WO2003000284A1 - Composition vaccinale comprenant un compose de type hydrotalcite - Google Patents

Composition vaccinale comprenant un compose de type hydrotalcite Download PDF

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WO2003000284A1
WO2003000284A1 PCT/FR2002/002173 FR0202173W WO03000284A1 WO 2003000284 A1 WO2003000284 A1 WO 2003000284A1 FR 0202173 W FR0202173 W FR 0202173W WO 03000284 A1 WO03000284 A1 WO 03000284A1
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vaccine
hydrotalcite
antigen
adjuvant
vaccine composition
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PCT/FR2002/002173
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Bruno Pitard
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Aventis Pasteur
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants

Definitions

  • Vaccine composition comprising a hydrotalcite type compound
  • the present invention relates to the field of vaccine compositions. More particularly, the invention relates to the field of adjuvants for vaccine composition.
  • vaccine adjuvant is meant a product which, added to a vaccine, makes it possible to increase or modify the response of the immune system of an organism to the administration of an antigen. In particular, it may be an increase in the humoral response or the cellular response, or both simultaneously.
  • the action of a vaccine adjuvant can also be, not an increase in the response which would occur in the absence of an adjuvant, but a different orientation from the response produced: for example, orientation towards a cellular response rather than a humoral response, production of certain cyto ines rather than others, production of certain types or subtypes of antibodies rather than others, stimulation of certain cells rather than others.
  • the action of an adjuvant can also be to provoke a faster response than that which would occur without an adjuvant, or even to lead to a kind of immunization prolonged over time.
  • the subject of the present invention is a vaccine composition comprising at least one antigen, characterized in that it also comprises at least one adjuvant of the hydrotalcite type.
  • the antigen is a subunit antigen
  • the antigen is a fraction of DNA coding for a vaccine antigen
  • the subject of the invention is also a vaccine adjuvant comprising at least one compound of the hydrotalcite type.
  • the vaccine adjuvant according to the invention comprises the compound having the formula Mg 6 Al (OH) ⁇ 6 (CO 3 ) 4H 2 O which has undergone decarbonation
  • the present invention also relates to the use of a vaccine adjuvant comprising at least one hydrotalcite type compound for the manufacture of a medicament capable of inducing a TH2 type response vis-à-vis an antigen
  • the compounds of hydrotalcite type within the meaning of the present invention are compounds which are also called “double lamellar hydroxides” or LDH (for “layered double hydroxide”), they constitute a family of lamellar ionic compounds, containing exchangeable anions These compounds have positively charged hydroxyl sheets, between which anions and water molecules are interspersed Their general formula is as follows
  • M ⁇ is a divalent metal cation (Mg 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ ,)
  • M m is a valid metal cation
  • X m is an interfoliar anion with m being an integer greater than or equal to 1, and x varying between 0.2 and 0.3
  • the divalent metal cations M 11 are chosen from, in particular, magnesium (Mg), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), copper (Cu ) zinc (Zn), Calcium (Ca). Particularly good results have been obtained with magnesium.
  • the trivalent metal cations M m are chosen from in particular: aluminum (Al), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), gallium (Ga).
  • a particularly suitable cation is aluminum.
  • the 2 members of the divalent cation / trivalent cation couple originate from the same metal, for example iron with Fe 2 7 Fe 3+ or manganese with Mn 2+ / Mn 3+ .
  • the anions located between the sheets can be halides, oxoanions, iso- or heteroanions, complex anions or organic anions. It may especially be fluorides, chlorides, bromides, carbonates, nitrates, sulfates or even CrO 2 " . An anion which is particularly suitable is Carbonate CO 3 2" .
  • n which indicates the hydration state of the molecule used is strictly greater than 0.
  • the value of m which translates the flag load is an integer value, which can in particular be 1, 2, 3, 4, 5 or 6.
  • Ni-Al Ni 6 Al 2 CO 3 (OH) 16 .4H 2 O
  • Ni-Co Ni 6 Co 2 CO 3 (OH) 16 .4H 2 O
  • Zri 6 Al 2 (OH) i6 (CO 3 ) 4H 2 O from a mixture of ZnCl 2 and A1C1 3 in proportion 3/1
  • the solution obtained is mixed dropwise with a concentrated sodium hydroxide solution, the pH remaining constant around 7
  • the precipitate obtained is centrifuged and then washed several times with ultrafiltered water
  • ZneFe (OH) i 6 (CO 3 ) 4H 2 O can be prepared, starting from this time, not from A1C1 3
  • hydrotalcite-type compounds are used in combination with antigens for immunization purposes
  • the antigens used can be of a varied nature, they can be substances capable of directly inducing an immune response on the part of the organism to which they are administered protein, peptide, polysaccharide, lipopeptide antigens, portions or all of virus or bacteria, or they can be DNA fractions capable of being exp ⁇ mées in the organism to which they are administered, and therefore indirectly lead to a stimulation of the immune system which will react against the expression product of this fraction of DNA administered
  • association of the compounds according to the invention with the immunization antigens can be of a type such as that occurring during the conventional use of an aluminum suspension. This association is obtained by simple mixing of the compounds of type hydrotalcite and antigens of interest, in proportions which may vary according to the nature of the antigen and according to the nature of the hydrotalcite type compound
  • the vaccine composition according to the invention may, in addition to the antigen or antigens of interest and the compounds of the hydrotalcite type, also include any other substance. usually included in a vaccine, and in particular a stabilizer, a preservative, one or other adjuvants ...
  • Such a vaccine composition can be administered by all the routes usually used, and according to all the administration protocols recommended by the various health organizations.
  • Example 1 Vaccine compositions comprising at least one tetanus antigen.
  • Doses of 0.5 ml of vaccine compositions are prepared having the following formulations: compound of hydrotalcite type or conventional aluminum suspension: 0.3 g / l (expressed by weight of aluminum)
  • the adjuvant activity of hydrotalcite-type compounds vis-à-vis the tetanus antigen is assessed by means of a test carried out in mice, vis-à-vis a lethal dose of tetanus toxin administered by subcutaneous route .
  • the tetanus activity is determined by comparing the dose necessary to protect 50% of the animals (ED50) from the effects of the toxin, with that of a reference vaccine calibrated in IU / ml.
  • mice For each test, there are 316 mice allowing to test 3 vaccine formulations; the mice are distributed as follows:
  • mice for vaccination 16 mice per dose at a rate of 4 doses
  • mice per dose at a rate of 5 doses, The sou ⁇ s receive subcutaneously 0.5 ml of one of the dilutions of the vaccine compositions to be tested or of the reference vaccine
  • the sou ⁇ s are tested with a tetanus toxin test solution. There are 4 days after the test, the surviving sou ⁇ s, and it is determined
  • the activity (in IU dose) is then determined from the relative activity and the IU titer of the reference vaccine
  • the adjuvant used is a compound of the hydrotalcite Mg / Al / CO 3 decarbonate type
  • the antitetanic activity is of the same order as when the adjuvant used is an aluminum phosphate suspension.
  • Example 2 Vaccine compositions comprising the p24 antigen
  • Vaccine compositions are prepared comprising the p24 antigen which is an antigen capable of entering into the composition of an AIDS vaccine.
  • This p24 antigen was described in the following publication Diagnostic value of HIV-Ag testing and ant ⁇ -p24 Mers in HIV carriers and AIDS patients Roumehotou A, Nesto ⁇ dou E, Economidou I, Psa ⁇ a E, Sidi ⁇ E, Choremi E, Kallmikos G, Papaevangelou G, AIDS 1988 Feb, 2 (l) 64, ⁇ l is present at a concentration of 6.7 g / 1 in a solution of lOOmM sodium phosphate and 50mM sodium chloride, at pH 7.4 The following materials are available for the preparation of the vaccine compositions
  • PBS buffer 0.012 g / 1 Na 2 HPO 2H 2 O, 0.06 g / 1 KHPO 4 , 9g / l NaCl.
  • 0.3 ml of p24 diluted to 0.134 g / l in PBS buffer is added, so as to obtain 1.6 ml of a suspension comprising 0.04 mg of p24 and 4 , 8mg of mineral additive.
  • 0.2 ml doses are thus obtained containing 5 ⁇ g of p24 and 0.6 mg of mineral adjuvant.
  • the study protocol is as follows: the vaccine compositions are prepared on the same day of their administration to the mice.
  • mice For each vaccine composition tested, 6 mice are immunized.
  • mice are immunized on D1 and D21, by subcutaneous administration of a dose of 200 ⁇ l of the vaccine composition to be tested.
  • FIG. 5 as regards the production of IFN ⁇ in the supernatant of the spleen cells
  • FIG. 6 as regards the production of IL5 in the supernatant of the spleen cells
  • FIG. 7 as regards the enumeration of IFN ⁇ producing cells in Figure 8 with regard to the proliferation response after restimulation to recombinant p24.
  • mice The groups of mice are referenced in relation to the vaccine composition tested. - group 1 received only p24;
  • compositions according to the invention which contain compounds of the hydrotalcite type, lead to results close to those obtained with aluminum hydroxide.
  • the strong increase in the production of immunoglobulins of the IgG2a type shows that the compounds according to the invention are capable of inducing an immune response of the TH2 type.
  • Example 3 Vaccine composition for DNA immunization
  • Vaccine compositions are prepared comprising, no longer a direct antigen as in the case of the 2 previous examples, but a plasmid coding for an antigen, in particular the plasmid VR-1012 HA coding for hemagglutinin (HA) of the influenza virus, in this case the strain A / PR8 / 34, H1N1)
  • hydrotalcite Mg / Al / CO 3 is available and stored at a concentration of 5g / l in 50 mM Hepes buffer.
  • the vaccine compositions comprising different concentrations of hydrotalcite and DNA are prepared by rapid injection of the hydrotalcite into the DNA, homogenization by aspiration / delivery 3 times, then mixed with Vortex slightly.
  • Each of the vaccine compositions is administered to a group of 6 mice, which receive a 1st administration at OJ, a second administration at D21, bilaterally by im route in the anterior tibialis muscle at a rate of 50 ⁇ l per muscle for each of the injections.
  • Blood samples were taken from the retro-orbital sinus on OJ, D21 and D35 to study the humoral response. The mice were sacrificed on D35 for the cell immunity test.
  • mice are divided into groups A to H according to the vaccine composition administered:
  • Group D 50 ⁇ g of VR-HA
  • Group E 0.1 ⁇ g of VR-HA + 0.5 ⁇ g Hydrotalcite
  • the total anti-HA IgGs were assayed individually for groups A to H.
  • the number of IFN- ⁇ secreting cells was evaluated by ELISPOT after ex vivo stimulation with a peptide presented by MHC class 1 specific for HA for each mouse from groups A to H.
  • An antibody specific for the cytokine to be detected (ref 18181D Pharmingen for the anti-IFN- ⁇ ) was incubated overnight at 4 ° C. in 96-well plates with a nitrocellulose background. The plates were then saturated with culture medium for 1 h at 37 ° C. The splenocytes were stimulated in vitro by the peptides presented by the MHC class 1 of the HA protein (IYSTVASSLVL) of the influenza virus or of the gag protein (negative control, AMQMLKETI) of HIV. The peptides were used at the only final concentration of 20 ⁇ g / ml. Controls, negative with medium and positive with ConA (10 ⁇ g / ml final), were also included.
  • 3xl0 5 spleen cells were deposited in each well in triplicates in the presence of murine IL-2 at 20U / ml final (Boehringer) and incubated for 18 h at 37 ° C.
  • a biotinylated anti-IFN- ⁇ antibody (ref 18112D Pharmingen) was then added and the complex was revealed by streptavidin - peroxidase (ref 7100-05 Southern biotech). The spots were counted using a Microvision reader. The results obtained are illustrated in Figure 9.
  • the IgG titers of the sample sera were calculated relative to the standard serum with the CodUnit calculation method. They are expressed in logto.
  • the arithmetic IgG titer of the standard influenza serum has been set at 41636 Arbitrary Units

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Abstract

L'invention concerne une composition vaccinale comprenant un composé de type hydrotalcite tel que le Mg6Al2CO3(OH)16.4H2O; un tel composé a pour avantage d'agir comme adjuvant vis-à-vis de l'antigène ou des antigènes habituellement compris dans une composition vaccinale.

Description

Composition vaccinale comprenant un composé de type hydrotalcite
La présente invention est relative au domaine des compositions vaccinales. Plus particulièrement l'invention est relative au domaine des adjuvants pour composition vaccinale.
Par adjuvant vaccinal, on entend un produit qui, ajouté dans un vaccin, permet d'accroître ou de modifier la réponse du système immunitaire d'un organisme vis à vis de l'administration d'un antigène. En particulier, il peut s'agir d'une augmentation de la réponse humorale ou de la réponse cellulaire, ou des deux simultanément.
L'action d'un adjuvant vaccinal peut également être, non pas une augmentation de la réponse qui se produirait en l'absence d'adjuvant, mais une orientation différente de la réponse produite : par exemple, orientation vers une réponse cellulaire plutôt qu'une réponse humorale, production de certaines cyto ines plutôt que d'autres, production de certains types ou sous-types d'anticorps plutôt que d'autres, stimulation de certaines cellules plutôt que d'autres. L'action d'un adjuvant peut également être de provoquer une réponse plus rapide que celle qui se produirait sans adjuvant, ou encore de conduire à une sorte d'immunisation prolongée dans le temps.
On connaît , dans l'art antérieur, de nombreux adjuvants pour composition vaccinale ; cependant, à ce jour, peu ont été approuvés par les autorités pharmaceutiques pour la fabrication de vaccins, la plupart des vaccins présents sur le marché étant adjuvés par ce que l'on appelle des gels d'aluminium, qui sont essentiellement, soit de l'hydroxide d'aluminium, soit du phosphate d'aluminium.
Cependant, de tels adjuvants ne permettent pas toujours d'obtenir les résultats d'immunisation souhaités, suivant l'antigène et/ou la voie d'administration choisis.
Il est donc souhaitable de pouvoir disposer de nouveaux adjuvants.
A cette fin, la présente invention a pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un antigène, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un adjuvant de type hydrotalcite. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'antigène est un antigène sous-unitaire
Selon un autre mode de réalisation, l'antigène est une fraction d'ADN codant pour un antigène vaccinal
L'invention a également pour objet un adjuvant vaccinal comprenant au moins un composé de type hydrotalcite
Selon un mode particulier de réalisation, l'adjuvant vaccinal selon l'invention comprend le composé ayant la formule Mg6Al (OH)ι6(CO3) 4H2O qui a subi une décarbonatation
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un adjuvant vaccinal comprenant au moins un composé de type hydrotalcite pour la fabπcation d'un médicament susceptible d'induire une réponse de type TH2 vis-à-vis d'un antigène
Les composés de type hydrotalcite au sens de la présente invention sont des composés que l'on appelle aussi « Hydroxydes doubles lamellaires » ou LDH (pour « layered double hydroxide ») , ils constituent une famille de composés ioniques lamellaires, contenant des anions échangeables Ces composés ont des feuillets d'hydroxyle chargé positivement, entre lesquels sont intercalés des anions et des molécules d'eau Leur formule générale est la suivante
[Mπι.„ Mffl_ (OH)2r+ [X" m n H2Of
Dans laquelle Mπ est un cation métallique divalent (Mg2+, Zn 2+, Mn 2+, ), Mm est un cation métallique tπvalent, Xm est un anion interfoliaire avec m étant un entier supéπeur ou égal à 1 , et x variant entre 0,2 et 0,3
Ces composés sont ainsi appelés en raison de leur structure analogue à celle de l' hydrotalcite minérale naturelle dont la formule est la suivante
Mg6Al2(OH)ι6(CO3) 4H2O
Les cations métalliques divalents M11 sont choisis parmi notamment le magnésium (Mg), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), le Calcium (Ca). On a obtenu de particulièrement bons résultats avec le magnésium.
Les cations métalliques trivalents Mm sont choisis parmi notamment : l'aluminium (Al), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), le gallium (Ga). Un cation convenant particulièrement bien est l'aluminium.
Il est également possible que les 2 membres du couple cation divalent/cation trivalent proviennent du même métal, par exemple le fer avec Fe27 Fe3+ ou encore le manganèse avec Mn2+ / Mn3+ .
Les anions situés entre les feuillets peuvent être des halogenures, des oxoanions, des iso- ou hétéroanions, des anions complexes ou des anions organiques. Il peut notamment s'agir de fluorures, de chlorures, de bromures, de carbonates, de nitrates, de sulfates ou encore de CrO 2". Un anion convenant particulièrement bien est le Carbonate CO3 2".
La valeur de n qui traduit l'état d'hydratation de la molécule utilisée est strictement supérieure à 0.
La valeur de m qui traduit la charge de fanion est une valeur entière, qui peut notamment être 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
Ces composés sont appelés selon la nature des cations métalliques des feuillets ; on a, par exemple les composés suivants:
- l'hydrotalcite (Mg-Al) : Mg6Al2CO3(OH)ι6.4H2O
- la pyroaurite (Mg-Fe) :
Figure imgf000004_0001
- la stichtite (Mg-Cr) : Mg6Cr2C03(OH)16.4H2O
- la takovite (Ni-Al) : Ni6Al2CO3(OH)16.4H2O
- la reevesite (Ni-Fe) :
Figure imgf000004_0002
- la comblainite (Ni-Co): Ni6Co2CO3(OH)16.4H2O
De nombreux autres composés sont possibles, en faisant varier la nature des cations métalliques, leurs proportions respectives ( il est même possible d'avoir plus de 2 types de cations notamment Mg Zn/Al), la nature des anions interfoliaires, ou encore l'état d'hydratation. Ces composés sont généralement des composés disponibles commercialement II est également possible de les préparer spécifiquement grâce à des méthodes connues dites « de chimie douce »
Il est par exemple possible de fabπquer le Zri6Al2(OH)i6(CO3) 4H2O à partir d'un mélange de ZnCl2 et de A1C13 en proportion 3/1 La solution obtenue est mélangée goutte à goutte avec une solution de soude concentrée, le pH restant constant autour de 7 Le précipité obtenu est centrifugé puis lavé plusieurs fois avec de l'eau ultrafiltrée De même, on peut préparer ZnéFe (OH)i6(CO3) 4H2O, à partir cette fois, non pas de A1C13
Figure imgf000005_0001
De tels composés ont été largement décπts dans la littérature pour leurs applications comme échangeurs d'ions, catalyseurs, adsorbants, conducteurs d'ions Cependant, ils n'ont jamais été décπts ni suggérés comme ayant une capacité à stimuler une réponse immunitaire, leur permettant d'être utilisés comme adjuvant vaccinal
Selon l'invention, les composés de type hydrotalcite sont utilisés en association avec des antigènes à des fins d'immunisation
Les antigènes utilisés peuvent être de nature variée , il peut s'agir de substances capables d'induire directement une réponse immunitaire de la part de l'organisme auquel elles sont administrées antigènes protéiques, peptidiques, polysaccharidiques, lipopeptidiques, portions ou totalité de virus ou de bactéπes , ou encore il peut s'agir de fractions d'ADN capables d'être expπmées dans l'organisme auquel elles sont administrées, et donc de conduire indirectement à une stimulation du système immunitaire qui réagira contre le produit d'expression de cette fraction d'ADN administrée
L'association des composés selon l'invention avec les antigènes d'immunisation peut être d'un type tel que celle se produisant lors de l'utilisation classique d'une suspension d'aluminium Cette association est obtenue par simple mélange des composés de type hydrotalcite et des antigènes d'intérêt, dans des proportions qui peuvent varier selon la nature de l'antigène et selon la nature du composé de type hydrotalcite
La composition vaccinale selon l'invention peut, outre l'antigène ou les antigènes d'intérêt et les composés de type hydrotalcite, comprendre également toute autre substance habituellement comprise dans un vaccin, et notamment un stabilisant, un conservateur, un ou d'autres adjuvants...
Une telle composition vaccinale peut être administrée par toutes les voies habituellement utilisées, et selon tous les protocoles d'administration recommandés par les différents organismes de santé.
Les exemples qui suivent illustrent différents modes de réalisation de la présente invention.
Exemple 1 : Compositions vaccinales comprenant au moins un antigène contre le tétanos.
On dispose de composé de type hydrotalcite Mg/Al de formule : Mg6Al2CO3(OH)ι6.4H20 provenant de Sud Chemie que l'on décarbonate par calcination. On dispose également d'une suspension de phosphate d'aluminium.
On prépare des doses de 0,5 ml de compositions vaccinales ayant les formulations suivantes : composé de type hydrotalcite ou suspension d'aluminium classique : 0,3g/l (exprimé en poids d'aluminium)
- anatoxine diphtérique : 30 LF/ml - anatoxine tétanique : 10 LF/ml
- merthiolate : 40 μg/dose
L'activité adjuvante des composés de type hydrotalcite vis-à-vis de l'antigène du tétanos est appréciée grâce à un test effectué chez la souris, vis-à-vis d'une dose létale de toxine tétanique administrée par voie sous-cutanée.
Lors de ce test, l'activité antitétanique est déterminée en comparant la dose nécessaire pour protéger 50% des animaux (DE50) des effets de la toxine, à celle d'un vaccin de référence étalonné en Ul/ml.
Brièvement, le test est réalisé de la manière suivante : Pour chaque test, on dispose de 316 souris permettant de tester 3 formulations vaccinales ; les souris sont réparties de la façon suivante :
- souris pour vaccination : 16 souris par dose à raison de 4 doses
- souris témoins de l'épreuve : 10 souris
- souris pour vérification de la DL50 : 10 souris par dose à raison de 5 doses , Les souπs reçoivent par voie sous-cutanée 0,5ml d'une des dilutions des compositions vaccinales à tester ou du vaccin de référence
28 jours après cette immunisation, les souπs sont éprouvées par une solution d'épreuve de toxine tétanique On dénombre 4 jours après l'épreuve, les souπs survivantes, et on détermine
- la DE50 du vaccin de référence et des vaccins à titrer,
- l'activité relative du vaccin par rapport au vaccin de référence,
- le nombre de DL50 contenu dans la dose d'épreuve
L'activité (en Ul dose) est ensuite déterminée à partir de l'activité relative et du titre en UI du vaccin de référence
Les résultats obtenus pour les différentes compositions vaccinales testées sont les suivants Mg/Al/CO3 décarbonaté 45 et 57 - Al/PO4 41
Ces résultats permettent de voir que lorsque l'adjuvant utilisé est un composé de type hydrotalcite Mg/Al/CO3 décarbonaté , l'activité antitétanique est du même ordre que lorsque l'adjuvant utilisé est une suspension de phosphate d'aluminium
Exemple 2 Compositions vaccinales comprenant l'antigène p24
On prépare des compositions vaccinales comprenant l'antigène p24 qui est un antigène susceptible d'entrer dans la composition d'un vaccin contre le SIDA Cet antigène p24 a été décπt dans la publication suivante Diagnostic value of HIV-Ag testing and antι-p24 Mers in HIV carriers and AIDS patients Roumehotou A, Nestoπdou E, Economidou I, Psaπa E, Sidiπ E, Choremi E, Kallmikos G, Papaevangelou G, AIDS 1988 Feb,2(l) 64 ,ιl est présent à une concentration de 6,7 g/1 dans une solution de Phosphate de sodium lOOmM et de Chlorure de sodium 50mM, à pH 7,4 On dispose pour la préparation des compositions vaccinales, des matéπaux suivants
- de l'hydroxide d'aluminium (Reheis) en suspension aqueuse à 10,02 g/1,
- du phosphate d'aluminium (Superfos) en suspension aqueuse à 4,4 g/1,
- de l'hydrotalcite Mg/Al/CO3 (Sud Chemie) en tampon Hepes à 6 g/1,
- du composé de type hydrotalcite Mg/Fe/CO3 (Sud Chemie) en tampon Hepes à 6 g/1, - de l'hydrotalcite Mg/Al/CO3 (Sud Chemie) décarbonaté par chauffage, en tampon Hepes dégazéifié, à une concentration de 6g/l, stocké sous argon à 4°C.
Chacune des suspensions des matériaux cités ci-dessus est diluée à 3,7g/l par du tampon PBS (= 0,012 g/1 Na2HPO 2H2O, 0,06 g/1 KHPO4, 9g/l NaCl). A 1,3ml des échantillons de solution qui en résultent, on ajoute 0,3 ml de p24 dilué à 0,134 g/1 en tampon PBS, de manière à obtenir 1,6ml d'une suspension comprenant 0,04 mg de p24 et 4,8mg d'adjuvant minéral. On obtient ainsi des doses de 0,2ml contenant 5μg de p24 et 0,6mg d'adjuvant minéral.
Le protocole de l'étude est le suivant : on prépare les compositions vaccinales le jour-même de leur administration aux souris.
Pour chaque composition vaccinale testée, on immunise 6 souris.
Les souris sont immunisées à Jl et à J21, par administration en sous-cutané d'une dose de 200μl de la composition vaccinale à tester.
Des prélèvements sanguins sont effectués à J14 et à J35, et les souris sont sacrifiées à J37.
Les dosages effectués sont les suivants :
- dosage des IgGl et IgG2a sériques spécifiques de la p24 par ELISA - Dosage par ELISA de la production en IL5 et en IFNγ dans les surnageants des cellules spléniques qui sont stimulées pendant 5 jours in vitro avec de la p24 recombinante à raison de lOμg/ml,
- Dosage par ELISPOT de la fréquence de cellules produisant de l'IFNγ après stimulation des cellules spléniques par un peptide CTL de la p24 et par de l'IL2 pendant 7 jours (avec un contrôle effectué au moyen d'une stimulation par un peptide HA),
- test de lymphoprolifération après stimulation à la p24 recombinante à raison de 5μg/ml pendant 5 jours.
Les résultats des différents groupes d'animaux sont représentés : - sur la Figure 1 pour ce qui concerne les titres en IgGl à J14, sur la Figure 2 pour ce qui concerne les titres en IgG2a à J14,
- sur la Figure 3 pour ce qui concerne les titres en IgGl à J35, sur la Figure 4 pour ce qui concerne les titres en IgG2a à J35, sur la Figure 5 pour ce qui concerne la production d'IFNγ dans le surnageant des cellules spléniques, sur la Figure 6 pour ce qui concerne la production d'IL5 dans le surnageant des cellules spléniques, - sur la Figure 7 pour ce qui concerne le dénombrement des cellules productrices d'IFNγ sur la Figure 8 pour ce qui concerne la réponse en prolifération après restimulation à la p24 recombinante.
Les groupes de souris sont référencées en relation avec la composition vaccinale testée. - le groupe 1 n'a reçu que de la p24 ;
- le groupe 2 a reçu p24 + A1OOH
- le groupe 3 a reçu p24 + Al PO4
- le groupe 4 a reçu p24 + Mg/Al/CO3
- le groupe 5 a reçu p24 + Mg/Fe /CO3 - le groupe 6 a reçu p24 + Mg/Al/CO3 décarbonaté.
Ces résultats montrent que les compositions selon l'invention, qui contiennent des composés de type hydrotalcite, conduisent à des résultats proches de ceux obtenus avec de l'hydroxide d'aluminium . La forte augmentation de la production d'immunoglobulines de type IgG2a montrent que les composés selon l'invention sont susceptibles d'induire une réponse immunitaire de type TH2.
Exemple 3 Composition vaccinale pour une immunisation ADN
On prépare des compositions vaccinales comprenant, non plus un antigène direct comme dans le cas des 2 exemples précédents, mais un plasmide codant pour un antigène, notamment le plasmide VR-1012 HA codant pour l'hémagglutinine (HA) du virus de la grippe, en l'occuπence la souche A/PR8/34, H1N1) A cette fin, on dispose d'hydrotalcite Mg/Al/CO3 et conservé à une concentration de 5g/l en tampon Hepes 50 mM.
Les compositions vaccinales comprenant différentes concentrations d'hydrotalcite et d'ADN sont préparées par injection rapide de l'hydrotalcite dans l'ADN, homogénéisation par aspiration/refoulement 3 fois, puis mélange au Vortex légèrement. Chacune des compositions vaccinales est administrée à un groupe de 6 souris, qui reçoivent une 1ère administration à JO, une seconde administration à J21, de manière bilatérale par voie i.m. dans le muscle tibialis antérieur à raison de 50μl par muscle pour chacune des injections. Des prélèvements sanguins ont été réalisés au niveau du sinus retro-orbital à JO, J21 et J35 pour l'étude de la réponse humorale. Les souris ont été sacrifiées à J35 pour le test d'immunité cellulaire.
Les souris sont réparties dans des groupes A à H en fonction de la composition vaccinale administrée :
Groupe A : 0.1 μg de VR-HA
Groupe B : 1 μg de VR-HA
Groupe C : 10 μg de VR-HA
Groupe D : 50 μg de VR-HA Groupe E : 0.1 μg de VR-HA + 0.5 μg Hydrotalcite
Groupe F : 1 μg de VR-HA + 5 μg Hydrotalcite
Groupe G : 10 μg de VR-HA + 50 μg Hydrotalcite
Groupe H : 50 μg de VR-HA + 250 μg Hydrotalcite
ANALYSE Les IgG totales anti-HA ont été dosées individuellement pour les groupes A à H. On a évalué par ELISPOT le nombre de cellules sécrétrices d'IFN-γ après stimulation ex vivo avec un peptide présenté par le MHC de classe 1 spécifique de HA pour chaque souris des groupes A à H.
La méthode d'analyse de la réponse cellulaire est présentée brièvement ci-après :
Un anticorps spécifique de la cytokine à détecter (réf 18181D Pharmingen pour l'anti-IFN- γ) a été incubé toute la nuit à 4°C dans des plaques à 96 puits comportant un fond en nitrocellulose. Les plaques ont ensuite été saturées avec du milieu de culture durant 1 h à 37°C. Les splénocytes ont été stimulés in vitro par les peptides présentés par le MHC de classe 1 de la protéine HA (IYSTVASSLVL) du virus de la grippe ou de la protéine gag (contrôle négatif, AMQMLKETI) de HIV. Les peptides ont été utilisés à la seule concentration finale de 20 μg/ml. Des contrôles, négatif avec du milieu et positif avec de la ConA (10 μg/ml final), ont aussi été inclus. 3xl05 cellules spléniques ont été déposées dans chaque puits en triplicats en présence d'IL-2 murine à 20U/ml final (Boehringer) et incubées 18h à 37°C. Un anticorps anti-IFN-γ biotinylé (réf 18112D Pharmingen) a ensuite été ajouté et le complexe a été révélé par de la streptavidine - peroxidase (réf 7100-05 Southern biotech). Les spots ont été comptés à l'aide d'un lecteur Microvision. Les résultats obtenus sont illustrés sur la Figure 9 .
En ce qui concerne la réponse humorale, les tests ont été effectués de la manière décrite ci- après.
Les sérums des souris prélevés avant immunisation et après la 2eme injection (J35) ont été analysés par ELISA pour doser la présence d'IgG contre la souche de virus grippal A/PR8/34 (virus inactivé aux rayons ultra-violets et formol, adsorbé à 100 ng / puits). Un sérum de souris hyperimmun anti-A/PR8/34 dirigé contre l'antigène HA (appelé Te SouI/A/PR8/34) a été utilisé comme standard. Chaque sérum (standard ou échantillon) a été déposé en simplicat à des dilutions successives de raison 2 sur 12 cupules (ELISA réalisé robotiquement, Robot ZYMARK). Le conjugué anti-IgG de souris (Jackson, réf 115-036- 062) a été utilisé au 1/30000 .
Expression des résultats :
Les titres IgG des sérums échantillons ont été calculés par rapport au sérum standard avec la méthode de calcul CodUnit. Ils sont exprimés en logto.
Le titre IgG arithmétique du sérum standard grippe a été fixé à 41636 Unités Arbitraires
(UA)/ml.
Les résultats obtenus sont illustrés sur la Figure 10
Ces résultats montrent clairement l'effet adjuvant du composé selon l'invention, à la fois vis-à-vis de la réponse CD8 mesurée par ELISPOT IFN-γ , mais aussi vis-à-vis de la production d'immunoglobulines, et notamment d'immunoglobulines spécifiques de l'antigène administré.
De manière similaire, on a réalisé des essais avec un plasmide comprenant de l'ADN codant pour les antigènes gag, pol, nef et syn du virus du SIDA ; la réponse cellulaire spécifique du peptide Gag ou de Pol a ensuite été mesurée. De même que dans le cas de la grippe, on a pu voir un net effet adjuvant du compose selon l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition vaccinale comprenant au moins un antigène caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un adjuvant de type hydrotalcite.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'antigène est un antigène sous-unitaire.
3. Composition vaccinale selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'antigène est une fraction d'ADN codant pour un antigène vaccinal.
4. Adjuvant vaccinal comprenant au moins un composé de type hydrotalcite.
5. Adjuvant vaccinal selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend le composé ayant la formule suivante : Mg6Al2CO3(OH)i6.4H2O qui a subi une décarbonatation.
6. Utilisation d'un adjuvant vaccinal selon une des revendications 4 à 5, pour la fabrication d'un médicament susceptible d'induire une réponse de type TH2 vis-à-vis d'un antigène.
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