WO2003003020A1 - Procede de detection de cancer et agents de detection de cancer utilises dans ce procede - Google Patents

Description

明細書 癌検出方法及びそれに用 いる癌検出物質 技術分野

この発明は、 癌検出方法及びそれに用いる検出物質に属する。 背景技術

細胞表面の大部分は、 種々のオリ ゴ糖で緻密に覆われてお り 、 これら の糖鎖は、 細胞間及び細胞—タ ンパク質の識別において重要な役割を果 たしている。 糖鎖の う ち、 糖脂質に結合したものの構造及び生理学上の 機能は従来か ら知 られている。 例えばフコースをもつ糖脂質は、 癌抗原 や血液型活性糖脂質と して重要である。 一方、 糖蛋白質に結合した糖鎖 の機能については、 そのよ うな糖鎖の精製に膨大な時間を要していたこ とか ら、 あま り 知 られていない。

糖蛋白質糖鎖について知 られている こ とを挙げる と、 G l c N A c 転 移酵素 （ G n T — V ) 、 1 , 3 — フコース転移酵素 （ 《 1 、 3 — F u c T ) 及び i3 —ガラク ト シ ド 2 , 3 シァ リ ル転移酵素— I V ( S Τ 3 G a 1 — I V ) のよ う な酵素が、 非小細胞肺癌組織内で増加している こ と が、 既に報告されている （Cancer Res, , 58： 512- 518, 1998等） 。 これは、 悪性癌組織中では N結合型オリ ゴ糖が変化している こ とを示す程度であ る。 また、 非小細胞肺癌患者の血清内で ひ 1 , 3-FucT活性が増加 している こ と も報告されている （Cancer, 62:516- 520, 1988等） 。 従って、 a l 、 3 ー フ コース転移酵素を阻害する物質の投与によ り 、 肺由来の細胞の癌 化を抑制できる こ とが一応期待できる。

しか し、 上記各転移酵素が作用する基質の構造、 即ち癌患者に特異的 な糖蛋白質糖鎖の構造はこれまで解明されていなかっ た。 特定の糖脂質 糖鎖が腫瘍に特異的であっても悪性である場合とそうでない場合もある こ と を鑑みる と、 糖脂質糖鎖に基づく だけで癌と診断するのは早計であ る。

それ故、 この発明の課題は、 従来の検出方法と異なる方法によ り癌検 出率を向上させる と と もに、 癌患者に特異的な糖鎖を解明する こ とによ り癌の早期治療に有用な検出物質を提供する こ とにある。

発明の開示

その課題を解決するために、 この発明の癌検出方法は、

糖タ ンパク質の N結合型糖鎖に基づいて癌を検出する こ とを特徴とす る。 本発明者ら は鋭意研究の結果、 糖蛋白質の N結合型糖鎖のう ち特定 のものが癌患者に増加している こ とを見いだした。 従って、 この検出方 法を従来の検出方法と組み合わせる こ とで、 よ り 高い精度で癌を検出す る こ とができる。

上記 N結合型糖鎖のう ちで特に高い検出率を期待できるのは、 図 1 に 示される A 3 G 3 F oである。 この糖鎖が癌患者血清において著し く 増 加しているか らである。

こ こで、 A 3 G 3 F O という各記号の意味は次の通 り である。

A n ： M 3.糖鎖構造に結合する G l c N A c のア ンテナの数

G n ： 非還元末端に付け られたガラク 卜ース残基の数

F ： 還元末端の G l c N A c残基に結合したフコースを有する もの F o ： G 1 c N A c の外側にフ コースが Q! l — 3結合したもの B ： M 3糖鎖構造の真ん中のマ ンノ ースに結合する G l c N A c を有 する もの。

発明者らは、 肺癌患者と健常人の血清に含まれる糖鎖を検討したと こ ろ、 N結合型糖鎖の う ち上記 A 3 G 3 F o を含む特定の糖鎖だけが肺癌 患者の血清内に有意に増加 している こ とを見いだした。 従って、 例えば これらの糖鎖を認識する抗体を作成する こ とによ り癌を早期且つ簡易に 検出する こ とができる こ とは明 らかである。 また、 この糖鎖が細胞内で 遺伝子か ら発現する こ とを抑制する物質によ り癌細胞の増殖が抑制され る可能性が高い。

尚、 A 3 G 3 F O を認識する抗体は、 大量の A 3 G 3 F O を実験動物 に接種する こ とによ り作成可能である。

図面の簡単な説明 図 1 は A 3 G 3 F ο の構造を示す図、 図 2 は標準糖鎖のマンノ ースュ ニッ ト対グルコースュニッ トの二次元マッ プ、 図 3 はある健常人の検体 に由来する全フ ラク ショ ンの逆相 HPCLCパ夕一ンである。

発明を実施するための最良の形態

[実験方法]

表 1 に示される健常人及び非小細胞肺癌 （以下、 NSCLCとい う。 ） 患者 の血液を試料と した。 患者は京都大学付属病院で病理学的に WHO分類に基 づいて NSCLCである と診断された。 表 1 健常人 NSCLC患者 試料の数 1 2 1 4

平均年齢 （範囲）

性別 （男 女） 7/5 11/3 採血した血液を約 30分間、 室温で放置し、 血液内のフイ ブリ ノ一ゲン をフイ ブリ ン化して血清を得た後、 4で、 1300gで 20分間遠心して血球成 分を取 り 除き、 その上清を純粋な血清と して得た。

血清の 9倍量のアセ ト ンを添加し、 よ く 攪拌した後、 4で、 lOOOOg で 再び遠心して今度'はその上清内に血清の脂溶性成分を溶解し、 その沈殿 を検体と した。

2 mgの検体を GlycoPrepTM 1000 (Oxford Gl ycoSys t ems社製、 英国） という機械に N- 1 inked modeでかけて、 自動的に検体をヒ ド ラジン分解 して蛋白質か ら糖鎖を切 り はなした。

次に切 り離された糖鎖を GlycoTagTM (Takara社製） とい う機械にかけ て、 検体である糖鎖に 自動的に ピ リ ジルァ ミ ノ基をつけて、 蛍光標識す る ものである。

この状態で事実上、 高性能液体ク ロマ ト グラフィ ー （HPLC)にかけて糖鎖 の分析が可能だが、 解析をよ り単純化するために、 ノィ ラ ミ ニダーゼと い う酵素で糖鎖を処理して、 その側鎖にある シアル酸を切断した。 電荷 を有する シアル酸が切断された結果、 ヒ ト血清内に存在する中性の糖鎖 を得る こ とができた。

検体中の様々な大きさの糖鎖を、 その大きさ別に分けるために、 蛍光 標識された上記中性の糖鎖群を含む検体を順相 HPLCにかけ、 糖鎖の量を 蛍光検出器で検出して測定した。 使用 した HPLCカ ラムは Asahipak NH2P- 50 (4.6x50 mm, 昭和電光製） 、 HPLCポンプはギルソ ン社 （米国） の mo del 305 と 306、 蛍光検出器は島津製作所製の RF- 535である。

順相 HPLCの測定条件を詳 し く 述べる と、 流速は 0.6 ml/min 、 カ ラムの 温度は 25 ：、 溶媒 A を 20%ァセ トニ ト リ ル、 0.3%酢酸を含み、 ト リ ヱ チルァミ ンで pH7.0に調節した水、 溶媒 Bは 93 %ァセ トニ ト リ ル、 0.3 % 酢酸を含み、 ト リ ェチルァ ミ ンで pH7.0に調節した水と して、 最初 A： Bの 比を 97: 3でスター ト させ、 溶媒 Bを、 検体を投入して 1 分後に 19%、 35 分後に 57 %まで直線的に増加させた。 こ こか ら溶出 してく る蛍光標識糖 鎖を励起波長 310 nm、 検出波長 380 nmで検出 し、 M 2 (マ ンノ ース 2 個） か ら M 9 (同 9個） の標準糖鎖の溶出時間に したがっ て分取した。 順相 HPLCで大きさ別に分類された糖鎖を、 今度はその糖鎖分子の構造 上の特性によって分類するために逆相 HPLCにかけた。 使用 した HPLC力 ラ ムは Cosmosil 5C18-P (4.6x150 mm, ナカ ライ社製） 、 HPLCポンプはゥ ォ一夕一社 （米国） の 600システム、 蛍光検出器もウォー夕一社のモデル 474である。

逆相 HPLCの測定条件を詳し く 述べる と、 流速は 1.5 ml/min 、 カ ラムの 温度は 25で、 溶媒 Cを 0. 1Mの酢酸ア ンモニゥム緩衝液 （pH 4.0) 、 溶 媒 Dは溶媒 Cに 0.5 %の 1 ブ夕 ノールを加えたものと して、 最初 C： Dの比を 94: 6でスター ト させ、 溶媒 Dを、 検体を投入して 45分後に 80%まで、 直 線的に増加させた。 こ こか ら溶出してく る蛍光標識糖鎖を励起波長 320 nm、 検出波長 400 nmで検出 し、 その溶出パターンを次の手順で比較検討 し、 検体中の糖鎖の構造と含有量を決定した。

逆相 HPLC に検体を投入する前に、 あ らかじめ、 グルコースオリ ゴマー という ブ ドウ糖が様々な数 （ 3か ら 22) 直線的に結合した標準糖鎖を投 入し、 その溶出時間を測定しておき、 検体の溶出時間の内的標準とする。 検体の ピークが内部標準のどれく ら いの位置に匹敵するかを計算し、 グ ルコースユニッ ト （GU) と して表現する。

逆相 HPLCで認め られる ピーク毎にそのピーク に含有する糖鎖を採取し、 も う一度これを順相 HPLCに投入する。 GUと同様な方法で、 今度はマンノ ースュニッ ト （MU)を計算し、 逆相 HPLCで認め られる各々 のピーク につい て、 GU、 MUという 2つの指標をつけ、 横軸に GU、 縦軸に MUをとつて 2次元 のグラ フの上に点を打つ。 2次元でその糖鎖の特性を判別する この方法を、 あ らか じめ構造がわ かっている糖鎖 （Takara社製、 生化学株式会社製及びオッ クスフ ォー ド グリ コ システム製） について行ったあと、 血清由来の糖鎖について行い、 その 2次元マッ プ上で点が重複するか否かで、 構造を同定する。 図 2 は、 市販の標準糖鎖の 2次元マッ プであ り 、 縦軸は MU、 横軸は GUを示す。 例 えば上記の打点位置が MU = 8.9、 GU=10.0であれば、 その糖鎖は A3G3Foであ る と同定される。

図 3 は、 ある健常人由来の逆相 HPLCにおける全フ ラク シ ョ ンの溶出パ ターンを示す。 左端の記号 M n ( n ： 2 — 9 ) は、 M n とほぼ同じ大き さの糖鎖を逆相 HPLCで分析したパターンである こ とを表す。 例えば、 A2 G2は、 M 4から M 7 の 4つのフ ラク ショ ンに見いだされる。 この場合、 A2G2の含有量は、 各フ ラク ショ ンの A2G2ピーク強度の総和か ら算出 して モル％で表される。

[結果]

こ う して同定された糖鎖の構造と含有量を表 2 に示す。

表 2 含有量 （平均 ± SD%) 構造 健常人 NSCLC患者 ア ンテナ数 = 2

A2G0 0.24± 0.04 0.29± 0. 13

A2G1 1. 18土 0.36 0.73± 0.30

A2G2 40. 18± 4.03 39.88 ± 6.89

A2G0F 3.91 1. 19 5.68土 1.99

A2G1F 1.65 5.47土 1.43

A2G2F 13.70 3.46 10.33± 3. 14 A2G0FB 1. 12土 0.47 1. 12± 0.43 A2G1FB 1. 17土 0.49 1. 16± 0.54 A2G2FB 2.37土 0.58 2.45土 0.85 ア ンテナ数 = 3

A3G3 6.81± 2.66 6.72± 2.57 A3G3F 0.37± 0. 12 0.29± 0. 15 A3G3FO 1.91± 1.09 4.78± 2.79 ア ンテナ数 = 4

A4G4 2. 17± 0.88 1.92 0.58 A4G4FO 0. 18土 0.32 0.26 0. 15 オリ ゴマンノ ース系列

M5A 0.85士 0. 15 1.34土 1.60 M6B 0. 17土 0.05 0. 18土 0.04 M8A 0.29土 0. 13 0. 18土 0.05 M9A 0.59土 0. 18 0.51± 0. 15

表 2 に見られるよ う に、 A3G3FOという構造の糖鎖の発現が非小細胞肺 癌患者の血清内において、 健常人に比べて有意に上昇していた （危険率 0. 1%以下） 。 ちなみに細胞内で A3G3FO構造の前駆体となる A3G3構造は上 昇していなかっ た。 産業上の利用可能性

以上の通り 、 従来解析されていなかった糖蛋白質糖鎖に基づいて検出 するので、 こ の発明は癌の早期発見及び治療に極めて有益である。

Claims

請求の範囲

1 . 糖タ ンパク質の N結合型糖鎖に基づいて癌を検出する こ とを特徴 とする癌検出方法。

2 . 前記 N結合型糖鎖が A 3 G 3 F oである請求項 1 に記載の癌検出 方法。

3 . 糖タ ンパク質の特定の N結合型糖鎖を認識する抗体か らなる癌検 出物質。

4 . 前記 N結合型糖鎖が A 3 G 3 F o である請求項 3 に記載の癌検出 物質。