WO2002057464A2 - Verfahren zur expression von biosynthesegenen in pflanzlichen samen unter verwendung von multiplen expressionskonstrukten - Google Patents

Verfahren zur expression von biosynthesegenen in pflanzlichen samen unter verwendung von multiplen expressionskonstrukten Download PDF

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WO2002057464A2
WO2002057464A2 PCT/EP2002/000461 EP0200461W WO02057464A2 WO 2002057464 A2 WO2002057464 A2 WO 2002057464A2 EP 0200461 W EP0200461 W EP 0200461W WO 02057464 A2 WO02057464 A2 WO 02057464A2
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desaturase
gene
expression
nucleic acid
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Jens Lerchl
Elke Duwenig
Friedrich Bischoff
Ernst Heinz
Hjördis DREXLER
Jodi Scheffler
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Basf Plant Science Gmbh
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    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • the invention relates to expression cassettes, their combination and vectors containing the expression cassettes which contain plant promoters with an expression specificity for plant seeds, in particular linseed, and the use of these expression cassettes or vectors for the recombinant expression of heterologous genes in plants.
  • the invention further relates to transgenic plants transformed with these expression cassettes or vectors, cultures derived therefrom, parts or transgenic propagation material, and the use thereof as food, feed or seed, pharmaceuticals, fine chemicals or as an industrial base material.
  • the expression cassettes according to the invention are advantageously used in a process for the production of unsaturated fatty acids with at least two double bonds and / or a process for the production of triglycerides with an increased content of polyunsaturated fatty acids with at least two double bonds.
  • the nucleic acid sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or 11 are advantageously used in the method and are expressed using the expression cassettes.
  • These aforementioned nucleic acids are suitable in the process and for the production of a transgenic organism, preferably a transgenic plant or a transgenic microorganism with an increased content of fatty acids, oils or lipids with unsaturated Cig-, C o ⁇ / or C -fatty acids.
  • genes besides the nucleic acid sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 11 or its homologs, derivatives or analogs as well as gene constructs containing these genes or their homologs, derivatives or analogs, and their use alone or in combination with other biosynthetic genes preferably biosynthetic genes for polyunsaturated fatty acids, as advantageously shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9, are preferably expressed in organisms in plants.
  • a number of products and by-products of naturally occurring metabolic processes in microorganisms, animal and plant cells are useful for many industries, including the animal feed, food, cosmetic and pharmaceutical industries.
  • These molecules collectively referred to as "fine chemicals", include, for example Lipids and fatty acids, among which an exemplary class are the polyunsaturated fatty acids.
  • Fatty acids and triglycerides have a large number of applications in the food industry, animal nutrition, cosmetics and in the pharmaceutical sector. Depending on whether it is free saturated or unsaturated fatty acids or triglycerides with an increased content of saturated or unsaturated fatty acids, they are suitable for a wide variety of applications, for example polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are used to increase baby food Added nutritional value.
  • PUFAs also have a positive influence on the cholesterol level in the blood of humans and are therefore suitable for protection against heart diseases. So they are used in various dietary foods or medications.
  • microorganisms for the production of PUFAs are microorganisms such as Thraustochytria or Schizochytria strains, algae such as Phaeodactylum tricornutum or Crypthecodinium species, ciliates such as Stylonychia or Colpidium, fungi such as Mortierella, Entomophthora or Mucor.
  • strain selection a number of mutant strains of the corresponding microorganisms have been developed which produce a number of desirable compounds, including PUFAs.
  • the selection of strains with improved production of a particular molecule is a time-consuming and difficult process.
  • the production of fine chemicals can suitably be carried out on a large scale through the production of plants designed to produce the above-mentioned PUFAs.
  • Plants that are particularly suitable for this purpose are oil-fruit plants which contain large amounts of lipid compounds, such as rapeseed, canola, linseed, soya, sunflowers, borage and evening primrose.
  • lipid compounds such as rapeseed, canola, linseed, soya, sunflowers, borage and evening primrose.
  • other crop plants containing oils or lipids and fatty acids are also well suited, as mentioned in the detailed description of this invention.
  • Using conventional breeding a number of mutant plants have been developed that produce a spectrum of desirable lipids and fatty acids, cofactors and enzymes.
  • yeasts nor plants naturally produce polyunsaturated C 2 o ⁇ and / or C 22 fatty acids with at least two double bonds in the fatty acid molecule such as arachidonic acid (ERA) and / or eicosapentaenoic acid (EPA) and / or docosahexaenoic acid (DHA) ,
  • ERA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the aim is to produce plants with advantageous novel properties, for example for increasing agricultural productivity, 'improving quality of human foods or for producing specific chemicals or pharmaceuticals (Dunwell JM, J. Exp Bot, 2000:.. 51 Spec No: 487 -96).
  • a basic requirement for the transgenic expression of certain genes is the provision of plant-specific promoters. Promoters are important tools in plant biotechnology in order to control the expression of a specific gene in a transgenic plant locally and in time and thus to exploit or achieve certain essential characteristics of the plant. Various promoters for various types of plants, certain plant tissues and stages of development are known.
  • constitutive promoters such as the promoter of nopaline synthase from Agrobacterium, the TR double promoter or the promoter of the 35S transcript of the cauliflower mosaic virus (CaMV) (Odell et al., Nature 1985: 313,810-812), the OCS (octopine Synthase) promoter from Agrobacterium, the Ubiguitin promoter (Holtorf S et al., Plant Mol. Biol.
  • Promoters whose activity is regulated in a tissue-specific or development-dependent manner were isolated. Specificities are described for the anthers, ovaries, flowers, leaves, stems, roots and seeds. The stringency of the specificity as well as the expression activity of these promoters is very different. Promoters that ensure leaf-specific expression should be mentioned, such as the promoter of the cytosolic FBPase from potato (WO 97/05900), the SSU promoter (small subunit) of the rubi sco (ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase) or the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245).
  • promoters are, for example, specific promoters for tubers, storage roots or roots, such as, for example, the class I patatin promoter (B33), the potato cathepsin D inhibitor promoter, the starch synthase starch (GBSS1) or the sporamine promoter, fruit-specific Promoters like
  • fruit-specific promoter from tomato EP-A 409625
  • fruit-ripening-specific promoters such as for example the fruit-ripening-specific promoter from tomato
  • flower-specific promoters such as the phytoene-synthetic promoter (WO 92/16635) or the promoter of the P-rr gene (WO
  • Promoters are known which control expression in seeds and plant embryos. For example, the promoters of genes that code for storage proteins of different dicotyledons were identified. Seed-specific promoters are, for example, the promoter of phaseoline (US 5504200, Bustos
  • sucrose binding protein WO 00/26388
  • LeB4 promoter Bacillus subtilis
  • Gene expression in other parts of the plant can restrict the use of a promoter in another plant species. For example, if the expression of the gene interferes with the metabolism of the cell, the composition of the membrane lipids or biosynthesis.
  • the task was therefore to provide further expression cassettes for expression in plants. And to use these biosynthesis genes, which are advantageous for the expression of genes, alone or, if appropriate, in combination with other enzymes in a process, for example for the production of polyunsaturated fatty acids.
  • This object was achieved by the expression cassette according to the invention with a structure selected from the group:
  • Ll, L2, promoter and structural gene has the following meaning:
  • Ll SEQ ID NO: 32 or a sequence containing equivalent restriction cleavage sites
  • L2 independently of one another SEQ ID NO: 33, 34 or 35 or sequences containing equivalent restriction sites
  • Structural gene a nucleic acid sequence that can be expressed in plants.
  • the structural gene is advantageously a biosynthetic gene, more preferably it is a biosynthetic gene of the lipid or fatty acid metabolism, advantageously a vegetable gene.
  • the structural gene is a nucleic acid sequence, those selected for proteins from the group:
  • the structural gene is very particularly preferably a nucleic acid sequence selected from the group:
  • nucleic acid sequences which are obtained on the basis of the degenerate genetic code by back-translation of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 12,
  • restriction restriction sites are to be understood as sequences which contain restriction sites which are suitable for the construction of multiple expression cassettes, that is to say are suitably not present in the structural gene or in the binary vector.
  • Restriction interfaces such as, for example, EcoRI, BamHI, Sacl, PstI, Ncol, Ndel, Bgll, Bglll, Xhol, Xba and others are known to the person skilled in the art and can be found in relevant specialist books.
  • the expression cassettes according to the invention can be used for the expression of genes in economically important crop plants such as linseed, for which no endogenous seed-specific promoters were known.
  • flax is particularly problematic for a seed-specific expression of genes, since obviously several promoters which are routinely used by the expert for seed-specific expression in other plants do not function in, for example, other plants such as flax, that is to say not one Transcription or ultimately leads to expression of the mRNA of the structural gene.
  • nucleic acid sequences which are obtained on the basis of the degenerate genetic code by back-translation of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 12,
  • nucleic acid sequences used in the method are isolated nucleic acid sequences which code for polypeptides with ⁇ -5, ⁇ -6 or ⁇ -12 desaturase activity.
  • fatty acid esters with polyunsaturated cis, C 2 o ⁇ and / or C 2 fatty acid molecules with at least two double bonds in the fatty acid ester are advantageously produced.
  • These fatty acid molecules preferably contain three, four or five double bonds and advantageously lead to the synthesis of arachidonic acid (ERA), eicosapentaenoic acid (EPA) or docosahexaenoic acid (DHA).
  • ERA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the fatty acid esters with polyunsaturated C 20 and / or C 22 fatty acid molecules can be obtained from the organisms used for the production of the fatty acid esters in the form of an oil or lipid, for example in the form of compounds such as sphingolipids, phosphoglycerides , Lipids, glycolipids, phospholipids, Monoacylglycerides, diacylglycerides, triacylglycerides or other fatty acid esters containing the polyunsaturated fatty acids with at least two double bonds are isolated.
  • prokaryotic or eurkaryotic organisms such as prokaryotic or eurkaryotic microorganisms such as gram-positive or gram-negative bacteria, fungi, yeasts, algae, ciliates, animal or plant cells, animals or plants come as organisms for production in the process Moss, dicotyledonous or monocotyledonous plants in question.
  • Organisms belonging to the oil-producing organisms that is to say used for the production of oils, such as microorganisms such as Crypthecodinium, Thraustochytrium, Phaeodactylum and Mortierella, Ento ophthora, Mucor, Crypthecodinium and other algae, are advantageously used in the process according to the invention or mushrooms as well as animals or plants, in particular plants, preferably oil fruit plants which contain large amounts of lipid compounds, such as soybean, peanut, rapeseed, canola, sunflower, safflower, evening primrose, linseed, soya, borage, trees (oil palm, coconut) or field crops , such as corn, wheat, rye, oats, triticale, rice, barley, cotton, cassava, pepper, tagetes, solanaceae plants, such as potato, tobacco, eggplant and tomato, types of Vicia, peas, alfalfa or bush plants (coffee , Cocoa, tea),
  • the method includes either the cultivation of a suitable transgenic organism or transgenic microorganism or the cultivation of transgenic plant cells, tissues, organs or whole plants, comprising the nucleotide sequences according to the invention of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 optionally in Compounds with the sequences shown in SEQ ID NO: 7 and / or SEQ ID NO: 9, alone or in combination with sequences from advantageous expression cassettes according to the invention in advantageous vectors with SEQ ID NO: 13-17, or their homologs, derivatives or analogs or a gene construct which comprises SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11, optionally in conjunction with SEQ ID NO: 7 and / or 9 or their homologues, derivatives or analogs, or a vector which comprises this sequence or the gene construct which brings about the expression of nucleic acid molecules according to the invention, so that a fine chemical is produced.
  • the method further comprises the step of obtaining a cell which contains such a nucleic acid sequence according to the invention. contains zen, wherein a cell is transformed with a desaturase nucleic acid sequence, a gene construct or a vector which bring about the expression of a desaturase nucleic acid according to the invention alone or in combination.
  • this method further comprises the step of extracting the fine chemical from the culture.
  • the cell belongs to the order of the ciliates, to microorganisms, such as fungi, or to the plant kingdom, in particular to oil fruit plants, particularly preferred are microorganisms or oil fruit plants, for example peanut, rapeseed, canola, flax, soy, safflower (thistle), sunflowers or borage.
  • microorganisms or oil fruit plants for example peanut, rapeseed, canola, flax, soy, safflower (thistle), sunflowers or borage.
  • Transgenic in the sense of the invention means that the nucleic acids used in the method or the expression cassettes according to the invention are not in their natural position in the genome of an organism, and the nucleic acids can be expressed homologously or heterologously.
  • transgene also means that the nucleic acids or expression cassettes are in their natural positions in the genome of an organism, but that the sequence has been changed compared to the natural sequence and / or that the regulatory sequences, the natural sequences, have been changed.
  • Transgenic is preferably to be understood as meaning the expression of the nucleic acids according to the invention at a non-natural location in the genome, that is to say that the nucleic acids are homologous or preferably heterologous.
  • Preferred transgenic organisms are the abovementioned transgenic plants, preferably oil fruit plants.
  • the polyunsaturated fatty acids containing can be released, for example via an alkali treatment, such as aqueous KOH or NaOH, advantageously in the presence of an alcohol, such as methanol or ethanol, and isolated via, for example, phase separation and subsequent acidification using, for example, H 2 SO 4 .
  • an alkali treatment such as aqueous KOH or NaOH
  • an alcohol such as methanol or ethanol
  • the fatty acid esters produced in the process are obtained in the form of oils, lipids and / or fatty acids which contain at least two double bonds in the fatty acid molecules, preferably three, four, five or six double bonds.
  • Compositions which contain the oleic, lipid and / or fatty acids mentioned, and the use of the oils, lipids and / or fatty acids or the compositions in feed, foods, cosmetics or pharmaceuticals are a further possible application of the abovementioned substances.
  • Another aspect relates to a method for modulating the production of a molecule by a microorganism.
  • These methods include contacting the cell with a substance which modulates the desaturase activity according to the invention alone or in combination or the desaturase nucleic acid expression so that a cell-associated activity is changed relative to the same activity in the absence of the substance.
  • a substance which modulates the desaturase activity can be a substance that stimulates desaturase activity or desaturase nucleic acid expression or that can be used as an intermediate in fatty acid biosynthesis.
  • substances which stimulate desaturase activity or desaturase nucleic acid expression include small molecules, active desaturases and desaturase-coding nucleic acids which have been introduced into the cell.
  • substances that inhibit desaturase activity or expression include small molecules and antisense desaturase nucleic acid molecules.
  • Another aspect relates to a method for modulating the
  • Yielding a desired compound from a cell comprising introducing into a cell a wild-type or mutant desaturase gene that is either maintained on a separate plasmid or integrated into the genome of the host cell.
  • the integration can be random or by recombination such that the native gene is replaced by the inserted copy, thereby modulating the production of the desired compound by the cell, or by using a gene in trans so that the The gene is functionally linked to a functional expression unit which contains at least one sequence which ensures the expression of a gene and at least one sequence which ensures the polyadenylation of a functionally transcribed gene.
  • the yields are modified.
  • the desired chemical is increased, and undesirable interfering compounds can be reduced.
  • the desired fine chemical is a lipid or a fatty acid, a cofactor or an enzyme.
  • this chemical is a polyunsaturated fatty acid. Before In addition, it is selected from arachidonic acid (ERA), eicosapentaenoic acid (EPA) or docosahexaenoic acid (DHA).
  • the present invention provides advantageous multi-expression cassettes and constructs for multiparallel seed-specific expression of gene combinations in plants.
  • genes preferably those described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 .
  • preferred organisms are used for the process.
  • the process can be used in conjunction with the nucleic acid molecules mentioned above for the genetic engineering of plants, so that they ultimately lead to the production of better or more efficient producers of one or more fine chemicals.
  • This improved production or efficiency of the production of a fine chemical can be brought about by a direct effect of the manipulation of a gene according to the invention or by an indirect effect of this manipulation.
  • fine chemicals include, for example, fatty acid esters which contain polyunsaturated fatty acids with at least two double bonds, such as sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, glycolipids, phospholipids, monoacylglycerides, diacylglycerides, triacylglycerides or other fatty acid esters which contain the polyunsaturated fatty acids with at least contain two double bonds.
  • This also includes compounds such as vitamins, for example vitamin E, vitamin C, vitamin B2, vitamin B6, pantolactone, carotenoids such as astaxanthin, ⁇ -carotene, zeaxanthin and others.
  • Mosses and algae are the only known plant systems that produce significant amounts of polyunsaturated fatty acids such as arachidonic acid (ERA) and / or eicosapentaenoic acid (EPA) and / or docosahexaenoic acid (DHA).
  • ERA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • Mosses contain PUFAs in membrane lipids while algae, algae-related organisms and some fungi also accumulate significant amounts of PUFAs in the triacylglycerol fraction. Therefore nucleic acid molecules which are isolated from those strains which also accumulate PUFAs in the triacylglycerol fraction are particularly advantageous for modifying the lipid and PUFA production system in a host, in particular in microorganisms, such as the microorganisms mentioned above, and plants. like oil crops, for example rapeseed, canola, flax, soybeans, sunflower
  • nucleic acid sequences used in the process using the expression cassettes according to the invention code for desaturases which are suitable for the production of long-chain polyunsaturated fatty acids, preferably with more than sixteen, eighteen or twenty carbon atoms in the carbon skeleton of the fatty acid and / or at least two double bonds in the carbon chain , wherein a nucleic acid codes for an enzyme which can introduce double bonds in the ⁇ -5 position, in another case in the ⁇ -6 position and in a further case in the ⁇ -12 position.
  • These nucleic acids can be used to obtain large amounts of PUFAs in the triacylgycerol fraction.
  • the polyunsaturated cis fatty acids must first be extended by at least two carbon atoms by the enzymatic activity of an elongase. After one round of elongation this enzyme activity leads to C 2 o fatty acids, and after two, three and four rounds of elongation leads to C, C or C 26 fatty acids.
  • the nucleic acid sequences disclosed in this invention which code for various desaturases, can lead to very long-chain, polyunsaturated in concert with elongases.
  • the activity of the desaturases according to the invention preferably leads to cis, C 0 and / or C fatty acids with at least two double bonds in the fatty acid molecule, preferably with three, four, five or six double bonds, particularly preferably to cis and / or C 0 fat acids with at least two double bonds in the fatty acid molecule, preferably with three, four or five double bonds in the molecule.
  • the fatty acid elongation can be carried out by combining the desaturases according to the invention with an elongase activity, the elongase encoded in SEQ ID NO: 9 advantageously being used can be.
  • the products of the desaturase activities and the possible further desaturation lead to preferred PUFAs with a higher degree of desaturation, such as dihomo-gamma-lonolenic acid, docosadienoic acid, arachidonic acid, ⁇ 6-eicosatrienedihomo- ⁇ -linolenic acid, eicosapentaenoic acid, ü) 3-eicosatrienoic acid, ö) 3-eicosatetraenic acid, docosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid.
  • substrates of the enzyme activity according to the invention are taxolic acid;
  • 6, 9-0ctadecadienoic acid linoleic acid, pinolenic acid, ⁇ - or ⁇ -linolenic acid or stearidonic acid as well as arachidonic acid, eicosatetraenoic acid, docosapentaenoic acid, eicosapentaenoic acid.
  • Preferred substrates are linoleic acid, ⁇ -linolenic acid and / or ⁇ -linolenic acid and arachidonic acid, eicosatetraenoic acid, docosapentaenoic acid, eicosapentaenoic acid.
  • Ci 8 ⁇ fatty acids with at least two double bonds in the fatty acid can be extended by the inventive enzymatic activity in the form of the free fatty acid or in the form of the esters such as phospholipids, glycolipids, sphingolipids, phosphoglycerides, monoacylglycerides, diacylglycerides or triacylglycerides ,
  • Conjugated linoleic acid "CLA” is of particular importance for human nutrition.
  • the desaturases according to the invention ⁇ -12-desaturase
  • conjugated fatty acids with at least two double bonds in the molecule can also be desaturated and such health-promoting fatty acids can thus be supplied to human nutrition.
  • Another example of conjugated fatty acids are alpha-parinic acid, punicic acid, eleostearic acid and calendulic acid.
  • genes can advantageously use biosynthetic genes such as the nucleic acids described above for the genetic engineering modification of a broad spectrum of plants, so that they are a better or more efficient producer, for example of one or more products derived from lipids, like PUFAs.
  • This improved production or efficiency of the production of a product derived, for example, from lipids, such as PUFAs can be brought about by a direct effect of the manipulation or an indirect effect of this manipulation.
  • a desaturase gene or several desaturase genes under control of the expression cassettes according to the invention into an organism alone or in combination with other genes in a cell, not only can the flow of biosynthesis to the end product be increased, but also the corresponding composition of the products, for example the triacylglycerols, can be increased or de novo can be created.
  • the number or activity of other genes required for the import of nutrients required for the biosynthesis of one or more fine chemicals eg fatty acids, polar and neutral lipids
  • concentration of these precursors, cofactors or intermediate compounds within cells or within the storage compartment is increased, which further increases the ability of the cells to produce PUFAs, as described below.
  • Fatty acids and lipids are desirable even as fine chemicals; by optimizing the activity or increasing the number of one or more desaturases involved in the biosynthesis of these compounds, or by destroying the activity of one or more desaturases involved in the degradation of these compounds, the yield, production and / or to increase the efficiency of the production of fatty acid and lipid molecules from plants or microorganisms.
  • the mutagenesis of the desaturase gene (s) according to the invention can furthermore lead to a desaturase protein with modified activities which directly or indirectly influence the production of one or more desired fine chemicals.
  • the number or activity of the desaturase gene (s) according to the invention can be increased so that the normal metabolic waste or by-products of the cell (the amount of which may be increased due to the overproduction of the desired fine chemical) can be efficiently exported before it uses other molecules or destroy processes within the cell (which would lower the cell's viability) or disrupt the fine chemical's biosynthetic pathways (thereby reducing the yield, production, or efficiency of production of the desired fine chemical).
  • the relatively large intracellular amounts of the desired fine chemical can itself be toxic to the cell or interfere with enzyme feedback mechanisms such as allosteric regulation, for example by increasing the activity or number of other downstream enzymes or detoxification enzymes of the PUFA pathway Allocate PUFA allocation to the triacylgylcerin fraction, one could increase the viability of seed cells, which in turn leads to better development of cells in culture or to seeds that produce the desired fine chemical.
  • the desaturase gene according to the invention can also be manipulated in such a way that the corresponding amounts of the different lipid and fatty acid molecules are produced. This can have a drastic effect on the lipid composition of the cell membrane and generates new oils in addition to the occurrence of newly synthesized PUFAs.
  • isolated nucleic acid molecules eg cDNAs
  • 5 comprising nucleotides, which encode a desaturase or several desaturases or biologically active parts thereof, or nucleic acid fragments, which act as primers or hybridization probes for the detection or amplification of desaturase-encoding nucleic acids (eg DNA or mRNA) are used.
  • the nucleic acid molecule comprises one of the nucleotide sequences shown in sequence ID N0: 1 or 3 and 5 or the coding region or a complement of one of these nucleotide sequences.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises
  • nucleotide sequence which hybridizes to a nucleotide sequence as shown in the sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 or a part thereof or at least about 50%, preferably at least about 60%, more preferably at least about 70% , 80% or 90% and even more preferably at least about 95%,
  • the isolated nucleic acid molecule encodes one of the amino acid sequences shown in the sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12.
  • the preferred desaturase gene preferably also has at least one of those described here
  • the isolated nucleic acid molecule encodes a protein or a part thereof, the protein or the part thereof containing an amino acid sequence
  • the protein or part thereof maintains desaturase activity.
  • the protein or part thereof encoded by the nucleic acid molecule retains the ability to metabolize to build
  • the protein encoded by the nucleic acid molecule is at least about 50%, preferably at least about 60%, and more preferably at least about 70%, 80% or
  • Protein is a full-length protein that is essentially partially homologous to an entire amino acid sequence of sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12.
  • this is Protein is a full-length protein that is essentially partially homologous to an entire amino acid sequence of sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12.
  • the isolated desaturase comprises an amino acid sequence which is at least about 50% homologous to one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12 and in the metabolism of compounds necessary for the formation of fatty acids in a microorganism or a plant cell or can participate in the transport of molecules across these membranes, meaning desatured Ci 8 ⁇ or C 2 o- 22 carbon chains with double bonds at at least two sites.
  • the isolated nucleic acid molecule is derived from Phaeodactylum tricornutum UTEX646 and encodes a protein (eg a desaturase fusion protein) which contains a biologically active domain which is at least about 50% or more homologous to an amino acid sequence of the sequence SEQ ID NO 2, 4, 6 or 12 and maintains the ability to participate in the metabolism of compounds necessary for building cell membranes of plants or in the transport of molecules across these membranes, or at least one of the desaturation activities resulting in PUFAs such as GLA, ALA, Dihomo -gamma linolenic acid, ERA, EPA or DHA or their precursor molecules, and also includes heterologous nucleic acid sequences that encode a heterologous polypeptide or regulatory proteins.
  • PUFAs such as GLA, ALA, Dihomo -gamma linolenic acid, ERA, EPA or DHA or their precursor molecules
  • the isolated desaturase may comprise an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11, e.g. hybridizes under stringent conditions, or at least about 50%, preferably at least about 60%, more preferably at least about 70%, 80% or 90% and even more preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more homologous to it. It is also preferred that the preferred desaturase forms also have one of the desaturase activities described here.
  • the isolated nucleic acid molecule is at least 15, 25, 50, 100, 250 or more nucleotides long and hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule which comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 17.
  • the isolated nucleic acid molecule preferably corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule. More preferably, the isolated nucleic acid molecule encodes naturally occurring Phaeodactylum desaturase or a biologically active part thereof.
  • Another embodiment of the invention are expression cassettes which enable the expression of the nucleic acids according to the invention with the sequences SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 in the various organisms such as plant cells, tissues, parts of plants or whole plants.
  • nucleic acid construct or fragment are those in SEQ ID NO: 32 as L1 and a promoter, a structural gene selected from the advantageous sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or
  • These regulatory sequences contained in the constructs are intended to enable the targeted expression of the genes and the protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed and / or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased.
  • the gene construct can also have a simpler structure, that is to say no additional regulation signals have been inserted in front of the nucleic acid sequence or its derivatives, and the natural promoter with its regulation has not been removed. Instead, the natural regulatory sequence was mutated so that regulation no longer takes place and / or gene expression is increased.
  • the gene construct can also advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • vectors e.g. recombinant expression vectors which contain at least one of the expression cassettes according to the invention, and host cells into which the expression cassettes according to the invention or these vectors have been introduced, in particular microorganisms, plant cells, plant tissue or plant organs or whole plants.
  • a host cell can store fine chemical compounds, in particular PUFAs; the cells are harvested to isolate the desired compound.
  • the compound (oils, lipids, triacylglycerides, fatty acids) or the desaturase can then, from the medium or the host cell, which are cells in plants which contain or store fine chemicals, most preferably cells of storage tissues such as seed shells, tubers, epidermis and Sperm cells, endosperm or embyro tissue can be isolated.
  • Yet another aspect of the invention relates to a genetically modified transgenic plant, preferably an oil crop, as mentioned above, particularly preferably a rape or linseed plant, into which an expression cassette according to the invention, which advantageously contains further genes such as desaturase genes, has been introduced.
  • the genome of oilseed rape or linseed has advantageously been changed as a transgene by introducing an expression cassette according to the invention which advantageously contains further nucleic acid molecules which, for example, encodes a wild-type or mutated desaturase sequence.
  • rapeseed or linseed is also used to produce a desired compound, such as lipids and fatty acids, with PUFAs being particularly preferred.
  • the moss Physcomitrella patens can be used to demonstrate the function of an expression cassette with a desaturase curse homologous recombination based on the nucleic acids described in this invention.
  • the desaturase polypeptide or a biologically active part thereof can advantageously be linked to another polypeptide which has a different enzymatic activity than the desaturases, for example an elongase, acyltransferase or other activity, under the control of the expression cassette according to the invention, so that a fusion protein is formed.
  • This fusion protein advantageously has an activity that differs from that of desaturase alone.
  • this fusion protein participates in the metabolism of compounds which are necessary for the synthesis of lipids and fatty acids, cofactors and enzymes in microorganisms or plants, or in the transport of molecules across these membranes.
  • this fusion protein in a host cell particularly advantageously modulates the production of a desired compound within and by the cell.
  • these fusion proteins also contain ⁇ -4, ⁇ -5 or ⁇ -6, ⁇ -8, ⁇ -15, ⁇ -17 or ⁇ -19 desaturase activities alone or in combination.
  • Such gene combinations in particular are preferred embodiments which are selected from SEQ ID NO: 7 or 9, or parts thereof, derivatives or their homologues.
  • those combinations are preferred which contain the complete protein activity as in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 and are inserted in multi-expression cassettes as defined by SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 and 17 for the transformation of plants and expression in Plants are suitable.
  • An object of the invention are also the expression cassettes in connection with isolated nucleic acid sequence (s) which codes for a polypeptide with desaturase activity, selected from the group:
  • nucleic acid sequences which are obtained on the basis of the degenerate genetic code by back-translation of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 12, c) Derivatives of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11, which are suitable for polypeptides with the sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ Encode ID NO: 6 or SEQ ID NO: 12 and have at least 50% homology at the amino acid level without significantly reducing the enzymatic action of the polypeptides.
  • the invention relates to an amino acid sequence which is encoded by the above-mentioned nucleic acid sequence (s) (for the invention, the singular is intended to include the plural and vice versa).
  • the invention relates to amino acid sequences which are encoded by the sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11.
  • the present invention provides expression cassettes which are suitable for the expression of nucleic acids and protein molecules with desaturase activity and of nucleic acids coding for proteins which are involved in the metabolism of lipids and fatty acids, PUFA cofactors and enzymes in the moss Physcomitrella patens or in the transport of lipophilic compounds are involved over membranes.
  • the compounds according to the invention can be used to modulate the production of fine chemicals from organisms such as plants, such as maize, wheat, rye, oats, triticale, rice, barley, soybean, peanut, cotton, linum species such as oil or fiber flax, Brassica species , such as rapeseed, canola and turnip, pepper, sunflower, borage, evening primrose and tagetes, solanacaen plants, such as potato, tobacco, eggplant and tomato, Vicia species, peas, cassava, alfalfa, bush plants (coffee, cocoa, tea ), Salix species, trees (oil palm, coconut) and perennial grasses and fodder crops, either directly (eg if the overexpression or optimization of a fatty acid biosynthesis protein has a direct influence on the yield, production and / or efficiency of the production of the fatty acid modified organisms) use or may have an indirect effect, which nevertheless leads to an increase in the yield, production and / or efficiency of production of a desired ver
  • Fine chemicals and PUFAs The term "fine chemical” is known in the art and encompasses molecules that have been produced by an organism and find applications in various industries, such as, but not limited to, the pharmaceutical, agricultural, food, and cosmetic industries. These compounds include lipids, fatty acids, cofactors and enzymes, etc. (as described, for example, in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology Vol. 6, Reh et al., Eds. , VCH: Weinheim and the literature references contained therein), lipids, saturated and unsaturated fatty acids (eg arachidonic acid), vitamins and cofactors (as described in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol.
  • PUFAs are not only simply incorporated into triacylglycerol, but also into membrane lipids.
  • Precursors for PUFA biosynthesis are, for example, oleic acid, linoleic and linolenic acid. These cis-carbon fatty acids must be extended to C 20 and C 2 in order to obtain fatty acids of the Eicosa and Docosa chain type.
  • Arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid as well as various others can be used with the aid of various desaturases, such as enzymes which have ⁇ -12-desaturase, ⁇ -15-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -5 and ⁇ -4-desaturase activity
  • desaturases such as enzymes which have ⁇ -12-desaturase, ⁇ -15-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -5 and ⁇ -4-desaturase activity
  • Long-chain PUFAs are obtained, extracted and used for various purposes in food, feed, cosmetic or pharmaceutical applications.
  • the polyunsaturated Ci 8 ⁇ or C 20 fatty acids have to be desaturated several times.
  • the nucleic acid sequences according to the invention encode first functionally active desaturases from Phyeodactylum tricornutum, a microorganism which contains PUFAs in the triacyl contains glycerol fraction. With the desaturases according to the invention, double bonds can be introduced into the ⁇ -5, ⁇ -6 or ⁇ -12 position.
  • the activities of the desaturases according to the invention preferably lead to Cis + C 0 fatty acids with at least two, three, four or five double bonds in the fatty acid molecule, preferably to C 2 o fatty acids with advantageously three, four or five double bonds in the fatty acid molecule.
  • Desaturation can take place before or after elongation of the corresponding fatty acid.
  • fatty acids such as linoleic acid, docosadienic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, ⁇ -eicostriendihomo- ⁇ -linolenic acid, eicosapentaen
  • Substrates of this enzyme activity according to the invention are, for example, taxolic acid, 6, 9-0ctadecadienoic acid, oleic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, pinolenic acid, ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid or stearidonic acid.
  • Preferred substrates are linoleic acid, ⁇ -linolenic acid and / or ⁇ -linolenic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid or arachidonic acid, eicosatetraenoic acid or eicosapentaenoic acid.
  • the cis or C 0 fatty acids with at least two double bonds in the fatty acid can by the enzyme activity according to the invention in the form of the free fatty acid or in the form of the esters, such as phospholipids, glycolipids, sphingolipids, phosphoglycerides, monoacylglycerides, diacylglycerides, triacylglycerides or other esters , be extended. Furthermore, fatty acids then have to be transported to different modification sites and incorporated into the triacylglycerol storage lipid. Another important step in lipid synthesis is the transfer of fatty acids to the polar head groups, for example by glycerol fatty acid acyltransferase (see Frentzen, 1998, Lipid, 100 (4-5): 161-166).
  • Vitamins, cofactors and nutraceuticals such as PUFAs comprise a group of molecules that higher animals can no longer synthesize and therefore have to ingest or which higher animals can no longer produce themselves and therefore additionally
  • the present invention is based, among other things, on the discovery of new molecules, referred to herein as desaturase nucleic acid and protein molecules, which have an effect on exert the production of cell membranes and lipids Phaeodactylum tricornutum and, for example, influence the movement of molecules across these membranes.
  • the desaturase molecules participate in the metabolism of compounds necessary for the construction of cell membranes in organisms, such as microorganisms and plants, or indirectly influence the transport of molecules across these membranes.
  • the activity of the desaturase molecules according to the invention for regulating the production of membrane components and membrane transport has an effect on the production of the desired fine chemical by this organism.
  • the activity of the desaturase molecules according to the invention is modulated, so that the yield, production and / or efficiency of the production of the metabolic pathways of microorganisms or plants which regulate the desaturases according to the invention are modulated and the efficiency of the transport of compounds through the membranes is changed, which directly or indirectly modulates the yield, production and / or efficiency of the production of a desired fine chemical by microorganisms and plants.
  • the term "desaturase” or “desaturase polypeptide” includes proteins that participate in the desaturation of fatty acids. Examples of desaturases are disclosed in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11 or their homologues, derivatives or analogs.
  • the terms desaturase or desaturase nucleic acid sequence (s) encompass nucleic acid sequences which encode a desaturase and in which a part can be a coding region and likewise corresponding 5 'and 3' untranslated sequence regions. Examples of desaturase genes are those shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11.
  • production or productivity are known in the art and include the concentration of the fermentation product (for example the desired fine chemical) that is formed in a certain time period and a certain fermentation volume (for example kg product per hour per liter).
  • concentration of the fermentation product for example the desired fine chemical
  • production efficiency encompasses the time it takes to achieve a certain production volume (eg how long it takes the cell to set up a certain throughput rate of a fine chemical).
  • yield or product / carbon yield is known in the art and encompasses the efficiency of converting the carbon source into the product (ie the fine chemical). This is usually expressed, for example, as kg of product per kg of carbon source.
  • biosynthesis or biosynthetic pathway are known in the art and encompass the synthesis of a compound, preferably an organic compound, by a cell from intermediate compounds, for example in a multi-step and highly regulated process.
  • degradation or degradation pathway are known in the art and include the cleavage of a compound, preferably an organic compound, by a cell into degradation products (more generally, smaller or less complex molecules), for example in a multi-step and highly regulated process.
  • metabolism is known in the specialist field and encompasses all of the biochemical reactions that take place in an organism. The metabolism of a particular compound (eg the metabolism of a fatty acid) then encompasses all of the biosynthetic, modification and degradation pathways of this compound in the cell that relate to this compound.
  • the nucleic acid sequences according to the invention which code for desaturase molecules, can modulate the production of a desired molecule, such as a fine chemical, in a microorganism or in plants.
  • a desired molecule such as a fine chemical
  • the number or activity of desaturases involved in the transport of fine chemical molecules inside or out of the cell can be increased so that larger amounts of these compounds are transported across membranes from which they are more easily obtained and converted into one another.
  • fatty acids, triacylglycerols and / or lipids are themselves desirable fine chemicals; by optimizing the activity or increasing the number of one or more desaturases according to the invention which are involved in the biosynthesis of these compounds, or by disrupting the activity of one or more desaturases which are involved in the degradation of these compounds, it may be possible to increase the yield, production and / or to increase the efficiency of the production of fatty acid and lipid molecules from organisms, such as microorganisms or plants.
  • the mutagenesis of the nucleic acid sequences mentioned can produce desaturases with altered activities which indirectly influence the production of one or more desired fine chemicals from microorganisms or plants.
  • desaturases involved in the export of waste products have a higher number or higher activity so that the cell's normal metabolic waste (the amount of which may be increased due to the overproduction of the desired fine chemical) can be efficiently exported before it can damage the molecules in the cell (reducing the cell's viability) would) or disrupt the fine chemical biosynthetic pathways (which would decrease the yield, production, or efficiency in producing a desired fine chemical).
  • the relatively large intracellular amounts of the desired fine chemical itself can also be toxic to the cell, so increasing the activity or number of transporters that can export these compounds from the cell can increase cell viability in culture, which in turn leads to a larger number of cells in the culture which produce the desired fine chemical.
  • the desaturases can also be manipulated in such a way that the corresponding amounts of different lipid and fatty acid molecules are produced. This can have a significant impact on the lipid composition of the cell membrane. Since each type of lipid has different physical properties, changing the lipid composition of a membrane can significantly change the membrane fluidity.
  • Plant membranes impart specific properties, such as tolerance to heat, cold, salt, dryness, and tolerance to pathogens, such as bacteria and fungi.
  • the isolated nucleic acid sequences mentioned are contained in the genome of a Phaeodactylum tricornutum UTEX646 strain, which is available from the algae collection of the University of Texas, Austin.
  • nucleotide sequence of the Phaeodactylum tricornutum cDNA and the derived amino acid sequences of the desaturases are shown in SEQ ID NO: 1 to 6 and 11 and 12.
  • Computer analyzes were carried out which classify and / or identify these nucleotide sequences as sequences which encode proteins involved in the metabolism of cell membrane components or proteins involved in the transport of compounds across cell membranes or PUFA biosynthesis.
  • ESTs with the database entry NO: PT001070010R and PT001078032R by the inventors represent the sequences according to the invention in SEQ ID NO: 1 and 3.
  • the sequence of the fragment from EST PT001070010R was determined and is as shown in SEQ ID NO: 5.
  • the analog is the Sequence of the clone PT001078032R shown in SEQ ID NO: 1.
  • PT001070010R from SEQ ID NO: 5 codes for a new gene homologous to ⁇ -12-desaturase and PT001078032R codes for a novel ⁇ -5-desaturase.
  • Pt_des6 can be isolated according to Example 5a by means of a polymerase chain reaction with the aid of degenerate oligonucleotides.
  • a fragment thus obtained can be isolated from Phaeodactylum tricornutum for screening a cDNA library and the coding region of a Phaeodactylum tricornutum ⁇ -6-desaturase can be obtained.
  • a gene isolated in this way is referred to in Table 1 as Pt_des6 and is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the corresponding amino acid sequences are obtained by translating the genetic code of the sequence ID NO: 1, 3 and 5 and are defined as SEQ ID NO: 2, 4 and 6 (see also Table 1).
  • a further nucleic acid sequence which codes for a ⁇ -12 desaturase can also be found in Table 1. It has the clone number PT001072031R.
  • the present invention also relates to proteins with an amino acid sequence which is essentially homologous to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12.
  • a protein having an amino acid sequence that is substantially homologous to a selected amino acid sequence is at least about 50% homologous to the selected amino acid sequence, e.g. the entire selected amino acid sequence.
  • a protein having an amino acid sequence that is substantially homologous to a selected amino acid sequence can also be at least about 50 to 60%, preferably at least about 60 to 70%, and more preferably at least about 70 to 80%, 80 to 90% or 90 to 95%, and most preferably at least about 96%, 97%, 98%, 99% or more, homologous to a selected amino acid sequence.
  • the desaturases or the biologically active parts or fragments thereof can participate in the metabolism of lipids to build up cell membranes or storage lipids in organisms and in Combination with other genes, in particular those with elongase activity, contribute to the elongation of cis or Co 2 PUFAs, so that cis, C 0 , C or C 4 PUFAs and related PUFAs are obtained. ⁇ •
  • the desaturases in combination with elongases and other desaturases can be cloned in expression cassettes according to the invention and used for the transformation of plants with the aid of Agrobacterium.
  • One embodiment of the invention is isolated nucleic acids which originate from PUFA-producing microorganisms and code for polypeptides which desaturate cis or C o- 22 fatty acids with at least one, two, three or four double bonds in the fatty acid.
  • a further embodiment according to the invention are isolated nucleic acids, comprising nucleotide sequences which code for polypeptides which desaturate cis or C 0 fatty acids with at least one, two, three or four double bonds in the fatty acid and are from the group consisting of
  • nucleic acid sequences which are obtained on the basis of the degenerate genetic code by back-translation of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 12,
  • the above-mentioned nucleic acid according to the invention comes from organisms, such as ciliates, fungi, algae or dinoflagellates, which can synthesize PUFAs, preferably from Phaeodactylum tricornutum or closely related organisms.
  • nucleic acid molecule as used herein is intended to encompass DNA molecules (e.g. cDNA or genomic DNA) and RNA molecules (e.g. RNA) as well as DNA or RNA analogs which are generated by means of nucleotide analogs.
  • This term also includes the untranslated sequence located at the 3 'and 5' end of the coding region: at least 500, preferably 200, particularly preferably 100 nucleotides of the sequence upstream of the 5 'end of the coding region and at least 100, preferably 50, particularly preferably 20 nucleotides of the sequence downstream of the 3 'end of the coding gene region.
  • the nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but is preferably double-stranded DNA.
  • An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid.
  • an "isolated" nucleic acid preferably has no sequences that naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived (e.g. sequences located at the 5 'and 3' ends of the nucleic acid).
  • the isolated desaturase nucleic acid molecule can contain, for example, less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of nucleotide sequences that naturally contain the nucleic acid molecule in flank the genomic DNA of the cell from which the nucleic acid originates (e.g. a Physcomitrella patens cell).
  • An "isolated" nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule can also be substantially free of other cellular material or culture medium when made by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized.
  • An expression cassette according to the invention with the structure SEQ ID NO: 32 promoter SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 35 nucleic acid molecule for example a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a part of these, can be isolated using standard molecular biological techniques and the sequence information provided here. Can too Using comparison algorithms, for example, a homologous sequence or homologous, conserved sequence regions can be identified at the DNA or amino acid level.
  • a Phaeodactylum tricornutum cDNA can be isolated from a Phaeodactylum tricornutum bank by using the complete SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 or a part thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • nucleic acid molecule comprising a complete sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 or a part thereof can be isolated by polymerase chain reaction, oligonucleotide primers based on this sequence or on parts thereof, in particular regions Motifs from example 5a are created or modifications of the same in individually defined amino acids can be used (for example, a nucleic acid molecule comprising the complete sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 or a part thereof, by polymerase chain reaction using Oligonucleotide primers are isolated, which have been created on the basis of this same sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11).
  • mRNA can be isolated from cells (for example by the guanidinium thiocyanate extraction method of Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) and cDNA using reverse transcriptase (for example Moloney-MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL).
  • reverse transcriptase for example Moloney-MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL.
  • Synthetic oligonucleotide primers for aplification by means of the polymerase chain reaction can be prepared on the basis of one of the sequences shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 and the sequence shown in FIG.
  • a nucleic acid of the invention can be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and suitable oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by means of DNA sequence analysis.
  • Oligonucleotides which correspond to a desaturase nucleotide sequence can be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • the cDNA shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 comprises sequences encoding desaturases (ie the "coding region") as well as 5'-untranslated sequences and 3 '-untranslated sequences.
  • the nucleic acid molecule can only encode the coding region of one of the sequences in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11.
  • one or more nucleotide exchanges can be modified by insertion (s) and / or deletion (s) without, however, interfering with the functionality or activity of the promoters. It is also possible that the activity of the promoters is increased by modifying their sequence or that they are completely replaced by more active promoters, even from heterologous organisms.
  • nucleic acid molecule according to the invention can only part of the coding region of one of the sequences in
  • SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 for example a fragment that can be used as a probe or primer, or a fragment that encodes a biologically active portion of a desaturase.
  • the nucleotide sequences determined from the cloning of the desaturase gene from Phaeodactylum tricornutum enable the generation of probes and primers which are designed for the identification and / or cloning of desaturase homologues in other cell types and organisms as well as desaturase homologues from other microalgae or related species.
  • the probe / primer usually comprises essentially purified oligonucleotide.
  • the oligonucleotide usually comprises a nucleotide sequence region which, under stringent conditions, comprises at least about 12, preferably about 16, more preferably about 25, 40, 50 or 75 successive nucleotides of a sense strand of one of the ones in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 specified sequences, an antisense strand of one of the sequences given in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 or its homologs, derivatives or analogs or naturally occurring mutants thereof.
  • Primers based on a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 can be used in PCR reactions for cloning desaturase homologues.
  • Probes based on the desaturase nucleotide sequences can be used for the detection of transcripts or genomic sequences which encode the same or homologous proteins.
  • the probe also includes a label group attached thereto, e.g. a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme or an enzyme cofactor.
  • These probes can be used as part of a genomic marker assay kit to identify cells that express a desaturase, for example by measuring an amount of a desaturase-encoding nucleic acid in a cell sample, e.g. Measuring desaturase mRNA levels, or to determine whether a genomic desaturase gene is mutated or deleted can be used.
  • the nucleic acid molecule according to the invention encodes a protein or a part thereof which comprises an amino acid sequence which is sufficiently homologous to one Amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12 is that the protein or part thereof retains the ability to participate in the metabolism of compounds necessary for the construction of cell membranes in microorganisms or plants or in the transport of molecules across these membranes ,
  • the term "sufficiently homologous” refers to proteins or portions thereof whose amino acid sequences have a minimal number of identical or equivalent amino acid residues (eg an amino acid residue with a similar side chain as an amino acid residue in
  • derivatives of the nucleic acid molecule according to the invention encode proteins with at least about 50 to 60%, preferably at least about 60 to 70% and more preferably at least about 70 to 80%, 80 to 90%,
  • 40 parts of proteins which are encoded by the desaturase nucleic acid molecules according to the invention are preferably biologically active parts of one of the desaturases.
  • biologically active part of a desaturase is intended to mean a section, e.g. a domain / motif, a desaturase
  • Additional nucleic acid fragments encoding biologically active sections of a desaturase can be isolated by isolating part of one of the sequences in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11, expressing the encoded section of the desaturase or the peptide (for example by recombinant expression in vitro) and determining the activity of the encoded portion of the desaturase or peptide.
  • the invention also encompasses nucleic acid molecules which differ from one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 (and parts thereof) because of the degenerate genetic code and thus encode the same desaturase as that from those is encoded in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 nucleotide sequences shown.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention has a nucleotide sequence which codes for a protein with an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12.
  • nucleic acid molecule according to the invention encodes a full-length desaturase protein which forms an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,4, 6 or 12 (that of an open one shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11
  • Reading frame is coded) is essentially homologous and can be identified and isolated by common methods.
  • the person skilled in the art recognizes that DNA sequence polymorphisms which lead to changes in the amino acid sequences of the desaturases exist within a population (for example the Phaeodactylum tricornutum population) can. These genetic polymorphisms in the desaturase gene can exist between individuals within a population due to natural variation.
  • the terms "gene” and “recombinant gene” mean nucleic acid molecules with an open reading frame that encodes a desaturase, preferably a Phaeodactylum tricornutum desaturase.
  • Nucleic acid molecules that correspond to the natural variants and non-Phaeodactylum tricornutum homologues, derivatives and analogues of the Phaeodactylum tricornutum cDNA can be based on their homology to the Phaeodactylum tricornutum desaturase nucleic acid disclosed here using the Phaeornutactumum tricornutum part of it can be isolated as a hybridization probe according to standard hybridization techniques under stringent hybridization conditions.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention is at least 15 nucleotides long and hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid molecule which comprises a nucleotide sequence of SEQ ID N0: 1, 3, 5 or 11.
  • the nucleic acid is at least 25, 50, 100, 250 or more nucleotides in length.
  • hybridizes under stringent conditions is intended to describe hybridization and washing conditions under which nucleotide sequences which are at least 60% homologous to one another usually remain hybridized to one another.
  • the conditions are preferably such that sequences which are at least about 65%, more preferably at least about 70% and even more preferably at least about 75% or more homologous to one another usually remain hybridized to one another.
  • stringent conditions are known to the person skilled in the art and can be found in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.
  • Examples of stringent hybridization conditions are hybridizations in 6 x sodium chloride / sodium citrate (SSC) at around 45 ° C, followed by one or more washing steps in 0.2 x SSC, 0.1% SDS at 50 to 65 ° C , It is known to the person skilled in the art that these hybridization conditions differ depending on the type of nucleic acid and, for example, if organic solvents are present, with regard to the temperature and the concentration of the buffer. The temperature differs, for example, under "standard hybridization conditions” depending on the type of nucleic acid between 42 ° C and 58 ° C in aqueous buffer with a concentration of 0.1 to 5 x SSC (pH 7.2).
  • the temperature is about 42 ° C under standard conditions.
  • the hybridization conditions for DNA: DNA hybrids are preferably, for example, 0.1 ⁇ SSC and 20 ° C. to 45 ° C., preferably between 30 ° C. and 45 ° C.
  • the hybridization conditions for DNA: RNA are preferably Hybrids for example 0.1 x SSC and 30 ° C to 55 ° C, preferably between 45 ° C and 55 ° C.
  • nucleic acid molecule which hybridizes under stringent conditions to a sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 preferably corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule.
  • a "naturally occurring" nucleic acid molecule refers to an RNA or DNA molecule with a nucleotide sequence that occurs in nature
  • the nucleic acid encodes a naturally occurring Phyaedactylum tricornutum desaturase.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 which leads to changes in the Amino acid sequence of the encoded desaturase leads without the functionality of the desaturase protein being impaired.
  • nucleotide substitutions which lead to amino acid substitutions at "non-essential" amino acid residues can be produced in a sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12.
  • a "non-essential" amino acid residue is a residue that is in one
  • Wild-type desaturase sequence of one of the desaturases can be changed without the activity of the desaturase being changed, that is to say substantially reduced, whereas an "essential" amino acid residue is required for the desaturase activity.
  • other amino acid residues for example those which are not conserved in the domain with desaturase activity or are only semi-preserved
  • An isolated nucleic acid molecule which encodes a desaturase which is homologous to a protein sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12 can be introduced into a nucleotide sequence of SEQ by introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions ID NO: 1, 3, 5 or 11 are generated so that one or more amino acid substitutions, additions or deletions are introduced into the encoded protein. Mutations can be introduced into one of the sequences of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 by standard techniques such as site-specific mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Preferably, conservative amino acid substitutions are made on one or more of the predicted non-essential amino acid residues.
  • amino acid residue is exchanged for an amino acid residue with a similar side chain.
  • Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (e.g.
  • a predicted non-essential amino acid residue in a desaturase is thus preferably replaced by another amino acid residue from the same side chain family.
  • the mutations can be introduced randomly over all or part of the desaturase coding sequence, e.g.
  • the encoded protein can be expressed recombinantly and the activity of the protein can e.g. can be determined using the tests described here (see example section).
  • nucleic acid molecules which are "antisense” to the nucleic acid sequences according to the invention.
  • An “antisense” nucleic acid comprises a nucleotide sequence which is complementary to a “sense” nucleic acid which encodes a protein, for example complementary to the coding strand of a double-stranded cDNA molecule or complementary to an mRNA sequence.
  • An antisense nucleic acid can consequently bind to a sense nucleic acid via hydrogen bonds.
  • the antisense nucleic acid can be complementary to an entire strand coding for desaturase or only to a part thereof.
  • an antisense nucleic acid molecule is "antisense” to a "coding region" of the coding strand of a nucleotide sequence that encodes a desaturase.
  • coding region refers to the region of the nucleotide sequence which comprises codons which are translated into amino acid residues (for example the entire coding region which begins and ends with the stop codon, ie the last codon before the stop codon).
  • the antisense nucleic acid molecule is "antisense” to a "non-coding region" of the coding strand of a nucleotide sequence which codes for desaturase.
  • non-coding region relates to 5 'and 3' sequences which flank the coding region and are not translated into amino acids (ie which are also referred to as 5 'and 3' untranslated regions).
  • antisense nucleic acids according to the invention can be designed in accordance with the rules of Watson-Crick base pairing.
  • the antisense nucleic acid molecule can be complementary to the entire coding region of desaturase mRNA, but is more preferably an oligonucleotide that is only part of the coding or non-coding region of desaturase mRNA "antisense".
  • the antisense oligonucleotide can be complementary to the region surrounding the translation start site of desaturase mRNA.
  • An antisense oligonucleotide can be, for example, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 and more nucleotides in length.
  • An antisense nucleic acid of the invention can be constructed using chemical synthesis and enzymatic ligation reactions using methods known in the art.
  • An antisense nucleic acid eg an antisense oligonucleotide
  • an antisense oligonucleotide can, for example, be chemically synthesized using naturally occurring nucleotides or variously modified nucleotides which are designed in such a way that they increase the biological stability of the molecules or the physical stability of the difference between the antisense and the duplex formed in the sense nucleic acid, for example phosphorothioate derivatives and acridine-substituted nucleotides can be used.
  • modified nucleotides which can be used to generate the antisense nucleic acid include 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chloro-uracil, 5-ioduracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) racil , 5-carboxymethylaminomethyl-2- thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galactosylqueosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2, 2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine Methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylqueosine, 5'-me
  • the antisense nucleic acid can alternatively be produced biologically using an expression vector into which a nucleic acid has been subcloned in the antisense direction (ie RNA which is transcribed by the introduced nucleic acid is oriented in the antisense direction to a target nucleic acid of interest , which is further described in the subsection below).
  • the antisense nucleic acid molecules according to the invention are usually administered to a cell or generated in situ so that they hybridize with or bind to the cellular mRNA and / or the genomic DNA which encodes a desaturase, in order thereby to express the protein, for example by inhibition to inhibit transcription and / or translation.
  • Hybridization can be accomplished by conventional nucleotide complementarity to form a stable duplex or, for example in the case of an antisense nucleic acid molecule that binds DNA duplexes, by specific interactions in the major groove of the double helix.
  • the antisense molecule can be modified to specifically bind to a receptor or to an antigen expressed on a selected cell surface, for example by binding the antisense nucleic acid molecule to a peptide or an antibody that binds to a cell surface receptor or an antigen ,
  • the antisense nucleic acid molecule can also be delivered to the cells using the vectors described here.
  • vector constructs in which the antisense nucleic acid molecule is under the control of a strong prokaryotic, viral or eukaryotic, including plant, promoter are preferred.
  • the antisense nucleic acid molecule according to the invention is an ⁇ -anomeric nucleic acid molecule.
  • An ⁇ -anomeric nucleic acid molecule forms specific double-stranded hybrids with complementary RNA, the strands running parallel to one another in contrast to conventional ⁇ -units.
  • the antisense nucleic acid molecule can also be a 2'-o-methylribonucleotide (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) or a chimeric RNA-DNA analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215: 327-330).
  • an antisense nucleic acid according to the invention is a ribozyme.
  • Ribozymes are catalytic RNA molecules with ribonuclease activity that can cleave a single-stranded nucleic acid, such as an mRNA, to which they have a complementary region.
  • ribozymes e.g. hammerhead ribozymes (described in Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591)) can be used for the catalytic cleavage of desaturase mRNA transcripts, thereby inhibiting the translation of desaturase mRNA.
  • a ribozyme with specificity for a desaturase-encoding nucleic acid can be isolated based on the nucleotide sequence of one of the desaturase cDNAs disclosed in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 (ie or based on a method according to the methods taught in this invention
  • a derivative of a Tetrahymena L-19 IVS RNA can be constructed, the nucleotide sequence of the active site being complementary to the nucleotide sequence that is to be cleaved in a desaturase-encoding mRNA, see for example Cech et al ., U.S. Patent No. 4,987,071 and Cech et al., U.S. Patent No.
  • desaturase mRNA can be used to select a catalytic RNA with specific ribonuclease activity from a pool of RNA molecules, see, e.g., Bartel, D ., and Szostak, JW (1993) Science 261: 1411-1418.
  • desaturase gene expression can be inhibited by directing nucleotide sequences that are complementary to the regulatory region of a desaturase nucleotide sequence (for example a desaturase promoter and / or enhancer) in such a way that triple helix structures are formed which form the Inhibit transcription of a desaturase gene in target cells.
  • a desaturase nucleotide sequence for example a desaturase promoter and / or enhancer
  • the expression cassette according to the invention includes the sequences mentioned in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11, which are the result of the genetic code and / or their functional or non-functional derivatives to understand that have been functionally linked to one or more regulatory signals to increase gene expression and which advantageously control the expression of the coding sequence in the host cell. These regulatory sequences are intended for the targeted expression of the genes and the
  • Enable protein expression Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed and / or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified, so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased.
  • the gene construct can also have a simpler structure, that is to say no additional regulation signals have been inserted in front of the nucleic acid sequence or its derivatives, and the natural promoter with its regulation has not been removed. Instead, the natural regulatory sequence was mutated so that regulation no longer takes place and / or gene expression is increased.
  • the gene construct can also advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences" functionally linked to the promoter, which enable increased expression of the nucleic acid sequence.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • genes for inducers, repressors or enzymes which intervene in the regulation of one or more genes of a biosynthetic pathway through their enzyme activity, to be introduced and expressed therein.
  • genes for inducers, repressors or enzymes which intervene in the regulation of one or more genes of a biosynthetic pathway through their enzyme activity, to be introduced and expressed therein.
  • genes can be of heterologous or homologous origin.
  • further biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism can advantageously be contained in the nucleic acid construct or gene construct, or these genes can lie on another or more further nucleic acid constructs.
  • Acyl transferase s
  • fatty acid synthase s
  • fatty acid hydroxylase s
  • acetyl coenzma A carboxylase (s)
  • acyl coenzyme A oxidase (s)
  • fatty acid desaturase s
  • Fatty acid acetylenases lipoxygenases, triacylglycerol lipases, allen oxide synthases, hydroperoxide lyases or fatty acid elongase (s) or combinations thereof are used.
  • gene constructs advantageously comprise further 3'- and / or 5'-terminal regulatory sequences for increasing expression, which are selected depending on the host organism selected and the gene or the genes for the optimal expression.
  • these regulatory sequences are intended to enable specific expression of the genes and protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can also preferably have an advantageous effect on the expression of the genes introduced and thus increase them.
  • the regulatory elements can be advantageously amplified at the transcription level using strong transcription signals, such as promoters and / or enhancers.
  • strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • vectors preferably expression vectors, which contain a nucleic acid, a desaturase alone (or a part thereof) or a nucleic acid construct described under point b in which the nucleic acid according to the invention alone or in combination with other biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism such as desaturases or elongases is contained.
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is attached.
  • plasmid which stands for a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • vectors Another type of vector is a viral vector, whereby additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can replicate autonomously in a host cell into which they have been introduced (eg bacterial vectors with bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors).
  • Other vectors eg non-episomal mammalian vectors
  • certain vectors can control the expression of genes to which they are operably linked. These vectors are referred to here as "expression vectors".
  • expression vectors suitable for recombinant DNA techniques are in the form of plasmids.
  • plasmid and "vector” can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass these other expression vector forms, such as viral vectors (eg replication-deficient retroviruses, adenoviruses and adeno-related viruses), which perform similar functions.
  • viral vectors eg replication-deficient retroviruses, adenoviruses and adeno-related viruses
  • vector is also intended to include other vectors which are known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposons, IS elements, phas ide, phagemids, cosmids, linear or circular DNA.
  • the recombinant expression vectors according to the invention comprise a nucleic acid or a gene construct according to the invention in a form which is suitable for expression of the nucleic acid in a host cell, which means that the recombinant expression vectors have one or more regulatory sequences selected on the basis of those to be used for expression Host cells that are operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed.
  • operably linked means that the nucleotide sequence of interest is linked to the regulatory sequence (s) in such a way that the expression of the nucleotide sequence is possible and they are linked to one another, so that both sequences have the predicted sequence assigned to the sequence Perform function (for example in an in vitro transcription / translation system or in a host cell when the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended to be promoters, enhancers and include other expression control elements (eg polyadenylation signals).
  • Regulatory sequences include those which control the constitutive expression of a nucleotide sequence in many host cell types and those which control the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells under certain conditions.
  • the expression vectors of the invention can be introduced into host cells to thereby produce proteins or peptides, including fusion proteins or peptides, which are encoded by the nucleic acids as described here (e.g. desaturases, mutant forms of desaturases, fusion proteins, etc.).
  • the recombinant expression vectors according to the invention can be designed for the expression of desaturases and elongases in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • desaturase genes in bacterial cells such as C. glutamicum,
  • Insect cells using baculovirus expression vectors
  • yeast and other fungal cells see Romanos, MA, et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel , CAMJJ, et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, JW Bennet & LL Lasure, ed., Pp.
  • the recombinant expression vector may alternatively, for example using T7 promoter regulatory sequences and
  • T7 polymerase can be transcribed and translated in vitro.
  • Proteins are usually expressed in prokaryotes using vectors which contain constitutive or inducible promoters which control the expression of fusion or non-fusion proteins.
  • Fusion vectors add a number of amino acids to a protein encoded therein, usually at the amino terminus of the recombinant protein, but also at the C terminus or fused within suitable ranges in the proteins. These fusion vectors usually have three functions: 1) to increase the expression of recombinant protein; 2) increasing the solubility of the recombinant protein and 3) supporting the purification of the recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification.
  • a proteolytic cleavage site is often introduced at the junction of the fusion unit and the recombinant protein, so that the recombinant protein can be separated from the fusion unit after the fusion protein has been purified.
  • These enzymes and their corresponding recognition sequences include factor Xa, thrombin and enterokinase.
  • Typical fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB, and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , in which glutathione-S-transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • GST glutathione-S-transferase
  • the desaturase coding sequence is cloned into a pGEX expression vector to produce a vector encoding a fusion protein comprising GST-thrombin cleavage site X protein from the N-terminus to the C-terminus.
  • the fusion protein can be purified by affinity chromatography using glutathione-agarose resin. Recombinant desaturase that is not fused to GST can be obtained by cleaving the fusion protein
  • yeast vectors are, for example, pAG-1, YEp6, YEpl3 or pEMBLYe23.
  • the desaturases according to the invention can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol .. 3: 2156-2165) and the pVL- Series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • a nucleic acid according to the invention is expressed in mammalian cells using a mammalian expression vector.
  • mammals are understood to mean all non-human mammals.
  • mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (aufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • the control functions of the expression vector are often provided by viral regulatory elements. Promoters commonly used are e.g. from Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalie virus and Simian Virus 40.
  • the recombinant mammalian expression vector can preferably control the expression of the nucleic acid in a specific cell type (for example, tissue-specific regulatory elements are used to express the nucleic acid).
  • tissue-specific regulatory elements are known in the art.
  • suitable tissue-specific promoters include the albumin promoter (liver-specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid-specific promoters (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275) , in particular promoters of T cell receptors (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J.
  • mammary specific promoters e.g., milk serum promoter; U.S. Patent No. 4,873,316 and European Patent Application Publication No. 264,166.
  • Development-regulated promoters are also included, e.g. the mouse hox promoters (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) and the fetoprotein promoter (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).
  • the desaturases according to the invention can be found in single-cell plant cells (such as algae), see Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 and literature references cited therein, and plant cells from higher plants (for example spermatophytes, such as crops) ) are expressed.
  • plant expression vectors include those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border ", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds .: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
  • a plant expression cassette preferably contains
  • polyadenylation signals are those derived from Agrobacterium tumefaciens-t-DNA, such as gene 3 of the Ti plasmid pTiACH5 known as octopine synthase (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) Or functional equivalents thereof, but all other terminators that are functionally active in plants are also suitable.
  • a plant expression cassette preferably contains other functionally linked sequences, such as translation enhancers, for example the overdrive sequence which comprises the 5 'untranslated leader sequence from tobacco mosaic. virus that increases the protein / RNA ratio contains (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
  • Plant gene expression must be operably linked to a suitable promoter that performs gene expression in a timely, cell or tissue specific manner.
  • promoters which bring about constitutive expression such as those derived from plant viruses, such as 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285 -294), 19S CaMV (see also US 5352605 and WO 84/02913) or plant promoters, such as that in US 4,962.02? described the small subunit of the Rubisco.
  • Targeting sequences which are necessary for controlling the gene product in its corresponding cell compartment (see an overview in Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 and references cited therein), for example in the vacuole, the Cell nucleus, all types of plastids, such as amyloplasts, chloroplasts, chromoplasts, the extracellular space, the mitochondria, the endoplasmic reticulum, oil bodies, peroxisomes and other parts of plant cells.
  • plastids such as amyloplasts, chloroplasts, chromoplasts, the extracellular space, the mitochondria, the endoplasmic reticulum, oil bodies, peroxisomes and other parts of plant cells.
  • Plant gene expression can also be facilitated via a chemically inducible promoter (see an overview in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108).
  • Chemically inducible promoters are particularly suitable if it is desired that the gene expression takes place in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
  • Promoters that react to biotic or abiotic stress conditions are also suitable promoters, for example the pathogen-induced PRPl gene promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), the heat-inducible hsp80 promoter from tomato (US Pat. No. 5,187,267), the cold-inducible alpha amylase promoter from potato (WO 96/12814) or the wound-inducible pin III promoter (EP-A-0 375 091).
  • the pathogen-induced PRPl gene promoter Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366
  • the heat-inducible hsp80 promoter from tomato US Pat. No. 5,187,267
  • the cold-inducible alpha amylase promoter from potato WO 96/1281
  • the wound-inducible pin III promoter EP-A-0 375 091
  • Suitable promoters are the Napingen promoter from rapeseed (US 5,608,152), the USP promoter from Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), the oleosin pro otor from Arabidopsis (WO 98/45461), the phaseolin Promoter from Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), the Bce4 promoter from Brassica (WO 91/13980) or the legumin B4 promoter (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9 ) and promoters which bring about seed-specific expression in monocotyledonous plants, such as maize, barley, wheat, rye, rice, etc.
  • Suitable noteworthy promoters are the lpt2 or iptl gene promoter from barley (WO 95/15389 and WO 95/23230) or those described in WO 99/16890 (promoters from the barley hordein gene, the rice glutelin gene , the rice oryzin gene, the rice prolamin gene, the wheat gliadin gene, wheat glutelin gene, the maize zein gene, the oat glutelin gene, the sorghum kasirin gene, the Rye secalin gene).
  • the multiparallel expression of desaturases according to the invention alone or in combination with other desaturases or elongases may be desired.
  • Such expression cassettes can be introduced via a simultaneous transformation of several individual expression constructs or by combining several expression cassettes on one construct.
  • Several vectors, each with several expression cassettes, can also be transformed and transferred to the host cell.
  • Promoters which bring about plastid-specific expression are also particularly suitable, since plastids are the compartment in which the precursors and some end products of lipid biosynthesis are synthesized.
  • Suitable promoters such as the viral RNA polymerase promoter, are described in WO 95/16783 and WO 97/06250, and the clpP promoter from Arabidopsis, described in WO 99/46394.
  • the invention also provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule according to the invention which is cloned into the expression vector in the antisense direction. ie the DNA molecule is operably linked to a regulatory sequence in such a way that expression (by transcription of the DNA molecule) of an RNA molecule that is "antisense" to the desaturase mRNA is made possible.
  • Regulatory sequences can be selected which are operably linked to a nucleic acid cloned in the antisense direction and which control the continuous expression of the antisense RNA molecule in a multiplicity of cell types, for example viral promoters and / or enhancers or regulatory sequences can be selected , which is the constitutive, tissue-specific or control cell type-specific expression of antisense RNA.
  • the antisense expression vector can be in the form of a recombinant plasmid, phagemid or attenuated virus in which antisense nucleic acids are produced under the control of a highly effective regulatory region, the activity of which can be determined by the type of cell into which the vector has been introduced.
  • a highly effective regulatory region the activity of which can be determined by the type of cell into which the vector has been introduced.
  • host cell and “recombinant host cell” are used interchangeably here. Of course, these terms refer not only to the specific target cell, but also to the descendants or potential descendants of this cell. Because certain modifications may occur in successive generations due to mutation or environmental influences, these offspring are not necessarily identical to the parental cell, but are still within the scope of the term as used herein.
  • Recombinant or transgene for example recombinant expression vector or recombinant host or host cells in the sense of the invention, is to be understood that the nucleic acids according to the invention and / or their natural regulatory sequences at the 5 'and 3' position of the nucleic acids are not in their natural environment, that is to say either the position of the sequences in the original organism was changed or the nucleic acid sequences and / or the regulatory sequences were mutated in this or the nucleic acid sequences according to the invention were moved to an organism other than the original organism or its regulatory sequences. Combinations of these changes are also possible.
  • the natural environment is the position of a nucleic acid sequence in an organism as it occurs in nature.
  • a host cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • a desaturase can be expressed in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells, fungal cells or mammalian cells (such as Chinese urinary ovary cells (CHO) or COS cells), algae, ciliates, plant cells, fungi or other microorganisms such as C. glutamicum become.
  • Other suitable host cells are known to the person skilled in the art.
  • Vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells using conventional transformation or transfection techniques. The terms "transformation” and “transfection”, conjugation and transduction, as used herein, are intended to mean a variety of methods known in the art for
  • transforming or transfecting host cells including plant cells, can be found in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and other laboratory manuals, such as Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44 , Agrobacterium protocols, eds .: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
  • selectable markers include those which confer resistance to drugs such as G418, hygromycin and methotrexate, or in plants which confer resistance to a herbicide such as glyphosphate or glufosinate.
  • markers which code genes which are involved in biosynthetic pathways for example of sugars or amino acids, such as ⁇ -galactodsidase, ura3 or ilv2.
  • Markers which encode genes such as luciferase, gfp or other fluorescent genes are also suitable. These markers can be used in mutants in which these genes are not functional, since they have been deleted, for example, using conventional methods.
  • markers which encode a nucleic acid which encodes a selectable marker can be introduced into a host cell on the same vector as the one which encodes a desaturase, or can be introduced on a separate vector.
  • Cells that have been stably transfected with the introduced nucleic acid can, for example, be identified by drug selection (for example, cells that have integrated the selectable marker survive, whereas the other cells die).
  • a vector is produced which contains at least a section of a desaturase gene into which a deletion, addition or substitution has been introduced in order to thereby change, for example functionally disrupt, the desaturase gene.
  • This desaturase gene is preferably a Phaeodactylum tricornutum desaturase gene, but a homologue or analogue from other organisms, even from a mammalian, fungal or insect source, can be used.
  • the vector is designed such that the endogenous desaturase gene is functionally disrumpted when homologous recombination occurs (ie no longer encodes a functional protein, also referred to as a knock-out vector).
  • the vector can be designed in such a way that the endogenous desaturase gene is mutated or otherwise changed during homologous recombination, but still encodes a functional protein (for example the upstream regulatory region can be changed in such a way that the expression of the endogenous desaturase is thereby changed)
  • DNA-RNA hybrids known as chimeraplasty which are derived from Cole-Strauss et al. , 1999, Nucleic Acids Research 27 (5): 1323-1330 and Kmiec, Gene therapy, 19999, American Scientist, 87 (3): 240-247.
  • the modified portion of the desaturase gene is flanked at its 5 'and 3' ends by additional nucleic acid of the desaturase gene, so that homologous recombination between the exogenous desaturase gene present on the vector and an endogenous desaturase gene in one Microorganism or a plant is possible.
  • the additional flanking desaturase nucleic acid is long enough for successful homologous recombination with the endogenous gene.
  • the vector contains several hundred base pairs of DNA flanking up to kilobases (both at the 5 'and 3' ends) (for a description of vectors for homologous recombination, see, for example, in Thomas, KR, and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503 or recombination in Physcomitrella patens based on cDNA in Strepp et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (8): 4368-4373).
  • the vector is introduced into a microorganism or plant cell (eg, using polyethylene glycol-mediated DNA), and cells in which the introduced desaturase gene is homologously recombined with the endogenous desaturase gene are selected using techniques known in the art.
  • recombinant organisms such as microorganisms, can be produced which contain selected systems which allow regulated expression of the introduced gene.
  • the inclusion of a desaturase gene in a vector, whereby it is brought under the control of the lac operon, enables, for example, the expression of the desaturase gene only in the presence of IPTG.
  • a host cell of the invention such as a prokaryotic or eukaryotic host cell, growing in culture or in a field, can be used to produce (i.e., express) a desaturase.
  • an alternative method can also be used by direct transfer of DNA into developing flowers via electroporation or gene transfer using Agrobacterium.
  • the invention thus further provides methods for producing desaturases using the host cells of the invention.
  • the method comprises culturing the host cell according to the invention (into which a recombinant expression vector encoding a desaturase has been introduced, or into whose genome a gene encoding a wild-type or modified desaturase has been introduced) in a suitable medium until the desaturase has been produced.
  • the method comprises isolating the desaturases from the medium or the host cell.
  • Host cells which are suitable in principle for taking up the nucleic acid according to the invention, the gene product according to the invention or the vector according to the invention are all prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the host organisms advantageously used are organisms such as bacteria, fungi, yeasts, animal or plant cells. Other advantageous organisms are animals or preferably plants or parts thereof.
  • Mushrooms, yeasts or plants are preferably used, particularly preferably mushrooms or plants, very particularly preferably plants, such as oil fruit plants, which contain large amounts of lipid compounds, such as oilseed rape, evening primrose, canola, peanut, flax, soya, safflower, sunflower, borage , or plants, such as corn, wheat, rye, oats, triticale, rice, barley, cotton, manioc, pepper, tagetes, solanaceae plants, such as potato, tobacco, eggplant and tomato, Vicia species, pea, alfalfa, bush plants ( Coffee, cocoa, tea), types of salix, trees (oil plant, coconut) as well as perennial grasses and fodder crops.
  • Particularly preferred plants according to the invention are oil fruit plants such as soybean, peanut, rapeseed, canola, flax, evening primrose, sunflower, safflower, trees (oil palm, coconut).
  • Another aspect of the invention relates to isolated desaturases and biologically active parts thereof.
  • An "isolated” or “purified” protein or a biologically active portion thereof is essentially free of cellular material when it is produced by recombinant DNA techniques, or of chemical precursors or other chemicals when it is chemically synthesized.
  • the term "essentially free of cellular material” encompasses desaturase preparations in which the protein is separated from cellular components of the cells in which it is produced naturally or recombinantly.
  • the term "substantially free of cellular material” includes desaturase preparations with less than about 30% (by dry weight) non-desaturase (also referred to herein as "contaminating protein"), more preferably less than about 20% non-desaturase, more preferably less than about 10% non-desaturase, and most preferably less than about 5% non-desaturase.
  • contaminating protein also referred to herein as "contaminating protein”
  • the desaturase or a biologically active portion thereof has been produced recombinantly, it is also substantially free of culture medium, ie the culture medium makes up less than about 20%, more preferably less than about 10% and most preferably less than about 5 % of the volume of the protein preparation.
  • substantially free of chemical precursors or other chemicals includes desaturase preparations in which the protein is separated from chemical precursors or other chemicals involved in the synthesis of the protein.
  • the term “substantially free of chemical precursors or other chemicals” includes desaturase preparations with less than about 30% (by dry weight) chemical precursors or non-desaturase chemicals, more preferably less than about 20% chemical precursors or non-desaturase chemicals, more preferably less than about 10% chemical precursors or non-desaturase chemicals, and most preferably less than about 5% chemical precursors or non-desaturase chemicals.
  • isolated proteins or biologically active parts thereof have no contaminating proteins from the same organism from which the desaturase originates.
  • Phaeodactylum tricornutum desaturase in plants such as Physcomitrella patens or og or microorganisms, for example bacteria such as E. coli, Bacillus subtilis, C. glutamicum, fungi such as Mortierella, yeast such as Saccharomyces, or Ciliates like Colpidium or algae like Phaeodactylum.
  • An isolated desaturase according to the invention or a part thereof can also participate in the metabolism of compounds necessary for the construction of cell membranes in Phaeodactylum tricornutum or in the transport of molecules across these membranes.
  • the protein or portion thereof comprises an amino acid sequence sufficiently homologous to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12 that the protein or portion thereof has the ability to metabolize to build Cell membranes in Phaeodactylum tricornutum not-
  • a desaturase according to the invention has one of the SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 12
  • the desaturase has an amino acid sequence which is encoded by a nucleotide sequence which, for example under stringent conditions, hybridizes to a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11. Another one
  • the desaturase has an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence that is at least about 50 to 60%, preferably at least about 60 to 70%, more preferably at least about 70 to 80%, 80 to 90%, 90 to 95% and more preferably at least about 96%,
  • a preferred desaturase according to the invention preferably also has at least one of the desaturase activities described here.
  • a preferred desaturase according to the invention comprises an amino
  • nucleotide sequence which, for example under stringent conditions, hybridizes to a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 11 and on the metabolism of compounds necessary for the construction of cell membranes in Phaeodactylum tricornutum or on transport of molecules
  • 35 can participate through these membranes or introduce a double bond into a fatty acid with one, two, three or four double bonds and a chain length of Cis, C 0 or C 2 .
  • the desaturase is substantially 40 homologous to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 and maintains the functional activity of the protein of one of the sequences of SEQ ID NO: 2, 4 or 6, their.
  • amino acid sequence differs due to natural variation or mutagenesis, as described in detail in subsection I above.
  • desaturase is thus a protein comprising an "amino acid sequence that is at least about 50 to 60%, preferably at least about 60 to 70% and more preferably at least about 70 to 80%, 80 to 90%, 90 " to 95% and most preferably at least about 96%, 97%, 98%, 99% or even more homologous to a complete amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, Is 4 or 6.
  • the invention relates to a complete Phaeodactylum tricornutum protein which is essentially homologous to a complete amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6.
  • Biologically active parts of a desaturase include peptides comprising amino acid sequences derived from the amino acid sequence of a desaturase, e.g. an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or the amino acid sequence of a protein homologous to a desaturase which has fewer amino acids than the full length desaturase or the full length protein homologous to a desaturase, and at least one activity have a desaturase.
  • Usually biologically active parts (peptides, for example peptides that are for example 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 or more amino acids long) comprise a domain or a motif with at least one activity of a desaturase.
  • biologically active parts in which other regions of the protein have been deleted can be produced by recombinant techniques and examined for one or more of the activities described herein.
  • the biologically active parts of a desaturase preferably comprise one or more selected domains / motifs or parts thereof with biological activity.
  • Desaturases are preferably produced by recombinant DNA techniques. For example, a nucleic acid molecule encoding the protein is cloned into an expression vector (as described above), the expression vector is introduced into a host cell (as described above), and the desaturase is expressed in the host cell. The desaturase can then be isolated from the cells using a suitable purification scheme using standard protein purification techniques. As an alternative to recombinant expression, a desaturase, a polypeptide or a peptide can be chemically synthesized using standard peptide synthesis techniques.
  • native desaturase can be isolated from cells (for example endothelial cells), for example using an anti-desaturase antibody which can be produced by standard techniques, using a desaturase according to the invention or a fragment thereof.
  • the invention also provides chimeric desaturase proteins or desaturase fusion proteins.
  • a "chimeric desaturase protein” or “desaturase fusion protein” includes a desaturase polypeptide that is operably linked to a non-desaturase polypeptide.
  • a “desaturase polypeptide” refers to a polypeptide with an amino acid sequence that corresponds to a desaturase
  • a “non-desaturase polypeptide” refers to a polypeptide with an amino acid sequence that corresponds to a protein that is substantially non-homologous to the desaturase, e.g. a protein that differs from desaturase and comes from the same or a different organism.
  • the term "operably linked” is intended to mean that the desaturase polypeptide and the non-desaturase polypeptide are fused to one another in such a way that both sequences fulfill the predicted function ascribed to the sequence used.
  • the non-desaturase polypeptide can be fused to the N-terminus or the C-terminus of the desaturase polypeptide.
  • the fusion protein is, for example, a GST-desaturase fusion protein in which the desaturase
  • fusion proteins are fused to the C-terminus of the GST sequences. These fusion proteins can facilitate the purification of the recombinant desaturases.
  • the fusion protein is a desaturase which has a heterologous signal sequence at its N-terminus.
  • the expression and / or secretion of a desaturase can be increased by using a heterologous signal sequence.
  • a chimeric desaturase protein according to the invention or
  • Desaturase fusion protein is made by standard recombinant DNA techniques. For example, DNA fragments encoding different polypeptide sequences are ligated together in-frame according to conventional techniques, for example by smooth or overhanging ends for ligation, restriction enzyme cleavage to provide suitable ends, filling in cohesive ends as required, treatment with alkaline phosphatase to avoid unwanted linkages to avoid and enzymatic ligation are used.
  • the fusion gene can be synthesized by conventional techniques, including automated DNA synthesizers.
  • a PCR amplification of gene fragments can be carried out using anchor primers which generate complementary overhangs between successive gene fragments which can subsequently be hybridized with one another and reamplified so that a chimeric gene sequence is generated (see for example Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al. , John Wiley & Sons: 1992).
  • anchor primers which generate complementary overhangs between successive gene fragments which can subsequently be hybridized with one another and reamplified so that a chimeric gene sequence is generated
  • many expression vectors are already commercially available which already encode a fusion unit (eg a GST polypeptide).
  • a desaturase-encoding nucleic acid can be cloned into such an expression vector, so that the fusion unit is linked in frame with the desaturase protein.
  • Desaturase homologs can be isolated by mutagenesis, e.g. by specific point mutation or shortening of the desaturase.
  • the term "homologs" as used herein refers to a variant form of desaturase that acts as an agonist or antagonist of desaturase activity.
  • An agonist of desaturase can maintain essentially the same activity as or part of the biological activities of desaturase.
  • An antagonist of desaturase can carry out one or more activities of the naturally occurring form of desaturase by, for example, competitive binding to a downstream or upstream element of the metabolic cascade for cell membrane components comprising the desaturase or by binding to a desaturase which facilitates the transport of compounds mediated via cell membranes, inhibit, whereby the translocation is inhibited.
  • homologs of desaturase can be identified by viewing combinatorial banks of mutants, eg shortening mutants, of desaturase for desaturase agonist or antagonist activity.
  • a varied bank of desaturase variants is generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level and encoded by a varied gene bank.
  • a varied bank of desaturase variants can be produced, for example, by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides in gene sequences, so that a degenerate set of potential desaturase sequences can be used as individual polypeptides or alternatively as a set of larger fusion proteins (for example for the phage display ) that contain this set of desaturase sequences.
  • a degenerate set of potential desaturase sequences can be used as individual polypeptides or alternatively as a set of larger fusion proteins (for example for the phage display ) that contain this set of desaturase sequences.
  • the chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be carried out in an automatic DNA synthesizer and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector.
  • degenerate set of genes allows all of the sequences encoding the desired set of potential desaturase sequences to be provided in a mixture.
  • Methods for synthesizing degenerate oligonucleotides are known in the art (see, for example, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
  • banks of desaturase fragments can be used to produce a varied population of desaturase fragments for screening and for the subsequent selection of homologues of a desaturase.
  • a bank of fragments of the coding sequence can be obtained by treating a double-stranded PCR fragment of a coding desaturase sequence with a nuclease under conditions under which double-strand breaks occur only about once per molecule, denaturing the double-stranded DNA, renaturing the DNA to form double-stranded DNA, which can include sense / antisense pairs of different double stranded break products, removing single stranded sections from newly formed duplexes by treatment with S1 nuclease and ligating the resulting fragment library into an expression vector.
  • an expression bank can be derived which encodes N-terminal, C-terminal and internal fragments of desaturase of different sizes.
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • a screening process that detects PUFA-dependent enzyme activity (s) is a prerequisite, especially for screening desaturase activities.
  • Desaturase activities with specificity for PUFAs can be used in Mucor species, which can be transformed by known transformation processes with desired gene constructs, the toxicity of arachidonic acid in the presence of a toxic metabolite (here: salicylic acid or salicylic acid derivatives) (Eroshin et al., Mikrobiologiya, Vol 65, No.l 1996, pages 31-36) in order to carry out a growth-based initial inspection.
  • Resulting clones can then be subjected to an analysis of their lipid constituents by means of gas chromatography and mass spectroscopy in order to determine the type and quantity of starting materials and products.
  • cell-based tests can be used to analyze a varied desaturase library using other methods known in the art.
  • nucleic acid molecules, proteins, protein homologues, fusion proteins, primers, vectors and host cells described here can be used in one or more of the following methods: identification of Phaeodactylum and related organisms, mapping of the genomes of organisms related to Phaeodactylum tricornutum, identification and localization of Phaeodactylum tricornutum sequences from
  • the desaturase nucleic acid molecules according to the invention have a multitude of uses. They can initially be used to identify an organism as Phaeodactylum tricornutum or as a close relative of it. They can also be used to identify the presence of Phaeodactylum tricornutum or a relative thereof in a mixed population be used by microorganisms.
  • the invention provides the nucleic acid sequences of a number of Phaeodactylum tricornutum genes; by probing the extracted genomic DNA of a culture of a uniform or mixed population of microorganisms under stringent conditions with a probe spanning a portion or part of a Phaeodactylum tricornutum gene unique to that organism, one can determine whether that organism is present.
  • Phaeodactylum tricornutum itself is used for the commercial production of polyunsaturated acids and is also suitable for PUFA production in other organisms, particularly if the aim is to incorporate the resulting PUFAs in the triacylglycerol fraction.
  • nucleic acid and protein molecules according to the invention can serve as markers for specific regions of the genome. This is not only suitable for mapping the genome, but also for functional Phaeodactylum tricornutum proteins. To identify the genome region to which a specific DNA-binding protein from Phaeodactylum tricornutum binds, the Phaeodactylum tricornutum genome could, for example, be cleaved and the fragments incubated with the DNA-binding protein.
  • nuclemic acid molecules according to the invention can additionally be probed with the nuclemic acid molecules according to the invention, preferably with easily detectable markings; the binding of such a nucleic acid molecule to the genome fragment enables the localization of the fragment on the genome map of Phaeodactylum tricornutum and, if this is carried out several times with different enzymes, facilitates a rapid determination of the nucleic acid sequence to which the protein binds.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can also be sufficiently homologous to the sequences of related species that these nucleic acid molecules can serve as markers for the construction of a genomic map in related fungi or algae.
  • the desaturase nucleic acid molecules according to the invention are also suitable for evolution and study studies.
  • the metabolic and transport processes in which the molecules according to the invention are involved are used by many prokaryotic and eukaryotic cells; by comparing the sequences of the nucleic acid molecules according to the invention with those which code similar enzymes from other organisms, the degree of evolutionary kinship of the organisms can be determined. Accordingly, such a comparison enables determination of which sequence regions are conserved and which are not, which can be helpful in determining regions of the protein which are essential for the enzyme function. This type of determination is valuable for protein engineering studies and can provide an indication of how much mutagenesis the protein can tolerate without losing function.
  • the manipulation of the desaturase nucleic acid molecules according to the invention can lead to the production of desaturases with functional differences from the wild-type desaturases.
  • the efficiency or activity of these proteins can be improved, they can be present in the cell in larger numbers than usual, or their efficiency or activity can be reduced.
  • Improved efficiency or activity means, for example, that the enzyme has a higher selectivity and / or activity, preferably an at least 10% higher, particularly preferably an at least 20% higher activity, very particularly preferably an at least 30% higher activity than the original enzyme.
  • Fatty acids such as PUFAs and lipids containing PUFAs are themselves desirable fine chemicals;
  • the yield, production and / or increase the efficiency of the production of fatty acid and lipid molecules in ciliates, algae, plants, fungi, yeasts or other microorganisms are themselves desirable fine chemicals;
  • the manipulation of one or more desaturase genes according to the invention can likewise lead to desaturases with changed activities which indirectly influence the production of one or more desired fine chemicals from algae, plants, ciliates or fungi.
  • the normal biochemical metabolic processes lead e.g. for the production of a large number of waste products (e.g. hydrogen peroxide and other reactive oxygen species) which can actively disrupt these metabolic processes (e.g. nitrated peroxynitrite, as is known, tyrosine side chains, whereby some enzymes are inactivated with tyrosine in the active center (Groves, JT (1999) Curr Opin. Chem. Biol. 3 (2), -226-235)).
  • the cells used for large-scale fermentative production are optimized for the overproduction of one or more fine chemicals and can therefore produce more waste products than is usual for a wild-type cell.
  • one or more desaturases according to the invention which are involved in the export of waste molecules, one can improve the viability of the cell and maintain an efficient metabolic activity.
  • the presence of high intracellular amounts of the desired fine chemical can actually be toxic to the cell, so that by increasing the ability of the cell to secrete these compounds, the viability of the cell can be improved.
  • the desaturases according to the invention can also be manipulated in such a way that the relative amounts of different lipid and fatty acid molecules are changed. This can have a decisive impact on the lipid composition of the cell membrane. Because each type of lipid has different physical properties, changing the lipid composition of a membrane can significantly change membrane fluidity. Changes in membrane fluidity can affect the transport of molecules across the membrane, which, as explained above, can modify the export of waste products or the fine chemicals produced or the import of necessary nutrients. These changes membrane fluidity can also have a decisive influence on the integrity of the cell; Cells with comparatively weaker membranes are more susceptible to abiotic and biotic stress conditions, which can damage or kill the cell.
  • nucleic acid and protein molecules according to the invention can be used to generate algae, ciliates, plants, animals, fungi or other microorganisms, such as C. glutamicum, which express mutated desaturase nucleic acid and protein molecules - Mieren, so that the yield, production and / or efficiency of production of a desired compound is improved.
  • This desired compound can be any natural product of algae, ciliates, plants, animals, fungi or bacteria, which includes the end products of biosynthetic pathways and intermediate products of naturally occurring metabolic pathways, as well as molecules that are not naturally occurring in the metabolism of these cells, but which are derived from the cells according to the invention are produced.
  • a further embodiment according to the invention is a method for producing PUFAs, the method comprising culturing an organism which comprises a nucleic acid according to the invention, a gene construct according to the invention or a vector according to the invention which encode a polypeptide, the cis, C o ⁇ or C-fatty acids with at least two double bonds in the fatty acid molecule extended by at least two carbon atoms under conditions under which PUFAs are produced in the organism.
  • PUFAs produced by this method can be isolated by harvesting the organisms either from the culture in which they grow or from the field, breaking up and / or extracting the harvested material with an organic solvent.
  • the oil, lipids, phospholipids, sphingolipids, glyco- contains lipids, triacylglycerme and / or free fatty acids with a higher PUFA content.
  • the free fatty acids with a higher PUFA content can be isolated by basic or acidic hydrolysis of the lipids, phospholipids, sphingolipids, glycolipids, triacylglycermes.
  • a higher content of PUFAs means at least 5%, preferably 10%, particularly preferably 20%, very particularly preferably 40% more PUFAs than the original organism, which has no additional nucleic acid which encodes the desaturase according to the invention.
  • the PUFAs produced by this process are preferably cis or C 2 o- 22 fatty acid molecules with at least two double bonds in the fatty acid molecule, preferably three or four, or five or six double bonds when combined with a further elongase and a ⁇ -4 desaturase.
  • These C 18 or C o 22 fatty acid molecules can be isolated from the organism in the form of an oil, lipid or a free fatty acid. Suitable organisms are, for example, those mentioned above. Preferred organisms are transgenic plants.
  • An embodiment according to the invention are oils, lipids or fatty acids or fractions thereof which have been produced by the process described above, particularly preferably oil, lipid or a fatty acid composition which comprise PUFAs and originate from transgenic plants.
  • a further embodiment according to the invention is the use of the oil, lipid or the fatty acid composition in feed, food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • Another object of the invention is a method for identifying an antagonist or agonist of desaturases, comprising
  • the candidate substance mentioned can be a chemically synthesized or microbiologically produced substance and can occur, for example, in cell extracts from, for example, plants, animals or microorganisms. Furthermore, although the substance mentioned may be known in the prior art, it has not hitherto been known to increase or represent the activity of the desaturases.
  • the reaction mixture can be a cell-free extract or can comprise a cell or cell culture.
  • Suitable methods are known in the art and are generally described in Alberts eg, molecular cular Biology the cell, 3rd Edition (1994), for example Chapter 17.
  • the substances mentioned can be injected, for example, be added to the reaction mixture or the culture medium or cells or sprayed on a plant.
  • a sample containing a substance active according to the method according to the invention has been identified, then it is either possible to isolate the substance directly from the original sample or the sample can be divided into different groups, e.g. if it consists of a large number of different components so as to reduce the number of different substances per sample and then to repeat the method according to the invention with such a "sub-sample" of the original sample.
  • the steps described above can be repeated several times, preferably until the sample identified according to the method according to the invention only comprises a small number of substances or only one substance.
  • the substance or derivative thereof identified according to the method according to the invention is preferably further formulated so that it is suitable for use in plant breeding or plant cell or tissue culture.
  • the substances that were tested and identified according to the method according to the invention can be: expression libraries, for example cDNA expression libraries, peptides, proteins, nucleic acids, antibodies, small organic substances, hormones, PNAs or the like (Milner, Nature Medicin 1 (1995 ), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 and references cited therein). These substances can also be functional derivatives or analogs of the known inhibitors or activators. Processes for the production of chemical derivatives or analogs are known to the person skilled in the art. The derivatives and analogues mentioned can be tested according to methods according to the prior art.
  • the cell or tissue that can be used for the method according to the invention is preferably a host cell, plant cell or a according to the invention Plant tissue as described in the above embodiments.
  • the present invention also relates to a substance which has been identified in accordance with the above methods according to the invention.
  • the substance is e.g. a homologue of the desaturases according to the invention.
  • Homologs of the desaturases can be obtained by mutagenesis, e.g. by point mutation or deletion of the desaturases.
  • the term "homolog" is used herein as a variant form of the desaturases, which acts as an agonist or antagonist for the activity of the desaturases.
  • An agonist can have substantially the same or a part of the biological activity of the desaturases.
  • An antagonist of the desaturases can inhibit one or more activities of the naturally occurring forms of the desaturases, e.g. competitively located on a downstream or upstream member of the fatty acid synthesis pathways which include, bind to, or bind to desaturases and thereby reduce or inhibit activity.
  • the present invention also relates to an antibody or a fragment thereof, as described herein, which inhibits the activity of the desaturases according to the invention.
  • the present invention relates to an antibody which specifically recognizes or binds the agonist or antagonist according to the invention described above.
  • compositions which comprises the antibody, the stop identified by the method according to the invention or the antisense molecule.
  • the present invention relates to a kit comprising the nucleic acid according to the invention, the gene construct according to the invention, the amino acid sequence according to the invention, the antisense nucleic acid molecule according to the invention, the antibody and / or composition according to the invention, an antagonist or agonist which was produced by the method according to the invention , and / or oils, lipids and / or fatty acids according to the invention or a fraction thereof.
  • the kit can also comprise the host cells, organisms, plants or parts thereof according to the invention, harvestable parts of the plants or propagation material according to the invention or else the antagonists or agonists according to the invention.
  • the components of the kit of the present invention can be packaged in suitable containers, for example with or in buffers or other solutions.
  • One or more of the components mentioned can be in one and packed in the same container. Additionally or alternatively, one or more of the components mentioned can be adsorbed, for example, on a solid surface, for example nitrocellulose filters, glass plates, chips, nylon membranes or microtiter plates.
  • the kit can be used for any of the methods and embodiments described herein, eg for the production of host cells, transgenic plants, for the detection of homologous sequences, for the identification of antagonists or agonists etc. Furthermore, the kit can provide instructions for the use of the kit for a of the applications mentioned.
  • Cloning processes such as restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, connection of DNA fragments, transformation of Escherichia coli and yeast cells, cultivation of bacteria and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as described in Sambrook et al.
  • the isolated nucleic acid sequences according to the invention are contained in the genome of a Phaeodactylum tricornutum UTEX646 strain, 15 which is available from the algae collection of the University of Texas, Austin.
  • Phaeodactylum tricornutum was cultivated at 25 ° C with a light / dark rhythm of 14:10 hours at 22 ° C and 35 microEinstein (corresponding to 20 micromol photons per square meter and second) in glass tubes which were aerated with air from below.
  • the culture medium for Phaeodactylum tricornutum was the f / 2 culture medium with 10% organic medium according to Guillard, R.R.L. 25 used (1975; Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In: Smith, W.L. and Chanley, M.H. (Eds.) Culture of marine Invertebrate animals, NY Plenum Press, pp. 29-60.): It contains
  • Trace element solution Na 2 EDTA (4.36 g / 1), FeCl 3 (3.15 g / 1), 35 Primary trace elements: CuS04 (10 g / 1), ZnS0 4 (22 g / 1), CoCl 2
  • 0.1 mg / 1 org medium Na acetate (1 g / 1), glucose (6 g / 1), Na succinate 40 (3 g / 1), bacto-tryptone (4 g / 1), yeast Extract (2 g / 1)
  • the details of the isolation of total DNA relate to the processing of plant material with a fresh weight of one gram.
  • CTAB buffer 2% (w / v) N-acetyl-N, N, N-trimethylammonium bromide (CTAB); 100 M Tris-HCl, pH 8.0; 1.4 M NaCl; 20mM EDTA. 10
  • N-lauryl sarcosine buffer 10% (w / v) N-lauryl sarcosine; 100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 20mM EDTA.
  • Phaeodactylum tricornutum cell material was under liquid
  • the DNA was treated with NaCl (1.2 M final concentration) and precipitated again at -70 ° C. for 30 min using twice the volume of absolute ethanol. After a washing step with 70% ethanol, the DNA was dried and then in 50 ml H 2 0 + RNAse (50 mg / ml
  • the DNA was dissolved overnight at 4 ° C. and the RNAse cleavage was then carried out at 37 ° C. for 1 hour. The DNA was stored at 4 ° C.
  • Example 3 Isolation of total RNA and poly (A) + RNA from 40 plants and Phaeodactylum tricornutum
  • RNA isolation from Phaeodactylum tricornutum is isolated according to a method described by Logemann et al (1987, Anal. Biochem. 163, 21).
  • the total RNA Protonema tissue can be obtained from moss by the GTC method (Reski et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352-359).
  • Frozen algae samples (- 70 ° C) were ground into fine powder in an ice-cold mortar under liquid nitrogen.
  • 2 volumes of homogenization medium (12.024 g sorbitol, 40.0 ml IM Tris-HCl, pH 9 (0.2 M); 12.0 ml 5 M NaCl (0.3 M), 8.0 ml 250 mM EDTA, 761, 0 mg EGTA, 40.0 ml 10% SDS were made up to 200 ml with H 2 0 and the pH was adjusted to 8.5) and 4 volumes of phenol with 0.2% mercaptoethanol were added at 40 to 50 ° C with good mixing frozen cell powder. Then 2 volumes of chloroform were added and the mixture was stirred vigorously for 15 min. It was centrifuged at 10,000 g for 10 min and the aqueous phase was extracted with phenol / chloroform (2 vol) and finally with chloroform.
  • the mixture was then centrifuged at 10,000 g for 30 min and the supernatant was sucked off. A washing step with 70% EtOH followed and centrifugation again.
  • the sediment was taken up in Tris-borate buffer (80 mM Tris-borate buffer, 10 mM EDTA, pH 7.0). Then the supernatant was mixed with 1/3 vol 8 M LiCl, mixed and incubated at 4 ° C. for 30 min. After centrifuging again, the sediment was washed with 70% ethanol, centrifuged and the sediment was dissolved in RNAse-free water.
  • Poly (A) + RNA was isolated using Dyna Beads (Dynal, Oslo, Finland) according to the instructions in the manufacturer's protocol.
  • RNA or poly (A) + RNA concentration After determining the RNA or poly (A) + RNA concentration, the RNA was precipitated by adding 1/10 volumes of 3 M sodium acetate, pH 4.6, and 2 volumes of ethanol and stored at -70 ° C.
  • RNA 20 ⁇ g RNA were separated in a 1.5% agarose gel containing formaldehyde and transferred to nylon membranes (Hybond, Amersham). The detection of specific transcripts was carried out as described in Amasino ((1986) Anal. Biochem. 152, 304)).
  • the first strand synthesis using reverse transcriptase from mouse leukemia virus (Röche, Mannheim, Germany) and oligo-d (T) primers the second strand synthesis obtained by incubation with DNA polymerase I, Klenow enzyme and cleavage with RNAse H at 'l2 ° C (2 hrs.), 16 ° C (1 hr.) and 22 ° C (1 hr.). The reaction was stopped by incubation at 65 ° C (10 min) and then transferred to ice. Double-stranded DNA molecules were blunt-ended with T4 DNA polymerase (Röche, Mannheim) at 37 ° C. (30 min).
  • the nucleotides were removed by phenol / chloroform extraction and Sephadex G50 centrifugation columns.
  • EcoRI / XhoI adapters (Pharmacia, Freiburg, Germany) were ligated to the cDNA ends using T4 DNA ligase (Röche, 12 ° C, overnight), cut with Xhol and by incubation with polynucleotide kinase (Röche, 37 ° C , 30 min) phosphorylated. This mixture was subjected to separation on a low-melting agarose gel.
  • DNA molecules over 300 base pairs were eluted from the gel, phenol extracted, concentrated on Elutip-D columns (Schleicher and Schüll, Dassel, Germany) and ligated to vector arms and in lambda-ZAP-Express phages using the Gigapack Gold -Kits (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands) packed using manufacturer's material and following its instructions.
  • cDNA banks as described in Example 4, were used for DNA sequencing by standard methods, in particular by the chain termination method using the ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-El er, Rothstadt, Germany).
  • the sequencing of random, isolated clones was carried out after the preparative plasmid extraction from cDNA libraries via in vivo mass excision and retransformation of DH10B on agar plates (details on material and protocol from Stratagene, Amsterdam, Netherlands). Plasmid DNA was obtained from overnight grown E. coli cultures grown in Luria broth with ampicillin (see Sambrook et al.
  • sequences were processed and annotated using the standard software package EST-MAX, which is commercially available from Bio-Max (Munich, Germany).
  • EST-MAX standard software package
  • SEQ ID NO: 8 The search sequence shown was searched for homologous genes using the BLAST program (Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.).
  • Two sequences from Phaeodactylum tricornutum with homologies to the search sequence from Physco-mitrella patens were characterized in more detail.
  • Example 5a Isolation of desaturases from Phaeodactylum tricornutum via polymerase chain reaction using degenerate oligonucleotides:
  • Oligonucleotide sequences with possible variations are shown below.
  • the amino acid from which the base combination can be derived is shown in the one-letter code below the oligonucleotide sequence.
  • a / G means that at this position in the synthesis of the building block either an A or a G is incorporated into the oligonucleotide in a statistically uniform distribution, since the base triplet derived from the corresponding amino acid can be either an AAA or an AAG.
  • the DNA sequence can also contain an inosine (i) if the determination of a base at this position allows three or four different bases based on the genetic code.
  • the following sequences and primers can be used:
  • F5a L: CA T / C TA T / C TGG AA A / G AA T / C CA G C
  • F5a_ L HYWKNQH / Q F6a: TTG TTG AAi A / CAA / G AA i CA T / C AA
  • the primers can be used in all combinations for polymerase chain reactions. With the aid of individual combinations, desaturase fragments could be isolated if the following conditions were taken into account: 10 nmol primers and 10 ng of a plasmid bank obtained by in vivo excision 0 were used for PCR reactions.
  • the plasmid bank was isolated from the phage bank according to the manufacturer's protocols (Stratagene).
  • the PCR reaction was carried out in a thermal cycler (Biometra) with the Pfu DNA polymerase (Stratagene) and the following temperature program: 3 min at 96 ° C, followed by 5 of 35 cycles with 30 s at 96 ° C, 30 s at 55 ° C and 1 min at 72 ° C.
  • the temperature of the additive was gradually reduced by 3 ° C after the first step of 55 ° C and after the fifth cycle a • annealing temperature of 40 ° C maintained. Finally, a cycle was carried out at 72 ° C. for 10 min and the batch was terminated by cooling to 4 ° C.
  • the primer combination F6a and R4a2 are underlined in the text and could be successfully used to isolate a desaturase fragment.
  • the resulting fragment could be verified by sequencing and showed homologies to a desaturase with the Genbank Accession No. T36617 from Streptomyces coelicolor. Homology was obtained using the BLASTP program. The comparison is shown in FIG. 4. Identities of 34% and homology of 43% to sequence T36617 were found.
  • the DNA fragment was used according to Example 7 in a hybridization experiment to isolate a full length gene according to standard conditions according to the invention.
  • the coding region of a DNA sequence thus isolated was obtained by translating the genetic code into a polypeptide sequence.
  • SEQ ID NO: 3 it is 1434 base pairs long
  • sequence shown that could be isolated by the described method.
  • the sequence has a start codon in position 1 to 3 and a stop codon in position 1432-1434 and could be translated into a 477 amino acid polypeptide.
  • WO 98 46763 By comparison with a gene sequence described in WO 98 46763, it was found that a non-identical but homologous fragment from Phaeodactylum tricornutum coding for 87 amino acids was previously described.
  • WO 98/46763 does not disclose a complete, functionally active desaturase, position or substrate specificity. This is also clear from the fact that homologies to ⁇ -5 and to ⁇ -6 desaturase from Mortierella alpina are reported without specifying an exact function.
  • the sequence according to the invention codes for a functionally active ⁇ -6-acyl lipid desaturase.
  • the result of the two est sequences found is shown in FIG. 1 and in FIG. 2 and in FIG. 2a.
  • the sequences found are part of the nucleic acids according to the invention from SEQ ID NO: 1 (name: Pt_des5, own database number of the inventors PT001078032R), SEQ ID NO: 5 (name: Pt_desl2, own database number of the inventors PT0010070010R) and SEQ ID NO: 11 (name: Pt_desl2.2, own database of the inventor PT001072031R).
  • Letters indicate identical amino acids, while the plus sign means a chemically similar amino acid.
  • the identities or homologies of all sequences found according to the invention are summarized in Table 2.
  • Desaturases can have cytochrome b5 domains that also occur in other genes that do not code for desaturases. Cytochrome b5 domains therefore show high homologies, even though they are different gene functions. Desaturases of weakly conserved areas can only be identified as putative candidate genes and must be checked for the enzyme activity and position specificity of the enzymatic function. For example, various hydroxylases, acetylenases and epoxygenases similar to desaturases show histidine box motifs, so that a specific function has to be verified experimentally and, in addition, the verification of the double bond enables safe enzyme activity and position specificity of a desaturase.
  • ⁇ -6 and ⁇ -5 desaturase according to the invention have particularly suitable substrate specificities and are particularly suitable for use in combination with a ⁇ -6 elongase from Physcomitrella for the production of polyunsaturated fatty acids such as arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid can.
  • Sequencing of the complete cDNA fragment from clone PT001078032R resulted in a 1652 base pair sequence.
  • the sequence codes for a polypeptide of 469 amino acids shown in SEQ ID NO: 2. This was obtained by translating the genetic code from SEQ ID NO: 1 with a start codon in base pair position ' 115-117 and with a stop codon in base pair position 1522- 1524th
  • the clone contains a complete desaturase polypeptide, as can be seen from the sequence comparison in FIG. 3.
  • Dashes mean identical amino acids, while colons and single points represent chemically interchangeable, ie chemically equivalent, amino acids.
  • FIG. 6 and FIG. 7 show the comparison of the MA_desl2 peptide sequence with the sequences found.
  • Sequencing the complete cDNA fragment from clone PT0010070010R resulted in a 1651 base pair sequence shown in SEQ ID NO: 5 with a start codon in position 67-69 and a stop codon in position 1552-1554.
  • the polypeptide sequence according to the invention is shown in SEQ ID NO: 6.
  • Fragment from clone PT0010072031R resulted in a 1526 base pair sequence shown in SEQ ID NO: 11 with a start codon in position 92-94 and a stop codon in position 1400-1402.
  • the polypeptide sequence according to the invention is shown in SEQ ID NO: 12.
  • Table 2 shows the identities and homologies of desaturases according to the invention with one another and with the desaturase from Physcomitrella patens and Mortierella alpina. The information was obtained using the Bestfit program under given parameters as defined below as a sub-program of the following software: Wisconsin Package Version 10.0 (Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc, USA). Henikoff, S. and Henikoff, J.G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Be. USA 89: 10915-10919.
  • FIG. 5 also shows the comparison of the ⁇ -6-acyl lipid desaturase from Physcomitrella patens with the polypeptide sequence of the clone Pt_des6.
  • Table 2A Homologs with the highest sequence homologies or identities to polypeptide sequences according to the invention from SEQ ID NO. 2, 4, 6 or 12
  • Gene sequences can be used to identify homologous or heterologous genes from cDNA or genomic banks.
  • Homologous genes ie full-length cDNA clones that are homologous or homologs
  • cDNA libraries in particular for the isolation of functionally active full-length genes which can be shown in SEQ ID NO: 3 the method can be used.
  • 100,000 to 1,000,000 recombinant bacteriophages are plated and transferred to a nylon membrane. After denaturing with alkali, the DNA was immobilized on the membrane, for example by UV crosslinking. Hybridization takes place under highly stringent conditions.
  • Hybridization probes were, for example, labeled by means of radioactive ( 32 P) nick transcription (high prime, Röche, Mannheim, Germany). The signals are detected by means of autoradiography.
  • Partially homologous or heterologous genes which are related but not identical, can be identified analogously to the method described above using low-stringent hybridization and washing conditions.
  • the ionic strength was usually kept at 1 M NaCl, the temperature being gradually lowered from 68 to 42 ° C.
  • Radioactively labeled oligonucleotides are produced by phosphorylating the 5 'end of two complementary oligonucleotides with T4 polynucleotide kinase.
  • the complementary oligonucleotides are hybridized to one another and ligated so that concatemers are formed.
  • the double-stranded concatems are radioactively marked, for example, by nick transcription.
  • Hybridization is usually carried out under low-stringent conditions using high oligonucleotide concentrations.
  • CDNA sequences were used to produce recombinant protein, for example in E. coli (e.g. Qiagen QIAexpress pQE system).
  • the recombinant proteins were then usually affinity purified via Ni-NTA affinity chromatography (Qiagen).
  • the recombinant proteins were then used, for example, to produce specific antibodies
  • 15 expression cDNA libraries can be used by immunological screening (Sambrook, J., et al. (1989), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Ausubel, FM, et al. ( 1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
  • Agrobacterium-mediated plant transformation can be performed, for example, using GV3101- (pMP90-) (Koncz and Schell, 25 Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383-396) or LBA4404- (Clontech) or C58C1 pGV2260 (Deblaere et al 1984, Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788) Agrobacterium tumefaciens strain.
  • the transformation can be carried out using standard transformation techniques (also Deblaere et al. 1984).
  • Agrobacterium-mediated plant transformation can be performed using standard transformation and regeneration
  • rape can be transformed using cotyledon or hypocotyl transformation (Moloney et al., Plant Cell 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 45 694-701).
  • the use of antibiotics for Agrobacterium and plant selection depends on the binary vector and Agrobacterium strain used for the transformation.
  • the Rapeseed selection is usually carried out using kanamycin as a selectable plant marker.
  • Agrobacterium -mediated gene transfer in linseed can be carried out using, for example, one of Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13: 282-285 perform the technique described.
  • soy can be carried out using, for example, a technique described in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) or in EP-A-0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo) ,
  • Binary vectors such as pBinAR can be used for plant transformation
  • the binary vectors can be constructed by ligating the cDNA in sense or antisense orientation in T-DNA. 5 'of the cDNA, a plant promoter activates the transcription of the cDNA. A polyadenylation sequence is located 3 'from the cDNA.
  • the binary vectors can carry different marker genes. For example, resistance can be expressed by expressing the nptll marker gene under the control of the 35S or the nos promoter.
  • nptll marker gene coding for kanamycin resistance mediated by neomycin phosphotransferase can be exchanged for the herbicide-resistant form of an acetolactate synthase gene (AHAS or ALS).
  • the ALS gene is described in Ott et al., J. Mol. Biol. 1996, 263: 359-360.
  • the use of the hygromycin resistance gene is also suitable for some plants.
  • the v-ATPase-cl promoter can be cloned into the plasmid pBin19 or pGPTV and can be used for the marker gene expression by cloning in front of the coding region of the ALS gene.
  • the v-ATPase-cl promoter mentioned corresponds to a 1153 base pair fragment from Beta vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39: 463-475).
  • the nos promoter mentioned here both sulfonylureas and imidazolinones such as imazethapyr or sulfonylureas can be used as antimetabolites for selection. the.
  • the nos promoter can also be used for the marker gene expression.
  • Example 12 Determination of suitable promoters for expression in linseed
  • Tissue-specific expression can be achieved using a tissue-specific promoter.
  • seed-specific expression can be achieved by using the DC3-
  • any other seed-specific promoter element such as the Napin or Arcelin promoter (Goosens et al. 1999, Plant Phys. 120 (4): 1095-1103 and Gerhardt et al. 2000, Biochimica et Biophysica Acta 1490 (1-2): 87-98)
  • the CaMV-35S promoter or a v-ATPase-cl promoter can be used for constitutive expression in the whole plant.
  • the bacterial 25 ⁇ -glucuronidase (GUS) may be mentioned as an example of a reporter gene (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).
  • the ⁇ -glucuronidase activity can be determined in situ using a chromogenic substrate such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid as part of an activity staining (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 30 387 -405).
  • a chromogenic substrate such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid as part of an activity staining (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 30 387 -405).
  • a chromogenic substrate such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid as part of an activity staining (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5,
  • MUG 4-methyl-umbelliferyl-beta-D-glucuronide
  • MU methyl-umbelliferone
  • a protein extract of the desired tissue is first produced, to which the substrate of the GUS is then added.
  • a calibration series was prepared which contained concentrations of 0.1 mM to 10 mM MU (4-methyl-umbelliferone). If the sample values were outside these concentrations, less protein extract was used (10 ml, 1 ml, 1 ml from 1:10 dilution) and shorter time intervals were measured (0 h, 30 min, 1 h). The measurement was carried out with an exitation of 365 nm and an emission of 445 nm in a Fluoroscan II device (lab system).
  • the substrate cleavage can be monitored fluorometrically under alkaline conditions (excitation at 365 nm, measurement of the emission at 455 nm; SpectroFluorimeter BMG Polarstar +) as described in Bustos MM et al., 1989 Plant Cell 1: 839-853. All samples were subjected to a protein concentration determination according to Bradford (1976) in order to allow a statement about the promoter activity and strength in different tissues and plants.
  • reporter genes examples which may be the green fluorescent protein (GFP) and its derivatives called (C.Reichel et al. (1996) Proc.Natl.Acad. Sei.USA 93, from 5888 to 5893 and J. Sheen et al., (1995) Plant Journal 8, 777-784) and various luciferases (A.Millar et al. (1992) Plant Mol. Biol. Reporter 10, 324-414).
  • GFP green fluorescent protein
  • C.Reichel et al. (1996) Proc.Natl.Acad. Sei.USA 93, from 5888 to 5893 and J. Sheen et al., (1995) Plant Journal 8, 777-784) and various luciferases (A.Millar et al. (1992) Plant Mol. Biol. Reporter 10, 324-414).
  • the Talking detection methods are known to those skilled in the art and described, for example, the literature mentioned.
  • promoter-reporter gene constructs for the above promoters are given below. Fragments of these promoters can be isolated using the polymerase chain reaction and tailored with flanking sequences of your choice based on synthetic oligonucleotides.
  • oligonucleotides can be used, for example:
  • LeB4 front GAAAGCTTCTCGAGTTATGCATTTCTT
  • LeB4 rear GGGTCTAGATCTGTGACTGTGATAG
  • DC3a front AGTGGATCCCCGAGCTAACCACAACT DC3a rear: ATAAGCTTTTTCTTTGGCAGA napinvorne: GAAATACTTACAAACGGATAChinctacatac
  • the promoter fragments are amplified by PCR, cut with suitable restriction enzymes and cloned into the above cassettes.
  • the LeB4 (700) -PCR fragment is cut with Xbal and Hindlll and cloned into the vector pGPTV in the Hindlll and Xbal sites 5 'in front of the GUS reporter gene.
  • the PCR-amplified DC3 promoter fragment can be cut with BamHI and HindIII, for example subcloned into pBluescript (Stratagene) * and then cloned into suitable interfaces in pGPTV in front of the GUS reporter gene.
  • a nanoprotectant fragment PCR-amplified with the above primers and having a size of 1055 bp after digestion with HindIII and Xbal in pGPTV can be cloned in front of the GUS reporter gene.
  • An equivalent construct could be a napin promoter fragment of 11OObp 5 'cloned in front of a GUS reporter gene with intron with a 3 * • subsequent Nos terminator in a pHL9000 vector (Hausmann & Tmür, 1999).
  • the GUS activity can be measured in transgenic flax embryos of various ages that have been transformed with one of the following constructs: Napin-GUS, 35S-GUS, LeB4- CIS, USP-CIS.
  • the values are mean values from one to five measurements with different a lot of protein. Three embryos per construct were analyzed quantitatively.
  • the Napin promoter from Brassica napus was found to be two to three orders of magnitude less active than the two promoters from Vicia faba (LeB4 and USP).
  • GUS activity increased in the order of Napin, LeB4 and USP.
  • the positive control 35S moved in its activity between LeB4 and USP, whereas the negative control, the non-transformed wild type (Flanders variety), had practically no activity.
  • the following table shows the mean values of the activities in the individual age stages and overall for each construct.
  • Table 3.4 Overview of the mean GUS activities of flax embryos, transformed with different GUS constructs. daf: days after flowering begins.
  • Binary vectors such as pBinAR (Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) or pGPTV (Becker et al 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197) or derivatives thereof can be used for plant transformation.
  • the binary vectors can be constructed by ligating the cDNA in sense or antisense orientation in T-DNA. 5 'of the cDNA, a plant promoter activates the transcription of the cDNA. A polyadenylation sequence is located 3 'from the cDNA.
  • the binary vectors can carry different marker genes.
  • nptII marker gene coding for kanamycin resistance can be mediated can be replaced by neomycin phosphotransferase for the herbicide-resistant form of an acetolactate synthase gene (abbreviation: AHAS or ALS).
  • AHAS acetolactate synthase gene
  • the ALS gene is described in Ott et al. , J. Mol. Biol. 1996, 263: 359-360.
  • the v-ATPase-cl promoter can be cloned into the plasmid pBin19 or pGPTV and used for the marker gene expression by cloning in front of the ALS coding region.
  • the promoter mentioned corresponds to a 1153 base pair fragment from beta-Vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39: 463-475). Both sulphonylureas and imidazolinones such as imazethapyr or sulphonylureas can be used as antimetabolites for selection.
  • Tissue-specific expression can be achieved using a tissue-specific promoter.
  • seed-specific expression can be achieved by cloning the DC3 or the LeB4 or the USP promoter or the phaseolin promoter 5 'of the cDNA. Any other seed-specific promoter element such as the Napin or Arcelin promoter Goossens et al. 1999, Plant Phys. 120 (4): 1095-1103 and Gerhardt et al. 2000, Biochimica et Biophysica Acta 1490 (1-2): 87-98) can be used.
  • the CaMV-35S promoter or a v-ATPase Cl promoter can be used for constitutive expression in the whole plant.
  • genes coding for desaturases and elongases can be cloned in succession into a binary vector by constructing several expression cassettes in order to simulate the metabolic pathway in plants.
  • the protein to be expressed can be directed into a cellular compartment using a signal peptide, for example for plastids, mitochondria or the endoplasmic reticulum (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423).
  • the signal peptide is cloned 5 'in frame with the cDNA in order to achieve the subcellular localization of the fusion protein.
  • Expression cassettes consist of at least two functional units such as a promoter and a terminator. Further desired gene sequences such as targeting sequences, coding regions of genes or parts thereof, etc. can be inserted between the promoter and terminator.
  • promoters and terminators USP promoter: Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67
  • OCS terminator Gielen et al. EMBO J. 3 (1984) 835ff.
  • oligonucleotides can be used, for example: USP1 front: CCGGAATTCGGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA USP2 front: CCGGAATTCGGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA USP3 front: CCGGAATTCGGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA USP1 back: AAAACTGCAGGCGGCCGCCCACCGCGGTGGGCTGGCTATGAAGAAATT USP2 back: CGCGGATCCGCTGGCTATGAAGAAATT
  • USP3 rear TCCCCCGGGATCGATGCCGGCAGATCTGCTGGCTATGAAGAAATT 0CS1 front: AAAACTGCAGTCTAGAAGGCCTCCTGCTTTAATGAGATAT OCS2 front: CGCGGATCCGATATCGGGCCCATCTAGCGTTAACCCCCTGCTTTAATGAGAGCGTTAACCCTGCTTGATGAGAGAGGGTCCATGAGG
  • 0CS1 rear CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA
  • OCS2 rear CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA
  • 0CS3 rear CCCAAGCTTGGCTCGGGGGAGCGGGTCGAGA
  • a promoter and a terminator are amplified via PCR. Then the terminator is cloned into a recipient plasmid and in a second step the promoter is inserted in front of the terminator. An expression cassette on a carrier plasmid is thus obtained.
  • the plasmids pUT1, pUT2 and pUT3 are created on the basis of the plasmid pUCl9.
  • the constructs are defined in SEQ ID NO: 13, 14 and 15. They contain the USP promoter and the OCS terminator based on pUCl9.
  • the construct PÜT12 is created by cutting pUTl using Sall / Scal and pUT2 using Xhol / Scal. The fragments containing the expression cassettes are ligated and transformed into E. coli XLI blue MRF. After separating ampicillin-resistant colonies, DNA is prepared and those clones which contain two expression cassettes are identified by restriction analysis. The Xhol / Sall ligation of compatible ends has eliminated the two interfaces Xhol ' and Sall between the expression cassettes.
  • plasmid pUTl2 which is defined in SEQ ID NO: 16.
  • pUTl2 is cut again using Sal / Scal and pUT3 is cut using Xhol / Scal.
  • the fragments containing the expression cassettes are ligated and transformed into E. coli XLI blue MRF.
  • DNA is prepared and identified by restriction analysis those clones which contain three expression cassettes. In this way, a set of multi-expression cassettes is created that can be used for the insertion of the desired DNA and is described in Table 3 and can also accommodate further expression cassettes.
  • the DC3 promoter is described in Thomas, Plant Cell 1996, 263: 359-368 and consists only of the region -117 to +27 which is why it is one of the smallest known seed-specific promoters.
  • Fragments of these promoters can be isolated using the polymerase chain reaction and tailored with flanking sequences of your choice based on synthetic oligonucleotides.
  • oligonucleotides can be used, for example: LeB4 front: GAAAGCTTCTCGAGTTATGCATTTCTT LeB4 rear: GGGTCTAGATCTGTGACTGTGATAG DC3a front: CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAG DC3a rear: CGCGGATCCTAGCTTTTTCTTGGCAGATG
  • the promoter fragments are amplified by PCR, cut with suitable restriction enzymes and cloned into the above cassettes.
  • the LeB4 (700) PCR fragment is cut with Xhol and BglII and inserted into the Xhol and BglII sites of the plasmid pUT3 to obtain pLT3.
  • Advantageous expression cassettes contain, based on pUCl9 (Vieira and Messing (1982); Gene 19, 259), the SEQ ID NO: 32, the LeB4 promoter and the sequences SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO : 35.
  • the construct pLTl2 is created on the basis of these plasmids by cutting pUTl using Sall / Scal and pUT2 using Xhol / Scal.
  • the fragments containing the expression cassettes are ligated and transformed into E. coli XLI blue MRF. After separation of ampicillin-resistant colonies, DNA is prepared and those clones which contain two expression cassettes are identified by restriction analysis.
  • the Xhol / Sall ligation of compatible ends has eliminated the two interfaces Xhol and Sall between the expression cassettes.
  • the result is the plasmid pUTl2, which is defined in SEQ ID NO: 16.
  • pUT12 is cut again using Sal / Scal and pUT3 cut using Xhol / Scal.
  • the fragments containing the expression cassettes are ligated and transformed into E. coli XLI blue MRF.
  • DNA is prepared and those clones which contain three expression cassettes are identified by restriction analysis. In this way, a selection of multi-expression cassettes is created which can be used for the insertion of desired DNA and is described in Table 3 and can also accommodate other expression cassettes.
  • the expression cassettes can contain the same promoter several times or can be constructed using three different promoters.
  • Table 4 Multiple expression cassettes
  • Phaseolin promoter (Bustos et al. (1989) Plant Cell 1,839-853) or using the
  • Multi-expression cassettes can be inserted using Ascl directly from pUC19 derivatives from Table 3 into the vector pGPTV + AscI (see iii.)) Via the Ascl interface and are available for inserting target genes.
  • the corresponding gene constructs (pBUTl is in SEQUENCE ID NO: 20, pBUT2 is in SEQUENCE ID NO: 21, pBUT 3 is in SEQUENCE ID NO: 22, pBUTl2 is in SEQUENCE ID NO: 22 and pBUTl23 is shown in SEQUENCE ID NO: 24 ) are available according to the invention as a kit.
  • gene sequences can be inserted into the pUC19-based expression cassettes and used as Ascl fragments in pGPTV + AscI.
  • the D-6 elongase Pp_PSEl is first inserted into the first cassette via BstXI and Xbal. Then the D-6 desaturase from moss (Pp_des6) is inserted into the second cassette via BamHI / Nael.
  • the construct pUT-ED is produced.
  • the Ascl fragment from the plasmid pUT-ED is inserted into the vector pGPTV + AscI cut with Ascl and the orientation of the inserted fragment is determined by means of restriction or sequencing.
  • the plasmid pB-DHGLA is formed, the complete sequence of which is shown in SEQUENCE ID NO. 25 is shown.
  • the coding region of the Physcomitrella delta 6 elongase is in SEQUENCE ID NO. 26 shown that the delta 6 desaturase from Physcomitrella in SEQUENCE ID NO: 27.
  • the ⁇ -6 elongase Pp_PSEl is first inserted into the first cassette via BstXI and Xbal. Then the ⁇ -6-desaturase from moss (Pp_des6) is inserted into the second cassette via BamHI / Nael and finally the ⁇ -5-desaturase from Phaeodactylum (Pt_des5) is inserted into the third cassette via BglII.
  • the triple construct is given the name pARAl. Taking into account sequence-specific restriction interfaces, further expression cassettes according to Table 5 with the designation pARA2, pARA3 and pARA4 can be created.
  • the Ascl fragment from the plasmid pARAl is inserted into the vector pGPTV + AscI cut with Ascl and the orientation of the inserted fragment is determined by means of restriction or sequencing.
  • the complete sequence of the resulting plasmid pBARAl is in SEQUENCE ID NO. 28 shown.
  • the coding region of the Physcomitrella delta 6 elongase is in SEQUENCE ID NO. 29 shown that the delta 6 desaturase from Physcomitrella in SEQUENCE ID NO: 30 and that of the delta-5 desaturase from Phaeodactylum tricornutum in SEQUENCE ID NO: 31.
  • Plasmids 1 to 5 are pUC derivatives, plasmids 6 to 7 are binary plant transformation vectors
  • Pp Physcomitrella patens
  • Pt Phaeodactylum tricornutum
  • Pp_PSEl corresponds to the sequence from SEQ ID NO: 9.
  • PSE PUFA specific ⁇ -6 elongase
  • Ce_des5 ⁇ -5 desaturase from Caenorhabditis elegans (Genbank Acc.
  • Ce_des6 ⁇ -6 desaturase from Caenorhabditis elegans elegans
  • Ce_PSEl ⁇ -6-elongase from Caenorhabditis elegans (Genbank Acc.
  • Chimeric gene constructs based on those described in pUC19 can be inserted into the binary vector pGPTV using Ascl.
  • the multiple cloning sequence is extended by an Ascl interface.
  • the polylinker is newly synthesized as two double-stranded oligonucleotides, with an additional Ascl DNA sequence being inserted.
  • the oligonucleotide is inserted into the vector pGPTV using EcoRI and HindIII.
  • the plasmid pGPTV + AscI is formed.
  • the necessary cloning techniques are known to the person skilled in the art and can simply be read as described in Example 1.
  • Example 14 In vivo mutagenesis
  • the in vivo mutagenesis of microorganisms can be accomplished by passing the plasmid (or other vector) DNA through E. coli or other microorganisms (e.g. Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae), in which the skills, the integrity of their genetic Maintain information, is disturbed, take place.
  • E. coli or other microorganisms e.g. Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae
  • Common mutator strains have mutations in the genes for the DNA repair system (e.g. utHLS, mutD, mutT, etc.; for a literature reference see Rupp, WD (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, pp. 2277-2294, ASM: Washington). These strains are known to the person skilled in the art. The use of these strains is explained, for example, in Greener, A. and Callahan, M. (1994
  • Transgenic plants are created according to various examples in the example part of this document.
  • Example 15 Examination of the expression of a recombinant gene product in a transformed organism
  • the activity of a recombinant gene product in the transformed host organism can be measured at the transcription and / or the translation level.
  • a suitable method for determining the amount of transcription of the gene is to carry out a Northern blot as outlined below (for reference see Ausubel et al. (1988 ) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, or the example section mentioned above), wherein a primer which is designed in such a way that it binds to the gene of interest is labeled with a detectable label (usually radioactive or chemilumescence), so that when the total RNA of a culture of the organism is extracted, separated on a gel, transferred to a stable matrix and incubated with this probe, the binding and extent of binding of the probe are the presence and also the amount of mRNA therefor Gene indicates.
  • a detectable label usually radioactive or chemilumescence
  • Total cellular RNA can be derived from cells, tissues, or organs by several methods, all of which are known in the art, such as that of Bormann, ER, et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
  • RNA hybridization 20 ⁇ g of total RNA or 1 ⁇ g of poly (A) + RNA were analyzed by gel electrophoresis in agarose gels with a strength of 1.25% using formaldehyde, as described in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152 , 304) separated, transferred by capillary attraction using 10 x SSC to positively charged nylon membranes (Hybond N +, Amersham, Braunschweig), immobilized by means of UV light and 3 hours at 68 ° C. using hybridization buffer
  • the DNA probe was labeled with the Highprime DNA labeling kit (Röche, Mannheim, Germany) during the pre-hybridization using alpha- 32 P-dCTP (Amersham, Braunschweig, Germany).
  • the hybridization was carried out after adding the labeled DNA probe in the same buffer at 68 ° C. overnight.
  • the washing steps were carried out twice for 15 min using 2 X SSC and twice for 30 min using 1 X SSC, 1% SDS, at 68 ° C.
  • the exposure of the closed filter was carried out at -70 ° C for a period of 1 to 14 T.
  • Standard techniques such as a Western blot can be used to examine the presence or relative amount of protein translated from this mRNA (see, for example, Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).
  • the total cellular proteins are extracted, separated by gel electrophoresis, transferred to a matrix, such as nitrocellulose, and incubated with a probe, such as an antibody, which specifically binds to the desired protein.
  • This probe is usually provided with a chemiluminescent or colorimetric label that is easy to detect. The presence and amount of the label observed indicates the presence and amount of the desired mutant protein present in the cell.
  • Example 16 Analysis of the effect of the recombinant proteins on the production of the desired product
  • the effect of genetic modification in plants, fungi, algae, ciliates or on the production of a desired compound can be determined by growing the modified microorganisms or the modified plant under suitable conditions (such as those described above) and that Medium and / or the cellular components for the increased production of the desired product (ie lipids or a fatty acid) is examined.
  • This analysis Techniques are known to the person skilled in the art and include spectroscopy, thin-layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods and analytical chromatography, such as high-performance liquid chromatography (see for example Ullman, Encyclopedia of Industrial
  • the analysis methods include measurements of the amounts of nutrients in the medium (e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions), measurements of the biomass composition and growth, analysis of the production of common metabolites of biosynthetic pathways and measurements of gases that are generated during fermentation. Standard procedures for these measurements are in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, PM Rhodes and PF Stanbury, eds., IRL Press, pp. 103-129; 131-163 and 165-192 (ISBN: 0199635773) and the references cited therein.
  • nutrients in the medium e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions
  • fatty acids abbreviations: FAME, fatty acid methyl ester; GC-MS, gas-liquid chromatography-mass spectrometry; TAG, triacylglycerol; TLC, thin-layer chromatography.
  • the unambiguous evidence for the presence of fatty acid products can be obtained by analysis of recombinant organisms according to standard analysis methods: GC, GC-MS or TLC, as described variously by Christie and the references therein (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Fourth Ed .: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, gas chromatography-mass spectrometry method, lipids 33: 343-353).
  • the material to be analyzed can be broken up by ultrasound treatment, glass mill grinding, liquid nitrogen and grinding, or other applicable methods.
  • the material must be centrifuged after breaking up.
  • the sediment is in aqua dest. resuspended, heated at 100 ° C for 10 min, cooled on ice and centrifuged again, followed by extraction in 0.5 M sulfuric acid in methanol with 2% dimethoxypropane for 1 hour at 90 ° C, which leads to hydrolyzed oil and lipid compounds, which result in transmethylated lipids.
  • fatty acid methyl esters are extracted into petroleum ether and finally subjected to GC analysis using a capillary column (chrome pack, WCOT fused silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0.32 mm) at a temperature gradient between 170 ° C and 240 ° C for Subjected for 20 min and 5 min at 240 ° C.
  • the identity of the fatty acid methyl esters obtained must be defined using standards available from commercial sources (i.e. Sigma).
  • the Escherichia coli strain XLI Blue MRF 'kan (Stratagene) was used for subcloning the new desaturase pPDesaturasel from Physcomitrella patens.
  • the Saccharomyces cerevisiae strain INVSc 1 (Invitrogen Co.) for the functional expression of this gene.
  • E. coli was cultivated in Luria Bertini broth (LB, Duchefa, Haarlem, the Netherlands) at 37 ° C. If necessary, ampicillin (100 mg / liter) was added and 1.5% agar (w / v) was added for LB solid media. S.
  • cerevisiae was at 30 ° C either in YPG medium or in complete minimal medium without uracil (CMdum; see in: Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE, Moore, DD, Seidan, JG, Smith, JA, Struhl, K., Albright, LB, Coen, DM, and Varki, A. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) cultivated with either 2% (w / v) raffinose or glucose. For solid media, 2% (w / v) Bacto TM agar (Difco) was added. The plasmids used for cloning and expression are pUCl8 (Pharmacia) and pYES2 (Invitrogen Co.).
  • the Phaeodactylum tricornutum cDNA clones from Seq ID NO: 1, 3, 5 or 11 or the sequences from SEQ ID NO: 7 or 9 or other desired sequences were first modified so that only the coding region was used Polymerase chain reaction can be amplified with the help of two oligonucleotides. Care was taken to ensure that a consensus sequence was followed before the start odon for efficient translation. Either the base sequence ATA or AAA was chosen and inserted into the sequence before the ATG (Kozak, M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes, Cell 44, 283-292).
  • a restriction interface was also introduced, which must be compatible with the interface of the target vector into which the fragment is to be cloned and with the aid of which gene expression in microorganisms or plants is to take place.
  • the PCR reaction was carried out using plasmid DNA as a template in a thermal cycler (Biometra) with the Pfu-DNA (Stratagene) polymerase and the following temperature program: 3 min at 6 ° C, followed by 30 cycles at 30 ° at 96 ° C, 30 s at 55 ° C and 2 min at 72 ° C, 1 cycle with 10 min at 72 ° C and stop at 4 ° C.
  • the annealing temperature was varied depending on the oligonucleotides chosen.
  • a synthesis time of about one minute can be assumed for each kilobase pair of DNA.
  • Other parameters which influence the PCR such as Mg ions, salt, DNA polymerase etc., are familiar to the person skilled in the art in the field and can be varied as required.
  • the correct size of the amplified DNA fragment was confirmed by agarose TBE gel electrophoresis.
  • the amplified DNA was extracted from the gel with the QIA uick gel extraction kit (QIAGEN) and ligated into the Smal restriction site of the dephosphorylated vector pUCl ⁇ using the Sure Clone Ligation Kit (Pharmacia), whereby the pUC derivatives were obtained.
  • QIAGEN QIA uick gel extraction kit
  • Sure Clone Ligation Kit Pharmacia
  • BioTechniques 4, 310-313) performed on ampicillin-resistant transformants, and positive clones identified by means of BamHI restriction analysis. The sequence of the cloned PCR product was confirmed by resequencing using the ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Rothstadt).
  • the PCR fragment (1428bp) was cloned into pUC 18 using the Sure Clone Kit (Pharmacia), the inserted fragment Sacl / Xhol was digested and the fragment was inserted into pYES2 or pYES6 using appropriate restriction sites.
  • the PCR fragment (1505bp) was cloned into pUC 18 using the Sure Clone 10 kit (Pharmacia), the inserted fragment BamHI / XhoI digested and the fragment inserted into pYES2 or pYES6 using appropriate restriction sites.
  • the plasmid DNA was matched with restriction enzyme (s)
  • Saccharomyces cerevisiae INVScl was transformed with the pYES derivatives and pYES empty vector using a PEG / lithium acetate protocol (Ausubel et al., 1995). After selection on CMdum agar plates with 2% glucose, pYES derivatives
  • CMdum liquid medium without uracil but with 2% raffinose and 1% (vol. / Vol.) Tergitol NP-40 with fatty acid substrates were enriched to a final concentration of 0.003% (wt. / Vol.).
  • the media were inoculated with the precultures to an ODgoo of 0.05.
  • Expression was induced at an ODgoo of 0.2 with 2% (w / v) galactose for 16 hours, after which the cultures were harvested to an ODgoo of 0.8-1.2.
  • the total fatty acids were extracted from yeast cultures and analyzed by gas chromatography. Cells from 5 ml of culture were harvested by centrifugation (1000 ⁇ g, 10 min, 4 ° C.) and washed once with 100 mM NaHC0 3 , pH 8.0, in order to remove residual medium and fatty acids. To produce the fatty acid methyl ester (FAMES or Singular FAME), the cell sediments were treated with 1 M methanolic HS0 4 and 2% (vol. / Vol.) Dimethoxypropane for 1 hour at 80 ° C.
  • FAME fatty acid methyl ester
  • the FAMES were extracted twice with 2 ml of petroleum ether, once with 100 mM NaHC0 3 , pH 8.0, and once with distilled water and dried with NaS0 4 .
  • the organic solvent was evaporated under a stream of argon and the FAMES were dissolved in 50 microliters of petroleum ether.
  • the samples were separated on a ZEBRON-ZB-Wax capillary column (30 m, 0.32 mm, 0.25 micron; Phenomenex) in a Hewlett Packard 6850 gas chromatograph with a flame ionization detector.
  • the oven temperature was raised from 70 ° C (hold 1 min) to 200 ° C at a rate of 20 ° C / min, then to 250 ° C (hold 5 min) at a rate of 5 ° C / min and finally to 260 ° C programmed at a rate of 5 ° C / min.
  • Nitrogen was used as the carrier gas (4.5 ml / min at 70 ° C).
  • the fatty acids were identified by comparison with retention times of FAME standards (SIGMA).
  • the figures represent mol% fatty acids of cis fatty acids.
  • linoleic acid 20: 3 25 ⁇ -5, 11, 14-fatty acid, alpha or gamma linolenic acid, stearidonic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid etc.
  • fatty acids alone or in combination (e.g. linoleic acid, 20: 3 25 ⁇ -5, 11, 14-fatty acid, alpha or gamma linolenic acid, stearidonic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid etc.) can be used to confirm the substrate specificity in more detail and selectivity of these desaturases can be carried out.
  • the desired product can be obtained from plant material or fungi, algae, ciliates, animal cells or from the supernatant of the cultures described above by various methods known in the art. If the desired product is not secreted from the cells, the cells can be harvested from the culture by slow centrifugation, the cells can be lysed by standard techniques such as mechanical force or ultrasound treatment. Organs of plants can be mechanically separated from other tissues or other organs. After homogenization, the cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction containing the soluble proteins is saved for further purification of the desired compound. If the product is secreted from desired cells, the cells are removed from the culture by slow centrifugation and the supernatant fraction is saved for further purification.
  • the supernatant fraction from each purification process is subjected to chromatography with an appropriate resin, either with the desired molecule retained on the chromatography resin but not many contaminants in the sample, or the contaminants remaining on the resin but not leaving the sample. These chromatography steps can be repeated if necessary using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is skilled in the selection of suitable chromatography resins and their most effective application for a particular molecule to be purified.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum. A wide range of cleaning methods are known in the art and the above cleaning method is not intended to be limiting. These purification processes are described, for example, in Bailey, JE, & Ollis, DF, Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).
  • the identity and purity of the isolated compounds can be determined by standard techniques in the art. These include high-performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin-layer chromatography, in particular thin-layer chromatography and flame ionization detection (IATROSCAN, Iatron, Tokyo, Japan), NIRS, enzyme test or microbiological.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • spectroscopic methods staining methods
  • thin-layer chromatography in particular thin-layer chromatography and flame ionization detection
  • IATROSCAN flame ionization detection
  • Iatron Iatron, Tokyo, Japan
  • NIRS enzyme test or microbiological.
  • An overview of these analysis methods can be found in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-

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Abstract

Die Erfindung betrifft Expressionskassetten, deren Kombination und Vektoren enthaltend die Expressionskassetten, die pflanzliche Promotoren mit einer Expressionsspezifität für pflanzliche Samen insbesondere Leinsamen enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressionskassetten oder Vektoren zur rekombinanten Expression heterologer Gene in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben als Nahrungs-, Futtermittel oder Saatgut, Pharmazeutika, Feinchemikalien oder als industrieller Grundstoff.

Description

Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Expressionskassetten, deren Kombination und Vektoren enthaltend die Expressionskassetten, die pflanzliche Promotoren mit einer Expressionsspezifität für pflanzliche Samen insbesondere Leinsamen enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressionskassetten oder Vektoren zur rekombinanten Expression he- terologer Gene in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben als Nahrungs-, Futtermittel oder Saatgut, Pharmazeutika, Feinchemikalien oder als industrieller Grundstoff.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten werden vorteilhaft in einem Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen und/oder ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit erhöhtem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen verwendet . Im Verfahren finden vorteilhaf die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5 oder 11 Anwendung, die unter Verwendung der Expressionskassetten exprimiert werden. Diese vorgenannten Nukleinsäuren sind im Verfahren sowie zur Herstellung eines transgenen Organismuses bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit ungesättigten Cig-, C o~/ oder C -Fettsäuren geeignet. Außerdem können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Expressionskassetten weitere Gene neben den Nuklein- säuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 11 oder seine Homologen, Derivate oder Analoga sowie Genkonstrukte, die diese Gene oder ihre Homologen, Derivate oder Analoga umfasst, sowie Ihre Verwendung allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen bevorzugt Biosynthesegene für polyungesättigter Fettsäuren, wie vorteilhaft in SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9 dargestellt, in Organismen bevorzugt Pflanzen exprimiert werden.
Eine Reihe von Produkten und Nebenprodukten natürlich vorkommender StoffWechselprozesse in Mikroorganismen, tierischen und pflanzlichen Zellen sind für viele Industriezweige, ein- schließlich der Futtermittel-, Nahrungsmittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie, nützlich. Zu diesen gemeinsam als "Feinchemikalien" bezeichneten Molekülen gehören beispielsweise Lipide und Fettsäuren, unter denen eine beispielhafte Klasse die mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind. Fettsäuren und Tri- glyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharma- bereich. Je nachdem ob es sich um freie gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren oder um Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet, so werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren (eolyunsaturated fatty acids, PUFAs) Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. PUFAs haben weiterhin einen positiven Einfluss auf den Cholesterinspiegel im Blut von Menschen und eignen sich daher zum Schutz gegen Herzkrankheiten. So finden sie in verschiedenen diätischen Lebensmitteln oder Medikamenten Anwendung.
Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUFAs sind Mikroorganismen wie Thraustochytrien oder Schizochytrien- Stä me, Algen wie Phaeodactylum tricornutum oder Crypthecodinium- Arten, Ciliaten, wie Stylonychia oder Colpidium, Pilze, wie Mortierella, Entomophthora oder Mucor. Durch Stammselektion ist eine Anzahl von Mutantenstämmen der entsprechenden Mikroorganismen entwickelt worden, die eine Reihe wünschenswerter Verbindungen, einschließlich PUFAs, produzieren. Die Selektion von Stämmen mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren.
Alternativ kann die Produktion von Feinchemikalien geeigneterweise über die Produktion von Pflanzen, die so entwickelt sind, dass sie die vorstehend genannten PUFAs herstellen, im großen Maßstab durchgeführt werden. Besonders gut für diesen Zweck geeignete Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten wie Raps, Canola, Lein, Soja, Sonnenblumen, Borretsch und Nachtkerze. Aber auch andere Nutzpflanzen, die Öle oder Lipide und Fettsäuren enthalten, sind gut geeignet, wie in der eingehenden Beschreibung dieser Erfindung erwähnt. Mittels herkömmlicher Züchtung ist eine Reihe von Mutantenpflanzen entwickelt worden, die ein Spektrum an wünschenswerten Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen produzieren. Die Selektion neuer Pflanzensorten mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls ist jedoch ein zeit ufwändiges und schwieriges Verfahren oder 'sogar unmöglich, wenn die Verbindung in der entsprechenden Pflanze nicht natürlich vorkommt, wie im Fall von mehrfach ungesättigten Ciβ-, C20~Fet säuren und C22-Fett- säuren und solchen mit längeren Kohlenstoffketten. Aufgrund der positiven Eigenschaften ungesättigter Fettsäuren hat es in der Vergangenheit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der Synthese von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen in verschiedenen Organismen 5 mit geändertem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ-9-Desaturase beschrieben. In WO 93/11245 wird eine Δ-15-Desaturase in WO 94/11516 wird eine Δ-12-Desaturase beansprucht. Δ-6-Desaturasen werden in WO 93/06712, US 5,614,393,
10 VIO 96/21022 und WO 99/27111 beschrieben. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem. , 265, 1990: 20144-20149, Wada et al . , Nature 347, 1990: 200-203 oder Huang et al . , Lipids 34, 1999:
15 649-659 beschrieben. In WO 96/13591 wird eine Δ-6-Palmitoyl- ACP-Desaturase beschrieben und beansprucht. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und charakterisieren sind
20 (McKeon et al . , Methods in Enzymol . 71, 1981: 12141-12147, Wang et al . , Plant Physiol. Biochem. , 26, 1988: 777-792).
In Hefen konnte sowohl eine Verschiebung des Fettsäurespektrums zu ungesättigten Fettsäuren hin als auch eine Steigerung der
25 Produktivität nachgewiesen werden (siehe Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659, Napier et al . , Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614) . Die Expression der verschiedenen Desaturasen in transgenen Pflanzen zeigte allerdings nicht den gewünschten Erfolg. Eine Verschiebung des Fettsäurespektrum zu ungesättigten Fett-
30 säuren hin konnte gezeigt werden, gleichzeitig zeigte sich aber, dass die Syntheseleistung der transgenen Pflanzen stark nachließ, das heißt gegenüber den Ausgangspflanzen konnten nur geringere Mengen an Ölen isoliert werden.
35 Weder in Hefen noch in Pflanzen werden natürlicherweise mehrfach ungesättigte C2o~ und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül wie Arachidonsäure (ÄRA) und/oder Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Docosahexaen- säure (DHA) hergestellt.
40
Nach wie vor besteht daher ein großer Bedarf an neuen Genen, die für Enzyme kodieren, die an der Biosynthese ungesättigter Fettsäuren beteiligt sind und es ermöglichen, diese in einem technischen Maßstab herzustellen. Keines der bisher bekannten
45 biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren liefert die vorgenannten Fettsäuren in wirtschaftlich nutzbaren Mengen.
Bei der Expression von Genen in Pflanzen gibt es immer wieder Probleme, dass heißt es kommt durch die Expression nicht zur erwarteten Steigerung bei der Herstellung des gewünschten Wertprodukts .
Verschiedene Methoden zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sind bekannt (Haiford NG, Shewry PR, Br. Med. Bull.,
2000; 56: 62-73). Ziel ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteilhaften, neuen Eigenschaften, zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur ' Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM, J. Exp. Bot., 2000: 51 Spec No : 487-96) .
Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter Gene ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer Promotoren. Pro- motoren sind wichtige Werkzeuge in der Pflanzenbiotechnologie, um die Expression eines bestimmten Gens in einer transgenen Pflanze lokal und zeitlich zu steuern und so bestimmte Wesensmerkmale der Pflanze auszunutzen bzw. erst zu erzielen. Verschiedene Promotoren für diverse Pflanzenarten, bestimmte Pflanzengewebe und Ent- wicklungsstadien sind bekannt.
Verwendet werden zum Beispiel konstitutive Promotoren wie der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor oder der Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohlmo- saikvirus (CaMV) (Odell et al., Nature 1985: 313,810-812), der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiguitin Promotor (Holtorf S et al . , Plant Mol. Biol . 1995, 29:637-646), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) . Nachteilig bei diesen Promotoren ist, dass sie in fast allen Geweben der Pflanze konstitutiv aktiv sind. Eine gezielte Expression von Genen in bestimmten Pflanzenteilen oder zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten ist mit diesen Promotoren nicht möglich.
Promotoren, deren Aktivität gewebsspezifisch oder entwicklunsgab- hängig reguliert ist, wurden isoliert. Spezifitäten sind für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen beschrieben. Die Stringenz der Spezifität, als auch die Expressionsaktivität dieser Promotoren ist sehr unterschiedlich. Zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten, wie der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubi- sco (Ribulose-1, 5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al . , EMBO J. 8 (1989), 2445 - 245) .
5 Weitere Promotoren sind beispielsweise spezifische Promotoren für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Pa- tatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie
10 beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625) , fruchtreifungspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifungspezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794) , blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen-Syn- thase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO
15 98/22593) .
Eine Variation der Aktivität eines Promotoren anhängig vom Entwicklungsstadium der Pflanze wurd unter anderem von Baerson et al . beschrieben (Baerson SR, La ppa GK. Plant Mol Biol. 20 1993;22(2) :255-67) .
Samenspezifische Promotoren sind aufgrund der Bedeutung des Samens als eine der Hauptnahrungs- bzw. Futterquellen von Mensch und Tier und als Produktionsort für Wertstoffe von besonderen In-
25 teresse. Bekannt sind Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. So wurden beispielsweise die Promotoren von Genen identifiziert, die für Speicherproteine verschiedener Dicotyledonen kodieren. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5504200, Bustos
30 MM et al., Plant Cell. 1989; 1 (9) : 839-53 ) , des 2S Albumingens (Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262:12196-12201), des Legu- mins (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989 ;215 (2) :326-331) , des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al . , Molecular & General Genetics 1991, 225 (3) : 459-67) des Napin Gens ( Stalberg K, et
35 al . , L. Planta 1996, 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al . , Mol Gen genet 1991, 225: 121-128). Diese steuern eine hohe samenspezifische Expression von Speicherproteinen.
40 Trotz der allgemeinen Annahme, daß pflanzliche Promotoren von einer Spezies auf die andere Übertragbar sind und auch in artfremden Pflanzenspezies ähnliche Aktivitäten und Spezifitäten aufweisen, mehren sich Hinweise auf Einschränkungen von dieser Annahme. So zeigte es sich, daß die Höhe der transgenen Expression von he-
45 terologen Genen unter Kontrolle dieser Promotoren, oft stark von der Art der Wirtspflanze abhängig ist. Es wurde festgestellt, dass die Expression nicht immer absolut zelltypspezifisch ist. Unterschiede im Expressionsmuster und der Expressionsstärke eines bestimmten Promotors können durch unterschiedliche Wirtspflanzen oder durch unterschiedliche Insertionsorte in das Genom der Wirtspflanze bedingt sein (Goossens A et al . , Plant Phys 1999, 120:1095-1104) .
Durch eine Genexpression in anderen Pflanzenteilen kann die Verwendung eines Promoters in einer anderen Pflanzenart sehr eingeschränkt sein. Etwa wenn die Expression des Genes in den Metabo- lismus der Zelle, die Zusammensetzung der Membranlipide oder die Biosynthese eingreift.
Es bestand daher die Aufgabe weitere Expressionskassetten für die Expression in Pflanzen zur Verfügung zu stellen. Und diese für die Expression von Genen vorteilhaft Biosynthesegenen allein oder gegebenenfalls in Kombination mit anderen Enzymen in einem Verfahren beispielsweise zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren zu verwenden. Diese Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäßen Expressionskassette mit einer Struktur ausgewählt aus der Gruppe gelöst:
a) Ll - Promotor - Strukturgen - L2,
b) Ll - Promotor - Strukturgen - L2 - Ll - Promotor - Struktur- gen - L2 ,
c) Ll - Promotor - Strukturgen - L2 - Ll - Promotor - Strukturgen - L2 - Ll - Promotor - Strukturgen - L2 ,
wobei Ll, L2 , Promotor und Strukturgen die folgende Bedeutung hat:
Ll = SEQ ID NO: 32 oder eine äquivalente Restriktionsschnittstellen enthaltende Sequenz,
L2 = unabhängig voneinander SEQ ID NO: 33, 34 oder 35 oder äquivalente Restriktionsschnittstellen enthaltende Sequenzen,
Promotor = pflanzlicher Promotor
Strukturgen = eine in Pflanzen exprimierbare Nukleinsäuresequenz .
Vorteilhaft ist das Strukturgen ein Biosynthesegen, boevorzugt ist es ein Biosynthesegen des Lipid- oder Fettsäurestoffwechsels, vorteilhaft ein pflanzliches Gen. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist das Strukturgen eine Nukleinsäuresequenz, die für Proteine ausgewählt aus der Gruppe :
Acyl-CoA-Dehydrogenase (n) , Acyl-ACP[= acyl carrier protein] - Desaturase (n) , Acyl-ACP-Thioesterase (n) , Fettsäure-Acyl-Transfe- rase (n) , Fettsäure-Synthase (n) , Fettsäure-Hydroxylase (n) , Acetyl- Coenzym A-Carboxylase (n) , Acyl-Coenzym A-Oxidase (n) , Fettsäure- Desaturase (n) , Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylgly- cerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase (n) , kodiert.
Ganz besonders bevorzugt ist das Strukturgen eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten werden,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Po- lypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.
Unter einer äquivalente Restriktionsschnittstellen enthaltende Sequenz im Sinne der Erfindung sind Sequenzen zu verstehen, die Restriktionsschnittstellen enthalten, die für den Aufbau multipler Expressionskassetten geeignet sind, das heißt geeigneter Weise nicht im Strukturgen vorhanden sind oder im binären Vektor. Solche Restriktionsschnittstellen wie beispielhaft EcoRI, BamHI, Sacl, PstI, Ncol, Ndel, Bgll, Bglll, Xhol, Xba und weitere sind dem Fachmann bekannt und können einschlägigen Fachbüchern entnommen werden.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können für die Expres- sion von Genen in wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen wie beispielsweise Lein, für die keine endogenen samenspezifischen Promotoren bekannt waren, verwendet werden. Lein ist, wie die vorliegenden Arbeiten zeigten, für eine samenspezifische Expression von Genen besonders problematisch, da offensichtlich mehrere Promotoren, die vom Fachmann für samenspezifische Expression in anderen Pflanzen routinemäßig benutzt werden, in z.B. in anderen Pflanzen wie Lein nicht funktionieren, das heißt nicht zu einer Transkription bzw. letztlich zu einer Expression der mRNA des Strukturgens führt .
Verwendung der oben genannten erfindungsgemäßen Expressionskas- setten in einem Verfahren zur Herstellung von Fettsäureestern mit einem erhöhtem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Sequenz ,
b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten werden,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist,
in einen Fettsäureester produzierenden Organismus einbringt, anzieht und die dem Organismus enthaltenden Fettsäureester isoliert. ! i
Bei den im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen handelt es sich um isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Δ-5-, Δ-6- oder Δ-12-Desaturaseaktivität codieren.
Im Verfahren werden vorteilhaft Fettsäureester mit mehrfach unge- stättigten Cis-, C2o~ und/oder C2 -Fettsäuremolekülen mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäureester hergestellt . Bevorzugt enthalten diese Fettsäuremoleküle drei, vier oder fünf Doppelbindungen und führen vorteilhaft zur Synthese von Arachi- donsäure (ÄRA) , Eicosapentaensäure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA) .
Die Fettsäureester mit mehrfach ungesättigten Cis- C20- und/oder C22-Fettsäuremolekülen können aus den Organismen, die für die Her- Stellung der Fettsäureester verwendet wurden, in Form eines Öls oder Lipids beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingo- lipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglyceride, Diacylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen enthalten, isoliert werden.
Als Organismus für die Herstellung im Verfahren kommen prinzipell alle prokaryontisehen oder eurkaryontischen Organismen wie proka- ryontische oder eurkaryontische Mikroorganismen wie gram-positive oder gram-negative Bakterien, Pilze, Hefen, Algen, Ciliaten, tie- rische oder pflanzliche Zellen, Tiere oder Pflanzen wie Moose, zweikeimblättrige oder einkeimblättrige Pflanzen in Frage. Vorteilhaft werden Organismen im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, die zu den Öl-produzierenden Organismen gehören, das heißt die für die Herstellung von Ölen verwendet werden, wie Mikroorga- nismen wie Crypthecodinium, Thraustochytrium, Phaeodactylum und Mortierella, Ento ophthora, Mucor, Crypthecodinium sowie andere Algen oder Pilze sowie Tiere oder Pflanzen, insbesondere Pflanzen bevorzugt Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Sojabohne, Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor, Nachtkerze, Lein, Soja, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Ko- kosnuss) oder Feldfrüchte, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, So- lanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee) , Salix-Arten, Bäume (Ölplame, Kokosnuß) sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Soja, Erdnuß, Raps, Canola, Lein, Nachtkerze, Sonnenblume, Safflor oder Bäume (Ölpalme, Kokosnuß) .
Das Verfahren beinhaltet entweder die Züchtung eines geeigneten transgenen Organismus bzw. transgenen Mikroorganismus oder die Züchtung von transgenen Pflanzenzellen, -geweben, -Organen oder ganzen Pflanzen, umfassend die erfindungsgemäßen Nukleotidsequen- zen der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gegebenenfalls in Verbindungen mit den in SEQ ID NO: 7 und/oder SEQ ID NO: 9 dargestellten Sequenzen allein oder in Kombination mit Sequenzen von vorteilhaften erfindungsgemäßen Expressionskassetten in vorteilhaften Vektoren mit SEQ ID NO: 13-17 oder ihre Homologen, Derivate oder Analoga oder ein Genkonstrukt, das die SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 ggf. in Verbindung mit SEQ ID NO: 7 und/oder 9 oder ihre Homologen, Derivate oder Analoga umfasst, oder einen Vektor, der diese Sequenz oder das Genkonstrukt umfasst, welches die Expression erfindungsgemäßer Nukleinsäuremoleküle herbeiführt, so dass eine Feinchemikalie produziert wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer Zelle, die eine solche erfindungsgemäße Nukleinsäuresequen- zen enthält, wobei eine Zelle mit einer Desaturasenukleinsäurese- quenz, einem Genkonstrukt oder einem Vektor, welche die Expression einer erfindungsgemäßen Desaturasenukleinsäure allein oder in Kombination herbeiführen, transformiert wird. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Feinche ikalie aus der Kultur. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform gehört die Zelle zur Ordnung der Ciliaten, zu Mikroorganismen, wie Pilzen, oder zum Pflanzenreich, insbesondere zu Ölfruchtpflanzen, besonders bevorzugt sind Mikroorganismen oder Ölfruchtpflanzen beispielsweise Erdnuss, Raps, Canola, Lein, Soja, Safflower (Distel) , Sonnenblumen oder Borretsch.
Unter transgen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, daß die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder die erfindungsgemäßen Expressionskassetten nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Transgen bedeutet aber auch, dass die Nukleinsäuren oder Expressionskassetten an ihrem natür- liehen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Bevorzugte transgene Organismen sind die oben genannten transgenen Pflanzen bevorzugt Ölfruchtpflanzen.
Aus den im Verfahren hergestellten Fettsäureestern lassen sich die enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung wie wässrige KOH oder NaOH vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließen- der Ansäuerung über z.B. H2S04.
Die im Verfahren hergestellten Fettsäureester fallen in Form von Ölen, Lipiden und/oder Fettsäuren an, die mindestens zwei Doppelbindungen in den Fettsäuremolekülen bevorzugt drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten. Auch sind Zusammensetzungen, die die genannten Öl-, Lipid- und/oder Fettsäuren enthalten, sowie die Verwendung der Öle, Lipide und/oder Fettsäuren oder der Zusammensetzungen in Futter, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika ein weiterer Anwendungsmöglichkeit der vorgenannten Stoffe. Ein weiterer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Modulation der Produktion eines Moleküls durch einen Mikroorganismus . Diese Verfahren umfassen das Zusammenbringen der Zelle mit einer Substanz, welche die erfindungsgemäßen Desaturaseaktivität allein oder in Kombination oder die Desaturasenukleinsäureexpression moduliert, so dass eine zellassoziierte Aktivität relativ zu der gleichen Aktivität in Abwesenheit der Substanz verändert wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird/werden ein oder zwei Stoffwechselweg(e) der Zelle für Lipide und Fettsäuren, Cofaktoren und En- zyme moduliert oder der Transport von Verbindungen über diese Membranen moduliert, so dass die Ausbeute oder die Rate der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Mikroorganismus verbessert ist. Die Substanz, welche die Desaturaseaktivität moduliert, kann eine Substanz sein, welche die Desaturaseaktivität oder Desaturasenukleinsäureexpression stimuliert oder die als Zwischenprodukt bei der Fettsäurebiosynthese verwendet werden kann. Beispiele für Substanzen, welche die Desaturaseaktivität oder Desaturasenukleinsäureexpression stimulieren, sind u.a. kleine Moleküle, aktive Desaturasen sowie desaturasenkodierende Nukleinsäuren, die in die Zelle eingebracht worden sind. Beispiele für Substanzen, welche die Desaturaseaktivität oder -Expression hemmen, sind u.a. kleine Moleküle und Antisense- Desaturasenukleinsäuremoleküle .
Ein weiterer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Modulation der
Ausbeuten einer gewünschten Verbindung aus einer Zelle, umfassend das Einbringen eines Wildtyp- oder Mutanten-Desaturasegens , das entweder auf einem separaten Plasmid gehalten oder in das Genom der Wirtszelle integriert wird, in eine Zelle. Bei Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in trans, so dass das Gen mit einer funk- tionellen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktioneil transkribierten Gens gewährleistende Sequenz enthält, funktionell verbunden ist.
Bei einer bevorzugten Form des Verfahrens sind die Ausbeuten modifiziert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die gewünschte Chemikalie vermehrt, wobei unerwünschte störende Verbindungen vermindert werden können. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die gewünschte Fein- chemikalie ein Lipid oder eine Fettsäure, ein Cofaktor oder ein Enzym. Bei besonders bevorzugten Ausführungsform ist diese Chemikalie eine mehrfach ungesättigte Fettsäure. Stärker bevor- zugt ist sie ausgewählt aus Arachidonsäure (ÄRA) , Eicosapentaensäure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA) .
Die vorliegende Erfindung stellt vorteilhafte Multiexpressions- kassetten und Konstrukte zur multiparallelen samenspezifischen Expression von Genkombinationen in Pflanzen zur Verfügung.
Diese können im oben beschriebenen Verfahren zur Expression von Genen, bevorzugt den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 beschriebenen, in Algen und Pilzen und Pflanzen, insbesondere Ölfruchtpflanzen sind bevorzugte Organismen für das Verfahren verwendet werden.
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten können im Verfahren in Verbindung mit den oben genannten Nuklein- säuremoleküle zur gentechnologisch Veränderung von Pflanzen verwendet werden, so dass sie schließlich zur Herstellung von besseren oder effizienteren Produzenten einer oder mehrerer Feinchemikalien führen. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie kann durch eine direkte Wirkung der Manipulation eines erfindungsgemäßen Gens oder durch eine indirekte Wirkung dieser Manipulation hervorgerufen werden. Unter Feinchemikalien sind im Sinne der Erfindung beispielsweise Fettsäureester, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen enthalten wie Sphingolipide, Phosphoglyce- ride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglyceride, Dia- cylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen enthalten, zu verstehen. Weiter sind darunter zu ver- stehen Verbindungen wie Vitamine beispielsweise Vitamin E, Vitamin C, Vitamin B2, Vitamin B6, Pantolacton, Carotinoide wie Asta- xanthin, ß-Carotin, Zeaxanthin und andere.
Moose und Algen sind die einzigen bekannten P lanzensysteme, die erhebliche Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie Arachidonsäure (ÄRA) und/oder Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Docosahexaensäure (DHA) herstellen. Moose enthalten PUFAs in Membranlipiden während Algen, algenverwandte Organismen und einige Pilze auch nennenswerte Mengen an PUFAs in der Triacyl- glycerolfraktion akkumulieren. Daher eignen sich Nukleinsäure- moleküle, die aus solchen Stämmen isoliert werden, die PUFAs auch in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren, besonders vorteilhaft zur Modifikation des Lipid- und PUFA-Produktionssystems in einem Wirt, insbesondere in Mikroorganismen, wie den vorstehend erwähnten Mikroorganismen, und Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen, beispielsweise Raps, Canola, Lein, Soja, Sonnenblumen, Borretsch. Sie sind deshalb vorteilhaft im Verfahren verwendbar.
Die im Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Expres- sionskassetten verwendeten Nukleinsäuresequenzen codieren für Desaturasen, die zur Produktion langkettiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren, vorzugsweise mit mehr als sechzehn, achtzehn oder zwanzig Kohlenstoffatomen im Kohlenstoffgrundgerüst der Fettsäure und/oder mindestens zwei Doppelbindungen in der Kohlenstoffkette, geeignet sind, wobei eine Nukleinsäure für ein Enzym codiert, das Doppelbindungen in die Δ-5-Position, in einem anderen Fall in die Δ-6-Position und in einem weiteren Fall in die Δ-12-Position einführen kann. Mithilfe dieser Nukleinsäuren können hohe Mengen an PUFAs in der Triacylgycerolfraktion erhal- ten werden. Weiterhin wurden weitere Desaturasen isoliert, die allein oder zusammen mit einer Δ-4-Desaturase für ein Verfahren zur Produktion polyungesättigter Fettsäuren genutzt werden können. Dabei ist in der Anmeldung unter -dem Singular d.h. unter einem Desaturasegen oder -Protein auch der Plural d.h. die Desatu- rasegenen oder -Proteinen zu verstehen.
Die Herstellung einer Triensäure mit Cis-Kohlenstoffkette mithilfe von Desaturasen konnte bisher gezeigt werden. In diesen literaturbekannten Verfahren wurde die Herstellung von γ-Linolen- säure beansprucht. Bisher konnte jedoch niemand die Herstellung sehr langkettiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren (mit C2o_ und längerer Kohlenstoffkette sowie von Triensäuren und höher ungesättigten Typen) allein durch modifizierte Organismen zeigen.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen langkettiger PUFAs müssen die mehrfach ungesättigten Cis-Fettsäuren zunächst durch die enzymatische Aktivität einer Elongase um mindestens zwei Kohlenstoffatome verlängert werden. Nach einer Elongationsrunde führt diese Enzymaktivität zu C2o-Fettsäuren, und nach zwei, drei und vier Elongationsrunden zu C -, C - oder C26-Fettsäuren. Die in dieser Erfindung offenbarten Nukleinsäuresequenzen, die für verschiedene Desaturasen codieren, können im Konzert mit Elongasen zu sehr langkettigen, polyungesättigten führen. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Desaturasen führt vorzugsweise zu Cis-, C 0- und/oder C -Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt zu Cis- und/oder C 0-Fett- säuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei, vier oder fünf Doppelbindungen im Molekül. Die Fettsäureelongation kann durch Kombination der erfindungsgemäßen Desaturasen mit einer Elongaseaktivität erfolgen, wobei die durch die in SEQ ID NO: 9 codierte Elongase vorteilhaft verwendet werden kann. Nachdem die Verlängerung mit dem erfindungsgemäßen Enzym(en) stattgefunden hat, können weitere Desaturierungs- schritte wie z.B. eine solche in Δ-5-Position erfolgen. Auch die Kombination mit anderen Elongasen wie solche, die zu einer Ver- längerung von Cis- auf C0- oder von C2o- auf C2 -24 Ketten wie in WO0012720 offenbart führt, kann Verwendung finden und/oder einer Desaturase mit Aktivität für Δ-4-Position kann vorteilhaft eingesetzt werden, um die hoch desaturierten Fettsäuren zu erhalten. Daher führen die Produkte der Desaturaseaktivitäten und der möglichen weiteren Desaturierung zu bevorzugten PUFAs mit einem höheren Desaturierungsgrad, wie Dihomo-gamma-Lonolensäure, Docosadiensäure, Arachidonsäure, ω6-Eicosatriendihomo-γ-linolen- säure, Eicosapentaensäure, ü)3-Eicosatriensäure, ö)3-Eicosatetraen- säure, Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure. Substrate der erfindungsgemäßen Enzymaktivität sind zum Beispiel Taxolsäure;
6, 9-0ctadecadiensäure, Linolsäure, Pinolensäure, α-oder γ-Linolen- säure oder Stearidonsäure sowie Arachidonsäure, Eicosatetraen- säure, Docosapentaensäure, Eicosapentaensäure. Bevorzugte Substrate sind Linolsäure, γ-Linolensäure und/oder α-Linolensäure sowie Arachidonsäure, Eicosatetraensäure, Docosapentaensäure, Eicosapentaensäure. Besonders bevorzugt als Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Arachidonsäure, Docosapentaensäure, Eicosapentaensäure. Die Ci8~Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure können durch die erfindungs- gemäße enzymatische Aktivität in Form der freien Fettsäure oder in Form der Ester, wie Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide, Phosphoglyceride, Monoacylglyceride, Diacylglyceride oder Tri- acylglyceride, verlängert werden.
Für die menschliche Ernährung ist konjugierte Linolsäure "CLA" von besonderer Bedeutung. Unter CLA versteht man insbesondere Fettsäuren wie C18:2 s =is- urans oder das Isomer C18:2 lotrans, 12 cis; die aufgrund menschlicher Enzymsysteme nach Aufnahme im Körper desaturiert bzw. elongiert werden können und zu gesundheits- fördernden Effekten beitragen können. Mit den erfindungsgemäßen Desaturasen (Δ-12-Desaturase) können auch solche konjugierten Fettsäuren mit wenigstens zwei Doppelbindungen im Molekül desaturiert werden und damit solche gesundheitsfördernden Fettsäuren der menschlichen Ernährung zugeführt werden. Weitere Beispiel für konjugierte Fettsäuren sind alpha-Parinarsäure, Punicasäure, Eleostearinsäure und Calendulasäure .
Unter der Verwendung von der erfindungsgemäßen Expressionkassetten in Klonierungsvektoren in Pflanzen und bei der Pflanzentrans- formation, wie denjenigen, die veröffentlicht sind in und dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Uti- lization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) ) , lassen sich Gene vorteilhaft Biosynthesegene wie die oben beschriebenen Nukleinsäuren zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Pflanzen verwenden, so dass diese ein besserer oder effizienterer Produzent beispielsweise eines oder mehrerer von Lipiden hergeleiteter Produkte, wie PUFAs, werden. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz der Produktion eines beispielsweise von Lipiden hergeleiteten Produktes, wie PUFAs, kann durch direkte Wirkung der Manipulation oder eine indirekte Wirkung dieser Manipulation hervorgerufen werden.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung eines erfindungsgemäßen Desaturaseproteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Fein- chemikalie aus einer Ölfruchtpflanze oder einem Mikroorganismus aufgrund eines veränderten Proteins direkt beeinflussen kann. Die Anzahl oder Aktivität des Desaturaseproteins oder -Gens sowie von Genkombinationen von Desaturasen und Elongasen kann erhöht sein, so dass größere Mengen dieser Verbindungen de novo hergestellt werden, weil den Organismen diese Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese vor dem Einbringen des entsprechenden Gens fehlte. Entsprechendes gilt für die Kombination mit weiteren Desaturasen oder Elongasen oder weiteren Enzymen aus dem Lipidstσffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter, d.h. auf DNA-Sequenzebene unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die Verwendung von Promotoren zur Genexpression, die eine andere zeitliche Genexpression z.B. abhängig vom Reifegrad eines Samens oder Öl-speichernden Gewebes ermöglicht .
Durch das Einbringen eines Desaturasegens oder mehrerer Desatura- segene unter Kontrolle der erfindungsgemäßen Expressionskassetten in einen Organismus allein oder in Kombination mit anderen Genen in eine Zelle kann nicht nur den Biosynthesefluss zum Endprodukt erhöht, sondern auch die entsprechende Zusammensetzung der Ξnpro- dukte beispielsweise der Triacylglycerine erhöht oder de novo geschaffen werden. Ebenso kann die Anzahl oder Aktivität anderer Gene, die am Import von Nährstoffen, die zur Biosynthese einer oder mehrerer Feinchemikalien (z.B. Fettsäuren, polaren und neu- tralen Lipiden) nötig sind, erhöht sein, so dass die Konzentration dieser Vorläufer, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen innerhalb der Zellen oder innerhalb des Speicherkompartiments er- höht ist, wodurch die Fähigkeit der Zellen zur Produktion von PUFAs, wie im folgenden beschrieben, weiter gesteigert wird. Fettsäuren und Lipide sind selbst als Feinchemikalien wünschenswert; durch Optimierung der Aktivität oder Erhöhung der Anzahl einer oder mehrerer Desaturasen, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Zerstören der Aktivität einer oder mehrerer Desaturasen, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann es möglich sein, die Ausbeute, Produktion und/ oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus Pflanzen oder Mikroorganismen zu steigern.
Die Mutagenese der/des erfindungsgemäßen Desaturasegene (s) kann weiterhin zu einem Desaturaseprotein mit geänderten Aktivitäten führen, welche die Produktion einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien direkt oder indirekt beeinflussen. Beispielsweise kann die Anzahl oder Aktivität der/des erfindungsgemäßen Desaturasegens (e) gesteigert werden, so dass die normalen Stoffwechselabfälle oder -nebenprodukte der Zelle (deren Menge möglicherweise aufgrund der Überproduktion der gewünschten Fein- chemikalie erhöht ist) effizient exportiert werden, bevor sie andere Moleküle oder Prozesse innerhalb der Zelle (welche die Lebensfähigkeit der Zelle senken würden) zerstören oder die Biosynthesewege der Feinchemikalie stören würden (wodurch die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion der gewünschten Feinchemikalie verringert wird) . Ferner können die relativ großen intrazellulären Mengen der gewünschten Feinchemikalie selbst toxisch für die Zelle sein oder Enzym-Rückkopplungsmechanismen, wie die allosterische Regulation, stören, beispielsweise könnte sie durch Steigerung der Aktivität oder Anzahl anderer strom- abwärts folgender Enzyme oder Entgiftungsenzyme des PUFA-Wegs die Allokation der PUFA in die Triacylgylcerin-Fraktion steigern, man könnte die Lebensfähigkeit von Saatzellen erhöhen, was wiederum zu besserer Entwicklung von Zellen in Kultur oder zu Saaten führt, die die gewünschte Feinchemikalie produzieren. Das erfindungsgemäße Desaturasegen kann auch so manipuliert werden, dass die entsprechenden Mengen der verschiedenen Lipid- und Fettsäuremoleküle hergestellt werden. Dies kann eine einschneidende Wirkung auf die Lipidzusammensetzung der Membran der Zelle haben und erzeugt neue Öle zusätzlich zum Auftreten neusynthetisierter PUFAs. Da jeder Lipidtyp unterschiedliche physikalische Eigenschaften hat, kann eine Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die Membranfluidität erheblich verändern. Änderungen der Membranfluidität können sich auf den Transport von Molekülen über die Membran sowie auf die Unversehrtheit der Zelle auswirken, die beide eine entscheidende Wirkung auf die Produktion von Feinchemikalien besitzen. In Pflanzen können diese Änderungen überdies auch andere Merk- male, wie Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stresssituationen, beeinflussen.
Im Verfahren können isolierte Nukleinsäuremoleküle (z.B. cDNAs) , 5 umfassend Nukleotidse uenzen, die eine Desaturase oder mehrere Desaturasen oder biologisch aktive Teile davon codieren, oder Nu- kleinsäurefragmente, die sich als Primer oder Hybridisierungsson- den zum Nachweis oder zur Amplifikation desaturasekodierender Nukleinsäuren (z.B. DNA oder mRNA) eignen, verwendet werden. Bei
10 besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Nukleinsäure- molekül eine der in Sequenz ID N0:1 bzw 3 und 5 dargestellten Nukleotidsequenzen oder die kodierende Region oder ein Komplement einer dieser Nukleotidsequenzen. Bei anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül
15 eine Nukleotidsequenz, die an eine Nukleotidsequenz, wie in der Sequenz SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 dargestellt, oder einen Teil davon hybridisiert oder zu mindestens etwa 50 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 %, 80 % oder 90 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95 %,
20 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr homolog dazu ist. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen kodiert das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in der Sequenz SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 dargestellten Aminosäuresequenzen. Das bevorzugte Desaturasegen besitzt vorzugsweise auch mindestens eine der hier beschriebenen
25 Desaturaseaktivitäten.
Bei einer weiteren Ausführungsform kodiert das isolierte Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Teil davon, wobei das Protein oder der Teil davon eine Aminosäuresequenz enthält,
30 die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist, dass das Protein oder der Teil davon eine Desaturaseaktivität beibehält. Vorzugsweise behält das Protein oder der Teil davon, das/der von dem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau
35 von Zellmembranen von Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen. Bei einer Ausführungsform ist das von dem Nukleinsäuremolekül kodierte Protein zu mindestens etwa 50 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 % und stärker bevorzugt mindestens etwa 70 %, 80 % oder
40 90 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Protein ein Volllängen-Protein, das im wesentlichen in Teilen homolog zu einer gesamten Amino-
45 säuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 (die von dem in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten offenen Leserahmen herrührt) ist.
Bei anderen Ausführungsformen umfasst die isolierte Desaturase eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens etwa 50 % homolog zu einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist und am Stoffwechsel von zum Aufbau von Fettsäuren in einem Mikroorganismus oder einer Pflanzenzelle notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann, wobei desaturierte Ci8~ oder C2o-22-Kohlenstoffketten mit Doppelbindungen an mindestens zwei Stellen gemeint ist .
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform rührt das isolierte Nukleinsäuremolekül von Phaeodactylum tricornutum UTEX646 her und kodiert ein Protein (z.B. ein Desaturasefusionsprotein) , das eine biologisch aktive Domäne enthält, die zu mindestens etwa 50 % oder mehr homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NR 2, 4, 6 oder 12 ist und die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen von Pflanzen notwendigen Ver- bindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen, beibehält oder zumindest eine der Desaturierungs- aktivitäten resultierend in PUFAs wie GLA, ALA, Dihomo-gamma Linolensäure, ÄRA, EPA oder DHA oder deren Vorläufermoleküle besitzt, und umfasst auch heterologe Nukleinsäuresequenzen, die ein heterologes Polypeptid oder regulatorische Proteine kodieren.
Alternativ kann die isolierte Desaturase eine Aminosäurese uenz umfassen, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die an eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 hybridi- siert, z.B. unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder zu mindestens etwa 50 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 %, 80 % oder 90 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr homolog dazu ist. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die bevor- zugten Desaturaseformen ebenfalls eine der hier beschriebenen Desaturaseaktivitäten besitzen.
Bei einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Nukleinsäuremolekül mindestens 15, 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 17 umfasst. Vorzugsweise entspricht das isolierte Nukleinsäuremolekül einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül . Stärker bevorzugt kodiert das isolierte Nukleinsäuremolekül natürlich vorkommende Phaeodactylum-Desaturase oder einen biologisch aktiven Teil davon. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind Expressionskassetten, die die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 in den verschiedenen Organismen wie pflanzliche Zellen, Geweben, Teilen von Pflanzen oder ganzen Pflanzen ermöglichen.
Unter der erfindungsgemäßen Expressionskassette (= Nukleinsäure- konstrukt oder -fragment) sind die in SEQ ID NO: 32 als Ll und einem Promotor, einem Strukturgen ausgewählt aus den vorteilhaf- ten Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder
SEQ ID NO: 11, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/ oder deren funktioneilen oder nicht funktioneilen Derivate zu verstehen, und die Polylinder-Terminator-Polylinker-Sequenzen (= L2) SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 oder SEQ ID NO: 35 zu verstehen. Diese steuern vorteilhafterweise die Genexpression in der Wirtszelle. Diese in den Konstrukten enthaltenen regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/ oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder an- stelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpres- sion gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form ΛΓOΏ. Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 '-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die Δ-5-Desaturase-/Δ-6-Desatu- rase und/oder Δ-12-Desaturasegene können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, z.B. rekombinante Expressionsvektoren, die mindestens eine der erfin- dungsgemäßen Expressionskassetten enthalten, und Wirtszellen, in die die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder diese Vektoren eingebracht worden sind, insbesondere Mikroorganismen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe, -organe oder ganze Pflanzen. Bei einer Ausführungsform kann eine solche Wirtszelle Feinchemikalien-Ver- bindungen, insbesondere PUFAs, speichern; zur Isolation der gewünschten Verbindung werden die Zellen geerntet. Die Verbindung (Öle, Lipide, Triacylglyceride, Fettsäuren) oder die Desaturase können dann aus dem Medium oder der Wirtszelle, welche bei Pflanzen Zellen sind, die Feinchemikalien enthalten oder speichern, am stärksten bevorzugt Zellen von Speichergeweben, wie Samenhüllen, Knollen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe isoliert werden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine genetisch veränderte transgene Pflanze, bevorzugt ein Ölfruchtpflanze, wie vorstehend erwähnt, besonders bevorzugt eine Raps- oder Leinpflanze, in die eine erfindungsgemäße Expressionskassette, die vorteilhaft weitere Gene wie Desaturasegen enthält, eingebracht worden ist. Bei einer Ausführungsform ist das Genom von Raps oder Lein durch Einbringen einer erfindungsgemäßen Expressionskassette vorteilhaft enthaltend weitere Nukleinsäuremoleküle, die beispielsweise eine Wildtyp- oder mutierte Desaturasesequenz kodiert, als Transgen verändert worden. Bei einer bevorzugten Ausführungs- form wird Raps oder Lein auch zur Produktion einer gewünschten Verbindung, wie Lipiden und Fettsäuren, wobei PUFAs besonders bevorzugt sind, verwendet.
Bei noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Moos Physcomitrella patens zur Demonstration der Funktion eriner Expressionskassette mit einem Desaturasesegen unter Verwendung homologer Rekombination auf der Basis der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäuren verwendet werden.
Das Desaturasepolypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon kann vorteilhaft unter Kontrolle der erfindungsgemäßen Expressionskassette funktionsfähig mit einem weiteren Polypeptid, das eine andere enzymatische Aktivität als die Desaturasen hat beispielsweise eine Elongase-, Acyltransferase- oder sonstige Aktivität verbunden werden, so dass ein Fusionsprotein gebildet wird. Vorteilhaft hat dieses Fusionsprotein eine Aktivität, die sich von derjenigen der Desaturase allein unterscheidet. Bei anderen bevorzugten Ausführungsform nimmt dieses Fusionsprotein am Stoffwechsel von Verbindungen, die zur Synthese von Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen in Mikroorganismen oder Pflanzen notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teil . Besonders vorteilhaft moduliert das Einbringen dieses Fusionsproteins in einer Wirtszelle die Produktion einer gewünschten Verbindung innerhalb einer und durch die Zelle. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthalten diese Fusion- sproteine auch Δ-4-, Δ-5- oder Δ-6, Δ-8-, Δ-15, Δ-17 oder Δ-19-Desaturaseaktivitäten allein oder in Kombination. Insbesondere solche Genkombinationen sind bevorzugte Ausführungsformen, die aus SEQ ID NO: 7 oder 9 gewählt sind, bzw Teilen davon, Derivate oder ihren Homologen. Insbesondere solche Kombinationen sind bevorzugt, die die vollständige Proteinaktivität wie in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 enthalten und in Multiexpressionskassetten definiert durch SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 und 17 eingefügt zur Transformation von Pflanzen und Expression in Pflanzen geeignet sind.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Ein erfindungsgemäßer Gegenstand sind auch die Expressionskassetten in Verbindung mit isolierten Nukleinsäuresequenz (en) , die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe :
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dar- gestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten werden, c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäurese- quenzen codieren und mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine Aminosäuresequenz, die durch die oben genannte (n) Nukleinsäuresequenz (en) codiert werden (für die Erfindung soll der Singular den Plural und umgekehrt umfassen) . Speziell betrifft die Erfindung Aminosäuresequenzen, die durch die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellte Sequenz codiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Expressionskassetten bereit, die für die Expression von Nukleinsäuren und Proteinmoleküle mit Desaturaseaktivität geeignet sind, und von Nukleinsäuren kodierend für Proteine, die am Stoffwechsel von Lipiden und Fettsäuren, PUFA-Cofaktoren und Enzymen in dem Moos Physcomitrella patens oder am Transport lipophiler Verbindungen über Membranen beteiligt sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich zur Modulation der Produktion von Feinchemikalien aus Organismen wie Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Ger- ste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Linum Arten wie Öl- oder Faserlein, Brassica-Arten, wie Raps, Canola und Rübsen, Pfeffer, Sonnenblume, Borretsch, Nachtkerze und Tagetes, Solanacaen-Pflan- zen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Maniok, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee) , Sa- lix-Arten, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss) und ausdauernden Gräsern und Futterfeldfrüchten, entweder direkt (z.B. wenn die Überexpression oder Optimierung eines Fettsäurebiosynthese-Proteins einen direkten Einfluss auf die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Fettsäure aus modifizierten Organismen hat) verwenden oder können eine indirekt Auswirkung haben, die dennoch zu einer Steigerung der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung oder einer Abnahme unerwünschter Verbindungen führt (z.B. wenn die Modulation des Stoffwechsels von Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen zu Veränderungen der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion oder der Zusammensetzung der gewünschten Verbindungen innerhalb der Zellen führt, was wiederum die Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien beeinflussen kann) . Aspekte der Erfindung sind nachstehend weiter erläutert.
I . Feinchemikalien und PUFAs Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und umfasst Moleküle, die durch einen Organismus produziert worden sind und Anwendungen in verschiedenen Industrien finden, wie, aber nicht beschränkt auf, die pharmazeutische, Landwirtschafts-, Nahrungsmittel- und Kosmetik-Industrie. Diese Verbindungen umfassen Lipide, Fettsäuren, Cofaktoren und Enzyme usw. (wie z.B. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related com- pounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Reh et al . , Hrsgb., VCH: Weinheim und darin enthaltenen Literaturstellen) , Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (z.B. Arachidonsäure), Vitamine und Cofaktoren (wie beschrieben in Ullmann's Ency- clopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, Vitamins, S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und darin enthaltenen Literaturstellen; und Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L. (1995) Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086, und darin angegebenen Literaturstellen beschriebenen Chemikalien. Der Stoffwechsel und die Verwendungen bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert.
Die Kombination verschiedener Vorläufermoleküle und Biosyntheseenzyme führt zur Herstellung verschiedener Fettsäuremoleküle, was eine entscheidende Auswirkung auf die Zusammensetzung der Membran hat. Es kann angenommen werden, dass PUFAs nicht nur einfach in Triacylglycerin, sondern auch in Membranlipide eingebaut werden.
Vorläufer für die PUFA-Biosynthese sind beispielsweise Ölsäure, Linol- und Linolensäure . Diese Cis-Kohlenstoff-Fettsäuren müssen auf C20 und C2 verlängert werden, damit Fettsäuren vom Eicosa- und Docosa-Kettentyp erhalten werden. Mithilfe verschiedener Desaturasen, wie Enzymen, welche Δ-12-Desaturase, Δ-15-Desaturase, Δ-6-Desaturase-, Δ-5- und Δ-4-Desaturase- aktivität aufweisen, können Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure sowie verschiedene andere langkettige PUFAs erhalten, extrahiert und für verschiedene Zwecke bei Nahrungs- mittel-, Futter-, Kosmetik- oder pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden.
Zur Herstellung langkettiger PUFAs müssen, wie oben erwähnt, die mehrfach ungesättigten Ci8~ bzw C20-Fettsäuren mehrfach desaturiert werden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kodieren erste funktioneil aktive Desaturasen aus Phyeodactylum tricornutum, einem Mikroorganismus, der PUFAs in der Triacyl- glycerolfraktion enthält. Mit den erfindungsgemäßen Desaturasen können Doppelbindungen in die Δ-5-, Δ-6- oder Δ-12-Position eingeführt werden. Die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Desaturasen führt vorzugsweise zu Cis- + C 0-Fettsäuren mit mindestens zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise zu C2o-Fettsäuren mit vorteilhaft drei, vier oder fünf Doppelbindungen im Fettsäuremolekül . Die Desaturierung kann vor oder nach Elongation der entsprechenden Fettsäure erfolgen. Daher führen die Produkte der Desaturaseaktivitäten und der mög- liehen weiteren Desaturierung und Elongation zu bevorzugten PUFAs mit höherem Desaturierungsgrad, einschließlich einer weiteren Elongation von C o zu C2-Fettsäuren, zu Fettsäuren wie Linolsäure, Docosadiensäure, dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, ωδ-Eicosa- triendihomo-γ-linolensäure, Eicosapentaensäure, C03-Eicosatrien- säure, ω3-Eicosatetraensäure, Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure. Substrate dieser erfindungsgemäßen Enzymaktivität sind zum Beispiel Taxolsäure, 6, 9-0ctadecadiensäure, Ölsäure, Linolsäure, γ-Linolensäure, Pinolensäure, α-Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure oder Stearidonsäure . Bevorzugte Substrate sind Linolsäure, γ-Linolensäure und/oder α-Linolensäure, dihomo-γ-linolensäure bzw. Arachidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure. Die Cis-oder C 0-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure können durch die erfindungsgemäße Enzymaktivität in Form der freien Fettsäure oder in Form der Ester, wie Phospholipide, Glykolipide, Sphingolipide, Phosphoglyceride, Monoacylglyceride, Diacylglyceride, Triacylgly- ceride oder sonstige Ester, verlängert werden. Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und in das Triacylglycerin- Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure- Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100 (4-5) :161-166) .
Veröffentlichungen über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese, Desaturierung, den LipidstoffWechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation, Fettsäuremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und -Assemblierung einschließlich der Literaturstellen darin siehe in den folgenden Artikeln: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge und Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin und Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49 :'611-641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al . , 1995, Prog. Lipid Res . 34:267-342; Stymne et al . , 1993, in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb. : Murata und So erville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1) :1-16. 5
Vitamine, Cofaktoren und Nutraceutical wie PUFAs, umfassen eine Gruppe von Molekülen, die höhere Tiere nicht mehr synthetisieren können und somit aufnehmen müssen oder die höhere Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstellen können und somit zusätzlich
10 aufnehmen müssen, obwohl sie leicht von anderen Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die sie produzieren können, wie in Bakterien, ist im großen und ganzen charakterisiert worden (Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27,
15 S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations
20 in Malaysia and the Society for Free Radical Research Asia, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S) .
Die oben erwähnten Moleküle sind entweder selbst biologisch
25 aktive Moleküle oder Vorstufen biologisch aktiver Substanzen, die entweder als Elektronenüberträger oder Zwischenprodukte bei einer Vielzahl von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Ver-
30 arbeitungshilfsstoffe. (Einen Überblick über Struktur, Aktivität und industrielle Anwendungen dieser Verbindungen siehe z.B. in Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Mehrfach ungesättigte Fettsäuren haben verschiedene Funktionen und gesundheitsfördernde
35 Wirkungen, beispielsweise bei koronarer Herzerkrankung, Entzündungsmechanismen, Kinderernährung usw. Veröffentlichungen und Literaturstellen, einschließlich darin zitierter Literaturstellen, siehe in: Simopoulos, 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70 (3. Suppl .): 560-569, Takahata et al . , Biosc. Biotechnol . Biochem.
40 1998, 62(11) :2079-2085, Willich und Winther, 1995, Deutsche Medizinische Wochenschrift 120 (7) :229ff .
II. Elemente und Verfahren der Erfindung
45 Die vorliegende Erfindung beruht unter anderem auf der Entdeckung neuer Moleküle, die hier als Desaturasenukleinsäure- und -proteinmoleküle bezeichnet werden, welche eine Wirkung auf die Produktion von Zellmembranen und Lipiden Phaeodactylum tri- cornutum ausüben und beispielsweise die Bewegung von Molekülen über diese Membranen beeinflussen. Bei einer Ausführungsform nehmen die Desaturasemoleküle am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Organismen, wie Mikroorganismen und Pflanzen, notwendigen Verbindungen teil oder beeinflussen indirekt den Transport von Molekülen über diese Membranen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat die Aktivität der erfindungsgemäßen Desaturasemoleküle zur Regulation der Produktion von Membran- komponenten und des Membrantransports eine Auswirkung auf die Produktion der gewünschten Feinchemikalie durch diesen Organismus. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Aktivität der erfindungsgemäßen Desaturasemoleküle moduliert, so dass die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Stoffwechselwege von Mikroorganismen oder Pflanzen, welche die erfindungsgemäßen Desaturasen regulieren, moduliert sind und die Effizienz des Transport von Verbindungen durch die Membranen verändert ist, was entweder direkt oder indirekt die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch Mikroorganismen und Pflanzen moduliert.
Der Begriff "Desaturase" oder "Desaturasepolypeptid" umfasst Proteine, die an der Desaturierung von Fettsäuren teilnehmen. Beispiele für Desaturasen sind in der SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11 oder ihren Homologen, Derivaten oder Analoga offenbart. Die Begriffe Desaturase oder Desaturasenukleinsäuresequenz (en) umfassen Nukleinsäuresequenzen, die eine Desaturase kodieren und bei denen ein Teil eine kodierende Region und ebenfalls entsprechende 5'- und 3 ' -untranslatierte Sequenzbereiche sein können. Beispiele für Desaturase-Gene sind die in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 dargestellten. Die Begriffe Produktion oder Produktivität sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes (zum Beispiel der gewünschten Feinchemikalie) , das in einer bestimmten Zeitspanne und einem bestimmten Fermentationsvolumen gebildet wird (z.B. kg Produkt pro Stunde pro Liter) . Der Begriff Effizienz der Produktion umfasst die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (z.B. wie lange die Zelle zur Auf- richtung einer bestimmten Durchsatzrate einer Feinchemikalie benötigt) . Der Begriff Ausbeute oder Produkt/Kohlenstoff- Ausbeute ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie) . Dies wird gewöhnlich beispielsweise ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Erhöhen der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe Biosynthese oder Biosyntheseweg sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Ver- bindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Die Begriffe Abbau oder Abbauweg sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle) beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Der Begriff Stoffwechsel ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Stoffwechsel einer bestimmten Verbindung (z.B. der Stoffwechsel einer Fettsäure) umfasst dann die Gesamtheit der Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege dieser Verbindung in der Zelle, die diese Verbindung betreffen.
Bei einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, die für Desaturase-Moleküle codieren, die Produktion eines gewünschten Moleküls, wie einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus oder in Pflanzen modulieren. Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung einer erfindungsgemäßen Sequenz die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie aus einem Mikroorganismus- oder Pflanzenstamm, die dieses veränderte Protein enthalten, direkt beeinflussen kann. Die Anzahl oder Aktivität von Desaturasen, die am Transport von Feinchemikalienmolekülen innerhalb oder aus der Zelle beteiligt sind, kann erhöht werden, so dass größere Mengen dieser Verbindungen über Membranen transportiert werden, aus denen sie leichter gewonnen und ineinander umgewandelt werden. Ferner sind Fettsäuren, Triacylglycerine und/oder Lipide selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch Optimierung der Aktivität oder Steigern der Anzahl einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Desaturasen, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Stören der Aktivität einer oder mehrerer Desaturasen, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann es möglich sein, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus Organismen, wie Mikroorganismen oder Pflanzen, zu erhöhen.
Die Mutagenese der genannten Nukleinsäuresequenzen kann Desaturasen mit veränderten Aktivitäten hervorbringen, welche die Produk- tion einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien aus Mikroorganismen oder Pflanzen indirekt beeinflussen. Beispielsweise können Desaturasen, die am Export von Abfallprodukten beteiligt sind, eine größere Anzahl oder höhere Aktivität aufweisen, so dass die normalen StoffWechselabfälle der Zelle (deren Menge möglicherweise aufgrund der Überproduktion der gewünschten Feinchemikalie erhöht ist) effizient exportiert werden, bevor sie die Moleküle in der Zelle schädigen können (was die Lebensfähigkeit der Zelle herabsetzen würde) oder die Feinchemikalien-Biosynthesewege stören können (was die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie senken würde) . Die relativ großen intrazellulären Mengen der gewünschten Fein- chemikalie selbst können ferner für die Zelle toxisch sein, so dass man durch Steigern der Aktivität oder Anzahl von Transportern, die diese Verbindungen aus der Zelle exportieren können, die Lebensfähigkeit der Zelle in Kultur steigern kann, was wiederum zu einer größeren Anzahl an Zellen in der Kultur führt, welche die gewünschte Feinchemikalie produzieren. Die Desaturasen können auch so manipuliert werden, dass die entsprechenden Mengen unterschiedlicher Lipid- und Fettsäuremoleküle produziert werden. Dies kann eine erhebliche Auswirkung auf die Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipidtyp unterschiedliche physi- kalische Eigenschaften aufweist, kann eine Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die Membranfluidität signifikant verändern. Änderungen der Membranfluidität können den Transport von Molekülen über die Membran sowie die Integrität der Zelle beeinflussen, was jeweils eine erhebliche Auswirkung auf die Produktion von Feinchemikalien aus Mikroorganismen und Pflanzen in Fermentationskultur im großen Maßstab hat. Pflanzenmembranen verleihen spezifische Eigenschaften, wie Toleranz gegenüber Wärme, Kälte, Salz, Trockenheit sowie Toleranz gegen Pathogene, wie Bakterien und Pilze.
Die genannten isolierten Nukleinsäuresequenzen sind im Genom eines Phaeodactylum tricornutum UTEX646-Stammes enthalten, der über die Algensammlung der University of Texas, Austin verfügbar ist.
Die Nukleotidsequenz der Phaeodactylum tricornutum-cDNA und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Desaturasen sind in den SEQ ID NO: 1 bis 6 sowie 11 und 12 gezeigt. Es wurden Computeranalysen durchgeführt, die diese Nukleotidsequenzen als Sequenzen klassifizieren und/oder identifizieren, die am Stoffwechsel von Zellmembrankomponenten beteiligte Proteine oder am Transport von Verbindungen über Zellmembranen beteiligte Proteine bzw. der PUFA Biosynthese codieren. EST's mit der Datenbankeingabe-NO: PT001070010R und PT001078032R durch die Erfinder stellen die erfindungsgemäßen Sequenzen in SEQ ID NO: 1 und 3 dar. Die Sequenz des Fragments aus EST PT001070010R wurde ermittelt und ist wie dargestellt in SEQ ID NO: 5. Analog ist die Sequenz des Klones PT001078032R dargestellt in SEQ ID NO: 1. Den Klonen wurden Gen- namen zugewiesen. Abkürzungen bedeuten: Pp = Physcomitrella pa- tens, Pt = Phaeodactylum tricornutum. PT001070010R aus SEQ ID NO: 5 codiert für ein neues Gen homolog zu Δ-12-Desaturase und PT001078032R codiert für eine neuartige Δ-5-Desaturase. Pt_des6 kann gemäß Beispiel 5a mittels Polymerase Kettenreaktion unter Zuhilfenahme degenerierter Oligonukleotide isoliert werden. Ein so erhaltenes Fragment kann zum Sichten einer cDNA Bank aus Phaeodactylum tricornutum isoliert werden und die codierende Region einer Phaeodactylum tricornutum Δ-6-Desaturase erhalten wer- den. Ein so isoliertes Gen wird in Tabelle 1 als Pt_des6 bezeichnet und ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt. Die korrespondierenden Aminosäuresequenzen werden durch Übersetzung des genetischen Codes der Sequenz ID NO: 1, 3 und 5 erhalten und sind als SEQ ID NO: 2, 4 und 6 definiert (siehe auch Tabelle 1) . Auch eine wei- tere Nukleinsäuresequenz, die für eine Δ-12-Desaturase codiert, ist Tabelle 1 zu entnehmen. Sie trägt die Klon-Nummer PT001072031R.
Tabelle 1
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Die vorliegende Erfindung betrifft auch Proteine mit einer Amino- säuresequenz , die im wesentlichen homolog zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist. Wie hier verwendet, ist ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen homolog zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz ist, zu min- destens etwa 50 % homolog zu der ausgewählten Aminosäuresequenz, z.B. der gesamten ausgewählten Aminosäuresequenz. Ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen homolog zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz ist, kann auch zu mindestens etwa 50 bis 60 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70 % und stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 % oder 90 bis 95 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr homolog zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz sein.
Die Desaturasen oder der biologisch aktive Teile oder Fragmente davon können am Stoffwechsel von Lipiden zum Aufbau von Zellmembranen oder Speicherlipiden in Organismen teilnehmen und in Ko - bination mit weiteren Genen, insbesondere solchen mit Elongaseak- tivität zur Elongation von Cis-bzw Co-2-PUFAs benötigten Aktivitäten beitragen, so dass Cis, C0-, C - oder C4-PUFAs sowie verwandte PUFAs erhalten werden. ~ •
Dabei können die Desaturasen in Kombination mit Elongasen und anderen Desaturasen in erfindungsgemäßen Expressionskassetten klo- niert werden und zur -Transformation von Pflanzen mithilfe von Agrobakterium eingesetzt werden.
Verschiedene Aspekte der Erfindung sind eingehender in den folgenden Unterabschnitten beschrieben.
A. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
Eine Ausführungsform der Erfindung sind isolierte Nukleinsäuren, die von PUFA produzierenden Mikroorganismen stammen und für Polypeptide kodieren, die Cis-oder C o-22~Fettsäuren mit mindestens einer, zwei, drei oder vier Doppelbindungen in der Fettsäure desaturieren.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform sind isolierte Nukleinsäuren, umfassend Nukleotidsequenzen, die für Polypeptide kodieren, die Cis-bzw C0-Fettsäuren mit mindestens ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen in der Fettsäure desaturieren und sind aus der Gruppe, bestehend aus
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dar- gestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten werden,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist. Die oben genannte erfindungsgemäße Nukleinsäure stammt von Organismen, wie Ciliaten, Pilzen, Algen oder Dinoflagellaten, die PUFAs synthetisieren können, vorzugsweise von Phaeodactylum tricornutum oder nah verwandten Organismen.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Expressionskassetten sowie Nukleinsäuremoleküle, die Desaturase-Polypeptide oder biologisch aktive Teile davon kodieren, sowie Nukleinsäurefragmente von diesen, die zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung einer Desaturase- kodierenden Nukleinsäure (z.B. Desaturase-DNA) ausreichen. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül", wie hier verwendet, soll DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. RNA) sowie DNA- oder RNA-Analoga, die mittels Nukleotidanaloga erzeugt werden, umfassen. Dieser Begriff umfasst zudem die am 3 ' - und am 5 '-Ende des kodierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens 500, bevorzugt 200, besonders bevorzugt 100 Nu- kleotide der Sequenz stromaufwärts des 5 ' -Endes des kodierenden Bereichs und mindestens 100, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3 ' -Endes des kodierenden Genbereichs. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise doppeisträngige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäu- remolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nu- kleinsäure vorliegen. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, welche die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (z.B. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3 ' -Enden der Nukleinsäure befinden) . Bei verschiedenen Ausführungsför- men kann das isolierte Desaturase-Nukleinsäure olekül zum Beispiel weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt (z.B. eine Physcomitrella patens-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA- Molekül, kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäße Expressionskassette mit der Struktur SEQ ID NO: 32 -Promotor- SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 oder SEQ ID NO: 35 Nukleinsäuremolekül, z.B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nu- kleotidsequenz der SEQ ID N0:1 oder eines Teils davon, kann unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Auch kann mithilfe von Vergleichsalgorithmen beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA oder Aminosäureebene identifiziert werden. Beispielsweise kann aus einer Phaeodactylum tricornutum cDNA aus- einer Phaeodactylum tri- cornutum-Bank isoliert werden, indem die vollständige SEQ ID NO:l, 3, 5 oder 11 oder ein Teil davon als Hybridisierungssonde sowie Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Labo- ratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden.
Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonu- kleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz oder von Teilen davon, insbesondere Regionen um Motive aus Beispiel 5a erstellt werden oder Modifikationen ebensolcher in einzelnen definierten Aminosäuren, verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständigen Sequenz der SEQ ID NO:l, 3, 5 oder 11 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion unter Ver- wendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 erstellt worden sind) . Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen isolieren (z.B. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al . (1979) Biochemistry 18:5294-5299) und cDNA mittels Reverser Transkriptase (z.B. Moloney-MLV-Reverse-Trans- kriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Re- verse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St .Petersburg, FL) herstellen. Synthetische Oligonukleotidprimer zur Aplifizierung mittels Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 sowie der in Figur 5a gezeigten Sequenzen oder mithilfe der in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer Desaturase-Nukleotidsequenz entsprechen, können durch Standard- Syntheseverfahren, beispielsweise mit einem automatischen DNA- Synthesegerät, hergestellt werden.
Die in SEQ ID NO: 1,3, 5 oder 11 gezeigte cDNA umfasst Sequenzen, die Desaturasen kodieren, (d.h. den "kodierenden Bereich") sowie 5'-untranslatierte Sequenzen und 3 '-untranslatierte Sequenzen. Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül nur den kodierenden Bereich einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 um-
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einen oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) modifiziert werden, ohne dass jedoch die Funktionalität oder Aktivität der Promotoren gestört wird. Es ist weiterhin möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht ist oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar aus heterologen Organismen, ersetzt werden.
Überdies kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül nur einen Teil des kodierenden Bereichs einer der Sequenzen in
SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 umfassen, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, welches einen biologisch aktiven Abschnitt einer Desaturase kodiert. Die aus der Klonierung des Desaturase-Gens von Phaeodactylum tricornutum ermittelten Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von Desaturase-Homologen in anderen Zelltypen und Organismen sowie Desaturase-Homologen aus anderen Mikroalgen oder verwandten Arten gestaltet sind. Die Sonde/der Primer umfasst gewöhnlich im wesentlichen gereinigtes Oligo- nukleotid. Das Oligonukleotid umfasst gewöhnlich einen Nukleotid- sequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise etwa 16, stärker bevorzugt etwa 25, 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 angegebenen Sequenzen, eines Antisense-Stranges einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 angegebenen Sequenzen oder seiner Homologen, Derivate oder Analoga oder natürlich vorkommender Mutanten davon hybridisiert. Primer auf der Basis einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 können in PCR-Reaktionen zur Klonierung von Desaturase- Homologen verwendet werden. Sonden auf der Basis der Desaturase- Nukleotidsequenzen können zum Nachweis von Transkripten oder genomischen Sequenzen, die das gleiche oder homologe Proteine kodieren, verwendet werden. Bei bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Sonde zudem eine daran gebundene Markierungsgruppe, z.B. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder einen Enzym-Cofaktor . Diese Sonden können als Teil eines Test-Kits für genomische Marker zur Identifizierung von Zellen, die eine Desaturase misexprimieren, beispielsweise durch Messen einer Menge einer Desaturase-kodierenden Nukleinsäure in einer Zellenprobe, z.B. Messen der Desaturase-mRNA-Spiegel, oder zur Bestimmung, ob ein genomisches Desaturase-Gen mutiert oder deletiert ist, verwendet werden.
Bei einer Ausführungsform kodiert das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Teil davon, das/der eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist, dass das Protein oder der Teil davon die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Mikroorganismen oder Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über 5 diese Membranen teilzunehmen, beibehält. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "ausreichend homolog" Proteine oder Teile davon, deren Aminosäuresequenzen eine minimale Anzahl identischer oder äquivalenter Aminosäurereste (z.B. einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette, wie ein Aminosäurerest in
10 einer der Sequenzen der SEQ ID NO : 2 ) zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO : 2 aufweisen, so dass das Protein oder der Teil davon am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Mikroorganismen oder Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann. Protein-
15 bestandteile dieser Stoffwechselwege für Membrankomponenten oder Membrantransportsysteme können, wie hier beschrieben, eine Rolle bei der Produktion und Sekretion einer oder mehrerer Feinchemikalien spielen. Beispiele für diese Aktivitäten sind hier ebenfalls beschrieben. Somit trägt die "Funktion einer
20 Desaturase" entweder direkt oder indirekt zur Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien bei. Beispiele für Desaturase-Substratspezifi- täten der katalytischen Aktivität sind in Tabelle 5 und 6 angegeben.
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Bei einer weiteren Ausführungsform kodieren Derivate des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls Proteine mit mindestens etwa 50 bis 60 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70 % und stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 %,
30 90 bis 95 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Homologie zu einer vollständigen Aminosäuresequenz der SEQ ID NO : 2. Die Homologie der Aminosäuresequenz kann über den gesamten Sequenzbereich mit dem Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al . ,
35 CABIOS, 5, 1989:151-153) oder BESTFIT oder GAP bestimmt
(Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992). Amino acid Substitution matrices from protein blocks . Proc . Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919.)
40 Teile von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen Desaturase- Nukleinsäuremolekülen kodiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Teile einer der Desaturasen. Wie hier verwendet, soll der Begriff "biologisch aktiver Teil einer Desaturase", einen Abschnitt, z.B. eine Domäne/ein Motiv, einer Desaturase
45 umfassen, der am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Mikroorganismen oder Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann oder eine in Tabelle 5 und 6 angegebene Aktivität aufweist. Zur Bestimmung, ob eine Desaturase oder ein biologisch aktiver Teil davon am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Mikroorganismen oder Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Trans- port von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann, kann ein Test der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend in Beispiel 8 des Beispielteils beschrieben, sind dem Fachmann geläufig.
Zusätzliche Nukleinsäurefragmente, die biologisch aktive Abschnitte einer Desaturase kodieren, lassen sich durch Isolierung eines Teils einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11, Exprimieren des kodierten Abschnitt der Desaturase oder des Peptids (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Bestimmen der Aktivität des kodierten Teils der Desaturase oder des Peptids herstellen.
Die Erfindung umfasst zudem Nukleinsäuremoleküle, die sich von einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten Nukleotid- Sequenzen (und Teilen davon) aufgrund des degenerierten genetischen Codes unterscheiden und somit die gleiche Desaturase kodieren wie diejenige, die von den in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten Nukleotidsequenzen kodiert wird. Bei einer anderen Ausführungsform hat ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäure- molekül eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit einer in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert. Bei einer weiteren Ausführungsform kodiert das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein Vollängen-Desaturase-Protein, das zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2,4, 6 oder 12 (die von einem in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten offenen
Leseraster kodiert wird) im wesentlichen homolog ist und durch gängige Methoden identifizierbar und isolierbar ist.
Zusätzlich zu den in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 gezeigten Desaturase-Nukleotidsequenzen erkennt der Fachmann, dass DNA- Sequenzpolymorphismen, die zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen der Desaturasen führen, innerhalb einer Population (z.B. der Phaeodactylum tricornutum-Population) existieren können. Diese genetischen Polymorphismen im Desaturase-Gen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund von natürlicher Variation existieren. Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "Gen" und "rekombinantes Gen" Nukleinsäuremoleküle mit einem offenen Leserahmen, der eine Desaturase, vorzugsweise eine Phaeodactylum tricornutum -Desaturase, kodiert. Diese natür- liehen Varianten bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz des Desaturase-Gens. Sämtliche und alle dieser Nukleotidvariationen und daraus resultierende Aminosäurepolymorphismen in der Desaturase, die das Ergebnis natürlicher Variation sind und die funktioneile Aktivität von Desaturasen nicht verändern, sollen im Umfang der Erfindung enthalten sein .
Nukleinsäuremoleküle, die den natürlichen Varianten entsprechen, und nicht-Phaeodactylum tricornutum-Homologen, -Derivate und -Analoga der Phaeodactylum tricornutum-cDNA können auf der Grundlage ihrer Homologie zu der hier offenbarten Phaeodactylum tricornutum-Desaturase-Nukleinsäure unter Verwendung der Phaeodactylum tricornutum-cDNA oder eines Teils davon als Hybridi- sierungssonde gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. Bei einer anderen Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz der SEQ ID N0:1, 3, 5 oder 11 umfasst. Bei anderen Ausführungsformen ist die Nukleinsäure mindestens 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide lang. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, soll Hybridi- sierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60 % homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 75 % oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., finden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes
Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 x Natriumchlorid/Natriumcitrat (sodium Chloride/ sodiumcitrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 x SSC, 0,1 % SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich je nach dem Typ der Nukleinsäure und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden. Die Temperatur unterscheidet sich beispielsweise unter "Standard-Hybridi- sierungsbedmgungen" je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 x SSC (pH 7,2). Falls organisches Lösungsmittel im obengenannten Puffer vorliegt, zum Beispiel 50 % Formamid, ist die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA- Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die vorstehend genannten Hybridisierungs- te peraturen sind beispielsweise für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern, wie dem vorstehend erwähnten oder aus den folgenden Lehrbüchern Sambrook et al . , "Molecular Cloning" , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes und Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.
Vorzugsweise entspricht ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz der SEQ ID NO:l, 3, 5 oder 11 hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hier verwendet, betrifft ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA- oder DNA- Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt
(z.B. ein natürliches Protein kodiert). Bei einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure eine natürliche vorkommendes Phyaeo- dactylum tricornutum-Desaturase.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der Desaturase- sequenz, die in der Population existieren können, erkennt der Fachmann ferner, dass auch Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 eingebracht werden können, was zu Änderungen der Aminosäuresequenz der kodierten Desaturase führt, ohne dass die Funktionsfähigkeit des Desaturaseproteins beeinträchtigt wird. Beispielsweise lassen sich Nukleotidsusbtitutionen, die an "nicht-essentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen führen, in einer Sequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 herstellen. Ein "nicht- essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der sich in einer
Wildtyp-Desaturasequenz einer der Desaturasen (SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12) verändern lässt, ohne dass die Aktivität der Desaturase verändert das heißt wesentlich reduziert wird, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die Desaturaseaktivität erforderlich ist. Andere Aminosäurereste (z.B. diejenigen, die in der Domäne mit Desaturaseaktivität nicht konserviert oder lediglich semikonserviert sind) können jedoch für die Aktivität nicht essentiell sein und lassen sich somit verändern, ohne dass die Desaturaseaktivität verändert wird.
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Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Desaturase kodiert, die zu einer Proteinsequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 homolog ist, kann durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotid- substitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotid- sequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 erzeugt werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingebracht werden. Mutationen können in eine der Sequenzen der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 durch Standardtechniken, wie stellenspezifische Muta- genese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin) , sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein) , unpolaren Seitenketten, (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) . Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einer Desaturase wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der Desaturase-kodierenden Sequenz eingebracht werden, z.B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können nach der hier beschriebenen Desaturase- Aktivität durchmustert werden, um Mutanten zu identifizieren, die Desaturaseaktivität beibehalten. Nach der Mutagenese einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann z.B. unter Verwendung der hier beschriebenen Tests (siehe Beispielteil) bestimmt werden.
Zusätzlich zu den Nuklemsäuremolekülen, welche die vorstehend beschriebenen Desaturasen kodieren, betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle, die "Antisense" zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen sind. Eine "Anti- sense"-Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer "Sense"-Nukleinsäure, welche ein Protein kodiert, komplementär ist, z.B. komplementär zum kodierenden Strang eines doppel- strängigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz . Eine Antisense-Nukleinsäure kann folglich über Wasserstoffbrückenbindungen an eine Sense-Nukleinsäure binden. Die Antisense-Nukleinsäure kann zu einem gesamten Desaturase-kodierenden Strang oder nur zu einem Teil davon komplementär sein. Bei einer Ausführungsform ist ein Antisense-Nukleinsäuremolekül "Antisense" zu einem "kodierenden Bereich" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, die eine Desaturase kodiert. Der Begriff "kodierender Bereich" betrifft den Bereich der Nukleotidsequenz, der Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden (z.B. den gesamten kodierenden Bereich, der mit dem Stopcodon beginnt und endet, d.h. dem letzten Codon vor dem Stopcodon) . Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül "Antisense" zu einem "nicht-kodierenden Bereich" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, die Desaturase kodiert. Der Begriff "nicht-kodierender Bereich" betrifft 5'- und 3 '-Sequenzen, die den kodierenden Bereich flankieren und nicht in Aminosäuren translatiert werden (d.h. die man auch als 5'- und 3 '-untranslatierte Bereiche bezeichnet).
Unter Voraussetzung der hier offenbarten Desaturase-kodierenden Sequenzen des kodierenden Stranges (z.B. die in SEQ ID NO: 1, 3 , 5 oder 11 dargestellten Sequenzen) können erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuren gemäß den Regeln der Watson-Crick-Basen- paarung gestaltet werden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zum gesamten kodierenden Bereich von Desaturase-mRNA sein, ist aber stärker bevorzugt ein Oligonukleotid, das nur zu einem Teil des kodierenden oder nicht-kodierenden Bereichs von Desaturase-mRNA "Antisense" ist. Das Antisense-Oligonukleotid kann z.B. zu dem Bereich, der die Translationsstartstelle von Desaturase-mRNA umgibt, komplementär sein. Ein Antisense-Oligonukleotid kann z.B. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 und mehr Nukleotide lang sein. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure kann unter Verwendung chemischer Synthese und enzymatischer Ligationsreaktionen mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäure (z.B. ein Antisense-Oligonukleotid) kann z.B. chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedentlich modifizierte Nukleotide verwendet werden, die so gestaltet sind, dass sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen oder die physikalische Stabilität des zwischen der Antisense- und der Sense-Nukleinsäure gebildeten Duplexes erhöhen, beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, sind u.a. 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chlor- uracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5- (Carboxyhydroxylmethyl) racil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2- thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyl- guanin, 1-Methylinosin, 2, 2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl- 2-thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5 '-Methoxycarboxymethyl- uracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentyladenin, Uracil- 5-oxyessigsäure (v) , Wybutoxosin, Desaturaseudouracil , Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5- oxyessigsäure (v) , 5-Methyl-2-thiouracil, 3- (3-Amino-3-N-2- carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2, 6-Diaminopurin. Die Antisense-Nukleinsäure kann alternativ biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in den eine Nuklein- säure in Antisense-Richtung subkloniert worden ist (d.h. RNA, die von der eingebrachten Nukleinsäure transkribiert wird, ist zu einer Zielnukleinsäure von Interesse in Antisense-Richtung orientiert, was im nachstehenden Unterabschnitt weiter beschrieben ist) . Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden üblicherweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie mit der zellulären mRNA und/oder der genomischen DNA, die eine Desaturase kodiert, hybridisieren oder daran binden, um dadurch die Expression des Proteins, z.B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation, zu hemmen. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplexes oder z.B. im Fall eines Antisense- Nukleinsäuremoleküls , das DNA-Duplices bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix erfolgen. Das Antisense-Molekül kann so modifiziert sein, dass es spezifisch an einen Rezeptor oder an ein auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiertes Antigen bindet, z.B. durch Binden des Antisense-Nukleinsäuremoleküls an ein Peptid oder einen Antikörper, das/der an einen Zeiloberflächenrezeptor oder ein Antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren den Zellen zugeführt werden. Zur Erzielung ausreichender intrazellulärer Konzentrationen der Antisense-Moleküle sind Vektorkonstrukte, in denen sich das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken prokaryotischen, viralen oder eukaryotischen, einschließlich pflanzlichen, Promotors befindet, bevorzugt.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, wobei die Stränge im Gegensatz zu gewöhnlichen ß-Einheiten parallel zueinander verlaufen. (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res . 15:6625-6641). Das Antisense- Nukleinsäuremolekül kann zudem ein 2 ' -o-Methylribonukleotid (Inoue et al . (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al. (1987) FEBS Lett . 215:327-330) umfassen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, spalten können, zu der sie einen komplementären Bereich haben. Somit können Ribozyme (z.B. Hammer- head-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) zur katalytischen Spaltung von Desaturase-mRNA- Transkripten verwendet werden, um dadurch die Translation von Desaturase-mRNA zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Desaturase-kodierende Nukleinsäure kann auf der Basis der Nukleotidsequenz einer der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 offenbarten Desaturase-cDNA (d.h. oder auf der Basis einer gemäß den in dieser Erfindung gelehrten Verfahren zu isolierenden heterologen Sequenz gestaltet werden. Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruiert werden, wobei die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer Desaturase-kodierenden mRNA gespalten werden soll. Siehe z.B. Cech et al., US-Patent Nr. 4,987,071 und Cech et al., US-Patent Nr. 5,116,742. Alternativ kann Desaturase-mRNA zur Selektion einer katalytischen RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden. Siehe z.B. Bartel, D. , und Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.
Alternativ lässt sich die Desaturase-Gen-Expression hemmen, indem Nukleotidsequenzen, die komplementär zum regulatorischen Bereich einer Desaturase-Nukleotidsequenz (z.B. einem Desaturase- Promotor und/oder -Enhancer) sind, so dirigiert werden, dass Dreifachhelix-Strukturen gebildet werden, welche die Transkription eines Desaturase-Gens in Zielzellen hemmen. Siehe allgemein Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res. 6(6) 569-84; Helene, C, et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sei. 660:27-36; und Mäher. L.J. (1992) Bioassays 14 (12) : 807-815.
B. Genkonstrukt (= Nukleinsäurekonstrukt, -fragment oder Expressionskassette)
Unter der erfindungsgemäßen Expressionskassette sind die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 genannten Sequenzen, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktioneilen oder nicht funktionellen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden und welche vorteilhaft die Expression der codierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der
Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 '-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die Δ-5-Desaturase-/Δ-6-Desaturase und/oder Δ-12-Desaturasegene können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Ver- Stärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
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- wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubringen und darin zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Weiterhin können vorteilhaft im Nukleinsäurekon- strukt bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene des Fettsäureoder Lipidstoffwechsels enthalten sein oder aber diese Gene können auf einem weiteren oder mehreren weiteren Nukleinsäure- konstrukten liegen. Vorteilhaft werden als Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ein Gen ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n) , Acyl-ACP[= acyl carrier protein] -Desaturase (n) , Acyl-ACP-Thioesterase (n) , Fettsäure-Acyl- Transferase(n) , Fettsäure-Synthase (n) , Fettsäure-Hydroxylase (n) , Acetyl-Coenz m A-Carboxylase (n) , Acyl-Coenzym, A-Oxidase (n) , Fettsäure-Desaturase (n) , Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase (n) oder deren Kombinationen verwendet.
Genkonstrukte umfassen vorteilhafterweise zur Expression der anderen vorliegenden Gene weitere 3'- und/oder 5'-terminale Regulationssequenzen zur Steigerung der Expression, die in Abhängigkeit vom gewählten Wirtsorganismus und dem Gen oder den Genen für die optimale Expression ausgewählt werden. Diese Regulationssequenzen sollen, wie oben erwähnt, die spezifische Expression der Gene und die Proteinexpression ermöglichen. Dies kann je nach dem WirtsOrganismus beispielsweise bedeuten, dass das Gen nur nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die Regulationssequenzen oder -faktoren können außerdem vorzugsweise eine vorteilhafte Wirkung auf die Expression der eingebrachten Gene haben und diese somit steigern. Auf diese Weise ist es möglich, dass die Regulationselemente unter Verwendung starker Transkriptionssignale, wie Promotoren und/oder Enhancer, vorteilhafterweise auf Transkriptionsebene verstärkt werden. Es ist jedoch weiterhin auch möglich, die Translation zum Beispiel durch Verbesserung der mRNA-Stabilität zu verstärken.
C. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die eine Desaturase allein (oder einen Teil davon) oder ein unter Punkt b beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt in dem die erfindungsgemäße Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels wie Desaturasen oder Elongasen enthalten ist. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen DNA- Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung und episomale Säugervektoren) . Andere Vektoren (z.B. nicht-episomale Säugervektoren) werden beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (z.B. replikations- defiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte Viren) , die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll der Begriff Vektor auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phas ide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt in einer Form, die sich zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, dass die re- kombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulationssequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfasst. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig ver- bunden" , dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz (en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und sie aneinander gebunden sind, so dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen (z.B. in einem In-vitro- Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird) . Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungs- signale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb. : Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, einschließlich der Literaturstellen darin. RegulationsSequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirts- zeiltypen steuern, und solche, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw. , abhängen kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingebracht werden, um dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteinen oder -peptiden, herzustellen, die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, kodiert werden (z.B. Desaturasen, mutante Formen von Desaturasen, Fusionsproteine usw. ) .
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von Desaturasen und Elongasen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet sein. Beispielsweise können Desaturasegene in bakteriellen Zellen, wie C. glutamicum,
Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressions- vektoren) , Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A. , et al . (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review" , Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al . (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al . , 1999, Marine Biotechnology.1, 3:239-251), Ciliaten der Typen: Holo- trichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Para- mecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturase- udocohnilembus , Euplotes, Engelmaniella und Stylonyehia, insbesondere der Gattung Stylonyehia lemnae, mit Vektoren nach einem Transformationsverfahren, wie beschrieben in WO 98/01572, sowie Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tυmefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep. : 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (und darin zitierte Literaturstellen)) oder Säugerzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, zum Beispiel unter Verwendung von T7-Promotor-Regulationssequenzen und
T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren ent- halten, welche die Expression von Fusions- oder nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren fügen eine Reihe von Aminosäuren an ein darin kodiertes Protein an, gewöhnlich am Amino- terminus des rekombinanten Proteins, aber auch am C-Terminus oder fusioniert innerhalb geeigneter Bereiche in den Proteinen. Diese Fusionsvektoren haben gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von rekombinantem Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins und 3) die Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreinigung. Bei Fusions- Expressionsvektoren wird oft eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und des rekombinanten Proteins eingebracht, so dass die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins möglich ist. Diese Enzyme und ihre entsprechenden ErkennungsSequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Entero- kinase .
Typische Fusions-Expressionsvektoren sind u.a. pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B., und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , bei denen Glutathion-S-Transferase (GST) , Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird. Bei einer Ausführungsform ist die Desaturase-kodierende Sequenz in einen pGEX- Expressionsvektor kloniert, so dass ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusionsprotein kodiert, das vom N-Terminus zum C-Terminus GST-Thrombin-Spaltstelle-X-Protein umfasst. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Gluta- thion-Agarose-Harz gereinigt werden. Rekombinante Desaturase, die nicht an GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusions- proteins mit Thrombin' gewonnen werden.
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J.F. Peberdy et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego]. Weitere geeignete Hefevektoren sind beispielsweise pAG-1, YEp6, YEpl3 oder pEMBLYe23.
Alternativ können die erfindungsgemäßen Desaturasen in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (z.B. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al . (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).
Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsgb. Pouwels, P.H., et al . , Elsevier, Amsterdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) .
Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungs- gemäße Nukleinsäure in Säugerzellen unter Verwendung eines Säuger-Expressionsvektors exprimiert . Unter Säugern werden im Sinne der Erfindung alle nicht-humanen Säuger verstanden. Beispiele für Säuger-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC ( aufman et al . (1987) EMBO J. 6:187-195) . Bei der Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft von viralen Regulationselementen bereitgestellt . Üblicherweise verwendete Promotoren stammen z.B. aus Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalie- virus und Simian Virus 40. Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Bei einer anderen Ausführungsform kann der rekombinante Säuger- Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp steuern (z.B. werden gewebespezifische Regulationselemente zur Expression der Nukleinsäure verwendet) . Gewebespezifische Regulationselemente sind im Fachgebiet bekannt. Nicht beschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promotoren sind u.a. der Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al . (1987) Genes Dev. 1:268-277), lymphoidspezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) und Immunglobulinen (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33:741-748), neuronspezifische Promotoren (z.B. Neurofilament- Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), pankreas- spezifische Promotoren (Edlund et al . , (1985) Science
230:912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren (z.B. Milchserum-Promotor; US-Patent Nr. 4,873,316 und Europäische Patentanmeldung-Veröffentlichung Nr. 264,166). Auch entwicklungs- regulierte Promotoren sind umfasst, z.B. die hox-Promotoren der Maus (Kessel und Gruss (1990) Science 249:374-379) und der Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546) .
Bei einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Desaturasen in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen) , siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z.B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E. , Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation" , Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise
Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevor- zugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-t-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al . , EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktioneile Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktioneil aktiven Terminatoren sind geeignet.
Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbunden Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz , welche die 5 ' -untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaik- virus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).
Die Pflanzengenexpression muss funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Bevorzugt sind Promotoren, welche die konstitutive Expression herbeiführen (Benfey et al . , EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913) oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,02? beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktions- fähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind
Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 und darin zitierte Literaturstellen) , beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Piastiden, wie Amylo- plasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Ko partimente von Pflanzenzellen.
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure- induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzier- barer Promotor (Gatz et al . (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRPl-Gen-Pro otor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), der hitzeinduzierbare hsp80- Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare Alpha- amylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinll-Promotor (EP-A-0 375 091) .
Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos . Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67), der Oleosin- Pro otor aus Arabidopsis (WO 98/45461) , der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9) sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in Mono- kotyledonen-Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der lpt2- oder Iptl-Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin- Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum- Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen) .
Insbesondere kann die multiparallele Expression von erfindungsgemäßen Desaturasen allein oder in Kombination mit anderen desaturasen oder Elongasen gewünscht sein. Die Einführung solcher Expressionskassetten kann über eine simultane Transformation mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder durch Kombination mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch können mehrere Vektoren mit mit jeweils mehreren Exopressionskassetten transformiert und auf die Wirtszelle übertragen werden.
Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Piastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige End- produkte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP- Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394.
Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül, das in Antisense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist. d.h. das DNA-Molekül ist derart mit einer regulatorischen Sequenz funktionsfähig verbunden, dass die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das zur Desaturase-mRNA "Antisense" ist, ermöglicht wird. Es können Regulationssequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig mit einer in Antisense-Richtung klonierten Nukleinsäure verbunden sind und die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Mole- küls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, zum Beispiel können virale Promotoren und/oder Enhancer oder Regulationssequenzen ausgewählt werden, welche die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in dem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch den Zeiltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingebracht worden ist. Eine Erläuterung der Regulation der Genexpression mittels Antisense-Genen siehe in Weintraub, H. , et al . , Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirts- zelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Selbstverständlich betreffen diese Begriffe nicht nur die bestimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Zelle. Da in aufeinanderfolgenden Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch immer noch vom Umfang des Begriffs, wie hier verwendet, umfasst.
Unter Reko binant oder Transgen beispielsweise rekombinanten Expressionsvektor oder rekombinanten Wirt oder Wirtszellen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder deren natürliche Regulationssequenzen an 5 ' und 3 ' -Position der Nukleinsäuren nicht in ihrer natürlichen Umgebung sind, das heißt entweder wurde die Lage der Sequenzen im Herkunfstorganismus verändert oder in diesem wurden die Nukleinsäuresequenzen und/oder die Regulationssequenzen mutiert oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen wurden in einen anderen Organismus als den Herkunfstorganismus verbracht oder deren Regulationssequenzen. Auch Kombinationen dieser Veränderungen sind möglich. Unter natürlicher Umgebung ist die Lage einer Nukleinsäuresequenz in einem Organismus zu verstehen, wie er in der Natur vorkommt.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Zum Beispiel kann eine Desaturase in Bakterienzellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen, Pilzzellen oder Säugerzellen (wie Chinesischer Harnster-Ovarzeilen (CHO) oder COS-Zellen) , Algen, Ciliaten, Pflanzenzellen, Pilzen oder anderen Mikroorganismen, wie C. glutamicum, exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig. Vektor-DNA lässt sich in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" , Konjugation und Transduktion, wie hier verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum
Einbringen fremder Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzi- pitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemisch vermittelter Transfer, Elektro- poration oder Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, lassen sich finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsgb: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Über die stabile Transfektion von Säugerzellen ist bekannt, dass je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Transfektionstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integriert. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektier- baren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) kodiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen solche, welche Resistenz gegen Medikamente, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen, oder in Pflanzen solche, welche Resistenz gegen ein Herbizid, wie Glyphosphat oder Glufosinat, verleihen. Weitere geeignete Marker sind beispielsweise Marker, welche Gene kodieren, die an Biosynthesewegen von zum Beispiel Zuckern oder Aminosäuren beteiligt sind, wie ß-Galactodsidase, ura3 oder ilv2. Marker, welche Gene, wie Luziferase, gfp oder andere Fluoreszenzgene kodieren, sind ebenfalls geeignet. Diese Marker lassen sich in Mutanten verwenden, in denen diese Gene nicht funktioneil sind, da sie beispielsweise mittels herkömmlicher Verfahren deletiert worden sind. Ferner können Marker, welche eine Nukleinsäure kodieren, die einen selektierbaren Marker kodiert, in eine Wirts- zelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der eine Desaturase kodiert, oder können auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden -sind, können zum Beispiel durch Medikamentenselektion identifiziert werden (z.B. überleben Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen absterben) . Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines Desaturasegens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um dadurch das Desaturasegen zu verändern, z.B. funktioneil zu disrumpieren. Dieses Desaturasegen ist vorzugsweise ein Phaeodactylum tricornutum Desaturasegen, es kann jedoch ein Homologon oder Analogon aus anderen Organismen, sogar aus einer Säuger-, Pilz- oder Insektenquelle verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor so gestaltet, dass das endogene Desaturasegen bei homologer Rekombination funktionell disrumptiert wird (d.h. nicht länger ein funktionelles Protein kodiert, auch als Knock-out- Vektor bezeichnet) . Alternativ kann der Vektor so gestaltet sein, dass das endogene Desaturasegen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert wird, aber immer noch ein funktionelles Protein kodiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich so verändert sein, dass dadurch die Expression der endogenen Desaturase verändert wird) . Zur Erzeugung einer Punktmutation über homologe Rekombination können auch als Chimeraplasty bekannte DNA-RNA-Hybride verwendet werden, die aus Cole-Strauss et al . , 1999, Nucleic Acids Research 27 (5) : 1323-1330 und Kmiec, Gene therapy, 19999, American Scientist, 87 (3 ): 240-247 bekannt sind.
Im Vektor für die homologe Rekombination ist der veränderte Abschnitt des Desaturasegens an seinem 5 ' - und 3 ' -Ende von zusätzlicher Nukleinsäure des Desaturasegens flankiert, so dass homologe Rekombination zwischen dem exogenen Desaturasegen, das auf dem Vektor vorliegt, und einem endogenen Desaturasegen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze möglich ist. Die zusätzliche flankierende Desaturase-Nukleinsäure ist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinreichend lang. Gewöhnlich sind im Vektor mehrere hundert Basenpaare bis zu Kilobasen flankierende DNA (sowohl am 5 ' - als auch am 3 '-Ende) enthalten (eine Beschreibung von Vektoren zur homologen Rekombination siehe z.B. in Thomas, K.R. , und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 oder der Rekombination in Physcomitrella patens auf cDNA-Basis in Strepp et al . , 1998, Proc . Natl . Acad. Sei. USA 95 (8) : 4368-4373) . Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle (z.B. mittels Polyethylenglycol-ver- mittelter DNA) eingebracht, und Zellen, in denen das eingebrachte Desaturasegen mit dem endogenen Desaturasegen homolog rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Techniken selektiert . Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Organismen, wie Mikroorganismen, hergestellt werden, die ausgewählte Systeme enthalten, welche eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen. Der Einschluß eines Desaturasegens in einem Vektor, wobei es unter die Kontrolle des lac-Operons gebracht wird, ermöglicht z.B. die Expression des Desaturasegens nur in Gegenwart von IPTG. Diese RegulationsSysteme sind im Fachgebiet bekannt .
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, in Kultur oder auf einem Feld wachsend, kann zur Produktion (d.h. Expression) einer Desaturase verwendet werden. In Pflanzen kann zusätzlich ein alternatives Verfahren durch direkten Transfer von DNA in sich entwickelnde Blüten über Elektroporation oder Gentransfer mittels Agrobacterium angewendet werden. Die Erfindung stellt folglich ferner Verfahren zur Produktion von Desaturasen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Anzucht der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der eine Desaturase kodiert, eingebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das eine Wildtyp- oder veränderte Desaturase kodiert) in einem geeigneten Medium, bis die Desaturase produziert worden ist. Das Verfahren umfasst bei einer weiteren Ausführungsform das Isolieren der Desaturasen aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Wirtszellen, die im Prinzip zum Aufnehmen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, des erfindungsgemäßen Genproduktes oder des erfindungsgemäßen Vektors geeignet sind, sind alle prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Die vorteilhafterweise verwendeten Wirtsorganismen sind Organismen, wie Bakterien, Pilze, Hefen, Tier- oder Pflanzenzellen. Weitere vorteilhafte Organismen sind Tiere oder vorzugsweise Pflanzen oder Teile davon. Pilze, Hefen oder Pflanzen werden vorzugsweise ver- wendet, besonders bevorzugt Pilze oder Pflanzen, ganz besonders bevorzugt Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Raps, Nachtkerze, Canola, Erdnuss, Lein, Soja, Safflor, Sonnenblume, Borretsch, oder Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee) , Salix-Arten, Bäume (Ölplame, Kokosnuß) sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Soja, Erdnuss, Raps, Canola, Lein, Nachtkerze, Sonnenblume, Safflor, Bäume (Ölpalme, Kokosnuß) . D. Isolierte Desaturase
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Desaturasen und biologisch aktive Teile davon. Ein "isoliertes" oder "ge- reinigtes" Protein oder ein biologisch aktiver Teil davon ist im wesentlichen frei von zellulärem Material, wenn es durch DNA- Rekombinationstechniken produziert wird, oder von chemischen Vorstufen oder andern Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Der Begriff "im wesentlichen frei von zellulärem Material" umfasst Desaturase-Präparationen, in denen das Protein von zellulären Komponenten der Zellen, in denen es natürlich oder rekombi- nant produziert wird, getrennt ist. Bei einer Ausführungsform umfasst der Ausdruck "im wesentlichen frei von zellulärem Material" Desaturase-Präparationen mit weniger als etwa 30 % (bezogen auf das Trockengewicht) nicht-Desaturase (hier auch als "verunreinigendes Protein" bezeichnet) , stärker bevorzugt weniger als etwa 20 % nicht-Desaturase, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10 % nicht-Desaturase und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5 % nicht-Desaturase. Wenn die Desaturase oder ein biologisch aktiver Teil davon rekombinant hergestellt worden ist, ist sie/er auch im wesentlichen frei von Kulturmedium, d.h. das Kulturmedium macht weniger als etwa 20 %, stärker bevorzugt weniger als etwa 10 % und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5 % des Volumens der Proteinpräparation aus. Der Begriff "im wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" umfasst Desaturase-Präparationen, in denen das Protein von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien getrennt ist, die an der Synthese des Proteins beteiligt sind. Bei einer Ausführungsform umfasst der Begriff "im wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" Desaturase-Präparationen mit weniger als etwa 30 % (bezogen auf das Trockengewicht) chemischen Vorstufen oder nicht-Desaturase-Chemikalien, stärker bevorzugt weniger als etwa 20 % chemischen Vorstufen oder nicht-Desaturase-Chemikalien, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10 % chemischen Vorstufen oder nicht-Desaturase-Chemikalien und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5 % chemischen Vorstufen oder nicht-Desaturase- Chemikalien. Bei bevorzugten Ausführungsformen weisen isolierte Proteine oder biologisch aktive Teile davon keine verunreinigenden Proteine aus dem gleichen Organismus auf, aus dem die Desaturase stammt. Diese Proteine werden gewöhnlich durch rekombinante Expression zum Beispiel Phaeodactylum tricornutum- Desaturase in Pflanzen wie Physcomitrella patens bzw. o.g. oder Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien, wie E. coli, Bacillus subtilis, C. glutamicum, Pilzen, wie Mortierella, Hefe, wie Saccharomyces, oder Ciliaten wie Colpidium oder Algen wie Phaeodactylum hergestellt. Eine erfindungsgemäße isolierte Desaturase oder ein Teil davon kann auch am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Phaeodactylum tricornutum notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen. Bei 5 bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Protein oder der Teil davon eine Aminosäuresequenz, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12 ist, dass das Protein oder der Teil davon die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Phaeodactylum tricornutum not-
10 wendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen, beibehält. Der Teil des Proteins ist vorzugsweise ein biologisch aktiver Teil, wie hier beschrieben. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat eine erfindungsgemäße Desaturase eine der in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 12
15 gezeigten Aminosäuresequenzen. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die Desaturase eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die, zum Beispiel unter stringenten Bedingungen, an eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 hybridisiert. Bei noch einer weiteren
20 bevorzugten Ausführungsform hat die Desaturase eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die mindestens etwa 50 bis 60 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 %, 90 bis 95 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 96 %,
25 97 %, 98 %, 99 % oder noch homologer zu einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 18 ist. Die erfindungsgemäße bevorzugte Desaturase besitzt vorzugsweise auch mindestens eine der hier beschriebenen Desaturase-Aktivitäten. Zum Beispiel umfasst eine erfindungsgemäße bevorzugte Desaturase eine Amino-
30 säuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die, zum Beispiel unter stringenten Bedingungen, an eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 11 hybridisiert und am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Phaeodactylum tricornutum notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen
35 über diese Membranen teilnehmen kann oder eine Doppelbindung in eine Fettsäure mit ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen und einer Kettenlänge von Cis, C 0 oder C2 einführt.
Bei anderen Ausführungsformen ist die Desaturase im wesentlichen 40 homolog zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 und behält die funktionelle Aktivität des Proteins einer der Sequenzen der SEQ ID NO : 2 , 4 oder 6 bei , ihre. Aminosäuresequenz unterscheidet sich jedoch aufgrund von natürlicher Variation oder Mutagenese, wie eingehend im obigen Unterabschnitt I beschrieben. 45 Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Desaturase folglich ein Protein, das eine" Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens etwa 50 bis 60 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70 % und stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 %, 90" bis 95 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder noch homologer zu einer vollständigen Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 ist und zumindest eine der hier beschriebenen Desaturase-Aktivitäten aufweist . Bei einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein vollständiges Phaeodactylum tricornutum-Protein, das im wesentlichen homolog zu einer vollständigen Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 ist.
Biologisch aktive Teile einer Desaturase umfassen Peptide, umfassend Aminosäuresequenzen, die von der Aminosäuresequenz einer Desaturase hergeleitet sind, z.B. eine in SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 gezeigte Aminosäuresequenz oder die Aminosäuresequenz eines Proteins, das zu einer Desaturase homolog ist, welche weniger Aminosäuren als die Vollängen-Desaturase oder das Vollängenprotein aufweisen, das zu einer Desaturase homolog ist, und zumindest eine Aktivität einer Desaturase aufweisen. Gewöhnlich umfassen biologisch aktive Teile (Peptide, z.B. Peptide, die zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität einer Desaturase. Überdies können andere biologisch aktive Teile, in denen andere Bereiche des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt und bezüglich einer oder mehrerer der hier beschriebenen Aktivitäten untersucht werden. Die biologisch aktiven Teile einer Desaturase umfassen vorzugsweise ein/eine oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Teile davon mit biologischer Aktivität.
Desaturasen werden vorzugsweise durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt. Zum Beispiel wird ein das Protein kodierendes Nukleinsäuremolekül in einen Expressionsvektor (wie vorstehend beschrieben) kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle (wie vorstehend beschrieben) eingebracht, und die Desaturase wird in der Wirtszelle exprimiert. Die Desaturase kann dann durch ein geeignetes Reinigungsschema mittels Standard- Proteinreinigungstechniken aus den Zellen isoliert werden. Alternativ zur rekombinanten Expression kann eine Desaturase, ein -Polypeptid, oder -Peptid mittels Standard-Peptidsynthese- techniken chemisch synthetisiert werden. Überdies kann native Desaturase aus Zellen (z.B. Endothelzellen) z.B. unter Verwendung eines Anti-Desaturase-Antikörpers isoliert werden, der durch Standardtechniken produziert werden kann, wobei eine erfindungs- gemäße Desaturase oder ein Fragment davon verwendet wird. Die Erfindung stellt auch chimäre Desaturase-Proteine oder Desaturase-Fusionsproteine bereit. Wie hier verwendet, umfasst ein "chimäres Desaturase-Protein" oder "Desaturase-Fusions- protein" ein Desaturase-Polypeptid, das funktionsfähig an ein nicht-Desaturase-Polypeptid gebunden ist . Ein "Desaturase-Polypeptid" betrifft ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die einer Desaturase entspricht, wohingegen ein "nicht-Desaturase- Polypeptid" ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz betrifft, die einem Protein entspricht, das im wesentlichen nicht homolog zu der Desaturase ist, z.B. ein Protein, das sich vom der Desaturase unterscheidet und aus dem gleichen oder einem anderen Organismus stammt. Innerhalb des Fusionsproteins soll der Begriff "funktionsfähig verbunden" bedeuten, dass das Desaturase-Polypeptid und das nicht-Desaturase-Polypeptid so miteinander fusioniert sind, dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der verwendeten Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen. Das nicht-Desaturase-Polypeptid kann an den N-Terminus oder den C-Terminus des Desaturase-Polypeptids fusioniert sein. Bei einer Ausführungsform ist das Fusionsprotein zum Beispiel ein GST-Desaturase-Fusionsprotein, bei dem die Desaturase-
Sequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Diese Fusionsproteine können die Reinigung der rekombinanten Desaturasen erleichtern. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Fusionsprotein eine Desaturase, die eine heterologe Signal- sequenz an ihrem N-Terminus aufweist. In bestimmten Wirtszellen (z.B. Säuger-Wirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion einer Desaturase durch Verwendung einer heterologen Signalsequenz gesteigert werden.
Ein erfindungsgemäßes chimäres Desaturase-Protein oder
Desaturase-Fusionsprotein wird durch Standard-DNA-Rekombinations- techniken hergestellt. Zum Beispiel werden DNA-Fragmente, die unterschiedliche Polypeptidsequenzen kodieren, gemäß herkömmlicher Techniken im Leseraster aneinander ligiert, indem beispielsweise glatte oder überhängende Enden zur Ligation, Restriktionsenzymspaltung zur Bereitstellung geeigneter Enden, Auffüllen kohäsiver Enden, wie erforderlich, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um ungewollte Verknüpfungen zu vermeiden, und enzymatische Ligation eingesetzt werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Fusionsgen durch herkömmliche Techniken, einschließlich DNA-Syntheseautomaten, synthetisiert werden. Alternativ kann eine PCR-Amplifizierung von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern durchgeführt werden, die komplementäre Überhänge zwischen aufeinanderfolgenden Gen- fragmenten erzeugen, die anschließend miteinander hybridisiert und reamplifiziert werden können, so dass eine chimäre Gensequenz erzeugt wird (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Hrsgb. Ausubel et al . , John Wiley & Sons: 1992). Überdies sind viele Expressionsvektoren kommerziell erhältlich, die bereits eine Fusionseinheit (z.B. ein GST-Polypeptid) kodieren. Eine Desaturase-kodierende Nukleinsäure kann in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, so dass die Fusionseinheit im Leseraster mit dem Desaturase-Protein verbunden ist.
Homologe der Desaturase können durch Mutagenese, z.B. durch spezifische Punktmutation oder Verkürzung der Desaturase, erzeugt werden. Der Begriff "Homologe", wie hier verwendet, betrifft eine Variante Form der Desaturase, die als Agonist oder Antagonist der Desaturase-Aktivität wirkt. Ein Agonist der Desaturase kann im wesentlichen die gleiche Aktivität wie die oder einen Teil der biologischen Aktivitäten der Desaturase beibehalten. Ein Antagonist der Desaturase kann eine oder mehrere Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form der Desaturase durch zum Beispiel kompetitive Bindung an ein stromabwärts oder -aufwärts gelegenes Element der Stoffwechselkaskade für Zellmembrankomponenten, welche die Desaturase umfasst, oder durch Bindung an eine Desaturase, welche den Transport von Verbindungen über Zellmembranen vermittelt, hemmen, wodurch die Translokation gehemmt wird.
Bei einer alternativen Ausführungsform können Homologe der Desaturase durch Sichten kombinatorischer Banken von Mutanten, z.B. Verkürzungsmutanten, der Desaturase hinsichtlich Desaturase- Agonisten- oder -Antagonisten-Aktivität identifiziert werden. Bei einer Ausführungsform wird eine variegierte Bank von Desaturase- - Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäure- ebene erzeugt und durch eine variegierte Genbank kodiert . Eine variegierte Bank von Desaturase-Varianten kann z.B. durch enzymatische Ligation eines Gemisches von synthetischen Oligo- nukleotiden in Gensequenzen hergestellt werden, so dass sich ein degenerierter Satz potentieller Desaturase-Sequenzen als individuelle Polypeptide oder alternativ als Satz größerer Fusionsproteine (z.B. für das Phage-Display) , die diesen Satz von Desaturase-Sequenzen enthalten, exprimieren lässt. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Desaturase-Homologen aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA- Syntheseautomaten durchgeführt und das synthetische Gen dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Satzes von Genen ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen, die den gewünschten Satz an potentiellen Desaturase-Sequenzen kodieren, in einem Gemisch. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al . (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al . (1983) Nucleic Acids Res. 11:477) .
Zusätzlich können Banken von Desaturase-Fragmenten zur Herstellung einer variegierten Population von Desaturase-Fragmenten für das Sichten und für die anschließende Selektion von Homologen einer Desaturase verwendet werden. Bei einer Ausführungsform kann eine Bank von Fragmenten der kodierenden Sequenz durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer kodierenden Desaturase-Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen Doppelstrangbrüche nur etwa einmal pro Molekül erfolgen, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, welche Sense/Antisense-Paare von verschiedenen Produkten mit Doppelstrangbrüchen umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit Sl-Nuklease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Mit diesem Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente der Desaturase verschiedener Größen kodiert .
Im Fachgebiet sind mehrere Techniken für das Sichten von Genprodukten in kombinatorischen Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und für das Sichten von cDNA-Banken nach Genprodukten mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Sichtung der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von Desaturase-Homologen erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Sichtung großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterworfen werden können, umfassen gewöhnlich das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren von geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Muta- genese (REM) , eine neue Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken erhöht, kann in Kombination mit den Sichtungstests zur Identifikation von Desaturase-Homologen verwendet werden (Arkin und Yoürvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3) :327-331) .
Eine weitere bekannte Technik zur Veränderung von katalytischen Eigenschaften von Enzymen bzw. deren codierenden Genen ist das "Gen-Shuffling" (siehe z.B. in Stemmer, PNAS 1994, 91: 10747-10751, WO9720078 oder W09813487), das eine Kombination von Genfragmenten darstellt, wobei diese Neukombination zusätzlich noch durch fehlerhafte Polymerasekettenreaktionen variiert werden kann und somit eine hohe zu testende Sequenzdiversität schafft. Voraussetzung für den Einsatz eines solchen Ansatzes ist jedoch ein geeignetes Screeningsystem, um die erstellte Gendiversität auf Funktionalität zu überprüfen.
Insbesondere für die Sichtung von Desaturaseaktivitäten ist ein Sichtungsverfahren Voraussetzung, das PUFA-abhängig Enzymaktivität (en) erfaßt. Bzgl. Desaturaseaktivitäten mit Spezifität für PUFAs kann man in Mucor-Species, die durch bekannte Transformationsverfahren mit gewünschten Genkonstrukten transformierbar sind, die Toxizität von Arachidonsäure in An- Wesenheit eines toxischen Metaboliten (hier: Salicylsäure oder Salicylsäurederivate) nutzen (Eroshin et al . , Mikrobiologiya, Vol. 65, No.l 1996, Seiten 31-36), um eine wachstumsbasierte Erstsichtung durchzuführen. Resultierende Klone können dann einer Analyse ihrer Lipidinhaltstoffe mittels Gaschromatographie und Massenspektroskopie unterzogen werden, um Edukte und Produkte in Art und Menge zu erfassen.
Bei einer weiteren Ausführungsform können Tests auf Zellbasis zur Analyse einer variegierten Desaturase-Bank unter Verwendung von weiteren im Fachgebiet bekannten Verfahren ausgenutzt werden.
E. Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Protein- homologen, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können bei einem oder mehreren der nachstehenden Verfahren verwendet werden: Identifikation von Phaeodactylum und verwandten Organismen, Kartierung der Genome von Organismen, die mit Phaeodactylum tricornutum verwandt sind, Identifikation und Lokalisierung von Phaeodactylum tricornutum-Sequenzen von
Interesse, EvolutionsStudien, Bestimmung von Desaturase-Protein- bereichen, die für die Funktion notwendig sind, Modulation einer Desaturase-Aktivität; Modulation des Stoffwechsels einer oder mehrerer Zellmembrankomponenten; Modulation des Transmembran- transports einer oder mehrerer Verbindungen sowie Modulation der zellulären Produktion einer gewünschten Verbindung, wie einer Feinchemikalie . Die erfindungsgemäßen Desaturase-Nukleinsäure- moleküle haben eine Vielzahl von Verwendungen. Sie können zunächst zur Identifikation eines Organismus als Phaeodactylum tricornutum oder als naher Verwandter davon verwendet werden. Sie können auch zur Identifikation des Vorliegens von Phaeodactylum tricornutum oder eines Verwandten davon in einer Mischpopulation von Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die Nukleinsäuresequenzen einer Reihe von Phaeodactylum tricornutum- Genen bereit; durch Sondieren der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer einheitlichen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, die einen Bereich eines Phaeodactylum tricornutum -Gens oder von Teilen davon überspannt, das für diesen Organismus einzigartig ist, kann man bestimmen, ob dieser Organismus vorliegt. Phaeodactylum tricornutum selbst werden zur kommerziellen Produktion mehrfach ungesättigter Säuren verwendet und eignen darüber hinaus zur PUFA-Produktion auch in anderen Organismen insbesondere wenn erreicht werden soll, dass resultierende PUFAs auch in die Tri- acylglycerolfraktion eingebaut werden sollen.
Ferner können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen. Dies ist nicht nur zur Kartierung des Genoms, sondern auch für funktioneile Phaeodactylum tricornutum-Proteinen geeignet. Zur Identifikation des Genombereichs, an den ein bestimmtes DNA- bindendes Protein von Phaeodactylum tricornutum bindet, könnte das Phaeodactylum tricornutum-Genom zum Beispiel gespalten werden und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nuklemsäuremolekülen, vorzugsweise mit leicht nachweisbaren Markierungen, sondiert werden; die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisierung des Fragments auf der Genomkarte von Phaeodactylum tricornutum und erleichtert, wenn dies mehrmals mit unterschiedlichen Enzymen durchgeführt wird, eine rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an die das Protein bindet. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem ausreichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, dass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte bei verwandten Pilzen oder Algen dienen können.
Die erfindungsgemäßen Desaturase-Nukleinsäuremoleküle eignen sich auch für Evolutions- und Prot instruktur-Untersuchungen. Die Stoffwechsel- und Transportprozesse, an denen die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden von vielen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen genutzt; durch Vergleich der Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit solchen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen kodieren, kann der Evolutions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden. Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung, welche Sequenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestimmung von Bereichen des Proteins hilfreich sein kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind. Dieser Typ der Bestimmung ist für Proteinengineering-Untersuchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, wieviel Mutagenese das Protein tolerieren kann, ohne die Funktion zu verlieren.
Die Manipulation der erfindungsgemäßen Desaturase-Nukleinsäure- moleküle kann zur Produktion von Desaturasen mit funktioneilen Unterschieden zu den Wildtyp-Desaturasen führen. Die Effizienz oder Aktivität dieser Proteine kann verbessert sein, sie können in größeren Anzahlen als gewöhnlich in der Zelle zugegen sein, oder ihre Effizienz oder Aktivität kann verringert sein. Verbesserte Effizienz oder Aktivität bedeutet beispielsweise, dass das Enzym eine höhere Selektivität und/oder Aktivität, vorzugsweise eine mindestens 10 % höhere, besonders bevorzugt eine mindestens 20 % höhere Aktivität, ganz besonders bevorzugt eine mindestens 30 % höhere Aktivität als das ursprüngliche Enzym aufweist.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung einer erfindungsgemäßen Desaturase die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie, welche ein solches verändertes Protein enthält, direkt beeinflussen kann. Die Gewinnung von Feinchemikalien-Verbindungen aus Kulturen von Ciliaten, Algen oder Pilzen im großen Maßstab ist signifi- kant verbessert, wenn die Zelle die gewünschten Verbindungen sezerniert, da diese Verbindungen aus dem Kulturmedium (im Gegensatz zur Extraktion aus der Masse der gezüchteten Zellen) leicht gereinigt werden können. Ansonsten lässt sich die Reinigung verbessern, wenn die Zelle in vivo Verbindungen in einem speziali- sierten Kompartiment mit einer Art Konzentrationsmechanismus speichert. Bei Pflanzen, die Desaturasen exprimieren, kann ein gesteigerter Transport zu besserer Verteilung innerhalb des Pflanzengewebes und der -organe führen. Durch Vergrößern der Anzahl oder der Aktivität von Transportermolekülen, welche Fein- Chemikalien aus der Zelle exportieren, kann es möglich sein, die Menge der produzierten Feinchemikalie, die im extrazellulären Medium zugegen ist, zu steigern, wodurch Ernte und Reinigung oder bei Pflanzen eine effizientere Verteilung erleichtert werden. Zur effizienten Überproduktion einer oder mehrerer Feinchemikalien sind dagegen erhöhte Mengen an Cofaktoren, Vorläufermolekülen und Zwischenverbindungen für die geeigneten Biosynthesewege erforderlich. Durch Vergrößern der Anzahl und/oder der Aktivität von Transporterproteinen, die am Import von Nährstoffen, wie Kohlenstoffquellen (d.h. Zuckern), Stickstoffquellen (d.h. Aminosäuren, Ammoniumsalzen) , Phosphat und Schwefel, beteiligt sind, kann man die Produktion einer Feinchemikalie aufgrund der Beseitigung aller Einschränkungen des Nährstoffangebots beim Biosynthese- prozess verbessern. Fettsäuren, wie PUFAs, und Lipide, die PUFAs enthalten, sind selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch Optimieren der Aktivität oder Erhöhen der Anzahl einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Desaturasen, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Stören der Aktivität einer oder mehrerer Desaturasen, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann man somit die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmole- küle in Ciliaten, Algen, Pflanzen, Pilzen, Hefen oder anderen Mikroorganismen steigern.
Die Manipulation eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Desaturase-Gene kann ebenfalls zu Desaturasen mit veränderten Aktivitäten führen, welche die Produktion einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien aus Algen, Pflanzen, Ciliaten oder Pilzen indirekt beeinflussen. Die normalen biochemischen Stoffwechselprozesse führen z.B. zur Produktion einer Vielzahl an Abfallprodukten (z.B. Wasserstoffperoxid und andere reaktive Sauerstoffspezies) , die diese Stoffwechselprozesse aktiv stören können (z.B. nitriert Peroxynitrit bekanntlich Tyrosin-Seiten- ketten, wodurch einige Enzyme mit Tyrosin im aktiven Zentrum inaktiviert werden (Groves, J.T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (2) ,-226-235) ) . Diese Abfallprodukte werden zwar üblicherweise ausgeschieden, aber die zur fermentativen Produktion im großen Maßstab verwendeten Zellen werden für die Überproduktion einer oder mehrerer Feinchemikalien optimiert und können somit mehr Abfallprodukte produzieren als für eine Wildtypzelle üblich. Durch Optimieren der Aktivität einer oder mehrerer erfindungs- gemäßer Desaturasen, die am Export von Abfallmolekülen beteiligt sind, kann man die Lebensfähigkeit der Zelle verbessern und eine effiziente Stoffwechselaktivität aufrechterhalten. Auch das Vorliegen hoher intrazellulärer Mengen der gewünschten Feinchemikalie kann tatsächlich für die Zelle toxisch sein, so dass man durch Steigern der Fähigkeit der Zelle zur Sekretion dieser Verbindungen die Lebensfähigkeit der Zelle verbessern kann.
Die erfindungsgemäßen Desaturasen können ferner so manipuliert sein, dass die relativen Mengen verschiedener Lipid- und Fettsäuremoleküle verändert werden. Dies kann eine entscheidende Aus- Wirkung auf die Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipidtyp unterschiedliche physikalische Eigenschaften hat, kann eine Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die Membranfluidität signifikant verändern. Änderungen der Membranfluidität können den Transport von Molekülen über die Membran beeinflussen, was, wie vorstehend erläutert, den Export von Abfallprodukten oder der produzierten Feinchemikalie oder den Import notwendiger Nährstoffe modifizieren kann. Diese Änderungen der Membranfluidität können auch die Integrität der Zelle entscheidend beeinflussen; Zellen mit vergleichsweise schwächeren Membranen sind anfälliger gegenüber abiotischen und biotischen Stressbedingungen, welche die Zelle beschädigen oder abtöten können. Durch Manipulieren von Desaturasen, die an der Produktion von Fettsäuren und Lipiden für den Membranaufbau beteiligt sind, so dass die resultierende Membran eine Membranzusammensetzung hat, die für die in den Kulturen, die zur Produktion von Feinchemikalien verwendet werden, herrschenden Umweltbedingungen empfänglicher sind, sollte ein größerer Anteil der Zellen überleben und sich vermehren. Größere Mengen an produzierenden Zellen sollten sich in größeren Ausbeuten, höherer Produktion oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie aus der Kultur manifestieren.
Die vorstehend genannten Mutagenesestrategien für Desaturasen, die zu erhöhten Ausbeuten einer Feinchemikalie führen sollen, sollen nicht beschränkend sein; Variationen dieser Strategien sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Unter Verwendung dieser Mechanismen und mithilfe der hier offenbarten Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle zur Erzeugung von Algen, Ciliaten, Pflanzen, Tieren, Pilzen oder anderen Mikroorganismen, wie C. glutamicum, verwendet werden, die mutierte Desaturase-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle expri- mieren, so dass die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung verbessert wird. Diese gewünschte Verbindung kann ein beliebiges natürliches Produkt von Algen, Ciliaten, Pflanzen, Tieren, Pilzen oder Bakterien sein, welches die Endprodukte von Biosynthesewegen und Zwischenprodukte natürlich vorkommender Stoffwechselwege umfasst, sowie Moleküle, die im Stoffwechsel dieser Zellen nicht natürlich vorkommen, die jedoch von den erfindungsgemäßen Zellen produziert werden.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Verfahren zur Produktion von PUFAs, wobei das Verfahren das Züchten eines Organismus, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt oder einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst, welche ein Polypeptid kodieren, das Cis-, C o~ oder C -Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül um mindestens zwei Kohlenstoffatome unter Bedingungen, unter denen PUFAs in dem Organismus produziert werden, verlängert, umfasst. Durch dieses Verfahren hergestellte PUFAs lassen sich durch Ernten der Organismen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder von dem Feld, Aufbrechen und/oder Extrahieren des geernteten Materials mit einem organischen Lösungsmittel isolieren. Aus diesem Lösungsmittel kann das Öl, das Lipide, Phospholipide, Sphingolipide, Glyco- lipide, Triacylglycerme und/oder freie Fettsäuren mit höherem Gehalt an PUFAs enthält, isoliert werden. Durch basische oder saure Hydrolyse der Lipide, Phospholipide, Sphingolipide, Glyco- lipide, Triacylglycerme können die freien Fettsäuren mit höherem Gehalt an PUFAs isoliert werden. Ein höherer Gehalt an PUFAs bedeutet mindestens 5 %, vorzugsweise 10 %, besonders bevorzugt 20 %, ganz besonders bevorzugt 40 % mehr PUFAs als der ursprüngliche Organismus, der keine zusätzliche Nukleinsäure, die die erfindungsgemäße Desaturase kodiert, besitzt.
Vorzugsweise sind die durch dieses Verfahren produzierten PUFAs Cis- oder C2o-22 -Fettsäuremoleküle mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise drei, vier, bei Kombination mit einer weiteren Elongasen und einer Δ-4 Desaturase fünf oder sechs Doppelbindungen. Diese C18- oder C o-22-Fettsäure- moleküle lassen sich aus dem Organismus in Form eines Öls, Lipids oder einer freien Fettsäure isolieren. Geeignete Organismen sind beispielsweise die vorstehend erwähnten. Bevorzugte Organismen sind transgene Pflanzen.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform sind Öle, Lipide oder Fettsäuren oder Fraktionen davon, die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt worden sind, besonders bevorzugt Öl, Lipid oder eine FettSäurezusammensetzung, die PUFAs umfassen und von transgenen Pflanzen herrühren.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung des Öls, Lipids oder der Fettsäurezusammensetzung in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Identifikation eines Antagonisten oder Agonisten von Desaturasen, umfassend
a) in Kontaktbringen der Zellen, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimieren, mit einem Kandidatenstoff;
b) Testen der Desaturaseaktivität;
c) Vergleichen der Desaturaseaktivität mit einer Standardaktivität in Abwesenheit des Kandidatenstoffs, wobei ein Anstieg der Desaturaseaktivität über den Standard anzeigt, daß der Kandidatenstoff ein Agonist und ein Verringerung der Desaturaseaktivität anzeigt, daß der Kandidatenstoff ein Antagonist ist . Der genannte Kandidatenstoff kann ein chemisch synthetisierter oder mikrobiologisch produzierter Stoff sein und z.B. in Zellextrakten von z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auftreten. Weiterhin kann der genannte Stoff zwar im Stand der Technik bekannt sein, aber bisher nicht bekannt sein als die Aktivität der Desaturasen steigernd oder repremierend. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. allgemein beschrieben in Alberts, Mole- cular Biology the cell, 3rd Edition (1994), z.B. Kapitel 17. Die genannten Stoffe können z.B. zu dem Reaktionsgemisch oder dem Kulturmedium zugegeben werden oder den Zellen injiziert werden oder auf eine Pflanze gesprüht werden.
Wenn eine Probe, die ein nach der erfindungsgemäßen Methode aktiven Stoff beinhaltet, identifiziert wurde, dann ist es entweder möglich, den Stoff direkt von der ursprünglichen Probe zu isolieren oder man kann die Probe in verschiedene Gruppen teilen, z.B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu reduzieren und dann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer solchen "Unterprobe" der ursprünglichen Probe zu wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Probe nur noch eine geringe Anzahl von Substanzen oder nur noch eine Substanz umfaßt . Vorzugsweise wird der gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Stoff oder Derivate davon weiter formuliert, so, daß er für die Anwendung in der Pflanzenzüchtung oder Pflanzen- zell- oder Gewebekultur geeignet ist.
Die Stoffe, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet und identifiziert wurden, können sein: Expressionsbibliotheken, z.B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäu- ren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen) . Diese Stoffe könne auch funktionelle Derivate oder Analogon der bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Verfahren zur Herstellung von chemischen Derivaten oder Analogon sind dem Fachmann 'bekannt . Die genannten Derivate und Analogon können gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik getestet werden. Weiterhin kann computergestütztes Design oder Peptidomimetics zur Herstellung geeigneter Derivate und Analogon verwendet werden. Die Zelle oder das Gewebe, die/das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, ist vorzugsweise eine erfindungsgemäße Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe, wie in den oben genannten Ausführungsformen beschrieben.
Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Stoff, der gemäß den vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde. Der Stoff ist z.B. ein Homolog der erfindungsgemäßen Desaturasen. Homologe der Desaturasen können durch Mutagenese, z.B. durch Punktmutation oder Deletion der Desaturasen, erzeugt werden. Hierin verwendet wird der Begriff "Homolog" als eine Variante Form der Desaturasen, die als Agonist oder Antagonist für die Aktivität der Desaturasen wirkt. Ein Agonist kann die im wesentlichen gleiche oder einen Teil der biologischen Aktivität der Desaturasen haben. Ein Antagonist der Desaturasen kann eine oder mehr Aktivitäten der natürlich vor- kommenden Formen der Desaturasen inhibieren, z.B. kompetitiv an ein Downstreaia oder Upstream gelegenes Mitglied der Fettsäure- synthese-Stoffwechselwege, die die Desaturasen einschließen, binden oder an Desaturasen binden und dabei die Aktivität reduzieren oder inhibieren.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Antikörper oder ein Fragment davon, wie sie hierin beschrieben werden, der die Aktivität der erfindungsgemäßen Desaturasen inhibiert.
Bei einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Antikörper, der spezifisch den erfindungsgemäßen oben beschriebenen Agonisten oder Antagonisten erkennt bzw. bindet.
Ein weiterer Aspekt betrifft eine Zusammensetzung, die den Anti- körper, den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Stopp oder das Antisense-Molekül umfaßt .
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, umfassend die erfindungsgemäße Nukleinsäure, das erfindungsgemäße Genkonstrukt, die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül, den erfindungsgemäßen Antikörper und/oder Zusammensetzung, einen Antagonisten oder Agonisten, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, und/oder erfindungsgemäße Öle, Lipide und/oder Fettsäuren oder eine Fraktion davon. Ebenso kann das Kit die erfindungsgemäßen Wirtszellen, Organismen, Pflanzen oder Teile davon, erntbare Teile der erfindungsgemäßen Pflanzen oder Vermehrungsmaterial oder aber auch den erfindungsgemäßen Antagonisten oder Agonisten umfassen. Die Komponenten des Kits der vorliegenden Erfindung können in geeigneten Containern, beispielsweise mit oder in Puffern oder anderen Lösungen verpackt sein. Ein oder mehr der genannten Komponenten können in ein und demselben Container verpackt sein. Zusätzlich oder alternativ können ein oder mehr der genannten Komponenten z.B. auf einer festen Oberfläche adsorbiert sein, z.B. Nitrozellulosefilter, Glasplatten, Chips, Nylonmembranen oder Mikrotiterplatten. Das Kit kann für jede der hierin beschriebenen Methoden und Ausführungsformen verwendet werden, z.B. für die Produktion von Wirtszellen, transgenen Pflanzen, zur Detektion von homologen Sequenzen, zur Identifikation von Antagonisten oder Agonisten usw. Weiterhin kann das Kit Anleitungen für die Verwendung des Kits für eine der genannten Anwendungen enthalten.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefaßt werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispielteil
Beispiel 1: Allgemeine Verfahren
a) Allgemeine Klonierungsverfahren:
Klonierungsverfahren, wie beispielsweise Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose- und Nylonmembranen, Verbindung von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli- und Hefe-Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA, wurden durchgeführt wie beschrieben in Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) oder Kaiser, Michaelis und Mitchell (1994) "Methods in Yeast Genetics" (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-451-3). Die Transformation und Anzucht von Algen, wie Chlorella oder Phaeodactylum werden durchgeführt wie beschrieben von El-Sheekh (1999), Biologia Plantarum 42:209-216; Apt et al. (1996) Molecular and General Genetics 252 (5):872-9.
b) Chemikalien
Die verwendeten Chemikalien wurden, wenn im Text nicht anders angegeben, in p. A. -Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm) , Merck (Darmstadt) , Roth (Karlsruhe) , Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen) bezogen. Lösungen wurden unter Verwendung von reinem pyrogenfreiem Wasser, im nachstehenden Text als H0 bezeichnet, aus einer Milli-Q-Wassersystem-Wasserreinigungs- anlage (Millipore, Eschborn) hergestellt. Restriktionsendo- nukleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden bezogen von den Firmen AGS (Heidelberg) , Amersham (Braunschweig) , Biometra (Göttingen) , Boehringer (Mannheim) , Genomed (Bad Oeynhausen) , New England Biolabs (Schwalbach/
5 Taunus) , Novagen (Madison, Wisconsin, USA) , Perkin-Elmer (Weiterstadt) , Pharmacia (Freiburg) , Qiagen (Hilden) und Stratagene (Amsterdam, Niederlande) . Wenn nicht anders ange-
• geben, wurden sie nach den Anweisungen des Herstellers verwendet.
10
Zellmaterial
Die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenzen sind im Genom eines Phaeodactylum tricornutum UTEX646-Stammes enthalten, 15 der über die Algensammlung der University of Texas, Austin verfügbar ist .
Phaeodactylum tricornutum wurde bei 25°C mit einem Licht/Dunkel Rhythmus von 14:10 Stunden bei 22°C und 35 microEinstein (ent- 20 spricht micromol Photonen pro Quadratmeter und Sekunde) in Glasröhren kultiviert, die von unten mit Luft begast wurden.
Als Kulturmedium für Phaeodactylum tricornutum wurde das f/2 Kulturmedium mit 10 % organischen Medium nach Guillard, R.R.L. 25 verwendet (1975; Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates . In: Smith, W.L. and Chanley, M.H. (Eds.) Culture of marine Invertebrate animals, NY Plenum Press, pp. 29-60.): Es enthält
30 995,5 ml Seewasser (artifiziell)
1 ml NaN03 (75 g/1), 1 ml NaH2P04 (5 g/1), 1 ml Spurenelemente- lösung, 1 ml Tris/Cl pH 8.0, 0.5 ml f/2 Vitaminlösung
Spurenelementelösung: Na2EDTA (4,36 g/1), FeCl3 (3,15 g/1), 35 Primäre Spurenelemente: CuS04 (10 g/1), ZnS04 (22 g/1), CoCl2
(10 g/1), MhCl2 (18 g/1), NaMo04 (6,3 g/1) f/2 Vitaminlösung: Biotin: 10 mg/1, Thia in 200 mg/1, Vit B12
0,1 mg/1 org-Medium: Na-Acetat (1 g/1) , Glucose (6 g/1) , Na-Succinat 40 (3 g/1), Bacto-Trypton (4 g/1), Hefe-Extrakt (2 g/1)
45 Beispiel : 2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Phaeodactylum tricornutum UTEX646 für Hybridisierungsexperimente
Die Einzelheiten der Isolierung von Gesamt-DNA betreffen die Auf- 5 arbeitung von Pflanzenmaterial mit einem Frischgewicht von einem Gramm.
CTAB-Puffer: 2 % (Gew. /Vol.) N-Acetyl-N,N,N-trimethylammonium- bromid (CTAB) ; 100 M Tris-HCl, pH 8,0; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA. 10
N-Laurylsarkosin-Puffer: 10 % (Gew. /Vol.) N-Laurylsarkosin; 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM EDTA.
Phaeodactylum tricornutum-Zellmaterial wurde unter flüssigem
15 Stickstoff in einem Mörser verrieben, so dass ein feines Pulver erhalten wurde, und in 2 ml-Eppendorfgefäße überführt. Das gefrorene Pflanzenmaterial wurde dann mit einer Schicht von 1 ml Zersetzungspuffer (1 ml CTAB-Puffer, 100 ml N-LaurylsarkosinPuffer, 20 ml ß-Mercaptoethanol und 10 ml Proteinase K-Lösung,
20 10 mg/ml) überschichtet und eine Stunde unter kontinuierlichem Schütteln bei 60°C inkubiert. Das erhaltene Homogenat wurde in zwei Eppendorfgefäße (2 ml) aufgeteilt und zweimal durch Schütteln mit dem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Zur Phasentrennung wurde eine Zentrifugation
25 bei 8000 x g und RT (= Raumtemperatur = ~ 23°C) jeweils 15 min lang durchgeführt. Die DNA wurde dann 30 min unter Verwendung von eiskaltem Isopropanol bei -70°C gefällt. Die gefällte DNA wurde bei 10000 g 30 min bei 4°C sedimentiert und in 180 ml TE-Puffer (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN
30 0-87969-309-6) resuspendiert. Zur weiteren Reinigung wurde die DNA mit NaCl (1,2 M Endkonzentration) behandelt und erneut 30 min unter Verwendung des zweifachen Volumens an absolutem Ethanol bei -70°C gefällt. Nach einem Waschschritt mit 70 % Ethanol wurde die DNA getrocknet und anschließend in 50 ml H20 + RNAse (50 mg/ml
35 Endkonzentration) aufgenommen. Die DNA wurde über Nacht bei 4°C gelöst und die RNAse-Spaltung wurde anschließend 1 Std. bei 37°C durchgeführt. Die Aufbewahrung der DNA erfolgte bei 4°C.
Beispiel 3: Isolierung von Gesamt-RNA und poly(A)+-RNA aus 40 Pflanzen und Phaeodactylum tricornutum
Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen wie Lein und Raps etc . erfolgt nach einer bei Logemann et al beschriebenen Methode (1987, Anal. Biochem. 163, 21) isoliert. Aus Moos kann 45 die Gesamt-RNA Protonema-Gewebe nach dem GTC-Verfahren (Reski et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 244:352-359) gewonnen werden. RNA Isolierung aus Phaeodactylum tricornutum:
Tiefgefrorene Algenproben (- 70°C) wurden in einem eiskaltem Mörser unter Flüssigstickstoff zu feinem Pulver zerreiben. 2 Volumen Homogenisationsmedium (12,024 g Sorbitol, 40,0 ml IM Tris-HCl, pH 9 (0,2 M); 12,0 ml 5 M NaCl (0,3 M), 8,0 ml 250 mM EDTA, 761,0 mg EGTA, 40,0 ml 10 % SDS wurden auf 200 ml mit H20 aufgefüllt und der pH auf 8,5 eingestellt) und 4 Volumen Phenol mit 0,2 % Mercaptoethanol wurden bei 40 bis 50°C unter gutem Mischen zu gefrorenem Zellpulver gegeben. Danach wurden 2 Volumen Chloroform hinzufügen und für 15 min kräftig gerührt. Es wurde 10 min bei 10000 g zentrifugiert und die wässrige Phase mit Phenol/Chloroform (2 Vol) und abschließend mit Chloroform extrahiert .
Das erhaltene Volumen der wässrigen Phase wurde mit 1/20 Vol 4 M Na-Acetat (pH 6) und 1 Vol Isopropanol (eiskalt) versetzet und die Nukleinsäuren bei -20°C über Nacht (= ÜN) gefällt. Anschließend wurde 30 min bei 10000 g zentrifugiert und der Überstand abgesogen. Es folgte ein Waschschritt mit 70 % EtOH und erneute Zentrifugation. Das Sediment wurde in Tris-Borat- Puffer (80 mM Tris-Borat-Puffer, 10 mM EDTA, pH 7,0) aufgenommen. Dann wurde der Überstand mit 1/3 Vol 8 M LiCl versetzt, gemischt 30 min bei 4°C inkubiert. Nach erneutem zentrifugieren wurde das Sediment mit 70 % Ethanol gewaschen, zentrifugiert und das Sediment in RNAse-freiem Wasser gelöst .
Die Isolierung von poly(A)+-RNA erfolgte unter Verwendung von Dyna Beads (Dynal, Oslo, Finnland) nach den Anweisungen im Protokoll des Herstellers.
Nach der Bestimmung der RNA- oder poly(A) +-RNA-Konzentration wurde die RNA durch Zugabe von 1/10 Volumina 3 M Natriumacetat, pH 4,6, und 2 Volumina Ethanol gefällt und bei -70°C aufbewahrt.
Für die Analyse wurden jeweils 20 μg RNA in einem Formaldehyd- haltigen l,5%igen Agarosegel aufgetrennt und auf Nylon Membranen (Hybond, Amersham) überführt. Der Nachweis spezifischer Transkripte wurde wie bei Amasino beschrieben durchgeführt ((1986) Anal. Biochem. 152, 304)).
Beispiel 4: Konstruktion der cDNA-Bank
Zur Konstruktion der cDNA-Bank aus Phaeodactylum tricornutum wurde die Erststrangsynthese unter Verwendung von Reverser Transkriptase aus Maus-Leukämie-Virus (Röche, Mannheim, Deutschland) und Oligo-d(T) -Primern, die Zweitstrangsynthese durch Inkubation mit DNA-Polymerase I, Klenow-Enzym und RNAse H-Spaltung bei'l2°C (2 Std.), 16°C (1 Std.) und 22°C (1 STd. ) erzielt. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 65°C (10 min) gestoppt und anschließend auf Eis überführt. Doppelsträngige DNA- Moleküle wurde mit T4-DNA-Polymerase (Röche, Mannheim) bei 37°C (30 min) mit glatten Enden versehen. Die Nukleotide wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Sephadex-G50-Zentrifugiersäulen entfernt. EcoRI/XhoI-Adapter (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurden mittels T4-DNA-Ligase (Röche, 12°C, über Nacht) an die cDNA-Enden ligiert, mit Xhol nachgeschnitten und durch Inkubation mit Polynukleotidkinase (Röche, 37°C, 30 min) phosphoryliert . Dieses Gemisch wurde der Trennung auf einem Low-Melting-Agarose- Gel unterworfen. DNA-Moleküle über 300 Basenpaaren wurden aus dem Gel eluiert, Phenol-extrahiert, auf Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland) konzentriert und an Vektorarme ligiert und in lambda-ZAP-Express-Phagen unter Verwendung des Gigapack Gold-Kits (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) verpackt, wobei Material des Herstellers verwendet und seine Anweisungen befolgt wurden.
Beispiel 5 : DNA-Sequenzierung und Computeranalyse
cDNA-Banken, wie im Beispiel 4 beschrieben, wurden zur DNA- Sequenzierung nach Standardverfahren, insbesondere durch das Kettenterminationsverfahren unter Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction-Kit (Perkin- El er, Weiterstadt, Deutschland), verwendet. Die Sequenzierung zufälliger, vereinzelter Klone wurde anschließend an die präparative Plasmidgewinnung aus cDNA-Banken über in vivo-Massen- excision und Retransformation von DH10B auf Agarplatten durchgeführt (Einzelheiten zu Material und Protokoll von Stratagene, Amsterdam, Niederlande) . Plasmid-DNA wurde aus über Nacht gezüchteten E. coli-Kulturen, die in Luria-Brühe mit Ampicillin (siehe Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6)) gezüchtet worden waren, an einem Qiagen-DNA-Präparations-Roboter (Qiagen, Hilden) nach den Protokollen des Herstellers präpariert. Sequenzierprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen wurden verwendet :
5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3 ' 5 ' -CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3 ' 5 ' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 '
Die Sequenzen wurden unter Verwendung des Standard-Softwarepa- kets EST-MAX, das kommerziell von Bio-Max (München, Deutschland) geliefert wird, prozessiert und annotiert. Durch Nutzung von Vergleichsalgorithmen und unter Verwendung der in SEQ ID NO: 8 dargestellten Suchsequenz wurde mithilfe des BLAST-Programms nach homologen Genen gesucht (Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.). Zwei Sequenzen aus Phaeo- dactylum tricornutum mit Homologien zur Suchsequenz aus Physco- mitrella patens wurden eingehender charakterisiert.
Beispiel 5a: Isolation von Desaturasen aus Phaeodactylum tricornutum über Polymerase Kettenreaktion mithilfe degenerierter Oligonukleotide:
Mithilfe von publizierten Desaturasen können Motive identifiziert werden, die für Δ-5 und Δ-6 Desaturasen typisch sind. Im folgenden sind Oligonukleotidsequenzen mit möglichen Variationen dar- gestellt . Unter der Oligonukleotidsequenz ist im Ein-Buchstaben- code die Aminosäure dargestellt, von der die Basenkombination abgeleitet werden kann. Z.B. bedeutet A/G, daß an dieser Position bei der Synthese des Bausteins statistisch gleichverteilt entweder ein A oder ein G in das Oligonukleotid eingebaut wird, da das von der korrespondierenden Aminosäure abgeleitete Basen- triplett entweder ein AAA oder ein AAG sein kann. Die DNA Sequenz kann auch ein Inosin (i) enthalten, wenn die Bestimmung einer Base an dieser Position aufgrund des genetischen Codes drei oder vier unterschiedliche Basen erlaubt. Folgende Sequenzen und Primer können verwendet werden:
5 ' -Vorwärts-Primer :
Fla TGG TGG AA A/G TGG AAi CA T/C AA
Flb TGG TGG AA A/G TGG ACi CA T/C AA
Fla W W K W N/T H K/N
Flb W W K W K H > K/N
F2a Gi TGG AA A/G GAi A/C Ai CA T/C AA
F2b Gi TGG AA A/G TTG A/C Ai CA T/C AA
F2a G/W W K E/D K/Q/N H K/N
F2b G/W W K W K/Q/N H K/N
F3a T A/T i TTG AAi A/C A A/G C/A G/A i CA
F3b T A/T i TTG AAi A/C A A/G CAi CA
F3a W W K/N H/N R/Q H
F3b Y W K/N H/N R/Q H
F4a GTi TGG A A/T G/A GA A/G CA A/G CA
F4b GTi TGG A A/T G/A A/T A T/C CA A/G CA
F4a V W K/M E Q H
F4b V W K/M N/Y Q H
F5a: L: CA T/C TA T/C TGG AA A/G AA T/C CA G C
F5a] L: CA T/C TA T/C TGG AA A/G AA T/C CA A C
F5a_ L: H Y W K N Q H/Q F6a: TTG TTG AAi A/C A A/G AA i CA T/C AA
F6a: W W K/N H/N K/N H K/N
3 ' - Reverse Primer
5 Rlb: GG A/G AA iAG G/A TG G/A TG T/C TC
Rlb: GG A/G AA iAA G/A TG G/A TG T/C TC
Ria: P F L H H E
Rlb: P F F H H E
R2al AA iAG A/G TG A/G TG iA C/T iA/G T/C TG 0 R2a2 AA T/C AA A/G TG A/G TG iA C/T iA/G T/C TG
R2al F L H H V/I V/A Q
R3al AT iTG iGG A/G AA iAA A/G TG A/G TG
R3a2 AT A/G TT iGG A/G AA iAA A/G TG A/G TG
R3a3 AT iTG iGG A/G AA iAG A/G TG A/G TG 5 R3a4 AT A/G TT iGG A/G AA iAG A/G TG A/G TG
R3al I/M H/Q P F F H H
R3a2 I/M N P F L H H
R4al CT iGG A/G AA iA A/G A/G TG A/G TG
R4a2 GA iGG A/G AA iA A/G A/G TG A/G TG 0 R4a3 GT iGG A/G AA iA A/G A/G TG A/G TG
R4al = T/R/S P F F/L H H
R5al AA iAA A/G TG A/G TG T/C TC T/A/G AT T/C TG
R5a2 AA iAG A/G TG A/G TG T/C TC T/A/G AT T/C TG
R5al F F H H E I Q 5 R5a2 F L H H E I Q
R6al T iGG iA A/G iAA A/G TG A/G TG iAC
R6al T iGG iA . h/G iAG A/G TG A/G TG iAC
R6al T/N P L F/L H H V
Q Aufgrund verschiedener Variationsmöglichkeiten sind viele abgeleitete Oligonukleotide möglich, jedoch überraschenderweise gefunden wurde, dass dargestellte Oligonukleotide besonders zur Isolation von Desaturasen geeignet sein können.
5 Die Primer können in allen Kombinationen für Polymerase Kettenreaktionen eingesetzt werden. Mithilfe einzelner Kombinationen konnten Desaturase-Fragmente isoliert, wenn nachfolgende Bedingungen berücksichtigt wurden: Für PCR Reaktionen wurden jeweils 10 nMol Primer und 10 ng einer durch in vivo Excision 0 gewonnenen Plasmidbank eingesetzt. Die Plasmidbank konnte nach Protokollen des Herstellers (Stratagene) aus der Phagenbank isoliert werden. Die PCR-Reaktion wurde in einem Thermocycler (Biometra) mit der Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) und dem folgenden Temperaturprogramm durchgeführt: 3 min bei 96°C, gefolgt 5 von 35 Zyklen mit 30 s bei 96°C, 30 s bei 55°C und 1 min bei 72°C. Dabei wurde die Anlagerungstemperatur nach dem ersten Schritt von 55°C schrittweise um je 3°C erniedrigt und nach dem fünften Zyklus eine Anlagerungstemperatur • von 40°C beibehalten. Letztlich wurde ein Zyklus mit 10 min bei 72°C durchgeführt und der Ansatz durch Kühlen auf 4°C beendet.
Die Primerkombination F6a und R4a2 sind im Text unterstrichen gekennzeichnet und konnten erfolgreich zur Isolierung eines Desaturasefragmentes genutzt werden. Das resultierende Fragment konnte durch Sequenzierung verifiziert werden und zeigte Homologien zu einer Desaturase mit der Genbank Accession Nr. T36617 aus Streptomyces coelicolor. Die Homologie wurde mithilfe des BLASTP Programmes erhalten. Der Vergleich ist in Figur 4 dargestellt. Es ergaben sich Identitäten von 34 % und eine Homologie von 43 % zu Sequenz T36617. Das DNA-Fragment wurde gemäß Beispiel 7 in einem Hybridisierungsexperiment zur Isolierung eines Vollängengens nach Standardbedingungen erfindungsgemäß eingesetzt.
Die Codierregion einer so isolierten DNA-Sequenz wurde durch Übersetzung des genetischen Codes in eine Polypeptidsequenz erhalten. In SEQ ID NO: 3 ist eine 1434 Basenpaare lange
Sequenz dargestellt, die durch beschriebenes Verfahren isoliert werden konnte. Die Sequenz besitzt ein Startcodon in Position 1 bis 3 und ein Stopcodon in Position 1432-1434 und konnte in ein 477 Aminosäuren langes Polypeptid übersetzt werden. Durch Ver- gleich mit einer in WO 98 46763 beschriebenen Gensequenz wurde gefunden, dass ein nicht identisches aber homologes Fragment aus Phaeodactylum tricornutum codierend für 87 Aminosäuren vorbeschrieben wurde. Jedoch offenbart WO 98/46763 weder eine vollständige, funktionell aktive Desaturase noch Positions- oder Substratspezifiät. Dies wird auch dadurch deutlich, dass sowohl Homologien zur Δ-5, als auch zur Δ-6-Desaturase aus Mortierella alpina berichtet werden, ohne eine genaue Funktion festzulegen. Die erfindungsgemäße Sequenz hingegen codiert für eine funktioneil aktive Δ-6-Acyl Lipid Desaturase.
Beispiel 6 : Identifizierung von DNA Sequenzen codierend für Desaturasen aus Phaeodactylum tricornutum
Die Volllängensequenz der Δ-6-Acyl Lipid Desaturase Pp_des6 AJ222980 (NCBI Genbank Accession Nr.) aus dem Moos Physco- mitrella patens (siehe auch Tabelle 1) sowie die Δ-12-acyl Lipid Desaturase Sequenz (Tabelle 1 siehe Ma_desl2) aus Mortierella alpina AF110509 (AF110509 NCBI Genbank Accession Nr.) wurden für Sequenzvergleiche mithilfe des TBLASTN Suchalgorhythmus eingesetzt. Die EST-Sequenzen PT0010070010R, PT001072031R sowie PT001078032R wurden zunächst aufgrund schwacher Homologien mit den Suchsequenzen aus Physcomitrella und Mortierella unter weiteren Kandidatengenen als Zielgen in Betracht gezogen. In Figur 1 und in Figur 2 sowie Figur 2a ist das Ergebnis der zwei gefundenen est-Sequenzen dargestellt. Die gefundenen Sequenzen sind Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aus SEQ ID NO: 1 (Genname: Pt_des5, eigene Datenbank Nr. der Erfinder PT001078032R) , SEQ ID NO: 5. (Genname: Pt_desl2, eigene Datenbank NR. der Erfinder PT0010070010R) und SEQ ID NO: 11 (Genname: Pt_desl2.2, eigene Datenbank des Erfinders PT001072031R) . Buchstaben zeigen identische Aminosäuren an, während das Pluszeichen eine chemisch ähnliche Aminosäure bedeutet. Die Identitäten bzw. Homologien aller erfindungsgemäß gefundener Sequenzen gehen aus Tabelle 2 zusammenfassend hervor.
Desaturasen können Cytochrom b5 Domänen aufweisen, die auch in anderen nicht Desaturasen codierenden Genen vorkommen. Cytochrom b5 Domänen zeigen mithin hohe Homologien an, obwohl es sich um verschiedene Genfunktionen handelt. Desaturasen können schwach konservierter Bereiche lediglich als putative Kandidatengene identifiziert werden und müssen auf die Enzymaktivität und Positionsspezifität der enzymatischen Funktion hin geprüft werden. Beispielsweise zeigen auch verschiedene Hydroxylasen, Acetylenasen und Epoxygenasen ähnlich wie Desaturasen Histidin- Box Motive, so dass eine konkrete Funktion experimentell nachgewiesen werden muß und zusätzlich die Verifizierung der Doppelbindung erst eine sichere Enzymaktivität und Positionsspezifität einer Desaturase ermöglicht. Überraschenderweise wurde gefunden, dass erfindungsgemäße Δ-6- und Δ-5- Desaturase besonders geeignete Substratspezifitäten aufweisen und besonders geeignet sind, um in Kombination mit einer Δ-6-Elongase aus Physcomitrella zur Produktion von polyungesättigten Fettsäuren wie Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure genutzt werden können.
Die Sequenzierung des vollständigen cDNA Fragmentes aus Klon PT001078032R ergab eine 1652 Basenpaare lange Sequenz. Die Sequenz codiert für ein Polypeptid von 469 Aminosäuren dargestellt in SEQ ID NO: 2. Diese wurde erhalten durch Über- setzung des genetischen Codes aus SEQ ID NO: 1 mit einem Startcodon in Basenpaarposition '115-117 und mit einem Stopcodon in Basenpaarposition 1522-1524. Der Klon beinhaltet ein vollständiges Desaturase-Polypeptid, wie aus dem Sequenzvergleich in Figur 3 zu ersehen ist . Striche bedeuten identische Amino- säuren während Doppelpunkte und Einzelpunkte chemisch austauschbare, d.h. chemisch äquivalente Aminosäuren darstellen. Der Vergleich wurde mit der BLOSUM62 Austauschmatrix für Amino- säuren nach Henikoff & Henikoff durchgeführt :( (1992) Amino acid Substitution matrices from protein blocks . Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89: 10915-10919). Verwendete Parameter: Gap Weight: 8; Average Match: 2.912, Length Weight: 2, Average Mismatch: -2.003.
In Figur 6 und Figur 7 ist der Vergleich der MA_desl2 Peptid- sequenz mit den gefundenen Sequenzen dargestellt .
Die Sequenzierung des vollständigen cDNA Fragmentes aus Klon PT0010070010R ergab eine in SEQ ID NO: 5 dargestellte 1651 Basenpaare lange Sequenz mit einem Startcodon in Position 67-69 und einem Stopcodon in Position 1552-1554. Die erfindungsgemäße Poly- petidsequenz ist in SEQ ID NO: 6 dargestellt.
Die Sequenzierung des vollständigen identifizierten cDNA
Fragmentes aus Klon PT0010072031R ergab eine in SEQ ID NO: 11 dargestellte 1526 Basenpaare lange Sequenz mit einem Startcodon in Position 92-94 und einem Stopcodon in Position 1400-1402. Die erfindungsgemäße Polypetidsequenz ist in SEQ ID NO: 12 dargestellt.
In Tabelle 2 sind die Identitäten und Homologien erfindungsgemäßer Desaturasen untereinander und mit der Desaturase aus Physcomitrella patens und Mortierella alpina dargestellt. Die Angaben wurden mithilfe des Programms Bestfit unter gegebenen Parametern wie unten definiert als Teilprogramm folgender Software erhalten: Wisconsin Package Version 10.0 (Genetics Computer Group (GCG) , Madison, Wisc, USA). Henikoff, S. and Henikoff, J.G. (1992) . Amino acid Substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919.
Weiterhin ist in Figur 5 der Vergleich der Δ-6-acyl Lipid Desaturase aus Physcomitrella patens mit der Polypeptidsequenz des Klons Pt_des6 dargestellt.
Tabelle 2
Figure imgf000084_0001
n.d. = nicht durchgeführt Mithilfe des Algorhythmus TBLASTN 2.0.10: Altschul et al 1997, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 wurden über einen lokalen Datenbankvergleich Sequenzen mit höchster Sequenzhomologie bzw. Identität identifiziert. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 2A dargestellt.
Tabelle 2A: Homologe mit den höchsten Sequenzhomologien bzw Identitäten zu erfindungsgemäßen Polypeptidsequenzen aus SEQ ID NO. 2, 4, 6 oder 12
Figure imgf000085_0001
Beispiel 7 : Identifikation von Genen mittels Hybridisierung
Gensequenzen lassen sich zur Identifikation homologer oder heterologer Gene aus cDNA- oder genomischen Banken verwenden.
Homologe Gene (d.h. Voll-Längen-cDNA-Klone, die homolog sind, oder Homologen) lassen sich über Nukleinsäurehybridisierung unter Verwendung von beispielsweise cDNA-Banken isolieren: Insbesondere zur Isolierung von funktionell aktiven Voll-Längengenen der in SEQ ID NO: 3 gezeigten kann die Methode genutzt werden. Je nach der Häufigkeit des Gens von Interesse werden 100000 bis zu 1000000 rekombinante Bakteriophagen plattiert und auf eine Nylonmembran überführt. Nach der Denaturierung mit Alkali wurde die DNA auf der Membran z.B. durch UV-Vernetzung immobilisiert. Die Hybridisierung erfolgt bei hoch-stringenten Bedingungen. In wässriger Lösung werden die Hybridisierung und die Waschschritte bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C durchgeführt. Hybridisierungssonden wurden z.B. durch Markierung mittels radioaktiver (32P-) Nicktranskription (High Prime, Röche, Mannheim, Deutschland) hergestellt. Die Signale werden mittels Autoradiographie nachgewiesen.
Partiell homologe oder heterologe Gene, die verwandt, aber nicht identisch sind, lassen sich analog zum oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung niedrig-stringenter Hybridisierungs- und Waschbedingungen identifizieren. Für die wässrige Hybridisierung wurde die Ionenstärke gewöhnlich bei 1 M NaCl gehalten, wobei die Temperatur nach und nach von 68 auf 42°C gesenkt wurde.
Die Isolierung von Gensequenzen, die nur zu einer einzelnen Domäne von beispielsweise 10 bis 20 Aminosäuren Homologien aufweisen, lässt sich unter Verwendung synthetischer, radioaktiv markierter Oligonukleotidsonden durchführen. Radioaktiv markierte Oligonukleotide werden mittels Phosphorylierung des 5 '-Endes zweier komplementärer Oligonukleotide mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt . Die komplementären Oligonukleotide werden aneinander hybridisiert und ligiert, so dass Konkatemere entstehen. Die doppelsträngigen Konkatemere werden beispielsweise durch Nick- transkription radioaktiv markiert. Die Hybridisierung erfolgt gewöhnlich bei niedrig-stringenten Bedingungen unter Verwendung hoher Oligonukleotidkonzentrationen.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:
6 x SSC
0,01 M Natriumphosphat 1 mM EDTA (pH 8) 0,5 % SDS 100 mikrog/ml denaturierte Lachssperma-DNA 0,1 % fettarme Trockenmilch
Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5 bis 10°C unter die berechnete Oligonukleotid-Tm oder bis auf Raum- temperatur (bedeutet RT = ~ 23°C in allen Experimenten, wenn nicht anders angegeben) gesenkt, gefolgt von Waschschritten und Autoradiographie . Das Waschen wird mit extrem niedriger Stringenz durchgeführt, zum Beispiel 3 Waschschritte unter Verwendung von 4 X SSC. Weitere Einzelheiten sind wie von Sambrook, J., et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder Ausubel, F.M., et al . (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, beschrieben. Beispiel 8 : Identifikation von Zielgenen durch Sichtung von Expressionsbanken mit Antikörpern
Es wurden cDNA-Sequenzen zur Herstellung von rekombinantem 5 Protein zum Beispiel in E. coli verwendet (z.B. Qiagen QIAexpress pQE-System) . Die rekombinanten Proteine wurden dann gewöhnlich über Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitäts- gereinigt . Die rekombinanten Proteine wurden dann zur Herstellung spezifischer Antikörper beispielsweise unter Verwendung von
10 Standardtechniken zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Anschließend wurden die Antikörper dann unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule, die mit rekombinantem Antigen vorgesättigt wird, affinitätsgereinigt , wie von Gu et al., (1994) BioTechniques 17:257-262 beschrieben. Der Antikörper kann dann zur Durch-
15 musterung von Expressions-cDNA-Banken mittels immunologischem Sichtung verwendet werden (Sambrook, J., et al . (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder Ausubel, F.M., et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons) .
20
Beispiel 9: Transformation von Agrobacterium
Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung des GV3101- (pMP90-) (Koncz und Schell, 25 Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383-396) oder LBA4404- (Clontech) oder C58C1 pGV2260 (Deblaere et al 1984, Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788) Agrobacterium tumefaciens-Stamms durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standard-Transformationstechniken durchgeführt werden (ebenfalls Deblaere et al. 1984).
30
Beispiel 10: Pflanzentransformation
Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann unter Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerations-
35 techniken durchgeführt werden (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A. , Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic Publ . , 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. , Thompson, John E. , Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton:
40 CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).
Beispielsweise kann Raps mittels Kotyledonen- oder Hypokotyl- transformation transformiert werden (Moloney et al . , Plant Cell 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 45 694-701) . Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion' hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion wird gewöhnlich unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt.
Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum usitatissimum) lässt sich unter Verwendung von beispielsweise einer von Mlynarova et al . (1994) Plant Cell Report 13:282-285 beschriebenen Technik durchführen.
Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispiels- weise einer in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) oder in EP-A-0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.
Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchen- beschuss, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder über die Siliziumcarbonatfaser-Technik ist beispielsweise beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York) .
Beispiel 11: Plasmide für die Pflanzentransformation
Geeignete binäre Vektoren und Transformationsmarker
Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR
(Höfgen und Will itzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) oder pGPTV (Becker et al . 1992, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197) verwendet werden. Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in T- DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich 3' von der cDNA. Die binären Vektoren können unterschiedliche Markergene tragen. So kann etwa die Resistenz durch die Expression des nptll Markergens unter Kontrolle des 35S oder des nos Promoters erfolgen. Insbesondere kann das nptll-Markergen codierend für Kanamycin-Resistenz vermittelt durch Neomycinphospho- transferase gegen die herbizidresistente Form eines Acetolactat Synthasegens (AHAS oder ALS) ausgetauscht werden. Das ALS-Gen ist beschrieben in Ott et al., J. Mol. Biol. 1996, 263:359-360. Geeignet für manche Pflanzen ist auch die Verwendung des Hygromycin- Resistenz-Gens . Der v-ATPase-cl-Promotor kann in das Plasmid pBinl9 oder pGPTV kloniert werden und durch Klonierung vor die kodierende Region des ALS Gens für die Markergenexpression genutzt werden. Der genannte v-ATPase-cl-Promotor entspricht einem 1153 Basenpaarfragment aus Beta vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39:463-475). Der genannte nos Promoter Dabei können sowohl Sul- phonylharnstoffe als auch Imidazolinone wie Imazethapyr oder Sul- phonylharnstoffe als Antimetaboliten zur Selektion verwendet wer- den. Alternativ kann auch der nos-Promoter für die Markergenex- pression verwendet werden.
Beispiel 12 : Ermittlung von geeigneten Promotoren für die 5 Expression in Lein
Die gewebespezifische Expression lässt sich unter Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erzielen. Beispielsweise kann die samenspezifische Expression erreicht werden, indem der DC3-
10 oder der LeB4- oder der USP-Promotor oder der Phaseolin-Promotor 5' der cDNA einkloniert wird. Auch jedes andere samenspezifische Promotorelement wie z.B. der Napin- oder Arcelin Promotor (Goos- sens et al . 1999, Plant Phys . 120 (4) : 1095-1103 und Gerhardt et al. 2000, Biochimica et Biophysica Acta 1490 (1-2) : 87-98) kann
15 verwendet werden. Zur konstitutiven Expression in der ganzen Pflanzen lässt sich der CaMV-35S-Promotor oder ein v-ATPase-cl Promotor verwenden.
Um die Eigenschaften des Promotors zu bestimmen und die essen- 20 tiellen Elemente desselben, die seine Gewebespezifität ausmachen, zu identifizieren, ist es erforderlich, den Promotor selbst oder verschiedene Fragmente desselben vor ein sogenanntes Reportergen zu setzen, das eine Bestimmung der Expressionsaktivität ermöglicht. Beispielhaft für ein Reportergen sei die bakterielle 25 ß-Glucuronidase (GUS) genannt (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) . Die ß-Glucuronidase Aktivität kann in-situ mittels eines chromogenen Substrates wie 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl- ß-D-Glucuronsäure im Rahmen einer Aktivitätsfärbung bestimmt werden (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 30 387-405) . Für die Untersuchungen der Gewebespezifität wird das pflanzliche Gewebe geschnitten, eingebettet, gefärbt und analysiert wie beschrieben (z.B. Bäumlein H et al . , 1991 Mol Gen Genet 225: 121-128) .
35 Fluorimetrischer GUS-Test (nach Montgomery et al . , 1993)
Dieser Assay erlaubt eine quantitative Bestimmung der GUS-Aktivität in dem untersuchten Gewebe. Für die quantitative Aktivitätsbestimmung wird als Substrat für die b-Glucuronidase MUG (4-Me- 40 thyl-umbelliferyl-beta-D-glucuronid) verwendet, das in MU (Methyl-umbelliferon) und Glucuronsäure gespalten wird.
Dabei wird zunächst ein Proteinextrakt des gewünschten Gewebe hergestellt, dem dann das Substrat der GUS zugesetzt wird. Das 45 Substrat ist erst nach der Umsetzung durch GUS fluorimetrisch messbar. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Proben entnommen, die anschließend im Fluorimeter gemessen werden. Dieser Test wurde mit Leinembryonen verschiedener Altersstadien durchgeführt (21, 24 oder 30 Tage nach Beginn der Blüte, daf = days after flo- wering) . Dazu wurde je ein Embryo in einem 2 ml-Reaktionsgefäß mit Hilfe einer Schwingmühle (Retsch MM 2000) in flüssigem Stick- stoff zu Pulver zerrieben. Nach Zugabe von 100 ml EGL-Puffer wurde für 10 min bei 25C und 14000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und ein zweites Mal zentrifugiert. Wieder wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gehalten. Von diesem Proteinex- trakt wurden 25 ml mit 65 ml EGL-Puffer (ohne DTT) versetzt und für den GUS-Assay eingesetzt. Nun wurden 10 ml des Substrates MUG (10 mM 4-Methyl-umbelliferyl-ß-D-glucuronid) dazugegeben, gevor- text und sofort 30 ml als Nullwert entnommen und mit 470 ml Stopp-Puffer (0,2 M NaC0 ) versetzt. Dieser Vorgang wurde für alle Proben in einem Abstand von 30 s wiederholt. Die entnommenen Proben wurden bis zur Messung im Kühlschrank gelagert. Weitere Messwerte wurden nach 1 h und nach 2 h entnommen. Für die Messung im Fluorimeter wurde eine Eichreihe erstellt, die Konzentrationen von 0,1 mM bis 10 mM MU (4-Methyl-umbelliferon) enthielt. Waren die Probenwerte außerhalb dieser Konzentrationen, wurde weniger Proteinextrakt eingesetzt (10 ml, 1 ml, 1 ml aus 1:10 Verdünnung) , und es wurden kürzere Zeitabstände gemessen (0 h, 30 min, 1 h) . Die Messung erfolgte bei einer Exitation von 365 nm und einer Emission von 445 nm in einem Fluoroscan II-Gerät (Labsystem) . Alternativ kann die SubstratSpaltung Unter alkalischen Bedingungen fluorometrisch verfolgt werden (Anregung bei 365 nm, Messung der Emission bei 455 nm;SpectroFluorimeter BMG Polarstar+) wie beschrieben in Bustos M.M. et al., 1989 Plant Cell 1:839-853. Alle Proben wurden einer Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford (1976) unterzogen, um so eine Aussage über die Promoteraktivität und -stärke in verschiedenen Geweben und Pflanzen erlauben.
EGL-Puffer 0,1 M KP04, pH 7,8
ImM EDTA
5 % Glycerin
1 M DTT
' Als weitere Beispiele für Reportergene, die äquivalent benutzt werden können, seien beispielhaft das grün fluoreszierende Protein (GFP) und dessen Derivate genannt (C.Reichel et al. (1996) Proc.Natl.Acad. Sei.USA 93, 5888-5893 und J.Sheen et al . , (1995) Plant Journal 8, 777-784) und verschiedene Luciferasen (A.Millar et al. (1992) Plant Mol. Biol. Reporter 10, 324-414). Die ent- sprechenden Detektionsmethoden sind dem Fachmann bekannt und z.B. genannter Literatur beschrieben.
Beispiele für Promoter-Reportergen-Konstrukte für oben genannte Promotoren sind im folgenden gegeben. Von diesen Promotoren können Fragmente mithilfe der Polymerasekettenreaktion isoliert und mit flankierenden Sequenzen nach Wahl auf Basis von synthetischen Oligonukleotiden maßgeschneidert werden.
Folgende Oligonukleotide können beispielsweise verwendet werden:
LeB4 vorne: GAAAGCTTCTCGAGTTATGCATTTCTT LeB4 hinten: GGGTCTAGATCTGTGACTGTGATAG DC3a vorne: AGTGGATCCCCGAGCTAACCACAACT DC3a hinten: ATAAGCTTTTTCTTTGCAGA napinvorne : GAAAGCTTCTAATATGATAAACTCTG napinhinten: GGGTCTAGAAACACATACAAACATCAC
Die Methoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind allgemein literaturbekannt.
In einem ersten Schritt werden die Promotorfragmente über PCR amplifiziert, mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten und in die obigen Kassetten einkloniert. Beispielsweise wird das LeB4 (700) -PCR-Fragment mit Xbal und Hindlll geschnitten und in den Vektor pGPTV in die Hindlll und Xbal-Schnittstellen 5 ' vor dem GUS Reportergen kloniert. Das PCR-amplifizierte DC3-Promoter- fragment kann mit BamHI und Hindlll geschnitten, z.B. in pBlues- cript (Stratagene)* subkloniert und dann in pGPTV in geeignete Schnittstellen vor das GUS-Reportergen kloniert werden.
Beispielsweise kann ein mit obigen Primern PCR-amplifiziertes na- pin-Pro otorfragment mit einer Größe von 1055bp nach Verdau mit Hindlll und Xbal in pGPTV vor das GUS Reportergen einkloniert werden. Ein äquivalentes Konstrukt könnte ein Napin-Promoterfrag- ment von llOObp 5 '-kloniert vor ein GUS Reportergen mit Intron mit in 3 *• Richtung nachfolgendem Nos-Terminator in einem pHL9000-Vektor (Hausmann & Töpfer, 1999) sein.
Unter Verwendung von oben beschriebenen oder äquivalenten Kon- strukten nach Transformation in Lein der Sorte Flanders, läßt sich die GUS-Aktivität in transgenen Leinembryonen verschiedener Altersstadien messen, die mit einem der folgenden Konstrukte transformiert wurden: Napin-GUS, 35S-GUS, LeB4-GUS, USP-GUS. Die Werte sind Mittelwerte aus ein bis fünf Messungen mit verschiede- nen Proteinmengen. Pro Konstrukt wurden je drei Embryonen quantitativ analysiert.
In der quantitativen Analyse ergaben sich große Unterschiede zwi- sehen den verschiedenen samenspezifischen Promotoren. Der Napin Promotor aus Brassica napus erwies sich als um zwei bis drei Zehnerpotenzen weniger aktiv als die beiden Promotoren aus Vicia faba (LeB4 und USP) . Die GUS-Aktivität nahm in der Reihenfolge Napin, LeB4 und USP zu. Die Positivkontrolle 35S bewegte sich in ihrer Aktivität zwischen LeB4 und USP, wohingegen die Negativkontrolle, der nicht transformierte Wildtyp (Sorte Flanders) , so gut wie keine Aktivität besaß. Die folgende Tabelle gibt die Mittelwerte der Aktivitäten in den einzelnen Altersstadien sowie gesamt für jedes Konstrukt wieder.
Tabelle 3.4: Übersicht über die mittleren GUS-Aktivitäten von Leinembryonen, transformiert mit verschiedenen GUS-Konstrukten. daf: Tage nach Beginn der Blüte.
Mit * markiert wurden Werte, die nur einer Messung zugrundeliegen.
Figure imgf000092_0001
Beispiel 13 : Plasmide für die Pflanzentransformation
Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) oder pGPTV (Becker et al 1992, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197) oder Derivate davon verwendet werden. Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense- Orientierung in T-DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylie- rungssequenz befindet sich 3' von der cDNA. Die binären Vektoren können unterschiedliche Markergene tragen. Insbesondere kann das nptII-Markergen codierend für Kanamycin-Resistenz vermittelt durch Neomycinphosphotransferase gegen die herbizidresistente Form eines Acetolactat Synthasegens (Abkürzung: AHAS oder ALS) ausgetauscht werden. Das ALS-Gen ist beschrieben in Ott et al . , J. Mol. Biol. 1996, 263:359-360. Der v-ATPase-cl-Promotor kann in das Plasmid pBinl9 oder pGPTV kloniert werden und durch Klonierung vor das ALS Codierregion für die Markergenexpression genutzt werden. Der genannte Promotor entspricht einem 1153 Basenpaar- fragment aus beta-Vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39:463-475). Dabei können sowohl Sulphonylharnstoffe als auch Imidazolinone wie Imazethapyr oder Sulphonylharnstoffe als Antimetaboliten zur Selektion verwendet werden.
Die gewebespezifische Expression lässt sich unter Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erzielen. Beispielsweise kann die samenspezifische Expression erreicht werden, indem der DC3- oder der LeB4- oder der USP-Promotor oder der Phaseolin-Promotor 5' der cDNA einkloniert wird. Auch jedes andere samenspezifische Promotorelement wie z.B. der Napin- oder Arcelin Promotor Goossens et al . 1999, Plant Phys. 120 (4) : 1095-1103 und Gerhardt et al. 2000, Biochimica et Biophysica Acta 1490 (1-2) : 87-98) kann verwendet werden. Zur konstitutiven Expression in der ganzen Pflanzen lässt sich der CaMV-35S-Promotor oder ein v-ATPase Cl Promotor verwenden.
Insbesondere lassen sich Gene codierend für Desaturasen und Elongasen durch Konstruktion mehrerer Expressionskassetten hintereinander in einen binären Vektor klonieren, um den Stoffwechselweg in Pflanzen nachzubilden.
Innerhalb einer Expressionskassette kann das zu exprimierende Protein unter Verwendung eines Signalpeptids, beispielsweise für Piastiden, Mitochondrien oder das Endoplasmatische Retikulum, in ein zelluläres Kompartiment dirigiert werden (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423). Das Signalpeptid wird 5' im Leseraster mit der cDNA einkloniert, um die subzelluläre Lokalisierung des Fusionsprotein zu erreichen.
Beispiele für Multiexpressionskassetten sind im folgenden gegeben.
I . ) Promotor-Terminator-Kassetten
Expressionskassetten bestehen aus wenigstens zwei funktioneilen Einheiten wie einem Promotor und einem Terminator. Zwischen Promotor und Terminator können weitere gewünschte Gensequenzen wie Targetting-Sequenzen, Codierregionen von Genen oder Teilen davon etc. eingefügt werden. Zum Aufbau von Expressionskassetten werden Promotoren und Terminatoren (USP Promotor: Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67); OCS Terminator: Gielen et al. EMBO J. 3 (1984) 835ff.) mithilfe der Polymerasekettenreaktion isoliert und mit flankierenden Sequenzen nach Wahl auf Basis von synthetischen Oligonukleotiden maßgeschneidert.
Folgende Oligonukleotide können beispielsweise verwendet werden: USP1 vorne : CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA USP2 vorne : CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA USP3 vorne: CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA USP1 hinten:AAAACTGCAGGCGGCCGCCCACCGCGGTGGGCTGGCTATGAAGAAATT USP2 hinten: CGCGGATCCGCTGGCTATGAAGAAATT
USP3 hinten:TCCCCCGGGATCGATGCCGGCAGATCTGCTGGCTATGAAGAAATT 0CS1 vorne: AAAACTGCAGTCTAGAAGGCCTCCTGCTTTAATGAGATAT OCS2 vorne: CGCGGATCCGATATCGGGCCCGCTAGCGTTAACCCTGCTTTAATGAGATAT OCS3 vorne : TCCCCCGGGCCATGGCCTGCTTTAATGAGATAT
0CS1 hinten: CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA OCS2 hinten: CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA 0CS3 hinten:CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA
Die Methoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind allgemein literaturbekannt.
In einem ersten Schritt werden ein Promotor und ein Terminator über PCR amplifiziert. Dann wird der Terminator in ein Empfänger- plasmid kloniert und in einem zweiten Schritt der Promotor vor den Terminator inseriert. Mithin erhält man eine Expressionskassette auf einem Trägerplasmid. Auf Basis des Plamides pUCl9 werden die Plasmide pUTl, pUT2 und pUT3 erstellt.
Die Konstrukte sind erfindungsgemäß in SEQ ID NO: 13, 14 und 15 definiert . Sie enthalten auf Basis von pUCl9 den USP-Promotor und den OCS Terminator. Auf Basis dieser Plasmide wird das Konstrukt PÜT12 erstellt, indem pUTl mittels Sall/Scal geschnitten wird und pUT2 mittels Xhol/Scal geschnitten wird. Die die Expressionskassetten enthaltenden Fragmente werden ligiert und in E. coli XLI blue MRF transformiert. Es wird nach Vereinzelung ampicillin- resistenter Kolonien DNA präpariert und per Restriktionsanalyse solche Klone identifiziert, die zwei Expressionskassetten ent- halten. Die Xhol/Sall Ligation kompatibler Enden hat dabei die beiden Schnittstellen Xhol 'und Sall zwischen den Expressionskassetten eliminiert. Es resultiert das Plasmid pUTl2, das in SEQ ID NO: 16 definiert ist. Anschließend wird pUTl2 wiederum mittels Sal/Scal geschnitten und pUT3 mittels Xhol/Scal ge- schnitten. Die die Expressionskassetten enthaltenden Fragmente werden ligiert und in E. coli XLI blue MRF transformiert. Es wird nach Vereinzelung ampicillinresistenter Kolonien DNA präpariert und per Restriktionsanalyse solche Klone identifiziert, die drei Expressionskassetten enthalten. Auf diese Weise wird ein Set von Multiexpressionskassetten geschaffen, dass für die Insertion gewünschter DNA genutzt werden kann und in Tabelle 3 beschrieben wird und zudem noch weitere Expressionskassetten aufnehmen kann.
Diese enthalten folgende Elemente:
Tabelle 3
Figure imgf000095_0001
Weiterhin lassen sich wie beschrieben und wie in Tabelle 4 näher spezifiziert weitere Multiexpressionskassetten mithilfe des
i) USP-Promotors oder mithilfe des ii) ca. 700 Basenpaare 3 ' -Fragmentes des LeB4-Promotors oder mithilfe des iii) DC3-Promotors erzeugen und für samenspezifische Genexpression einsetzen.
Der DC3-Promotor ist beschrieben bei Thomas, Plant Cell 1996, 263:359-368 und besteht lediglich aus der Region -117 bis +27 weshalb er mithin einer der kleinsten bekannten samenspezifischen Promotoren darstellt.
Von diesen Promotoren können Fragmente mithilfe der Polymerasekettenreaktion isoliert und mit flankierenden Sequenzen nach Wahl auf Basis von synthetischen Oligonukleotiden maßgeschneidert werden.
Folgende Oligonukleotide können beispielsweise verwendet werden: LeB4 vorne: GAAAGCTTCTCGAGTTATGCATTTCTT LeB4 hinten: GGGTCTAGATCTGTGACTGTGATAG DC3a vorne: CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAG DC3a hinten: CGCGGATCCTAGCTTTTTCTTGGCAGATG
Die Methoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind allgemein literaturbekannt.
In einem ersten Schritt werden die Promotorfragmente über PCR am- plifiziert, mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten und in die obigen Kassetten einkloniert. Beispielsweise wird das LeB4 (700) -PCR-Fragment mit Xhol und Bglll geschnitten und in die Xhol und Bglll-Schnittstellen des Plasmids pUT3 eingesetzt, um pLT3 zu erhalten.
Vorteilhafte Expressionskassetten enthalten auf Basis von pUCl9 (Vieira und Messing (1982); Gene 19, 259), die SEQ ID NO: 32, den LeB4-Promotor und die Sequenzen SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 oder SEQ ID NO: 35. Auf Basis dieser Plasmide wird das Konstrukt pLTl2 erstellt, indem pUTl mittels Sall/Scal geschnitten wird und pUT2 mittels Xhol/Scal geschnitten wird. Die die Expressionskassetten enthaltenden Fragmente werden ligiert und in E. coli XLI blue MRF transformiert. Es wird nach Vereinzelung Ampicillin-resistenter Kolonien DNA präpariert und per Restriktionsanalyse solche Klone identifiziert, die zwei Expressionskassetten enthalten. Die Xhol/ Sall Ligation kompatibler Enden hat dabei die beiden Schnittstellen Xhol und Sall zwischen den Expressionskassetten eliminiert. Es resultiert das Plasmid pUTl2, das in SEQ ID NO: 16 definiert ist. Anschließend wird pUT12 wiederum mittels Sal/Scal geschnit- ten und pUT3 mittels Xhol/Scal geschnitten. Die die Expressionskassetten enthaltenden Fragmente werden ligiert und in E. coli XLI blue MRF transformiert. Es wird nach Vereinzelung Ampicillin- resistenter Kolonien DNA präpariert und per Restriktionsanalyse solche Klone identifiziert, die drei Expressionskassetten enthal- ten. Auf diese Weise wird eine Auswahl von Multiexpressionskassetten geschaffen, die für die Insertion gewünschter DNA genutzt werden kann und in Tabelle 3 beschrieben wird und zudem noch weitere Expressionskassetten aufnehmen kann.
Die Expressionskassetten können mehrfach den selben Promotor enthalten oder aber über drei verschiedene Promotoren aufgebaut werden. Tabelle 4 : Multiple Expressionskassetten
Figure imgf000097_0001
* EcoRV Schnittstelle schneidet im 700 Basenpaarfragment des LeB4 Promotors (LeB4-700)
Analog lassen sich weitere Promotoren für Multigenkonstrukte erzeugen insbesondere unter Verwendung des
a) 2,4 kB Fragmentes des LeB4-Promotors (Bäumlein et al. 1991: Mol .Gen.Genet . 225,121-128) oder mithilfe des
b) Phaseolin-Promotors (Bustos et al . (1989) Plant Cell 1,839-853) oder mithilfe des
c) konstitutiven v-ATPase cl-Promotors .
Es kann insbesondere wünschenswert sein, weitere besonders geeignete Promotoren zum Aufbau samenspezifischer Multiexpressionskassetten wie z.B. eines der Fragmente des Napin-Promotors (Stal- berg et al . , 1993: Plant Mol .Biol .23 , 671-683 ) oder den Arcelin-5 Promotor (A.Goossens et al., 1999: plant Physiol. 120,1095-1104) zu verwenden. ii) Erstellung von Expressionskonstrukten in pUCl9- oder pGPTV Derivaten, die Promotor und Terminator erhalten und in Kombination mit gewünschten Gensequenzen zur PUFA Genexpression in pflanzlichen Expressionskassetten enthalten.
Multiexpressionskassetten können mittels Ascl direkt von pUC19-Derivaten aus Tabelle 3 in den Vektor pGPTV+AscI (siehe iii . ) ) über die Ascl Schnittstelle inseriert werden und stehen zur Inserierung von Zielgenen zur Verfügung. Die entsprechenden Genkonstrukte (pBUTl ist in SEQUENZ ID NO: 20, pBUT2 ist in SEQUENZ ID NO: 21, pBUT 3 ist in SEQUENZ ID NO: 22, pBUTl2 ist in SEQUENZ ID NO: 22 und pBUTl23 ist in SEQUENZ ID NO: 24 dargestellt) stehen erfindunsgemäß als Kit zur Verfügung. Alternativ können Gensequenzen in die pUC19 basierten Expressionskassetten inseriert werden und als Ascl Fragment in pGPTV+AscI eingesetzt werden.
In pUTl2 wird zunächst über BstXI und Xbal die D-6-Elongase Pp_PSEl in die erste Kassette inseriert. Dann wird die D-6-Desaturase aus Moos (Pp_des6) über BamHI/Nael in die zweite Kassette inseriert. Es entsteht das Konstrukt pUT-ED.Das Ascl Fragment aus dem Plasmid pUT-ED wird in den mit Ascl geschnittenen Vektor pGPTV+AscI inseriert und die Orientierung des inserierten Fragmentes mittels Restriktion oder Sequenzierung ermittelt. Es entsteht das Plasmid pB-DHGLA, dessen vollständige Sequenz in SEQUENZ ID NO. 25 dargestellt ist. Die Codierregion der Physcomitrella delta 6 Elongase ist in SEQUENZ ID NO. 26 dargestellt, die der delta 6 Desaturase aus Physcomitrella in SEQUENZ ID NO: 27.
In pUTl23 wird zunächst über BstXI und Xbal die Δ-6-Elongase Pp_PSEl in die erste Kassette inseriert. Dann wird die Δ-6-Desaturase aus Moos (Pp_des6) über BamHI/Nael in die zweite Kassette inseriert und schließlich die Δ-5-Desaturase aus Phaeodactylum (Pt_des5) über Bglll in die dritte Kassette inseriert. Das Dreifachkonstrukt erhält den Namen pARAl. Unter Berücksichtigung sequenzspezifischer Restriktionsschnittstellen können weitere Expressionskassetten gemäß Tabelle 5 mit der Bezeichnung pARA2 , pARA3 und pARA4 erstellt werden.
Das Ascl Fragment aus dem Plasmid pARAl wird in den mit Ascl geschnittenen Vektor pGPTV+AscI inseriert und die Orientierung des inserierten Fragmentes mittels Restriktion oder Sequenzierung ermittelt . Die vollständige Sequenz des resultierenden Plasmides pBARAl ist in SEQUENZ ID NO. 28 dargestellt. Die Codierregion der Physcomitrella delta 6 Elongase ist in SEQUENZ ID NO. 29 dargestellt, die der delta 6 Desaturase aus Physcomitrella in SEQUENZ ID NO: 30 und die der delta-5 Desaturase aus Phaeodactylum tricornutum in SEQUENZ ID NO: 31.
Tabelle 5 : Kombinationen von Desaturasen und Elongasen
Figure imgf000099_0001
Plasmide 1 bis 5 sind pUC Derivate, Plasmide 6 bis 7 sind binäre Pflanzentransformationsvektoren
Pp = Physcomitrella patens, Pt = Phaeodactylum tricornutum
Pp_PSEl entspricht der Sequenz aus SEQ ID NO: 9.
PSE = PUFA spezifische Δ-6-Elongase
Ce_des5 = Δ-5-Desaturase aus Caenorhabditis elegans (Genbank Acc .
Nr. AF078796)
Ce_des6 = Δ-6-Desaturase aus Caenorhabditis elegans elegans
(Genbank Acc. Nr. AF031477, Basen 11-1342)
Ce_PSEl = Δ-6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Genbank Acc.
Nr. AF244356, Basen 1-867)
Auch weitere Desaturasen oder Elongasegense uenzen können in Expressionskassetten beschriebener Art inseriert werden wie z.B. Genbank Acc. Nr. AF231981, NM_013402, AF206662, AF268031, AF226273, AF110510 oder AF110509.
iii) Transfer von Expressionskassetten in Vektoren zur
Transformation von Agrobakterium tumefaciens und zur Transformation von Pflanzen
Chimäre Genkonstrukte auf Basis der in pUC19 beschriebenen können mittels Ascl in den binären Vektor pGPTV inseriert. Die multiple Klonierungssequenz wird zu diesem Zweck um eine Ascl Schnittstelle erweitert. Zu diesem Zweck wird der Polylinker als zwei doppelsträngige Oligonukleotide neu synthetisiert, wobei eine zusätzliche Ascl DNA Sequenz eingefügt wird. Das Oligonukleotid wird mittels EcoRI und Hindlll in den Vektor pGPTV inseriert. Es entsteht das Plasmid pGPTV+AscI. Die notwendigen Kloniertechniken sind dem Fachmann bekannt und können einfach wie in Beispiel 1 beschrieben nachgelesen werden. Beispiel 14: In vivo-Mutagenese
Die in vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann mittels Passage der Plasmid- (oder einer anderen Vektor-) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae) , bei denen die Fähigkeiten, die Unversehrtheit ihrer genetischen Information aufrechtzuerhalten, gestört ist, erfolgen. Übliche Mutator-Stämme haben Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem (z.B. utHLS, mutD, mutT usw.; als Literaturstelle siehe Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, S. 2277-2294, ASM: Washington) . Diese Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung dieser Stämme ist beispielsweise in Greener, A. , und Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34, erläutert. Der Transfer mutierter DNA-Moleküle in Pflanzen erfolgt vorzugsweise nach
Selektion und Test der Mikrooganismen. Transgene Pflanzen werden nach verschiedenen Beispielen im Beispielteil dieses Dokumentes erzeugt.
Beispiel 15: Untersuchung der Expression eines rekombinanten Genproduktes in einem transformierten Organismus
Die Aktivität eines rekombinanten Genproduktes im transformierten Wirtsorganismus kann auf der Transkriptions- und/oder der Translationsebene gemessen werden.
Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Transkription des Gens (ein Hinweis auf die Menge an RNA, die für die Translation des Genproduktes zur Verfügung steht) ist die Durchführung eines Northern-Blots wie unten ausgeführt (als Bezugsstelle siehe Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, oder den oben erwähnten Beispielteil) , wobei ein Primer, der so gestaltet ist, dass er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren Markierung (gewöhnlich radioaktiv oder chemilummeszent) markiert wird, so dass, wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix transferiert und mit dieser Sonde inkubiert wird, die Bindung und das Ausmaß der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information zeigt den Grad der Transkription des 'transformierten Gens an. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mit mehreren Verfahren, die alle im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel das von Bormann, E.R., et al. (1992) Mol. Microbiol . 6:317-326 beschriebene, präpariert werden. Northern-Hybridisierung
Für die RNA-Hybridisierung wurden 20 μg Gesamt-RNA oder 1 μg poly(A)+-RNA mittels Gelelektrophorese in Agarosegelen mit einer Stärke von 1,25 % unter Verwendung von Formaldehyd, wie beschrieben in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304) aufgetrennt, mittels Kapillaranziehung unter Verwendung von 10 x SSC auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond N+, Amersham, Braunschweig) übertragen, mittels UV-Licht immobilisiert und 3 Stunden bei 68°C unter Verwendung von Hybridisierungspuffer
(10 % Dextransulfat Gew. /Vol., 1 M NaCl, 1 % SDS, 100 mg Heringssperma-DNA) vorhybridisiert. Die Markierung der DNA-Sonde mit dem Highprime DNA labeling-Kit (Röche, Mannheim, Deutschland) erfolgte während der Vorhybridisierung unter Verwendung von alpha-32P-dCTP (Amersham, Braunschweig, Deutschland) . Die Hybridisierung wurde nach Zugabe der markierten DNA-Sonde im gleichen Puffer bei 68°C über Nacht durchgeführt. Die Waschschritte wurden zweimal für 15 min unter Verwendung von 2 X SSC und zweimal für 30 min unter Verwendung von 1 X SSC, 1 % SDS, bei 68°C durch- geführt. Die Exposition der verschlossenen Filter wurde bei -70°C für einen Zeitraum von 1 bis 14 T durchgeführt .
Zur Untersuchung des Vorliegens oder der relativen Menge an von dieser mRNA translatiertem Protein können Standardtechniken, wie ein Western-Blot, eingesetzt werden (siehe beispielsweise Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) . Bei diesem Verfahren werden die zellulären Gesamt- Proteine extrahiert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie Nitrozellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, der spezifisch an das gewünschte Protein bindet, inkubiert. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszenten oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen lässt. Das Vorliegen und die Menge der beobachteten Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gewünschten, in der Zelle vorliegenden mutierten Proteins an.
Beispiel 16: Analyse der Auswirkung der rekombinanten Proteine auf die Produktion des gewünschten Produktes
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, Pilzen, Algen, Ciliaten oder auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen oder die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analyse- techniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial
Chemistry, Bd. A2 , S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al . , (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al . (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification" , S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al . (1988) Bioseparations : downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3 ; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications) .
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22) : 12935-12940 , und Browse et al . (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W. , Advances in Lipid Methodology, Ayr/ Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2) ; Christie, William W. , Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1) ; "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u.d.T. : Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Zusätzlich zur Messung des Endproduktes der Fermentation ist es auch möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu ana- lysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamtef izienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (z.B. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoff uellen, Phosphat und andere Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion üblicher Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsgb., IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie- Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie) .
Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäure- Produkten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromato- graphie-Massenspektrometrie-Verfahren, Lipide 33:343-353).
Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2 % Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d.h. Sigma) , definiert werden.
Bei Fettsäuren, für die keine Standards verfügbar sind, muss die Identität über Derivatisierung und anschließende GC-MS-Analyse gezeigt werden. Beispielsweise muss die Lokalisierung von Fettsäuren mit Dreifachbindung über GC-MS nach Derivatisierung mit 4,4-Dimethoxyoxazolin-Derivaten (Christie, 1998, siehe oben) gezeigt werden. Expressionskonstrukte in heterologen mikrobiellen Systemen
Stämme, Wachstumsbedingungen und Plasmide
Der Escherichia coli-Stamm XLI Blue MRF' kan (Stratagene) wurde zur Subklonierung der neuen Desaturase pPDesaturasel aus Physcomitrella patens verwendet. Für die funktioneile Expression dieses Gens verwendeten wir den Saccharomyces cerevisiae-Stamm INVSc 1 (Invitrogen Co.). E. coli wurde in Luria-Bertini-Brühe (LB, Duchefa, Haarlem, Niederlande) bei 37°C kultiviert. Wenn nötig, wurde Ampicillin (100 mg/Liter) zugegeben, und 1,5 % Agar (Gew./ Vol . ) wurde für feste LB-Medien hinzugefüg . S . cerevisiae wurde bei 30°C entweder in YPG-Medium oder in komplettem Minimalmedium ohne Uracil (CMdum; siehe in: Ausubel, F.M., Brent, R. , Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidan, J.G., Smith, J.A. , Struhl, K. , Albright, L.B., Coen, D.M., und Varki, A. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) mit entweder 2 % (Gew. /Vol.) Raffinose oder Glucose kultiviert. Für feste Medien wurden 2 % (Gew. /Vol.) Bacto™-Agar (Difco) hinzugefügt. Die zur Klonierung und Expression verwendeten Plasmide sind pUCl8 (Pharmacia) und pYES2 (Invitrogen Co.) .
Beispiel 17 : Klonierung und Expression PUFA-spezifischer Desaturasen aus Phaeodactylum tricornutum
Für die Expression in Hefe wurden die Phaeodactylum tricornutum -cDNA-Klone aus Seq ID NO: 1, 3, 5 oder 11 bzw. die Sequenzen aus SEQ ID NO: 7 oder 9 bzw andere gewünschte Sequenzen zuerst so modifiziert, dass lediglich die Codierregion mittels Polymerase Kettenreaktion unter Zuhilfenahme zweier Oligonukleotide ampli- iziert werden. Dabei wurde darauf geachtet, dass eine Konsensusequenz vor dem Startσodon zur effizienten Translation eingehalten wurde. Entweder wurde hierzu die Basenfolge ATA oder AAA gewählt und vor das ATG in die Sequenz eingefügt (Kozak, M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes, Cell 44, 283-292) . Vor diesem Konsensustriplett wurde zusätzlich eine Restriktionsschnittstelle eingeführt, die kompatibel sein muss zur Schnittstelle des Zielvektors, in den das Fragment kloniert werden soll und mit dessen Hilfe die Genexpression in Mikroorganismen oder Pflanzen erfolgen soll. Die PCR-Reaktion wurde mit Plasmid-DNA als Matrize in einem Thermocycler (Biometra) mit der Pfu-DNA- (Stratagene) Polymerase und dem folgenden Temperaturprogramm durchgeführt: 3 min bei 6°C, gefolgt von 30 Zyklen mit 30 s bei 96°C, 30 s bei 55°C und 2 min bei 72°C, 1 Zyklus mit 10 min bei 72°C und Stop bei 4°C. Die Anlagerungstemperatur wurde je nach gewählten Oligonukleotiden variiert . Pro Kilobasenpaare DNA ist von einer Synthesezeit von etwa einer Minute auszugehen. Weitere Parameter, die Einfluss auf die PCR haben wie z.B. Mg-Ionen, Salz, DNA Polymerase etc., sind dem Fachmann auf dem Gebiet geläufig und können nach Bedarf variiert werden.
Die korrekte Größe des amplifizierten DNA-Fragments wurde mittels Agarose-TBE-Gelelektrophorese bestätigt. Die amplifizierte DNA wurde aus dem Gel mit dem QIA uick-Gelextraktionskit (QIAGEN) extrahiert und in die Smal-Restriktionsstelle des dephosphory- lierten Vektors pUClδ unter Verwendung des Sure Clone Ligations Kit (Pharmacia) ligiert, wobei die pUC-Derivate erhalten wurden. Nach der Transformation von E. coli XLI Blue MRF' kan wurde eine DNA-Minipräparation (Riggs, M.G., & McLachlan, A. (1986) A simplified screening procedure for large numbers of plasmid mini- preparation. BioTechniques 4, 310-313) an ampicillinresistenten Transfor anden durchgeführt, und positive Klone mittels BamHI- Restriktionsanalyse identifiziert. Die Sequenz des klonierten PCR-Produktes wurde mittels Resequenzierung unter Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt) bestätigt.
Δ5 Acyl Lipid desaturase, Pt_des5 Primer 1 GAG CTC ACA TAA TGG CTC CGG ATG CGG ATA AGC Primer 2 CTC GAG TTA CGC CCG TCC GGT CAA GGG
Das PCR-Fragment (1428bp) wurde mithilfe des Sure Clone Kit (Pharmacia) in pUC 18 kloniert, das inserierte Fragment Sacl/Xhol verdaut und das Fragment mithilfe entsprechender Restriktionsschnittstellen in pYES2 oder pYES6 inseriert .
Δ6 Acyl Lipid desaturase, Pt_des6
Primer 3 GGA TCC ACA TAA TGG GCA AAG GAG GGG ACG CTC GGG Primer 4 CTC GAG TTA CAT GGC GGG TCC ATC GGG
Das PCR-Fragment (1451 bp) wurde mithilfe des Sure Clone Kit (Pharmacia) in pUC 18 kloniert, das inserierte Fragment BamHI/XhoI verdaut und das Fragment mithilfe entsprechender Restriktionsschnittstellen in pYES2 oder pYES6 inseriert. Δ12 Acyl Lipid desaturase, Pt_desl2
Primer 5 GGA TCC ACA TAA TGG TTC GCT TTT CAA CAG CC
Primer 6 CTC GAG TTA TTC GCT CGA TAA TTT GC
5 Δ12 Acyl Lipid desaturase, Pt_desl2.2
Primer 7 GGA TCC ACA TAA TGG GTA AGG GAG GTC AAC G Primer 8 CTC GAG TCA TGC GGC TTT GTT TCG C
Das PCR Fragment (1505bp) wurde mithilfe des Sure Clone 10 Kit (Pharmacia) in pUC 18 kloniert, das inserierte Fragment BamHI/XhoI verdaut und das Fragment mithilfe entsprechender Restriktionsschnittstellen in pYES2 oder pYES6 inseriert.
Die Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsenzym/en passend zur
15 eingeführten Schnittstelle der Primersequenz gespalten und das erhaltene Fragment in die kompatiblen Restriktionsstellen des dephosphorylierten Hefe-E. coli-Shuttlevektors pYES2 oder pYES6 ligiert, wobei pYES-Derivate erhalten werden. Nach der Transformation von E. coli und DNA-Minipräparation aus den
20 Transformanden wurde die Orientierung des DNA-Fragments im
Vektor durch geeignete Restriktionsspaltung oder Sequenzierung überprüft . Ein Klon wurde für die DNA-Maxipräparation mit dem Nucleobond® AX 500 Plasmid-DNA-Extraktionskit (Macherey-Nagel, Düringen) angezogen.
25
Saccharomyces cerevisiae INVScl wurde mit den pYES-Derivaten und pYES Leervektor mittels eines PEG/Lithiu acetat-Protokolls transformiert (Ausubel et al . , 1995). Nach der Selektion auf CMdum-Agarplatten mit 2 % Glucose wurden pYES-Derivate-
30 Transformanden und eine pYES2-Transformande zur weiteren Anzucht und funktioneilen Expression ausgewählt. Bei pYES6-Derivaten wurde Blasticidin als Antimetabolit verwendet . Im Fall von Coexpressionen auf Basis von pYES2 und pYES6 wurde auf Minimalmedium mit Blasticidin selektiert.
35
Funktionelle Expression einer Desaturaseaktivität in Hefe
Vorkultur
40 20 ml CMdum-Flüssigmedium ohne Uracil aber mit 2 % (Gew. /Vol.) Raffinose wurden mit den transgenen Hefeklonen (pYES2) angeimpft und 3 Tage bei 30°C, 200 rpm gezüchtet, bis eine optische Dichte bei 600 nm (OD6oo) von 1,5 bis 2 erreicht wurde. Wurde als Vektor pYESβ verwendet, so wurde zusätzlich auf Blasticidin als Anti-
45 metabolit selektioniert . Hauptkultur
Für die Expression wurden 20 ml CMdum-Flüssigmedium ohne Uracil aber mit 2 % Raffinose und 1 % (Vol. /Vol.) Tergitol NP-40 mit Fettsäuresubstraten auf eine Endkonzentration von 0,003 % (Gew. /Vol.) angereichert. Die Medien wurden mit den Vorkulturen auf eine ODgoo von 0,05 angeimpft. Die Expression wurde bei einer ODgoo von 0,2 mit 2 % (Gew. /Vol.) Galaktose für 16 Std. induziert, wonach die Kulturen eine ODgoo von 0,8-1,2 geerntet wurden.
Fettsäureanalyse
Die Gesamt-Fettsäuren wurden aus Hefekulturen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Davon wurden Zellen von 5 ml Kultur mittels Zentrifugation (1000 x g, 10 min, 4°C) geerntet und einmal mit 100 mM NaHC03 , pH 8,0, gewaschen, um restliches Medium und Fettsäuren zu entfernen. Zur Herstellung des Fettsäuremethylester (FAMES oder Singular FAME) wurden die Zellsedimente mit 1 M methanolischer HS04 und 2 % (Vol . /Vol . ) Dimethoxypropan für 1 Std. bei 80°C behandelt. Die FAMES wurden zweimal mit 2 ml Petrolether extrahiert, einmal mit 100 mM NaHC03, pH 8,0, und einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und mit NaS04 getrocknet. Das organische Lösungsmittel wurde unter einem Argonstrom verdampft, und die FAMES wurden in 50 mikrol Petrol- ether gelöst . Die Proben wurden auf einer ZEBRON-ZB-Wax-Kapillar- säule (30 m, 0,32 mm, 0,25 mikro m; Phenomenex) in einem Hewlett Packard-6850-Gaschromatograph mit einem Flammenionisationsdetektor aufgetrennt. Die Ofentemperatur wurde von 70°C (1 min halten) bis 200°C mit einer Rate von 20°C/min, dann auf 250°C (5 min halten) mit einer Rate von 5°C/min und schließlich auf 260°C mit einer Rate von 5°C/min programmiert. Stickstoff wurde als Trägergas verwendet (4,5 ml/min bei 70°C) . Die Fettsäuren wurden durch Vergleich mit Retentionszeiten von FAME-Standards (SIGMA) identifiziert.
Expressionsanalyse
Die Verhältnisse der zugegebenen und aufgenommenen Fettsäuresubstrate wurden ermittelt und so Quantität und Qualität der Desaturasereaktion gemäß Tabelle 6, Tabelle 7 und Tabelle 8 erfasst.
Ergebnis der Expression einer Phaeodactylum tricornutum Δ-6-Acyl Lipid Desaturase in Hefe: Tabelle 6
Fettsäure pYes2 pYes2- -Ptd6 gefüttert mit
- - +18:2 +18:3
16:0 13,3 18,9 28,4 16,7
16:1Δ9 45,4 44,7 12,5 16,9
16:2Δ6,9 - 4,3 - -
18:0 4,9 6,3 10,4 9,1
18:1Δ9 36,4 24,1 6,8 11,8
18:2Δ6,9 - 1,8 - -
10 18:2Δ9,12 - - 33,4 -
18:3Δ6, 12,15 - - 4,9 -
18:3Δ9,12,15 - - 43,1
18:4Δ6,9,12,15 - - - 2,3
15 Die Angaben stellen Mol-% entsprechender cis-Fettsäuren dar.
Ergebnis der Expression einer Phaeodactylum tricornutum Δ-5-Acyl Lipid Desaturase in Hefe:
20 Tabelle 7
pYES2 pYES_PtD5-Konstrukt gefüttert mit
FettKon-. säure Leer trolle ; 18:2 18:3 20:1 -20:1 20:2 20:3 20:3
25 Δ8 Δll Δ11.14 Ω3 Ω6
16:0Δ 16,9 20,4 27,7 24,4 16,2 21 17,6 19,5 22,8
16.1Δ9 44,7 44,1 13,2 9,6 37,4 39,4 38,3 36,9 30,7
18:0 6,1 6,9 10,54 9,8 4,7 7,9 6,3 6,8 8,2
18 : 1 Δ9 31,72 28,1 8,77 6 15 26 29,5 25,6 21,1
30 18:2Δ5,9 0,17 0 0 0 0,09 0,21 0,09 9
18 : 2 Δ9,12 - 39,7 - - - - - -
18:3 Δ9, 12 ,15 - 49,9 — - - - -
20:1Δ8 - - 25,5 - - - -
20:1Δ11 - - - 5,41 - - -
35 20:2Δ5,11 - - - 0,21 - - -
20:2Δ11,14 - - - - 6,48 - -
20:3Δ5,11 ,14 - 0,76 - -
20:3Δ11,14,17 - - - - - 9,83 -
20:3Δ8,11 ,14 - - - - - - 13,6
40 20:4Δ5,11 ,14,17 - - - - - 1,16 -
20: Δ5,8, 11,14 - - - - - - 3,08
Die Angaben stellen Mol-% Fettsäuren von cis-Fettsäuren dar.
45 Aus weiteren Fütterungsversuchen wurde gefunden, dass C18:1Δ9 in der Anwesenheit von C18:2Δ9,11 oder C18 :3 Δ9, 12, 15 oder C20:1Δ8 Fettsäuren nicht desaturiert wurde während in Anwesenheit von C20.1Δ11, C20:2Δ11,14 und C20 : 3 Δ8 , 11, 14 auch C18:1 desaturiert 5 wird. Ebenfalls keine Desaturierung erfolgte in Anwesenheit von C20:3Δ8,11,14.
Bei Nutzung des Protease-defizienten Hefestammes C13BYS86 (Kunze I. et al., Biochemica et Biophysica Acta (1999) 1410:287-298) für
10 die Expression der Δ-5-Desaturase aus Phaeodactylum tricornutum auf Vollmedium mit Blasticidin wurde gefunden, dass C20.-4 Δ8,l1,14,17 als Substrat der Δ-5-Desaturase mit 20 % Umsatzrate ebenso gut umgesetzt wurde wie C20:3 Δ8,ll,14. Alternativ können auch die Auxotrophiemarker leu2 , ura3 oder his für Genexpression
15 genutzt werden.
In einem weiteren Coexpressionsexperiment von Δ-5 Desaturase aus Phaeodactylum und Δ-6 Elongase aus Physcomitrella wurde der Stamm UTL7A (Warnecke et al . , J. Biol. Chem. (1999) 20 274(19) :13048-13059)benutzt, wobei die Δ-5 Desaturase ca 10 % C20:3 Δ8,ll,14 zu C20:4 Δ5,8,ll,14 umsetzte.
Weitere Fütterungsexperimente mit verschiedensten anderen Fettsäuren allein oder in Kombination (z.B. Linolsäure, 20:3 25 Δ-5, 11, 14-Fettsäure, alpha- oder gamma Linolensäure, Stearidon- säure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure etc.) können zur detaillierteren Bestätigung der Substratspezifität und -Selektivität dieser Desaturasen durchgeführt werden.
30 Tabelle 8: Ergebnis der Coxpression einer Phaeodactylum tricornutum Δ-5-Acyl Lipid Desaturase und einer Δ-6 Elongase aus Moos in Hefe auf Basis der Expressionsvektoren pYes2 und pYesδ
35 pYes2- -Elo pYes2-Elo and pYes6-Ptd5
+18:3 +18:4 +18 1:3 +18:4
16:0 15,0 14,8 15 ,6 15,1 16 : 1Δ9 27,7 29,2 27 ,5 29,0 18:0 5,6 6,3 5, 7 6,4
40
18 : 1Δ9 17,1 30,8 27 ,4 31,6
18:3Δ6, 9, 12 7,60 - 7, 8
18:4Δ6, 9 , 12, 15 - 6,71 6,4
20:3Δ8, 11 .,14 15,92 - 13, 55
45 20:4Δ5, 8, 11, 14 - - l,: 31
20:4Δ8, ,11 .,14 ,17 - 11,4 10,31
20:5Δ5, 8, 11, 14, 17 - - 0,53 Aus den Substratumsetzungen geht hervor, dass die verwendete Δ-5-Desaturase aus Phaeodactylum und die Δ-6-Elongase aus Physcomitrella patens bzgl. der Substrataktivität und insbesondere der Substratspezifität geeignet sind, um Arachidon- säure bzw. Eicosapentaensäure mithilfe erfindungsgemäßer Sequenzen zu produzieren.
Die Fragmentierungsmuster und Massenspektren von DMOX-Derivaten von Standards als auch den Peakfraktionen per GC identifizierter Fettsäuren der in Tabelle 6, 7 und 8 aufgeführten, zeigen vergleichsweise identische Ergebnisse, wodurch die jeweilige Position der Doppelbindung über die bloße GC-Detektion hinaus abgesichert wurde.
Beispiel 18: Reinigung des gewünschten Produktes aus transformierten Organismen
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus Pflanzenmaterial oder Pilzen, Algen, Ciliaten, tierischen Zellen oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kulturen kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt nicht aus den Zellen sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standardtechniken, wie mechanische Kraft oder Ultraschallbehandlung, lysiert werden. Organe von Pflanzen können mechanisch von anderem Gewebe oder anderen Organen getrennt werden. Nach der Homogenisation werden die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, welche die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung aufbewahrt. Wird das Produkt aus gewünschten Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung aufbewahrt.
Die Überstandsfraktion aus jedem Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, oder die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können wenn nötig wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl geeigneter Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert . Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist. Im Fachgebiet ist ein breites Spektrum an Reinigungsverfahren bekannt, und das vorstehende Reinigungsverfahren soll nicht beschränkend sein. Diese Reinigungsverfahren sind zum Beispiel beschrieben in Bailey, J.E., & Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Standardtechniken des Fachgebiets bestimmt werden. Dazu gehören Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , spektro- skopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, insbesondere Dünnschichtchromatographie und Flammenionisations- detektion (IATROSCAN, Iatron, Tokio, Japan) , NIRS, Enzymtest oder mikrobiologisch. Eine Übersicht über diese Analyseverfahren siehe in: Patek et al . (1994) Appl . Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11:27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A., et al . (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Äquivalente
Der Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier beschriebenen erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet. Diese Äquivalente sollen von den Patentansprüchen umfasst sein.

Claims

Patentansprüche
1. Expressionskassette mit einer Struktur ausgewählt aus der Gruppe :
a) Ll - Promotor - Strukturgen - L2 ,
b) Ll - Promotor - Strukturgen - L2 - Ll - Promotor - Struk- turgen - L2,
c) Ll - Promotor - Strukturgen - L2 - Ll - Promotor - Strukturgen - L2 - Ll - Promotor - Strukturgen - L2 ,
wobei Ll , L2 , Promotor und Strukturgen die folgende Bedeutung hat:
Ll = SEQ ID NO: 32 oder eine äquivalente Restriktionsschnittstellen enthaltende Sequenz, L2 = unabhängig voneinander SEQ ID NO: 33, 34 oder 35 oder äquivalente Restriktionsschnittstellen enthaltende Sequenzen, Promotor = pflanzlicher Promotor Strukturgen = eine in Pflanzen exprimierbare Nukleinsäuresequenz .
2. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei das Strukturgen ein Biosynthesegen ist .
3. Expressionskassette nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Strukturgen ein Biosynthesegen des Lipid- oder Fettsäurestoffwechsels ist.
4. Expressionskassette nach den Ansprüche 1 bis 3, wobei das Strukturgen ein pflanzliches Gen ist.
Zeichn.
5. Expressionskassette nach den Ansprüche 1 bis 4, wobei das Gen eine Nukleinsäuresequenz ist, die für Proteine ausgewählt aus der Gruppe :
Acyl-CoA-Dehydrogenase (n) , Acyl-ACP[= acyl carrier protein] - Desaturase (n) , Acyl-ACP-Thioesterase(n) , Fettsäure-Acyl- Transferase (n) , Fettsäure-Synthase (n) , Fettsäure-Hydroxy- lase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase (n) , Acyl-Coen- zym A-Oxidase (n) , Fettsäure-Desaturase (n) , Fettsäure- Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure- Elongase(n), kodiert.
6. Expressionskassette nach den Ansprüche 1 bis 5, wobei das Gen eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe ist:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten werden,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäure- Sequenzen codieren und mindestens 50 % Homologie auf
Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.
7. Verwendung von Expressionskassetten gemäß den Anspüchen 1 bis 6 in einem Verfahren zur Herstellung von Fettsäureestern mit einem erhöhtem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen dadurch gekennzeichnet, daß man die Expressionskassette in einen Fettsäureester produzierenden Organismus einbringt, anzieht und die in dem Or- ganismus enthaltenen Fettsäureester isoliert.
8. Verfahren nach Anspruch 7 , wobei die durch das Verfahren hergestellten Fettsäureester mehrfach ungesättigte Cis-, C2o~ oder C -Fettsäuremoleküle mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäureester enthalten.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Cis-, C o~ oder C22-Fettsäuremoleküle aus dem Organismus in Form eines Öls, Lipids isoliert werden.
5 10. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 9, wobei der Organismus eine transgene Pflanze ist.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 10, wobei die Fettsäureester Cis-, C o~ oder C 2-Fettsäuren mit drei, vier oder fünf
10 Doppelbindungen im Fettsäureester enthalten.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die in den Fettsäureestern enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren freisetzt.
15
13. Vektor enthaltend eine Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 6.
14. Organismus enthaltend mindestens eine Expressionskassette ge- 20 maß den Ansprüchen 1 bis 6 oder mindestens einen Vektor gemäß
Anspruch 13.
15. Organismus nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Organismus um eine Pflanze handelt.
25
16. Transgene Pflanze enthaltend eine funktioneile oder nicht funktioneile Nukleinsäuresequenz in einer Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 6.
30 17. Verwendung einer einer Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.
35
40
45
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