) in an incubator at 37 ° C. After adding another 5 U Hin ⁇ ⁇ another hour was cut.
  • the buffer was changed either by adding the appropriate buffer and salt solutions or, as in this case, by
  • Buffer for the second enzyme In the example described here, the Vector digested in 1 x buffer B (Röche) and 10 U Bam ⁇ ⁇ in 30 ⁇ l final volume for one hour and after renewed enzyme addition (5 U) overnight. The next morning 5 U Bam ⁇ were added and incubated again for one hour. The restriction enzymes were then denatured at 65 ° C. for 10 min.
  • the DNA was then run through Centrifugation for 1 5 min at 1 3,000 rpm and 4 ° C, washed with 70% ethanol and dried at 37 ° C.
  • the prepared vector was resuspended in 30 ⁇ l H 2 O and the concentration was estimated by agarose gel electrophoresis.
  • the PCR approach below was pipetted and the PCR was carried out according to the program indicated. Since the amplification of almost the entire plasmid leads to long PCR products, the reaction batches were supplemented with 5% by volume glycerol and 2-5% by volume DMSO. In addition, both the amount of template DNA ( ⁇ 10 ng) and the number of PCR cycles ( ⁇ 25) were kept as small as possible.
  • the Qiagen PCR Purification Kit was used to purify the PCR products.
  • the PCR products were mixed with 5 times the volume of buffer PB and bound to a mini column by centrifugation. After washing with PE buffer, the DNA was eluted with 40 ⁇ l H 2 O.
  • the samples were denatured for 15 minutes at 75 ° C. and, as described for the vector preparation, purified and analyzed.
  • oligonucleotides For the dimerization of the oligonucleotides, 10 ⁇ g of primer in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) were mixed with 1.75 mM MgCl 2 in a final volume of 100 ⁇ l and in a PCR device at 95 ° C. denatured. The hybridization was carried out by slowly cooling the heating block to room temperature.
  • restriction enzymes the interface of which is not in the recognition sequence
  • the most serious advantage is the possibility of directed cloning with only one restriction enzyme. Since the efficiency of a restriction is much higher than that of a double digest, the cloning rate increases enormously. In addition, no linker fragment falls out of the vector, which therefore no longer has to be separated.
  • the recognition sequence for Xcm ⁇ used here nine Bases at the interface can be chosen freely. However, one could also use any other restriction enzyme which, in addition to a specific recognition sequence, allows the free choice of bases. Examples are Xmn ⁇ , Van91 ⁇ , Sfi ⁇ , Mwo ⁇ or others. This enables the user to insert bases which allow the use of oligonucleotides already present in the laboratory. The high efficiency achieved with this cloning technique makes it suitable for automated cloning of DNA.
  • the Xc l interface was inserted into the vector pDLO 1 2 via a Di- / TriSec mutagenesis with the oligonucleotides pDLO 1 x-5'-Xc / 77l (5'-Phos-TTATCGATGGATCCAGACATGATAAGATACATTGA-3 ') and pDLO 1 - 3'- ca7? L (5'-Phos-ATAAGGTGGCAGGTCGGATCGGTCC-3 ').
  • the vector pDLO1 2 was amplified with the aid of these oligonucleotides. After the T 4 DNA polymerase reaction with dCTP and dGTP, the ligation and subsequent transformation in £. coli, the positive clones could be identified by Xc / 77l digestion. The insertion of the interface was also checked by sequencing.
  • the bases marked with N are freely selectable, they do not contribute to the interface recognition. This enables the introduction of a sequence which is required for a Di / TriSec cloning via a certain often used cloning scheme. This has the advantage that only one Primer pair must be bought, which then allows cloning into different vectors.
  • the Xcl interface has the following sequence: Xcm ⁇
  • the trimming reaction (3'-5'-exonuclease activity) with the T4-DNA polymerase then takes place using dCTP as a stop nucleotide:
  • PCR fragments can then be cloned into the purified vectors, which have the sequence "TTC” at the 5 'end and "GAC” at the 3' end (in the example: G3BP cloning with the oligonucleotides 5'-G3BP-DLO ( 5'-TTC ATG GTG ATG GAG AAG CCT AGT-3 ') and 3'-G3BP (5'-GAC TTA CTG CCG TGG CGC AAG CCC CCT-3').
  • the PCR product has the following ends:
  • the vector and insert can be ligated.
  • the ligated DNA is transformed into E. coli.
  • the positive clones can be identified and checked using colony PCR and sequencing.
  • the DNA was then transformed into E. coli.
  • the positive clones could be identified by colony PCR and restriction digestion and verified by sequencing.
  • Example 4 Di / TriSec cloning of DNA oligonucleotides into a vector for in vivo expression of siRIMA
  • the developed Di / TriSec cloning is to be examined for its suitability for cloning DNA oligonucleotides in vectors which are suitable for the production of double-stranded RNA in transfected cells.
  • an inhibitor for the Lamin A / C gene should be generated.
  • oligonucleotides were mixed in different concentrations in a magnesium-containing buffer (see section 2.3.1) and heated to 95 ° C in a PCR machine.
  • the oligonucleotides were hybridized by slowly cooling from 95 ° C. over 3 hours to room temperature. The lid of the reaction vessel remained heated to 95 ° C.
  • the oligonucleotides can be dimerized in concentrations of 0.25-40 ⁇ M without this having a decisive influence on the ligation rate.
  • the pSUPER vector (Brummelkamp et al., 2002) was cut with the restriction endonucleases BglW and Hind ⁇ according to the manufacturer's instructions and filled in with dATP and dGTP using the method described above (see Section 2.1 .1).
  • the ligation was carried out as previously described (see section 2.3.2). The ratios of the free vector ends to the free insert ends of 1: 100 and 1: 500 were tested.
  • the ligation batches were transformed into E. coli using standard methods, and recombinant plasmids were propagated and purified.
  • the overall efficiency of the cloning of the double-stranded hLamin 1 IVE oligonucleotides was 84%, the vector to insert ratio having only a minor influence (1: 500, 80%, 1: 100, 86%).
  • the example shown here underlines the high efficiency of the cloning method according to the invention.
  • the minor influence of the Concentration of the oligonucleotides during the dimerization and the ratio of vector insert to the ligation rate demonstrate the robustness of the method in relation to the reaction conditions.
  • siRNA cloning technique shown here could represent an important step in creating a permanent "knockdown" cell clone library. All steps, starting with the dissolution of the oligonucleotides through the dimerization, the ligation, the transformation up to the PCR screen for positive clones and the isolation of plasmid DNA can be automated. As a result, silencer constructs for almost all human genes can be generated in a short time.
  • the advantage of the method described here over conventional methods is the high efficiency and robustness of the cloning.
  • Conventional strategies are based on the cloning of double-stranded oligonucleotides via palindromic restriction sites.
  • the oligonucleotides to be cloned preferably form concatamers. The result is a significantly reduced cloning efficiency.
  • the method described here excludes concatamer formation of the oligonucleotides and thereby increases the efficiency of the cloning.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Reagenzienkits zur DNA-Manipulation, insbesondere zur ortsspezifischen Mutagenese oder zur Klonierung.

Description

Methoden zur DNA-Manipulation
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Reagenzienkits zur DNA- Manipulation, insbesondere zur ortsspezifischen Mutagenese oder zur Klonierung.
Trotz der erheblichen Fortschritte, die in den letzten Jahren bei der Manipulation von Nukleinsäuren, beispielsweise bei der Mutagenisierung oder Klonierung von DNA-Fragmenten, gemacht wurden, besteht immer noch ein erhebliches Bedürfnis, derartige Verfahren zu verbessern. Probleme bei bekannten Mutagenisierungs- und Kionierungsverfahren bestehen oftmals hinsichtlich deren Effizienz. Durch die vorliegende Anmeldung werden neue Mutagenisierungs- und Kionierungsverfahren bereitgestellt, mit denen diese Probleme zumindest teilweise ausgeräumt werden können.
Für die Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen, wie z.B. der Kinasefunktion in Abhängigkeit bestimmter Aminosäuren oder der Promoterfunktion von DNA-Abschnitten in Abhängigkeit ihrer Sequenz, ist es häufig notwendig, eine gezielte Mutagenese von Nukleinsäuren durchzuführen.
Hutchison et al. (Hutchison et al. , 1 978) beschreiben eine Site-directed- Mutagenese, bei der einzelsträngige DNA mit einem Oligonukleotid hybridisiert wird, das bis auf die zu mutagenisierende Base komplementär zur Matrizen-DNA ist. Nach der Verlängerung des Oligonukleotids, also der Erzeugung eines Doppelstranges mit einer DNA-Polymerase, dem Schließen des synthetisierten Stranges mit einer Ligase und der Transformation in E. coli, sollten eigentlich 50 % der Klone mutierte DNA enthalten. In der Praxis ist diese Rate aber jedoch deutlich geringer (Kramer et al. , 1 984).
Deshal b verwenden d ie derzeit kommerziell erh ältlichen Mutagenesesysteme Selektionsmarker für die mutierte DNA. Einige davon sollen hier vorgestellt werden. Das pALTER" System von Promega verwendet einen Vektor der in seinem Ausgangszustand ein inaktives
Ampicillin- und ein aktives Tetracyclinresistenzgen enthält. Die Mutagenese erfolgt ähnlich der oben beschriebenen Methode, mit dem Unterschied, dass zusammen mit dem Mutagenese-OIigonukleotid noch zwei weitere
Primer hybridisiert werden, die das AmpR-Gen aktivieren und das TetR-Gen inaktivieren (Kleina et al. , 1990; Normanly et al. , 1 990). Nach der
Transformation in E. coli werden die Klone mit der mutierten DNA mit
Ampicillin selektioniert. Nachteile dieser Methode sind zum einen, dass die zu mutierende DNA in ein spezielles Plasmid kloniert werden muss und zum anderen, dass DNA-Reparatur-defiziente E. co// Stämme verwendet werden müssen.
Das Transformer™ Site-Directed Mutagenesis Kit von Clontech verwendet zur Selektion ein zweites zu hybridisierendes Oligonukleotid, mit dem eine im Ausgangskonstrukt einmalige Restriktionsschnittstelle zerstört wird (Deng and Nickoloff, 1 992; Zhü, 1 996). Nach Hybridisierung und Oligonukleotidverlängerung werden durch Verdau mit diesem Restriktionsenzym nur die nichtmutierten Plasmide geschnitten, die somit nicht mehr transformierbar sind. Auch diese Methode greift auf reparaturdefiziente Stämme zurück. Außerdem sind zwei nacheinander folgende Transformationen notwendig, was die Dauer der Mutagenese wesentlich verlängert.
Bei der Mutagenese mit dem Quickchange™ Site-Directed Mutagenesis Kit von Stratagene werden zwei komplementäre Mutagenese-Oligonukleotide an beide Stränge hybridisiert und die mutierte DNA mit Hilfe der Pfu-l xbo DNA-Polymerase in 1 2 bis 1 8 Temperaturzyklen amplifiziert. Nach dem Verdau der Matrizen-DNA mit Dpn\ wird die doppelsträngige DNA in E. coli transformiert. Diese schließen dann die noch vorhandenen Einzelstranglücken.
Bei einer weiteren Mutagenesemethode wird der zu mutierende DNA- Abschnitt in zwei getrennten PCRs so amplifiziert, dass die Produkte an der Mutationsstelle ca. 20 Basen überlappen und bereits die mutierte Sequenz enthalten (Lottspeich, F. and Zorbas, 1 998). Die beiden Produkte werden gemischt und in einer dritten PCR mit Oligonukleotiden, die das Klonieren in den gewünschten Vektor erlauben, wird die gesamte DNA amplifiziert. Der Nachteil dieser Methode ist, dass drei PCRs notwendig sind.
Mit ebenfalls zwei PCRs startet eine weitere Mutagenesemethode (Cooney, 1 998). Auch bei ihr überlappen die beiden Produkte an der Mutationsstelle, allerdings nicht 20 Basen, sondern nur so viele, dass durch eine T4-DNA- Polymerase-Trimmreaktion komplementäre δ'-Überhänge entstehen. Die äußeren Enden der PCR-Produkte werden mit Restriktionsenzymen behandelt. Zur Ligation werden beide Produkte und der Vektor gemischt. Sowohl die Notwendigkeit, auf Restriktionsschnittstellen innerhalb der Fragmente Rücksicht zu nehmen, als auch die Ligation von drei DNA- Fragmenten, sind Nachteile dieser Methode.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Anmeldung ist Gegenstand des Anspruchs 1 und betrifft ein Verfahren zur Mutagenisierung von
Nukleinsäuren, insbesondere von doppelsträngigen DNA-Fragmenten, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer zu mutagenisierenden zirkulären doppelsträngigen Nukleinsäure-Matrize, z.B. eines Plasmidvektors, (b) Bereitstellen von zwei Oligonukleotiden, die (i) jeweils mit einem Strang der Nukleinsäure-Matrize hybridisieren und (ii) im Bereich ihrer 5'-Enden einen kurzen, vorzugsweise 2-4
Basenpaare langen, zueinander komplementären Abschnitt aufweisen,
(iii) wobei zumindest eines der Oligonukleotide die mutierte
Zielsequenz enthält, die vorzugsweise im Bereich des 5'-
Endes des Oligonukleotids liegt,
(c) Amplifizieren der zu mutagenisierenden Nukleinsäure-Matrize aus (a) unter Verwendung der Oligonukleotide mit der mutierten Zielsequenz aus (b) als Primer, wobei ein mutiertes doppelsträngiges Amplifikationsprodukt erhalten wird,
(d) Trimmen der Enden des Amplifikationsprodukts, wobei ein getrimmtes Amplifikationsprodukt mit zueinander komplementären 5'-Überhängen erzeugt wird, und
(e) Ligieren des getrimmten Amplifikationsprodukts, wobei ein mutiertes zirkuläres Nukleinsäure-Konstrukt erhalten wird.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 6.
Mit Hilfe des Verfahrens wird eine neue, sehr einfache, günstige und effiziente Mutagenesemethode bereitgestellt (Abbildung 1 ). Hierzu werden Oligonukleotide hergestellt, die z.B. an den δ'-Enden die mutierten DNA- Sequenzen enthalten und die vorzugsweise eine 2-3 Basenpaare lange Überlappung (hier AA bzw. TT) aufweisen. Die Länge der Oligonukleotide wird so gewählt, dass sie unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit ausreichender Effizienz an die Matrize binden können. Üblicherweise beträgt die Länge der Oligonukleotide z.B. 1 5-50 Basen. Durch PCR- Amplifikation des gesamten Konstrukts mit den Mutagenese- Oligonukleotiden und einem anschließenden Trimmen der Enden, z.B. durch die T4-DNA-Polymerase mit entsprechendem Stopp-Nukleotid (im Beispiel dGTP), entsteht ein Produkt mit zueinander komplementären 5'- Überhängen. Diese können sehr effizient ligiert werden.
Durch die Entfernung der Matrizen-DNA, z.B. mittels p ?l-Verdau, wobei nur methylierte DNA geschnitten wird, kann die Mutageneserate zusätzlich gesteigert werden. Als Negativkontrolle kann ein Ligationsansatz ohne
Ligase dienen. Nach der Transformation in E. coli lässt sich aus dem
Verhältnis der Anzahl der Klone die Mutageneseeffizienz abschätzen. Im
Idealfall kann der Ansatz ohne Ligase keinen Transformanten liefern. Die Überprüfung der Mutation kann nach Transformation des mutagenisierten
Konstrukts in eine geeignete Wirtzelle, z.B. durch Sequenzierung, oder/und
PCR Kontrolle erfolgen, bei der ein Oligonukleotid verwendet wird, das nur mit mutierter DNA zu einem Produkt führt. Bei den ersten zehn mit dieser
Methode durchgeführten Mutagenesen und je zwei überprüften Klonen lag die Mutationsrate bei 95 %.
Durch das erfindungsgemäße Mutagenese-Verfahren werden insbesondere DNA-Manipulationen durchgeführt, ausgewählt aus der Gruppe: Punktmutationen, wobei ein Austausch bzw. eine Substitution von einem oder mehreren einzelnen Nukleotiden erfolgt; Insertionen, wobei ein oder mehrere einzelne Nukleotide in die Sequenz zusätzlich eingefügt werden; Inversionen, wobei eine oder mehrere Sequenzen von mindestens zwei Basen, z.B. zwei, drei oder vier Basen, umgedreht werden; Deletionen, wobei eine oder mehrere einzelne Basen entfernt werden; und beliebige Kombinationen der genannten Mutagenesemöglichkeiten, z.B. zwei- oder mehrfache Kombinationen von Punktmutation, Insertion, Inversion oder/und Deletion in einem einzigen Schritt oder Einfügen mehrerer Punktmutationen mit einem maximalen Abstand, entsprechend der Länge der verwendeten Oligonukleotide, von z.B. 50 Basen in einem einzigen Schritt.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber anderen Mutagenesemethoden ist die extrem hohe Mutageneserate von 95 %. Die Erzeugung von gestuften Enden durch das Trimmen, z.B. mittels einer T4- DNA-Polymerasereaktion, bewirkt, dass nur akkurat getrimmte Produkte religieren können. Im Gegensatz dazu können bei der Religation von ungetrimmten Amplifikationsprodukten eher Leserahmenverschiebungen durch eine zusätzliche Base, z.B. ein Adenin, auftreten. Im Gegensatz zu vielen kommerziell erhältlichen Systemen ist man nicht auf das Vorhandensein von singulären Restriktionsschnittstellen sowie bestimmten Antibiotikaresistenzen angewiesen. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens liegt in der Geschwindigkeit. Am ersten Tag können PCR, T4-DNA- Polymerasereaktion, Ligation, Dpnl-Verdau und Transformation durchgeführt werden. Am zweiten Tag erfolgt- die Analyse der Kolonien durch PCR und Kulturen zur Plasmidpräparation werden angesetzt. Bereits am dritten Tag kann die mutierte DNA isoliert und in Versuchen verwendet werden.
Weiterhin betrifft dieser erste Aspekt der Erfindung gemäß Anspruch 7 auch einen Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des zuvor beschriebenen Mutagenese-Verfahrens, umfassend: (a) Mittel zur Nukleinsäure-Amplifizierung, (b) Mittel zum Trimmen von doppelsträngigen Nukleinsäuren zur Erzeugung von gestuften Enden, die komplementär zueinander sind,
(c) Mittel zum Ligieren von Nukleinsäuren und
(d) gegebenenfalls Mittel zum selektiven Entfernen von methylierter DNA. Die Komponenten des Reagenzienkits können gemeinsam bezogen oder aus verschiedenen Quellen zusammengestellt werden. Weiterhin kann der Kit übliche Puffer- und Hilfsreagenzien zur Durchführung der Reaktionen sowie eine schriftliche Verfahrensbeschreibung enthalten.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft ein neues Kionierungsverfahren, mit dem insbesondere die mit der Ausbildung von Multimeren verbundenen S c h w i e r i g k e i te n b e i d e r K l o n i e r u n g d o p p e l st r ä n g i g e r Nukleinsäurefragmente, z.B. Oligonukleotide mit einer Länge von vorzugweise bis zu 200 bp, besonders bevorzugt von 1 5-100 bp, oder auch längerer PCR-Fragmente, ausgeräumt werden können.
Für die Klonierung kürzerer DNA-Fragmente werden üblicherweise zwei komplementäre Oligonukleotide verwendet, die nach Hybridisierung komplementäre Ü berhänge zu einem mit entsprechenden Restriktionsenzymen geöffneten Vektor aufweisen und in diesen ligiert werden können. Dabei tritt jedoch häufig das Problem auf, dass die doppelsträngigen Oligonukleotide Multimere bilden und dadurch entweder gar nicht kloniert werden können- oder als Multimere in den Vektor integrieren. Dieses Problem kann durch das erfindungsgemäße Verfahren umgangen werden.
Für die Generierung eines geöffneten Vektors zum Einfügen eines doppelsträngigen Oligonukleotids oder eines längeren DNA-Fragments stehen zwei Ausführungsformen zur Verfügung:
Bei der Variante 1 wird der Vektor mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen geöffnet und mit Hilfe der Klenow-Polymerase werden ein oder zwei Nukleotide an den DNA-Enden aufgefüllt. Dadurch entstehen unterschiedliche gestufte Enden, die nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind (Abbildung 2) . Die Enden der Oligonukleotide werden so ausgewählt, dass sie komplementär zu den aufgefüllten Vektorenden sind.
Zur Generierung des Vektors nach der Variante 2 wird der Teil, in den das zu klonierende Fragment inseriert werden soll, z.B. mittels PCR, amplifiziert. Dann werden durch Trimmen, z.B. mit T4-DNA-Polymerase, unter Verwendung von bestimmten Stopp-Nukleotiden gestufte Enden erzeugt, die nicht komplementär zu sich selbst und nicht komplementär zueinander sind. Um dies zu erreichen, müssen beim Design der Oligonukleotide geeignete Basen an den 5'-Enden vorgesehen werden. Die Variante 2 erlaubt das Einfügen von doppelsträngigen Oligonukleotiden an jede beliebige Stelle in einem Vektor, z.B. einem Plasmid.
Zum Erzeugen doppelsträngiger Oligonukleotide werden jeweils äquivalente Mengen der einzelsträngigen Oligonukleotide unter geeigneten Bedingungen miteinander hybridisiert, z.B. durch Vermischen in Anwesenheit von MgCI2, Erhitzen und langsames Abkühlen von 95 °C auf Raumtemperatur. Die Enden der hybridisierten Oligonukleotide weisen vorzugsweise 5'- Überhänge auf, die komplementär zu den 5'-Überhängen der präparierten Vektoren sind. Da die 5'-Überhänge der so entstandenen doppelsträngigen DNA nicht komplementär zueinander und zu sich selbst sind, können keine Multimere gebildet werden. Dies führt zu einer enormen Effizienzsteigerung der Klonierung von Oligonukleotiden. Der Einbau der Oligonukleotide kann durch PCR oder/und Restriktionsverdau sowie Sequenzierung überprüft werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist Gegenstand des Anspruchs 8 und betrifft ein Verfahren zur Klonierung von Nukleinsäurefragmenten in einen Vektor gemäß Variante 1 umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines zirkulären doppelsträngigen Nukleinsäure-Vektors,
(b) Spalten des Vektors aus (a) mir zwei unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen, wobei ein linearer Vektor mit zwei unterschiedlichen gestuften Enden erhalten wird, (c) teilweises Auffüllen der Enden des geschnittenen Vektors, wobei ein aufgefüllter linearer Vektor mit unterschiedlichen gestuften Enden erzeugt wird, die nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind,
(d) Bereitstellen eines in den Vektor aus (c) zu klonierenden Nukleinsäurefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften Enden, die zu den Enden des aufgefüllten Vektors komplementär sind, die aber nicht komplementär zueinander und nicht zu sich selbst sind, und (e) Ligieren des Nukleinsäurefragments in den aufgefüllten Vektor.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 9 bis 1 1 .
Weiterhin betrifft diese Ausführungsform gemäß Anspruch 1 2 ein Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des Klonierungsverfahrens, umfassend:
(a) Mittel zur Spaltung einer Nukleinsäure durch zwei unterschiedliche Restriktionsendonukleasen, die jeweils unterschiedliche gestufte Enden erzeugen,
(b) Mittel zum teilweisen Auffüllen von gestuften Enden bei doppelsträngigen Nukleinsäuren, z.B. ein geeignetes Enzym und 2
Nukleosidtriphosphate, wobei die Enden nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind, und
(c) Mittel zum Ligieren von Nukleinsäuren.
Weiterhin kann der Reagenzienkit übliche Puffer- und Hilfsreagenzien sowie eine schriftliche Verfahrensbeschreibung enthalten.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist Gegenstand des Anspruchs 1 3 und betrifft ein Verfahren zur Klonierung von Nukleinsäure-Fragmenten in einen Vektor gemäß Variante 2, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines zirkulären doppelsträngigen Nukleinsäure-Vektors,
(b) Bereitstellen von zwei Oligonukleotiden, die
(i) jeweils mit einem Stang des Nukleinsäurevektors hybridisieren und (ii) im Bereich ihrer 5'-Enden einen vorzugsweise kurzen, z.B. 2-4 Basenpaare langen, zu den Enden der einzufügenden DNA homologen Abschnitt aufweisen,
(c) Amplifizieren des Nukleinsäure-Vektors aus (a) unter Verwendung der Oligonukleotide aus (b) als Primer, wobei ein doppelsträngiges
Amplifikationsprodukt erhalten wird,
(d) Trimmen der Enden des Amplifikationsprodukts, wobei ein getrimmter linearer Vektor mit unterschiedlichen gestuften Enden erzeugt wird, die nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind,
(e) Bereitstellen eines in den Vektor zu klonierenden Nukleinsäurefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften Enden, die zu den Enden des getrimmten Vektors komplementär sind, die aber nicht komplementär zueinander und nicht zu sich selbst sind, und
(f) Ligieren des Nukleinsäurefragments in den getrimmten Vektor.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 1 4 bis 1 5.
Weiterhin betrifft diese Ausführungsform gemäß Anspruch 1 6 einen
Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des zuvor genannten
Klonierungsverfahrens, umfassend
(a) Mittel zur Nukleinsäure-Amplifizierung, (b) Mittel zum Trimmen von doppelsträngigen Nukleinsäuren zur Erzeugung von gestuften Enden, die nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind, und
(c) Mittel zum Ligieren von Nukleinsäuren.
Der Reagenzienkit kann weiterhin übliche Puffer- und Hilfsreagenzien sowie eine Verfahrensbeschreibung enthalten. Eine weitere neue Möglichkeit im Zusammenhang mit nach Variante 2 erzeugten offenen Vektoren oder Plasmidteilen besteht darin, mit T4-DNA- Polymerase getrimmte Amplifikationsprodukte, z.B. PCR-Produkte, einzufügen. Außerdem ist das Klonieren mit dieser Methode unabhängig von Restriktionsschnittstellen. Die gestuften Enden der einzufügenden PCR- Produkte müssen komplementär zu den Vektorenden sein. Dadurch wird es möglich, sehr einfach bestimmte DNA-Abschnitte punktgenau und ohne zusätzliche, mitunter störende Basen einzufügen. Dieses ist besonders hilfreich, wenn die Fusionsproteine sich z.B. aus einem Signalpeptid und dem zu untersuchenden Protein zusammensetzen. Ferner können so funktioneile Domänen zwischen verschiedenen Proteinen nach Belieben ausgetauscht werden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist Gegenstand des Anspruchs 1 7 und betrifft ein Verfahren zur Klonierung von Nukleinsäurefragmenten in einen Vektor, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines zirkulären doppelsträngigen Nukleinsäurevektors mit einer Restriktionsschnittstelle für ein Restriktionsenzym, bei der die Erkennungssequenz neben der eigentlichen Schnittstelle liegt, (b) Spalten des Vektors mit dem Restriktionsenzym,
(c) teilweises Auffüllen oder Trimmen der Enden des geschnittenen Vektors, wobei ein linearer- Vektor mir unterschiedlich gestuften Enden erzeugt wird, die nicht komplementär zueinander und zu sich selbst sind, (d) Bereitstellen eines in den Vektor aus (c) zu klonierenden Nukleinsäurefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften Enden, die zu den Enden des aufgefüllten Vektors komplementär sind, die aber nicht komplementär zueinander und nicht zu sich selbst sind, und (e) Ligieren des Nukleinsäurefragments in den aufgefüllten Vektor. Weiterhin betrifft diese Ausführungsform gemäß Anspruch 1 8 einen Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des zuvor genannten Klonierungsverfahrens, umfassend:
(a) Mittel zur Spaltung einer Nukleinsäure durch eine Restriktionsendonuklease mit einer Restriktionsschnittstelle, bei der die Erkennungssequenz neben der eigentlichen Schnittstelle liegt,
(b) Mittel zum teilweisen Auffüllen von gestuften Enden bei doppelsträngigen Nukleinsäuren zur Erzeugung gestufter Enden, die nicht komplementär zueineinander und nicht komplementär zu sich selbst sind,
(c) Mittel zum Trimmen von doppelsträngigen Nukleinsäuren zur Erzeugung von gestuften Enden, die nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind, und
(d) Mittel zum Ligieren von Nukleinsäuren.
Der Reagenzienkit kann weiterhin übliche Puffer- und Hilfsreagenzien sowie eine Verfahrensbeschreibung enthalten.
Für die Definition der für die Mutagenisierung bzw. Klonierung zu verwendenden Oligonukleotide gelten vorzugsweise folgende Regeln bzw. Algorithmen:
Über die Wahl geeigneter Sequenzen arrTgestuften Ende können die Eigenschaften "nicht komplementär zu sich selbst" und "nicht komplementär zueinander" erzeugt werden. . "Nicht komplementär" zueinander bedeutet, dass zwei gestufte
Enden nicht miteinander ligiert werden können. "Nicht komplementär zu sich selbst" bedeutet, dass die Sequenz innerhalb eines Überhangs in deren gestuftes Ende nicht komplementär ist. Beim Trimmen durch ein Enzym mit Exonuklease/Polymerase- Aktivität in Gegenwart von Stopp-Nukleotiden, z.B. T4-DNA-
Polymerase, dürfen nicht alle 4 Basen in den überlappenden Enden enthalten sein, da sonst ein Stoppen der Reaktion durch Zugabe eines Stopp-Nukleotids nicht mehr möglich ist. Die bevorzugte Annealing-Temperatur der Oligonukleotide wird vorgegeben und nach der 4 + 2-Regel (2 °C für jedes Adenin- und Thyminnukleotid; 4 °C für jedes Guanin- und Cytosinnukleotid) anhand der Basensequenz des Oligonukleotids ermittelt. Dabei soll der Unterschied der Annealing-Temperatur der beiden Oligonukleotide vorzugsweise maximal 2 °C betragen. Am 3'-Ende der Oligonukleotide soll vorzugsweise die Base Thymidin vermieden werden.
Für die Definition von Oligonukleotiden zur Mutagenese werden folgende Regeln bzw. Algorithmen festgelegt:
Am 5'-Ende der Oligonukleotide sollen nach dem Trimmen, z.B. durch T4-DNA-Polymerasereaktion, Überhänge entstehen, die komplementär zueinander, aber nicht zu sich selbst sind. Die 5'-
Enden der Amplifikationsprodukte sollen phosphoryliert sein.
Vorgegeben wird entweder die gewünschte Mutation, z.B. ein
Aminosäureaustausch, und die dabei zu verändernden Basen werden durch den Algorithmus ermittelt, oder nur die gewünschte Mutation, z.B. ein Basenaustausch, wird vorgegeben. In beiden Fällen können zusätzliche stille Mutationen eingefügt werden.
Für das Einfügen von Oligonukleotiden an bestimmte Stellen in einem Vektor, z.B. einem Plasmid, wird zwischen den beiden Möglichkeiten der Vektorvorbereitung unterschieden. Für die Variante 1 , das Vorbereiten des Vektors durch Restriktionsverdau und anschließende Auffüllreaktion, z.B. durch das Klenow-Enzym, gilt folgender Algorithmus:
Vorgegeben werden mögliche Restriktionsschnittstellen. Das Programm soll eine Schnittstellenkombination mit Nukleotidvorgabe für die Klenow-Reaktion ermitteln. Ferner sollen die 5 '-Überhänge der einzufügenden doppelsträngigen Oligonukleotide, die komplementär zu den Vektorenden sein müssen, aber nicht komplementär zu sich selbst sein dürfen, ermittelt werden.
Wird der Vektor nach Variante 2 durch PCR amplifiziert, gelten folgende Regeln:
Vorgegeben wird die genaue Insertionsstelle. Diese kann auch eine Deletion umfassen. Die Enden der PCR-Produkte dürfen nach T4- DNA-Polymerasereaktion weder zueinander noch zu sich selbst komplementär sein. Die für die PCR verwendeten Oligonukleotide müssen an ihren 5'-Enden phosphoryliert sein.
Falls an der vorgegebenen Insertionsstelle die Generierung von gestuften Enden mit den Eigenschaften "nicht komplementär zu sich selbst" und "nicht komplementär zueinander" nicht möglich ist, so soll von der vorgegebenen Insertionsstelle ausgehend eine Sequenz gesucht werden, die die Erzeugung der gewünschten Eigenschaften sowohl im Vektor als auch an den Enden der einzufügenden Oligonukleotide erlaubt. Die Enden der Oligonukleotide für die PCR oder das Einfügen werden entsprechend verlängert oder verkürzt. Ferner ist es möglich, die für die Klonierung notwendigen Basen über das Oligonukleotid einzuführen.
Die Länge der einzufügenden Oligonukleotide ist beliebig und einzig durch die gegebenen Möglichkeiten der Oligonukleotidsynthese beschränkt.
Die bei der Dimerisierung entstehenden gestuften Enden der - einzufügenden doppelsträngigen Oligonukleotide müssen komplementär zu den Vektorenden sein. Dahingegen dürfen sie nicht komplementär zu sich selbst sein.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch nachfolgende Abbildungen und Beispiele erläutert werden. Es zeigen: Abbildung 1 ein Beispiel für die Durchführung des erfindungsgemäßen Mutageneseverfahrens. Abbildung 1A zeigt die durchzuführende Mutagenese (Ersetzen von G/C durch A/T, verbunden mit einem Aminosäureaustausch Asp nach Asn) . In Abbildung 1 B ist die schematische Durchführung des Verfahrens gezeigt. Das zu mutagenisierende Ausgangskonstrukt wird, z.B. durch PCR, amplifiziert. Die 5'-Enden der dafür als Primer verwendeten Oligonukleotide enthalten die mutierte Sequenz. Durch eine T4-DNA-Polymerase-Trimmreaktion werden gestufte komplementäre Enden erzeugt, die miteinander ligiert werden können. Nach Transformation in einen geeigneten Wirtsorganismus, z.B. E.coli, können die positiven Klone durch geeignete Maßnahmen, wie PCR oder/und Sequenzierung, identifiziert werden.
Abbildung 2 zeigt die Klonierung von Oligonukleotiden nach Variante 1 des erfindungsgemäßen Klonierungsverfahrens. Der zirkuläre Vektor wird hierzu mit 2 Restriktionsenzymen, z.B. Nhel und BamHI, die nicht miteinander komplementäre gestufte Enden ergeben, geschnitten. Durch Behandlung mit Klenow-Enzymen werden die gestuften Enden teilweise aufgefüllt. Die Sequenz der in den Vektor zu klonierenden Oligonukleotide bzw. Amplifikationsprodukte ist so definiert, dass sie als doppelsträngiges Fragment zum Vektor komplementäre 5'-Überhänge besitzen und mit dem Vektor ligiert werden können.
Beispiel 1 : Mutagenese
1.1 Mutagenese-PCR
Die Bedingungen für die PCR wurden gemäß nachfolgender Tabelle gewählt. Da die Amplifikation eines gesamten Plasmids zu langen PCR- Produkten führt, wurden die Reaktionsansätze durch 5 Vol.-% Glycerol und 2-5 Vol.-% DMSO ergänzt. Außerdem wurde sowohl die Matrizen-DNA- Menge ( < 1 0 ng) als auch die PCR-Zyklenzahl ( < 25) möglichst klein gehalten.
Figure imgf000017_0001
Zyklische Amplifikation:
Temperatur Dauer Zyklenzahl
94 °C 2 min 1
94 °C 30 sec
50-68 °C 1 min - < 25
68 °C 1 min/kb 1
68 °C 10 min
Variationen der MgCI2-Konzentration oder/und die Verwendung von HotStart-Polymerasen sind weitere Alternativen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Erzeugung und Verwendung sehr reiner PCR-Produkte eine Voraussetzung für die erfolgreiche Mutagenese war. Die anschließende Aufreinigung und T4-Reaktion erfolgte nach Beispiel 2.2.2. 1 .2 Ligation und Dpn\ Verdau
Für die Ligation in einem Endvolumen von 10 μ\ wurden zwischen 100 und 200 ng DNA und 0,5 μl Ligase (Invitrogen) verwendet. Als Negativkontrolle diente ein Ligationsansatz ohne Ligase. Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C wurde der gesamte Ligationsansatz mit 2 μl Puffer A (Röche), 0,5 μl Dpn\ und 7,5 μl H2O versetzt und die Matrizen-DNA wurde für 30 min bei 37 °C verdaut. Die Transformation in E. coli erfolgte unter Standardbedingungen. Sofern die Anzahl der Transformanten des Ansatzes mit Ligase zu dem Ansatz ohne Ligase über 5: 1 lag, wurde von 2 Klonen DNA isoliert und die Mutagenese durch Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 2: Klonieren von Oligonukleotiden
2.1 Präparation des Vektors nach Variante 1 : Öffnen des Vektors durch Restriktionsverdau mit anschließender Klenow-Reaktion
2.1 .1 Restriktionsverdau
Mit Hilfe von Restriktionsenzymen wurden die Klonierungsvektoren an den entsprechenden Stellen geöffnet. Da nicht alle Enzyme im gleichen Puffer schneiden und einige Enzyme in der Nähe von DNA-Enden nur sehr schlecht arbeiten, richteten sich die : Bedingungen für den Restriktionsverdau nach der Wahl der Enzyme. Im Folgenden sind die Bedingungen für das Schneiden mit Hinύ\\\ und Bam \ angegeben. Zunächst wurden ca. 7 μg des Vektors für eine Stunde mit 10 U Hinύ\\\ in 30 μl 1 x Puffer A (Röche) im Inkubator bei 37 °C verdaut. Nach Zugabe weiterer 5 U Hinά\\\ wurde nochmals eine Stunde geschnitten.
Der Pufferwechsel erfolgte entweder durch Zugabe der entsprechenden Puffer- und Salzlösungen oder, wie in diesem Falle, durch
Ethanolpräzipitation (siehe 2.1 .3) und anschließendem Resuspendieren im
Puffer für das zweite Enzym. Im hier beschriebenen Beispiel wurde der Vektor in 1 x Puffer B (Röche) und 10 U Bam λ\ in 30 μl Endvolumen für eine Stunde und nach erneuter Enzymzugabe (5 U) über Nacht verdaut. Am nächsten Morgen wurden 5 U Bam \ zugegeben und nochmals für eine Stunde inkubiert. Danach wurden die Restriktionsenzyme 10 min bei 65 °C denaturiert.
2.1 .2 Klenow-Reaktion
Zum Restriktionsansatz wurden folgende Lösungen pipettiert:
Figure imgf000019_0001
Hierbei war zu beachten, dass das Gesamtenzymvolumen nicht 1 0 % der Lösungsmenge überschritt, weil der hohe Glycerolgehalt die Enzymaktivität hätte herabsetzen können. Der Ansatz wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und das Klenow-Enzym anschließend für 1 5 min bei 75 °C denaturiert. :
2.1.3 Aufreinigung
Um die Enzyme aus einem Reaktionsansatz zu entfernen wurden zwei Phenol/Chloroform-Extraktionen durchgeführt. Hierzu wurden der DNA- Lösung 1 0 μl 3 M Natriumacetat pH 5,2, 50 μl H2O und 100 μl Phenol/Chloroform zugegeben. Nach kräftigem Schütteln und dreiminütiger Zentrifugation bei 1 3.000 Upm in einer Tischzentrifuge wurde die obere, wässrige Phase abgenommen und erneut mit Phenol/Chloroform gereinigt. Zur Fällung der DNA wurden 250 μl Ethanol (p.A.) zugegeben und für 1 5 min bei -70 °C inkubiert. Anschließend wurde die DNA durch Zentrifugation für 1 5 min bei 1 3.000 Upm und 4 °C pelletiert, mit 70 % Ethanol gewaschen und bei 37 °C getrocknet. Der fertig präparierte Vektor wurde in 30 μl H2O resuspendiert und die Konzentration durch Agarose- Gelelektrophorese abgeschätzt.
2.2 Präparation des Vektors nach Variante 2: Generierung des geöffneten Vektors durch PCR mit anschließender T4-DNA- Polymerasereaktion unter Verwendung bestimmter Stopp-Nukleotide
2.2.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PGR)
Für die Amplifikation wurde untenstehender PCR-Ansatz pipettiertund nach dem angegebenen Programm die PCR durchgeführt. Da die Amplifikation des nahezu gesamten Plasmids zu langen PCR-Produkten führt, wurden die Reaktionsansätze durch 5 Vol.-% Glycerol und 2-5 Vol.-% DMSO ergänzt. Außerdem wurde sowohl die Matrizen-DNA-Menge ( < 1 0 ng) als auch die PCR-Zyklenzahl ( ≤ 25) möglichst klein gehalten.
Figure imgf000020_0001
Zyklische Amplifikation:
Temperatur Dauer Zyklenzahl
94 °C 2 min 1
94 °C 30 sec
50-68 °C 1 min < 25
68 °C 1 min/kb 1
68 °C 10 min
2.2.2 Aufreinigung
Zur Aufreinigung der PCR-Produkte wurde der Qiagen PCR-Purification Kit verwendet. Dazu wurden die PCR-Produkte mit 5 fachem Volumen Puffer PB vermischt und durch Zentrifugation an eine Minisäule gebunden. Nach Waschen mit PE-Puffer wurde die DNA mit 40 μl H2O eluiert.
2.2.3 Trimmen des PCR Produkts
Zum Erzeugen der zum präparierten Vektor komplementären 5'-Überhänge wurde folgender Mix auf Eis angesetzt:
Figure imgf000021_0001
Nach 30 minütiger Inkubation bei 1 2 °C wurden die Proben für 1 5 min bei 75 °C denaturiert und, wie bei der Vektorpräparation beschrieben, aufgereinigt und analysiert.
2.3 Einfügen der doppelsträngigen Oligonukleotide
2.3.1 Vorbereiten der doppelsträngigen Oligonukleotide
Für die Dimerisierung der Oligonukleotide wurden je 10 μg Primer in einem 50 mM Tris-HCI-Puffer (pH 7,5) mit 1 ,75 mM MgCI2 in einem Endvolumen von 1 00 μl gemischt und in einem PCR-Gerät bei 95 °C denaturiert. Die Hybridisierung erfolgte durch langsames Abkühlen des Heizblocks auf Raumtemperatur.
2.3.2 Ligation Präparierter Vektor und doppelsträngige Oligonukleotide wurden bei einem Endvolumen von 1 0-1 5 μl so gemischt, dass das Verhältnis der freien Enden 1 :500 betrug, wobei ca. 100 ng Vektor eingesetzt wurden. Nach Zugabe von 0,5 μl T4-DNA Ligase wurde der Ansatz über Nacht bei 4 °C inkubiert.
Beispiel 3: - c/wl-Klonierung
3.1 Einleitung
Die Verwendung von Restriktionsenzymen, deren Schnittstelle nicht in der Erkennungssequenz liegt, zum Öffnen des Klonierungsvektors bietet mehrere weitreichende Vorteile. Der gravierendste Vorteil ist die Möglichkeit gerichteten Klonierens mit nur einem Restriktionsenzym. Da die Effizienz einer Restriktion wesentlich höher ist als die eines Doppelverdaus, steigt die Klonierungsrate enorm. Zudem fällt aus dem Vektor kein Linkerfragment heraus, das somit nicht mehr abgetrennt werden muss. Im Falle der hier verwendeten Erkennungssequenz für Xcm\ können neun Basen an der Schnittstelle frei gewählt werden. Man könnte aber auch jedes andere Restriktionsenzym einsetzten, das neben einer spezifischen Erkennungssequenz die freie Wahl von Basen zulässt. Beispiele sind Xmn\, Van91\, Sfi\, Mwo\ oder andere. Das ermöglicht dem Anwender das Einfügen von Basen, welche die Nutzung bereits im Labor vorhandener Oligonukleotide erlauben. Durch die mit dieser Klonierungstechnik erzielte hohe Effizienz bietet sich diese für eine automatisierte Klonierung von DNA an.
3.2 Generierung von pDL012-Xc/77l
Das Einfügen der Xc l-Schnittstelle in den Vektor pDLO 1 2 erfolgte über eine Di-/TriSec-Mutagenese mit den Oligonukleotiden pDLO 1 x-5'-Xc/77l (5'-Phos-TTATCGATGGATCCAGACATGATAAGATACATTGA-3') und pDLO 1 -3'- cA7?l (5'-Phos-ATAAGGTGGCAGGTCGGATCGGTCC-3'). Mit Hilfe dieser Oligonukleotide wurde der Vektor pDLO1 2 amplifiziert. Nach der T4-DNA-Polymerasereaktion mit dCTP und dGTP, der Ligation und anschließender Transformation in £. coli, konnten die positiven Klone durch Xc/77l-Verdau identifiziert werden. Das Einfügen der Schnittstelle wurde zudem mittels Sequenzierung überprüft.
Klonierung von G3BP in pDLO-Xc l: Xcm\ hat folgende Erkennungssequenz: Xcm\
5'-CCANNNNN IMNNNNTGG-3' 3'-GGTNNNNNNNNNACC-5' t
Die mit N gekennzeichneten Basen sind frei wählbar, sie tragen nicht zur Schnittstellenerkennung bei. Dies ermöglicht die Einführung einer Sequenz, die benötigt wird für eine Di-/TriSec-Klonierung über ein bestimmtes oft verwendetes Klonierungschema. Dies hat den Vorteil, dass nur ein Primerpaar gekauft werden muss, das dann aber eine Klonierung in verschiedene Vektoren erlaubt. Im hier angeführten Beispiel besitzt die Xc l-Schnittstelle folgende Sequenz: Xcm\
5'-CCAccttatcgaTGG-3'
3'-GGTggaatagctACC-5' T
Nach Xcml-Verdau des Vektors entsteht ein „Einzelbasen-3'-Überhang".
5'-CCAcctta tcgaTGG-3'
3'-GGTggaa tagctACC-5'
Anschließend erfolgt die Trimmreaktion (3'-5'-Exonukleaseaktivität) mit der T4-DNA-Polymerase unter der Verwendung von dCTP als Stopp-Nukleotid:
5'-CCAcc tcgaTGG-3'
3'-GGTggaa ctACC-5'
In die aufgereinigten Vektoren können dann PCR-Fragmente einkloniert werden, die am 5'-Ende die Sequenz "TTC" und am 3'-Ende "GAC" besitzen (im Beispiel: G3BP-Klonierung mit den Oligonukleotiden 5'-G3BP-DLO (5'-TTC ATG GTG ATG GAG AAG CCT AGT-3') und 3'-G3BP (5'-GAC TTA CTG CCG TGG CGC AAG CCC CCT-3'). Das PCR-Produkt trägt folgende Enden:
5'-TTCxxxxxxxxxxxxxxxxGTC-3' 3'-AAGxxxxxxxxxxxxxxxxCAG-5'
Es wird ebenfalls einer T4-DNA-Polymerase-Reaktion unterzogen, mit dGTP als Stopp-Nukleotid, wodurch untenstehendes Produkt erhalten wird: 5'-TTCxxxxxxxxxxxxxxxxG-3' 3'-GxxxxxxxxxxxxxxxxCAG-5'
Nach der Aufreinigung, können der Vektor und das Insert ligiert werden.
5'-CCAccTTCxxxxxxxxxxxxxxxxGtcgaTGG-3' 3'-GGTggaaGxxxxxxxxxxxxxxxxCAGctACC-5'
Die iigierte DNA wird in E. coli transformiert. Mit Hilfe von Kolonie-PCR und Sequenzierung können die positiven Klone identifiziert und überprüft werden.
3.3 Methoden:
3.3.1 Amplifikation des Inserts:
Templat: G3BP in pET28a (Gl: 5031 702)
PCR: 3 x Ansätze a 50 μl
1 μl pARB021 ( 10 ng/μl)
1 5 μl Expand Puffer 3 (Röche) 3 μl dNTPs ( 10 mM each) 1 , 5 μl 5'-Primer (50 μM) 1 ,5 μl 3'-Primer (50 μM) - 1 μl Expand Long Template 1 25 υ\ H2O 1 50 μl
Programm: 1 ' 94 ° C 1 x
Figure imgf000026_0001
3.3.2 Vektorverdau mit XcmV.
10μg pDLO12-XcΛ77l
2 μl Xc l
5 μl Stratagene „one-for-aH"-Puffer ad 50 μl
ca.2 h, 37 °C
3.3.3 Vektor-Trimmen mit T4-DNA Polymerase:
2,5 μl geschnittener pDLO12-Xc/77l (0,5 μg/μl) 2 μl Puffer A (Röche)
2 μl BSA (1:10) 2 μl dCTP (10mM) 10,5 μl H2O 1 μl T4 (1:5)
30 min 12 °C, anschließend 15 min 75 °C
3.3.4 Insert-Trimmen mit T4-DNA Polymerase:
8 μl G3BP-PCR-Fragment (150 ng/μl) .4 μl Puffer A (Röche) 0,4 μl BSA (100 x) 4 μl dGTP (10mM) 22,6 μl H2O 1 μl T4-Polymerase
30 min 12 °C, anschließend 15 min 75 °C Nach dem Trimmen erfolgte eine Aufreinigung über Phenol/Chlororform- Extraktion und Ethanolpräzipitation (siehe Abschnitt 2.1 .3) .
3.3.5 Ligation (in 15 μl)
3,5 μl getrimmter pDLO 1 2-Xc/7?l-Vektor ( 100 ng) 1 μl getrimmtes G3BP-PCR-Fragment ( 100 ng)
3 μl 5 x Ligation Buffer 0,5 μl T4-Ligase (Life Tech.) 8 μl H2O
4 ° C über Nacht
Anschließend wurde die DNA in E. coli transformiert. Die positiven Klone konnten durch Kolonie-PCR sowie Restriktionsverdau identifiziert und durch Sequenzierung verifiziert werden.
Beispiel 4: Di-/TriSec-Klonierung von DNA-Oligonukleotiden in einen Vektor zur in vivo Expression von siRIMA
4.1 Einleitung
Die entwickelte Di-/TriSec-Klonierung soll auf ihre Eignung für die Klonierung von DNA-Oligonukleotiden in Vektoren untersucht werden, die sich zur Produktion von doppelsträngiger RNA in transfizierten Zellen eignen. Als Beispiel sollte ein Inhibitor für das Lamin A/C Gen generiert werden.
4.2 Methoden
Die DNA-Oligos mit der Sequenz hLamin l as IVE 5' CTT TTC CAA AAA CTG GAC TTC CAG AAG AAC ATC TCT TGA ATG TTC TTC TGG AAG TCC AGG GG 3' und hLamin 1 s IVE 5' TCC CCC TGG ACT TCC AGA AGA ACA TTC AAG AGA TGT TCT TCT GGA AGT CCA GTT TTT GGA AA 3' wurden in einer Konzentration von 100 μM in H2O gelöst.
Für die Dimerisierung wurden komplementäre Oligonukleotide in unterschiedlichen Konzentrationen in einem Magnesium-haltigen Puffer (siehe Abschnitt 2.3.1 ) gemischt und in einer PCR-Maschine auf 95 ° C erhitzt. Die Hybridisierung der Oligonukleotide erfolgte durch langsames Abkühlen von 95 ° C über 3 Stunden auf Raumtemperatur. Der Deckel des Reaktionsgefäßes blieb auf 95 ° C erhitzt. Die Dimerisierung der Oligonukleotide kann in Konzentrationen von 0,25-40 μM erfolgen, ohne dass dies entscheidenden Einfluss auf die Ligationsrate hat.
Zur Vorbereitung der Klonierung wurde der pSUPER Vektor (Brummelkamp et al., 2002) mit den Restriktionsendonukleasen BglW und Hind\\\ nach Herstellerangaben geschnitten und nach der zuvor beschriebenen Methode mit dATP und dGTP aufgefüllt (siehe Abschnitt 2.1 .1 ).
Die Ligation erfolgte wie zuvor beschrieben (siehe Abschnitt 2.3.2). Dabei wurden Verhältnisse der freien Vektorenden zu den freien Insertenden von 1 : 1 00 und 1 :500 getestet.
Die Ligationsansätze wurden mittels Staήdardmethoden in E.coli transformiert, rekombinante Plasmide vermehrt und gereinigt.
4.3 Ergebnis
Die Effizienz der Klonierung der doppelsträngigen hLamin 1 IVE Oligonukleotide lag insgesamt bei 84 % wobei das Verhältnis Vektor zu Insert nur geringen Einfluss hatte ( 1 :500, 80 %, 1 : 100, 86 %).
Das hier gezeigte Beispiel unterstreicht die hohe Effizienz des erfindungsgemäßen Klonierungsverfahrens. Der geringe Einfluss der Konzentration der Oligonukleotide bei der Dimerisierung sowie des Verhältnisses Vektoπlnsert auf die Ligationsrate belegen die Robustheit des Verfahrens gegenüber den Reaktionsbedingungen.
Im postgenomischen Zeitalter entsteht ein immer höherer Bedarf an Ansätzen, die eine sehr große Anzahl von Genen untersuchen. Die hier gezeigte siRNA-Klonierungstechnik könnte einen wichtigen Schritt zur Erstellung einer permanenten " Knockdown"-Zellklonbibliothek darstellen. Sämtliche Schritte, angefangen mit dem Lösen der Oligonukleotide über die Dimerisierung, die Ligation, die Transformation bis zum PCR-Screen für positive Klone und die Isolation von Plasmid-DNA können automatisiert werden. Dadurch können in kurzer Zeit Silencer-Konstrukte für nahezu alle humanen Gene erzeugt werden.
Der Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens zu herkömmlichen Verfahren ist die hohe Effizienz und Robustheit der Klonierung. Herkömmliche Strategien beruhen auf der Klonierung von doppelsträngigen Oligonukleotiden über palindromische Restriktionsschnittstellen. Dabei bilden die zu klonierenden Oligonukleotide bevorzugt Concatamere. Die Folge ist eine erheblich verringerte Klonierungseffizienz. Das hierin beschriebene Verfahren schließt hingegen Concatamerbildung der Oligonukleotide aus und erhöht dadurch die Effizienz der Klonierung.
Referenzen
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Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer zu mutagenisierenden zirkulären doppelsträngigen Nukleinsäure-Matrize,
(b) Bereitstellen von zwei Oligonukleotiden, die
(i) jeweils mit einem Strang der Nukleinsäure-Matrize hybridisieren,
(ii) im Bereich ihrer 5'-Enden einen 2-4 Basenpaare langen zueinander komplementären Abschnitt aufweisen, und (iii) wobei zumindest eines der Oligonukleotide die mutierte Zielsequenz enthält, (c) Amplifizieren der zu mutagenisierenden Nukleinsäure-Matrize aus (a) unter Verwendung der Oligonukleotide mit der mutierten Zielsequenz aus (b) als Primer, wobei ein mutiertes doppelsträngiges Amplifikationsprodukt erhalten wird,
(d) Trimmen der Enden des Amplifikationsprodukts, wobei ein getrimmtes Amplifikationsprodukt mit zueinander komplementären 5'-Überhängen erzeugt wird, und
(e) Ligieren des getrimmtön Amplifikationsprodukts, wobei ein mutiertes zirkuläres Nukleinsäure-Konstrukt erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Amplifizieren in Schritt (c) eine PCR umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Trimmen in Schritt (d) eine Behandlung mit einem Enzym mit 3'-Exonuklease- und Polymerase-Aktivität, insbesondere mit T4- DNA-Polymerase in Gegenwart von Stopp-Nukleotiden umfasst.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Ligieren in Schritt (e) ein Entfernen der Nukleinsäure- Matrize erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine methylierte Nukleinsäure-Matrize und zu deren Entfernung eine nur methylierte DNA spaltende
Restriktionsendonuklease verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutagenisierung ausgewählt wird aus:
(i) Bewirken von einer oder mehreren einzelnen
Nukleotidsubstitutionen, (ii) Bewirken von einer oder mehreren einzelnen Nukleotidinsertionen, - (iii) Bewirken von einer oder mehreren Inversionen einer Sequenz von mindestens 2 Basen, (iv) Bewirken von einer oder mehreren einzelnen
Nukleotiddeletionen und (v) Bewirken jeder beliebigen Kombination der Mutagenisierungen (i), (ii), (iii) und (iv).
7. Re a gen zie n kit, i n s beso n d ere z u r D u rc hf ü h ru n g d e s Mutagenisierungsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend:
(a) Mittel zur Nukleinsäure-Amplifizierung, (b) Mitte! zum Trimmen von doppelsträngigen Nukleinsäuren zur
Erzeugung gestufter Enden, die komplementär zueinander sind,
(c) Mittel zum Ligieren von Nukleinsäuren und
(d) gegebenenfalls Mittel zum selektiven Entfernen von methylierter DNA.
8. Verfahren zur Klonierung von Nukleinsäurefragmenten in einen Vektor, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines zirkulären doppelsträngigen Nukleinsäure- Vektors,
(b) Spalten des Vektors aus (a) mit zwei unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen, wobei ein linearer Vektor mit zwei unterschiedlichen gestuften Enden erhalten wird,
(c) teilweises Auffüllen der Enden des geschnittenen Vektors, wobei ein aufgefüllter linearer Vektor mit unterschiedlichen gestuften Enden erzeugt wird, die nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind,
(d) Bereitstellen eines in den Vektor aus (c) zu klonierenden Nukleinsäurefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften . Enden, die zu den Enden des aufgefüllten Vektors komplementär sind, die aber nicht komplementär zueinander und nicht zu sich selbst sind, und
(e) Ligieren des Nukleinsäurefragments in den aufgefüllten Vektor.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt (b) Restriktionsenzyme verwendet, die 5'- Überhänge ergeben.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichent, dass das Auffüllen in Schritt (c) eine Behandlung mit einem Enzym mit DNA-Polymerase-Aktivität, insbesondere mit Klenow-Enzym, in Gegenwart von maximal zwei Nukleotidtriphosphaten umfasst, um eine nur partielle Auffüllung der gestuften Enden zu bewirken.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man das in den Vektor zu klonierende Nukleinsäurefragment durch chemische oder enzymatische Synthese einzelsträngiger Oligonukleotide und anschließende Hybridisierung der einzelstängigen Oligonukleotide erzeugt.
1 2. Re ag en zie n kit, i n s beso nd ere zu r Du rc hf ü h run g d es Klonierungsverfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 1 1 , umfassend:
(a) Mittel zur Spaltung einer Nukleinsäure durch zwei unterschiedliche Restriktionsendonukleasen, die jeweils - unterschiedliche gestufte Enden erzeugen,
(b) Mittel zum teilweisen Auffüllen von gestuften Enden bei doppelsträngigen Nukleinsäuren zur Erzeugung gestufter Enden, die nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind, (c) Mittel zum Hybridisieren von DNA-Oligonukleotiden und
(d) Mittel zum Ligieren von Nukleinsäuren.
3. Verfahren zur Klonierung von Nukleinsäurefragmenten in einen Vektor, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines zirkulären doppelsträngigen Nukleinsäurevektors, (b) Bereitstellen von zwei Oligonukleotiden, die
(i) jeweils mit einem Stang des Nukleinsäurevektors hybridisieren und (ii) im Bereich ihrer 5'-Enden einen 2-4 Basenpaare langen zueinander komplementären Abschnitt aufweisen, (c) Amplifizieren des Nukleinsäurevektors aus (a) unter
Verwendung der Oligonukleotide aus (b) als Primer, wobei ein doppelsträngiges Amplifikationsprodukt mit gestuften Enden erhalten wird,
(d) Trimmen der Enden des Amplifikationsprodukts, wobei ein getrimmter linearer Vektor mit unterschiedlichen gestuften
Enden erzeugt wird, die nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind,
(e) Bereitstellen eines in den Vektor zu klonierenden Nukleinsäurefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften Enden, die zu den Enden des getrimmten Vektors komplementär sind, die aber nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind, und
(f) Ligieren des Nukleinsäurefragments in den getrimmten Vektor.
4. Verfahren nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Amplifizieren in Schritt (c) eine PCR umfasst.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Trimmen in Schritt (d) eine Behandlung mit einem Enzym mit 3'-Exonuklease-Aktivität, insbesondere mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von Stopp-Nukleotiden umfasst.
16. Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des Klonierungsverfahrens nach einem der Ansprüche 13 bis 15, umfassend: (a) Mittel zur Nukleinsäure-Amplifizierung,
(b) Mittel zum Trimmen von doppelsträngigen Nukleinsäuren zur Erzeugung von gestuften Enden die nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind,
(c) Mittel zum Hybridisieren von DNA-Oligonukleotiden und (d) Mittel zum Ligieren von Nukleinsäuren.
17. Verfahren zur Klonierung von Nukleinsäurefragmenten in einen Vektor, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines zirkulären doppelsträngigen Nukleinsäurevektors mit einer Restriktionsschnittstelle für ein
Restriktionsenzym, bei der die Erkennungssequenz neben der eigentlichen Schnittstelle liegt, ~
(b) Spalten des Vektors mit dem Restriktionsenzym,
(c) teilweises Auffüllen oder Trimmen der Enden des Λ geschnittenen Vektors, wobei ein linearer Vektor mit unterschiedlichen gestuften Enden erzeugt wird, die nicht komplementär zueinander und zu sich selbst sind,
(d) Bereitstellen eines in den Vektor aus (c) zu klonierenden Nukleinsäurefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften Enden, die zu den Enden des aufgefüllten Vektors komplementär sind, die aber nicht komplementär zueinander und nicht zu sich selbst sind, (e) Ligieren des Nukleinsäurefragments in den aufgefüllten Vektor.
18. Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des Klonierungsverfahrens nach Anspruch 17, umfassend:
(a) Mittel zur Spaltung einer Nukleinsäure durch eine Restriktionsendonuklease mit einer Restriktionsschnittstelle, bei der die Erkennungssequenz neben der eigentlichen Schnittstelle liegt, (b) Mittel zum teilweisen Auffüllen von gestuften Enden bei doppelsträngigen Nukleinsäuren . zur Erzeugung gestufter Enden, die nicht komplementär zueineinander und nicht komplementär zu sich selbst sind,
(c) Mittel zum Trimmen von doppelsträngigen Nukleinsäuren zur Erzeugung von gestuften Enden, die nicht komplementär zueinander und nicht komplementär zu sich selbst sind,
(d) Mittel zum Hybridisieren von DNA-Oligonukleotiden und
(e) Mittel zum Ligieren von Nukleinsäuren.
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