WO2002099437A1 - Methode d'analyse de structure de proteines par spectroscopie de masse - Google Patents

Methode d'analyse de structure de proteines par spectroscopie de masse Download PDF

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WO2002099437A1
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carrier
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molecular weight
mass spectrometry
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Xinchun Shen
Takanori Kigawa
Shigeyuki Yokoyama
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Riken
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing the structure of a protein, and more particularly, to a method for rapidly synthesizing and Z- or limited-degrading a protein of a multi-sample, and identifying the molecular weight of the protein and / or its domain by mass spectrometry.
  • Proteins with large molecular weight are often composed of multiple functional domains, and to analyze the three-dimensional structure of these proteins, a small region is required for each partial amino acid sequence that constitutes each domain. It is necessary to analyze separately.
  • structural protein domain boundaries have been identified by limited degradation by proteases because the junctions between the domains are exposed and are likely to be substrates for proteases (Barwell). Chem. 270, 20556-205, 1995, Cohen et al., Protein Sci., 4, 1088-1099, 1995, and Pfuetzner et al., J. Biol. Chem., 272. 430-434, 1997).
  • Mass spectrometry is a technique typically used to determine and determine the analyte's molecular weight by volatilizing and ionizing the analyte and exposing the ionized analyte to an electric and / or magnetic field. Analyzing the data to measure the mass-to-charge ratio of a particular analyte ion, accelerating toward the detector. In addition, it is known to use matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) technology to volatilize and ionize biomolecules in a mass spectrometer (Karas , M. and Hillenka Immediately, F., Anal. Cem., 60, 2299-23 01, 1988).
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • This technique involves surrounding biomolecules in a specific matrix material.
  • the laser beam is matched to the frequency absorbed by the matrix and targeted on the matrix material. Lasers deliver enough energy to volatilize a small portion of the matrix material. A small number of analyte molecules are thus sent into the gas phase with the matrix material in the mass spectrometer.
  • MALDI the analysis of biomolecules by mass spectrometry did not utilize techniques that were sufficiently quiet to volatilize intact biomolecules without any degradation or fragmentation. It was very difficult, if not impossible.
  • MALDI technology provides an advantageous technology for volatilizing biomolecules.
  • the cell-free protein synthesis system which is one of the means to efficiently express many proteins, various improvements such as the introduction of dialysis methods have resulted in the production of proteins on the order of milligrams in a few hours.
  • the cell-free protein synthesis system has the following features as compared to in vivo protein synthesis using conventional Escherichia coli and animal cells. (1) A protein coded for a desired gene to be expressed can be directly synthesized from linear DNA without cloning the gene into an expression vector. (2) All reactions such as PCR and cell-free protein synthesis reaction can be completed in one day using a 96-well plate.
  • the affinity-purified protein synthesized in a cell-free protein synthesis system could not be directly subjected to limited degradation by a protease or the molecular weight measured by mass spectrometry.
  • the protein sample eluted from the 21st carrier contains a high concentration of dimidazole in the salt solution, which inhibits enzyme reactions by proteases and MALDI analysis.
  • it was necessary to exchange the buffer solution of the protein solution by precipitation with acetone or TCA, gel filtration, dialysis or ultrafiltration.
  • the present invention provides a method for rapidly processing a large number of samples by streamlining such a series of operations of protein synthesis, purification, and analysis, and in particular, a method for efficiently measuring the molecular weight of a protein by mass spectrometry.
  • the purpose is to provide.
  • the present inventors have synthesized proteins by a cell-free synthesis system using type I DNA amplified by PCR from a cDNA library, and used for affinity purification on a filter plate. Mass spectrometry of the protein bound to the 21 carrier (on-bead) revealed that the molecular weight could be measured surprisingly accurately. Furthermore, the inventors have found that not only can proteins be limitedly degraded by on-beads, but also that protein domains can be identified very quickly by simultaneously processing multiple samples. Was completed.
  • the carrier that specifically binds to the tag sequence is a carrier that carries at least one selected from an antibody, a binding protein, a receptor, and a portion including a binding site thereof, or a metal atom, an amino acid, a peptide, It is a carrier that carries at least one selected from oligonucleotides and heterocyclic compounds.
  • the mass spectrometry is a time-of-flight matrix-assisted laser-desorption ionization (MALDI-TOF).
  • MALDI-TOF time-of-flight matrix-assisted laser-desorption ionization
  • the present invention provides a method for identifying a protein domain, comprising:
  • the domain structure of the protein is improved. It can be accurately identified.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an outline of a high-throughput limited decomposition system according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a method of preparing a ⁇ -type DNA by PCR to express a histidine-tagged Ras protein in a cell-free protein synthesis system.
  • FIG. 3 shows the results of analysis of a: Ras protein in an on-bead state and b: Ras protein desalted by UF membrane by MALDI-TOF mass spectrometry.
  • Fig. 4 shows a: Ras protein without trypsin.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of analysis by MALDI-T0F-mass spectrometry of a protein degraded by addition and addition of b: 8 ng / l trypsin.
  • the protein whose structure can be analyzed by the method of the present invention may be any of a naturally occurring protein or an artificially synthesized protein existing in nature, and various modified proteins.
  • those synthesized by a cell-free protein synthesis system using a genomic gene or a nucleic acid derived from cDNA are used.
  • a cell-free protein synthesis system is a system that synthesizes proteins in a test tube using a cell extract. Such a synthesis system reads cell information from mRNA and synthesizes proteins on a liposome. Any system may be used, or a system containing both a cell-free transcription system and a cell-free translation system that synthesizes RNA using DNA as type II.
  • DNA is used as ⁇ type, a large number of ⁇ type DNAs can be rapidly and simultaneously processed by the amplification reaction in a test tube such as PCR without the complicated operation of cloning which has been required conventionally. Can be prepared.
  • eukaryotic or prokaryotic cell extracts containing components required for protein synthesis such as ribosomes and RNA can be used.
  • the eukaryotic cell and the prokaryotic cell any of conventionally known ones can be used, and specific examples thereof include Escherichia coli, thermophilic bacteria, wheat germ, egret reticulocytes, mouse L cells, and ale. Ritz ascites cancer cells, HeLa cells, CHO cells, budding yeast, etc., especially those derived from Escherichia coli (eg, Escherichia coli S30 cell extract) or those derived from highly thermophilic bacteria (Thermus termopilus) Is desirable in that a high synthesis amount is obtained.
  • Escherichia coli eg, Escherichia coli S30 cell extract
  • highly thermophilic bacteria Thermus termopilus
  • the Escherichia coli S30 cell extract was prepared from Escherichia coli A19 (n let), BL21, BL21 star, BL21 codon plasmids and other methods known in the art (Pratt, JM et al., Transcription and translation-a practical approach, (1984) 179-209, Henes, BD and Higgins, S.L., edited by IRL Press, Oxford), or commercially available from Promega and Novagen may be used.
  • Such a cell extract may be a concentrate of each of the above cell extracts (hereinafter referred to as “enriched cell extract”) or an unconcentrated one (hereinafter referred to as “crude cell extract”). Higher protein synthesis can be obtained by using concentrated cell extracts.
  • a method for obtaining the concentrated cell extract can be performed by any means, for example, ultrafiltration, dialysis, PEG precipitation, or the like.
  • the composition of the cell-free protein synthesis system of the present invention includes, in addition to a crude cell extraction night such as E. coli S30 or a concentrated cell extract (10 to 90% by weight), a DNA or RNA ( mRNA, etc.), ATP (0.5-5 mM), GTP (0.05-1. OmM), CTP (0.05-1. OmM), UTP (0.05-1. OraM), buffers, salts, amino acids, RNa It can contain se inhibitors, antibacterial agents, RNA polymerase (when DNA is type II), tRNA, etc., if necessary.
  • a crude cell extraction night such as E. coli S30 or a concentrated cell extract (10 to 90% by weight
  • a DNA or RNA mRNA, etc.
  • ATP 0.5-5 mM
  • GTP 0.05-1. OmM
  • CTP 0.05-1. OmM
  • UTP 0.05-1. OraM
  • buffers salts, amino acids, RNa It can contain se inhibitors, antibacterial agents, RNA polymerase
  • ATP regeneration system polyethylene glycol (for example, PEG # 8000), 3 ', 5 ; -cAMP, folic acid (0.1 to 5), reducing agent (for example, 1 to 10 dithiothreitol), etc. are included. It is.
  • a buffer such as Hepes-KOH or Tris-OAc can be used as a buffer.
  • salts acetate (eg, ammonium salt, magnesium salt, etc.), glutamate, etc. can be used, and as antibacterial agents, sodium azide, ampicillin, etc. can be used.
  • RNA polymerase is added to the reaction system.
  • a commercially available enzyme such as T7 RNA polymerase can be used.
  • the regeneration system preferably includes a combination of creatine kinase (CK) of 0.02 to 5/1 and creatine phosphate (CP) of 10 to 100 mM, but is not limited thereto. What is the material In addition to the above, for example, a combination of 1-2 (M phosphoenolpyruvate (PEP) and 0.01-1 lg / l pyruvate kinase (PK)) can be used. Both PK and CK are enzymes that regenerate ADP into ATP, and require PEP and CP as substrates, respectively.
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • PK pyruvate kinase
  • any of the well-known techniques other than the batch method and the flow method can be applied.
  • ultrafiltration membrane method dialysis membrane method, and translation into resin.
  • Column chromatography method with immobilized type Spirin, A., et al., Meth. In Enzymol. 2117, 123-142, pp. 1993.
  • the tag is preferably synthesized as a fusion protein with a tag (repeated sequence. Any known tag sequence can be used. For example, a certain peptide sequence that can serve as an antigen, a histidine tag sequence, and a biotin-added sequence.
  • a system in which the target gene is integrated in frame with the GST (Glutathione S-Transferase) gene sequence and expressed in large amounts as a fusion protein in E. coli can be used.
  • the recombinant vector pGEX Vectors is available from Amersham Pharma. Commercially available from Shea Biotech.
  • a base sequence encoding a plurality of histidines before or after the target gene sequence it can be synthesized as a histidine / evening fusion protein.
  • the number of histidine residues in the histidine tag is 4 to 20, and preferably 6 to 10 histidine residues are added.
  • recombinant DNA in which a biotinylated peptide gene encoding a specific amino acid sequence is linked to a target protein can synthesize a biotinylated protein in Escherichia coli.
  • the method of biotinylation is described in JP-A-8-308578 and the like.
  • the carrier that specifically binds to the above protein may be a protein such as an antibody, a binding protein, a receptor, or a part thereof, and may be a carrier that carries a part involved in binding to an antigen or a ligand. Any can be used.
  • the antibody for example, an antibody against the above-mentioned GST can be used, and an anti-GST goat antibody and the like are commercially available (GST Detect ion Module, Amersham Almasia Biotech).
  • a binding protein such as avidin-streptavidin or the like can be used for the above-mentioned biotin, and a specific receptor for a specific label can also be used.
  • a carrier carrying a metal atom, an amino acid, a peptide, an oligonucleotide, a heterocyclic compound, a complex thereof, or the like can be used.
  • a carrier in which daryuthion, which is a substrate of the above-mentioned GST, is bound to a carrier via an epoxy bond, or a carrier on which a divalent metal ion having affinity for the above-mentioned histidine-ligand fusion protein is immobilized is commercially available ( For example, Ni-NTA agarose beads, QIAGEN, Germany).
  • the carrier is preferably a solid or insoluble material (eg, a material that can be separated from a protein mixture by filtration, precipitation, magnetic separation, or the like), and that has low nonspecific adsorption of proteins.
  • Beads eg, agarose, Sepharose, Sephadex, polystyrene, polyacrylamide, cellulose, Teflon (registered trademark), pore-control glass
  • thin films eg, cellulose, nitrocellulose polystyrene, polyester, polycarbonate, polyamide, nylon
  • Glass fibers, and flat carriers such as Teflon (registered trademark), glass plates, metal plates, silicon wafers, micro tie plates, and the like.
  • the target proteins are specifically bound by contacting the target proteins with a carrier that specifically binds them, for example, by mixing them in a solution.
  • bonds are non-covalent bonds, but in general, the biotin-streptavidin complex and the antigen-antibody interaction have a strong affinity, and therefore cannot be dissociated even with strong washing to separate them from impurities.
  • the carrier to which the target protein is bound can be recovered by any conventionally known method such as filtration, centrifugation, etc., after appropriate washing operation as necessary.
  • a multi-well filter plate such as a plate, multiple samples can be filtered and recovered simultaneously and rapidly. (Measurement of molecular weight)
  • the molecular weight of the protein bound to the carrier and recovered is measured.
  • Protein molecular weight can be measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), gel filtration chromatography (GPC), mass spectrometry (Mass Spectrome try), etc., but rapid and accurate molecular weight measurement For this purpose, mass spectrometry is particularly preferred.
  • mass spectrometry is particularly preferred.
  • mass spectrometers for ionizing and detecting their samples.For example, the ionization method is most widely used, the electron impact (EI) method, and the chemical ionization method (CI ), Field ionization (FI), field desorption (FD), and first atom bombardment (F AB).
  • a matrix assisted laser desorption / ionization (MALW) method is used.
  • MALW matrix assisted laser desorption / ionization
  • a sample is usually attached to a smooth metal surface, and desorbed into the gas phase by impinging a pulsed laser beam on the sample surface.
  • a time-of-flight mass spectrometer (Time-Of-Flight: T0F) separates ions according to their mass-to-charge ratio by measuring the time it takes for the generated ions to reach a detector.
  • T0F time-of-flight
  • the meter is particularly preferable for measuring the mass-to-charge ratio of an organic molecule having a large sensitivity shortage.
  • the type I DNA amplified by the PCR method can be used as it is to synthesize a desired tagged protein in 37 ° (:, 1 hour using, for example, an E. coli cell extract.
  • the mixture is transferred to a 96-L-fil plate and mixed with an affinity carrier that binds to the tag.
  • the desired tagged protein is recovered after the carrier binding step and the washing step, and is recovered.
  • Mass spectrometry can be performed using the protein bound to the carrier.
  • the protein bound to the carrier is subjected to a limited digestion treatment with the protease as it is, for example, by trypsinization in 10 mM Tris-HC1 buffer (PH 7.6). Is managed. Trypsin is known to hydrolyze peptide bonds at the C-terminal side (Lys-X, Arg-X) of basic amino acid residues such as lysine and arginine in proteins. Other proteases used for such limited degradation include cleavage of Glu-X by Stapylococcus V8 protease and cleavage of Tyr-X, Phe-X, Trp-X and the like by chymotrypsin. Limited-degraded proteins can be measured for molecular weight by mass spectrometry without any need for post-processing.
  • a cDNA clone 2B7 (GenBank Accession No. X59382, a genome of RIKEN, which is arbitrarily selected from a human c-Ha_Ras protein (GenBank Accession No. PO 1112) and a mouse full-length cDNA library) Provided by the Research Center for Science, the Genetic Structure Analysis Team, and Dr. Yoshihide Hayashizaki.)
  • the results of the study of the method of the present invention are described in detail below, but the present invention is limited to these examples. Not something.
  • type III cDNA in a cell-free protein synthesis system, plasmid pK7-Ras (see Kigawa et al., FEBS Lett., 442, 15-19, 1999) containing the human C-Ha_Ras protein gene was prepared. Two-step PCR amplification was performed as type ⁇ .
  • PCR two primers for amplifying DNA from the N-terminal coding region of the Ras protein: 5 'primer 1 (SEQ ID NO: 1) and 5' primer 2 (SEQ ID NO: 2)
  • 5 'primer 1 SEQ ID NO: 1
  • 5' primer 2 SEQ ID NO: 2
  • a reaction solution 20A having the composition shown in Table 1 was prepared and amplified according to the program shown in Table 2. did.
  • DNA polymerase (Boehringer Mannheim) 3500un its / ml 0.15 ⁇ 1
  • the E. coli S30 extract was prepared from E. coli BL21 according to the method of Zubay et al. (Annu. Rev. Genet., 7, 267-287, 1973).
  • a 96-well microplate was used for the protein synthesis reaction.
  • the PCR product for the expression of the His-tagged Ras protein was added to the solution with the composition shown in Table 4 below, and the Escherichia coli S30 extract was used.
  • the total volume of the reaction mixture was adjusted to 30 l, and His-Ras protein was synthesized at 30 ° C for 1 hour.
  • the liquid was removed by centrifugation at 500 xg for 3 minutes using a centrifuge CR21G and rotor R6S (both manufactured by Hitachi).
  • the agar-mouth beads on the filter were suspended in washing buffer A (50 mM NaCl, 300 mM NaC 15 mM imidazole, H8.0) 2001, shaken for 5 minutes, and the liquid was removed by the same centrifugation as described above. The same washing operation was repeated once more.
  • the agarose beads on the filter were suspended in washing buffer B (50 mM NaH2P (k: 300 mM Ml, 30 mM imidazole, pH 8.0) 2001), shaken for 5 minutes, and the liquid was removed by the same centrifugation as described above. Further washing with ⁇ Tris-HCl pH 7.6 was repeated three times. To the beads, ⁇ Tris-HCl pH 7.6 was added so that the beads volume became 50%, and the beads were sufficiently suspended.
  • FIG. 3a shows the result of similarly analyzing Ras protein which was eluted from agarose beads with 0.25M imidazole and then desalted using a UF membrane.
  • His-2B7 was purified using Ni-NTA agarose beads in the same manner as in Example 1.
  • the suspension 201 of agarose beads adsorbing His-2B7 was reacted at 30 ° C. for 120 minutes with or without trypsin.
  • the reaction solution containing the beads was immediately maintained at 2 to 4 ° C, and the MALDI-TOF-MS analysis was performed on the reaction solution.
  • Figure 4 shows the results. When trypsin was not added, only peaks (A +, A2 + ) derived from undegraded (molecular weight: 14549.5) were observed as shown in Fig. 4a, but the trypsin concentration was 8 ng / l.
  • the present invention enables limited degradation of proteins in an on-bead state.
  • the reaction solution containing these beads could be directly subjected to MALDI-TOF-MS analysis, and the site to be degraded could be estimated.
  • the present invention can be used for estimating the domain of a protein.
  • multiple samples can be processed at one time by this method, it is possible to increase the throughput of limited resolution and mass spectrometry of the product.
  • the method of the present invention it is possible to measure the molecular weight by limited digestion with a protease or mass spectrometry without changing the buffer solution of the protein purified by the affinity carrier. Moreover, since a series of operations such as protein synthesis, purification and analysis can be performed using a commonly used multi-sample screening plate, it is suitable for system automation. Such an efficient tongue The method of identifying protein and its domain structure is considered to play a significant role in promoting the study of structural genomics, which attempts to elucidate the typical three-dimensional structure of proteins in a comprehensive manner.

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Description

明 細 書 質量分析法によるタンパク質の構造解析方法 技術分野
本発明は、 タンパク質の構造解析方法に関し、 より詳しくは多検体のタンパク 質を迅速に合成及び Z又は限定分解し、 質量分析法によりタンパク質及び/又は そのドメインの分子量を同定する方法に関する。
背 -1：景： 技術
分子量の大きなタンパク質は、 複数の機能的ドメインから構成されている場合 が多く、 これらの夕ンパク質の立体構造を解析するためには各ドメインを構成す る部分的なアミノ酸配列ごとに、 小さな領域に分けて解析することが必要となる 。 従来よりこのような構造的なタンパク質ドメインの境界は、 ドメイン間の連結 部分が露出し、 プロテア一ゼの基質となりやすいことから、 プロテア一ゼによる 限定分解を行うことにより同定されている （Barwel lら、 J. Biol. Chem. 270巻 、 20556- 205顧、 1995年、 Cohenら、 Protein Sci.、 4巻、 1088— 1099頁、 1995 年、 及び Pfuetznerら、 J. Biol. Chem.、 272巻、 430-434頁、 1997年参照） 。 こ のようにして、 プロテア一ゼによるタンパク質の限定分解法は、 タンパク質ドメ インを単離してその機能を解析するだけでなく、 X線結晶解析や NMR分光法に よるタンパク質の立体構造を解析するために広く用いられている。 また、 近年、 タンパク質やそのドメインの構造解析方法として質量分析法 (Mass Spectrometry )が、 有力な手段となっている。
通常、 質量分析法は、 分析物をその分子量を測定して確認するのに使用される 技術であり、 分析物を揮発させイオン化し、 イオンを電場及び/又は磁場に曝す ことによりイオン化分析物を検出器に向かって加速し、 特定の分析物イオンの質 量対電荷の比率を測定するためにデータを分析する工程を含む。 さらに、 質量分 析計の中で生体分子を揮発化しイオン化するマトリクス支援レーザー脱離イオン 化法（Matrix - Ass is ted Laser Desorpt ion/Ionizat ion: MALDI)技術を使用するこ とが公知である (Karas, M.及び Hi l lenka即， F.， Anal. C em. , 第 60巻、 2299〜23 01頁、 1988年参照） 。 この技術は、 特定のマトリクス物質中で生体分子を包囲す ることを含む。 レーザ一·ビームはマトリクスが吸収する周波数に調和され、 マ トリクス物質上で標的化される。 レーザーは、 小部分のマトリクス物質を揮発さ せるのに十分なエネルギーを伝える。 少数の分析物分子は、 こうして質量分析計 内でマトリクス物質とともに気相中に送られる。 MALDIが開発される以前は、 質 量分析法による生体分子の分析は、 無傷の生体分子をいかなる分解又は断片化も させずに揮発させるのに十分に穩ゃかな技術が利用できなかったので、 不可能で ないにしても非常に難しかった。 MALDI技術は、 生体分子を揮発するのに有利な 技術を提供する。
一方、 生物のゲノム塩基配列の大規模解析により、 膨大な数の遺伝子が明らか にされ、 これらの遺伝子がコ一ドするタンパク質の構造や機能解明のためには、 タンパク質の発現、 精製、 限定分解などの全ての工程をハイスループット化する ことが望まれている。
多くのタンパク質を効率よく発現させる手段の一つである無細胞タンパク質合 成系については、 これまで透析法の導入など様々な改良が行われた結果、 数時間 でミリグラムオーダ一のタンパク質が得られるようになつている （Kigawaら、 FE BS Let t. , 442巻、 15— 19頁、 1999年、 及び特開 2000- 175695号公報参照） 。 従来 の大腸菌や動物細胞を用いた生体内でのタンパク質合成に比べ、 無細胞タンパク 質合成系は、 以下のような特徴を有する。 （1 ) 発現させたい所望の遺伝子にコ ードされたタンパク質を、 当該遺伝子を発現べクタ一にクローン化することなく 直鎖状の D N Aから直接合成することができる。 ( 2 ) P C Rや無細胞タンパク 質合成反応等の全ての反応を 9 6ゥエルプレートを用いて一日で完了することが できる。
従って、 無細胞タンパク質合成系で合成されるタンパク質に特定のタグ （標識 ) 配列を付けておけば、 このタグ配列を手がかりとして 9 6ゥエルプレー卜上で ァフィ二ティ一精製することが可能である。
しかしながら、 従来法においては、 無細胞タンパク質合成系で合成され、 ァフ ィニティー精製されたタンパク質を、 そのままプロテアーゼによる限定分解を行 つたり、 質量分析法により分子量測定することができなかった。 例えば、 ァフィ 二ティ一担体より溶出した夕ンパク質試料は高濃度の塩溶液ゃィミダゾールを含 んでいるため、 プロテアーゼによる酵素反応や、 MALDI分析を阻害する。 このた め、 アセトンや T C Aによる沈殿形成、 ゲルろ過、 透析又は限外ろ過等により夕 ンパク質溶液の緩衝液交換が必要であった。 これらの操作は、 手間や時間がかか り、 自動化を著しく困難にし、 また精製されたタンパク質を不溶化させてその後 の構造解析を困難にする場合もあった。
発明の開示
そこで、 本発明は、 このようなタンパク質の合成、 精製、 分析という一連の操 作を効率化して多検体の試料を迅速に処理し、 特に、 質量分析法により効率よく タンパク質の分子量を測定する方法を提供することを目的とする。
さらに、 このような方法を用いて未だ機能や構造が明らかでない多くのタンパ ク質のドメイン構造を効率よく同定してタンパク質の代表的な立体構造を網羅的 に解明することを目的とする。
上記課題に鑑みて、 本発明者らは c D N Aライブラリ一から P C R増殖した銬 型 D N Aを用いて、 無細胞合成系によりタンパク質を合成し、 フィルタープレー ト上でァフィ二ティー精製を行うに際し、 ァフィ二ティ一担体に結合した状態 （ オンビーズ） のタンパク質を質量分析したところ、 驚くべきことに精度良く分子 量が測定できることを見出した。 さらにオンビーズでタンパク質の限定分解を行 うことが可能であるだけでなく、 多検体を同時に処理することによつて極めて迅 速にタンパク質ドメインの同定ができることを見出し、 これらの知見に基づいて 本発明を完成した。
すなわち、 本発明の第一の視点において、 質量分析法によるタンパク質の分子 量同定方法において、
( a ) タグ配列と融合させたタンパク質を、 無細胞タンパク質合成系で合成す る工程、
(b ) 前記合成された融合タンパク質と、 前記タグ配列と特異的に結合する担 体とを接触させる工程、
( c ) 前記融合タンパク質と結合した前記担体を回収する工程、 及び
(d) 前記回収した担体に結合した状態の前記融合タンパク質を用いて、 質量 分析法により前記融合夕ンパク質の分子量を測定する工程、
を含むことを特徴とするタンパク質の分子量同定方法を提供する。
好ましい態様において、 前記タグ配列に特異的に結合する担体は、 抗体、 結合 タンパク質、 受容体及びそれらの結合部位を含む部分から選択される少なくとも 一種を担持した担体、 又は金属原子、 アミノ酸、 ペプチド、 オリゴヌクレオチド 及び複素環式化合物から選択される少なくとも一種を担持した担体であることを 特徴とする。
別の好ましい態様において、 前記質量分析法は、 飛行時間型マトリックス支援 レーザ一脱離イオン化法 (MALDI- T0F)であることを特徴とする。
本発明の方法を用いてタンパク質の分子量を同定することにより、 タンパク質 の一次構造又は高次構造に関する種々の情報、 例えば、 タンパク質の修飾、 タン パク質の構造変化又はタンパク質のドメイン構造の同定等を行うことができる。 本発明の別の視点において、 質量分析法によるタンパク質ドメインの同定方法 において、
( a ) タグ配列と融合させたタンパク質を、 無細胞タンパク質合成系で合成す る工程、
( b ) 前記合成された融合タンパク質と、 前記タグ配列と特異的に結合する担 体とを接触させる工程、
( c ) 前記融合タンパク質と結合した前記担体を回収する工程、
( d ) 前記回収した担体に結合した状態の前記融合タンパク質をプロテアーゼ により限定分解する工程、
( e ) 前記分解反応溶液を用いて質量分析法により、 前記融合タンパク質及び /又はその分解物の分子量を測定する工程、
を含むことを特徴とするタンパク質ドメインの同定方法を提供する。
好ましい態様において、 前記プロテア一ゼ処理を行う前の担体に結合したまま の融合タンパク質の分子量と、 前記プロテア一ゼによって分解した分解物の分子 量とを比較することによって、 タンパク質のドメイン構造をより正確に同定する ことができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の一実施形態であるハイスループット限定分解システムの概要 を表したフローチヤ一卜である。
図 2は、 無細胞タンパク質合成系でヒスチジンタグ付き Rasタンパク質を発現 させるための錶型 D NAを P C Rにより調製する方法を示した図である。
図 3は、 a :オンビーズの状態の Rasタンパク質及び、 b : U F膜により脱塩し た Rasタンパク質を MALDI- T0F 質量分析法により解析した結果を示した図である 図 4は、 a ： トリプシン無添加及び、 b ： 8 ng/ lのトリプシンを添加して限 定分解したタンパク質を MALDI-T0F-質量分析法により解析した結果を示した図で ある。 発明の実施の形態
(標的タンパク質）
本発明の方法により、 構造解析することができるタンパク質は自然界に存在す る天然型のタンパク質や人工的に合成したタンパク質のいずれでも良く、 種々の 修飾夕ンパク質でも可能である。 好ましくはゲノム遺伝子や c D N Aに由来する 核酸を用いて無細胞夕ンパク質合成系で合成されたものを用いる。
無細胞タンパク質合成系は、 細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成 する系であり、 このような合成系としては m R N Aの情報を読み取ってリポゾ一 ム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系、 又は D N Aを铸型として R N Aを合 成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む系の何れでも良い。 D NAを铸 型として用いる場合には、 P C R等の試験管内での増幅反応により、 従来必要と されたクロ一ニングという煩雑な操作を経ることなく、 多数の鍀型 D N Aを同時 並行的に迅速に調製することができる。
上記細胞抽出液としては、 リボゾーム、 t R NA等のタンパク質合成に必要な 成分を含む真核細胞又は原核細胞の抽出液が使用可能である。 前記真核細胞及び 原核細胞としては従来公知のものが何れも使用可能であり、 具体的に例示すれば 、 大腸菌、 好熱性細菌、 小麦胚芽、 ゥサギ網状赤血球、 マウス L一細胞、 エール リツヒ腹水癌細胞、 He L a細胞、 C HO細胞及び出芽酵母などが挙げられ、 特 に大腸菌由来のもの （例えば大腸菌 S 30細胞抽出液） 又は高度好熱菌 (Thermus t ermop ilus)由来のものが高い合成量を得る点において望ましい。 該大腸菌 S 30細胞抽出液は、 大腸菌 A19 (n let) ， BL21, BL21 star, BL21 codon plu s株等から公知の方法 (Pratt, J.M. et al. , Transcription and translation - a practical approach, (1984), pp.179-209, Henes, B. D.と Higgins, S. L編 、 IRL Press, Oxford参照） に従って調製できるし、 あるいは Promega社や Novag en社から市販されるものを使用してもよい。
このような細胞抽出液は、 上記各細胞抽出液が濃縮されたもの （以下 「濃縮細 胞抽出液」 という。 ） でもよいし、 未濃縮のもの （以下 「粗細胞抽出液」 という 。 ） であっても良いが、 濃縮細胞抽出液を使用することにより、 より高いタンパ ク質合成量が得られる。 この濃縮細胞抽出液を得る方法としては、 任意の手段例 えば限外濾過、 透析、 PEG沈殿等によって行うことができる。
本発明の無細胞タンパク質合成系の組成としては、 大腸菌 S 30等の粗細胞抽 出夜又は濃縮細胞抽出液 （10〜90重量％) の他に、 目的のタンパク質をコードす る DNA又は RNA (mRNA等） 、 ATP (0.5〜5mM) 、 GTP (0· 05〜1. Om M) 、 CTP (0.05〜1. OmM) 、 UTP (0.05〜1. OraM) 、 緩衝液、 塩類、 ァミノ 酸、 RNa s e阻害剤、 抗菌剤、 必要により RNAポリメラーゼ （DNAを踌型 とする場合） 及び t RNA等を含むことができる。 その他、 AT P再生系、 ポリ エチレングリコール （例えば PEG# 8000) 、 3'， 5;- cAMP、 葉酸類 (0· 1 〜5 ）、 還元剤 （例えば 1〜10 のジチオスレイト一ル） 等が含まれる。
； 緩衝液としては、 例えば Hepes- K0H、 Tris- OAcのような緩衝剤を使用できる。 塩類としては、 酢酸塩 (例えばアンモニゥム塩、 マグネシウム塩等）、 グルタミン 酸塩等が使用でき、 抗菌剤としてはアジ化ナトリウム、 アンピシリン等が使用可 能である。 また DNAを鍀型として用いる場合には RNAポリメラーゼを反応系 に添加するが、 例えば T7RNAポリメラ一ゼ等の市販の酵素を使用できる。
本発明の方法において、 八丁？再生系としては好ましくは0.02〜5 / 1のク レアチンキナーゼ （CK) と 10〜100mMのクレアチンホスフェート （CP) の組 合せが挙げられるが、 これに限定されるものではなく、 従来より公知の材料が何 れも使用可能であり、 上記以外に例えば 1〜2( Mのホスホェノールピルべ一卜 （ P E P ) と 0. 01〜l ^ g/ 1のピルビン酸キナーゼ （P K) の組合せ等が使用可能 である。 これら P K及び C Kは何れも AD Pを A T Pに再生する酵素であり、 そ れぞれ P E Pおよび C Pを基質として必要とする。
本発明の方法に使用する無細胞タンパク質合成系には、 バッチ法、 フロー法の 他、 従来公知の技術がいずれも適用可能であり、 例えば限外濾過膜法や透析膜法 、 樹脂に翻訳铸型を固定化したカラムクロマト法等 （Spirin, A.ら、 Meth. In E nzymol. 2 1 7巻、 1 2 3〜 1 4 2頁、 1 9 9 3年参照） を挙げることができる 合成された夕ンパク質をァフィ二ティ一精製するために、 タグ (標誦配列との 融合タンパク質として合成されることが好ましい。 タグ配列には、 公知のものを 任意に選択して用いることができる。 例えば、 抗原となりうる一定のペプチド配 列、 ヒスチジンタグ配列、 及びピオチン付加配列等である。
目的遺伝子を GST (Glutathione S-Transferase)遺伝子配列の後ろにフレームを 合わせて組み込み、 大腸菌内で融合タンパク質として大量に発現させるシステム が利用でき、 このための組換えべクタ一 pGEX Vectorsはアマシャムフアルマシア バイオテック社から市販されている。 また、 目的遺伝子配列の前又は後ろに複数 のヒスチジンをコードする塩基配列を付加することにより、 ヒスチジン ·夕グ融 合タンパク質として合成することもできる。 ヒスチジン ·タグにおけるヒスチジ ン残基は 4〜 2 0個、 好ましくは 6〜1 0個のヒスチジン残基が付加される。 さらに、 特定のアミノ酸配列をコードするピオチン化ペプチド遺伝子を目的の タンパク質と連結した組換え D NAは大腸菌内でピオチン化されたタンパク質を 合成することができ、 例えばこのようにしてホ夕ルルシフェラーゼをピオチン化 する方法は特開平 8-308578号公報等に記載されている。
(タンパク質と特異的に結合する担体）
上記タンパク質と特異的に結合する担体としては、 抗体、 結合タンパク質、 受 容体等の夕ンパク質やそれらの一部であって、 抗原やリガンドとの結合に関与す る部分を担持した担体であれば何れも使用できる。 抗体としては、 例えば、 上記 GSTに対する抗体等が使用でき、 抗 GSTャギ抗体等が市販されている （GST Detect ion Module, アマシャムフアルマシアバイォテック社) 。 この他、 上記ピオチン に対してはァビジンゃストレプトァビジン等の結合夕ンパク質を使用することが でき、 特定の標識物に対する特異的な受容体等も用いることができる。
また、 低分子物質としては、 金属原子、 アミノ酸、 ペプチド、 オリゴヌクレオ チド、 複素環式化合物及びそれらの複合体等を担持した担体が使用できる。 例え ば、 上記 GSTの基質であるダル夕チオンをエポキシ結合を介して担体に結合させ たり、 上記ヒスチジン夕グ融合タンパク質と親和性のある二価金属ィオンを固定 化した担体が市販されている （例えば、 Ni- NTAァガロースビース、 QIAGEN社、 ド イツ） 。
担体としては、 固体または不溶性材料 （例えば、 ろ過、 沈殿、 磁性分離などに よりタンパク質混合物から分離することができる材料） であって、 タンパク質の 非特異的な吸着が少ない物が好ましく、 例としては、 ビーズ （例えば、 ァガロー ス、 セファロース、 セフアデックス、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 セル ロース、 テフロン （登録商標） 、 孔調節ガラス） 、 薄膜 （例えば、 セルロース、 ニトロセルロースポリスチレン、 ポリエステル、 ボリカーボネー卜、 ポリアミド 、 ナイロン、 ガラス繊維、 及びテフロン （登録商標） 製） のような平坦担体、 ガ ラスプレー卜、 金属プレー卜、 シリコンウェハ、 マイクロタイ夕一プレート等を 含む。
(タンパク質を結合した担体の分離、 精製方法）
上記標的タンパク質及びこれらと特異的に結合する担体とを接触、 例えば溶液 中で両者を混合することによって、 これらを特異的に結合させる。 これらの結合 は、 非共有結合であるが、 一般にピオチン一ストレプトアビジン複合体や、 抗原 一抗体相互作用は親和性が強く、 従って、 不純物と分離するため強度な洗浄を行 つても解離しないことが知られている。 また、 タンパク質と担体との結合能力に 応じて、 適度な洗浄条件を選択することは、 当業者において公知である。 このよ うに、 標的タンパク質を結合した担体は、 必要に応じて適宜洗浄操作を行った後 、 ろ過、 遠心分離等、 従来から公知の任意の方法によって回収することができる 好ましくは 9 6ゥエルフィル夕一プレー卜などのマルチウエルフィルタープレ ートを用いることにより多検体を同時、 迅速にろ過、 回収することができる。 (分子量の測定）
本発明の方法においては、 上記担体と結合して回収されたタンパク質の分子量 を測定する。 タンパク質の分子量測定は、 S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳 動 （SDS- PAGE) 、 ゲルろ過クロマトグラフィー (GPC)及び質量分析 (Mass Spectro me try)等により測定することができるが、 迅速かつ正確な分子量測定のためには 質量分析法が特に好ましい。 質量分析計にはその試料をイオン化する方法や検出 方法について種々の方法があり、 例えばィォン化の方法としては最も広く用いら れている電子衝撃 (EI)法の他に、 化学イオン化法 (CI)、 フィールドイオン化 (FI) 法、 フィールドディソープシヨン（FD)法、 ファーストアトムボンバードメント（F AB)法等がある。 より好ましくは、 マトリクス支援レーザー脱離イオン化 (MALW) 法が用いられる。 MALDIで試料は通常平滑な金属表面に添着され、 試料表面にパ ルスレーザービームを衝突させることにより気相に脱着される。 飛行時間型質量 分析計 (Time- Of- Fl ight : T0F)は発生したイオンが検出器に達するまでの時間を 測定することにより質量電荷比に従つてイオンを分離する。 T0F型質量分析計を 用いれば、 実質的に質量電荷比範囲に制限が無く、 各イオン化時に発生したィォ ン全てを記録するために走査機器より高感度になり得、 従来型の磁場質量分析計 では感度不足の大きな有機分子の質量電荷比を測定するのに特に好ましい。
(ハイスループッ卜限定分解システムの構築）
次に、 本発明の方法により構築されたハイスループットタンパク質限定分解シ ステムについて図 1を参照して詳細に説明する。 まず、 タンパク質合成のための 無細胞系は、 他の生細胞を用いた系よりもはるかに自動化及びハイスループット タンパク質合成に適している。 P C R法により増幅された铸型 D NAは、 そのま ま、 例えば大腸菌の細胞抽出液を用いて 37° (：、 1時間で所望のタグ付タンパク質 を合成することができ、 合成されたタンパク質は、 9 6ゥエルフィル夕一プレー 卜に移して前記タグと結合するァフィ二ティー担体と混合される。 所望のタグ付 夕ンパク質は該担体との結合工程及び洗浄工程を経た後に回収され、 回収された 担体に結合した状態のタンパク質を用いて質量分析を行うことができる。
同時に、 担体と結合したタンパク質はそのままの状態でプロテアーゼによる限 定分解処理に付され、 例えば、 10慮 Tris- HC1緩衝液 (PH 7. 6)中でトリプシン処 理される。 トリプシンはタンパク質中においてリジン、 アルギニン等の塩基性ァ ミノ酸残基の C末端側 (Lys- X, Arg-X)でべプチド結合を加水分解することが知ら れている。 このような限定分解に用いられるプロテアーゼとしてはこの他に Stap ylococcus V8プロテアーゼによる Glu - X、 キモトリブシンによる Tyr- X, Phe-X, Trp- X等の結合の切断等が用いられる。 限定分解されたタンパク質は、 いかなる 後処理を行う必要もなく質量分析による分子量測定が可能である。
実施例
以下に本発明の実施例として、 ヒト c-Ha_Rasタンパク質（GenBank Accession No. PO 1112)及びマウス完全長 c D N Aライブラリーから任意に選択した c D N Aクローン 2B7 (GenBank Accession No. X59382, 理化学研究所ゲノム科学総合 研究センター、 遺伝子構造解析研究チーム、 林崎良英博士から提供を受けた。 ） を用いて本発明の方法について検討した結果を詳細に説明するが、 本発明はこれ らの実施例に限定されるものではない。
[実施例 1 ] ァガロースビーズに結合したヒスチジン夕グ付き Rasタンパク質 (His- as)の質量分析
(1) 鍀型 cDNAフラグメントの調製
無細胞タンパク質合成系での铸型 c DNAを調製するために、 ヒト C- Ha_Ras タンパク質遺伝子を含むプラスミド pK7- Ras (Kigawaら、 FEBS Lett.、 442巻、 15 一 19頁、 1999年参照）を铸型として 2段階 PCR増幅を行った。 第 1段階の PC Rでは、 Rasタンパク質の N末端をコードする領域から DNAを増幅するための 2種類のプライマ一： 5 ' プライマー 1 (配列番号 1) 及び 5 ' プライマー 2 ( 配列番号 2) と、 Rasタンパク質の C末端の下流領域とァニールする 3' プライ マ一 （配列番号 3) とを用い、 表 1に示した組成の反応液 20A を調製し、 表 2 に示したプログラムに従つて増幅した。
5 ' プライマ一 1 (配列番号 1)
5'- CCTCGGCCGGAGCGGCCACCATG - 3'
5 ' プライマー 2 (配列番号 2)
5'- GAAGGAGCCGCCACCATGACCGAATACAAACTGGTTGTAG -3'
3 ' プライマー （配列番号 3) 5' - AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC -3'
[表 1]
添加量 鎢型プラスミド lng/ I 4 \ 5 ' プライマー 1 5
5' プライマ一 2 0.
3 ' プライマ一 組
成
d NT P s (東洋紡） 2m
10 X Expand HF緩衝液（ベーリンガ一マンハイム） 2μ. \
( 15mM塩化マグネシゥム含有）
滅菌蒸留水 2.85 Ι
DNAポリメラ一ゼ （ベーリンガーマンハイム） 3500un its/ml 0.15^1
[表 2]
STEP1 94°C 2 min
STEP2 94°C 30 sec
STEP3 60。C 30 sec
STEP4 72°C 2m in
STEP5 GOTO 2 for 9 times
STEP6 94°C 30 sec
STEP7 60°C 30 sec
STEP8 72°C 2 min +
STEP9 GOTO 6 for 19 times
STEP10 72DC 7 min
STEP" 4°C forever 次に、 上記反応によって得られた第 1次 PCR産物と、 T7プロモーター配列 の下流にヒスチジンタグ配列を有する 5' DNA断片 （配列番号 4) と、 T7夕 一ミネ一夕一配列を有する 3' DNA断片 （配列番号 5) と、 ユニバーサルブラ イマ一 ·· 5'- CCGCTGTCCTCGTTCCCAGCC- 3' (配列番号 6) とを用い、 表 3に示した 組成の反応液 25 1を調製し、 表 2に示したプログラムに従つて第 2次オーバー ラップ PC Rを行った。 この結果、 図 2に示したように、 T 7プロモーターの制 御下で、 6個のヒスチジンタグと Rasタンパク質との融合タンパク質 (His- Ras)を 発現することのできる DNA断片を増幅した。 なお、 このように合成した錶型 D NAによってコードされる His- Rasタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 7に示 した。
[表 3]
組成 添加量 第 1次 PCR産物 (錶型） 10M ! ユニバーサルプライマー 100 μΜ 0.25 t I 5 ' 断片 2n 0.625 At I 3 ' 断片 2nM 0.625 t I d NT P s (東洋紡） 2m 2.5 Ι
10 X Expand HF緩衝液（ベーリンガーマンハイ厶） 2.5n \ (15mM塩化マグネシゥ厶含有）
滅菌蒸留水 8.3 Ail
DMAポリメラ一ゼ （ベーリンガーマンハイム） 3500un its/ml 0.2μ. \
( 2 ) 無細胞夕ンパク質合成系による His- Rasタンパク質の合成
大腸菌 S30抽出液は Zubayら (Annu. Rev. Genet i. , 7, 267-287, 1973) の方法に従 つて、 大腸菌 BL21株から調製した。 タンパク質合成反応は 96ウェルマイクロブ レートを用い、 その各ゥエルに下記の表 4に示した組成の溶液に、 上記ヒスチジ ンタグ付き Rasタンパク質の発現用 PCR産物 1 21、 上記大腸菌 S30抽出液 7.2/ 1を 加え、 反応液の全量を 30 lとし、 30°Cで 1時間、 His- Rasタンパク質の合成を行 つた。
[表 4 ]
組成
HEPES-KOH pH7. 5 58. 0 m
ジチオスレィ I ^一ル 2. 3 mM
ATP 1. 2 mM
CTP, GTP, UTP 各 0. 9 mM
クレアチンリン酸 81. 0 mM
クレアチンキナーゼ 250. 0 ju g/ml
ポリエチレングリコール 8000 4. 0%
3' , 5' -cAMP 0. 64 mM
L (-) -5 -フオルミル- 5， 6， 7, 8, -テ卜ラ-ヒドロ葉酸 35. 0 fi g/ml
大腸菌トータル t RMA 170. 0 i g/m l グルタミン酸カリウム 200. 0 mM
酢酸アンモニゥム 27. 7 mM
酢酸マグネシウム 10. 7 mM
アミノ酸 各 1. 0 mM
T7RNAポリメラーゼ （東洋紡） 16. 0 un i ts/ I
( 3 ) ニッケル結合ァガロースビーズを用いた Rasタンパク質の精製
合成反応終了後、 '反応液を、 0. 22 / mのポアサイズをもった 96ウェルマルチス クリーンフィルトレ一シヨンプレート (Durapore AGV S 22、 ミリポア製) に移 し、 これにスラリ一状の Ni- NTAァガロースビーズ (QIAGEN) を 50%含む 10 トリ ス塩酸 (pH7. 6) 溶液 20 1を加え、 さらに結合バッファー （50mM NaH2P04, 600m M NaCK 15mMイミダゾール、 pH8. 0) 120 1を加え、 4°C、 45分間、 20 rpmの口 —タリーシェーカーで振とうすることにより Rasタンパク質をピーズに吸着させ た。 その後、 遠心機 CR21G、 ロータ R6S (いずれも日立製） を用い 500 x g、 3分 間遠心することにより液体を除去した。 フィルター上のァガ口一スビーズを洗浄 バッファー A (50mM Na議、 300mM NaC 15mMイミダゾール、 H8. 0) 200 1に 懸濁し、 5分間振とうの後、 前述と同じ遠心操作により液体を除去した。 同じ洗 浄操作をさらに 1回繰り返した。 フィルタ一上のァガロースビーズを洗浄バッフ ァー B (50mM NaH2P(k 300mM Ml、 30mMイミダゾール、 pH8. 0) 200 1に懸濁し 、 5分間振とうの後、 前述と同じ遠心操作により液体を除去した。 さらに の ΙΟπιΜトリス塩酸 pH7. 6による洗浄を 3回繰り返した。 フィルタ一上のァガ口一 スビーズに、 ビ一ズ体積が 50%となるように ΙΟπιΜトリス塩酸 pH7. 6を加え、 十分 に懸濁した。
( 4 ) ァガロースビーズに吸着した Ras夕ンパク質の質量分析
Rasタンパク質をァガロースビーズに吸着した状態で MALDI-TOF- MS (Voyager -!） E™ STR、 Persept ive Biosystems) 解析を行った。 上記 Rasタンパク質を吸着さ せたァガロースビーズの懸濁液 0. 5 lを MALDIサンプルサポートに載せ、 続けて 0 . 5 /Z 1の SinapicAcid (50%ァセトニトリル、 0. 2%トリフルォロ酢酸に飽和させ たもの） を載せ、 線形モードにてスペクトルをとつた。 この結果を図 3 aに示し た。 コントロールとして、 0. 25Mイミダゾールによりァガロースビーズから溶出 した後、 U F膜を用いて脱塩した Rasタンパク質を同様に解析した結果を図 3 b に示した。 いずれの結果も、 一価にイオン化した [Ras] +のピーク （m/z=22108. 1 ) と、 二価にイオン化した [Ras] 2 +のピーク （m/z=11053. 5) が認められた。 ァガ 口一スビーズに吸着した状態で測定した Rasタンパク質のスペクトルのパターン は従来法により精製したもののパターンと同じであり、 Ni- NTAァガロースビーズ は MALDI - T0F - MS解析に影響を与えないことが明らかになった。 この結果から、 ァ ガロースビーズに吸着したタンパク質は、 溶出させることなく、 ビーズに吸着し た状態 （オンビーズと記す） で MALDI- T0F- MS解析が可能であることが示された。
[実施例 2 ] ァガロースビーズに結合したヒスチジンタグ付きマウスタンパク質 2B7 (His-2B7)の限定分解と質量分析
( 1 ) 錶型 D N A断片の調製と無細胞タンパク質合成系による 2B7の合成 マウスタンパク質 2B7をコードする c D NAを含むプラスミドを铸型とし、 実 施例 1と同様の方法により第 1次 P C Rを行った。 ただし、 実施例 1における 5 ， プライマー 2の代わりに、 2B7タンパク質の N末端領域をコードする配列とァ ニールさせるための 5， プライマー 3 (配^番号 8 ) を用いた。
5 ' プライマー 3 (配列番号 8 )
5' - GAAGGAGCCGCCACCATGTCGATGACAGACGTGCTC -3'
第 1次 P C R産物を用いて、 実施例 1と同様の方法により第 2次 P C Rを行い 、 無細胞タンパク質合成系での鐯型 D N Aとして用いる D N A断片を増幅した。 なお、 このように合成した鍀型 D N Aがコードする His- 2B7タンパク質のァミノ 酸配列を配列番号 9に示した。 さらに、 上記表 4に示した組成の溶液に、 第 2次 P C Rjg i l lと大腸菌 S30抽出液 7. 2 1を加え反応液の全量を 30 とし、 30 °Cで 1時間、 Hi s- 2B7タンパク質の合成を行った。
( 2 ) ニッケル結合ァガロースビーズを用いた Hi s_2B7の精製とオンビーズ限定 分解
実施例 1と同様の方法で Ni-NTAァガロースビーズを用いて His- 2B7を精製した 。 His- 2B7を吸着させたァガロースビーズの懸濁液 20 1にトリプシン添加又は 無添加の条件で、 30°C、 120分間反応を行った。 反応終了後、 ビ一ズを含む反応 液を直ちに 2〜4°Cに保持し、 この反応液について MALDI- T0F-MS解析を行った。 こ の結果を図 4に示した。 トリプシン無添加の場合は図 4 aのように未分解 （分子 量 14549. 5) のものに由来するピーク （A+、 A2 + ) のみが観察されたが、 トリプシ ン濃度を 8ng/ lとなるように添加した場合は、 未分解 （分子量 14549. 5) のもの に由来するピーク （A+、 A2 + ) はほとんど無く、 分子量 12535. 9の分解産物に由来 するピ一ク （B+、 B2 + ) が主に観察された。 ここで得られた結果を Sof t GPMAW (L ig thouse data) により解析したところ、 この分子種は 2 B7の N末端アミノ酸か ら 19番目から C末端 136番目に相当する部分であることが明らかになった。
以上のように本発明によりタンパク質をオンビーズの状態で限定分解できるこ とが明らかになった。 また、 このビーズを含む反応液はそのまま MALDI- T0F-MS解 析を行うことが可能であり、 分解を受ける部位を推定することができた。 これら の結果から、 本発明がタンパク質のドメインの推定に利用可能であることが示さ れた。 また、 この方法により一度に多検体を処理することができるため、 限定分 解およびその産物の質量分析のハイスループット化が可能である。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、 ァフィ二ティー担体で精製したタンパク質の緩衝液を 交換する必要なく、 そのままプロテア一ゼによる限定分解や、 質量分析法により 分子量測定することができる。 しかも、 通常用いられている多検体スクリーニン グ用のプレートを用いて、 タンパク質合成、 精製及び分析という一連の操作を行 うことができるため、 システムの自動化に好適である。 このような効率的なタン パク質及びそのドメイン構造の同定方法は、 タンパク質の代表的な立体構造を網 羅的に解明しょうとする構造ゲノミクスの研究を推進する上で大きな役割を果た すと考えられる。

Claims

請求の範囲
1 質量分析法によるタンパク質の分子量同定方法において、
( a ) タグ配列と融合させたタンパク質を、 無細胞タンパク質合成系で合成す る工程、
( b ) 前記合成された融合タンパク質と、 前記タグ配列と特異的に結合する担 体とを接触させる工程、
( c ) 前記融合タンパク質と結合した前記担体を回収する工程、 及び
(d) 前記回収した担体に結合した状態の前記融合タンパク質を用いて、 質量 分析法により前記融合タンパク質の分子量を測定する工程、
を含むことを特徴とするタンパク質の分子量同定方法。
2 前記タグ配列に特異的に結合する担体は、 抗体、 結合タンパク質、 受容体及 びそれらの結合部位を含む部分から選択される少なくとも一種を担持した担体で あることを特徴とする請求の範囲 1に記載の方法。
3 前記タグ配列に特異的に結合する担体は、 金属原子、 アミノ酸、 ペプチド、 オリゴヌクレオチド及び複素環式化合物から選択される少なくとも一種を担持し た担体であることを特徴とする請求の範囲 1に記載の方法。
4 前記質量分析法は、 飛行時間型マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (M ALDI-T0F)であることを特徴とする請求の範囲 1に記載の方法。
5 質量分析法によるタンパク質ドメインの同定方法において、
( a ) タグ配列と融合させたタンパク質を； 無細胞タンパク質合成系で合成す る工程、
( b ) 前記合成された融合タンパク質と、 前記タグ配列と特異的に結合する担 体とを接触させる工程、
( c ) 前記融合タンパク質と結合した前記担体を回収する工程、 (d) 前記回収した担体に結合した状態の前記融合タンパク質をプロテアーゼ により限定分解する工程、
(e) 前記分解反応溶液を用いて質量分析法により、 前記融合タンパク質及び Z又はその分解物の分子量を測定する工程、
を含むことを特徴とするタンパク質ドメインの同定方法。
6 質量分析法によるタンパク質ドメインの同定方法において、
(a) タグ配列と融合させたタンパク質を、 無細胞タンパク質合成系で合成する 工程、
(b) 前記合成された融合タンパク質と、 前記タグ配列に特異的に結合する担体 とを接触させる工程、
( c ) 前記融合タンパク質と結合した前記担体を回収する工程、
(d) 前記回収した担体に結合した状態の前記融合タンパク質を用いて、 質量分 析法により前記融合タンパク質の分子量を測定する工程、
(e) 前記工程 （c) で回収した担体に結合した状態の前記融合タンパク質をプ 口テアーゼにより限定分解し、 その反応溶液を用いて質量分析法によりその分解 物の分子量を測定する工程、 及び
(f ) 前記工程 （d) で測定した融合タンパク質の分子量と、 前記工程 （e) で 測定した分解物の分子量とを比較する工程、
を含むことを特徴とするタンパク質ドメインの同定方法。
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