WO2002081685A1 - PEPTIDAKZEPTOR/tRNA-HYBRIDMOLEKÜL UND SEINE VERWENDUNG ZUR HERSTELLUNG VON CODON-SPEZIFISCH ARRETIERTEN TRANSLATIONSKOMPLEXEN - Google Patents

PEPTIDAKZEPTOR/tRNA-HYBRIDMOLEKÜL UND SEINE VERWENDUNG ZUR HERSTELLUNG VON CODON-SPEZIFISCH ARRETIERTEN TRANSLATIONSKOMPLEXEN Download PDF

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WO2002081685A1
WO2002081685A1 PCT/EP2002/003649 EP0203649W WO02081685A1 WO 2002081685 A1 WO2002081685 A1 WO 2002081685A1 EP 0203649 W EP0203649 W EP 0203649W WO 02081685 A1 WO02081685 A1 WO 02081685A1
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trna
hybrid molecule
peptide acceptor
mrna
acceptor
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PCT/EP2002/003649
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Eberhard Schneider
Jens Solsbacher
Klaus Handel
Peter Wagner
Dirk BÖKENKAMP
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Phylos Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently

Definitions

  • the present invention relates to a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule and its use as a substrate for the in vitro translation of an mRNA to form codon-specifically arrested translation complexes.
  • RNA fusion display technology WO 98/31700; Roberts, 1999. From a mixture of a large number of such genotype-phenotype fusions, it is possible to separate certain genotype-phenotype fusions from all other fusions on the basis of defined properties of their polypeptide fractions (selection).
  • RNA-protein fusions genotype-phenotype fusions
  • PCR polymerase chain reaction
  • BESTATIGUNGSKOPIE for the production of a coding mRNA and (d) in vitro translation of the previously synthesized mRNA.
  • the polypeptide / mRNA complex As a prerequisite for the use of the above-mentioned in vitro evolution techniques - for coupling the genotype and phenotype - the polypeptide / mRNA complex must be prevented from falling apart during the translation process, so that either a non-covalent polypeptide / mRNA fusion is retained and / or - due to previous modifications to the coding mRNA - a covalent polypeptide / mRNA fusion is achieved during the translation process.
  • Examples of the in vitro production of non-covalent polypeptide / mRNA fusions are the polysome display and the ribosome display technology [Kawasaki GH US 5658754; Mattheakis et al., 1994; Mattheakis et al., 1996; Hanes & Plückthuhn, 1997; Pickling WO 98/48008].
  • the use of a stop codon-free mRNA prevents the translation complex (peptide / ribosome / mRNA tRNA complex) from falling apart at the end of the translation process and the peptide / ribosome / mRNA / tRNA complex is additionally stabilized, if necessary, by adding salt and lowering the temperature.
  • RNA fusion display technology described by Robert & Szostak (1997).
  • Prerequisite for the generation of Genotype / phenotype fusions in the context of this technology is the presence of a covalent modification at the 3 'end of the coding RNA in the form of a puromycin-containing linker structure [Roberts & Szostak, 1997, WO 98/31700, DE 19646372, WO 98/16636] ,
  • the ribosome stops at the 3 'end of the RNA at the transition to the puromycin-containing linker.
  • the puromycin immobilized on the coding mRNA via the linker can then enter the A site of the ribosome and take over the peptide chain translated up to this point in a ribosomally catalyzed reaction step.
  • the result of such a process is a covalent link between J a peptide and its coding mRNA, which is achieved through the action of puromycin as an acceptor of the growing peptide chain.
  • This mRNA / polypeptide complex is stable over a wide temperature and salt concentration range even after the ribosome has been cleaned off.
  • polypeptide / mRNA fusion technologies are usually restricted to the use of stop codon free RNAs. If a stop codon-containing RNA were used, the release factor effect during translation would lead to premature detachment of the translated polypeptide chain from the translation complex (by stimulation of the hydrolysis of the ester linkage between the tRNA in the P site of the ribosome and the Carboxyl end of the polypeptide chain) even before it, e.g. in the case of a puromycin-modified mRNA, a covalent linkage can occur between the polypeptide and its coding mRNA.
  • RNA fusion display technology also requires, as an additional step, the modification of the 3 ' end of the RNA already described by adding the covalently linked puromycin-containing linker. Removal of the 3'-untranslated region of cellular mRNA of heterogeneous length, including the stop codon, can be achieved using several methodological approaches [described in WO 00/09737], such as, for example
  • the present invention now describes a method which, by using a specially modified tRNA or a specially modified tRNA-analog molecule (hereinafter referred to as “peptide acceptor / tRNA hybrid molecule”), causes the translation complex to fall apart during in vitro translation, even when used an unmodified, stop codon and 3 ' -UTR-containing mRNA as a template of the translation process, the invention thus enables the production of codon-locked translation complexes regardless of the presence of a stop codon in the coding mRNA Stop codon itself can be used to produce codon-locked, in this case stop-codon-locked, translation complexes
  • the available codon-locked translation complexes include the coding mRNA, the translated peptide, the ribosome and the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule Use of a peptide acceptor / sup pressor-tRNA hybrid molecule, the disintegration of the translation complex caused by a release factor-dependent termination process is prevented by the
  • the peptide acceptor / tRNA hybrid molecules according to the invention are distinguished by the fact that they do not have to be previously covalently bound to the mRNA to be translated in order to enable translation, and accordingly are also not covalently bound to it.
  • the peptide acceptor tRNA to be used is a hybrid molecule comprising, in particular, consisting of a tRNA or a tRNA-analogous unit (hereinafter referred to as “tRNA” or “tRNA unit”), a covalently linked peptide acceptor unit and, if appropriate a linker that covalently links the tRNA unit and peptide acceptor unit.
  • the tRNA unit of the peptide acceptor tRNA is responsible for the codon-specific binding of the peptide acceptor tRNA during the ribosomal protein synthesis.
  • the tRNA unit is preferably a naturally occurring tRNA, a synthetically produced tRNA or a tRNA produced by wrro-transcription or a corresponding tRNA derivative.
  • sequence of the tRNA unit 3'-terminal can be shortened by preferably up to 20, in particular by up to 10, 5 or 3 nucleotides, in particular by one nucleotide, or extended by a few, preferably 1 or 2, nucleotides.
  • the nucleotide sequence can differ from the sequence of naturally occurring tRNAs.
  • the tRNA unit can also include naturally non-occurring, artificially synthesized nucleotide analogs.
  • the tRNA unit can also be modified or comprise a modifying group, for example at least one fluorogenic, chromogenic, radioactive or photoreactive group.
  • the at least one modifying group preferably has a molecular weight of less than 20 kDa, in particular less than 10 kDa, particularly preferably less than 5 kDa, especially less than 2 kDa.
  • the tRNA unit preferably comprises no more than 140 nucleotides, in particular no more than 120 nucleotides, particularly preferably no more than 100, especially no more than 80 nucleotides.
  • the peptide acceptor unit of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule is able, in analogy to the amino acid portion of an aminoacyl tRNA, to take over the P-site tRNA-anchored peptide chain in a transpeptidase reaction with the formation of a covalent linkage.
  • the functional group of the peptide acceptor unit of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule which forms the link can be, for example, a primary amino group, which is able to form an acid amide bond with the carboxy-terminal end of the translated peptide chain in the transpeptidase reaction with cleavage of a carboxylic acid ester bond.
  • the peptide acceptor unit can, for example, be an amino acid, an amino acid derivative or an amino acid analogue or puromycin, a puromycin derivative or a puromycin analogue or another organic compound with a free amino group.
  • the peptide acceptor unit is covalently linked to the tRNA unit of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule directly or via a linker, the covalent bond preferably neither spontaneously nor in a ribosomally catalyzed reaction (eg after stimulation by a release factor) during the vitro translation can be lysed.
  • the covalent bond can be, for example, a CC bond, an amide bond, a sulfide bond or a disulfide bond.
  • a linker is preferably used to link the peptide acceptor unit and the tRNA unit when the tRNA unit is shortened 3'-terminal.
  • the linker is preferably an organic compound, for example a hydrocarbon chain or a polyethylene group.
  • Both the peptide acceptor unit and the optionally present linker can optionally be modified by at least one group or comprise at least one modifying group, the at least one modifying group being a fluorogenic, chromogenic, radioactive or photoreactive group and that Molecular weight of the at least one modifying group is preferably less than 10 kDa, in particular less than 5 kDa, particularly preferably less than 2 kDa, especially less than 1 kDa.
  • a particularly preferred embodiment of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule is a puromycin-loaded tRNA (puromycin tRNA), the tRNA preferably being shortened 3'-terminally by one nucleotide, so that after the puromycin has been linked, the naturally occurring nucleotide number of the tRNA is available (see Fig. 1 and 2).
  • Puromycin is an antibiotic produced by Streptomycetes with a translation-inhibiting effect [Nathans & Neidle, 1963].
  • puromycin Because of its striking structural homology to the 3 ' end of an aminoacyl-loaded tRNA (the homologous region comprises the last 3 ' -terminal nucleotide of the tRNA with the amino acid linked to it, see FIG. 2), puromycin has the property of being independent of the sequence and prokaryotic as well as to prematurely terminate the eukaryotic translation process. Puromycin is stored independently of the coding of the mRNA in the A site of the ribosome and, with its primary amino group, takes over the previously formed polypeptide chain from the P site tRNA. This results in C-terminally shortened peptide fragments of heterogeneous length, all of which have a carboxy-terminal puromycin modification.
  • the effect of the puromycin portion as a peptide acceptor can be controlled depending on the mRNA coding.
  • this hybrid molecule is incorporated into the A site of the ribosome, so that the puromycin unit of the hybrid molecule is able to Take over polypeptide chain from the P-site tRNA in a transpeptidase reaction.
  • Exoribonuclease can the mRNA from its 3 ' end in the 5 ' direction to that Removed area that is protected by the adjacent, codon-specific anchored translation complex.
  • RNA in a reverse transcriptase reaction with the help of a primer hybridizing at the 3 ' end of the mRNA (eg a poly-A-tail specific oligo (dT) primer) the mRNA can be derived from its 3 ' end Convert in a 5 ' direction into a partial mRNA / cDNA hybrid until the activity of the polymerase stops due to the blockage of the stop codon-specific anchored translation complex located on the mRNA. Subsequent treatment of the RNA with a double-stranded RNA / DNA-dependent RNAse (such as RNase H) can specifically remove the previously reversely transcribed 3 'end of the RNA.
  • a double-stranded RNA / DNA-dependent RNAse such as RNase H
  • the result of such a treatment is an mRNA, the 3 ' - untranslated region of which is almost completely removed up to the vicinity of the stop codon.
  • the size of the remaining portion of the 3 ' UTR is determined by the sequence section of the RNA which is "protected” by the attached translation complex specifically anchored by the stop codon. This residual sequence of the 3 ' UTR including the stop codon leaves subsequently remove themselves from the mRNA by linking the following methodological steps [cf.
  • WO 00/09737 (a) coupling an RNA adapter (this introduces a primer binding site and a recognition sequence for a type IIS restriction enzyme); (b ) Reverse transcription of the RNA using an adapter-complementary primer and second-strand synthesis; (c) Cutting this double-stranded DNA upstream from the stop codon by incubation with a type IIS restriction enzyme (recognition sequence was previously introduced into the sequence by coupling the RNA adapter) (cf. Fig. 4), thereby removing both the stop codon and the 3 ' UTR residue on the corresponding DNA Eb ene enables.
  • a type IIS restriction enzyme recognition sequence was previously introduced into the sequence by coupling the RNA adapter
  • the DNA can then be converted back into RNA by in vitro transcription and is thus available in a suitable form for various in vitro (above-mentioned) or in vivo genotype / phenotype coupling techniques (for example phage display, yeast display).
  • the translation complex also contains full length the coding RNA and thus represents a stable phenotype / genotype linkage, which is also the basis for the polysome display and the ribosome display technology. Due to the alternative coupling strategy described here, which is based on the use of an acceptor suppressor tRNA (eg puromycin suppressor tRNA) during the translation process, in contrast to polysome or ribosome display technology, direct use of stop Codon and 3 ' UTR-containing mRNA possible. A complex reworking of the mRNA to remove the stop codon and the 3 ' UTR before use in the in vitro translation step can therefore be dispensed with.
  • an acceptor suppressor tRNA eg puromycin suppressor tRNA
  • the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule can additionally be modified such that it is suitable for establishing a covalent link between the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule and the translated mRNA during the translation process.
  • the modification is, for example, a photoreactive group (for example wybutin) which is able, after irradiation with light of a suitable wavelength, to form a covalent link to the mRNA which is read during the translation process [Hanna, 1989; Steiner et al., 1984].
  • Activating radiation can take place both during and after the translation process has ended.
  • the photoreactive form of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule is therefore able to form two covalent linkages: a first link via the primary amino group of the acceptor portion to the translated polypeptide chain and a second link via the photoreactive group of the tRNA half to the coding mRNA.
  • the photoreactive form of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule thus functions as a covalently linking link between the coding genotype and the coded phenotype, it being possible for an unmodified mRNA to be used as the coding genotype and for a previous complex removal of the 3 ' UTR and / or the stop codon , or a modification of the 3 'end of the RNA by addition of a puromycin linker is therefore unnecessary.
  • the ribosome can be removed in a manner known to the person skilled in the art, so that a compound (Hybrid molecule), in which mRNA (genotype) and the polypeptide encoded by it (phenotype) are covalently linked to one another via a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to the invention.
  • the hybrid molecule of genotype and phenotype obtained in this way can be used, for example, as described above for the locked translation complex, for degradation of the 3'-untranslated region of the mRNA or can be used for in vitro evolution experiments, as described, for example, in WO 98/31700 ,
  • a further possible application of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecules according to the invention is their use for the production of codon-specifically terminated and simultaneously labeled polypeptides or proteins and protein fragments.
  • the codon specificity is conveyed via the tRNA portion used (especially via the sequence of the anticodon) of the peptide acceptor tRNA during the translation process.
  • the codon specificity of the peptide acceptor tRNA used also determines the length of the polypeptide or protein fragment formed during the translation process.
  • stop codon-specific acceptor suppressor tRNAs in the translation process leads to the creation of full-length C-terminally labeled proteins.
  • the aforementioned peptide acceptor / tRNA hybrid molecules according to the invention and the genotpy / phenotype hybrid molecules obtainable using them and locked translation complexes are particularly well suited for in ⁇ ro evolution experiments, as described, for example, in WO 98/31700.
  • the peptide acceptor / tRNA hybrid molecules simultaneously introduce a uniform C-terminal label into the resulting protein or polypeptide fragments, depending on the codon.
  • This uniform C-terminal modification can be detected immunologically, for example, with the aid of acceptor-specific antibodies (for example, using puromycin-specific antibodies), or by using the attached nucleic acid via hybridization events.
  • acceptor-specific antibodies for example, using puromycin-specific antibodies
  • labeled peptide acceptor / tRNA hybrid molecules can be labeled accordingly by detecting radioactivity or spectroscopically or spectrometrically.
  • Such a C-terminal modification also enables the modified polypeptides to be immobilized quickly and easily, for example on a matrix which is specific for the peptide acceptor or the tRNA part of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule.
  • the matrix mentioned can also be a nucleic acid-loaded chip.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the labeling group should preferably be covalently coupled via the peptide acceptor part of the molecule or via 3 ' -terminal nucleotides of the tRNA part of the molecule. If this portion of the tRNA is, for example, a suppressor tRNA, specific translation of translated proteins at the natural C-terminus can be achieved in the translation process.
  • mRNA mixtures such as the transcriptome of a cell
  • Distinct fluorescent dyes can be used for the analysis of different transcriptomes or their corresponding mixtures of fluorescence-labeled polypeptides: For example, to analyze the transcriptome of a cell line before treatment with an active substance or with a substance to be tested, the corresponding translation products can be labeled, for example, with the aid of a specific fluorescent dye (eg fluorescent dye "red”). On the other hand, for the analysis of the transcriptome of the cell line after treatment with the active substance, another fluorescent dye (eg fluorescent dye "green”) can be used for labeling the corresponding translation products. Via the attached, distinguishable fluorescent dyes, the translation products can always be clearly assigned to the original transcriptome. Therefore, the marked translation products of several transcriptomes can be analyzed in parallel using common separation methods.
  • a specific fluorescent dye eg fluorescent dye "red”
  • another fluorescent dye eg fluorescent dye "green”
  • the translation products can always be clearly assigned to the original transcriptome. Therefore, the marked translation products of several transcriptomes can be analyzed in parallel using common separation methods.
  • a specific mRNA if it is present has defined positions within its coding sequence of this codon one or more times during the translation into a peptide of characteristic length or a peptide mixture of peptides of characteristic length.
  • the number and length of the resulting peptides can be predicted based on the codon sequence of their coding mRNA.
  • codon-locked translation complexes by means of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecules according to the invention can be achieved in vitro, for example using different translation-competent lysates, for example with rabbit reticulocyte lysate, E. coli extracts, for example E. coli S30 extract, one Lysate from yeast cells or an extract from wheat germ.
  • further modifications of the cell lysates or their original cells are preferably carried out, which lead to inactivation of the release factor activity, for example
  • inactivations as a result of cleaning the release factors from the lysate, 2.) inactivations as a result of inactivating ligand binding (e.g. binding of an antibody) or 3.) inactivations as a result of the use of inducible inactivables
  • Release factor mutants e.g. ts- inactivable by temperature shift
  • Fig. 1 Schematic overview of the structure of a peptide acceptor-tRNA hybrid molecule.
  • Fig. 2 Schematic overview of the structural analogy between puromycin, puromycin suppressor tRNA and a tyrosine-loaded tRNA (upper half of the picture), and the effect of puromycin (lower half of the picture, left) and of puromycin suppressor tRNA ( lower half of the picture, right).
  • Fig. 3 Schematic overview of the course of an in vitro selection using non-covalent fusions from mRNA / puromycin suppressor tRNA / polypeptide / ribosome complexes, which can be produced by translation in the presence of puromycin suppressor tRNA.
  • Fig. 4 Schematic overview of the sequence of methods for generating a 3 ' UUT and stop codon-free mRNA.
  • the 3 ' UTR region of the coding RNA can be degraded from its 3 ' end to the vicinity of the stop codon at a stop codon-specifically locked translation complex.
  • the region of the coding RNA located in the 3 'direction from the ribosome complex (stop codon-specifically locked) can be converted into a DNA / RNA hybrid, for example by reverse transcriptase. This RNA region can then be degraded using RNase H, for example.
  • Fig. 5 Production of puromycin suppressor tRNA.
  • Puromycin suppressor tRNA a puromycin suppressor tRNA (Puro-Sup-tRNA) can be divided into the following methodological steps, for example:
  • the in vitro transcription batch was mixed with 1 vol urea loading buffer (8.3 M urea, 50 mM EDTA) and after heat denaturation (batch first at 75 ° C., then incubate immediately on ice) via preparative 10% urea-TBE polyacrylamide gels separated.
  • the gel band containing suppressor tRNA (-3) was made visible in the gel by UV shadowing and the RNA was shaken out of the comminuted gel band with 0.3 M Na acetate (pH 5.4) for at least 1 hour at 40 ° C. and then precipitated by ethanol precipitation. After washing the RNA precipitate with 70% ethanol, the RNA was resuspended in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and its concentration was determined photometrically.
  • puromycin suppressor tRNA 40 uM 5 were '-phosphate riboC- riboC-puromycin-3' (donor) with 20 uM of the suppressor tRNA (-3) (acceptor) in a ligation reaction with 0.5 U / ul T4 RNA ligase (MBI fermentas), 0.02 mg / m! BSA (MBI-Fermentas), 10% DMSO, 50 mM HEPES-KOH (pH 8.3 at 25 ° C), 10 mM MgCl 2 , 5.5 mM ATP for 45 min at 16 ° C.
  • donor 20 uM of the suppressor tRNA (-3) (acceptor) in a ligation reaction with 0.5 U / ul T4 RNA ligase (MBI fermentas), 0.02 mg / m! BSA (MBI-Fermentas), 10% DMSO, 50 mM HEPES-KOH (pH 8.3 at 25
  • the acceptor RNA suppressor tRNA (-3) was incubated for 5 min at 85 ° C. and then slowly cooled to room temperature in order to promote the formation of a tRNA-specific secondary structure.
  • the ligated puromycin suppressor tRNA was purified by phenol / chloroform extraction and / or ethanol precipitation. The efficiency of the ligation reaction was checked by analysis on a 10% urea TBE polyacrylamide gel (cf. FIG. 5).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül, seine Verwendung als Substrat für die in vitro Translation einer mRNA zur Bildung von Codon-spezifisch, insbesondere Stopp-Codon-spezfisch arretierten Translationskomplexen. Auf diese Weise kann eine Genotyp/Phänotyp-Kopplung erreicht und/oder eine carboxyterminale Markierung in Proteine eingeführt werden. Die Codon-spezifisch-arretierten Translationskomplexe lassen sich beispielsweise für die selektive spezifische Degradation des 3'-untranslatierten Bereichs der kodierenden mRNA verwenden. Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere für die Transkriptomanalyse und für in vitro Evolutionsanwendungen.

Description

Beschreibung
Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül und seine Verwendung zur Herstellung von Codon-spezifisch arretierten Translationskomplexen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül sowie seine Verwendung als Substrat der in vitro Translation einer mRNA zur Bildung von Codon-spezifisch arretierten Translationskomplexen.
Die Herstellung einer Verknüpfung zwischen einem Peptid bzw. Protein (Phänotyp) und seiner kodierenden RNA (Genotyp) ist Voraussetzung für zahlreiche in vitro- Evolutionstechniken, wie z.B. die Ribosomen-Display- bzw. die Polysomen-Display- Technologie [Mattheakis et al., 1994; Mattheakis et al., 1996; Jermutus et al., 1998] oder die RNA-fusion-Display-Technologie [WO 98/31700; Roberts, 1999]. Aus einem Gemisch einer Vielzahl derartiger Genotyp-Phänotyp-Fusionen ist es möglich bestimmte Genotyp-Phänotyp-Fusionen aufgrund definierter Eigenschaften ihrer Polypeptidanteile von allen übrigen Fusionen abzutrennen (Selektion). Dies wird beispielsweise affinitätschromatographisch über direkte Bindung an ein immobilisiertes Zielmolekül (Target) erreicht. Die so aus dem ursprünglichen Gemisch selektierte Subpopulation von an das Zielmolekül bindenden Genotyp- Phänotyp-Fusionen (RNA-Protein-Fusionen) läßt sich unter Ausnutzung ihrer Nukleinsäureanteile über Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifizieren und steht damit für eine erneute Selektionsrunde zur Verfügung [detailliert ausgeführt in WO 98/31700], Der Nukleinsäureanteii erlaubt weiterhin auch eine Identifizierung der Primärsequenz einzelner RNA-Protein-Fusionen, beispielsweise durch Sequenzierungs- oder Hybridiesierungstechniken.
Die an der Amplifikation Liganden-bindender Genotyp-Phänotyp-Fusionen beteiligten methodischen Schritte sind im folgenden angeführt: (a) Reverse Transkription der RNA, (b) Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) zur Amplifikation der cDNA unter Verwendung eines Primers, der gleichzeitig einen Promotor, sowie eine geeignete ribosomale Bindungsstelle einführt, (c) in vitro Transkription dieser cDNA
BESTATIGUNGSKOPIE zur Herstellung einer kodierenden mRNA und (d) in vitro Translation der zuvor synthetisierten mRNA.
Als Voraussetzung für die Anwendung der oben angeführten in vitro Evolutionstechniken muß - zur Kopplung von Genotyp und Phänotyp - während des Translationsprozesses ein Auseinanderfallen des Polypeptid/mRNA-Komplexes verhindert werden, so daß entweder eine nicht-kovalente Polypeptid/mRNA-Fusion erhalten bleibt und/oder - aufgrund vorhergehender Modifikationen an der kodierenden mRNA - eine kovalente Polypeptid/mRNA-Fusion während des Translationsprozesses erreicht wird.
Beispiele für die in vitro Herstellung von nicht-kovalenten Polypeptid/mRNA- Fusionen ist die Polysomen-Display- und die Ribosomen-Display-Technologie [Kawasaki GH US 5658754; Mattheakis et al., 1994; Mattheakis et al., 1996; Hanes & Plückthuhn, 1997; Plückthuhn WO 98/48008]. Dabei wid durch die Verwendung einer Stopp-Codon freien mRNA ein Auseinanderfallen des Translationskomplexes (Peptid/Ribosomen/mRNA tRNA-Komplex) am Ende des Translationprozesses verhindert und der Peptid/Ribosomen/mRNA/tRNA-Komplex ggfs. durch Salzzugabe und Temperaturabsenkung zusätzlich stabilisiert.
Ein Beispiel für eine in vitro Evolutionstechnik, bei der es - während des Translationsprozesses - zur Ausbildung kovalenter Polypeptid/mRNA-Fusionen kommt, stellt die von Robert & Szostak (1997) beschriebene RNA-fusion-Display- Technologie dar. Voraussetzung für die Erzeugung von Genotyp/Phänotyp-Fusionen im Rahmen dieser Technologie ist das Vorhandensein einer kovalenten Modifikation am 3 '-Ende der kodierenden RNA in Form einer Puromycin-haltigen Linkerstruktur [Roberts & Szostak, 1997, WO 98/31700, DE 19646372, WO 98/16636]. Während des Translationsvorgangs stoppt bei Verwendung einer derart modifizierten RNA das Ribosom am 3'-Ende der RNA am Übergang zum Puromycin-haltigen Linker. Das über den Linker an die kodierende mRNA immobilisierte Puromycin kann dann in die A-Site des Ribosoms eintreten und die bis zu diesem Zeitpunkt translatierte Peptidkette in einem ribosomal katalysierten Reaktionsschritt übernehmen. Als Ergebnis eines solchen Vorganges entsteht eine kovalente Verknüpfung zwischen J einem Peptid und seiner kodierenden mRNA, die über die Wirkung des Puromycins als Akzeptor der wachsenden Peptidkette erreicht wird. Dieser mRNA/Polypeptid- Komplex ist auch nach Abreinigung des Ribosoms über einen weiten Temperatur- und Salzkonzentrationsbereich stabil.
Der Einsatz der oben genannten Polypeptid/mRNA-Fusions-Technologien ist in der Regel beschränkt auf die Verwendung Stopp-Codon freier RNAs. Bei Verwendung einer Stopp-Codon-haltigen RNA würde es nämlich durch die Release Factor- Wirkung während der Translation zu einer vorzeitigen Ablösung der translatierten Polypeptidkette vom Translationskomplex kommen (durch Stimulation der Hydrolyse der Esterverknüpfung zwischen der tRNA in der P-Site des Ribosoms und dem Carboxyl-Ende der Polypeptidkette), noch bevor es, z.B. im Falle einer Puromycin- modifizierten mRNA, zur Ausbildung einer kovalenten Verknüpfung zwischen dem Polypeptid und seiner kodierenden mRNA kommen kann.
Auch im Rahmen der Ribosomen- bzw. Polysomen-Display-Technologie würde das Vorhandensein eines Stopp-Codons innerhalb der RNA zum Auseinanderfallen des Translationskomplexes führen und damit die Bildung eines stabilen Ribosomen/mRNA tRNA/Peptid-Komplexes nicht zulassen.
Deshalb ist die Verwendung zellulärer mRNA für die Herstellung von Polypeptid/mRNA-Verknüpfungen in der Regel erst nach einer aufwendigen Entfernung des Stopp-Codons und des 3'-untranslatierten Bereiches der mRNA möglich. Die RNA-Fusion-Display-Technologie erfordert neben der Entfernung des Stopp-Codons und des 3'-untranslatierten Bereiches der mRNA außerdem als zusätzlichen Schritt die bereits beschriebene Modifikation des 3 '-Endes der RNA durch Anfügen des kovalent verknüpften Puromycin-haltigen Linkers. Eine Entfernung des 3'-untranslatierten Bereiches zellulärer mRNA von heterogener Länge, incl. des Stopp-Codons, kann dabei über mehrere methodische Ansätze erreicht werden [ beschrieben in WO 00/09737], wie z.B.
(a) durch eine gerichtete 3'- 5' Degradation der RNA mit Hilfe einer Exoribonuklease, (b) durch eine gerichtete 3'- 5' Degradation mit Hilfe einer Exonuklease, wie z.B Exonuklease III bzw. Lambda-Exonuklease auf der Ebene der korrespondierenden cDNA,
(c) durch die Verwendung zufällig annealender Random-Primer während des Umschreibens zellulärer mRNA in korrespondierende cDNA, wobei es u.a. auch zur Bildung Stopp-Codon-freier RNA kommt.
Diese genannten methodischen Ansätze können jedoch nicht sicherstellen, daß es innerhalb einer komplexen Mischung verschiedener zellulärer mRNAs mit 3'- untranslatierten Bereichen unterschiedlicher Länge zu einer exakten Entfernung des 3'-UTR und des Stopp-Codons kommt, während gleichzeitig der kodierende Bereich der mRNA nahezu vollständig erhalten bleibt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt nun eine Methode, die durch Einsatz einer speziell modifizierten tRNA bzw. eines speziell modifizierten tRNA-analogen Moleküls (im folgenden „Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül" genannt) während der in vitro Translation ein Auseinanderfallen des Translationskomplexes, auch bei der Verwendung einer unmodifizierten, Stopp-Codon und 3'-UTR-haltigen mRNA als Matrize des Translationsvorganges, verhindert. Die Erfindung ermöglicht damit die Herstellung von Codon-arretierten Translationskomplexen unabhängig von dem Vorhandensein eines Stopp-Codons in der kodierenden mRNA. Insbesondere kann hierbei auch das Stopp-Codon selbst zur Herstellung von Codon-arretierten, in diesem Falle Stopp-Codon-arretierten, Translationskomplexen verwendet werden. Die erhältlichen Codon-arretierten Translationskomplexe umfassen die kodierende mRNA, das translatierte Peptid, das Ribosom und das Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmolekül. Bei Verwendung eines Peptidakzeptor/Suppressor-tRNA- Hybridmoleküls wird das durch einen Releasefaktor-abhängigen Terminationsprozess bewirkte Auseinanderfallen des Translationskomplexes verhindert, indem das Hybridmolekül kompetitiv das Eintreten des Releasefaktors in die A-Site des Ribosoms verhindert. Die erfindungsgemäßen Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmoleküle zeichnen sich dadurch aus, daß sie zur Ermöglichung der Translation nicht zuvor an die zu translatierende mRNA kovalent gebunden werden müssen und an diese entsprechend auch nicht kovalent gebunden sind. Bei der zu verwendenden Peptidakzeptor-tRNA handelt es sich um ein Hybridmolekül, umfassend, insbesondere bestehend aus einer tRNA oder einer tRNA-analogen Einheit (im folgenden „tRNA" oder „tRNA-Einheit" genannt), einer kovalent verknüpften Peptidakzeptor-Einheit sowie gegebenenfalls einem Linker, der tRNA-Einheit und Peptidakzeptor-Einheit kovalent miteinander verknüpft. In Analogie zu Aufbau und Funktionsweise einer Aminoacyl-tRNA als Substrat des ribosomalen Translationsprozesses ist die tRNA-Einheit der Peptidakzeptor-tRNA verantwortlich für die Codon-spezifische Bindung der Peptidakzeptor-tRNA während der ribosomalen Proteinsynthese. Bei der tRNA-Einheit handelt es sich erfindungsgemäß vorzugsweise um eine natürlicherweise vorkommende tRNA, eine synthetisch hergestellte tRNA oder eine durch in wrro-Transkription hergestellte tRNA oder ein entsprechendes tRNA-Derivat. Ferner kann die Sequenz der tRNA- Einheit 3'-terminal um vorzugsweise bis zu 20, insbesondere um bis zu 10, 5 oder 3 Nukleotide, vor allem um ein Nukleotid, verkürzt oder um einige, vorzugsweise 1 oder 2 Nukleotide verlängert sein. Die Nukleotidsequenz kann von der Sequenzabfolge natürlicherweise vorkommender tRNAs abweichen. Die tRNA- Einheit kann neben natürlicherweise vorkommenden Nukleotiden auch natürlicherweise nicht vorkommende, künstlich synthetisierte Nukleotidanaloga umfassen. Die tRNA-Einheit kann außerdem modifiziert sein bzw. eine modifizierende Gruppe umfassen, beispielsweise mindestens eine fluorogene, chromogene, radioaktive oder photoreaktive Gruppe. Die mindestens eine modifizierende Gruppe hat vorzugsweise ein Molekulargewicht kleiner als 20 kDa, insbesondere kleiner als 10 kDa, besonders bevorzugt kleiner als 5 kDa, vor allem kleiner als 2 kDa. Die tRNA-Einheit umfaßt vorzugsweise nicht mehr als 140 Nukleotide, insbesondere nicht mehr als 120 Nukleotide, besonders bevorzugt nicht mehr als 100, vor allem nicht mehr als 80 Nukleotide.
Die Peptidakzeptor-Einheit des Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls ist in Analogie zum Aminosäureanteil einer Aminoacyl-tRNA in der Lage die P-Site-tRNA- verankerte Peptidkette in einer Transpeptidasereaktion unter Ausbildung einer kovalenten Verknüpfung zu übernehmen. Bei der die Verknüpfung ausbildenden funktionellen Gruppe der Peptidakzeptor-Einheit des Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmoleküls kann es sich beispielsweise um eine primäre Aminogruppe handeln, die in der Lage ist, mit dem carboxyterminalen Ende der translatierten Peptidkette in der Transpeptidasereaktion unter Spaltung einer Carbonsäureesterbindung eine Säureamidbindung auszubilden. Bei der Peptidakzeptor-Einheit kann es sich beispielsweise um eine Aminosäure, ein Aminosäurederivat oder ein Aminosäure- Analogon oder um Puromycin, ein Puromycin-Derivat oder ein Puromycin-Analogon oder um eine andere organische Verbindung mit einer freien Aminogruppe handeln. Die Peptidakzeptor-Einheit ist mit der tRNA-Einheit des Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmoleküls direkt oder über einen Linker kovalent verknüpft, wobei die kovalente Bindung vorzugsweise weder spontan, noch in einer ribosomal katalysierten Reaktion (z.B. nach Stimulation durch einen Release Faktor) während der in vitro Translation lysiert werden kann. Bei der kovalenten Bindung kann es sich beispielsweise um eine C-C-Bindung, eine Amidbindung, um eine Sulfidbindung oder um eine Disulfidbindung handeln.
Ein Linker wird zur Verknüpfung der Peptidakzeptor-Einheit und der tRNA-Einheit vorzugsweise dann eingesetzt, wenn die tRNA-Einheit 3'-terminal verkürzt ist. Bei dem Linker handelt es sich vorzugsweise um eine organische Verbindung, beispielsweise um eine Kohlenwasserstoffkette oder um eine Polyethylengruppe.
Sowohl die Peptidakzeptor-Einheit wie auch der gegebenenfalls vorhandene Linker können gegebenenfalls durch mindestens eine Gruppe modifiziert sein bzw. mindestens eine modifizierende Gruppe umfassen, wobei es sich bei der mindestens einen modifizierenden Gruppe um eine fluorogene, chromogene, radioaktive oder photoreaktive Gruppe handeln kann und das Molekulargewicht der mindestens einen modifizierenden Gruppe vorzugsweise kleiner als 10 kDa, insbesondere kleiner als 5 kDa, besonders bevorzugt kleiner als 2 kDa, vor allem kleiner als 1 kDa ist.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmoleküls ist eine Puromycin-beladene tRNA (Puromycin-tRNA), wobei die tRNA 3'-terminal bevorzugt um ein Nukleotid vekürzt ist, so dass nach Anknüpfung des Puromycins die natürlicherweise anzutreffende Nukleotid-Anzahl der tRNA vorliegt (vgl. Abb. 1 und 2). Bei Puromycin handelt es sich um ein von Streptomyceten produziertes Antibiotikum mit translationsinhibierender Wirkung [Nathans & Neidle, 1963]. Aufgrund seiner auffälligen strukturellen Homologie zu dem 3'-Ende einer Aminoacyl-beladenen tRNA (der homologe Bereich umfaßt das letzte 3'-terminale Nukleotid der tRNA mit daran geknüpfter Aminosäure, vgl. Abb. 2) besitzt Puromycin die Eigenschaft, sequenzunabhängig sowohl den prokaryotischen wie auch den eukaryotischen Translationsprozeß vorzeitig zu terminieren. Puromycin lagert sich unabhängig von der Kodierung der mRNA in die A-Site des Ribosoms und übernimmt mit seiner primären Aminogruppe die bis dahin gebildete Polypeptidkette von der P-Site-tRNA. Dabei entstehen C-terminal verkürzte Peptidfragmente heterogener Länge, die alle über eine carboxyterminale Puromycin- Modifikation verfügen. Erfindungsgemäß kann nun durch die Verknüpfung des Puromycins mit einer tRNA, insbesondere einer Suppressor-tRNA, die Wirkung des Puromycin-Anteils als Peptidakzeptor abhängig von der mRNA-Kodierung gesteuert werden. Im Falle der Verknüpfung mit einer Suppressor-tRNA kommt es Stopp- Codon-abhängig anstelle der translationsterminierenden Wirkung eines Release Faktors zu einer Einlagerung dieses Hybridmoleküls in die A-Site des Ribosoms, so daß die Puromycin-Einheit des Hybridmoleküls in der Lage ist, die Polypeptidkette von der P-Site-tRNA in einer Transpeptidase-Reaktion zu übernehmen. Ein Überlesen und damit eine fortschreitende Verlängerung der Polypeptidkette im Translationsprozeß ist hierbei nicht möglich, weil dies durch die Säureamidbindung zwischen dem Nukleotidteil und dem Aminoacyl-homologen Teil des Puromycinanteils der Puromycin-Suppressor-tRNA verhindert wird (vgl. Abb. 2). Im Endzustand dieses Vorgangs erhält man ein über dem Stopp-Codon der kodierenden mRNA arretiertes Ribosom mit einem an der Puromycin-Suppressor- tRNA verankerten Polypeptid voller Länge.
Eine solche Struktur ist nun Voraussetzung und Grundlage z.B. für folgende
Anwendungen:
(1.) Ein erfindungsgemäßer Stopp-Codon-spezifisch verankerter
Translationskomplex läßt sich, analog der methodischen Schritte, wie sie in WO
00/09737 dargestellt sind, für eine gezielte Entfernung des 3'-untranslatierten
Bereiches der sich im Komplex befindenden mRNA nutzen (Abb. 4):
(1.1.) Durch eine gerichtete Degradation der RNA mit Hilfe einer 3'->5'-
Exoribonuklease kann die mRNA von ihrem 3'-Ende in 5'-Richtung bis zu dem Bereich entfernt werden, der durch den anliegenden, Stopp-Codon-spezifisch- verankerten Translationskomplex geschützt wird.
(1.2.) In einer Reversen Transkriptase-Reaktioή läßt sich mit Hilfe eines am 3'-Ende der mRNA hybridisierenden Primers (z.B. ein Poly-A-Tail spezifischer Oligo-(dT)- Primer) die mRNA von ihrem 3'-Ende her in 5'-Richtung soweit in ein partielles mRNA/cDNA-Hybrid überführen, bis die Aktivität der Polymerase durch die Blockade des auf der mRNA aufsitzenden, Stopp-Codon-spezifisch verankerten Translationskomplexes stoppt. Durch anschließende Behandlung der RNA mit einer Doppelstrang-RNA/DNA-abhängigen RNAse (wie z.B. RNase H) läßt sich spezifisch das zuvor revers transkribierte 3 '-Ende der RNA entfernen.
In beiden Fällen ist das Ergebnis einer solchen Behandlung eine mRNA, deren 3'- untranslatierter Bereich fast vollständig bis in die Nähe des Stopp-Codons entfernt ist. Die Größe des verbleibenden Anteils des 3'-UTRs wird dabei durch den Sequenzabschnitt der RNA bestimmt, der durch den angelagerten, Stopp-Codon- spezifisch verankerten Translationskomplex „geschützt" ist. Diese Restsequenz des 3'-UTRs incl. des Stopp-Codons läßt sich anschließend durch Verknüpfung folgender methodischer Schritte [vgl. WO 00/09737] aus der mRNA entfernen: (a) Ankopplung eines RNA-Adaptors (dadurch erfolgt die Einführung einer Primer- Bindestelle und einer Erkennungssequenz für ein Typ IIS-Restriktionsenzym); (b) Reverse Transkription der RNA unter Verwendung eines Adaptor-komplementären Primers und Zweitstrangsynthese; (c) Schneiden dieser doppelsträngigen DNA stromauf vom Stopp-Codon durch Inkubation mit einem Typ IIS-Restriktionsenzym (Erkennungssequenz wurde zuvor durch Ankopplung des RNA-Adaptors in die Sequenz eingeführt) (vgl. Abb. 4). Dadurch wird eine Entfernung sowohl des Stopp- Codons als auch des 3'-UTR-Restes auf korrespondierender DNA-Ebene ermöglicht. Anschließend kann die DNA durch in vitro Transkription wieder in RNA überführt werden und steht damit für verschiedene in vitro (oben genannte) oder in vivo Genotyp/Phänotyp-Kopplungstechniken (z.B. Phage-Display, Yeast-Display) in geeigneter Form zur Verfügung.
(2.) Ein erfindungsgemäßer Stopp-Codon-spezifisch verankerter
Translationskomplex enthält neben dem synthetisierten Polypeptid voller Länge auch die kodierende RNA und stellt damit eine stabile Phänotyp/Genotyp-Verknüpfung dar, wie sie auch Grundlage für die Polysomen-Display und die Ribosomen-Display- Technologie ist. Durch die hier beschriebene alternative Kopplungsstrategie, die auf der Verwendung einer Akzeptor-Suppressor-tRNA (z.B. Puromycin-Suppressor- tRNA) während des Translationsvorganges basiert, ist aber im Gegensatz zur Polysomen- bzw. Ribosomen-Display-Technologie auch die direkte Nutzung Stopp- Codon- und 3'UTR-haltiger mRNA möglich. Auf eine aufwendige Umarbeitung der mRNA zur Entfernung des Stopp-Codons, sowie des 3'-UTRs vor Einsatz in den in vitro Translationsschritt kann deshalb verzichtet werden.
Durch eine weitere Modifikation im Bereich der Anticodon-Schleife läßt sich das Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül zusätzlich so verändern, daß es zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung zwischen dem Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül und der translatierten mRNA während des Translationsvorganges geeignet ist. Bei der Modifikation handelt es sich dabei beispielsweise um eine photoreaktive Gruppe (z.B. Wybutin), die in der Lage ist, nach Bestrahlung mit Licht geeigneter Wellenlänge eine kovalente Verknüpfung zur mRNA, die während des Translationsvorganges abgelesen wird, auszubilden [Hanna, 1989; Steiner et al., 1984]. Die aktivierende Bestrahlung kann sowohl während als auch nach Beendigung des Translationsvorganges erfolgen. Die photoreaktive Form des Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls ist also in der Lage, zwei kovalente Verknüpfungen auszubilden: Eine erste Verknüpfung über die primäre Aminogruppe des Akzeptoranteils mit der translatierten Polypeptidkette und eine zweite Verknüpfung über die photoreaktive Gruppe der tRNA-Hälfte mit der kodierenden mRNA. Damit fungiert die photoreaktive Form des Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmoleküls als ein kovalent verknüpfendes Bindeglied zwischen kodierendem Genotyp und kodiertem Phänotyp, wobei als kodierender Genotyp eine unmodifizierte mRNA Verwendung finden kann und eine vorhergehende aufwendige Entfernung des 3'-UTRs und / oder des Stopp-Codons, oder eine Modifizierung des 3'-Endes der RNA durch eine Anlagerung eines Puromycin-Linkers damit überflüssig ist. Nach kovalenter Verknüpfung der Peptid-beladenen Peptidakzeptor/tRNA-Einheit mit der mRNA mittels der photoreaktiven Gruppe kann das Ribosom in einer dem Fachmann bekannten Weise entfernt werden, so dass man eine Verbindung (Hybridmolekül) erhält, bei der mRNA (Genotyp) und das von ihr kodierte Polypeptid (Phänotyp) über ein erfindungsgemäßes Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül kovalent miteinander verknüpft sind. Das so erhaltene Hybridmolekül aus Genotyp und Phänotyp kann beispielsweise, wie zuvor für den arretierten Translationskomplex beschrieben, zur Degradation des 3'-untranslatierten Bereiches der mRNA verwendet werden oder kann für in vitro Evolutionsexperimente genutzt werden, wie sie beispielsweise in WO 98/31700 beschrieben werden.
(3.) Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von erfindungsgemäßen Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekülen besteht in ihrer Verwendung zur Herstellung von Codon-spezifisch terminierten und gleichzeitig markierten Polypeptiden bzw. Proteinen und Proteinfragmenten. Die Codon-Spezifität wird dabei über den verwendeten tRNA-Anteil (speziell über die Sequenz des Anticodons) der Peptidakzeptor-tRNA während des Translationsvorganges vermittelt. Die Codon- Spezifität der verwendeten Peptidakzeptor-tRNA bestimmt zugleich auch die Länge des während des Translationsvorganges entstehenden Polypeptids bzw. Proteinfragments. Die Verwendung von Stopp-Codon spezifischen Akzeptor- Suppressor-tRNAs im Translationsprozeß führt hierbei zur Entstehung C-terminal markierter Proteine voller Länge.
Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften sind die zuvor genannten erfindungsgemäßen Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküle sowie die unter Verwendung dieser erhältichen Genotpy/Phänotyp-Hybridmoleküle und arretierten Translationskomplexe besonders gut für in wϊro-Evolutionsexperimente geeignet, wie sie beispielsweise in WO 98/31700 beschrieben werden.
Durch die Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküle wird zugleich Codon-abhängig eine einheitliche C-terminale Markierung in die entstehenden Protein bzw. Polypeptidfragmente eingeführt. Diese einheitliche C-terminale Modifikation läßt sich beispielsweise mit Hilfe von Akzeptor-spezifischen Antikörpern immunologisch detektieren (beispielsweise unter Verwendung von Puromycin-spezifischen Antikörpern), oder unter Ausnutzung der anhängenden Nukleinsäure über Hybridisierungsereignisse nachweisen. Bei Verwendung von radioaktiv oder mit chromogenen oder fluorogenen Molekülen markierten Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmolekülen lässt sich die Markierung entsprechend durch Nachweis der Radioaktivität beziehungsweise spektroskopisch oder spektrometrisch nachweisen. Eine solche C-terminale Modifikation ermöglicht auch eine unkomplizierte und rasch durchführbare Immobilisierung der modifizierten Polypeptide, z.B. an einer Matrix, die spezifisch für den Peptidakzeptor- oder den tRNA-Teil des Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmoleküls ist.
Hierbei ist insbesondere eine Immobilisierung an einer Matrix, die mit einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäurederivat beladen ist, unter Ausnutzung komplementärer Basenpaarungen zu dem tRNA-Teil möglich. Bei der genannten Matrix kann es sich erfindungsgemäß auch um einen Nukleinsäure-beladenen Chip handeln.
Eine weitere Nachweismöglichkeit modifizierter Peptide mit anhängender Nukleinsäure besteht in der Amplifikation des Nukleinsäureanteils nach reverser Transkription und Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR).
Durch Verwendung eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Chromophor oder einer radioaktiven Gruppe gekoppelten Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls im Translationsprozeß ergibt sich die Möglichkeit zur Codon-spezifischen Markierung von Proteinen bzw. Proteinfragmenten an ihrem C-terminalen Ende. Die markierende Gruppe sollte in diesem Falle bevorzugt über den Peptidakzeptor-Teil des Moleküls oder über 3 '-terminal gelegene Nukleotide des tRNA-Anteils des Moleküls kovalent gekoppelt sein. Handelt es sich bei diesem tRNA-Anteil beispielsweise um eine Suppressor-tRNA läßt sich im Translationsprozeß eine spezifische Markierung von translatierten Proteinen am natürlichen C-Terminus erreichen.
In Folge eines RNase-Verdaus oder einer Inkubation bei basischem pH, ist es anschließend möglich, den tRNA-Anteil des C-terminal modifizierten Polypeptids teilweise oder vollständig abzubauen. Dadurch erhält man ein Polypeptid voller Länge, das C-terminal eine relativ kleine Modifikation in Form eines peptidisch verknüpften Peptidakzeptors oder Peptidakzeptor-Derivats (z.B. mit anhängendem Fluoreszenzfarbstoff) aufweist. Diese Modifikation beeinflußt die physikalischchemischen Eigenschaften des Polypeptids, beispielsweise im Falle eines angekoppelten Puromycins oder Puromycin-Derivats als Peptidakzeptor, nur geringfügig, so daß gängige Proteinanalysemethoden, wie z.B. elektrophoretische (2-D-Gelelektrophorese), oder chromatographische, als Trennmethode auch weiterhin Anwendung finden können. Auch komplexe mRNA-Gemische, wie das Transkriptom einer Zelle, lassen sich auf diese Weise durch die in v/fro-Translation in Anwesenheit von markierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten, Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekülen in korrespondierende Gemische markierter Polypeptide überführen und anschließend analysieren.
Für die Analyse unterschiedlicher Transkriptome bzw. ihrer korrespondierenden Gemische fluoreszenzmarkierter Polypeptide können dabei unterscheidbare Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden: So kann zur Analyse des Transkriptoms einer Zellinie vor Behandlung mit einem Wirkstoff oder mit einer zu testenden Substanz eine Markierung der korrespondierenden Translationsprodukte beispielsweise mit Hilfe eines bestimmten Fluoreszenzfarbstoffs (z.B. Floureszenzfarbstoff „Rot") erfolgen. Dagegen kann zur Analyse des Transkriptoms der Zellinie nach Behandlung mit dem Wirkstoff ein anderer Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Floureszenzfarbstoff „Grün") für die Markierung der korrespondierenden Translationsprodukte verwendet werden. Über die anhängenden, unterscheidbaren Fluoreszenzfarbstoffe lassen sich die Translationsprodukte stets eindeutig dem ursprünglichen Transkriptom zuordnen. Deshalb können die markierten Translationsprodukte mehrerer Transkriptome parallel mit Hilfe gängiger Trennverfahren analysiert werden. So ist es beispielsweise möglich, die markierten Translationsprodukte parallel im Gemisch über 2-dimensionale (2-D)- Gelelektrophorese aufzutrennen. Die im selben Gel aufgetrennten Peptide lassen sich nach Fluoreszenz-Scanning über die spezifisch detektierbaren Fluoreszenzfarbstoffe eindeutig dem ursprünglich kodierenden Transkriptom zuordnen. Dies ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen den Translationsprodukt-Gemischen, die ausgehend von unterschiedlichen Transkriptomen hergestellt wurden, hinsichtlich ihrer qualitativen und quantitaiven Zusammensetzung. Soweit Ladung und Masse der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe vergleichbar sind, werden nämlich gleiche Peptide, Peptidfragmente bzw. Proteine, unabhängig von ihrem kodierenden Transkriptom, auch gleichermaßen über die 2-D-Gelelektrophorese aufgetrennt. Dieser methodische Ansatz erlaubt einen Vergleich (quantitativen und qualitativen) der Translationsprodukte nicht nur von zwei, sondern von mehreren Transkriptomen über ein und dasselbe 2-D-Gel.
Wird anstelle einer Suppressor-tRNA eine andere Codon-spezifische tRNA als Bestandteil des Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls während der Translation eingesetzt und liegt diese im Gemisch mit der natürlichen Codon-spezifischen, Aminosäure-beladenen tRNA vor, wird eine bestimmte mRNA, soweit sie an definierten Positionen innerhalb ihrer kodierenden Sequenz dieses Codon ein- oder mehrmals aufweist, während der Translation in ein Peptid charakteristischer Länge oder ein Peptidgemisch aus Peptiden von charakteristischer Länge überführt. Anzahl und Länge der entstehenden Peptide ist aufgrund der Codon-Sequenz ihrer kodierenden mRNA vorhersagbar. Umgekehrt ist es möglich, einem so erzeugten Gemisch aus Peptiden mit jeweils charakteristischer Länge (z.B. detektierbar nach Gelanalyse in Form eines Fragmentmusters), evtl. in Kombination mit weiteren physikalisch-chemischen Charakteristika (z.B. Isolelektrischer Punkt, nach Bestimmung über 2-D-Gelelektrophorese) eine bestimmte kodierende Sequenz zuzuordnen. Dies geschieht durch den Vergleich des experimentell zu beobachtenden Ergebnisses mit den aus Sequenzen ableitbaren Ergebnissen - i.d.R. mit Hilfe einer computergestützten Analyse.
Die Herstellung von Codon-arretierten Translationskomplexen mittels der erfindungsgemäßen Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküle läßt sich in vitro beispielsweise unter Verwendung von unterschiedlichen translationskompetenten Lysaten erreichen, beispielsweise mit Reticulozytenlysat aus Kaninchen, E. coli- Extrakten, bspw. E. coli S30-Extrakt, einem Lysat aus Hefezellen oder einem Extrakt aus Weizenkeimen. Erfindungsgemäß werden hierbei bevorzugt weitere Modifikationen der Zelllysate bzw. ihrer Ursprungszellen durchgeführt, die zu einer Inaktivierung der Release Faktor-Aktivität führen, beispielsweise
1.) Inaktivierungen in Folge einer Abreinigung der Release Faktoren aus dem Lysat, 2.) Inaktivierungen in Folge einer inaktivierenden Liganden-Bindung (z.B. Anbindung eines Antikörpers) oder 3.) Inaktivierungen in Folge der Verwendung von induzierbar inaktivierbaren
Mutanten des Release Faktors (z.B. durch Temperaturshift inaktivierbare ts-
Mutante des Release-Faktors bzw. der Release Faktoren).
Abbildungen
Abb. 1 : Schematische Übersicht über den Aufbau eines Peptidakzeptor-tRNA- Hybridmoleküls.
Abb. 2: Schematische Übersicht über die strukturelle Analogie zwischen Puromycin, Puromycin-Suppressor-tRNA und einer Tyrosin-beladenen tRNA (obere Bildhälfte), sowie über die Wirkung von Puromycin (untere Bildhälfte, links) bzw. von Puromycin- Suppressor-tRNA (untere Bildhälfte, rechts).
Abb. 3: Schematische Übersicht über den Verlauf einer in vitro Selektion unter Nutzung von nicht-kovalenten Fusionen aus mRNA/Puromycin-Suppressor- tRNA/Polypeptid/Ribosom-Komplexen, die sich durch Translation in Gegenwart von Puromycin-Suppressor-tRNA herstellen lassen.
Abb. 4: Schematische Übersicht über den Ablauf der Methoden zur Erzeugung einer 3'-UTR- und Stopp-Codon-freien mRNA.
1A) Mit Hilfe einer 3'->5'-Exoribonuklease läßt sich an einem Stopp-Codon- spezifisch arretierten Translationskomplex der 3'-UTR-Bereich der kodierenden RNA von seinem 3'-Ende bis in die Nähe des Stopp-Codons abbauen. 1 B) Der in 3'-Richtung vom Ribosomenkomplex (Stopp-Codon-spezifisch arretiert) gelegene Bereich der kodierenden RNA läßt sich beispielsweise durch Reverse Transkriptase in ein DNA/RNA-Hybrid überführen. Anschließend kann dieser RNA- Bereich z.B. mit Hilfe von RNase H degradiert werden. Abb. 5: Herstellung von Puromycin-Suppressor-tRNA.
A) Schematische Übersicht über die erforderlichen methodischen Schritte zur Herstellung der Puromycin-Suppressor-tRNA.
B) Analyse des T4-RNA-Ligase-Reaktionsansatzes über ein 10%iges Harnstoff- TBE-Polyacrylamidgel vor (Spur 1) bzw. nach (Spur 2) Zugabe der T4-RNA- Ligase und 45-minütiger Inkubation bei 16°C. Die aufgetrennten RNAs wurden duch UV-Shadowing sichtbar gemacht. Wie dargestellt, läßt sich in Folge der erfolgreichen Kopplung von 5'-Phosphat-rC-rC-Puromycin an Suppressor-tRNA(- 3) ein Größen-Shift der tRNA im Gel nachweisen.
Im folgenden werden einige Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft erläutert.
Ausführungsbeispiele
Herstellung einer Puromycin-Suppressor-tRNA:
Die Herstellung einer Puromycin-Suppressor-tRNA (Puro-Sup-tRNA) läßt sich beispielsweise in folgende methodische Schritte gliedern:
1.) Polymerase Ketten Reaktion (PCR) zur Herstellung einer DNA-Matrize
2.) In vitro Transkription der DNA-Matrize und Aufreinigung des
Transkriptionsproduktes (Suppressor-tRNA(-3), 3'-terminal um 3 Nukleotide verkürzte Suppressor-tRNA) über ein 10%iges, denaturierendes Harnstoffgel 3.) Generierung von Puromycin-Suppressor-tRNA durch Kopplung von 5'-Phosphat-
C-C-Puromycin-3' mit dem 3'-termina!en Ende der Suppressor-tRNA(-3) unter katalytischer Wirkung der T4-RNA-Ligase.
Zu 1.) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Herstellung einer DNA-Matrize: 4 pmol der Sequenz 5 '-cgc tgc agt aat acg act cac tat agg ggc tat agc tca gct ggg aga gcg ctt gcc tct aaa gca aga ggt cag egg ttc gat ccc gct tag ccc cac cgc ggc gtc cat cca-3' (in einer Endkonzentration von 4 nM) wurden zusammen mit 1 μM des 5'- Primers 5'-aga ggg tac cgc tgc agt aat acg act cac-3' und 1 μM des 3'-Primers 5'- tgg ggc taa gcg gga tcg-3' in einer Polymerase-Ketten-Reaktion mit 0.625 mM dNTPs (jeweils), 10 mM Tris-HCI (pH 8.8 bei 25°C), 50 mM KCI, 0.8% Nonidet P40, 1.5 mM MgCI2 und 0.025 U/μl Taq-Polymerase (Promega) unter Anwendung des folgenden Temperaturprogramms amplifiziert: 1 min 95°C; 21x (0.5 min 95°C; 0.5 min 53°C; 0.5 min 72°C); 2 min 72°C. Zur Kontrolle des PCR-Produktes wurden 10 μl der PCR-Reaktion über ein 2%iges TBE-Agarosegel analysiert.
Zu 2.) In vitro Transkription zur Herstellung von Sup-tRNA(-3): Das ungereinigte PCR-Amplifikat wurde unter Verwendung des T7- MEGAshortscript™ (Ambion, #1354) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers (7.5 mM ATP, 7.5 mM CTP, 7.5 mM GTP, 7.5 mM UTP, 1x T7 Reaktionspuffer, 1/10 Vol T7-Enzym-Mix) über 10 Std. bei 37°C in vitro transkribiert. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch für weitere 15 min mit RNase-freier DNAse I (in einer Endkonzentration von 0.1 U/μL; Ambion) bei 37°C inkubiert. Zur Aufreinigung der gebildeten Sup-tRNA_3 wurde der in vitro Transkriptionsansatzs mit 1 Vol Urea-Ladepuffer (8.3 M Urea, 50 mM EDTA) versetzt und nach Hitzedenaturierung (Ansatz erst 3 min bei 75°C, anschließend sofort auf Eis inkubieren) über präparative 10%ige Hamstoff-TBE -Polyacrylamidgele aufgetrennt. Durch UV-Shadowing im Gel sichtbar gemacht wurde die Suppressor-tRNA(-3) enthaltende Gelbande ausgeschnitten und die RNA aus der zerkleinerten Gelbande mit 0.3 M Na-Acetat (pH 5.4) für mind. 1 Std. bei 40°C ausgeschüttelt und anschließend durch Ethanol-Präzipitation ausgefällt. Nach Waschen des RNA- Präzipitats mit 70%igem Ethanol wurde die RNA in 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) resuspendiert und ihre Konzentration photometrisch bestimmt.
Zu 3.) T4-RNA-Ligase-Kopplung zur Generierung eines Puromycin-Suppressor- tRNA-Fusionsmoleküls:
Zur Herstellung von Puromycin-Suppressor-tRNA wurden 40 μM 5'-Phosphat-riboC- riboC-Puromycin-3' (Donor) mit 20 μM der Suppressor-tRNA(-3) (Akzeptor) in einer Ligationsreaktion mit 0.5 U/μL T4-RNA-Ligase (MBI-Fermentas), 0.02 mg/m! BSA (MBI-Fermentas), 10% DMSO, 50 mM HEPES-KOH (pH 8.3 bei 25°C), 10 mM MgCI2, 5.5 mM ATP für 45 min bei 16°C inkubiert. Zuvor wurde die Akzeptor-RNA Suppressor-tRNA(-3) für 5 min bei 85°C inkubiert und anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um die Ausbildung einer tRNA-spezifischen Sekundärdtruktur zu fördern. Die ligierte Puromycin-Suppressor-tRNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und/oder Ethanol Präzipitation gereinigt. Die Effizienz der Ligationsreaktion wurde durch Analyse über ein 10%iges Hamstoff- TBE-Polyacrylamidgel kontrolliert (vgl. Figur 5).
Literatur
Hanna MM.
Photoaffinity cross-linking methods for studying RNA-protein interactions. Methods Enzymol. 1989;180:383-409.
Jermutus L, Ryabova LA, Pluckthun A.
Recent advances in producing and selecting functional proteins by using cell-free translation.
Curr Opin Biotechnol. 1998 Oct;9(5):534-48.
Mattheakis LC, Dias JM, Dower WJ.
Cell-free synthesis of peptide libraries displayed on polysomes. Methods Enzymol. 1996;267:195-207.
Mattheakis LC, Bhatt RR, Dower WJ.
An in vitro polysome display System for identifying ligands from very large peptide libraries.
Proc Natl Acad Sei U S A. 1994 Sep 13;91(19):9022-6.
Nathans, Neidle.
Nature, 197, 1076-1077, 1963
Steiner G, Luhrmann R, Kuechler E.
Crosslinking transfer RNA and messenger RNA at the ribosomal decoding region: identification of the site of reaction on the messenger RNA. Nucleic Acids Res. 1984 Nov 12;12(21):8181-91
Roberts RW.
Totally in vitro protein selection using mRNA-protein fusions and ribosome display. Curr Opin Chem Biol. 1999 Jun;3(3):268-73.
Roberts RW, Szostak JW.
RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Proc Natl Acad Sei U S A. 1997 Nov 11 ;94(23): 12297-302.

Claims

Patentansprüche
1. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül, umfassend a) tRNA oder tRNA-analoge Einheit, die zur Codon-spezifischen Bindung an die mRNA während des Translationsprozesses in der Lage ist, b) Peptidakzeptor-Einheit, die dazu in der Lage ist, in einer Transpeptidasereaktion einen Carbonsäureester unter Ausbildung einer stabilen, kovalenten Bindung zu spalten, wobei die Einheiten (a) und (b) direkt oder über einen Linker kovalent miteinander verknüpft sind.
2. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 1 , umfassend a) natürlicherweise vorkommende, synthetisch hergestellte oder durch in vitro- Transkription hergestellte tRNA oder tRNA-Derivat, das auch natürlicherweise nicht vorkommende Nukleotidanaloga umfassen kann, wobei die Sequenz der tRNA 3'-terminal um bis zu 20 Nukleotide verkürzt sein kann, b) Aminosäure, Aminosäurederivat, Puromycin oder Puromycin-Derivat, wobei die Einheit (b) kovalent mit dem 3'-Ende der Einheit (a) verknüpft ist.
3. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Akzeptor-Einheit mit dem 3'-terminalen Nukleotid oder Nukleotidanalogon der tRNA-Einheit in Form einer kovalenten Bindung, insbesondere einer Phosphatesterbindung oder Amidbindung, stabil verknüpft ist.
4. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Akzeptor-Einheit um ein Puromycinmolekül handelt, das über die δ'-Hydroxylgruppe der Zucker-Untereinheit eine Phosphatesterbindung mit dem 3'-terminalen Ende einer tRNA ausbildet.
5. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei Komponente (a) um eine Suppressor-tRNA oder ein Suppressor-tRNA-Derivat handelt.
6. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Einheit aus der Gruppe bestehend aus Peptidakzeptor-Einheit, tRNA-Einheit und Linker mindestens eine modifizierende Gruppe umfaßt.
7. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der modifizierenden Gruppe um einen Fluoreszenzfarbstoff, einen Chromophor oder eine radioaktive Gruppe handelt.
8. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich im oder benachbart zum Anticodon-Bereich der tRNA- Einheit ein kovalent gebundenes photoreaktives Nukleotidanalogon befindet.
9. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich 3'-terminaI zum Anticodon der tRNA-Einheit ein Wybutin als photoreaktives Nukleotidanalogon befindet.
10.Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Codon-spezifisch arretierten Translationskomplexes.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Codon-spezifisch arretierten Translationskomplex um einen Stopp-Codon- spezifisch arretierten Translationskomplex handelt.
12. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls nach Anspruch 8 oder 9 zur Herstellung eines arretierten Translationskomplexes, dadurch gekennzeichnet, daß das tRNA-Molekül nach Ausbildung des arretierten Translationskomplexes durch Aktivierung der photoreaktiven Gruppe kovalent an die mRNA gebunden wird.
13. Verfahren zur Herstellung eines Hybridmoleküls aus Polypeptid und für das Polypeptid kodierender mRNA, dadurch gekennzeichnet, daß gemäß Anspruch 12 ein arretierter Translationskomplex mit kovalenter Verknüpfung zwischen mRNA und tRNA-Einheit hergestellt wird und das Ribosom anschließend abgetrennt wird.
14. Hybridmolekül aus Polypeptid und für das Polypeptid kodierender mRNA, dadurch gekennzeichnet, dass Polypeptid und mRNA über ein Peptidakzeptor/tRNA-HybridmoIekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 miteinander verbunden sind.
15. Hybridmolekül nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül und mRNA über eine photoreaktive Gruppe kovalent miteinander verknüpft sind.
16. Arretierter Translationskomplex, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein codon- spezifisches Peptidakzeptor-tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 im Ribosom befindet, an dessen Peptidakzeptor-Untereinheit das Polypeptid kovalent gebunden ist.
17. Arretierter Translationskomplex nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül und mRNA über eine photoreaktive Gruppe kovalent miteinander verknüpft sind.
18. Verwendung des Hybridmoleküls nach Anspruch 14 oder 15 oder des arretierten Translationskomplexes nach Anspruch 16 oder 17 zur Degradation des 3'- untranslatierten Bereiches der mRNA und/oder zur Entfernung des Stopp- Codons.
19. Verwendung nach Anspruch 18 wobei die Degradation durch Einsatz einer 3'-5'- Exoribonuklease oder nach Herstellung des komplementären cDNA-Stranges unter Einsatz einer RNA/DNA-Strang-spezifischen RNase, bevorzugt RNase H, erfolgt.
20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei zur Entfernung des verbliebenen 3'-UTR und des Stopp-Codons mindestens folgende weitere Schritte durchgeführt werden: a) Ankopplung eines RNA-Adaptors, umfassend eine Primer-Bindestelle und eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, bevorzugt ein Typ IIS- Restriktionsenzym, b) Reverse Transkription der RNA unter Verwendung eines Adaptor- komplementären Primers, c) Degradation der RNA im Bereich des RNA/DNA-Doppelstranghybrids, d) Zweit-DNA-Strang-Synthese, e) Restriktion der doppelsträngigen DNA stromaufwärts vom Stopp-Codon durch ein Restriktionsenzym, bevorzugt durch ein Typ IIS-Restriktionsenzym.
21. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Codon-spezifischen Markierung von Proteinen und/oder Proteinfragmenten an ihrem carboxyterminalen Ende während ihrer Herstellung durch in vitro -Translation.
22. Verwendung nach Anspruch 21 , wobei es sich bei der codon-spezifischen Markierung um eine Stopp-Codon-spezfisiche Markierung handelt.
23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß nach Herstellung des markierten Proteins bzw. Proteinfragments der tRNA-Teil teilweise oder vollständig abgebaut wird, bevorzugt mittels einer RNase oder durch Inkubation bei basischem pH.
24. Protein, das an seinem carboxyterminalen Ende ein Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 trägt.
25. Verfahren zum Nachweis oder zur Reinigung von carboxyterminal markierten Proteinen nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis und/oder die Reinigung durch Akzeptor-spezifisch bindende Moleküle, bevorzugt Akzeptor-spezifische Antikörper und/oder durch Hybridisierung ihres tRNA- Anteils mit einer komplementären Nukleinsäure erfolgt, wobei Antikörper und komplementäre Nukleinsäure auf einer Matrix immobilisiert sein können.
26. Verfahren zum Nachweis von carboxyterminal markierten Proteinen nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch reverse Transkription ihres RNA-Anteils und anschließende Amplifikation der cDNA in der Polymerase-Kettenreaktion erfolgt.
27. Verfahren zur differentiellen Transkriptomanalyse, folgende Schritte umfassend: a) das Transkriptom von Zellen wird isoliert und gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23 werden C-terminal markierte Proteine und/oder Proteinfragmente synthetisiert, b) das Transkriptom von Zellen nach (a) wird, nachdem die Zellen einem Wirkstoff oder einer zu testenden Substanz ausgesetzt worden waren, isoliert und wie in (a) werden C-terminal markierte Proteine und/oder Proteinfragmente synthetisiert. c) Die erhaltenen Protein- und/oder Proteinfragmentgemische werden durch Proteinanalyse, bevorzugt durch 2-dimensionale Gelanalyse, miteinander verglichen.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß in (a) und (b) unterschiedlich markierte tRNA-Hybridmoleküle eingesetzt werden und die erhaltenen Protein- und/oder Proteinfragmentgemische parallel elektrophoretisch mit demselben 2-dimensionalen Gel analysiert werden.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül ein Peptidakzeptor/Suppressor-tRNA- Hybridmolekül verwendet wird und entsprechend vollständige Proteine synthetisiert werden.
30. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in vitro unter Verwendung von translationskompetenten Lysaten durchgeführt wird, bevorzugt mit Reticulozytenlysat, E. co//'-Extrakten, Extrakt aus Weizenkeimen und/oder mit Lysat aus Hefezellen.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Release-Faktor- Aktivität in dem Lysat herabgesetzt oder inhibiert wurde, bevorzugt durch Abreicherung des Release-Faktors, durch inaktivierende Ligandenbindung, besonders bevorzugt durch inaktivierende Anbindung eines spezifischen Antikörpers oder durch Verwendung von induzierbar inaktivierbaren Mutanten des Releasefaktors.
32. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 oder eines Hybridmoleküls gemäß Anspruch 14 oder 15 oder eines arretierten Translationskomplexes gemäß Anspruch 16 oder 17 für in vitro- Evolutionsexperimente.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19646372C1 (de) * 1995-11-11 1997-06-19 Evotec Biosystems Gmbh Genotyp und Phänotyp koppelnde Verbindung
EP0962527A1 (de) * 1996-10-17 1999-12-08 Mitsubishi Chemical Corporation Molekül, welches Genotyp und Phänotyp zusammenführt und dessen Anwendungen
US20020031762A1 (en) * 1998-04-17 2002-03-14 Charles Everett Merryman Method for producing diverse libraries of encoded polypeptides

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19646372C1 (de) * 1995-11-11 1997-06-19 Evotec Biosystems Gmbh Genotyp und Phänotyp koppelnde Verbindung
EP0962527A1 (de) * 1996-10-17 1999-12-08 Mitsubishi Chemical Corporation Molekül, welches Genotyp und Phänotyp zusammenführt und dessen Anwendungen
US20020031762A1 (en) * 1998-04-17 2002-03-14 Charles Everett Merryman Method for producing diverse libraries of encoded polypeptides

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEXIKON DER BIOCHEMIE UND MOLEKULARBIOLOGIE: "Aminoacyl-tRNA", 1991, HERDER, FREIBURG, XP002210889, 1 *
MATZKE AJ ET AL.: "Mechanism of translocation: relative arrangement of tRNA and mRNA on the ribosome.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES, vol. 77, no. 9, September 1980 (1980-09-01), pages 5110 - 5114, XP001098047 *
MERRYMAN CHUCK ET AL: "A bifunctional tRNA for in vitro selection.", CHEMISTRY & BIOLOGY (LONDON), vol. 9, no. 6, June 2002 (2002-06-01), June, 2002, pages 741 - 746, XP002210888, ISSN: 1074-5521 *

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