WO2002099104A1 - Polypeptide destabilisant une proteine dans des cellules dans des conditions aerobies et adn codant pour ce polypeptide - Google Patents

Polypeptide destabilisant une proteine dans des cellules dans des conditions aerobies et adn codant pour ce polypeptide Download PDF

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WO2002099104A1
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protein
amino acid
fusion protein
seq
acid sequence
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Masahiro Hiraoka
Shinae Kondoh
Hiroshi Harada
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Pola Chemical Industries Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide that destabilizes a protein in a cell under aerobic conditions, a DNA encoding the polypeptide, and a method using the DNA.
  • the present invention also relates to a vector containing the DNA and capable of expressing a fusion protein having stability depending on intracellular oxygen status.
  • the present invention relates to a fusion protein containing the above polypeptide, which has cell membrane permeability and stability depending on intracellular oxygen status, and a method of using the fusion protein.
  • the present invention also relates to a vector capable of expressing the fusion protein.
  • the partial pressure of oxygen in solid tumors is not uniform, and tumor cells are exposed to various oxygen environments. This is due to the limited distance oxygen molecules diffuse from the blood vessels to the tumor tissue.
  • the inside of a solid tumor is classified into three areas: 1) aerobic area, 2) necrotic area, and 3) hypoxic area according to the amount of oxygen supplied to each tumor cell. .
  • This region is called the aerobic region, because tumor cells at a distance of about 70 7m from the capillaries are supplied with a very large amount of oxygen molecules. Oxygen molecules are essential to achieve the effects of radiation therapy on solid tumors. Therefore, the aerobic region, which is literally rich in oxygen molecules, is known to be a region with extremely high radiation sensitivity. Even when chemotherapy is administered, the anticancer drug easily diffuses from the vascular system to the aerobic region, and thus the therapeutic effect of the chemotherapy on the aerobic region is considered to be high.
  • Oxygen molecules released from blood vessels are consumed by tumor cells in the aerobic region during diffusion. It is. Therefore, tumor cells located far from the capillaries are not supplied with sufficient oxygen molecules to survive. As a result, tumor cells at a distance of about 70 m or more from the vasculature fall into necrosis, forming a necrotic area.
  • hypoxic region composed of hypoxic cells in the region between these aerobic and necrotic regions.
  • the hypoxic region is supplied with the minimum amount of oxygen required for tumor cell survival.
  • a sufficient amount of molecular oxygen has not been supplied to obtain the effect of radiation therapy. Therefore, hypoxic areas in tumors are very low in radiosensitivity and are thought to contribute to tumor regrowth after radiation therapy.
  • the reality is that a sufficient therapeutic effect cannot be expected due to the limited amount of anticancer drugs that diffuse from the vascular system to the hypoxic region.
  • hypoxic cells it was difficult to confirm the presence of such hypoxic cells. This is because there was virtually no means for monitoring the state of oxygen in cells.
  • Methods for monitoring such hypoxic cells include measuring the oxygen voltage of cells using microelectrodes and immunohistochemical staining using pimonidazole (Hypox yprobe-1), which is known as a hypoxic cell indicator.
  • pimonidazole Hypox yprobe-1
  • immunohistochemical staining and the like using a gene product whose expression is induced in cells under hypoxic conditions as a label are known. However, these were not only technically difficult, but also the equipment was complicated and not widely used. That is, development of a general-purpose detection means for hypoxic cells has been desired.
  • hypoxic cancer cells hinders treatment with radiation therapy and chemotherapeutic agents, and there is a need for a means of effectively removing these.
  • hypoxic cells only a combination of a hypoxic cell radiosensitizer and radiotherapy has been known, but only one product is currently in clinical trials and is currently in practical use. No hypoxic cellular radiosensitizers have been provided yet. This is because 2-nitroimidazole, the mother nucleus of hypoxic cellular radiosensitizers, has neurotoxicity, and it was difficult to control the toxicity and efficacy. In other words, it has been desired to develop a means for effectively eliminating hypoxic cancer cells.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • erythroid progenitor cell growth factor and rythropoietin;
  • PO 3 hypoxia-inducible factor-1 complex
  • HIF-1 is a heterodimer consisting of HIF-1 and HIF-13 proteins. Both subunits have a basic one helix one norepe one helix domain (asic-el domain; bHLH domain) and a domain responsible for the formation of a heterodimer called the pass domain ER-aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT) -SIM (PAS) domain. It has also been clarified that HIF-1 protein has two transactivation domains-/ C-transactivation domains (N-TAD, C-TAD).
  • HIF-1 is constantly expressed independently of the external oxygen partial pressure. Similarly, transcription and translation of HIF-1 mRNA are always activated, but biosynthesized HIF-1 protein is actively degraded under aerobic conditions and stable only under hypoxic conditions. Exists.
  • HIF-1 protein is controlled by the oxygen concentration in the outside world, and the transcriptional activity of HIF-1 is also controlled mainly by the amount of the protein. It is clear.
  • HIF- ⁇ The oxygen-dependent stability of HIF- ⁇ has been suggested that amino acid residues in this region undergo some modification in an aerobic state in an oxygen-dependent manner, and ultimately It was found to be chitinylated and degraded by proteasomes (Huang, LE, Gu, J. Scliau, M. and Bunn, HF Regulation of hypoxia-inducible factor 1 is mediated by an O2-dependent degradation domain via The ubiquitin-proteasome pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 7987-7992, 1998.).
  • HIF- stability of HIF- is determined by the use of proteasome inhibitors such as N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norvalinal (Hereinafter also referred to as "Cbz-Ii") (Rock, KL, Gramm, C., Rothstein, L., Clark, K., Stein, R., Dick, L., Hwang, D. and Goldberg, AL Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class
  • Cbz-Ii N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norvalinal
  • the fusion protein containing the polypeptide is also degraded via the degradation mechanism using ubiquitin-proteasome as in the case of HIF-1, and the medium containing hypoxia and Cbz-LLL It was assumed that it would stabilize.
  • the GIF protein fused with the HIF-1 protein 530a.a.-652a.a. is controlled to be actively degraded in cultured cells only when the oxygen concentration is high.
  • TAT protein transduction domain a region consisting of only 11 amino acids of the TAT protein (TAT protein transduction domain) is responsible for the above activity.
  • TAT protein transduction domain a region consisting of only 11 amino acids of the TAT protein (TAT protein transduction domain) is responsible for the above activity.
  • TAT protein transduction domain is fused /?-Galactosidase protein is taken up into cells.
  • HIF-1 human TAT the relationship between the above-mentioned HIF-1 human TAT, and furthermore, the relationship between HIF-1 and a protein having a membrane-permeable activity has not been known so far, and therefore, a specific region controlling the stabilization of HIF-1 protein has
  • the fusion protein can be incorporated into cells when HIF-1 protein having the specific region, protein having a membrane permeable activity, and other proteins having the specific region are fused. It is not known that the fusion protein can be provided with oxygen concentration-dependent stability in a cell holding the fusion protein. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made under the above-mentioned circumstances, and identifies a region of a HIF-1 ⁇ protein that can control the stability of an arbitrary protein in an oxygen concentration-dependent manner by fusion, and It is an object of the present invention to control the expression of a specific gene and the expression of a fusion protein corresponding to the specific gene depending on the amount of oxygen using the same region.
  • Another object is to provide a vector that can express these fusion proteins.
  • a region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a protein obtained by fusing the region. was found to be an important part of the signal part when undergoing decomposition under aerobic conditions.
  • fusion protein containing a HIF-1 protein having the above specific region and a protein having a membrane-permeable activity can be suitably taken into cells, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • (B) having an amino acid sequence consisting of at least 16 amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and, when fused with a nuclear localization signal and another protein, the fusion protein is A polypeptide that confers oxygen concentration-dependent stability to other proteins in retaining cells.
  • DNA that encodes a nuclear localization signal and DNA that encodes the polypeptide described in any of (1) to (3), and these DNAs encode other proteins A vector into which DNA can be inserted to express a nuclear localization signal, a fusion protein with the polypeptide and other proteins. (5) The vector according to (4), which contains a DNA encoding the other protein.
  • a method for regulating the presence of a protein in a cell comprising introducing the vector according to (6) into a cell and expressing a fusion protein encoded by the vector.
  • a method for regulating the presence of a protein in a cell holding a DNA encoding the protein comprising: linking the DNA with the DNA according to (1) to the DNA; A signal, a polypeptide encoded by the DNA according to (1), and a fusion protein obtained by fusing the protein.
  • the other protein is a cytotoxic protein
  • the vector described in (7) is retained in the cell, and the fusion protein encoded by the vector is present in the cell under hypoxic conditions.
  • a fusion protein comprising a nuclear localization signal, a protein having a membrane-permeable activity, a polypeptide shown in the following (A) or (B), and another protein, Fusion protein with stability depending on intracellular oxygen status.
  • A a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • (B) having an amino acid sequence consisting of at least 16 amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and, when fused with a nuclear localization signal and another protein, the fusion protein is A polypeptide that confers oxygen concentration-dependent stability to other proteins in the cells it retains.
  • (C) A protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • a fusion comprising a polypeptide comprising the following (A) or (B1), a protein comprising the HIV-derived TAT signal sequence (TAT) shown in the following (C) or (D), and another protein: A fusion protein having cell membrane permeability and stability depending on oxygen status in a cell.
  • a fusion protein having cell membrane permeability and stability depending on oxygen status in a cell.
  • (B1) having the amino acid sequence of at least 16 or more amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and being fused to a protein comprising TAT and other proteins; A polypeptide that confers oxygen concentration-dependent stability to other proteins in cells that carry the fusion protein.
  • (C) A protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the fusion protein according to (16) or (18) is penetrated from outside the cell to the inside of the cell, and the stability of the fusion protein is regulated according to the oxygen state in the permeated cell. A method for regulating the presence of a fusion protein.
  • DNA that encodes a nuclear localization signal DNA that encodes a protein having a membrane-permeable activity
  • A) or B) DNA that encodes a polypeptide represented by the following (A) or (B):
  • (B) having an amino acid sequence consisting of at least 16 amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and, when fused with a nuclear localization signal and another protein, the fusion protein A polypeptide that confers oxygen concentration-dependent stability to other proteins in the cells it retains.
  • (25) Encodes a protein comprising a DNA encoding the polypeptide shown in (A) or (B1) below, and a TAT signal sequence (TAT) derived from HIV shown in (C) or (D) below
  • TAT TAT signal sequence
  • (B1) at least 16 amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Oxygen concentration-dependent stability in a cell that has the amino acid sequence consisting of a group and that is fused with a protein consisting of TAT and other proteins, and in the cell that retains the fusion protein when fused with other proteins To give the polypeptide.
  • (C) A protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the DNA of the first invention of the present invention is a DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a nuclear localization signal hereinafter, also referred to as “NLS”
  • other proteins it depends on other proteins in a cell retaining the fusion protein depending on the oxygen concentration. Provides stability.
  • the fusion protein is more stably retained when the cells retaining the fusion protein are under hypoxic conditions than under aerobic conditions. It is degraded more rapidly in cells under oxygenated conditions than under hypoxic conditions.
  • the hypoxic condition refers to a state where the oxygen partial pressure is about 20 mmHg or less in vivo. For example, if the oxygen concentration in the incubator is 1 The cell culture at less than% is under hypoxic conditions.
  • the aerobic condition refers to a state where the oxygen partial pressure exceeds about 2 O mmHg in a living body.
  • the DNA of the first invention includes a part of the encoded polypeptide, as long as the encoded polypeptide can impart the above-described fusion protein containing the polypeptide with the stability depending on the intracellular oxygen concentration as described above. There may be. Specifically, it has an amino acid sequence consisting of at least 16 or more, preferably 17 or more, more preferably 18 or more amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Polypeptides. More specifically, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 16 or more, 120 or less, preferably 17 or more, 50 or less, more preferably 18 or more, Those having an amino acid sequence consisting of 30 or less, particularly preferably 18 or more and 20 or less amino acids are exemplified. More specifically, examples thereof include a polypeptide having an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 1 to 16 of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 3 to 18 of SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide encoded by the DNA of the first invention may be any of the above-described polypeptides as long as the fusion protein containing the polypeptide can be provided with the stability depending on the intracellular oxygen concentration as described above.
  • And may have an amino acid sequence having a homology of 85% or more with the polypeptide of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the tyrosine residue corresponding to the tyrosine residue at amino acid number 9 in SEQ ID NO: 1 needs to be conserved.
  • NLS refers to an amino acid sequence required for a protein to be localized in the nucleus in a eukaryotic cell having a nuclear envelope structure in the cell. In other words, proteins having the same sequence are transported to the nucleus through the nuclear membrane. NLS is a sequence found in proteins having nuclear activity, such as DNA binding proteins.
  • the fusion protein when the NLS is fused with the polypeptide encoded by the DNA of the first invention and another protein, the fusion protein is translocated to the nucleus in the cell holding the fusion protein.
  • the activity is not particularly limited as long as it has an activity of, for example, NLS (large-T ant) derived from SV40 (simian virus 40) large-T antigen. igen 126a.a.-: I32a.a. region (Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 9327-9331: Reference 7). It also contains the NLS specific to the HIF-1 string, and the NLS can also be used.
  • proteins are not particularly limited as long as they are intended to control stabilization in a cell depending on the oxygen concentration, and include, for example, proteins for labeling, and proteins having cytotoxicity. And the like.
  • proteins for labeling include enzymes that catalyze a color-forming reaction, such as galactosidase, horseradish peroxidase, and alkaline phosphatase. These coloring reactions are well known in the field of antibodies and microorganisms as enzyme immunoassays and techniques for examining the presence of proteins in cells.
  • a protein having GFP (green flow essence, protein) fluorescence can also be used as the protein.
  • cytotoxic protein examples include a simple herpesvirus thymidine kinase toxin protein and other apoptosis-inducing factors.
  • the DNA of the first invention is not particularly limited as long as the encoded amino acid sequence satisfies the above-mentioned conditions. Specifically, for example, a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a partial nucleotide sequence thereof A is mentioned.
  • the DNA of the first invention can be chemically synthesized based on the encoded amino acid sequence according to a conventional chemical synthesis method.
  • the amino acid sequence of HIF-1 or the nucleotide sequence of cDNA encoding it is already known (Gene Bank Accession No. U22431), and was prepared based on those sequences and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. It can also be obtained by amplifying from chromosomal DNA or cDNA library of animal such as human or mouse by PCR (polymerase chain reaction) using the obtained oligonucleotide as a primer. Examples of such primers include various primers described in Examples. If the sequence of the primer includes a sequence encoding NLS, a sequence required for gene expression (eg, Kozak sequence), and a recognition sequence for a restriction enzyme, the DNA encoding the fusion protein can be easily prepared. Become.
  • the amplification product obtained by PCR is suitable for genetic recombination of Escherichia coli, etc.
  • the subsequent operations will be easier.
  • One such vector is pBluescript II (T0Y0B0).
  • the vector according to the first invention of the present invention includes a DNA encoding NLS and a DNA encoding the polypeptide of the first invention, and these DNAs are used for other proteins.
  • the DNA encoding the polypeptide specifically includes DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a partial nucleotide sequence thereof.
  • the DNA encoding NLS includes, for example, DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 or a partial nucleotide sequence thereof.
  • a DNA encoding the other protein as described above is used to transform NLS and a DNA encoding the polypeptide according to the first invention.
  • it is a vector that contains the fusion protein so as to express it.
  • the fusion protein includes, for example, NLS, the polypeptide according to the first invention, and other proteins in this order from the N-terminus. That is, in the vector of the first invention, the DNAs encoding these polypeptides and proteins are linked so that their frames match, and further include an expression control sequence such as a promoter necessary for gene expression.
  • promoter examples include the SV40 early promoter lac promoter and the like.
  • the cell according to the first invention of the present invention is a cell into which the vector according to the first invention has been introduced.
  • Cells include microbial cells. Examples of microorganisms include bacteria such as Escherichia coli, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi such as Aspergillus nidulans, and cultured cells of animals or plants.
  • an ordinary transformation method may be used.
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • Escherichia coli DH5 and IQ / PCH55-7-574 which retain the above plasmid pCH / 557-574, were established on February 17, 2001, by Research Institute Patent Microorganisms Depositary Center (Postal Code: 2005-85-66, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 1-1-1 Higashi, Chuo No. 6) has been transferred to the International Depositary under the accession number FERMBP-7828.
  • the fusion protein of the first invention in which the nuclear localization signal, the polypeptide encoded by the DNA of the first invention, and another protein are fused, the presence state differs depending on the oxygen state in the cell .
  • the fusion protein when the cell is under hypoxic conditions, the fusion protein is stably present, and under aerobic conditions, the fusion protein is actively degraded. Therefore, when the above-described vector of the first invention is introduced into a cell and the fusion protein encoded by the vector is expressed, the protein constituting the fusion protein of the first invention is expressed depending on the oxygen state in the cell. The presence can be adjusted.
  • the protein can be stably retained if the cell is hypoxic, and the amount of protein can be reduced if the cell is aerobic.
  • the vector of the first invention using the protein for labeling as another protein is retained in a cell, and the fusion protein of the first invention containing the protein for labeling is expressed.
  • the protein for the label using the label as an index in other words, by monitoring the presence state of the fusion protein of the first invention, cells under hypoxic conditions can be detected. .
  • hypoxic cells can be visualized.
  • the first development using cytotoxic proteins as other proteins When the light vector is retained in a cell and the fusion protein of the first invention containing a cytotoxic protein is expressed in the cell, cell growth under hypoxic conditions can be inhibited. Specifically, by inserting DNA encoding the fusion protein of the first invention into a retrovirus or adenovirus and administering it to the body, tumor hypoxia, which has become a problem at the site of cancer treatment, is administered. Toxic proteins can be expressed only in the region. Therefore, cells that are under hypoxic conditions can be selectively removed, which may lead to the development of new treatments for cancer treatment.
  • the fusion protein of the second invention comprises NLS, a protein having a membrane permeable activity, another protein, and another protein in a cell that retains the fusion protein when fused with NLS and another protein.
  • NLS a protein having a membrane permeable activity
  • another protein a protein having a membrane permeable activity
  • another protein a protein having a membrane permeable activity
  • another protein a protein having a membrane permeable activity
  • another protein in a cell that retains the fusion protein when fused with NLS and another protein.
  • the polypeptide contained in the fusion protein of the second invention is a polypeptide encoded by the DNA of the first invention described above, that is, a polypeptide similar to the polypeptide contained in the fusion protein of the first invention. Can be used. Specifically, it is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It may be a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as long as it can impart stability depending on the intracellular oxygen concentration. A part of the guideline is as described in the description of the polypeptide coded by the DNA of the first invention described above.
  • the polypeptide contained in the fusion protein of the second invention is a polypeptide contained in the fusion protein of the first invention, that is, HIF-1 of SEQ ID NO: 1 557a.a.- 574a.a. It is particularly preferable to use a polypeptide corresponding to the above specific region.
  • the polypeptide contained in the fusion protein of the second invention only needs to have the specific region, and for example, corresponds to the region 401a.a.-603a.a. of HIF-1.
  • the polypeptides that are used can be used, and preferably, for example, 548a.a.-603a.
  • a polypeptide corresponding to the region a. can also be used.
  • the NLS used in the fusion protein of the second invention can be the same as the NLS in the fusion protein of the first invention described above.
  • the protein having a membrane-permeable activity used in the fusion protein of the second invention is an activity of permeating a cell membrane into the fusion protein when fused with the polypeptide and another protein.
  • the protein is not particularly limited as long as the protein imparts the same, but preferably includes TAT, the tnird alpha-hex of Antennapeaia homeodom ains VP22 protein from herpes simplex virus, and the like.
  • TAT is a protein derived from HIV (human immunodeficiency virus) and having an activity of crossing a cell membrane. Specific examples include a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • TAT in the present invention may be a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 as long as it has an activity of permeating a cell membrane.
  • a protein having an amino acid sequence consisting of 9 or more amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is exemplified. More specifically, it includes a protein having an amino acid sequence consisting of amino acids 3 to 11 of SEQ ID NO: 4.
  • the same protein as the other protein in the fusion protein of the first invention can be used.
  • similar examples include a protein for labeling and a protein having cytotoxicity.
  • the above-mentioned TAT, another protein, and another protein in a cell that retains the same fusion protein when fused with TAT and another protein is a fusion evening protein
  • TAT When the above-described TAT is used as a protein having a membrane-permeable activity, a fusion protein having cell-permeability and stability depending on the intracellular oxygen state can be obtained even in an embodiment having no NLS. In other words, proteins with membrane permeable activity When TAT is used, the fusion protein of the second invention of the present invention is obtained regardless of the presence or absence of NLS.
  • polypeptides and other proteins in other aspects of the fusion protein of the second invention of the present invention have been described in the description of the fusion protein of the second invention of the present invention. It is as follows.
  • a vector according to the second invention of the present invention is a vector capable of expressing the fusion protein of the second invention.
  • DNA that encodes NLS DNA that encodes a protein having fl permeable activity, and NLS and cells that, when fused to other proteins, retain the fusion protein, Contains DNA encoding a polypeptide that confers oxygen concentration-dependent stability to other proteins, and inserts DNA encoding other proteins into these DNAs, resulting in nuclear localization signals and membrane-permeable activities
  • a vector capable of expressing a fusion protein with the polypeptide and another protein is a vector capable of expressing the fusion protein of the second invention.
  • another embodiment of the vector according to the second invention of the present invention is a DNA encoding TAT, which is fused with TAT and another protein, and contains the other protein in a cell holding the fusion protein.
  • DNA that encodes a polypeptide that imparts stability dependent on oxygen concentration to the DNA, and DNAs encoding other proteins are inserted into these DNAs, and TAT, the polypeptide and other.
  • the DNA encoding the polypeptide is a polypeptide whose amino acid sequence satisfies the conditions described in the description of the fusion protein of the second invention. It is not particularly limited. Specifically, the DNA encoding the polypeptide of HIF-1557a.a.-574a.a. Includes, for example, a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 or a partial base sequence thereof. Examples of DNA encoding the polypeptide of HIF-1 strain 548a.a.-603a.a. include DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a partial nucleotide sequence thereof. Can be
  • the DNA encoding NLS may be, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6, or a part thereof, as described in the description of the vector of the first invention.
  • the DNA encoding a protein having a membrane-permeable activity includes, specifically, for example, a DNA encoding TAT.
  • the TAT-encoding DNA is not particularly limited as long as it has an activity of crossing the cell membrane.
  • the DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and the amino acid number of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 examples thereof include DNA encoding an amino acid sequence consisting of 3 to 11, and more specifically, DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or a partial base sequence thereof.
  • a DNA encoding another protein as described above may be used together with NLS, DNA encoding a protein having a membrane-permeable activity and a polypeptide, or And a DNA encoding another protein, such as TAT and a DNA encoding the polypeptide, so as to express the fusion protein of the second invention.
  • the fusion protein of the second invention includes, for example, NLS, a protein having a membrane-permeable activity, a polypeptide, and other proteins in order from the N-terminus. That is, in the vector of the second invention, the DNAs encoding these polypeptides and various proteins are ligated in such a manner that the frames coincide with each other, and further, an expression control sequence such as a promoter necessary for gene expression. including.
  • promoter examples include the SV40 early promoter ⁇ lac promoter.
  • the cells into which the vector of the second invention of the present invention is introduced include microbial cells.
  • microorganisms include bacteria such as Escherichia coli, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi such as Aspergillus nidulans, and cultured cells of animals or plants.
  • Escherichia coli LMPG 194 / pBAD 3-0 and LMPG 194 / pBAD 557 which respectively carry the plasmids pBAD / 3-0 and pBAD / 557-574 shown in Examples described later, 574, March 16, 2001, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Microorganisms Depositary Center (Zip code 305-5-8566, Tsukuba, Higashi 1-chome, 1-chome, Chuo No. 6) (Former: Industrial Technology Accession No. FERM P-18258 at Research Institute of Biotechnology, Industrial Technology Research Institute (Zip 1-3, Higashi 1-3-chome, Ibaraki, Japan 305-8566); Deposited as FERM P-18259 I have.
  • the adjusting method comprises permeating the fusion protein of the second invention from outside the cell into the cell, and adjusting the presence state of the fusion protein of the second invention according to the oxygen state in the permeated cell. It is characterized by.
  • the fusion protein of the second invention can be suitably taken into cells.
  • the term “incorporation” refers to the case where the protein is permeated from the outside of the cell to the inside of the cell. Can also be included.
  • the presence state of the fusion protein is regulated according to the oxygen state means that, specifically, as described above in the section of the fusion protein of the first invention, the second state is present in a cell under hypoxic conditions.
  • the fusion protein of the invention of the invention is regulated so as to exist more stably than under aerobic conditions.
  • a protein for labeling is used as another protein, and the presence state of the fusion protein is monitored using the label as an index.
  • the fact that cells under hypoxic conditions can be detected is as described in the method for controlling the presence state of the fusion protein of the first invention.
  • a cytotoxic protein is used as another protein, and the fusion protein is produced under hypoxic conditions.
  • the point that the growth of cells under hypoxic conditions can be inhibited by the presence of protein in the cells is described in the method of regulating the state of the fusion protein of the first invention. It is as follows. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows a schematic of the plasmid pCH / 0-0.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of plasmids pCH / 0-0 to pCH / 4-0.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of the plasmid pCH series.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of plasmids pCH / 3- ⁇ (ANLS) and pCH / 557-574 (ANLS).
  • FIG. 5 is a diagram (photograph) showing the results of X-gal staining.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram representing the structure of each fusion protein.
  • FIG. 7 is a diagram (photograph) showing the results of X-gal staining.
  • FIG. 8 is a diagram (photograph) showing the results of X-gal staining.
  • FIG. 9 is a diagram (photograph) showing the results of observation of apoptosis depending on the oxygen concentration in Example 6.
  • All indicated vectors were constructed based on the plasmid pCHllO Eukaryotic Assay Vector (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the plasmid has the Simian virus 40 early promoter overnight. '
  • Antisense primer (SEQ ID NO: 18) aaggtac c tgt aatggtgac aactgatcgaagga
  • Each plasmid was genetically engineered to fuse the ODD domain shown in Table 2 with the NLS and lacZ genes at the protein level.
  • “A.a.” indicates the position of the amino acid residue in the ODD domain.
  • pCH / 0-0 indicates that the DNA chain encoding positions 401 to 603 of the ODD domain was fused with the DNA chain encoding the NLS and lacZ genes.
  • Table 2 Plasmid fusion protein pCH / 0- ⁇ NLS / HIF-1 401a.a.-603a.a./ ⁇ - Gal
  • F0 and RO indicate the positions of the primers used for PCR.
  • the bold line in the figure indicates the ODD domain fused to the lacZ gene in each plasmid and the length thereof.
  • pCH / 0-0 a DNA chain encoding positions 401 to 603 of the ODD domain is fused with a DNA chain encoding NLS and lacZ genes.
  • F0, F1, F2, F3, F4, R ⁇ , R1, R2, R3, and R4 represent the positions of the primers used for PCR.
  • ODD 562-569 sense DNA SEQ ID NO: 21
  • Each plasmid was genetically engineered to fuse the ODD domains shown in Table 3 with the NLS and lacZ genes at the protein level.
  • Table 3 Plasmid fusion protein pCH / 557-574 NLS / HIF-1 557a.a.-574a.a./5-Gal
  • L and D indicate the amino acid sequence of the ODD domain fused to the lacZ gene in each plasmid.
  • pCH / 562-569 states that "a DNA strand encoding LAPYI PMD (SEQ ID NO: 29) j is fused with a DNA strand encoding NLS and lacZ genes.
  • Each plasmid was genetically engineered to fuse the lacZ gene with the ODD domain shown in Table 4 at the protein level.
  • the bold line indicates the length of the ODD domain fused to the lacZ gene in each plasmid.
  • pCH / 3-0 ANLS
  • a DNA strand encoding the 0DD domain of 548a.a.-603a.a is fused with a DNA strand encoding the lacZ gene.
  • HEK293 cells (derived from human fetal kidney) were cultured in Dulbecco's MEM medium (GIBCO BRL) containing 5% FCS, 100 U / ml ⁇ nicillin, and 100 / g / ml streptomycin (Meiji Pharmaceutical) at 37 ° C. They were cultured in 5% C0 2 incubator scratch.
  • the ODD domain of HIF-1 protein (401 &. &. -603 &. & Region) fused with NLS and lacZ gene: pCH /
  • NLS I HIF-la 401a. A. -603a. A./lacZ NLS I HIF-la 401a. A. -603a. A./lacZ was constructed ([A: Materials and Methods] ⁇ 1> (1)). Since NLS sequences are encoded in wild-type HIF-1 and pCH I 0-0, pCH I0-0 was constructed to fuse NLS with the ODD domain.
  • the IX 10 5 HEK293 cells were plated in 6-well multi-well dishes, and the positive Mi de pCH I 0-0 the following day 5 ⁇ g was introduced into cells by the calcium phosphate variants. 24 hours, 37 ° C, 3%
  • A. Is important for the stability control of the fusion protein depending on Cbz-LLL.
  • the results of X-gal staining of pCH / 3-0 are shown in FIG. 5 in comparison with pCHUO.
  • a and B are plasmids obtained by introducing plasmid pCHUO into HEK293 cells.
  • C and D introduce pCH / 3-0.
  • B and D are cultures in a medium containing Cbz-LLL
  • a and C are cultures in a medium without Cbz-LLL.
  • the plasmid pCH / 562-569, 557-571, 560-574 (the HIF-1 strand 562a.a. -569a.a ⁇ , 557a. A. -570a.a., 560a, a.- 571 ⁇ 2.a. Fused with NLS and LacZ)
  • the degradation of proteins by the ubiquitin / proteasome system is controlled by changes in the phosphorylation state of the target protein.
  • the degradation of the constructed fusion protein by the ubiquitin system may be controlled by changes in the phosphorylation state. Therefore, the plasmid pCH / 557-574, in which the tyrosine residue at the 5 ⁇ 5 position, which is the only amino acid that can be phosphorylated in HIF-1 and 557a-574a.
  • 557-574 (Y565A) was constructed ([A: Materials and Methods] ⁇ 1> (2), see Fig. 3), plasmid was introduced into HEK293 cells in the same manner as above, and X-gal staining was performed.
  • Table 9 shows the results. Table 9 Plasmid Cbz-LLL-dependent fusion protein stability control pCH / 557-574 +
  • NLS nuclear localization signal
  • Annealing of synthetic oligonucleotides is performed as follows. A total of 200 ⁇ 1 reactions were performed by mixing 10 ⁇ 1 of the synthetic single-stranded oligonucleotides (concentration 100 ⁇ M) complementary to each other, adding 20 ⁇ 1 NaCl solution (1M) and 160 zl of purified water. Adjust the liquid. Heat it at 95 ° C for 1 minute, keep it at 75 ° C for 1 minute, and gradually cool to 37 ° C over 2 minutes per 1 ° C. Next, add 10 ⁇ 1 sodium acetate solution (3M) and 250 ⁇ 1 ethanol to the 100 ⁇ 1 DNA solution, and centrifuge at 12krpm for 10 minutes (4 ° C). After that, discard the supernatant, wash the precipitate with 70% ethanol, and finally remove 70% ethanol to obtain purified DNA.
  • plasmid DNA purified by ethanol precipitation 1 g is dissolved in 10 1 universal buffer (TAKARA Biomedical) and 90) 1 purified water, and the desired restriction enzyme is added thereto, followed by pipetting. After 37. Perform by incubating at C for 30 minutes.
  • agarose gel including EtBr electrophoresis is performed to isolate the target DNA fragment treated with the restriction enzyme from other DNA fragments.
  • DNA is cut by applying 3651 UV lamp to this agarose gel. Visualize the fragment and cut out the agarose gel containing the target DNA fragment with a razor.
  • QIA Quick Gel Extraction Kit Qiagen
  • Ligation is performed according to the kit procedure using a DNA ligation kit Ver.2 (TAKA A Biomedical) to bind a plurality of DNA fragments to phosphodiesters in a test tube (in vitro).
  • the amount of both the vector DNA fragment and the insert DNA fragment used for ligation should be 10 ng.
  • the following synthetic oligo DNA (SEQ ID NO: 32, 33) encoding the TAT sequence was subjected to DNA fragment treatment, and pCH / 3-0 or pCH / 557-574 was treated with the restriction enzyme Bgll.
  • the product was incorporated into Yuichi Iku to obtain pCH / TAT / 3-0 and pCH / TAT / 557-574.
  • Plasmid pBAD / His / lacZ Vector has two BamHI sites. After digesting only the 413th base digestion site, the DNA ends were blunted. A DNA fragment of about 5170 bp generated by digestion with the restriction enzyme Sacl followed by Bow I was cut out by agarose gel electrophoresis to obtain a pBAD / His / lacZBamHI-Sacl vector. On the other hand, pCH / TAT / 3-0, pCH / T After digesting AT / 557-574 with the restriction enzyme Hindll I, the DNA termini were blunted, and a DNA fragment of about 2250 bp generated by treatment with the restriction enzyme Sacl was cut out by agarose gel electrophoresis. These were ligated into pBAD / His / lacZ BamHI-Sacl vector to obtain pBAD / 3-0 and pBAD / 557-574.
  • a DNA fragment obtained by ligating the following synthetic oligo DNA (SEQ ID NO: 36, 37) encoding the TAT sequence was inserted into a vector obtained by treating pCH / P. With the restriction enzyme KpnI. pCH / TAT / PC was constructed.
  • aa indicates the position of an amino acid residue in the ODD domain.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the structure of each fusion protein.
  • a plasmid expressing each fusion protein was constructed so as to have an active region as shown in FIG.
  • each plasmid corresponds as shown in Table 12.
  • Table 12 Plasmid SEQ ID NO: pCH / TAT / 3- ⁇ 38
  • E. coli strain LMG194 was transformed using the three expression vectors a) pBAD / P., B) pBAD / 3-0, and c) pBAD / 557-574.
  • each glucose plate was picked up from each culture plate, inoculated into 10 ml of TB medium (containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin), and cultured with shaking at 37 ° C.
  • 1 ml of overnight culture was added to 200 ml of TB medium (containing 50 ⁇ g / ml of ambicilin) and cultured with shaking at 37 ° C. Absorbance of culture solution 0D 6 . .
  • 0.4 g of L-(+)-arabinose was added to each culture to induce the expression of the fusion protein, and the culture was continued until the next day.
  • the fusion protein was roughly purified using Ni-NTA agarose (QIAGEN) according to the attached protocol. Further refine the degree of fusion protein after rough purification MICROCON YM-100 (AMICON) was used according to the protocol provided to increase the concentration of the fusion protein and to replace the buffer with PBS.
  • A549 cells (derived from human lung cancer) were cultured on a Dulbecco's MEM medium (GIBCO BRL) containing 5% FCS, 100 U / ml penicillin and lOO ⁇ gZml streptomycin (Meiji Pharmaceutical) as a normal medium. The cells were cultured at 5 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • A549 cells to which 3-0 protein had been added showed significantly deeper staining when Cbz-LLL was added (see FIGS. 7C and D). This indicates that the activity of the ODD region (548a.a.-603a.a of HIF-1) fused to the 3-0 protein increased the stability of the fusion protein in the presence of Cbz-LLL. It represents. When the same experiment was performed with the addition of the 557-574 protein, results similar to those obtained with the 3-0 protein could be obtained.
  • a and B are those to which P. ⁇ -gal is introduced, and C and D are those to which 3-0 ⁇ -ga1 is added.
  • a and C show the results when the cells were cultured in a medium containing no Cbz-LLL, and B and -D show the results when the cells were cultured in a medium containing Cbz-LLL.
  • Example 4 X-gal staining was performed in the same manner as in Example 4 except that the method of forming a hypoxic state in Example 4 was changed as described below.
  • A549 cells to which 3-0 protein had been added showed significantly deeper staining when hypoxic with 1% O 2 gas aerated (see FIGS. 8C and D).
  • a and B show that P./?-gal was introduced, and C and D show that 3-0 ⁇ -ga 1 was added.
  • A, C is a medium aerated with 20% ⁇ 2 gas (aerobic conditions)
  • B, D is a medium aerated with 1% 0 2 gas (hypoxic condition).
  • PCR was performed using the following two types of synthetic oligo DNA, and the TAT signal sequence derived from HIV and the oxygen-induced degradation domain (ODD) derived from HIF-1 gene were coded. DNA that has been amplified. This was treated with restriction enzymes BamHI and EcoRI, and then incorporated between BamHI and EcoRI of PGEX-6P-3 plasmid (Amersham Pharmacia Biotech) to construct pGEX / TAT-ODD.
  • the human lung cancer-derived cell line A549 cDNA was type III, and PCR was performed using the following two types of synthetic oligo DNAs to amplify the human-derived Caspase-3 gene, and the restriction enzymes EcoRI and SaII After treatment with pGEX / TAT-ODD, the plasmid pGEX / TAT-0DD3- is inserted between EcoRI and Sai of pGEX / TAT-ODD, and expresses the protein GST-TAT-ODD-wt. 0-wt.Casp3 was constructed.
  • Mutant Caspase3 having no apoptosis-inducing activity was replaced with Vocero-Akbani, AM, Heyden, NV, Lissy, NA, Ratner, L. Nat. Med. 5: 29-33, 1999. ls by transduction with an HIV protease -activated caspase-3 protein. This structural gene was constructed using Casp-sense-EcoRI primer and Casp-anti-Sail.
  • BL21 (DE3) pLysS competent cells (Novagen) were transformed. The next day, a single colony was picked from each culture plate, phagocytosed with 10 ml of a TB medium (containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin), and inoculated at 37 ° C.
  • the mouse embryo-derived cell line NIH3T3 uses Dulbecco's MEM medium (GIBC0 BRL) containing 10% FCS, 100 U / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin (Meiji Pharmaceutical) as a normal medium. in 37 ° C, and cultured in 5% C0 2 incubator Bae Isseki scratch.
  • Dulbecco's MEM medium GIBC0 BRL
  • FCS 100 U / ml penicillin
  • 100 ⁇ g / ml streptomycin Meiji Pharmaceutical
  • Fig. 9 shows the observation results of apoptosis for each well.
  • a fusion protein containing a protein having a region involved in stabilizing the identified HIF-1 protein which has stability dependent on intracellular oxygen status. It was possible to provide a fusion protein having
  • fusion protein containing a protein having a region involved in stabilizing the identified HIF-1 protein which is a fusion protein having cell membrane permeability and stability depending on intracellular oxygen status.
  • the presence of a desired protein can be regulated depending on the amount of oxygen in a cell holding a fusion protein, so that cells under hypoxic conditions can be detected. It can be used to inhibit the growth of spores.

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Description

明細書
有酸素条件下の細胞内でタンパク質を不安定化させるポリべプチドとそれをコー ドする D N A 技術分野
本発明は、 有酸素条件下におかれた細胞内でタンパク質を不安定化させるポリ ペプチドと、 同ポリペプチドをコードする D N A、 及び同 D N Aを利用する方法 に関する。 また、 該 D N Aを含み、 細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する 融合タンパク質を発現し得るベクターに関する。
さらに本発明は、 上記ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、 細胞膜透 過性、 及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質、 及び、 該融合タンパク質を用いる方法に関する。 また、 該融合タンパク質を発現し得る ベクターに関する。
本発明は、 微生物工業、 医薬、 医療等の分野で有用である。 背景技術
固形腫瘍内の酸素分圧は均一ではなく、 腫瘍細胞はさまざまな酸素環境にさら されている。 これは、 血管から腫瘍組織へ酸素分子が拡散する距離が限られてい ることに起因する。 放射線生物学の分野では、 各腫瘍細胞に供給される酸素量に 応じて固形腫瘍の内部を 1 ) 有酸素領域、 2 ) 懐死領域、 3 ) 低酸素領域という 3つの領域に分類している。
1 ) 毛細血管からの距離がおよそ 7 0〃mまでの腫瘍細胞には酸素分子が非常 に多く供給されることから、 この領域は有酸素領域と呼ばれている。 固形腫瘍に 対する放射線治療の効果を得るためには酸素分子が必須である。 したがって文字 どおり酸素分子に富む有酸素領域は、 放射線感受性が非常に高い領域である事が 知られている。 化学療法を実施する際にも、 血管系から有酸素領域へ抗癌剤が容 易に拡散する事から、 有酸素領域に対する化学療法の治療効果は高いと考えられ ている。
2 ) 血管から放出された酸素分子は拡散途中に有酸素領域の腫瘍細胞に消費さ れる。 したがって、 毛細血管から遠い領域に存在する腫瘍細胞には生存に十分な 酸素分子が供給されない。 その結果、 血管系からの距離がおよそ 7 0 m以上離 れている腫瘍細胞は懐死に陥り、 懐死領域を形成している。
3 ) これら有酸素領域と懐死領域の間の領域に低酸素性細胞からなる低酸素領 域が存在する。 低酸素領域には腫瘍細胞の生存に必要最低限の酸素分子は供給さ れている。 しかし、 放射線治療の効果を得るために十分な量の酸素分子は供給さ れていない状態になっている。 したがって、 腫瘍内低酸素領域は放射線感受性が 非常に低く、 放射線治療後の腫瘍再増殖の一因であるとされている。 化学療法を 行う際においても、 血管系から低酸素領域へ拡散する抗癌剤の量が限られている 事から、 十分な治療効果を期待できないのが現実である。
また、 この様な低酸素性細胞の存在の確認は困難であった。 それは、 細胞に於 ける酸素の存在状態をモニターする手段が実質的に存在しなかったためである。 この様な低酸素性細胞のモニター方法としては、 微小電極を用いて細胞の酸素電 圧を測定する方法や、 低酸素性細胞指示薬として知られるピモニダゾール (Hypox yprobe-1 )を用いた免疫組織染色、 さらに低酸素条件下におかれた細胞内で発現 が誘導される遺伝子産物を標識とする免疫組織染色等が知られている。 ところが 、 これらは技術的にも難しいばかりか、 装置も複雑で汎用されていないのが現状 であった。 即ち、 汎用的な低酸素細胞の検知手段の開発が望まれていた。
また、 上述のとおり、 癌療法に於いては、 低酸素性癌細胞の存在は、 放射線治 療ゃ化学療法剤による治療の妨げになるものであり、 これらを効果的に取り除く 手段が望まれていた。 この様な低酸素性細胞に対する処置としては、 低酸素性細 胞放射線増感剤と放射線治療の併用が知られているのみであつたが、 目下 1品が 臨床試験にあるのみで、 現在実用に供されている低酸素性細胞放射線増感剤はま だ存在していない。 これは、 低酸素性細胞放射線増感剤の母核である 2—ニトロ ィミダゾ一ルに神経毒性があり、 この毒性と薬効とのコント口一ルが難しかった ことに起因する。 即ち、 効果的に低酸素性の癌細胞を駆逐する手段の開発が望ま れていた。
ところで、 低酸素璟境にある細胞内では血管内皮細胞増殖因子 ( ascular endo thelial growth factor; VEGF)や赤血球系前駆細胞増殖因子（且 rythropoietin; E PO )をはじめとする生理的に重要な遺伝子の発現が誘導される。 これらの遺伝子 の発現は低酸素誘導因子一 1 ( ypoxia- inducible factor-1 complex,以下 HIF-1 ) によって転写レベルで誘導される。
H I F— 1は H I F— 1ひタンパク質と H I F— 1 3タンパク質からなるへテ 口ダイマーである。 両サブュニットともその N末端にベーシック一ヘリヅクス一 ノレープ一ヘリヅクス · ドメイン ( asic- el
Figure imgf000005_0001
domain; bHLH domain) と呼ばれる D N Aへの結合を担う領域と、 パス · ドメイン ER- aryl hydrocarbo n nuclear trans locator (ARNT)-SIM (PAS) domain)と呼ばれるヘテロダイマー の形成を担う領域を有する。 また、 H I F— 1ひタンパク質は 2つのトランスァ クテイべーシヨンドメイン -/ C- transact ivat ion domain; N-TAD, C-TAD )を 有することも明らかになつている。
近年、 H I F— 1の酸素濃度に依存した活性化機構が明らかになった。 H I F - 1 /3 mR N Aの転写、 および翻訳は常に活性化されており、 その遺伝子産物
(タンパク質） は外界の酸素分圧に非依存的に常に発現している。 同様に H I F - 1 mR N Aの転写、 および翻訳も常に活性化されているが、 生合成された H I F - 1ひタンパク質は有酸素条件下で積極的に分解され、 低酸素条件下での み安定に存在する。
このように、 H I F— 1ひタンパク質の安定性は外界の酸素濃度に依存して制 御されており、 主にそのタンパク質量に依存して H I F— 1の転写活性も制御さ れていることが明らかになっている。
また、 現在までに HIF-1ひの部分欠失変異体を用いた実験で、 HIF- 1ひの低酸素 条件下での安定化には 401a. a. -603a. a.の領域が重要である事が報告されている (Huang LE, Gu J, Schau M and Bunn HF . 1998. Regulation of hypoxia- indue ible factor 1 alpha is mediated by an 02 - dependent degradation domain vi a the biq itin-proteasome pathway. Proc . Natl . Ac d. Sci . USA. 95 :7987- 7992. ：文献 1 ) 。 この領域は ODDドメイン （ xygen Dependent Degradation dom ain) と呼ばれている。
H I F— αの酸素依存的安定性は、 この領域にあるアミノ酸残基が、 有酸素状 態で酸素依存的になんらかの修飾を受けることが示唆されており、 最終的にュビ キチン化され、 プロテアゾームで分解されることが判っていた（Huang, L. E.， G u, J. Scliau, M. and Bunn, H. F. Regulation of hypoxia-inducible factor 1 is mediated by an O2 - dependent degradation domain via the ubiquitin-p roteasome pathway. Proc. Natl . Acad. Sci. USA. 95 : 7987-7992, 1998. )。 従って、 H I F— の安定性は、 プロテアゾーム阻害剤、 例えば N-カルボベン ゾキシル- L-口イシニル- L-口イシニル- L-ノルバリナル （N- carbobenzoxyl- L- leu cinyl-L-leucinyl-L-norvalinal) (以下、 「Cbz - Ii 」 ともいう) (Rock, K. L. , Gramm, C. , Rothstein, L. , Clark, K. , Stein, R. , Dick, L. , Hwang, D. an d Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class
I molecules. Cell 78: 761-771, 1994.： 文献 3 )を加えた培地で培養すること により、 低酸素状態と同様の安定性を得ることができることも判っていた（ Sutte r， C. H. , Laughner, E. and Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor l a p rotein exprssion is controlled by oxygen-regulated ubiquitination that i s disrupted by deletions and missense mutations. Proc . Natl. Acad. Sci . USA. 97: 4748-4753, 2000.： 文献 4 )。 このことから、 該ポリペプチドを含む融 合蛋白の分解も、 H I F— 1ひ同様にュビキチン一プロテアゾームによる分解機 構を介しておこなわれることが想定され、 低酸素状態および Cbz-LLLを含む培地 で安定化することが想定された。
また、 HIF-1 タンパク質の 530a. a. -652a. a.を融合させた Gfa卜 4夕ンパク質は 、 酸素濃度が高い場合にのみ培養細胞内で積極的に分解されるといった制御を受 ける事が報告されている （Vickram Srinivas, Li-Ping Zhang, Xiao-Hong Zhu and
Jaime Caro .1999. Characterization of an Oxygen/Redox-Dependent Degradat ion Domain of Hypoxia- Inducible Factor a (HIF a ) Proteins . Biochem. Biophy .Res . Com.260 : 557- 561：文献 5 ) 。 また、 Ga卜 4と HIF- 1ひの 529a. a. -826a. a.を 融合させた遺伝子の中の HIF- 1 561a. a. -568a. a.をァラニン残基に置換すると、 上記の制御が消失する事も報告されている。 この事から、 マウスの HIF- 1 αから ヒ トの HIF- 1ひまで良く保存されている11 -1 0：の561&. &. -568a. a.を中心とする 領域が 酸素濃度に依存したタンパク質の安定化に関わっているのではないかと 推測されている。 尚、 HIF- 1ひの 557a. a.— 57 . a.の領域が、 HIF- 1ひタンパク質 の安定性の制御に重要な役割を果たしているのではないかとも論じられている （ 上記文献 5 ) 。
しかしながら、 本発明者らは、 前記 557a. a—571a. a.の領域のみでは、 融合夕 ンパク質の安定化を酸素濃度に依存させることができないことを見い出した。 ま た、 H I F— 1ひタンパク質のうち、 融合タンパク質の安定化に関与する領域は 同定されているとはいえなかった。
一方、 HIV (ヒト免疫不全ウィルス） 由来の TATと呼ばれるタンパク質が細胞膜 を通過する活性を持つ事が 1988年に報告されている (Cell ； 55, 1179(1988)、 Pr oc.Natl.Acad. Sci USA ； 91,664(1994)) 。 その後、 TATタンパク質のわずか 11ァ ミノ酸からなる領域 （TAT protein transduction domain) が上記の活性を担つ ている事が明らかにされた。 同時にこの TAT protein transduction domainが融 合された/?—ガラクトシダ一ゼのタンパク質が細胞内に取り込まれる事も報告さ れている。
しかし、 上記 H I F— 1ひと T A Tの関係、 ひいては H I F— 1 と膜透過性 活性を有するタンパク質の関係については従来知られておらず、 よって、 H I F - 1ひタンパク質の安定化を制御する特定領域を利用して、 該特定領域を有する H I F— 1 ひ夕ンパク質、 膜透過性活性を有する夕ンパク質及び他の夕ンパク質 を融合したときに、 該融合タンパク質を細胞内に取り込ませることができること 、 並びに融合タンパク質を保持する細胞内において、 融合タンパク質に酸素濃度 に依存した安定性を付与することができることについては知られていない。 発明の開示
本発明は、 上記の様な状況下なされたものであり、 融合させることによって任 意のタンパク質の安定性を酸素濃度依存的に制御し得る H I F— 1 αタンパク質 の領域を同定すること、 及び、 同領域を利用して酸素の多少に応じ、 特定遺伝子 の発現、 及びそれに対応する融合タンパク質の発現を制御することを課題とする また、 特定された H I F - 1 αタンパク質の安定化に関与する領域を有する夕 ンパク質を含む融合タンパク質であって、 細胞膜透過性、 及び細胞内の酸素状態 に依存した安定性を有する融合タンパク質、 及び、 該融合タンパク質を好適に細 胞に取り込ませ、 かつ取り込ませた細胞において、 酸素の多少に応じ融合タンパ ク質の安定性を調節することができる、 融合夕ンパク質の調節方法を提供するこ とを課題とする。
また、 これら融合タンパク質を発現し得るベクタ一を提供することを課題とす る。
本発明者らは、 前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 HIF— 1 ひタンパク質のァミノ酸配列のうち、 配列番号 1のアミノ酸配列を有する領域が 、 同領域を融合させたタンパク質が有酸素下で分解を受ける場合のシグナルとな る部分の要部となっていることを見出した。
また、 上記特定領域を有する H I F— 1ひタンパク質と膜透過性活性を有する タンパク質とを含む融合タンパク質は好適に細胞に取り込まれることを見出し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、 以下のとおりである。
(1) 以下の （A) 又は （B) に示すポリペプチドをコードする DNA。
( A ) 配列番号 1のァミノ酸配列からなるポリぺプチド。
(B)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 16個以上のアミノ酸残基 からなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 核局在化シグナル、 及び他のタンパク質と 融合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他のタンパク質 に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリぺプチド。
( 2 ) 低酸素条件下の細胞内では前記融合夕ンパク質は有酸素条件下に比べて安 定化される （1) に記載の DNA。
(3) 配列番号 2の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する （1) 又は （2) に記載の DNA。
(4)核局在化シグナルをコードする DNAと、 （1) 〜 （3) のいずれかに記 載のポリべプチドをコ一ドする DNAを含み、 これらの DNAに他のタンパク質 をコードする DNAを挿入し、 核局在化シグナル、 前記ポリペプチド及び他の夕 ンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクタ一。 (5)前記他のタンパク質をコードする DNAを含む （4) に記載のベクタ一。
(6)細胞内が有酸素条件下であるときに、 ベクター含有細胞において前記融合 タンパク質を不安定にさせ得る （5) に記載のベクタ一。
(7)前記他のタンパク質が、 標識のためのタンパク質及び/又は細胞毒性を有 するタンパク質である （6) に記載のベクタ一。
(8) (4) 〜 （7) のいずれかに記載のベクタ一が導入された細胞。
(9) 前記細胞が微生物細胞である （8) に記載の細胞。
(10)前記微生物がェシヱリヒア，コリである （9) に記載の微生物。
(11) (7) に記載のベクターを保持する細胞であって、 前記他のタンパク質 が、 標識のためのタンパク質である細胞において、 同タンパク質の存在状態をモ 二夕一することを特徴とする、 低酸素条件下の細胞を検出する方法。
(12) (6) に記載のベクターを細胞に導入し、 同ベクターがコードする融合 タンパク質を発現させることを特徴とする、 細胞内のタンパク質存在の調節方法
(13) タンパク質をコードする DNAを保持する細胞における同タンパク質の 存在を調節する方法であって、 前記 DN Aに核局在化シグナル及び （1) に記載 の DNAを連結し、 核局在化シグナル、 (1) に記載の DNAがコードするポリ ぺプチド及び前記タンパク質が融合した融合タンパク質として発現させることを 特徴とする方法。
(14) 前記融合タンパク質を、 低酸素条件下では細胞中に存在させ、 有酸素条 件下では存在させないように調節することを特徴とする （13) に記載の方法。
(15)前記他のタンパク質が、 細胞毒性を有するタンパク質である （7) に記 載のベクターを細胞に保持させ、 低酸素条件下で同ベクターがコードする融合夕 ンパク質を細胞中に存在させることを特徴とする、 低酸素条件下の細胞の生育を 阻害する方法。
(16)核局在化シグナルと、 膜透過性活性を有するタンパク質と、 以下の （A ) 又は （B) に示すポリペプチドと、 他のタンパク質からなる融合タンパク質で あって、 細胞膜透過性、 及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合夕 ンパク質。 (A)配列番号 1のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 16個以上のアミノ酸残基 からなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 核局在化シグナル、 及び他のタンパク質と 融合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他のタンパク質 に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
(17)前記膜透過性活性を有するタンパク質が、 以下の （C) 又は （D) に示 す H I V由来の T ATシグナル配列 （TAT) からなるタンパク質である （16 ) に記載の融合タンパク質。
( C )配列番号 4のァミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)配列番号 4のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 9個以上のアミノ酸残基か らなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパ ク質。
(18) 以下の （A) 又は （B 1) に示すポリペプチドと、 以下の （C) 又は （ D) に示す H I V由来の TATシグナル配列 （TAT) からなるタンパク質と、 他のタンパク質からなる融合タンパク質であって、 細胞膜透過性、 及び細胞内の 酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質。
( A ) 配列番号 1のァミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B 1) 配列番号 1のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 16個以上のアミノ酸残 基からなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 T ATからなるタンパク質、 及び他の夕 ンパク質と融合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他の タンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリぺプチド。
( C )配列番号 4のァミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)配列番号 4のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 9個以上のアミノ酸残基か らなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパ ク質。
(19) 低酸素条件下の細胞内では有酸素条件下に比べて安定に存在する （16 ) 〜 （18) の何れかに記載の融合タンパク質。
(20) 前記他のタンパク質が、 標識のためのタンパク質及び/又は細胞毒性を 有するタンパク質である （16) ~ (19) の何れかに記載の融合タンパク質。 (21) (16) 又は （18) に記載の融合タンパク質を細胞外から細胞内に透 過させ、 該透過した細胞中における酸素状態に応じて、 該融合タンパク質の安定 性を調節することを特徴とする、 融合タンパク質存在の調節方法。
(22)低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質を有酸素条件下に比べて 安定に存在させる （21) に記載の融合タンパク質存在の調節方法。
(23)核局在化シグナルをコードする DNAと、 膜透過性活性を有するタンパ ク質をコードする DNAと、 以下の （A) 又は （B) に示すポリペプチドをコ一 ドする DNAを含み、 これらの DNAに他のタンパク質をコードする DNAを揷 入したときに、 核局在化シグナル、 膜透過性活性を有するタンパク質、 前記ポリ ぺプチド及び他のタンパク質との融合夕ンパク質を発現し得るベクター。
( A )配列番号 1のァミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B) 配列番号 1のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 16個以上のアミノ酸残基 からなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 核局在化シグナル、 及び他のタンパク質と 融合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他のタンパク質 に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
(24)前記膜透過性活性を有するタンパク質が、 以下の （C) 又は （D) に示 す HI V由来の TATシグナル配列 （TAT) からなるタンパク質である （23 ) に記載のベクター。
(C)配列番号 4のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(D) 配列番号 4のァミノ酸配列のうち、 少なくとも 9個以上のァミノ酸残基か らなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパ ク質。
(25) 以下の （A) 又は （B 1) に示すポリペプチドをコードする DNAと、 以下の （C) 又は （D) に示す HI V由来の T ATシグナル配列 （TAT) から なるタンパク質をコードする DN Aを含み、 これらの DN Aに他のタンパク質を コードする DNAを挿入したときに、 TATからなるタンパク質、 前記ポリぺプ チド及び他の夕ンパク質との融合夕ンパク質を発現し得るベクター。
(A) 配列番号 1のァミノ酸配列からなるポリぺプチド。
(B 1)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 16個以上のアミノ酸残 基からなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 T ATからなるタンパク質、 及び他の夕 ンパク質と融合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他の タンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリぺプチド。
( C )配列番号 4のァミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)配列番号 4のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 9個以上のアミノ酸残基か らなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパ ク質。
(26)低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質は有酸素条件下に比べて 安定に存在する （23) 〜 （25) の何れかに記載のベクタ一。
(27) ポリペプチドをコードする DNAが、 配列番号 2の塩基配列又はその一 部の塩基配列を有する （23) 〜 （25) の何れかに記載のベクタ一。
(28) TATからなるタンパク質をコードする DNAが、 配列番号 5の塩基配 列又はその一部の塩基配列を有する （23) 〜 （25) の何れかに記載のベクタ
(29)前記他のタンパク質をコードする DN Aを含む （23) 〜 （28) の何 れかに記載のベクター。
(30)前記他のタンパク質が、 標識のためのタンパク質及び/又は細胞毒性を 有するタンパク質である （29) に記載のベクタ一。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の第 1の発明である D N Aは、 配列番号 1のアミノ酸配列を有するポリ ペプチドをコードする D N Aである。 該ポリペプチドは核局在化シグナル （以下 、 「NLS」 ともいう） 、 及び他のタンパク質と融合したときに、 同融合タンパ ク質を保持する細胞内において、 他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を 付与する。
そして、 上記融合タンパク質は、 該融合タンパク質を保持する細胞が、 低酸素 条件下にあるときは、 有酸素条件下に比べて、 安定的に保持される。 また、 有酸 素条件下の細胞内においては、 低酸素条件下に比べて速やかに分解される。 本発明においては、 低酸素条件とは、 生体内 （in vivo) では約 20mmHg 以下の酸素分圧にある状態をいう。 例えば、 インキュベータの中の酸素濃度を 1 %以下にした細胞培養は低酸素条件である。 また、 有酸素条件とは生体内で約 2 O mmH gを越える酸素分圧にある状態をいう。
第 1の発明の D N Aは、 コードされるポリペプチドが、 同ポリペプチドを含む 融合タンパク質に、 前記のような細胞内の酸素濃度に依存した安定性を付与する ことができる限り、 その一部であってもよい。 具体的には、 配列番号 1に示すァ ミノ酸配列のうち、 少なくとも連続する 1 6個以上、 好ましくは 1 7個以上、 よ り好ましくは 1 8個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有しているポリ ペプチドが挙げられる。 より具体的には、 配列番号 1に示すアミノ酸配列のうち 、 連続する 1 6個以上、 1 2 0個以下、 好ましくは 1 7個以上、 5 0個以下、 よ り好ましくは 1 8個以上、 3 0個以下、 特に好ましくは 1 8個以上、 2 0個以下 のァミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。 さらに具体的 には、 配列番号 1のアミノ酸番号 1〜1 6からなるアミノ酸配列、 又は、 ァミノ 酸番号 3〜 1 8からなるアミノ酸配列を有するポリべプチドが挙げられる。
また、 第 1の発明の D NAがコードするポリペプチドは、 同ポリペプチドを含 む融合タンパク質に、 前記のような細胞内の酸素濃度に依存した安定性を付与す ることができる限り、 前記配列番号 1に示すアミノ酸配列のうち、 少なくとも連 続する 1 5個以上、 かつ 2 0個以下のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列におい て、 1又は数個のアミノ酸残基の置換、 欠失又は挿入を含むアミノ酸配列を有し 、 配列番号 1に示すァミノ酸配列のポリぺプチドと 8 5 %以上の相同性を有する アミノ酸配列を有するものであってもよい。 但し、 配列番号 1のアミノ酸番号 9 のチロシン残基に相当するチロシン残基は、 保存されていることが必要である。
N L Sとは、 細胞内に核膜構造を持つ真核細胞でタンパク質が核に局在するた めに必要なアミノ酸配列をいう。 つまり、 同配列を有するタンパク質は核膜を通 つて核に輸送される。 N L Sは D N A結合タンパク質など核内での活性を有する タンパク質に見られる配列である。
第 1の発明においては、 N L Sは、 第 1の発明の D N Aがコードするポリぺプ チド及び他のタンパク質と融合したときに、 融合タンパク質を保持する細胞内に おいて同融合タンパク質が核へ移行する活性を有していれば特に制限されないが 、 例えば SV40 (simian virus 40) large-T antigenに由来する NLS (large-T ant igenの 126a.a.〜： I32a.a.の領域) が挙げられる (Proc. Natl. Acad. Sci. (1989 ) 86:9327- 9331:文献 7) 。 また、 HIF-1ひも固有の NLSを含んでおり、 同 NLSを用 いることもできる。
他のタンパク質としては、 細胞内において酸素濃度に依存して安定化を制御す ることを目的とするものであれば特に制限されないが、 例えば、 標識のための夕 ンパク質、 細胞毒性を有するタンパク質等が挙げられる。
標識のためのタンパク質としては、 ガラクトシダ一ゼ、 ホースラデイツシ ュパーォキシダ一ゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ等、 発色反応を触媒する酵素が 挙げられる。 これらの発色反応は、 酵素免疫測定法や、 細胞内のタンパク質の存 在状態を調べる手法として、 抗体分野及び微生物分野等でよく知られている。 ま た、 前記タンパク質として、 GFP (グリーンフローエッセンス、 プロテイン） の蛍光性を有するタンパク質も使用できる。
細胞毒性を有するタンパク質としては、 単純へルぺスウィルスのチミジンキナ ーゼの毒素タンパク質、 その他アポトーシス誘導因子等が挙げられる。
第 1の発明の DNAは、 コードするアミノ酸配列が、 上記条件をみたすもので あれば特に制限されないが、 具体的には例えば配列番号 2に示す塩基配列又はそ の一部の塩基配列を有する DN Aが挙げられる。
第 1の発明の DNAは、 コードするアミノ酸配列に基づいて、 通常の化学合成 法にしたがって化学合成することができる。 また、 HIF—1ひのアミノ酸配列 又はそれをコードした cDNAの塩基配列は既に知られており （Gene Bank Acce ssion No.U22431)、 それらの配列及び配列番号 2に示す塩基配列に基づいて作 製したオリゴヌクレオチドをプライマーとする P CR (ポリメラーゼ ·チェイン • リアクション） により、 ヒト又はマウス等の動物の染色体 DNA又は cDNA ライブラリ一から増幅することによつても、 取得することができる。 そのような プライマ一としては、 実施例に示す各種プライマーが挙げられる。 プライマ一の 配列に、 NLSをコードする配列や遺伝子の発現に必要な配列 （例えば Kozak配 列） 、 また制限酵素の認識配列を含ませておくと、 融合タンパク質をコードする DNAの作製が容易になる。
PCRにより得られた増幅産物は、 ェシエリヒア ·コリ等の遺伝子組換えに適 した宿主用のベクターに組み込んでおくと、 以降の操作が容易になる。 そのよう なべクタ一としては、 pBluescript II (T0Y0B0) が挙げられる。
次に、 本発明の第 1の発明であるべクタ一は、 NL Sをコ一ドする DNAと、 第 1の発明のポリべプチドをコードする DNAを含み、 これらの DNAに他の夕 ンパク質をコードする DNAを挿入し、 核局在化シグナル、 前記ポリペプチド及 び他のタンパク質との融合夕ンパク質を発現し得るベクターである。
上記べクタ一において、 ポリペプチドをコードする DNAとは、 具体的には、 上述の配列番号 2に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有する D N Aが挙げ られる。
また、 NLSをコードする DNAは、 例えば配列番号 6に示す塩基配列又はそ の一部の塩基配列を有する D N Aが挙げられる。
また、 本発明の第 1の発明であるベクターの他の態様は、 上記のような他の夕 ンパク質をコードする DNAを、 NL S及び第 1の発明に係わるポリべプチドを コードする DN Aとともに、 融合タンパク質を発現するように含むベクタ一であ る。 融合タンパク質は、 例えば、 N末端から、 NLS、 第 1の発明に係るポリべ プチド、 他のタンパク質の順に含む。 すなわち、 第 1の発明のベクターにおいて 、 これらのポリペプチド及びタンパク質をコードする DNAは、 フレームが一致 するように連結され、 さらに遺伝子発現に必要なプロモーター等の発現制御配列 を含む。
前記プロモーターとしては、 SV40 early promoter lac promoter等が挙げら れる。
本発明の第 1の発明である細胞は、 前記第 1の発明であるベクターが導入され た細胞である。 細胞としては、 微生物細胞が挙げられる。 微生物としては、 ェシ エリヒア 'コリ等の細菌、 サヅカロマイセス 'セレピシェ等の酵母、 ァスペルギ ルス ·二ジュランス等の糸状菌、 及び、 動物又は植物の培養細胞が挙げられる。 これらの細胞に第 1の発明のベクタ一を導入するには、 通常の形質転換法を用い ればよい。
第 1の発明の DNAを含むベクターの一例として後記実施例に示すプラスミ ド pCH/557- 574を保持するェシエリヒア 'コリ DH5ひ I Q/P CH 557 - 57 4は、 平成 1 3年 2月 1日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄 託センター (郵便番号 3 0 5 - 8 5 6 6日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番地 中央第 6 ) (旧 ：産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 —8 5 6 6日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号） ） に受託番号 F E R M P - 1 8 1 9 3として寄託されている。
また、 上記プラスミ ド pCH/557- 574を保持するェシエリヒア ' コリ D H 5 ひ I Q/P C H 5 5 7 - 5 7 4は、 平成 1 3年 1 2月 1 7日に、 上記独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター （郵便番号 3 0 5— 8 5 6 6日本 国茨城県つくば巿東一丁目 1番地 中央第 6 ) に受託番号 F E R M B P— 7 8 2 8として国際寄託に移管されている。
次に、 第 1の発明の D N Aでコードされたポリべプチドを含む融合夕ンパク質 を利用する方法について説明する。
核局在化シグナル、 第 1の発明の D N Aがコードするポリペプチド、 及び他の タンパク質とが融合した、 第 1の発明である融合タンパク質は、 細胞中における 酸素状態に応じて、 存在状態が異なる。
具体的には、 細胞内が低酸素条件下にあるときは、 融合タンパク質は安定に存 在し、 有酸素条件下にあるときは、 融合タンパク質は積極的に分解される。 よって、 上述した第 1の発明のベクタ一を細胞に導入し、 同ベクターがコード する融合タンパク質を発現させる場合、 細胞内の酸素状態に応じて、 第 1の発明 の融合タンパク質を構成するタンパク質の存在を調節することができる。
具体的には、 細胞内を低酸素条件にすればタンパク質を安定に保持させること ができ、 有酸素条件にすればタンパク質量を減少させることができる。
他の夕ンパク質として標識のための夕ンパク質を使用した第 1の発明のベクタ —を細胞に保持させ、 標識のための夕ンパク質を含む第 1の発明の融合夕ンパク 質を発現させ、 該標識を指標として、 該標識のためのタンパク質をモニタ一する と、 言い換えると該第 1の発明の融合夕ンパク質の存在状態をモニターすると、 低酸素条件下の細胞を検出することができる。 特に、 標識として可視化可能なも のを用いると、 低酸素細胞を可視化することができる。
また、 他のタンパク質として細胞毒性を有するタンパク質を使用した第 1の発 明のベクターを細胞に保持させ、 細胞毒性を有するタンパク質を含む第 1の発明 の融合夕ンパク質を該細胞中に発現させると、 低酸素条件下の細胞の生育を阻害 することができる。 具体的には、 レトロウイルスやアデノウイルスに第 1の発明 の融合タンパク質をコ一ドする D N Aを挿入し、 これを体内に投与することで癌 治療の現場で問題となっている腫瘍内低酸素領域でのみ毒性タンパク質を発現さ せることができる。 したがって、 低酸素条件にある細胞を選択的に除去すること ができるため、 癌治療での新しい治療法の開発へと結びつく可能性がある。
次に、 上述した第 1の発明に係わるポリべプチドを含む融合タンパク質であつ て、 細胞膜透過性、 及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する第 2の発明 の融合タンパク質について説明する。
第 2の発明の融合タンパク質は、 N L Sと、 膜透過性活性を有するタンパク質 と、 他のタンパク質と、 N L S及び他のタンパク質と融合したときに同融合タン パク質を保持する細胞内において他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を 付与するポリぺプチドとを含む融合タンパク質であり、 細胞外から細胞内に透過 することができ、 細胞内の酸素状態に依存して安定性が異なる融合タンパク質で ある。
上記第 2の発明の融合タンパク質に含まれるポリべプチドは、 上述した第 1の 発明の D N Aでコードされるポリぺプチド、 つまり第 1の発明の融合タンパク質 に含まれるポリペプチドと同様のポリペプチドが使用できる。 具体的には、 配列 番号 1のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。 また、 細胞内の酸素濃度に 依存した安定性を付与することができる限り、 配列番号 1のァミノ酸配列の一部 であってもよい。 その一部の目安については、 上述した第 1の発明の D NAでコ ードされるポリぺプチドの記載箇所で説明している通りである。
また、 上記第 2の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチドは、 第 1の発 明の融合タンパク質に含まれるポリべプチド、 つまり配列番号 1の HIF- 1ひ 557a. a. - 574a.a.の特定領域に対応するポリぺプチドを用いることが特に好ましい。 但 し、 第 2の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチドは、 該特定領域を有す るものであればよく、 例えば、 HIF- 1ひの 401a.a. - 603a.a.の領域に対応するポリ ペプチドを用いることもできるし、 好ましくは、 例えば HIF- 1ひの 548a. a.- 603a. a.の領域に対応するポリぺプチドを用いることもできる。
また、 上記第 2の発明の融合タンパク質に使用される N L Sは、 上述した第 1 の発明の融合タンパク質における N L Sと同様のものが使用できる。
また、 上記第 2の発明の融合夕ンパク質に使用される膜透過性活性を有する夕 ンパク質とは、 上記ポリペプチド及び他のタンパク質と融合したときに、 同融合 タンパク質に細胞膜を透過する活性を付与するタンパク質であれば特に制限され ないが、 好ましくは T A T、 the tnird alpha - he丄 ix of Antennapeaia homeodom a ins VP22 protein from herpes simplex virus等が挙げられる。
T A Tとは、 H I V (ヒト免疫不全ウィルス） 由来の細胞膜を通過する活性を 持つタンパク質である。 具体的には、 配列番号 4のアミノ酸配列を有するタンパ ク質が挙げられる。
また、 本発明でいう T A Tは、 細胞膜を透過する活性を有する限り、 配列番号 4に記載されるアミノ酸配列のうち一部であってもよい。 具体的には、 配列番号 4に示すアミノ酸配列のうち、 9以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有 するタンパク質が挙げられる。 さらに具体的には、 配列番号 4のアミノ酸番号 3 〜 1 1からなるァミノ酸配列を有するたんぱく質が挙げられる。
また、 上記第 2の発明の融合タンパク質に使用される他のタンパク質は、 上述 した第 1の発明の融合タンパク質における他のタンパク質と同様のものが使用で きる。 例えば、 標識のためのタンパク質、 細胞毒性を有するタンパク質等同様の 例が挙げられる。
また、 本発明の第 2の発明である融合タンパク質の他の態様は、 上記 T A Tと 、 他のタンパク質と、 T A Tと他のタンパク質と融合したときに同融合タンパク 質を保持する細胞内において他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与 するポリべプチドとを含む融合夕ンパク質であり、 細胞外から細胞内に透過する ことができ、 細胞内の酸素状態に依存して安定性が異なる融合夕ンパク質である ο
膜透過性活性を有するタンパク質として、 上記 T A Tを用いた場合、 N L Sを 有さない態様においても、 細胞莫透過性及び細胞内の酸素状態に依存した安定性 を有する融合タンパク質が得られる。 つまり膜透過性活性を有するタンパク質に TATを用いる場合、 NLSの有無に係わらず、 本発明の第 2の発明である融合 タンパク質となる。
尚、 本発明の第 2の発明である融合夕ンパク質の他の態様におけるポリぺプチ ド、 他のタンパク質については、 本発明の第 2の発明である融合タンパク質に関 する説明箇所で述べたとおりである。
本発明の第 2の発明であるべクタ一は、 上述の第 2の発明の融合夕ンパク質を 発現し得るベクタ一である。 具体的には、 NLSをコードするDNAと、 fl莫透過 性活性を有するタンパク質をコ一ドする DNAと、 NL Sと他のタンパク質と融 合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他のタンパク質に 酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチドをコードする D N Aを含み、 これらの DNAに他のタンパク質をコードする DNAを挿入し、 核局在化シグナ ル、 膜透過性活性を有するタンパク質、 前記ポリペプチド及び他のタンパク質と の融合タンパク質を発現し得るベクタ一である。
また、 本発明の第 2の発明であるベクターの他の態様は、 T ATをコードする DNAと、 TATと他のタンパク質と融合したときに、 同融合タンパク質を保持 する細胞内において、 他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポ リぺプチドをコ一ドする DNAを含み、 これらの DNAに他のタンパク質をコ一 ドする DN Aを挿入し、 TAT、 前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合 タンパク質を発現し得るベクターである。
第 2の発明のベクタ一において、 上記のポリべプチドをコ一ドする DNAとは 、 ポリペプチドのアミノ酸配列が、 上記第 2の発明の融合タンパク質の説明箇所 で述べた条件をみたすものであれば特に制限されない。 具体的には HIF- 1ひ 557a. a.-574a.a.のポリぺプチドをコードする D N Aとして例えば配列番号 2に示す塩 基配列又はその一部の塩基配列を有する DNAが挙げられる。 また、 HIF-1ひの 5 48a.a.- 603a.a.のポリべプチドをコ一ドする D N Aとして例えば配列番号 3に示 す塩基配列又はその一部の塩基配列を有する DN Aが挙げられる。
また、 第 2の発明のベクタ一において、 NL Sをコードする DNAは、 例えば 上述の第 1の発明のベクターの記載箇所で説明しているとおり、 配列番号 6に示 す塩基配列又はその一部の塩基配列を有する D N Aが挙げられる。 また、 第 2の発明のベクタ一において、 膜透過性活性を有するタンパク質をコ 一ドする DNAとして、 具体的には例えば T ATをコ一ドする DNAが挙げられ る。
そして、 TATをコードする DNAは、 細胞膜を通過する活性を有する限り特 に制限されないが、 具体的には配列番号 4のァミノ酸配列をコードする DNAや 配列番号 4のァミノ酸配列のうちアミノ酸番号 3〜 1 1からなるァミノ酸配列を コードする DNAが挙げられる、 より具体的には、 例えば配列番号 5に示す塩基 配列又はその一部の塩基配列を有する DN Aが挙げられる。
本発明の第 2の発明のベクターにおけるさらなる態様は、 上記のような他の夕 ンパク質をコードする DNAを、 NLS、 膜透過性活性を有するタンパク質及び ポリペプチドをコードする DNAとともに、 又は、 上記のような他のタンパク質 をコードする DN Aを、 T AT及びポリべプチドをコードする DNAとともに、 第 2の発明の融合夕 パク質を発現するように含むベクターである。 第 2の発明 の融合タンパク質は、 例えば、 N末端から、 NLS、 膜透過性活性を有するタン パク質、 ポリペプチド、 他のタンパク質の順に含む。 すなわち、 第 2の発明のぺ クタ一において、 これらのポリべプチド及び各種タンパク質をコードする DNA は、 フレームが一致するように連結され、 さらに遺伝子発現に必要なプロモ一夕 一等の発現制御配列を含む。
前記プロモー夕一としては、 SV40 early promoter^ lac promoter等が挙げら れる。
本発明の第 2の発明であるべクタ一を導入する細胞としては、 微生物細胞が挙 げられる。 微生物としては、 ェシエリヒア ·コリ等の細菌、 サッカロマイセス · セレピシェ等の酵母、 ァスペルギルス .ニジュランス等の糸状菌、 及び、 動物又 は植物の培養細胞が挙げられる。
第 2の発明のベクタ一の一例として、 後記実施例に示すプラスミ ド pBAD/3- 0と pBAD/557- 574をそれぞれ保持するェシエリヒア ·コリ LMPG 194/pBAD 3— 0と LMPG 194/pBAD 557— 574は、 平成 13年 3月 16日に 、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター （郵便番号 30 5— 8566日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番地 中央第 6) (旧 ：産業技術 総合研究所生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305 - 8566日本国茨城県つ くば巿東一丁目 1番 3号） ） に受託番号 FERM P—18258と； FERM P- 18259としてそれそれ寄託されている。
また、 上記プラスミ ド pBAD/3-Οと pBAD/557- 574をそれそれ保持するェシヱリヒ 7 ULMPG194/pBAD3— (^LMPG194/pBAD557— 574は、 平成 13年 11月 26日に、 上記独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター （郵便番号 305 - 8566日本国茨城県つくば巿東 一丁目 1番地 中央第 6) に受託番号 FERM BP— 7809と FERM B P-7810としてそれそれ国際寄託に移管されている。
次に、 第 2の発明の融合タンパク質を用いた、 融合タンパク質存在の調節方法 について説明する。
該調節方法は、 上記第 2の発明の融合タンパク質を細胞外から細胞内に透過さ せ、 該透過した細胞中における酸素状態に応じて、 第 2の発明の融合タンパク質 の存在状態を調節することを特徴とする。 第 2の発明の融合タンパク質を用いる と、 好適に細胞に取り込ませることができる。 ここで、 取り込ませるとは、 細胞 外から細胞内に透過させる場合をいうが、 ある細胞の細胞内から細胞外へ融合夕 ンパク質を排出させ、 それを他の細胞の細胞内へ取り込ませる場合も含めること ができる。
酸素状態に応じて、 融合タンパク質の存在状態が調節されるとは、 具体的には 上記第 1の発明の融合タンパク質の箇所でも説明しているように、 低酸素条件下 の細胞内では第 2の発明の融合夕ンパク質が有酸素条件下に比べて安定に存在す るように調節されることをいう。
尚、 第 2の発明の融合タンパク質の存在状態の調節方法を用いて、 他のタンパ ク質として標識のためのタンパク質を使用し、 該標識を指標として該融合タンパ ク質の存在状態をモニターすると、 低酸素条件下の細胞を検出することができる 点は、 第 1の発明の融合タンパク質の存在状態を調節する方法の箇所で説明して いるとおりである。
また、 第 2の発明の融合タンパク質の存在状態の調節方法を用いて、 他のタン パク質として細胞毒性を有する夕ンパク質を使用し、 低酸素条件下で同融合夕ン パク質を細胞中に存在させれば、 低酸素条件下の細胞の生育を阻害することがで きる点は、 第 1の発明の融合タンパク質の存在状態を調節する方法の箇所で説明 しているとおりである。 図面の簡単な説明
図 1は、 プラスミ ド pCH/0- 0の概略図を示す。
図 2は、 プラスミド pCH/0-0〜pCH/4- 0の概略図を示す。
図 3は、 プラスミド pCHシリーズの概略図を示す。
図 4は、 プラスミド pCH/3-Ο ( ANLS) 、 pCH/557-574 ( ANLS) の概略図を示す 図 5は、 X- gal 染色の結果を示す図 （写真） である。
図 6は、 各融合タンパク質の構造を表す概略図を示す。
図 7は、 X- gal 染色の結果を示す図 （写真） である。
図 8は、 X- gal 染色の結果を示す図 （写真） である。
図 9は、 実施例 6の酸素濃度に依存したアポトーシスの観察結果を示す図 （写 真） である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を更に具体的に説明する。
C A：材料と方法〕
< 1 >NLS/HIF1-ひ ODDドメイン acZ融合遺伝子発現プラスミドの構築
全ての表記したベクターは、 プラスミド pCHllO Eukaryotic Assay Vector (Am ersham Pharmacia Biotech) をもとに構築した。 同プラスミ ドは、 Simian virus 40 early プロモ一夕一を有している。 '
( 1 ) プラスミ ド ： pCH / 0-0、 0-1、 0-2、 0-3、 2、 1-3、 1-0、 2-0ヽ 3-0、 3-4 、 4-0の構築 （図 1及び 2 )
まず、 Kozak配列 （配列番号 7の塩基番号 8〜1 4 ) (Nucl. Acid Res. (1987 )vol. l55 20, 8125〜8131：文献 8 ) と NLS (核局在シグナル） （文献 7 ) を含む DNA (配列番号 7の塩基番号 1 7〜3 7 ) を合成し、 それそれをァニーリングさ せ、 制限酵素 Hindlll及び Bglll処理した。 次にヒト HIFl-αの ODDドメイン （Oxge n Dependent Degradation domain) を PCRによりヒト cDNAから増幅し、 制限 酵素 Bglllと Kpnlで処理した。 上記 DNA断片を pCHllO/NLSの Hindlll部位と Kpnl 部位の間に翻訳フレームが合うように 3分子ライゲーシヨンにより挿入した。 Ρ C Rに使用した合成 DNAは以下の通りである。
1) Kozak ATG/NLSセンス DNA (配列番号 7)
taagcttgacatggcgcctaagaagaagaggaagagatctg
2) Kozak ATG/NLSアンチセンス DNA (配列番号 8)
cagatctcttcctcttctxcttaggcgccatgtcaagctta
3) ODD- Bglll. F0プライマー (配列番号 9 )
gagatctgccccagccgctggagacacaa
4) ODD- Bglll. F1プライマー (配列番号 10 )
ggagatctttggc aatgt ctccattacccacc
5) ODD- Bglll. F2プライマー (配列番号 1 1)
ggagatctc ctagtcctt c c gatggaagcact
6) ODD- Bglll. F3プライマー (配列番号 12 )
ggagatctaacccattttctactcaggacaca
7) ODD- Bglll. Mプライマー (配列番号 13)
ggagat etc agttgt caccatt agaaagc agt
8) ODD-KpnI.ROアンチセンスプライマ一 （配列番号 14 )
aggtacctgctggaatactgtaactgtgc
9) ODD- Kpnl. R1アンチセンスプライマー （配列番号 15)
aaggtacctgatttatattctgtaatttttcgtt
10) 0DD-KpnI.R2アンチセンスプライマー （配列番号 16)
aaggtacc tgtgtctgat c c tgaat ctggggc at
11) ODD- Kpnl. R3アンチセンスプライマ一 （配列番号 17)
aaggtacctgctttgcttctgtgtcttcagcaaa
12) ODD- KpnI. アンチセンスプライマ一 （配列番号 18) aaggtac c tgt aatggtgac aactgatcgaagga
各プラスミ ドに揷入した ODD ドメインを PCRにて増幅した際に用いたプライマ 一の組み合わせは以下の通りである。
プラスミ ド センスフ。ライマ- アンチセンスフ。ライマ- pCH/0-Ο ODD-Bgl II. FO ODD-Kpn I.RO
pCH/0-l ODD-Bgl II. FO ODD-Kpn I.R1
pCH/0-2 ODD-Bgl II. FO ODD-Kpn I.R2
pCH/0-3 ODD-Bgl II. FO ODD-Kpn I.R3
pCH/1-2 ODD-Bgl II. Fl ODD-Kpn I.R2
pCH/1-3 ODD-Bgl II. Fl ODD-Kpn I.R3
pCH/1-0 ODD-Bgl II. Fl ODD-Kpn I.RO
pCH/2-0 ODD-Bgl II. F2 ODD-Kpn I.RO
pCH/3-0 ODD-Bgl II. F3 ODD-Kpn I.RO
pCH/3-4 ODD-Bgl II. F3 ODD-Kpn I.R4
pCH/4-0 ODD-Bgl II. F4 ODD-Kpn I.RO
それそれのプラスミ ドは、 表 2に示す ODD ドメインと、 NLS及び lacZ遺伝子を タンパク質レベルで融合させる様に遺伝子組み換えを行った。 「a.a.」 は、 ODD ドメインのアミノ酸残基の位置を示す。 表 2中、 例えば pCH/0- 0は、 ODDドメ ィンの 401位から 603位をコードする D N A鎖と、 N L S及び lacZ遺伝子をコード する DN A鎖を融合させたことを示している。 表 2 プラスミ ド 融合タンパク質 pCH/0-Ο NLS/HIF-1 401a. a. -603a. a. /^- Gal
pCH/0-1 NLS/HIF-1 a 401a. a. -447a. a. / 3 -Gal
pCH/0-2 NLS/HIF-1 a 401a. a. -500a. a./ ? -Gal pCH/0-3 NLS/HIF-1 a 401a. a. -547a. a. //5 -Gal
pCH/1-2 NLS/HIF-Ια 448a. a. -501a. a. //θ -Gal
pCH/1-3 NLS/HIF-1 a 448a. a. -547a. a. /θ -Gal
pCH/1-0 NLS/HIF-1 a 448a. a. -603a. a. //9 -Gal
pCH/2-0 NLS/HIF-1 a 501a.a.-603a.a./^-Gal
pCH/3-0 NLS/HIF-1 a 548a. . -603a. a./ ? -Gal
pCH/3-4 NLS/HIF-1 a 548a. a. -583a. a./ - Gal
pCH/4-0 NLS/HIF-1 a 579a. a. - 603a. a. / ? -Gal
図 1中、 F0、 ROは PCRに用いたプライマーの位置を表している。 また、 図中の太線は、 各プラスミド中で lacZ遺伝子と融合させた ODDドメイン、 及ぴ その長さを表している。 pCH/0- 0は、 ODDドメインの 401位から 603位をコ一ド する DNA鎖と、 NLS及び lacZ遺伝子をコ一ドする D N A鎖が融合している。 図 2中、 F 0、 F l、 F 2、 F 3、 F4、 R〇、 R l、 R2、 R3、 R4は、 P CRに用いたプライマーの位置を表している。
(2) プラスミ ド pCH / 557-574、 562-569、 557-571. 560-574、 557-574 (Y565A ) 557-574 (ANLS) の構築 (図 3)
ヒト HIF;l-ひの ODD ドメイン (Oxgen Dependent Degradation domain) の一部 をコードする DNA (配列番号 19〜28) を合成し、 それぞれの組み合わせでァ ニーリングさせ、 pCHllO/3-Οの Bglll部位と Kpnl部位の間に翻訳フレームが合う ように挿入した。 使用した合成 DNAは以下の通りである。
13) ODD 557-574センス DNA (配列番号 19)
gatctttagacttggagatgttagctccctatatcccaatggatgatgacttccagttacaggtac
14) ODD 557-57 アンチセンス DNA (配列番号 20)
ctgtaactggaagtcatcatccattgggatatagggagctaacatctccaagtctaaa
15) ODD 562- 569センス DNA (配列番号 21)
gatctttagctccctatatcccaatggatcaggtac
16) ODD 562- 569アンチセンス DNA (配列番号 22)
ctgatccattgggatatagggagctaaa
17) ODD 557-571センス MA (配列番号 23) gatctttagacttggagatgttagctccctatatcccaatggatgatgaccaggtac
18) ODD 557- 571アンチセンス DNA (配列番号 24)
ctggtcatcatccattgggatatagggagctaacatctccaagtctaaa
19) ODD 560-574センス DM (配列番号 25)
gatctgagatgttagctccctatatcccaatggatgatgacttccagttacaggtac
20) ODD 560- 574アンチセンス DNA (配列番号 26)
ctgtaactggaagtcatcatccattgggatatagggagctaacatctca
21) ODD 557-574 Y565Aセンス DNA (配列番号 27)
gatctttagacttggagatgttagctcccgctatcccaatggatgatgacttccagttacaggtac
22) ODD 557-574 Y565Aアンチセンス MA (配列番号 28)
ctgtaactggaagtcatcatccattgggatagcgggagctaacatctccaagxctaaa
それそれのプラスミ ドは、 表 3に示す ODD ドメインと、 NLS及び lacZ遺伝子を タンパク質レベルで融合させる様に遺伝子組み換えを行った。 表 3 プラスミ ド 融合タンパク質 pCH/557-574 NLS/HIF- 1ひ 557a. a. -574a. a. / 5 -Gal
pCH/562-569 NLS/HIF-Ια 562a.a.-569a.a./ 3~Gal
pCH/557-571 NLS/HIF- 1ひ 557a. a. -571a. a.//? -Gal
pCH/560-574 NLS/HIF- 1ひ 560a. a. -574a. a.//? -Gal
pCH/557-574(Y565A) NLS/HIF-Ι 557a. a. -574a. a. ( Y565A)/y5 -Gal
図 3中、 「L」 や 「D」 等は、 各プラスミ ド中で lacZ遺伝子と融合させた OD D ドメインのアミノ酸配列を表している。 例えば、 pCH/562-569は 「LAPYI PMD (配列番号 29) j をコードする DNA鎖と、 N L S及び lacZ遺伝子をコ ―ドする DN A鎖が融合している。
(3) < 1— 3>プラスミ ド pCH/557-574 (厶 NLS) 、 3-0 (ANLS) の構築 （図 4
) pCH/557-574 (ANLS) 、 及び pCH/3 - 0 (MLS) の構築は、 それそれ pCH/557 - 57 4、 pCH/3-Οを基に行った。 Kozak配列と NLS (核局在化シグナル) を含む Hindi II- Bglll領域を、 pCH/557-574と pCH/3-Οから切り出し、 代わりに Kozak ATG配列のみ をコ一ドする下記の DNAを合成し、 それそれをァ二一リングさせた DNA断片を挿入 した。
23) Kozak ATGセンス DNA (配列番号 3 0)
agcttgacat gcga
24) Kozak ATGアンチセンス DNA (配列番号 3 1 )
gatctcgccatgtca
それそれのプラスミ ドは、 表 4に示す ODD ドメインと lacZ遺伝子をタンパク質 レベルで融合させる様に遺伝子組み換えを行った。
プラスミ ド 融合タンパク質 pCH/557-574 (MLS) HIF-Ια 557a.a.-574a.a./ 5- -Gal
pCH/3-0 (ANLS) HIF- 1 548a.a.-603a.a./5- -Gal
図 4中、 太線は各プラスミ ド中で lacZ遺伝子と融合させた ODDドメインの長 さを表している。 例えば、 pCH/3- 0 (ANLS) は、 548a.a.- 603a.aの 0 D Dドメイ ンをコ一ドする DNA鎖と lacZ遺伝子をコ一ドする D N A鎖が融合している。
< 2 >細胞培養
HEK293(ヒト胎児腎臓由来）細胞は、 通常培地として、 5 % FCS, 100U/ml ぺ ニシリン、 100/ g/mlストレプトマイシン（明治製薬）を含むダルベッコ MEM培地 (GIBCO BRL) を用い、 37°C、 5% C02 インキュベータ一にて培養した。
< 3 >DNAトランスフエクション及び X- gal 染色
1 xl05HEK293細胞 (Graham FL, Smiley J, Russel WC, and Nairn R.， J Gen Virol. 36(1):59- 74， 1977 :文献 1 0) を 6穴マルチウエルデッシュにまき、 翌日 5マイクログラムのプラスミ ドをリン酸カルシウム変法 （Chen, C. and H. Okayama. , Mol . Cell . Biol . 7: 2745-2752, 1987 :文献 1 1 ) により細胞に導入 した。 24時間、 37°C， 3% C02インキュベータ一で培養した後、 トリプシン処理に より細胞をデッシュから剥がし、 6穴マルチウエルデッシュ 2穴にまき直した。 その際、 低酸素状態におかれた細胞内と同様にュビキチン一プロテアゾーム系を 阻害する目的で、 一方の細胞を Cbz- LLL (文献 3 ) を 5 0 zM含む通常培地で 24時 間培養した。 その後、 X- gal ( 5—プロモ一 4—クロ口一 3—インドリル一/?— D—ガラクトシド） 染色 (Sanes,J.R. ,J.L.Rubenstein and J.F.Nicolas.1986. U se of a recombinant retrovirus to study post-implantation cell lineage i n mouse embroyos. EMBO J.5 : 3133-3142. ：文献 1 2 ) を行った。
(実施例 1 )
< 1 >0DDドメインの Cbz- LLL依存的融合夕ンパク質安定性制御の確認
HIF-1ひタンパク質の ODDドメイン （401&. &. -603&.&の領域） を融合させたタン パク質の安定性を酸素濃度に依存して制御できるか検討するために、 まず ODD ド メイン （401a. a. - 603a. a) と NLS及び lacZ遺伝子を融合させたプラスミ ド ： pCH /
0-0 (NLS I HIF-l a 401a. a. -603a. a. / lacZ) を構築した （ [A：材料と方法 ] < 1 > ( 1 ) ) 。 尚、 野生型の HIF-1ひには NLS配列がコードされているため、 pCH I 0-0は、 ODDドメインとともに NLSを融合させる様に構築した。
I X 105 HEK293細胞を 6穴マルチウエルデッシュにまき、 翌日 5〃 gのプラス ミ ド pCH I 0-0をリン酸カルシウム変法により細胞に導入した。 24時間、 37°C，3%
C02インキュベータ一で培養した後、 EDTA処理により細胞を 2群に分け、 一方は 通常培地で、 他方は Cbz- LLLを 50〃M含む培地で 24時間培養した。 そして最後に融 合タンパク質の発現を確認するために X- gal染色を行った。 結果を表 5に示す。
X-gal染色の結果、 Cbz- LLL非存在下で培養した場合に、 Cbz- LLL存在下で培養 した場合と比較して、 青く染色された細胞の数とその染色の濃さは有意に減少し た。 尚、 表 5中 （以下の表も同様とする）、 このように Cbz-LLLの有無により融 合タンパク質の安定性に違いが生じた場合、 つまり、 Cbz- LLLに依存して融合夕 ンパク質の安定性が制御できることが観察できた場合を、 + (プラス） と表示す る。 一方、 ODDドメインを含まないプラスミ ド pCHllOを導入した場合、 Cbz-LLLの有無 に関わらず青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。 尚、 表 5中 （以下の表も同様とする） 、 このように Cbz-LLLの有無に関わらず融 合タンパク質の安定性に違いが生じない結果が観察された場合を、 一 （マイナス ) と表示する。 表 5 プラスミ ド Cbz- LLL依存的融合夕ンパク質安定性制御 pCHllO
pCH/0-Ο +
Cbz- LLLは、 転写活性にも ffl Aの安定性にも影響をおよぼさないことが報告さ れているので、 これらの結果は11 -1ひの401&^. - 603a. aの領域を融合させるこ とによって、 ^一ガラクトシ夕ーゼ （ ? - gal) タンパク質の安定性を Cbz-LLUこ 依存して制御できたことを示している。
く 2 >0DDドメインの Cbz-LLL依存的融合夕ンパク質安定性制御に必要な領域の同 定
( 1 ) 次に、 融合タンパク質の Cbz- LLLに依存的な安定性制御に必須な ODDドメイ ン中の領域を同定するために、 ODDドメインの N末端側及び Z又は C末端側を系 統的に欠失させ、 N L Sおよび lacZ遺伝子と融合させたプラスミ ドを構築し （ [ A ：材料と方法] < 1 > ( 1 ) 参照） 、 上記 < 1 >と同様にして HEK293細胞にプ ラスミ ドを導入し、 X-gal染色を行った。 結果を表 6に示す。
その結果、 pCH/0-l、 0-2、 0-3、 1-2, 1-3、 4-0を導入した場合、 Cbz- LLLの有 無に関わらず、 青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかつ た。 一方、 pCH/1- 0、 2-0、 3-0、 3- 4を導入し、 Cbz- LLL非存在下で培養した場合 、 Cbz- LLL存在下で培養した場合と比較して、 青く染色された細胞の数とその染 色の濃さは有意に減少した。 表 6 プラスミ ド Cbz- LLL依存的融合夕ンパク質安定性制御 pCH/0-l
pCH/0-2
pCH/0-3
pCH/1-2
pCH/1-3
pCH/1-0 +
pCH/2-0 +
pCH/3-0 +
pCH/3-4 +
pCH/4-0
これらの結果から、 ！1 -1ひの548&. &. - 583a. a.の領域が、 融合タンパク質の C bz-LLLに依存した安定性制御に重要であることが明らかになった。 尚、 pCH/3 - 0 の X- gal染色の結果を pCHUOと比較して、 図 5に示した。 図中、 A , Bは HEK293 細胞にプラスミ ド pCHUOを導入したものである。 一方、 C、 Dは pCH / 3-0を導 入したものである。 また、 Cbz- LLLを含む培地で培養した場合が B、 Dであり、 C bz-LLLを含まない培地で培養した結果が A， Cである。
( 2 ) ヒト HIF-1ひの ODDドメイン 548a. a. -583a. a.の領域について、 既知データ ベースに対して相同性検索を行った結果、 この領域は、 ヒト HIF-l aだけでなく マウスの HIF- 1ひにも保存されている 18残基のアミノ酸からなる配列 （557a. a. - 574a. a. ) を含むことが明かとなった。 そこで、 HIF-1ひの 557a. a. - 574a. a.領域 を lacZ遺伝子と融合させたプラスミ ド pCH/557- 574を構築し （ [A ：材料と方法 ] < 1 > ( 2 ) 、 図 3参照） 、 上記 < 2 >と同様にして HEK293細胞にプラスミ ド を導入し、 X-gal染色を行った。 表 7 プラスミ ド Cbz- LLL依存的融合夕ンパク質安定性制御 pCH/3-4 +
pCH/557-574 +
その結果、 pCH/ 557- 574を導入し Cbz-LLL非存在下で培養した場合に、 Cbz- LLL 存在下で培養した場合と比較して、 青く染色された細胞の数とその染色の濃さは 有意に減少した。 これは、 557a.a.- 574a.a.の領域のみを融合させただけで、 β -galタンパク質の安定性が Cbz- LLLに依存することを示している。
(3) 続いて、 y5-galタンパク質と融合させる HIF- 1ひの領域をさらに短くした プラスミ ド pCH/562-569、 557-571、 560-574 (それそれ HIF- 1ひの 562a.a.-569a.a ·、 557a. a. -570a. a., 560a,a.- 57½.a.を NLS及び LacZと融合させた） を構築し （
[A :材料と方法] < 1 > (2) 、 図 3参照） 、 上記 <2>と同様にして HEK293 細胞にプラスミ ドを導入し、 X-gal染色を行った。 結果を表 8に示す。 表 8 プラスミ ド Cbz- LLL依存的融合夕ンパク質安定性制御 pCH/3-4 +
pCH/557-574 +
pCH/562-569
pCH/557-571
pCH/560-574
その結果、 これらのプラスミ ドを導入した場合、 Cbz- LLLの有無に関わらず、 青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。
上記の結果から、 -galタンパク質の安定性を有意に Cbz- LLLに依存させるた めには、 HIF-lo:の 557a.a.—574a.a.の領域を融合させればよいことが明らかに なった。
< 3 >0DDドメイン 557a. a. -574a. a領域のチロシン残基の Cbz-LLL依存的安定性制 御にに対する重要性
タンパク質のュビキチン/プロテアソ一ム系による分解は、 標的タンパク質の リン酸化状態の変化によって制御されることが知られている。 そこで、 構築した 融合タンパク質のュビキチン系による分解も、 リン酸化状態の変化によって制御 されている可能性が考えられる。 そこで、 プラスミ ド pCH/557- 574の HIF- 1ひ 557 a. a.— 574a. a.内で唯一リン酸化されうるアミノ酸である 5 β 5位のチロシン残 基をァラニン残基に置換したプラスミ ド pCH/557-574 (Y565A) を構築し （ [A： 材料と方法] < 1 > ( 2 ) 、 図 3参照） 、 上記と同様にして HEK293細胞にプラス ミ ドを導入し、 X- gal染色を行った。 結果を表 9に示す。 表 9 プラスミ ド Cbz-LLL依存的融合夕ンパク質安定性制御 pCH/557-574 +
pCH/557-574(Y565A)
その結果、 pCH/557-574 (Y565A) を導入した場合、 Cbz-LLLの有無に関わらず 青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。 これにより 、 HIF-1ひの 557a. a.— 574a. a.を融合させたタンパク質の安定性に、 5 6 5位の チロシン残基が特に重要なアミノ酸であることが明らかになつた。
(実施例 2 )
—連の融合タンパク質の Cbz-LLLに依存した安定性の制御に、 NLS (核局在化シ グナル） が必要なのかを確認するために、 pCH/557- 574及び pCH/3-Οから NLSを欠 失させたプラスミ ド ： pCH/557- 574 ( ANLS) 及び pCH/3-0 ( ANLS) を構築し （ [ A ：材料と方法] < 1 > ( 3 ) 、 図 4参照） 、 実施例 1と同様にして HEK293細胞 にプラスミ ドを導入し、 X- gal染色を行った。 結果を表 1 0に示す。 表 1 0 プラスミ ド Cbz- LLL依存的融合夕ンパク質安定性制御 pCH3-0( ANLS)
pCH/557-574( ANLS )
その結果、 これらのプラスミ ドを導入した場合、 Cbz- LLLの有無に関わらず青 く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。 これにより、 融合夕ンパク質の Cbz-LLLに依存した安定性の制御に、 NLSが関与することが確認 された。
CB ：材料と方法〕
以下に記載の実施例 3以降において用いた一般的な操作について説明する。. 合成オリゴヌクレオチドのアニーリングは、 次のようにして行う。 互いに相補 的な合成一本鎖オリゴヌクレオチド （濃度 100〃M) を 10〃1ずつ混ぜ、 20〃1の Na C1溶液 （1M) 、 及び 160 z lの精製水を加えて、 計 200〃1の反応液を調整する。 こ れを 95°Cで 1分間熱した後、 75°Cで 1分間保温し、 さらに 1°Cあたり 2分をかけて 37 °Cまで徐々に冷却する。 次に 100〃1の DNA溶液に 10〃1の酢酸ナトリウム溶液 （3M ) と、 250〃1のエタノールを加え、 12krpmで 10分間 （4°C) 遠心分離する。 その 後、 上清を捨て 70%エタノールで沈殿物を洗い、 最後に 70%エタノールを除去する 事で精製した DNAを得る。
制限酵素処理は、 エタノール沈澱によって精製したプラスミ ド DNA 1 gを 10 1のユニバーサルバッファ （TAKARA Biomedical) と 90〃 1の精製水で溶解し、 こ れに、 目的の制限酵素を添加し、 ピペッティング後 37。Cで 30分間保温することに より行う。
DNA断片の分離 （切り出し） は、 次のようにして行う。 制限酵素処理した目的 の DNA断片を他の DNA断片から単離するために、 まず、 ァガロースゲル （含 EtBr) 電気泳動を行う。 このァガロースゲルに 3651 の UVランプをあてる事により DNA断 片を可視化し、 目的の DNA断片を含むァガロースゲルをカミゾリで切り出す。 最 後に QIAクイックゲルェクストラクシヨンキット （Qiagen) を用いて、 このァガ ロースゲルから目的の DNA断片を抽出し精製する。
ライゲーシヨンは、 試験管内 （in vitro) で複数の DNA断片をホスホジエステ ル結合させるために、 DNAライゲ一シヨンキット Ver.2 (TAKA A Biomedical) を 用い、 キットの手順に従って行う。 ライゲ一シヨンに用いたベクター DNA断片及 びィンサ一ト DNA断片の量はどちらも 10ngとする。
(実施例 3 ) ODDドメイン、 His残基 x6、 NLS、 TAT及び lacZ融合遺伝子を発 現するプラスミ ドの構築
く 1 >NLS/HIFl- aODDドメイン/ lacZ融合遺伝子含有プラスミ ドの構築
プラスミ ド ： pCH I 3-0、 及びプラスミ ド pCH/557- 574の構築は、 上記 [A：材 料と方法] < 1 > ( 1 ) 及び （2 ) に記載の方法 （表 2、 表 3、 図 1、 図 2、 及 び図 3も参照） に従って行った。
< 2 >His/NLS/TAT/HIFl-ひ ODDドメイン acZ融合遺伝子発現プラスミ ドの構築 全ての表記したベクタ一は、 プラスミ ド pBAD/His/lacZ Vector ( Invitrogen) をもとに構築した。
( 1 ) プラスミ ド ： pCH/TAT/3-Ο, pCH/TAT/557- 574の構築
TAT配列をコードする下記の合成オリゴ DNA (配列番号 3 2、 3 3 ) をァ二一リ ングさせた DNA断片を、 pCH/3- 0又は pCH/557- 574を制限酵素 Bgll lで処理したぺク 夕一に組み込み、 pCH/TAT/3- 0、 pCH/TAT/557- 574を得た。
2 5 ) TAT. Bgl IIセンス DNA (配列番号 3 2 )
gat cat atg gtc gta aga aac gtc gcc aac gtc gcc gaa
2 6 ) TAT. Bgl I Iアンチセンス DNA (配列番号 3 3 )
gat ctt egg cga cgt tgg cga cgt ttc tta cga cca tat
( 2 ) プラスミ ド ： pBAD/3- 0、 pBAD/557-574の構築
プラスミ ド pBAD/His/lacZ Vectorには BamHI部位が 2ケ所存在する。 このうち 4 13塩基目の消化部位のみを切断した後、 DNA末端を平滑化した。 弓 Iき続き制限酵 素 Saclで消化して生じた約 5170bpの DNA断片をァガロースゲル電気泳動により切 り出し、 pBAD/His/lacZ BamHI- Saclベクターとした。 一方、 pCH/TAT/3 - 0、 pCH/T AT/557-574を制限酵素 Hindll Iで消化後、 DNA末端を平滑化し、 さらに制限酵素 Sa clで処理して生じた約 2250bpの DNA断片をァガロースゲル電気泳動により切り出 した。 これらを pBAD/His/lacZ BamHI- Saclベクタ一にライゲ一シヨンし、 pBAD/3 - 0、 pBAD/557- 574を得た。
( 3 ) プラスミ ド ： pBAD/P. C.の構築
まず、 pCH/3-Οを制限酵素 Hind I I I及び Kpn Iで処理して生じた約 6900bpの DNA 断片をァガロースゲル電気泳動で切り出した。 これに Kozak ATGおよび NLSをコ一 ドする下記の合成 DNA (配列番号 3 4、 3 5 ) 断片をアニーリングさせたものを 挿入し、 pCH/P. とした。
2 7 ) Kozak ATG/NLS Hindl llセンス DNA (配列番号 3 4 )
age ttg aca tgg cgc cta aga aga aga gga age agg tac
2 8 ) Kozak ATG/NLS Kpnlアンチセンス DNA (配列番号 3 5 )
ctg ctt cct ctt ctt ctt agg cgc cat gtc a
次に、 TAT配列をコードする下記の合成オリゴ DNA (配列番号 3 6、 3 7 ) をァ 二一リングさせた DNA断片を、 pCH/P. を制限酵素 Kpn Iで処理したベクターに組 み込み pCH/TAT/P. C.を構築した。
2 9 ) TAT. Kpnlセンス DNA (配列番号 3 6 )
gat atg gtc gta aga aac gtc gcc aac gtc gcc gac agg tac
3 0 ) TAT Kpnlアンチセンス DNA (配列番号 3 7 )
ctg tcg gcg acg ttg gcg acg ttt ctt acg acc ata tcg tac
引き続き、 (¾ 17?. を制限酵素^11(1111で消化後、 DNA末端を平滑化し、 さ らに制限酵素 Saclで処理して生じた約 2000bpの DNA断片をァガロースゲル電気泳 動により切り出した。 これらを pBAD/His/lacZ BamHI-SacIベクターにライゲ一シ ヨンし、 pBAD/P. C.を得た。
( 4 ) 各プラスミ ドの説明
pBAD/P. 、 pBAD/3-0 pBAD/557-574においては、 下記の表 1 1に示す ODDドメ インと、 His残基 x6、 TAT、 NLS及び lacZ遺伝子がタンパク質レベルで融合されて いる （図 6参照） 。
尚、 表 1 1中、 「a. a.」 は、 ODDドメインのアミノ酸残基の位置を示す。 表 1 1中、 例えば pAD/3- 0は、 ODDドメインの 548位から 603位をコードする DNA 鎖と、 His、 NLS、 TAT及び lacZ遺伝子をコードする DNA鎖を融合させたことを 示している。
また、 図 6は、 各融合タンパク質の構造を表す概略図である。 本発明は、 図 6 に示すような活性領域を持つように、 各融合タンパク質を発現するプラスミ ドを 構築した。
図 6中、 「6 xHis」 はヒスチジン残基を 6つ連続させた領域を、 「NLS」 は SV 40 large T antigen 由来の核移行シグナルを、 「TATj は HIV由来の TATシグナル 配列 （Cell;55， 1179(1988)、 Proc. atl. Acad. Sci USA;91,664(1994)) を、 「0DD 」 はヒト HIF— la遺伝子由来の酸素誘導分解ドメイン （Oxgen Dependent Degrad at ion domain) を、 「 ?- gal」 は E. coli lacZ遺伝子産物を表している。 N.C. ? - galは野生型/?- galタンパク質を用いた。 また、 3- 0 ? -gal及び 557- 574 -galに 融合されたヒト HIF— 1ひ遺伝子由来の酸素誘導分解ドメインは、 それぞれ HIF— 1 a 548a. a. -603a. a. HIF— 1ひ 557a.a.-574a.a.である。 表 11 プラスミ ド 融合タンパク質 pBAD/P.C. 6 xHis/NLS/TAT/ ?-Gal
pBAD/3-0 6 xHis/NLS/TAT/HIF-1 a 548a. a. -603a. a. / -Gal pBAD/557-574 6 xHis/NLS/TAT/HIF-la557a.a.-574a.a./ ?-Gal
また、 各プラスミ ドの全塩基配列は表 12のように対応している。 表 12 プラスミ ド 配列番号 pCH/TAT/3-Ο 38
pCH/TAT/557-574 40
pBAD/3-Ο 42 pBAD/557-574 44
pCH/P.C. 46
pCH/TAT/P.C. 48
pBAD/P.C. 50
また、 各プラスミ ド中の遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は表 1 3の ように対応している。 、 表 13 プラスミ ド 配列番号 pCH/TAT/3-Ο 39
pGH/TAT/557-574 4 1
pBAD/3-Ο 43
pBAD/557-574 45
pCH/P.C. 47
pCH/TAT/P.C. 49
pBAD/P.C. 5 1
(実施例 4 ) 融合夕ンパク質の Cbz-LLL依存的安定性の確認
< 1 >融合タンパク質の精製
3種の発現べクタ一 a) pBAD/P. 、 b) pBAD/3- 0、 c) pBAD/557- 574を用い て、 E. coli LMG194株を形質転換した。 翌日、 それそれの培養プレートからシン グルコロニ一をつつき取り、 10mlの TB培地 （50〃g/mlのアンピシリンを含む） に 植菌して、 37°Cで振とう培養した。 さらに翌日、 それそれ lmlのオーバ一ナイ ト カルチヤ一を 200mlの TB培地 （50〃g/mlのアンビシリンを含む） に加え、 37°Cで 振とう培養した。 培養液の吸光度 0D6。。が 0.5に達したところで、 それぞれの培養 液に 0.4gの L-( + )-ァラビノースを添加して融合タンパク質の発現を誘導し、 翌日 まで培養を続けた。
次に、 Ni- NTAァガロース （QIAGEN) を用い、 付属のプロト 一ルに従って融合 夕ンパク質の粗精製を行った。 粗精製を終えた融合夕ンパク質の精製度をさらに 高めるため、 また、 融合タンパク質の濃度を高めるため、 さらに緩衝液を PBSに 置換する目的で、 MICROCON YM-100 (AMICON) を付属のプロトコ一ル通りに使用 した。
< 2 >
以下の操作において、 A549 (ヒト肺癌由来)細胞は、 通常培地として 5 % FCS, 100U/ml ペニシリン、 lOO^gZmlストレプトマイシン（明治製薬）を含むダルべ ヅコ MEM培地 （GIBCO BRL) を用い、 37°Cで、 5% C02インキュベータ一にて培養し た。
1 X 1 0 4個の A549細胞を 24穴マルチウエルデッシュにまき、 翌日、 無血清 D- M EMで各ゥエルを 2回洗浄した。 これに下記表 1 4の様に融合タンパク質を添加し 、 37°Cの 5 C02インキュベータ一で 30分培養した。 表 1 4 ゥエル No. 融合タンパク質 培地の量 2 N. タンパク質 （※丄） 0.2U 0.2ml
3、 4 P . タンパク質 0.2U 0.2ml
5、 6 3-0タンパク質 0.2U 0.2ml
7、 8 557- 574タンパク質 0.2U 0.2ml
尚、 表 1 4中、 ※丄として、 N . タンパク質には野生型/? - galタンパク質を用 いたことを特記する。 また、 「U」 は 37° pH= 7.5の条件下で 1分間に 1 /Mの 0 N P G ^o-nitrophenyl-b-D-lactopyranosiae) を o - trophenolと galactose に分解するために必要なタンパク量を示す。
そして、 再度無血清 D- MEMで各ゥエルを 2回洗浄した後、 ゥエル No. 1、 3、 5、 7 には通常培地で、 ゥエル No. 2、 4、 6、 8には低酸素状態におかれた細胞内と同 様にュビキチン一プロテアゾーム系を阻害する目的で、 Cbz-LLL (文献 3 ) を 5 含む培地で 20時間培養した。 その後、 X- gal染色 （文献 1 2 ) を行った。 その結果、 N. タンパク質を添加した A549細胞は、 Cbz- LLLの有無に関わらず 青く染色された細胞は見られなかった。 一方、 P. タンパク質を添加した A549細 胞は、 Cbz- LLLの有無に関わらず全ての細胞が青く染色された （図 7A、 B参照 ) 。 これは、 添加したタンパク質に融合させた HIV由来の TAT領域の活性によって 融合タンパク質が細胞内に取り込まれた事を表わしている。
3-0夕ンパク質を添加した A549細胞は Cbz- LLLを添加した場合に、 有意に濃く染 色された細胞が見られた （図 7 C、 D参照） 。 これは、 3-0タンパク質に融合さ せた ODD領域 （HIF- 1ひの 548a.a.-603a.a) の活性によって、 Cbz- LLL存在下で融 合タンパク質の安定性が増した事を表わしている。 557- 574タンパク質を添加し 同様の実験を行つた場合にも、 3-0タンパク質で得られた結果と同じ傾向の結果 を得る事ができた。
尚、 図 7中、 A、 Bは、 P. ^- galを導入したものであり、 C、 Dは 3- 0^ - ga 1を添加したものである。 また、 A、 Cは Cbz- LLLを含まない培地で培養した場合 であり、 B、 -Dは Cbz- LLLを含む培地で培養した場合である。
(実施例 5 ) 融合夕ンパク質の酸素濃度依存的安定性の確認
上記、 実施例 4において、 低酸素状態を形成する形成方法を、 以下で示すよう に変えた他は、 実施例 4と同様な方法を用いて X-gal染色を行った。
融合タンパク質を添加し、 その 30分後融合タンパク質を除去する。 次に、 有 酸素条件とする場合には 20%O2ガスを、 一方低酸素条件とする場合には 1 % 02ガスをそれぞれ培地に通気し、 約 24時間培養する。 そして、 最後に X-gal染 色を行う。
その結果、 P. タンパク質を添加した A549細胞は、 酸素濃度に係わらず、 全て の細胞が青く染色された （図 8A、 B参照） 。
一方、 3-0タンパク質を添加した A549細胞は 1 %02ガスを通気した低酸素状態 とした場合に、 有意に濃く染色された細胞が見られた （図 8 C、 D参照） 。
尚、 図 8中、 A、 Bは、 P. /?- galを導入したものであり、 C、 Dは 3- 0^-ga 1を添加したものである。 また、 A、 Cは 20%〇2ガスを通気した培地 （有酸素 条件） であり、 B、 Dは 1%02ガスを通気した培地 （低酸素条件） である。
(実施例 6 ) 融合夕ンパク質の酸素濃度依存的安定性の確認
< 1 >TAT- ODD- Caspase3融合タンパク質発現べクタ一 （pGEX/TAT- 0DD3- 0- Casp3 ) の構築
まず、 pBAD/3-Οを鎵型とし、 下記の 2種類の合成オリゴ DNAを用いて PCRを行い 、 HIV由来の TATシグナル配列と HIF-1ひ遺伝子由来の酸素誘導分解ドメイン （ODD ) がコードされている DNAを増幅した。 これを制限酵素 BamHI及び EcoRIで処理し た後、 PGEX-6P-3プラスミ ド （Amersham Pharmac ia Biotech) の BamHIと EcoRIの 間に組み込み、 pGEX/TAT-ODDを構築した。
3 1 ) TAT- sense- BamHIブラィマー （配列番号 5 2 )
aggatcctatggtcgtaagaaacgt
3 2 ) ODD-anti-EcoRIプライマ一 （配列番号 5 3 )
agaattc c tggaatactgtaac tgt 一方、 ヒト肺癌由来細胞株 A549の cDNAを錶型とし、 下記 2種類の合成オリゴ DN Aを用いて PCRを行い、 ヒト由来 Caspase- 3遺伝子を増幅し、 制限酵素 EcoRI及び Sa I Iで処理した後、 pGEX/TAT-ODDの EcoRIと Sai lの間に組み込み、 GSTタグを N末端 に融合させたタンパク質 GST-TAT- ODD- wt . Caspase3を発現するプラスミド pGEX/TA T-0DD3- 0- wt . Casp3を構築した。
3 3 ) Casp- sense_EcoRIプライマー （配列番号 5 4 )
agaatt catggagaac ac xgaaaac
3 4 ) 0&3 -&111^-8&11プラィマー (配列番号 5 5 )
agtcgacttagtgataaaaatagag また、 アポトーシス誘導活性を持たない変異 Caspase3 (以下 mut . Caspase3) を Vocero - Akbani， A. M. , Heyden, N. V. , Lissy, N. A. , Ratner, L . and Dowd y, S. F . Kill ing HIV-infected cel ls by transduction with an HIV protease -activated caspase- 3 protein. Nat . Med. 5 : 29-33， 1999.の文献に従って構 築し、 この構造遺伝子を Casp- sense- EcoRIプラィマーと Casp- anti-Sai lプラィマ 一を用いた PCRで増幅後、 制限酵素 EcoRI及び Sai lで処理し、 PGEX/TAT- ODDの EcoR Iと Sal Iの間に組み込み、 pGEX/TAT-0DD3- 0- mut. Casp3を構築した。
< 2 >TAT- 0DD-wt./mut. Caspase3融合夕ンパク質の精製
pGEX/TAT-0DD3-0- t . Casp3および pGEX/TAT-0DD3-0- mut . Casp3を用 、て E . col i
BL21 (DE3) pLysS competent cells (Novagen) を形質転換した。 翌日、 それそ- れの培養プレートからシングルコロニーをつつき、 10mlの TB培地 （50〃g/mlのァ ンピシリンを含む） 食菌して 37°Cで浸透培養した。
さらに翌日、 1mlのオーバ一ナイ トカルチヤ一を 200mlの TB培地 （50〃g/mlのァ ンビシリンを含む） に加え、 37°Cでさらに浸透培養した。 培養液の吸光度 OD が 0.5に達したところで、 最終濃度が 0.5Mになるように IPTGを添加し融合タンパク 質の発現を誘導し、 さらに翌日まで培養を続けた。
大量発現させたそれぞれの融合タンパク質の精製は Glutathione Sepharose 4B ゲノレ (Amersham Pharmacia Biotech) 、 及び PreScission Protease (Amersham P harmacia Biotech) を用い、 付属のプロトコ一ルに従って行った。
< 3 >酸素濃度依存的なアポトーシス誘導活性の検討
以下の操作において、 マウス胎児由来細胞株 NIH3T3は、 通常培地として 10% FC S、 100U/ml ペニシリン、 100〃g/ml ス トレプトマイシン （明治製薬） を含む ダルベッコ MEM培地 （GIBC0 BRL) を用い、 37°Cで、 5% C02インキュぺ一夕一にて 培養した。
l x lO5個の NIH3T3細胞を 6穴マルチウエルディッシュにまき、 ゥエル No. 4、 5 、 6は Cbz-LLLを最終濃度 50 iMになるように添加し、 ゥエル No. 1、 2、 3には 、 No. 4、 5、 6のゥエルに入れた Cbz-LLLと同量の dimethyl sulfoxide (DMS0)を 加えた。 翌日、 無血清 D- MEMで各ゥヱルを 2回洗浄した。 これに下記表 1 5の様に 融合タンパク質等を添加した。 さらに 24時間ゥエル No. 1、 2、 3は 2 0 % O 2、 ゥエル No. 4、 5、 6は 1 % 02の条件で培養し、 最後に各融合タンパク質による 酸素濃度に依存したアポトーシス誘導活性を観察した。 表 1 5 ゥエル No. 融合タンパク質 1、 4 バッファ一のみ添加
2、 5 TAT-0DD-mut. Casp3 7.
Figure imgf000042_0001
1
3、 6 TAT- ODD- Caspase3 7. 5 zg/30^ 1
その結果、 下表 1 6の様に TAT- 0DDit. Caspase3融合タンパク質を添加し、 か つ低酸素培養した場合に、 特に強いアポト一シスを観察する事ができた （ゥエル 番号 6 ) (表 1 6において +++で示す） 。 ゥエル Νο· 4および 5で観察されたわず かなアポト一シスは、 ゲノム由来の Caspase3の活性が Cbz- LLLによってわずかに 誘導された結果であると考えられる。 表 1 6 ゥエル番号 添加タンパク アポト—シス誘導活性
2 TAT- ODD- mut. Casp3
3 TAT-0DD- t. Casp3
4 +
5 TAT-ODD- mut. Casp3 +
6 TAT-0DD-wt. Casp3
また、 この各ゥエル毎のアポト一シスの観察結果を図 9に示す。
これらの結果は、 TAT- ODD- Caspase3融合夕ンパク質が有酸素条件下に置かれた 細胞内では分解され、 一方、 低酸素条件下に置かれた細胞内では安定化し、 かつ 活性化する事によってアポトーシスを誘導した事を示している。 産業上の利用の可能性
本発明により、 H I F— 1 ひタンパク質の安定化に関与する領域を同定するこ とができた。
また、 特定された H I F - 1 ひタンパク質の安定化に関与する領域を有する夕 ンパク質を含む融合タンパク質であって、 細胞内の酸素状態に依存した安定性を 有する融合タンパク質を提供することができた。
また、 特定された H I F - 1 ひタンパク質の安定化に関与する領域を有する夕 ンパク質を含む融合タンパク質であって、 細胞膜透過性、 及び細胞内の酸素状態 に依存した安定性を有する融合タンパク質を提供することができた。
本発明により、 融合タンパク質を保持する細胞内において、 酸素の多少に応じ 所望のタンパク質の存在を調節することができるため、 低酸素条件下の細胞を検 出すること、 及び低酸素条件下の細胞の生育を阻害すること等に利用することが できる。

Claims

請求の範囲
I . 以下の （A) 又は （B ) に示すポリペプチドをコードする： D N A。
(A) 配列番号 1のアミノ酸配列からなるポリべプチド。
( B ) 配列番号 1のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 1 6個以上のアミノ酸残基 からなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 核局在化シグナル、 及び他のタンパク質と 融合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他のタンパク質 に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリぺプチド。
2 . 低酸素条件下の細胞内では前記融合夕ンパク質は有酸素条件下に比べて 安定化される請求の範囲第 1項に記載の D N A。
3 . 配列番号 2の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する請求の範囲第 1 項又は第 2項に記載の D N A。
4 . 核局在化シグナルをコードする D N Aと、 請求の範囲第 1項〜第 3項の いずれかに記載のポリべプチドをコ一ドする D NAを含み、 これらの D NAに他 のタンパク質をコードする D N Aを揷入し、 核局在化シグナル、 前記ポリべプチ ド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
5 . 前記他のタンパク質をコ一ドする D N Aを含む請求の範囲第 4項に記載 のべクタ一。
6 . 細胞内が有酸素条件下であるときに、 ベクター含有細胞において前記融 合タンパク質を不安定にさせ得る請求の範囲第 5項に記載のベクター。
7 . 前記他のタンパク質が、 標識のためのタンパク質及び/又は細胞毒性を 有するタンパク質である請求の範囲第 6項に記載のベクター。
8 . 請求の範囲第 4項〜第 7項のいずれかに記載のベクターが導入された細 胞。
9 . 前記細胞が微生物細胞である請求の範囲第 8項に記載の細胞。
1 0 . 前記微生物がェシヱリヒア，コリである請求の範囲第 9項に記載の微生 物。
I I . 請求の範囲第 7項に記載のベクタ一を保持する細胞であって、 前記他の タンパク質が、 標識のためのタンパク質である細胞において、 同タンパク質の存 在状態をモニタ一することを特徴とする、 低酸素条件下の細胞を検出する方法。
12. 請求の範囲第 6項に記載のベクターを細胞に導入し、 同ベクターがコー ドする融合タンパク質を発現させることを特徴とする、 細胞内のタンパク質存在 の調節方法。
13. タンパク質をコードする DN Aを保持する細胞における同タンパク質の 存在を調節する方法であって、 前記 DN Aに核局在化シグナル及び請求の範囲第 1項に記載の DN Aを連結し、 核局在化シグナル、 請求の範囲第 1項に記載の D N Aがコ一ドするポリぺプチド及び前記タンパク質が融合した融合タンパク質と して発現させることを特徴とする方法。
14. 前記融合タンパク質を、 低酸素条件下では細胞中に存在させ、 有酸素条 件下では存在させないように調節することを特徴とする請求の範囲第 13項に記 載の方法。
15. 前記他のタンパク質が、 細胞毒性を有するタンパク質である請求の範囲 第 7項に記載のベクタ一を細胞に保持させ、 低酸素条件下で同ベクターがコード する融合タンパク質を細胞中に存在させることを特徴とする、 低酸素条件下の細 胞の生育を阻害する方法。
16. 核局在化シグナルと、 膜透過性活性を有するタンパク質と、 以下の （A ) 又は （B) に示すポリペプチドと、 他のタンパク質からなる融合タンパク質で あって、 細胞膜透過性、 及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合夕 ンパク質。
( A )配列番号 1のァミノ酸配列からなるポリぺプチド。
(B)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 16個以上のアミノ酸残基 からなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 核局在化シグナル、 及び他のタンパク質と 融合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他のタンパク質 に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
17. 前記膜透過性活性を有するタンパク質が、 以下の （C) 又は （D) に示 す H I V由来の T ATシグナル配列 （TAT) からなるタンパク質である請求の 範囲第 16項に記載の融合タンパク質。
( C ) 配列番号 4のァミノ酸配列からなるタンパク質。
(D) 配列番号 4のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 9個以上のアミノ酸残基か らなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパ ク質。
18. 以下の （A) 又は （B 1) に示すポリペプチドと、 以下の （C) 又は （ D) に示す H I V由来の TATシグナル配列 （TAT) からなるタンパク質と、 他のタンパク質からなる融合タンパク質であって、 細胞膜透過性、 及び細胞内の 酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質。
( A ) 配列番号 1のァミノ酸配列からなるポリべプチド。
(B 1)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 16個以上のアミノ酸残 基からなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 TATからなるタンパク質、 及び他の夕 ンパク質と融合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他の タンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリべプチド。
( C ) 配列番号 4のァミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)配列番号 4のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 9個以上のアミノ酸残基か らなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパ ク質。
19. 低酸素条件下の細胞内では有酸素条件下に比べて安定に存在する請求の 範囲第 16項〜第 18項の何れかに記載の融合タンパク質。
20. 前記他のタンパク質が、 標識のためのタンパク質及び/又は細胞毒性を 有するタンパク質である請求の範囲第 16項〜第 19項の何れかに記載の融合夕 ンパク質。
21. 請求の範囲第 16項又は第 18項に記載の融合タンパク質を細胞外から 細胞内に透過させ、 該透過した細胞中における酸素状態に応じて、 該融合タンパ ク質の安定性を調節することを特徴とする、 融合夕ンパク質存在の調節方法。
22. 低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質を有酸素条件下に比べて 安定に存在させる請求の範囲第 21項に記載の融合夕ンパク質存在の調節方法。
23. 核局在化シグナルをコードする DNAと、 膜透過性活性を有するタンパ ク質をコードする DNAと、 以下の （A)又は （B) に示すポリペプチドをコー ドする DN Aを含み、 これらの; DN Aに他のタンパク質をコードする DN Aを揷 入したときに、 核局在化シグナル、 膜透過性活性を有するタンパク質、 前記ポリ ぺプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
(A)配列番号 1のァミノ酸配列からなるポリぺプチド。
(B) 配列番号 1のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 16個以上のアミノ酸残基 からなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 核局在化シグナル、 及び他のタンパク質と 融合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他のタンパク質 に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリぺプチド。
24. 前記膜透過性活性を有するタンパク質が、 以下の （C) 又は （D) に示 す HI V由来の TATシグナル配列 （TAT) からなるタンパク質である請求の 範囲第 23項に記載のベクター。
( C )配列番号 4のァミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)配列番号 4のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 9個以上のアミノ酸残基か らなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパ ク質。
25. 以下の （A) 又は （B 1) に示すポリべプチドをコ一ドする DNAと、 ' 以下の （C) 又は （D) に示す HI V由来の T ATシグナル配列 （TAT) から なるタンパク質をコ一ドする DN Aを含み、 これらの DN Aに他のタンパク質を コードする DNAを揷入したときに、 TATからなるタンパク質、 前記ポリぺプ チド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
(A) 配列番号 1のァミノ酸配列からなるポリぺプチド。
(B 1)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 16個以上のアミノ酸残 基からなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 T ATからなるタンパク質、 及び他の夕 ンパク質と融合したときに、 同融合タンパク質を保持する細胞内において、 他の 夕ンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリぺプチド。
( C )配列番号 4のァミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)配列番号 4のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 9個以上のアミノ酸残基か らなるアミノ酸配列を有し、 かつ、 融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパ ク質。
26. 低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質は有酸素条件下に比べて 安定に存在する請求の範囲第 23項〜第 25項の何れかに記載のベクタ一。
27. ポリペプチドをコードする DNAが、 配列番号 2の塩基配列又はその一 部の塩基配列を有する請求の範囲第 23項〜第 25項の何れかに記載のベクター
28. TATからなるタンパク質をコードする DNAが、 配列番号 5の塩基配 列又はその一部の塩基配列を有する請求の範囲第 23項〜第 25項の何れかに記 載のベクター。
29. 前記他のタンパク質をコードする DN Aを含む請求の範囲第 23項〜第 28項の何れかに記載のベクター。
30. 前記他のタンパク質が、 標識のためのタンパク質及び Z又は細胞毒性を 有するタンパク質である請求の範囲第 29項に記載のベクタ一。
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