WO2002103360A1 - Methode d'analyse d'une proteine apparaissant dans une cellule ou d'une substance interagissant avec la proteine - Google Patents

Methode d'analyse d'une proteine apparaissant dans une cellule ou d'une substance interagissant avec la proteine Download PDF

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Terumi Nakajima
Hideo Naoki
Akikazu Yasuda
Keiko Iwasa
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Definitions

  • the present invention provides a method for evaluating, identifying, and analyzing the structure of a substance that interacts with a protein present in cells of an organism, and a substance that interacts with a specific protein in a cell of an organism. It relates to a method for determining the presence of a protein.
  • Intracellularly In the cell surface or intracellularly (in this specification, both are sometimes simply referred to as “intracellularly"), there is a role as a receptor (sometimes referred to as “receptor” in this specification), and ion channels.
  • the bioassay method using a protein whose activity is known has been common, but the bioassay method has at least two problems.
  • MAL DI-TOF MS matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry
  • capillary HPL CZMS and capillary HPL C / MS / MS online capillary reversed-phase high-performance liquid chromatography with mass spectrometric detection
  • This tool provides excellent information on the molecular weight of the peptide in the sample, and the MS / MS format allows the peptide to fragment, generate cleavage ions, and deduce its amino acid sequence.
  • the present inventors have already developed a method for directly identifying the chemical structure of a substance present in a biological tissue or cell using MALD I-TOF MS, and have filed an application as Japanese Patent Application No. 2000-060754.
  • the present invention has been completed as a result of intensive research to expand the application range of the above-mentioned application.
  • the present invention determines the presence of this protein or the presence of a substance that interacts with the protein by using a protein present in the cell membrane or in the cell and a substance that interacts with the protein.
  • Fig. 1 is a chart showing the results of MALD I-TOF-MS measurement of the ligand (hANP) -bound membrane fraction prepared using cells expressing GC-A, a receptor for hANP, in Example 1. is there.
  • FIG. 2 is a chart showing the results of MALD I-TOF-MS measurement of a ligand (hANP) -bound membrane fraction prepared using blank cells having no expression of GC-A in Example 1.
  • Fig. 3 shows MALD I-TOF of the ligand-bound membrane fraction prepared using ligand (a peptide mixture consisting of four peptides containing hANP) and GC-A-expressing cells in Example 2. — A chart showing the results of MS measurement.
  • Figure 4 shows MALD I-TOF-MS measurement of the ligand-bound membrane fraction prepared using the ligand (a peptide mixture consisting of four peptides containing hANP) and blank cells in Example 2. It is a chart showing the results.
  • FIG. 5 is a chart showing the results of MALD I-TOF-MS measurement of only the peptide mixture used in Example 2.
  • the cell when a known protein is present in a cell membrane or in a cell, the cell is brought into contact with an unknown test substance, and the test substance is adsorbed, bound, or associated with the cell. Interact in form.
  • cells or cell sections for example, cell membranes
  • the second embodiment of the method of the present invention uses a known substance, for example, a ligand for a specific receptor, and the presence of an unknown protein existing in a cell membrane or in a cell, contrary to the first embodiment.
  • the cell containing the unknown protein is brought into contact with a known substance, and the known substance is adsorbed, bound, or associated with the cell.
  • the known substance is adsorbed, bound, or associated with the cell.
  • amino acid sequence of a protein whose presence has been confirmed can also be determined by the method of the present invention.
  • ligands acting on various receptors expressed not only on the cell membrane but also on the nuclear membrane and the mitochondrial membrane are purified in a state of being adsorbed to the membrane, and the ligand-bound cell membrane is subjected to laser beam irradiation.
  • laser beam irradiation only the ligand can be directly ionized, and the ligand can be analyzed by mass spectrometry.
  • Receptors include so-called peptide hormone receptors, ion channels, transporters, and antibodies expressed on lymphocytes, macrophages, and the like.
  • the ligand includes not only various natural physiologically active substances such as peptides, amino acids, amines and steroids but also synthetic compounds acting as ligands. Therefore, this method is effective as a means for searching for an unknown ligand that interacts with such a receptor, and can also be used for searching for a receptor whose function is unknown on a cell membrane.
  • Mass spectrometry is used for analysis system, for example, if the cell number 1 0 4 -1 0 5 content of cell membrane fraction Cells, 2 mm X 2 mm thick if tissue sections 0. 1 mm ultrafine It can be analyzed with a large amount of sample, and in a short time, the molecular weight and the type of molecule (by peptide, protein, steroids, lignans, catechins, sugars, etc., hereinafter referred to as “chemical species”), and Information on molecules such as the structure of the molecules can be obtained at the same time. That is, if the MA LDI-TOF type is used as a mass spectrometer, the molecular weight of the ligand is measured. In addition, using the molecule-related ions as precursor ions / —co 1 umn LC-ESI—QTOF—MS / MS analyzer makes it possible to analyze the chemical species and structure of the adsorbed molecules. .
  • the method of the present invention can be widely applied to not only a combination of a receptor and a ligand but also any substance that interacts with a protein in some form. These interactions include, when the protein is an ion channel, a transport protein, an antibody, an enzyme, or the like, an action on these. Substances having such an action include antigens for antibodies, substrates for enzymes, or activators or inhibitors.
  • the present invention will be described by taking an example of detecting and identifying a ligand for a cell that expresses a known receptor.
  • Known cells expressing a known receptor are cultured to express the receptor.
  • the cultured cells are used as sample cells and treated as follows. For comparison, allogeneic cells not expressing the receptor were used.
  • isolated cells such as tissue cells from organ tissues, lymphocytes, and monocytes in the abdominal cavity can also be used.
  • Samples cells suitable number for example 1 0 3 to 1 0 5, preferably 1 0 4 to 1 0 qs five in distilled water, e.g. 1 0 0-8 0 0 1
  • 3 at room temperature for 3 The cells are disrupted by incubating for 0 minutes, preferably for 5-20 minutes, and the cell membranes are sedimented by centrifugation or separated by filtration, washed with distilled water and centrifuged or filtered again. Then, the cytoplasm is removed to obtain a receptor-expressing cell membrane fraction.
  • a substance that has the effect of preventing nonspecific adsorption of a substance sufficient to coat the nonspecific adsorption portion of the membrane fraction on the obtained membrane fraction for example, a 1 pmo 1Zz1 albumin (BSA) solution
  • BSA 1 pmo 1Zz1 albumin
  • a ligand for example, 10 pmo11 ligand solution
  • 1001 of a ligand for example, 10 pmo11 ligand solution
  • the mixture is added at room temperature for 3 to 30 minutes, preferably 5 to 30 minutes. Incubate for ⁇ 20 minutes. Then wash with distilled water Washing by washing and centrifugation (or filtration) is repeated twice or more, preferably 4 to 5 times, to remove excess ligand-unadsorbed fraction.
  • distilled water for example, 5 to 201
  • An appropriate amount of distilled water for example, 5 to 201, is added to the obtained ligand-adsorbed cell membrane, and suspended at Vo1tex. Dispense 0.5 to 31 of the suspension into a MALD I plate and air dry. Add ⁇ -cyano-14-hydroxycinnamic acid (aCHCA) matrix solution and measure MALD I-T ⁇ F-MS. By performing this measurement similarly for cell membranes that do not express a receptor for comparison and comparing the results, the ligand bound to a known receptor can be identified using the molecular weight as an index. The molecular ion associated with the laser used for the analysis was used as the precursor ion. — Co 1 umn LC— ES I—QTOF— MSZMS analyzer can be used to analyze the chemical species and structure of the adsorbed molecules. It is possible.
  • a protein existing on the cell surface or in a cell or a substance interacting with the protein can be detected, identified or analyzed by the following steps.
  • a substance interacting with a known protein existing on the cell surface or in a cell can be screened by a method comprising the following steps.
  • test substance is a substance that interacts with the protein. Then, by identifying the substance, a substance that interacts with a known protein present on the cell surface or in the cell can be screened and identified.
  • a cell or tissue expressing a receptor that interacts with a known ligand can be screened by the following method.
  • the mass spectrum obtained by (1) was compared with the mass spectrum obtained by performing only the steps after (2) without contacting with the ligand of (1), and the former increased the amount of ligand. In such a case, it is a method of determining that the receptor interacting with the ligand is present in the tissue or the cell.
  • Example 1 Binding experiment between human atrial natriuretic peptide (hereinafter referred to as "hANP”) and hANP receptor GC-A
  • Cultured cells used were CHOZGC-A, a receptor expressing cell, ie, CHO cells (Chinese hamster ovary cells) expressing hANP receptor GC-A, and CHO host cells for blanks. F—MS Preparation was performed up to the measurement sample.
  • albumin membrane fraction To the obtained albumin membrane fraction was added 10 1 pmo 11 hANP aqueous solution 100 1 and incubated at room temperature for 10 minutes. The suspension was centrifuged, and the obtained pellet was further washed with 5001 of distilled water and centrifuged again to obtain a ligand (hANP) -bound membrane fraction.
  • hANP ligand
  • hANP was detected about three times more in the GC-A expressing cells (FIG. 1) than in the blank cells (FIG. 2). From this, it can be determined that hANP interacts with GC-A receptor Yuichi.
  • the albumin-coated membrane was prepared in the same manner as in Steps 1 and 2 of Example 1. (CHOZGC-A and CHO host cells).
  • albumin membrane fraction a peptide mixture solution, i.e., hANP of 10 pmo11, angiotensin I of 10 pmo1 / 1, substance P (SP) of lOpmolZl and 10 pmo1 100/1 mixed aqueous solution of melanocyte stimulating hormone (K-MSH) in 1 / ⁇ 1 was added and incubated at room temperature for 10 minutes. The suspension was centrifuged, and the resulting pellet was further washed with 5001 of distilled water and centrifuged again to obtain a ligand-bound membrane fraction.
  • hANP of 10 pmo11
  • angiotensin I 10 pmo1 / 1
  • SP substance P
  • K-MSH melanocyte stimulating hormone
  • MALD I—TOF—MS measurement was performed in the same manner as in step 4 of experiment 1. The results are shown in FIG. 3 (for the expression of the GC-A receptor) and in FIG. 4 (for the blank without the expression of the GC-A receptor). For comparison, peptide mixture (10 pmol / l hANP, 10 pmol / ⁇ 1 angiotensin I, 10 pmol / l SP, 10 pmo 1/1 ⁇ -MS H) 1 l ⁇ MALD I-TOF-MS measurement was performed for only 1 (Fig. 5).
  • hANP bound to the GC-A receptor-expressing cell membrane fraction at least 5 times more selectively than the other three peptides. From this, it can be determined that only hANP interacts with the GC-A receptor, and other angiotensin I, substance P, and ⁇ -MSH do not interact.
  • the cell when a known protein is present in a cell membrane or in a cell, the cell is brought into contact with an unknown test substance to allow the test substance to interact with the cell in any form such as adsorption, binding, or association. Let it work. In this state, cells or cell sections (eg, cell membranes) are purified, and the presence of the test substance is confirmed using MALD I-TOF MS to determine whether it interacts with a known protein. it can.
  • cells or cell sections eg, cell membranes
  • a known substance such as a ligand for a specific receptor
  • the unknown substance existing in the cell membrane or in the cell is used.
  • the protein on which the known substance acts is converted to a cell membrane or It can be determined that it exists in the cell.
  • the amino acid sequence of a protein whose presence has been confirmed can also be determined by the method of the present invention.

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Description

明 細胞内に存在するタンパク質又は当該タンパク質と相互作用
する物質を分析する方法
[技術分野]
本発明は、 生物の細胞内に存在するタンパク質と相互作用する物質を評価、 同 定、 及び構造解析する方法、 並びに、 生物の細胞内における特定のタンパク質と 相互作用する物質を用いることにより、 当該タンパク質の存在を判定する方法に 関する。
[技術背景]
細胞表層又は細胞内 （本明細書では、 両者を併せて単に 「細胞内」 ということ もある） には、 レセプター （本明細書では 「受容体」 ということもある） として の役割や、 イオンチヤンネルとしての役割、 トランスポーターとしての役割、 抗 体としての役割、 酵素としての役割、 細胞内シグナル伝達に係る役割など、 生体 内において種々の役割を果たす、 各種の夕ンパク質が存在していることが知られ ている。 そして、 これらのタンパク質と相互作用をすることによって、 当該タン パク質の機能を活性化したり阻害したりする物質や、 抗体の抗原となる物質、 あ るいは酵素の基質となる物質が数多く存在することも知られている。 >:'
しかしながら、 こうした生物の細胞内に存在するタンパク質や、 当該タンパク 質と相互作用する物質は、 全容が解明された訳ではなく、 現在においても、 新た なタンパク質や、 各種の細胞内タンパク質と相互作用する物質の探索が世界中の 研究者によって精力的に行われている。
従来、 特定のタンパク質と相互作用する新規生理活性物質を天然界から探索す る場合には、 活性が既知のタンパク質を用いたバイオアツセィ法が一般的である が、 バイオアツセィ法には少なくとも 2つの問題点が含まれていた。 第一に、 生 理活性物質の精製段階において物質が消費されてしまうために、 構造決定するた めに十分な量の物質の確保には、 大量の出発成分及び成分を抽出するための天然 物 （生物を含む） が必要とされる。 第二に、 利用可能なバイオアツセィ法が限ら れており、 標準的バイオアツセィ法では多くの新規生理活性物質が未検出のまま となる可能性がある。
最近、 マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法 （MAL D I -TOF MS) が、 切断組織の小片からまたは単離単一細胞からのぺプチ ドプロファイルの直接分析に強力な手段となってきている（G a r d e nら， 1 996 ； D e Wi t hら， 1 997 ; Ga r d e nら， 1 998 ; Re d e k e rら， 1998)。 これらの実験において、 試料の非常に微小な領域を分 析することが可能であり、 そして生じたペプチドフィンガープリンティングは、 生物活性を持つぺプチドの生合成および発現を示す。
一方、 質量分析的検出を用いたオンラインキヤピラリー逆相高性能液体クロマ 卜グラフィー (キヤピラリー HPL CZMSおよびキヤピラリー HPL C/MS /MS) が現代の生物分析に利用可能である。 本手段は、 サンプル中のペプチド の分子量に対し優れた情報を提供し、 そして MS/MS方式は、 ペプチドを断片 化し、 開裂イオンを生じ、 そのアミノ酸配列を演繹するのを可能にする。
従来のバイオアツセィ法によらない、 細胞内に存在するタンパク質と相互作用 する物質をスクリーニングする新たな方法、 及び細胞内における特定のタンパク 質と相互作用する物質を用いて当該タンパク質の存在を判定する新たな方法の開 発が望まれていた。 しかも、 これらの方法としては操作が簡単で、 正確かつ速や かに判定が可能な方法が望まれていた。
[発明の開示]
本発明者らは、 既に、 MALD I— TOF MSを用いた、 生物の組織又は細胞 に存在する物質の化学構造を直接同定するための方法を開発し、 特願 2000— 060754号として出願した。 本発明は、 上記出願の応用範囲を拡大すべく鋭 意研究を続けた結果完成されたものである。 本発明は、 細胞膜又は細胞内に存在 するタンパク質と、 このタンパク質に対して相互作用する物質とを用いることに より、 このタンパク質の存在又はこのタンパク質に相互作用する物質の存在を判 定する方法を開発することに成功した。
[図面の簡単な説明]
図 1は、 実施例 1において、 h AN Pの受容体である GC— A発現細胞を使用 して調製したリガンド （hANP) 結合膜画分についての MALD I— TOF— MS測定結果を示すチャートである。
図 2は、 実施例 1において、 GC— Aの発現がないブランク細胞を使用して調 製したリガンド （hANP) 結合膜画分についての MALD I— TOF— MS測 定結果を示すチャートである。
図 3は、 実施例 2において、 リガンド （hANPを含む 4種のペプチドからな るペプチド混合液） と、 GC— A発現細胞とを使用して調製したリガンド結合膜 画分についての MALD I—TOF— MS測定結果を示すチヤ一トである。
図 4は、 実施例 2において、 リガンド （hANPを含む 4種のペプチドからな るペプチド混合液） と、 ブランク細胞とを使用して調製したリガンド結合膜画分 についての MALD I一 TOF— MS測定結果を示すチヤ一トである。
図 5は、 実施例 2で使用したペプチド混合液のみについての MALD I -TO F— MS測定結果を示すチャートである。
[発明の実施の態様]
本発明の方法の第 1の態様は、 細胞膜又は細胞内に既知のタンパク質が存在す る場合、その細胞と未知の被験物質とを接触させて被験物質を細胞に吸着、結合、 会合等の何らかの形態で相互作用させる。 この状態で細胞又は細胞の切片 （例え ば、 細胞膜等） を精製し、 MALD I一 TOF MSを用いて被験物質の存在量を 確認することによって既知のタンパク質と相互作用をするか否かを判定できる。 本発明の方法の第 2の態様は、 第 1の態様とは逆に既知の物質、 例えば、 特定 のレセプ夕一に対するリガンド等を用い、 細胞膜又は細胞内に存在する未知の夕 ンパク質の存在を判定する方法である。 この場合、 未知のタンパク質を有する細 胞と既知の物質とを接触きせて既知物質が細胞に吸着、 結合、 会合等の何らかの 形態で相互作用した場合、 その既知の物質が作用するタンパク質が細胞膜又は細 胞内に存在することが判定できる。
さらに、 存在が確認されたタンパク質について本発明の方法によって、 そのァ ミノ酸配列を決定することもできる。
本発明では、 例えば、 細胞膜のみならず、 核膜、 ミトコンドリア膜上などに発 現している各種のレセプターに作用するリガンド類は、 膜に吸着した状態で精製 し、 リガンドの結合した細胞膜をレーザービーム照射することにより、 リガンド のみを直接イオン化させ、 質量分析法でリガンドを解析することができる。
レセプターとしては、 所謂ペプチドホルモンレセプター、 イオンチャンネル、 トランスポーター、 さらには、 リンパ球、 マクロファージなどに発現している抗 体類等が挙られる。 一方、 リガンドは、 ペプチド、 アミノ酸、 ァミン、 ステロイ ド等の各種天然生理活性物質の他に、リガンドとして働く合成化合物も含まれる。 したがって、 この方法はこのようなレセプターに相互作用する未知のリガンドを 検索する手段として有効であり、 また、 細胞膜上の機能未知のレセプ夕一の検索 にも用いることができる。
解析システムに用いる質量分析法は、 例えば、 細胞であれば細胞数 1 0 4〜 1 0 5個分の細胞膜画分、 組織切片であれば 2 mm X 2 mm厚さ 0 . 1 mmの超微 量試料で解析可能であり、 且つ短時間で分子量、 分子の種類別 （ペプチド ·タン パク類、 ステロイド類、 リグナン類、 カテキン類、 糖類などの種類別、 以下 「化 学種」 という）、 及び分子の構造などの分子の情報を同時に得ることができる。即 ち、 質量分析計として MA L D I— T O F型を用いれば、 リガンドの分子量が測 定される。その上、その分子関連イオンを前駆イオンとして/ — c o 1 u m n L C一 E S I— Q T O F— M S /M S分析計を駆使すれば、 吸着分子の化学種、 及 び構造までを解析することが可能である。
これらの方法を組み合わせることにより、 新規な生理活性物質、 あるいは、 組 織由来の培養細胞に発現するレセプ夕一の存在を予測することも可能である。 特 にォーファンレセプ夕一とそのリガンドの発見に寄与できるばかりでなく、 新た な医薬品のスクリーニング手段、 疾病マーカ一探索としても有用である。 また、 本発明ではレセプターとリガンドとの組み合わせばかりでなく、 タンパ ク質と何らかの形態で相互作用する物質であれば、広く本発明方法を適用できる。 これらの相互作用とは、 タンパク質がイオンチャンネル、 トランスポー夕一、 抗 体、 酵素等の場合について、 これらに対する作用が挙られる。 このような作用を もつ物質としては、 抗体に対する抗原、 酵素に対する基質あるいは活性化又は阻 害物質がある。
既知のレセプターを発現する細胞に対するリガンドを検出、 同定する態様を例 にとつて、 本発明を説明する。
既知のレセプ夕一を発現する既知の細胞を培養してレセプ夕一を発現させる。 この培養細胞をサンプル細胞とし、 以下の通り処理する。 比較用には、 レセプタ 一を発現させていない同種の細胞を用いた。 本発明では、 このような既知のレセ プターを発現する培養細胞の他に、 臓器組織からの組織細胞、 リンパ球、 腹腔内 単球などの単離細胞も利用できる。
サンプル細胞を適当な数、 例えば 1 0 3〜 1 0 5個、 好ましくは 1 0 4〜1 0 5 個に蒸留水を適量、 例えば 1 0 0〜8 0 0 1を加え、 室温で 3〜 3 0分、 好ま しくは、 5〜2 0分間インキュベートすることにより細胞を破砕し、 遠心分離に よって細胞膜を沈殿させるか又はろ過によって細胞膜を分離し、 蒸留水で洗浄し て再度遠心分離又はろ過して、 細胞質を除去してレセプ夕一発現細胞膜画分を得 る。
得られた膜画分に膜画分の非特異的吸着部分をコートするに十分な物質の非特 異的吸着を妨げる効果のある物質、 例えば、 1 p m o 1 Z z 1のアルブミン （B S A) 溶液を 2 0 0〜5 0 0 1加えて分散させ、 室温で 3〜 3 0分、 好ましく は、 5〜2 0分間インキュベートして、 膜画分の非特異的吸着部分をアルブミン でコートする。 膜画分を遠心分離又はろ過によって集め、 蒸留水で洗浄して過剰 のアルブミンを除去する。
この洗浄アルブミンコート膜画分に、 レセプターに結合するのに十分な量のリ ガンド、 例えば、 1 0 p m o 1 1 リガンド溶液を 1 0 0 1加え、 室温で 3 〜3 0分、 好ましくは、 5〜2 0分間インキュベートする。 その後、 蒸留水で洗 浄し、 遠心分離 （又はろ過） する洗浄処理を 2回以上、 好ましくは 4〜5回繰り 返し、 過剰のリガンドの未吸着画分を除去する。
得られたリガンド吸着細胞膜に蒸留水を適量、 例えば 5〜20 1を加え、 V o 1 t e xで懸濁させる。 懸濁液 0. 5〜3 1を MALD I用プレートに分取 し風乾させる。 α—シァノ一4—ヒドロキシ桂皮酸 （aCHCA) マトリックス 溶液を添加し、 MALD I— T〇F— MSを測定する。 この測定を比較用のレセ プターを発現していない細胞膜についても同様に行って比較することにより、 既 知のレセプターに結合しているリガンドを分子量を指標に特定することができる 本発明では、 質量分析のために使用した、 レーザーによってイオン化された分 子関連イオンを前駆イオンとして — c o 1 umn LC— ES I—QTOF— MSZMS分析計を駆使すれば、 吸着分子の化学種、 構造までを解析することが 可能である。
本発明によれば、 細胞表層もしくは細胞内に存在するタンパク質又は当該タン パク質と相互作用する物質を下記の工程により、 検出、 同定あるいは解析するこ とができる。
(1) 細胞と、 当該細胞の表層もしくは細胞内のタンパク質と相互作用する物質 とを接触させ、 細胞に物質を相互作用させる工程、
(2) 細胞と物質とが相互作用した状態のままで細胞を精製する工程、
(3) 物質が相互作用した状態のままで精製された細胞にレーザーを照射して当 該物質を直接イオン化させる工程、 及び
(4) イオン化した物質を質量分析法で分析する工程、
からなる方法により、 上記目的を達成できる。
また、 本発明は、 下記工程からなる方法により、 細胞表層又は細胞内に存在す る活性が既知のタンパク質に対し、 当該既知タンパク質と相互作用する物質をス クリーニングすることができる。
(1) 既知のタンパク質の存在が知られている細胞に、 被験物質を接触させて相 互作用させる工程、
(2) 被験物質と相互作用した細胞又はその画分を精製する工程、 (3) 精製した細胞又はその画分にレーザーを照射して、 細胞と相互作用した物 質を直接イオン化させる工程、 及び
(4) イオン化した物質を質量分析法で分析する工程、
により得られたマススぺクトルと、 当該タンパク質が存在していないことが明ら かな細胞を用いて （1) ないし （4) の工程を実施して得られたマススペクトル とを比較することにより、 前者の方が被験物質の量が増加している場合に、 当該 被験物質は当該タンパク質と相互作用をする物質であると判定できる。 そして、 当該物質を同定することにより、 細胞表層又は細胞内に存在する既知夕ンパク質 と相互作用する物質をスクリーニングし、 同定することができる。
更に本発明では、 下記の方法により、 例えば、 既知のリガンドと相互作用する レセプターの発現細胞又は発現組織をスクリーニングすることができる。
(1) 既知のリガンドを、 当該リガンドに対するレセプ夕一の有無を確認しょう とする組織又は細胞と接触させ相互作用させる工程、
(2) リガンドを接触させた組織又は細胞を精製する工程、
(3) 精製した組織又は細胞にレーザ一を照射して存在するリガンドを直接ィォ ン化させる工程、 及び
(4) イオン化したリガンドを質量分析法で分析する工程、
により得られたマススペクトルと、 （1)のリガンドとの接触を行わないで、 （2) 以降の工程のみを行ったマススぺクトルとを比較して、 前者の方がリガンドの量 が増加している場合に、 当該組織又は細胞には当該リガンドと相互作用をするレ セプターが存在すると判定する方法である。
以下に実施例により本発明を更に詳細に説明する。
[実施例 1] ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド （以下 「hANP」 という） と、 h ANP受容体 GC— Aとの結合実験
培養細胞はレセプター発現細胞として CHOZGC— Aすなわち、 h ANP受 容体 GC— Aを発現させた CHO細胞 （Chinese hamster ovary cell)、 ブランク 用として CHOホスト細胞を用い、 以下同様の方法で MALD I— TO F— MS 測定サンプルまで調製を行つた。
ステップ 1. 膜画分の調製
7. 5 X 105個の培養細胞 （GC— A発現およびブランク用細胞）に蒸留水 5
00 1を加え、 室温で 10分間インキュベートした。 この懸濁液を遠心分離し ペレツトを得た。 このペレツトにさらに蒸留水 500 1を加え、 ふたたび遠心 分離、 上清を除去し膜画分を得た。
ステップ 2. アルブミン被覆
得られた膜画分に 1 pmol/^ 1のアルブミン水溶液 500 1を加え、室温 で 1 0分間インキュベートした。 この懸濁液を遠心分離し、 得られたペレットに さらに蒸留水 50 0 Iを加えふたたび遠心分離しアルブミン被覆膜画分を得た。 ステップ 3. リガンド （hANP) との結合
得られたアルブミン膜画分に 10 pmo 1 1の hANP水溶液 100 1を 加え、 室温で 10分間インキュベーションした。 その懸濁液を遠心分離し、 得ら れたペレツトをさらに蒸留水 500 1で洗浄、ふたたび遠心分離しリガンド（h ANP) 結合膜画分を得た。
ステップ 4. MALD I一 TO F— MS測定
得られたリガンド結合膜画分に蒸留水 10 1を加え懸濁させた。 その懸濁液 1 n 1を分析用プレートに分取し風乾させた。 次に α—シァノー 4ーヒドロキシ 桂皮酸 （α— CHCA) 飽和溶液 （メタノール：水 = 1 ： 1、 0. 1 %トリフル ォロ酢酸） 1 1を添加し、 MALD I— TOF— MS (Voy a g e r E l
1 t e) を測定した。
その結果、 図 1、 図 2に示すように GC— A発現細胞 （図 1) の方がブランク 細胞 （図 2) に対して約 3倍多く hANPが検出された。 このことから、 hAN Pが GC— Aレセプ夕一と相互作用していると判断できる。
[実施例 2 ] 選択性実験
ステップ 1. 膜画分の調製およびステップ 2.アルブミン被覆
実施例 1のステップ 1.およびステップ 2.と同様の方法でアルブミン被覆膜画 分 （CHOZGC—Aおよび CHOホスト細胞） を得た。
ステップ 3.リガンド（ぺプチド混合物） との結合
得られたアルブミン膜画分に、 ペプチド混合液、 すなわち 1 0 p m o 1 1 の hANP、 10 pmo 1 / 1のアンジォテンシン I、 l O pmo l Z lの サブスタンス P (S P) および 1 0 pmo 1 /〃 1のメラニン細胞刺激ホルモン ( K -MSH) 混合水溶液 100 1を加え、 室温で 10分間インキュベートし た。 その懸濁液を遠心分離し、 得られたペレツトをさらに蒸留水 500 1で洗 浄、 ふたたび遠心分離しリガンド結合膜画分を得た。
ステップ 4. MALD I— TO F— MS測定
実験 1. のステップ 4. と同様にして MALD I— TOF— MS測定を行った。 結果を図 3 (GC— Aレセプターが発現したもの） 及び図 4 (GC— Aレセプタ 一が発現していないブランクのもの） に示した。 また、 比較のためペプチド混合 液 （1 0 pmo l / lの hANP、 10 pmol/^1のアンジォテンシン I、 10 pmo l / lの S P、 10 pmo 1/ 1の α—MS H) 1 ιι 1のみについ て MALD I—TOF— MS測定を行った （図 5)。
その結果 h AN Pは他の 3種のペプチドに比べ 5倍以上選択的に G C— Aレセ プター発現細胞膜画分に結合していることが判明した。 このことから、 GC— A レセプタ一には hANPのみが相互作用し、 他のアンジォテンシン I、 サブスタ ンス P、 α-MSHは相互作用しないことが判定できる。
[産業上の利用可能性]
本発明の方法は、 細胞膜又は細胞内に既知のタンパク質が存在する場合、 その 細胞と未知の被験物質とを接触させて被験物質を細胞に吸着、 結合、 会合等の何 らかの形態で相互作用させる。 この状態で細胞又は細胞の切片 （例えば、 細胞膜 等）を精製し、 MALD I— TOF MSを用いて被験物質の存在量を確認するこ とによって既知のタンパク質と相互作用をするか否かを判定できる。
本発明の方法の別の態様では、 上記の場合とは逆に既知の物質、 例えば、 特定 のレセプ夕一に対するリガンド等を用い、 細胞膜又は細胞内に存在する未知の夕 ンパク質の存在を判定する方法である。 この場合、 未知のタンパク質を有する細 胞と既知の物質とを接触させて既知物質が細胞に吸着、 結合、 会合等の何らかの 形態で相互作用した場合、 その既知の物質が作用するタンパク質が細胞膜又は細 胞内に存在することが判定できる。 さらに、 存在が確認されたタンパク質につい て本発明の方法によって、 そのアミノ酸配列を決定することもできる。
これらの方法は操作が簡単で、 正確かつ速やかに判定が可能であり、 広い応用 範囲が期待できる。

Claims

請求の範囲
1. 細胞表層もしくは細胞内に存在するタンパク質又は当該タンパク質と相互 作用する物質を同定あるいは解析するための方法であって、
(1) タンパク質を有する細胞と当該タンパク質と相互作用する物質とを接触さ せ、 細胞に物質を相互作用させる工程、
(2) 細胞と物質とが相互作用した状態のままで細胞を精製する工程、
(3) 物質が相互作用した状態のままで精製された細胞にレーザーを照射して物 質を直接イオン化させる工程、 及び
(4) イオン化した物質を質量分析方法で分析する工程、
からなる方法。
2. 細胞表層もしくは細胞内に存在するタンパク質が、 レセプター、 イオンチ ヤンネル、 トランスポーター、 抗体、 酵素などとしての生理活性を示すタンパク 質である請求項 1に記載の方法。
3. タンパク質と相互作用する物質が、 当該タンパク質のリガンド、 抗原又は 基質である請求項 1又は 2に記載の方法。
4. タンパク質と相互作用する物質が、 生体内物質である、 請求項 1又は 2に 記載の方法。
5. 生体内物質が分子量 500から 3000程度である、 請求項 4に記載の方 法。
6. タンパク質と相互作用する物質が、 非生体内物質である、 請求項 1又は 2 に記載の方法。
7. 質量分析法が、 マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分 析法 （MALD I—TOF MS) である、 請求項 1ないし 6のいずれかに記載 の方法。
8. 質量分析法が、 マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分 析装置 （MALD I— TOF MS) 及びマイクロカラム液体クロマトグラフィ 一エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間タンデム型質量分析装置 一 c o 1 umn L C一 E S I— QTOF— MS/MS) を用いた方法である、 請求 項 7に記載の方法。
9. 細胞表層又は細胞内に存在する活性既知のタンパク質と相互作用する物質 をスクリ一ニングする方法であって、
(1) 当該タンパク質の存在が知られている細胞に、 被験物質を接触させて相互 作用させる工程、
(2) .被験物質と相互作用した状態で細胞を精製する工程、
(3) 精製された細胞にレーザーを照射して細胞と相互作用する物質を直接ィォ ン化させる工程、 及び
(4) イオン化した物質を質量分析法で分析する工程、
により得られたマススぺクトルと、 当該タンパク質が存在していないことが明ら かな細胞を用いて （1) ないし （4) の工程を実施して得られたマススペクトル とを比較することにより、 当該夕ンパク質と相互作用をする物質の存在を判定す る方法。
10. 既知のタンパク質が、 レセプタータンパク質 （受容体タンパク質） であ る、 請求項 9に記載の方法。
1 1. レセプ夕一の発現細胞が、 分離確立された細胞株を用いる方法である、 請求項 10に記載の方法。
12. レセプ夕一の発現細胞が、 当該レセプターを人為的に強制発現させた細 胞を用いる方法である、 請求項 10に記載の方法。
13. レセプターの発現細胞が、 ォーファンレセプター発現細胞を用いる方法 である、 請求項 10に記載の方法。
14. 活性既知の物質と相互作用するタンパク質の発現細胞又は発現組織をス クリーニングする方法であって、
(1) 当該物質を、 タンパク質の有無を確認しょうとする組織又は細胞と接触さ せて相互作用させる工程、
(2) 物質を接触させた組織又は細胞を精製する工程、
(3) 精製した組織又は細胞にレーザーを照射して存在する物質を直接イオン化 させる工程、 及び
(4) イオン化した物質を質量分析法で分析する工程、
により得られたマススペクトルと、 （1) の物質との接触を行わないで、 （2) な いし （4) の工程のみを実施して得られたマススペクトルとを比較することによ り、 当該物質と相互作用をするタンパク質の存在を判定する方法。
1 5. 前記物質がリガンドである、 請求項 14に記載の方法。
16. タンパク質がレセプタータンパク質である、 請求項 14又は 1 5に記載 の方法。
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