WO2002081663A1 - Procede de production de cellules souches de nerfs, de neurones moteurs et de neurones gabaergiques, a partir de cellules souches d'embryons - Google Patents

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Hideyuki Okano
Takuya Shimazaki
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Definitions

  • neural stem cells Description of neural stem cells, motor neurons and GABAergic neurons from embryonic stem cells
  • the present invention relates to a method for selectively producing neural stem cells from embryonic stem cells (ES cells), and furthermore, to selectively and efficiently produce motor neurons and GABAergic neurons.
  • ES cells embryonic stem cells
  • neural stem cells In the mammalian central nervous system, neural stem cells continue to exist throughout the life of an individual, and are thought to contribute to the development and maintenance of the central nervous system by producing various neurons and glial. Recently, techniques for isolating and culturing neural stem cells from the brains of mammals, including humans, have been developed and are expected to be applied to cell transplantation therapy for various neurodegenerative diseases and injuries. However, during development, various types of neurons that are produced and differentiated from stem cells under the control of various internal and external factors, especially motor neurons that are specifically produced during early embryonic development, are cultured in vitro. Attempts to produce from expanded neural stem cells have not been successful.
  • the present invention provides an efficient means for inducing differentiation from ES cells having the ability to differentiate into all cells of an individual into neural stem cells having early developmental properties, and selecting specific neurons such as motor neurons therefrom.
  • the challenge is to provide technology for efficient production. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted various studies on the conditions for the formation of embryoid bodies from ES cells, the induction of differentiation into neural stem cells, and the induction of differentiation into two eurons.
  • the addition of protein is particularly excellent.
  • medium containing sonic hedgehog protein in addition to fibroblast growth factor (FGF) was used for expansion of neural stem cells appearing in embryoid bodies. It has been found that utilization is extremely efficient, and furthermore, differentiation of neural stem cells induced in this way allows selective and efficient production of motor neurons and GABAergic neurons. It was completed.
  • FGF fibroblast growth factor
  • the present invention provides a method for forming an embryoid body, which is characterized by culturing ES cells in suspension in the presence of Noggin protein.
  • the present invention provides that the ES cells are cultured in suspension in the presence or absence of Noggin protein to form embryoid bodies, which are then cultured in suspension in the presence of fibroblast growth factor and sonic hedgehog protein. And a method for producing a neural stem cell.
  • the present invention provides an embryoid body formed by suspending ES cells in the presence or absence of Noggin protein to form an embryoid body, which is suspended in the presence of fibroblast growth factor and sonic hedgehog protein to form a neural cell.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing motor neurons and GABAergic neurons, which are induced into stem cells and then differentiated.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the culture days of embryoid bodies and neurosphere formation.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of immunostaining of neurospheres. The stained part expresses] 3-I I-tubulin, indicating that it is a neuron.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of immunostaining of neurospheres.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of immunostaining of neurospheres.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of immunostaining after neurosphere subculture.
  • FIG. 6 is a diagram showing the ratio of neurons to Daryah cells after neurosphere subculture.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of adding Noggin protein.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of adding sonic hedgehog protein.
  • ES cells already established as cultured cells can be used.
  • ES cell lines such as mouse, hamster, pig, and human can be used. Specific examples include 129 / 01a mouse-derived ES cells, EB3, E14tg2, and the like.
  • the ES cells are preferably subcultured in a GMEM medium or the like containing serum.
  • the efficiency of inducing differentiation of ES cells into neural stem cells is improved by suspension culture in a medium supplemented with Noggin protein.
  • Noggin protein for example, American Meganoelgin can be used, but a full-length cDNA of American Meganoelgin is introduced into COS 7 cells, and the culture supernatant in which Noggin protein is transiently expressed is used. You may use it as it is.
  • the concentration of Noggin protein in the medium is preferably about 1 to 50% (v / v) in terms of the culture supernatant.
  • the suspension culture of the ES cells may be performed, for example, at a concentration of about 1 ⁇ 10 5 eel ls_mL in the serum-containing ⁇ -MEM medium for 4 to 8 days.
  • the serum include lung serum, pig serum, and the like, and its concentration is preferably 5 to 15%, particularly preferably 8 to 12%.
  • 2-mercaptoethanol it is preferable to add 2-mercaptoethanol to the MEM medium at a concentration of 0.01 to 0.5 mM, particularly 0.05 to 0.2 mM.
  • Noggin protein at the time of embryoid body formation, that is, on the 1st to 6th days of culture.
  • sonic hedgehog protein improves the efficiency of inducing differentiation and proliferation of neural stem cells into motoneuron progenitor cells, and actually differentiates into motoneurons and GABAergic neurons by subsequent differentiation culture.
  • FGF-2 As the fibroblast growth factor (FGF), FGF-2 is preferable.
  • the content of FGF in the medium is preferably 5 to 50 ngZmL, particularly preferably 10 to 40 ngZmL.
  • sonic hedgehog protein for example, mouse sonic hedgehog protein is preferable.
  • the content of the sonic hedgehog protein in the medium is preferably 1 to 20 nM, particularly preferably 1 to 10 nM.
  • DMEM DMEM medium to which glucose, glutamine, insulin, transferrin, progesterone, putrescine, selenium chloride, heparin and the like are added in addition to the above components.
  • DM EM It is particularly preferred to use F12 medium.
  • a cell aggregate derived from a single cell called a neurosphere is formed.
  • the obtained neurospheres are derived only from neural stem cells, indicating that the differentiation induction efficiency by the culture method is extremely high.
  • the differentiation-inducing medium includes DMEM: F12 medium containing glucose, glutamine, insulin, transferrin, prodiesterone, putrescine, and selenium chloride (ie, excluding FGF and heparin from the neural stem cell growth medium). Medium).
  • the sonic hedgehog protein may or may not be present. Cultures 5% C_ ⁇ 2 conditions, preferably performed 35-40 in 5-7 days.
  • Neural cells differentiated from conventional ES cells include not only neurons but also a large amount of glial cells, and their utility is extremely limited. On the other hand, the neurons obtained by the present invention are almost only motor neurons and GABA A-operating neurons.
  • ES cells derived from 129 / 01a mouse, blastocidine resistance gene can be inserted into E14tg2a and its Oct3 / 4 locus to select undifferentiated ES cells.
  • EB3 is 10% fetal calf serum, Essential amino acid, ImM sodium pyruvate, 0. ImM2-mercaptoethanol and 100 UZmL leukemia inhibitory factor
  • the cells were subcultured in a Glasgow minimum essential medium (GMEM) medium containing (Leukemia inhibitory factor, LIF) by a standard method (5% CO 2 , 37, hereinafter simply referred to as “culture” under these conditions).
  • GMEM Glasgow minimum essential medium
  • LIF Leukemia inhibitory factor
  • Embryoid body (EB) formation from ES cells was performed as follows. After washing the ES cells with PBS, the cells were treated with 0.25% trypsin-ImM EDTA and stopped, and the cells dispersed by pipetting were mixed with 10% fetal calf serum and 0.1 niM 2-mercaptoethanol. _ Inoculated in a culture dish for bacteria filled with MEM medium at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cellsZmL, and cultured by transiently expressing the noggin protein (full-length cDNA of Noggin, a No. 1 nucleus, into COS 7 cells and transiently expressing it) Supernatant) EBs were formed by suspension culture for 4 to 8 days in the presence and absence. (2) Separation of neural stem cells from EBs by selective culture
  • the EBs formed as described above are transferred to a centrifuge tube together with the culture solution, and allowed to stand at the bottom of the tube for 10 minutes. After removing the supernatant, resuspend in 0.25% trypsin-lmM EDTA solution, incubate at 37 ° C for 5 minutes, and perform proteolysis in Hi-MEM medium containing 10% fetal calf serum. After stopping, the cells were dispersed with pipets.
  • the dispersed cells are washed twice by centrifugation in ⁇ -MEM medium, and glucose (0.6%), glutamine (2 mM), insulin (25 gZmL), transferrin (100 gZmL), and progesterone Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with (20 nM), putrescine (60 M), selenium chloride (30 nM), FGF-2 (20 ng / mL) and heparin (2 ng / mL): F12 (1 : 1) Seed at 5 ⁇ 10 4 cells / mL in a medium (neural stem cell growth medium) or a medium to which mouse sonic hedgehogl protein (5 nM) is further added.
  • DMEM progesterone Dulbecco's modified Eagle's medium
  • neurospheres By suspension culture for a day, cell aggregates derived from single cells called neurospheres were formed (neurosphere method). These neurospheres are obtained by centrifugally washing the above-mentioned neural stem cell growth medium with a differentiation medium from which FGF_2 and heparin have been removed, and then dispersing the cells as they are or by pipetting. The cells were seeded on a culture dish coated with poly-L-ornithin and differentiated by culturing for 5 to 7 days in the presence or absence of sonic hedgehog protein (5 nM). The neurospheres obtained as described above are dispersed again into single cells and subcultured in a neural stem cell growth medium for 7 days to form secondary neurospheres, which are also differentiated as described above.
  • sonic hedgehog protein 5 nM
  • the neuronal glial cells differentiated as described above were identified by a standard immunostaining method using a fluorescent antibody.
  • Motor neurons are mouse anti-I s 1-1 monochromatic
  • GABA A-operating neurons were identified using a rabbit heron anti-GAD67 polyclonal antibody.
  • Glial cells were identified using estrocyte anti-GFAP polyclonal antibody for astrocytes and oligodendrocyte using mouse anti-04 monoclonal antibody.
  • EBs from 4 to 8 days of culture were dispersed in single cells, and cultured in a neural stem cell medium for 7 days to form neurospheres. These neurospheres were transferred to a differentiation medium and differentiated, and their differentiation ability was assayed, and their self-renewal ability was examined by subculturing.
  • Figure 1 shows the results of selective culturing (neurosphere method) of neural stem cells by dispersing EBs into single cells 6 and 8 days after the start of EB formation by suspension culture.
  • the number of neurospheres obtained was the number of neural stem cells that appeared in EBs.
  • neural stem cells identified by this method (which can form neurospheres) were hardly detectable until the 4th day of EB culture, and 0.25% of all cells on the 6th day of EB culture. It was found that the rate gradually increased to 1.1%.
  • FIG. 1 neurospheres obtained from EBs on day 6 were cultured under differentiation conditions for 7 days, and their differentiation ability was assayed by immunostaining.
  • the results are shown in Figs. (Three-tubule immunostaining was performed using antibodies against 3-III_tubulin and GFAP and 04, which are glial cell markers, and all neurospheres expressed neurons almost expressing i3-III-tubulin.) Glial cells were not detected (Fig. 2). These neurons are at least motor neurons expressing Is1-1 and ChAT (rounded and fibrous parts in Fig. 3) and GABAergic neurons expressing GAD67 (fibrous parts in Fig. 4). Minutes).
  • the obtained neurospheres were subcultured to obtain secondary neurospheres, which were cultured for 7 days under differentiation conditions, and the differentiation ability was examined by immunostaining. As a result, all neurospheres contain glial cells (Fig.
  • FIG. 5 shows the results of triple immunostaining of 3-III-tubulin (fine and clear fibrous), GFAP (part around the 3-III-tubulin) and 04 (part further outside of GFAP).
  • Noggin was prepared by introducing the full-length cDNA of African Meganoelgin into a pEF-B ⁇ S expression vector, introducing it into COS 7 cells, using the transiently expressed culture supernatant as a Noggin solution, and introducing only the expression vector into COS.
  • the culture supernatant of 7 cells was used as a control.
  • the number of neural stem cells forming neurospheres induced to differentiate in EBs increased depending on the amount of Noggin culture supernatant, and reached a peak at 110-fold volume.
  • sonic hedgehog protein was added during the proliferation of neural stem cells, that is, during the formation of EB-derived primary cultured double europea spheres, and the effect was examined.
  • the motoneurons disperse two Eurospheres into single cells and culture them in differentiation medium for 5 days. Identification was performed by double immunostaining of i3-III-tubulin, and the number was quantified. As a result, as shown in FIG. 8, sonic hedgehog at 5 nM doubled the production of motor eurones. It should be noted that no effect was observed even when sonic hedgehog was added to the differentiation medium during neural differentiation.
  • At least motor neurons and GABAergic neurons can be produced systematically and efficiently from ES cells. If selective neurons can be obtained, they may be applicable to transplantation treatments such as amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's chorea, and Alheimer's disease.

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Description

明 細 胚性幹細胞からの神経幹細胞、 運動ニューロン及び G A B A作動性ニューロンの
技術分野
本発明は胚性幹細胞 （E S細胞） から選択的に神経幹細胞、 さらには選択的か つ効率的に運動ニューロン及び GA B A作動性ニューロンを製造する方法に関す る。 背景技術
哺乳類の中枢神経系において神経幹細胞は個体の一生を通して存在し続け、 多 様なニューロンゃグリアを生産することによって、 中枢神経系の発生及び維持に 寄与していると考えられている。 最近、 ヒトを含めた哺乳動物の脳より神経幹細 胞を分離 ·培養する技術が開発され、 様々な神経変性疾患や損傷に対する細胞移 植治療への応用が期待されている。 しかしながら、 発生過程において、 様々な内 的及び外的因子による制御によって幹細胞から産生され分化する様々なタイプの ニューロン、 特に胚発生初期に特異的に産生される運動ニューロンなどを、 in vi troで培養増幅させた神経幹細胞から生産する試みは確たる成果を上げていな い。
従って、 本発明は、 個体の全ての細胞に分化する能力を持つ E S細胞から発生 初期の性質を保持する神経幹細胞への効率的な分化誘導手段、 及びそこから運動 ニューロン等の特定のニューロンを選択的に生産する技術を提供することを課題 とする。 発明の開示 そこで本発明者は E S細胞から胚様体の形成、 神経幹細胞への分化誘導及び二 ユーロンへの分化誘導の条件について種々検討した結果、 E S細胞から胚様体の 形成には N o g g i n (ノギン） 蛋白質の添加が特に優れており、 胚様体中に出 現する神経幹細胞の増幅には繊維芽細胞増殖因子 （f ibroblas t growth fac tor： FGF) に加えてソニックヘッジホッグ蛋白質を添加した培地の利用が極めて効率 的であり、 さらにこのようにして誘導された神経幹細胞を分化させれば運動ニュ 一ロン及び GA B A作動性ニューロンが選択的かつ効率良く生産されることを見 出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 E S細胞をノギン蛋白質存在下に浮遊培養することを特 徴とする胚様体の形成方法を提供するものである。
また、 本発明は、 E S細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養し て胚様体を形成させ、 次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッ グ蛋白質の存在下で浮遊培養することを特徴とする神経幹細胞の製造法を提供す るものである。
さらに本発明は、 E S細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養し て胚様体を形成させ、 これを繊維芽細胞増殖因子及びソニックへッジホッグ蛋白 質の存在下で浮遊して神経幹細胞に誘導し、 次いでこれを分化させることを特徴 とする運動ニューロン及び G A B A作動性ニューロンの製造法を提供するもので ある。 図面の簡単な説明
図 1は、 胚様体の培養日数とニューロスフェア形成との関係を示す図である。 図 2は、 ニューロスフェアを免疫染色した結果を示す図である。 染色部は ]3— I I I— tubul inを発現し、 ニューロンであることを示す。
図 3は、 ニューロスフェアを免疫染色した結果を示す図である。
図 4は、 ニューロスフェアを免疫染色した結果を示す図である。 図 5は、 ニューロスフェア継代培養後の免疫染色結果を示す図である。
図 6は、 ニューロスフエァ継代培養後のニューロンとダリァ細胞の比率を示す 図である。
図 7は、 ノギン蛋白質の添加効果を示す図である。
図 8は、 ソニックへッジホッグ蛋白質の添加効果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられる ES細胞としては、 既に培養細胞として確立されている ES細胞を使用することができる。 例えば、 マウス、 ハムスター、 ブタ、 ヒト等 の ES細胞株を使用することができる。 具体例としては、 129/01 a系マウ ス由来の ES細胞、 EB3、 E 14 t g 2等が挙げられる。 当該 ES細胞は、 血 清を含む GMEM培地等にて培養継代しておくのが好ましい。
E S細胞から胚様体の形成には、 ノギン蛋白質を添加した培地で浮遊培養する と、 ES細胞から神経幹細胞への分化誘導効率が向上する。 ノギン蛋白質は、 例 えばアメリカッメガエルノギンを使用することができるが、 アメリカッメガエル ノギンの全長 cDNAを COS 7細胞に導入し、 一過性にノギン蛋白質を発現さ せた培養上清をそのまま使用してもよい。 ノギン蛋白質の培地中の濃度は、 この 培養上清換算で 1〜50% (v/v) 程度が好ましい。 ES細胞の浮遊培養は、 例 えば ES細胞を血清含有 α— MEM培地にて 1 X 105 eel ls_ mL程度の濃度で 4〜 8日間行えばよい。 ここで血清としてはゥシ血清、 ブタ血清などが挙げら れ、 その濃度は 5〜15%、 特に 8〜12%が好ましい。 また £¾一 MEM培地に は 2—メルカプトエタノールを 0. 01〜0. 5mM、 特に 0. 05〜0. 2mMと なるように添加するのが好ましい。 培養は 5%C〇2条件下、 35〜40°Cで行 うのが好ましい。
なお、 ノギン蛋白質の添加は胚様体形成時、 すなわち培養 1〜6日目に添加し ておくのが特に好ましい。 前記のように形成された胚様体を経由して E S細胞から得られた神経幹細胞を 増幅するには、 繊維芽細胞増殖因子に加えてソニックヘッジホッグ蛋白質を含有 する神経幹細胞増殖培地で浮遊培養する。 ソニックヘッジホッグ蛋白質の添加に より、 神経幹細胞の運動ニューロン前駆細胞への分化誘導効率及び増殖効率が向 上し、 その後の分化培養により運動ニューロン及び G A B A作動性ニューロンへ 実際に分化する。
繊維芽細胞増殖因子 （F G F ) としては、 F G F— 2が好ましい。 培地中の F G Fの含有量は 5〜 5 0 ngZmL、 特に 1 0〜 4 0 ngZmLが好ましい。 また、 ソ ニックへッジホッグ蛋白質としては、 例えばマウスソニックへッジホッグ蛋白質 が好ましい。 培地中のソニックヘッジホッグ蛋白質の含有量は 1〜2 0 nM、 特に 1〜1 O nMが好ましい。
培地としては、 上記成分の他にグルコース、 グルタミン、 インスリン、 トラン スフエリン、 プロジェステロン、 プトレシン、 塩化セレン、 へパリン等を添加し た DM EM培地を用いるのが好ましい。 DM E M： F 1 2培地を用いるのが特に 好ましい。 培養は 5 % C〇2条件下、 3 5〜4 0 °Cで行うのが好ましい。 培養時 間は 7〜 9日間が好ましい。
上記の浮遊培養により、 ニューロスフェア （neurosphere) と呼ばれる単一細 胞由来の細胞凝集塊が形成する。
得られたニューロスフェアは、 神経幹細胞のみに由来するものであり、 前記培 養法による分化誘導効率は極めて高いことがわかる。
このようにして得られた神経幹細胞を、 通常の分化培地で培養すれば、 運動二 ユーロン及び G A B A作動性ニュ一口ンのみが分化誘導される。 ここで分化誘導 培地としては、 グルコース、 グルタミン、 インスリン、 トランスフェリン、 プロ ジエステロン、 プトレシン、 塩化セレンを含む DM E M： F 1 2培地、 （すなわ ち、 神経幹細胞増殖用培地から F G Fとへパリンを除いた培地） を用いるのが好 ましい。 このとき、 ソニックヘッジホッグ蛋白質は存在しても、 なくてもよい。 培養は 5%C〇2条件下、 35〜40 で 5〜7日間行うのが好ましい。
従来の ES細胞から分化誘導された神経系細胞は、 ニューロンだけでなく、 多 量のグリア細胞などを含んでおり、 その利用価値は極めて制限されていた。 これ に対し、 本発明により得られたニューロンは、 ほとんど運動ニューロンと GAB A作動性ニューロンのみである。 実施例
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれに何ら限 定されるものではない。
A. 材料及び方法
(1) マウス ES細胞の培養継代と胚様体の形成
129/01 a系マウス由来の ES細胞、 E 14 t g 2 a及びその Oc t 3/ 4遺伝子座にブラストシジン耐性遺伝子を挿入し未分化 ES細胞を選択できる EB3は、 10%仔牛胎児血清、 非必須アミノ酸、 ImMピルビン酸ナトリウム、 0. ImM 2—メルカプトエタノール及び 1 0 0 O UZmL白血病抑制因子
(Leukemia inhibitory factor、 LIF) を含む Glasgow minimum essential medium (GMEM)培地にて定法 （5%C02, 37 、 以下、 単に 「培養」 というと きは、 この条件） によって培養継代した。
ES細胞からの胚様体 （Embryoid body： EB) の形成は以下のようにして行つ た。 ES細胞を PBSで洗浄後、 0. 25%トリプシン— ImM EDTA処理及 びその停止を行い、 ピペッティングによって分散させた細胞を、 10%仔牛胎児 血清及び 0. 1 niM 2—メルカプトェタノールを含む a _ M E M培地で満たしたバ クテリア用培養皿中に 1 X 105 cellsZmLの濃度で播種し、 ノギン蛋白質 （ァ フリカツメガエル Nogginの全長 cDNAを COS 7細胞に導入し、 一過性に発現 させた培養上清） 存在下及び非存在下で 4〜8日間浮遊培養して EBを形成させ た。 (2) EBからの神経幹細胞の選択的培養による分離
上記のようにして形成された EBは培養液とともに遠心チューブに移し、 10 分間静置することによってチューブ底に集め上清を除去し PBS中に再懸濁し、 再び 10分間静置する。 上清を除去した後、 £ は0. 25%トリプシン一 lmM EDT A溶液中に再懸濁し 37 °Cで 5分間インキュベートし、 10 %仔牛胎児血 清を含むひ一 MEM培地で蛋白質分解反応を停止させた後、 ピぺットで細胞を分 散させた。 分散させた細胞は α— MEM培地にて遠心操作により 2回洗浄し、 グ ルコース （0. 6%) 、 グルタミン （2mM) 、 インスリン （25 gZmL) 、 ト ランスフェリン （l O O gZmL) 、 プロジェステロン （20nM) 、 プトレシン (60 M) 、 塩化セレン （30nM) 、 FGF— 2 ( 20 ng/mL) 、 へパリン ( 2 n g/mL) を添カロした Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) ： F 12 (1 : 1) 培地中 （神経幹細胞増殖培地） に、 あるいはそこへさらにマウ スソニックヘッジホッグ蛋白質 mouse sonic hedgehogl (5nM)を加えた培地に 5 X 104 cells/mLの濃度で播種し、 7〜 9日間浮遊培養することによって、 ニュ —ロスフェア （neurosphere) と呼ばれる単一細胞由来の細胞凝集塊を形成させ た （neurosphere法） 。 これらニューロスフェアは上記の神経幹細胞増殖培地よ り F G F _ 2とへパリンを除いた分化培地で遠心洗浄した後、 そのままあるいは ピペッティングにより分散させた細胞を、 分化培地で満たしたポリ— L一オル二 チン （poly-L- ornithin) でコートした培養皿に播種し、 ソニックヘッジホッグ 蛋白質 （5nM) 存在下あるいは非存在下で 5〜7日間培養することによって分化 させた。 また上記のようにして得たニューロスフェアを再び単一細胞に分散し、 神経幹細胞増殖培地で 7日間継代培養し 2次ニューロスフェアを形成させ、 これ らも上記と同様に分化させる。
(3) 免疫染色による分化ニューロン及びグリア細胞の同定
上記のようにして分化させたニューロンゃグリア細胞は蛍光抗体を使った免疫 染色の定法によって同定した。 運動ニューロンはマウス抗 I s 1—1モノクロ一 ナル抗体、 ャギ抗 ChATポリクロ一ナル抗体及びマウス抗 j3_III tubulinモ ノクロ一ナル抗体を使って、 GAB A作動性ニューロンはゥサギ抗 GAD 67ポ リクローナル抗体を使って同定した。 グリア細胞は、 ァストロサイトをゥサギ抗 GFAPポリクロ一ナル抗体で、 オリゴデンドロサイトをマウス抗 04モノクロ ーナル抗体を使って同定した。
B. 実験結果
(1) EBからの神経幹細胞の選択的培養法による分離精製
まず EBの形成による E S細胞の初期分化において、 神経幹細胞が培養のどの 時期に出現してくるのかを検討した。 具体的には、 培養 4〜8日の EBを単一細 胞に分散し、 神経幹細胞培地にて 7日間培養し、 ニューロスフェアを形成させ た。 これらニューロスフェアは分化培地に移し分化させ、 その分化能を検定する とともに、 継代することによって自己複製能も検定した。
図 1には、 浮遊培養による EBの形成開始後 6及び 8日後、 EBを単一細胞に 分散し、 神経幹細胞の選択的培養 （neurosphere法） を行った結果を示した。 な お得られたニューロスフェアの数は EB中に出現した神経幹細胞の数とした。 そ の結果、 本方法で同定される （ニューロスフェアを形成できる） 神経幹細胞は、 E Bの培養 4日目まではほとんど検出できず、 培養 6 日目で全細胞中 0. 25%、 8日目で 1. 1 %と次第に増加していくことが分かった。
図 1に示したように 6日目の EBから得たニューロスフェアを、 分化条件で 7 日間培養し、 その分化能を免疫染色によって検定した。 その結果を図 2〜4に示 す。 ニューロンのマーカ一である) 3— III_tubulinとグリア細胞のマーカ一であ る GFAP及び 04の抗体による 3重免疫染色を行ったところ、 全てのニューロ スフエアがほぼ i3 -III- tubul inを発現するニューロンのみで構成されており、 グリア細胞は検出されなかった （図 2) 。 そして、 それらのニューロンは少なく とも I s 1— 1及び ChATを発現する運動ニューロン （図 3の丸い部分及び繊 維状部分） と GAD 67を発現する GABA作動性ニューロン （図 4の繊維状部 分） を含んでいた。
また、 得られたニューロスフェアを、 継代培養することによって 2次ニューロ スフエアを得、 それらを分化条件で 7日間培養し、 分化能を免疫染色によって検 定した。 その結果、 全てのニューロスフェアはグリア細胞を含んでおり （図
5) 、 そのうち 84. 2%はニューロンとグリア細胞の両方を含んでいた （図
6) 。 図 5は、 3—III— tubulin (細く明確な繊維状） 、 GFAP (/3 -III- tubulinのまわりの部分） 及び 04 (GFAPのさらに外側の部分） の 3重免疫染色 結果である。
その結果、 これらの neurosphereを単一細胞に分散、 継代培養し新たなニュー ロスフェアを形成させ分化させると、 それらのクローンの多くはニューロンとグ リァ細胞の両方を含むようになり、 実際の中枢神経系の発生においてグリァ細胞 が後期に出現するように、 E Bから分離した神経幹細胞も継代培養によって多分 化能を示すようになることが分かった。
(2) ノギン蛋白質による神経幹細胞の分化誘導の効率化
ノギン蛋白質を EB形成時 （6日間） に添加することによって神経幹細胞の分 化誘導の効率化を試みた。 ノギンは、 アフリカッメガエルノギンの全長 cDNA を pEF— B〇S発現ベクターに組み込み COS 7細胞に導入し、 一過性に発現 させた培養上清をノギン溶液とし、 発現ベクターのみを導入した COS 7細胞の 培養上清を対照とした。 図 7に示すように、 ノギン培養上清の量に依存して EB 中で分化誘導されるニューロスフェアを形成する神経幹細胞の数は増加し、 1 10倍容でピークに達した。
( 3 ) ソニックヘッジホッグ蛋白質による運動ニューロン分化の効率化
E B由来神経幹細胞からの運動ニューロン産生及び分化の効率化をめざし、 ソ ニックへッジホッグ蛋白質を神経幹細胞増殖時、 すなわち E B由来の初代培養二 ユーロスフエアの形成時に添加し、 その効果を検討した。 運動ニューロンは、 二 ユーロスフエアを単一細胞に分散し、 分化培地で 5日間培養後、 I s 1— 1及び i3— I I I— tubul inの二重免疫染色を行うことによって同定し、 その数を定量化し た。 その結果図 8に示したように、 5 nMのソニックヘッジホッグによって運動二 ユーロンの産生は倍増した。 なお、 神経分化時に分化培地にソニックヘッジホッ グを加えてもその効果は認められなかつた。 産業上の利用可能性
本発明方法によれば E S細胞より少なくとも運動ニューロンと G A B A作動性 ニューロンがシステマチックかつ効率的に生産できることが分かつた。 選択的に ニューロンが得られれば筋萎縮性側索硬化症、 ハンチントン舞踏病、 そしてアル ッハイマー病などの移植治療に適用できる可能性がある。

Claims

請求の範囲
1 . 胚性幹細胞をノギン蛋白質存在下に浮遊培養することを特徴とする胚様体 の形成方法。
2 . 胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を 形成させ、 次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックへッジホッグ蛋白質の 存在下で浮遊培養することを特徴とする神経幹細胞の製造法。
3 . 胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を 形成させ、 これを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の存在下 で浮遊培養して神経幹細胞に誘導し、 次いでこれを分化させることを特徴とする 運動ニューロン及び G A B A作動性ニューロンの製造法。
4. 胚様体の形成が、 ノギン蛋白質の存在下に浮遊培養するものである請求項 3記載の製造法。
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