WO2002053725A2 - Verkapselungsverfahren und damit hergestellte partikel - Google Patents

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WO2002053725A2
WO2002053725A2 PCT/EP2001/015335 EP0115335W WO02053725A2 WO 2002053725 A2 WO2002053725 A2 WO 2002053725A2 EP 0115335 W EP0115335 W EP 0115335W WO 02053725 A2 WO02053725 A2 WO 02053725A2
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WO
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biologically active
matrix material
glucose
active component
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Mathias Schroedter
Daniel Kaiser
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Alpha Bioverfahrenstechnick Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate

Definitions

  • the present invention relates to an encapsulation process (inclusion immobilization) for biologically active components and particles produced therewith which contain biologically active components.
  • Such methods are used to immobilize bioactive materials, especially cell cultures.
  • Such immobilized bioactive materials have several advantages over their cultivation in suspension culture.
  • the area of the immobilisation of bioactive materials, especially of cell cultures, offers some .Vormaschine against the cultivation 'suspension culture. Uniform capsule conditions can be found in the capsules, regardless of the reactor volume and that make it much easier to scale up a process. In addition, capsules offer shear-sensitive materials protection against mechanical stress. Furthermore, the establishment of continuous processes is simplified considerably by a simple cell separation.
  • bioactive materials When bioactive materials are encapsulated in matrices made of biopolymers, alginate, cellulose derivatives or lipids are conventionally used as biopolymer.
  • the bioactive materials can be enzymes, microorganisms, cell cultures and / or parts or organelles from microorganisms and cell cultures.
  • the capsules formed can be used for the biosynthesis of metabolites, for biotransformation or for biodegradation. Another point of use is the controlled release of substances, e.g. when used as a tissue replacement.
  • the object of the present invention is to provide an encapsulation process and particles produced therewith which are ideally suited for the stated purposes.
  • the biologically active components are embedded in a matrix material which is composed of a complex-forming substance.
  • a complex-forming substance which is composed of a complex-forming substance.
  • the individual sequence of which consists of two glucose molecules and two further non-glucose carbohydrate molecules.
  • the two non-glucose carbohydrate molecules ranthose and / or glucuronic acid are particularly advantageous and can also have further side chains, advantageously made of carbohydrates.
  • the glucose molecules can, advantageously with glycerate or acetate, be substituted to different degrees and to a preselected degree.
  • carbohydrate sequences are gellan or wellan, the properties of which can also be influenced by the degree of acetylation.
  • a solution of the carbohydrate sequence is advantageously mixed with the biologically active component to be immobilized and then dripped into a complex-forming liquid. This can also be supported by an additional fluid stream, the speed and strength of which can influence the droplet size and thus the particle size which subsequently form in the complexing liquid. If the process is carried out in a suitable manner, the biologically active components are enveloped or enclosed in the matrix material.
  • the capsules or particles hardened in this way can then be transferred to a conventional reaction system such as a stirred reactor and can be cultivated there under the conditions known from classic biotechnology.
  • the fields of application extend from the production of native or recombinant proteins (antibodies, enzymes, hormones cytokines and the like) to use as extracorporeal replacement tissue, for example in cytotoxicity measurement, to use as intracorporeal replacement tissue or as intracorporeal tissue for production and / or Release of substances, for example hormones, enzymes, antibodies or pharmaceuticals in general.
  • the capsules formed can therefore be used for the biosynthesis of metabolites, for biotransformation, for biodegradation or for the controlled release of substances.
  • Gellan is the biopolymer [-3-) -bD-glucose- (1-4) -b- D-glucuronic acid- (1-4-) -bD-glucose- (14) -aL-rhamnose- (l-] n (see Fig. 2), which is mainly used in the food industry as a gelling agent, it is formed by the microorganism Sphingomonas eloedea (formerly: Pseudomonas eleodea) and is available in large quantities in constant quality.
  • the glucose subunits can have different degrees of acetylene ,
  • Wellan can also be used, the structural formula of which is also shown below:
  • the capsule formation takes place through the formation of complexes with cations, preferably divalent cations.
  • the Gellan is dissolved at temperatures between 70 ° C and 100 ° C in ultrapure water in a moving bath. '
  • the concentration of the gellan is between 0.1% and 10%, preferably 0.75%.
  • the encapsulation is carried out with a dropletizer with one nozzle, optionally with two nozzles, which are then advantageously arranged concentrically.
  • the component to be encapsulated can be added in two ways: A) directly into the dissolved polymer material.
  • the component to be encapsulated is enclosed by the polymer material.
  • the drop that forms at the end of the nozzles falls into a bath containing a complex-forming substance.
  • the complexing agent can be a cation, for example sodium, preferably a multivalent cation, for example calcium or barium.
  • the complexing agent is in a buffer such as PBS (0.2 g / L KC1, 0.2 g / L KH 2 P0 4 , 8.0 g / L NaCl and 1.15 g / L Na 2 HP0 4 in H 2 0 ) or preferably Tris buffer (300 mM in H 2 0) dissolved in a concentration between 0.5 and 10%, preferably 1%.
  • the capsules can be immobilized, for example, using an encapsulation apparatus as shown in FIGS. 1 and 2.
  • FIG. 1 shows an encapsulation apparatus 1 with a.
  • Container 2 which contains a precipitation bath 3 with polyvalent cations.
  • This container 2 is arranged on a stirrer or base 4, with which the precipitation bath is kept in motion.
  • a nozzle 5 which here contains two concentric outlets 8 '9'.
  • the outlet 8 ' surrounds the central axial outlet 9'.
  • the outlet 8 ' is connected to a fluid supply channel 8 and the outlet 9' is connected to a component supply channel 9.
  • the channel 9 is now a mixture 23 of capsule-forming
  • Fig. 2 shows a corresponding encapsulation apparatus 1, wherein the same or similar reference numerals designate the same or similar elements.
  • three nozzle openings 8 ', 9', 13 ' are provided, the outermost nozzle opening 8' again containing a fluid.
  • the innermost axial nozzle opening 13 ' is connected to a feed 13, via which the ' bioactive material 22 is fed to the nozzle opening 13 '.
  • the nozzle opening 9 'located between the nozzle opening 13' and the nozzle opening 8 ', which concentrically surrounds the nozzle opening 13', is connected to the feed 9, via which the capsule-forming component 21 is fed to the nozzle 5.
  • the capsule-forming material is enclosed as a core 22 in a jacket 21 made of capsule-forming component when spraying out through the nozzle 5 and droplets. These drops 10 then again fall into the precipitation bath 3 and harden there to produce capsules 11.
  • the bioactive component is now surrounded by a jacket made of capsule-forming component.
  • the individual substances to be injected are supplied with the aid of a pump or with the aid of a pressure-overlaid storage vessel. The following are some examples of inventive Encapsulation process given.
  • Gellan is dissolved 1% (w / v) in ultrapure water.
  • 0.4 g of gellan (low acetylated) is dissolved in 40 ml of ultrapure water and heated to 90 ° C. with stirring.
  • Calcium chloride is made up to 10% (w / v) in 20 mm Tris buffer, the pH value of which was previously determined
  • 0.1 N HCI is set to 6.3.
  • the Gellan and the dropping apparatus. are heat sterilized in an autoclave, the calcium chloride is sterile filtered.
  • a cell suspension of SF21 cells is added to the gellan, the cell concentration of which is 5x107 cells / ml.
  • the suspension formed in this way is sent with the aid of a pump through the dropping apparatus shown in FIG. 1.
  • the resulting drops fall into the calcium chloride bath located under the dropletizer and moved by a magnetic stirrer and are stirred there for 30 minutes.
  • the stirring speed is 60 rpm so that undeformed capsules can form.
  • the capsules are then separated from the calcium chloride and washed three times with sodium / potassium buffer (100 mm, pH 6.3). This is followed by a washing step with medium (SF900II).
  • the cells immobilized in the capsules are cultivated in SF900II medium at 27 ° C. Vitality tests with MTT and EZ4U confirm the growth of the cells in the
  • the solutions are heat sterilized. After sterilization, the glucose solution (II) is added to the gellan solution (I) so that 50 ml of a solution (IV) is removed . stand, which is 1% (w / v) on both the gellan and the glucose.
  • 95 ml of cell culture medium (V) are mixed with the sodium chloride solution (III), so that a 1% (w / v) sodium chloride solution in 100 ml medium is obtained (VI).
  • a cell suspension (VII) of CHO cells with a living cell count of 1x106 cells with a vitality of> 90% are centrifuged at 150 rcf (+/- 50 rcf) and taken up in 1 ml of medium.
  • the concentrated cell suspension is added to the gellan-glucose solution (IV), mixed and heated to 27 ° C. for dripping in a water bath (VIII).
  • the cell suspension (VIII) is sent through a droplet apparatus according to FIG. 1 with a hose of 3 mm diameter by means of a hose pump at 5 ml / min.
  • the drops fall into the medium (VI), in which they harden for 1 h.
  • the cells are cultivated at 37 ° C. in a roller bottle at 6 rpm.
  • the number of living cells is determined by means of an MTT test and a previously recorded calibration line. 3 shows the course of cultivation.
  • the Gellan and the dropping apparatus are heat sterilized.
  • the calcium chloride solution is sterile filtered.
  • 220 ml of a cell suspension (III) of CHO cells with a living cell count of 1x106 cells / ml with a vitality of> 85% are centrifuged off at 200 rcf (+/- 50 rcf) and taken up in 5 ml of medium.
  • the concentrated cell suspension is added to the Gellan solution (I) (VI).
  • the cell suspension (VI) is sent with a tube of 1 mm diameter by means of a peristaltic pump at 5 ml / min through the inner capillary nozzle of a dropping apparatus according to FIG. 1.
  • the gellan (I) is passed through the jacket capillary at 5 ml / min.
  • a Cell suspension drop forms in a Gellan drop at the exit of the nozzles.
  • the drops fall into the calcium chloride bath (II), where they harden for 1 min.
  • the cells are cultivated at 37 ° C. in a roller bottle at 6 rp i.
  • the living cell number is determined using an MTT test and a previously recorded calibration line. 4 shows the course of a cultivation of these CHO cells enclosed in gellan capsules.
  • Wellan is a linear polymer consisting of repeated sequences of glucose, rhamnose and glucuronic acid in a ratio of 2: 1: 1. There are one-molar side chains made of L-rhamnose or L-mannose on this chain. Wellan is 0.25% (w / v) in WFI.
  • the Wellan is conveyed at 5 ml / min through a dropping apparatus according to FIG. 1 via a hose with an inner diameter of 3 mm.
  • Calcium chloride solution 1% (w / v) in WFI, serves as a hardening bath. The drops remain in the calcium chloride bath for 30 min.
  • the harmlessness of the welan for cell cultures is determined. A cytotoxicity test is used for this.
  • the capsules have a strength of approx. 10 N against mechanical destruction and are 2 mm in size on average.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einschlußimmobilisierung mindestens einer biologisch aktiven Komponente, wobei die biologisch aktive Komponente einer Lösung eines Matrixmaterials zugemischt und in eine das Matrixmaterial komplexierende Substanz eingebracht wird, und wobei als Matrixmaterial eine Kette aus einer sich wiederholenden Kohlenhydratsequenz verwendet wird, wobei die Kohlenhydratsequenz aus zwei Glukosemolekülen und zwei weiteren Nichtglukose-Kohlenhydratmolekülen besteht.

Description

Verkapselungsverfahren und damit hergestellte
Partikel
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver- kapselungsverfahren (Einschlußimmobilisierung) für biologisch aktive Komponenten und damit hergestellte Partikel, die biologisch aktive Komponenten enthalten.
Derartige Verfahren werden zur Immobilisierung bioaktiver Materialien, speziell von Zellkulturen, verwendet. Derartige immobilisierte bioaktive Materialien besitzen gegenüber ihrer Kultivierung in Suspensionskultur einige Vorteile.
Das Gebiet der Immobilisierung bioaktiver Materialien, speziell von Zellkulturen, bietet gegenüber der Kultivierung in' Suspensionskultur einige .Vorteile . So sind in den Kapseln einheitliche Kulturbedihgungen zu finden, die unabhängig vom Reaktorvolumen betrachtet werden können, und die die Maßstabsvergrößerung eines Prozesses wesentlich vereinfachen. Zudem bieten Kapseln scherempfindlichen Materialien Schutz vor mechanischem Streß. Weiterhin wird die Etablierung konti- nuierlicher Prozesse durch eine einfache Zellabtrennung wesentlich vereinfacht.
Bei der Verkapselung von bioaktiven Materialien in Matrizes aus Biopolymeren werden herkömmlicherweise als Biopolymere-Alginat, Zellulosederivate oder Lipi- de verwendet. Bei den bioaktiven Materialien kann es sich um Enzyme, Mikroorganismen, Zellkulturen und/oder Teile oder Organellen aus Mikroorganismen und Zellkulturen handeln. Die gebildeten Kapseln kön- nen zur Biosynthese von Metaboliten eingesetzt werden, zur Biotransformation oder zur Biodegradation. Ein weiterer Einsatzpunkt ist die kontrollierte Freisetzung von Substanzen, z.B. beim Einsatz als Gewe- ■ beersatz.
Die vorliegende Erfindung stellt sich nun die Aufgabe, ein Verkapselungsverfahren und damit hergestellte Partikel zur Verfügung zu stellen, die für die genannten Einsatzzwecke ideal geeignet sind.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 und die Partikel nach Anspruch 22 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Partikel werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben. Anspruch 25 nennt besonders vorteilhafte Verwendungen der erfindungsgemäßen Partikel.
Erfindungsgemäß werden die biologisch aktiven Kompo- nenten in ein Matrixmaterial eingebettet, das aus einer komplexbildenden Substanz aufgebaut ist. Als hierfür geeignete Substanz wurden sich wiederholende Kohlenhydratsequenzen gefunden, deren Einzelsequenz jeweils aus zwei Glucose olekülen und zwei weiteren Nichtglucose-Kohlenhydratmolekülen besteht. Besonders vorteilhaft sind die beiden Nichtglucose-Kohlen- hydratmoleküle Rha nose und/oder Glucuronsäure, die auch weitere Seitenketten, vorteilhafterweise aus Kohlenhydraten, aufweisen können. Die Glucosemoleküle können, vorteilhafterweise mit Glycerat oder Acetat, in unterschiedlichem Maße und in vorgewähltem Grad substituiert sein.
Besonders vorteilhafte Kohlenhydratsequenzen sind Gellan oder Wellan, wobei deren Eigenschaften noch zusätzlich durch den Acetylierungsgrad beeinflußt werden kann.
Vorteilhafterweise wird eine Lösung der Kohlenhydratsequenz mit der zu immobilisierenden biologisch akti- ven Komponente gemischt und anschließend in eine komplexbildende Flüssigkeit getropft. Dies kann auch unterstützt durch einen zusätzlichen Fluidstro erfolgen, über dessen Geschwindigkeit und Stärke die Tropfengröße und 'damit die Partikelgröße, die sich an- schließend in der ko plexierenden Flüssigkeit ausbilden, beeinflußt werden können. Bei geeigneter Verfahrensführung werden die biologisch aktiven Komponenten von dem Matrixmaterial umhüllt oder in dieses eingeschlossen.
Die so ausgehärteten Kapseln oder Partikel können dann in ein übliches Reaktionssystem wie ein Rührreaktor überführt werden und dort unter den aus der klassischen Biotechnologie bekannten Bedingungen kul- tiviert werden. Die Anwendungsgebiete erstrecken sich von der Produktion nativer oder rekombinanter Proteine (Antikörper, Enzyme, Hormone Cytokine und dergleichen) über den Einsatz als extrakorporales Ersatzgewebe, z.B. bei der Cytotoxizitätsmessung bis hin zum Einsatz als in- trakorporales Ersatzgewebe oder als intrakorporales Gewebe zur Erzeugung und/oder Freisetzung von Stoffen, beispielsweise von Hormonen, Enzymen, Antikörpern oder ganz allgemein Pharmaka. Die gebildeten Kapseln können also zur Biosynthese von Metaboliten eingesetzt werden, zur Biotransformation, zur Biodegradation oder auch zur kontrollierten Freisetzung von Substanzen.
Gellan ist das Biopolymer [-3-) -b-D-Glucose- (1-4) -b- D-Glucuronsäure- (1-4-) -b-D-Glucose- (14) -a-L-Rhamnose- (l-]n (siehe Abb. 2), das vor allem in der Lebensmittelindustrie als Geliermittel zum Einsatz kommt. Es wird vom Mikroorganismus Sphingomonas eloedea (früher: Pseudomonas eleodea) gebildet und ist in großen Mengen in gleichbleibender Qualität verfügbar. Die Glucoseuntereinheiten können verschieden Acetylie- rungsgrade aufweisen.
Die Strukturformel von Gellan ist wie folgt :
Figure imgf000005_0001
Alternativ kann auch vorzugsweise Wellan verwendet werden, dessen Strukturformel ebenfalls im folgenden dargestellt ist:
Figure imgf000006_0001
Die Kapselbildung erfolgt durch die Kömplexbildu g mit Kationen, vorzugsweise zweiwertigen Kationen. Die Lösung des Gellans erfolgt bei Temperaturen zwischen 70 °C und 100 °C in Reinstwasser im bewegten Bad. '
Die Konzentration des Gellans liegt dabei zwischen 0,1 % und 10 % vorzugsweise bei 0,75%. Die Verkapse- lung erfolgt dabei mit einer Vertropfungsapparatur mit einer Düse, wahlweise mit zwei Düsen, die dann vorteilhafterweise konzentrisch angeordnet sind. Die Zugabe der zu verkapselnden Komponente kann in zwei Arten erfolgen: A) direkt in das gelöste Polymermateriai.
=>' Die Vertropfungsapparatur wird nur mit einer
Düse betrieben. B) getrennt vom gelösten Polymermaterial durch die innere Düse.
=> Die zu verkapselnde Komponente wird dabei vom Polymermaterial umschlossen.
Der am Ende -der Düsen entstehende Tropfen fällt in ein komplexbildende Substanz enthaltendes Bad. Der Komplexbildner kann ein Kation, z.B. Natrium, vorzugsweise ein mehrwertiges Kation, z.B. Calcium oder Barium, sein. Der Komplexbildner wird dabei in einem Puffer wie PBS (0,2 g/L KC1, 0,2g /L KH2P04, 8,0 g/L NaCl und 1,15 g/L Na2HP04 in H20) oder vorzugsweise Trispuffer (300 mM in H20) gelöst und zwar in einer Konzentration zwischen 0,5 und 10 %, vorzugsweise 1 % .
Die Immobilisierung der Kapseln kann beispielsweise mit einer Verkapselungsapparatur, wie sie in den Figuren 1 und 2 dargestellt sind, durchgeführt werden.
Fig. 1 zeigt eine Verkapselungsapparatur 1 mit einem . Behälter 2, der ein Fällbad 3 mit mehrwertigen Kationen enthält. Dieser Behälter 2 ist auf einem Rührer bzw. Sockel 4 angeordnet, mit dem das Fällbad in Be- wegung gehalten wird. Oberhalb dieses Fällbades ist eine Düse 5 angeordnet, die hier zwei konzentrische Auslässe 8' 9' enthält. Der Auslaß 8' umgibt dabei den mittigen axialen Auslaß 9'. Der Auslaß 8' ist mit einem Fluidzufuhrkanal 8 verbunden und der Auslaß 9' mit einem Komponentenzufuhrkanal 9 verbunden. Dem Kanal 9 wird nun eine Mischung 23 aus kapselbildendem
Material und bioaktivem Material zugeführt, während der Fluidzufuhrkanal 8 mit einem Fluid 20 beauf- schlagt wird. Aus der Düsenöffnung 9' wird nun die
Mischung 23 in das Fällbad 3 ausgedüst bzw. getropft, während ein stützender Fluidstrom aus Fluid 20 aus der Düse 8T das ausgetropfte Material umgebend ausgeströmt wird. Durch Regelung der Fluidstromstärke bzw. der Fluidgeschwindigkeit kann nun die Tropfengröße 10 des noch nicht komplexierten Materials 23 bestimmt werden. Diese Tropfen 10 fallen in das Fällbad 3 und härten dort zu fertigen Kapseln 11 mit immobilisiertem bioaktivem Material eingeschlossen bioaktiven Komponente aus .
Fig. 2 zeigt eine entsprechende Verkapselungsapparatur 1, wobei mit gleichen oder ähnlichen Bezugszeichen gleiche oder ähnliche Elemente bezeichnet werden. In diesem Falle sind jedoch drei Düsenöffnungen 8', 9', 13' vorgesehen, wobei die äußerste Düsenöffnung 8' wiederum ein Fluid enthält. Die innerste axiale Düsenöffnung 13' ist mit einer Zufuhr 13 verbunden, über die das' bioaktive Material 22 der Düsenöffnung 13' zugeführt wird. Die zwischen der Düsen- Öffnung 13' und der Düsenöffnung 8' befindliche Düsenöffnung 9', die die Düsenöffnung 13' konzentrisch umgibt, ist mit der Zufuhr 9 verbunden, über die die kapselbildende Komponente 21 der Düse 5 zugeführt wird.
In diesem Falle wird das kapselbildende Material beim Ausdüsen durch die Düse 5 und Vertropfen als Kern 22 in einen Mantel 21 aus kapselbildender Komponente eingeschlossen. Diese Tropfen 10 fallen dann wiederum in das Fällbad 3 und verhärten dort zu fertigen Kapseln 11. Bei diesen Kapseln 11 ist nun die bioaktive Komponente von einem Mantel aus kapselbildender Komponente umgeben. Die Zufuhr der einzelnen auszudüsen- den Substanzen erfolgt mit Hilfe einer Pumpe oder mit Hilfe eines drucküberlagerten Vorlagegefäßes. Im folgenden werden einige Beispiele für erfindungsgemäße Verkapselungsverfahren gegeben .
Beispiel 1
Verkapselung von SF21 Zellen mit einer Düse
Gellan wird in Reinstwasser l%ig (w/v) gelöst. Dazu werden 0,4 g Gellan (niedrig acetyliert) in 40 ml Reinstwasser gelöst und unter Rühren auf 90 °C erhitzt. Calciumchlorid wird 10%ig (w/v) in 20 mm Trispuffer angesetzt, dessen pH-Wert vorher mit
0,1 N HCI auf 6,3 eingestellt wird. Das Gellan und die Vertropfungsapparatur . werden in einem Autoklaven hitzesterilisiert, das Calciumchlorid wird sterilfil- triert. Dem Gellan wird eine Zellsuspension von SF21 Zellen zugegeben, deren Zellkonzentration 5x107 Zellen/ml beträgt. Die so entstehende Suspension wird mit Hilfe einer Pumpe durch die in Fig. 1 dargestellte Vertropfungsapparatur geschickt. Die entstehenden Tropfen fallen in das unter der Vertropfungsapparatur befindliche, durch einen Magnetrührer bewegte Calci- umchloridbad und werden dort für 30 min gerührt. Die Rührgeschwindigkeit beträgt 60 rpmi, damit sich unde- formierte Kapseln bilden können. Die Kapseln werden anschließend vom Calciumchlorid getrennt und drei Mal mit Natrium/Kalium-Puffer (100 mm, pH 6,3) gewaschen. Daran schließt sich ein Waschschritt mit Medium (SF900II) an. Die Kultivierung der in den Kapseln immobilisierten Zellen erfolgt in SF900II-Medium bei 27 °C. Vitalitätstests mit MTT und EZ4U belegen das Wachstum der Zellen in den Kapseln.
Beispiel 2
Verkapselung von CHO-Zellen mit einer Düse.
Es werden folgende Substanzen getrennt eingewogen und gelöst:
Gellan (niedrig acetyliert) 0,5 g in 40 ml Reinstwasser (I), Glucose 0,5 g in 10 ml Reinstwasser (II) und Natriumchlorid 1 g in 5 ml Reinstwasser (III) . Die Lösungen werden hitzesterilisiert. Nach der Sterilisation wird die Glucoselösung (II) der Gellanlösung (I) hinzugefügt, so daß 50 ml einer Lösung (IV) ent- . stehen, die 1% (w/v) sowohl auf das Gellan, als auch auf die Glucose ist. 95 ml Zellkulturmedium (V) wer- den mit der Natriumchloridlösung (III) versetzt, so daß ein l%ige (w/v) Natriumchloridlösung in 100 ml Medium entsteht (VI) .
250 ml einer Zellsuspension (VII) von CHO-Zellen mit einer Lebendzellzahl von 1x106 Zellen bei einer Vitalität von >90% werden bei 150 rcf (+/- 50 rcf) abzen- trifugiert und in 1 ml Medium aufgenommen. Die aufkonzentrierte Zellsuspension wird der Gellan-Glucose- Lösung (IV) zugegeben durchmischt und für die Ver- tropfung im Wasserbad auf 27 °C temperiert (VIII) . Zur Vertropfung wird die Zellsuspension (VIII) mit einem Schlauch von 3 mm Durchmesser mittels einer Schlauchpumpe mit 5 ml/min durch eine Vertropfungsapparatur nach Fig. 1 geschickt. Die Tropfen fallen in das Medium (VI) , in dem sie für 1 h aushärten. Nach eine Waschschritt mit Zellkulturmedium werden die Zellen bei 37 °C in einer Rollerflasche bei 6 rpmi kultiviert. Die Lebendzellzahl wird mittels MTT-Test und einer vorher aufgenommen Kalibriergerade errαit- telt. Fig. 3 zeigt den Verlauf einer Kultivierung.
Beispiel 3
Verkapselung von CHO-Zellen mit zwei Düsen.
Es werden folgende Substanzen getrennt eingewogen und gelöst:
Gellan 0,5 g in 45 ml WFI (I), Calciumchlorid 2 g in 200 ml WFI (II) . Das Gellan und die Vertropfungsapparatur werden hitzesterilisiert. Die Calciumchloridlö- sung wird sterilfiltriert. 220 ml einer Zellsuspension (III) von CHO-Zellen mit einer Lebendzellzahl von 1x106 Zellen/ml bei einer Vitalität von >85% werden bei 200 rcf (+/- 50 rcf) abzentrifugiert und in 5 ml Medium aufgenommen. Die aufkonzentrierte Zellsuspen- sion wird der Gellan-Lösung (I) zugegeben (VI) . Zur Vertropfung wird die Zellsuspension (VI) mit einem Schlauch von 1 mm Durchmesser mittels einer Schlauchpumpe mit 5 ml/min durch die innere Kapillardüse einer Vertropfungsapparatur nach Fig. 1 geschickt. Das Gellan (I) wird mit 5ml/min durch die Mantelkapillare geschickt. A Ausgang der Düsen bildet sich ein Zell- suspensionstropfen in einem Gellantropfen. Die Tropfen fallen in das Calciumchloridbad (II) , in dem sie für 1 min aushärten. Nach drei Waschschritten mit Zellkulturmedium werden die Zellen bei 37 °C in einer Rollerflasche bei 6 rp i kultiviert. Die Lebendzellzahl wird mittels MTT-Test und einer vorher aufgenommen Kalibriergerade ermittelt. Fig. 4 zeigt den Verlauf einer Kultivierung dieser in Gellankapseln ein- geschlossenen CHO-Zellen.
Beispiel 4
Kapselbildung mit Wellan .
Wellan ist ein lineares Polymer, bestehend aus sich ' wiederholenden Sequenzen aus Glucose, Rhamnose und Glucuronsäure im Verhältnis 2:1:1. An dieser Kette gibt es einmolare Seitenketten aus L-Rhamnose oder L- Mannose. Wellan wird 0,25 %ig (w/v) in WFI angesetzt. Über einen Schlauch mit Innendurchmesser von 3 mm wird das Wellan mit 5 ml/min durch eine Vertropfungsapparatur nach Fig. 1. gefördert. Als Bad zum Aushärten dient Calciu chloridlösung, l%ig (w/v) in WFI. Die Tropfen verbleiben für 30 min im Calciumchloridbad. In einem getrennten Versuch wird die Unbedenklichkeit des Wel- lans für Zellkulturen ermittelt. Dazu wird ein Zyto- toxizitätstest verwendet. Die Kapseln weisen eine Fe- stigkeit von ca. 10 N gegen mechanische Zerstörung auf, sind im Mittel 2 mm groß.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Einschlußimmobilisierung minde- stens einer biologisch aktiven Komponente, wobei die biologisch aktive Komponente einer Lösung eines Matrixmaterials zugemischt und in eine das Matrixmaterial komplexierende Substanz eingebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Matrixmaterial eine Kette aus einer sich wiederholenden Kohlenhydratsequenz verwendet wird, wobei die Kohlenhydratsequenz aus zwei Glukosemolekülen und zwei weiteren Nichtglukose- Kohlenhydratmolekülen besteht.
2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Nichtgluko- se-Kohlenhydratmoleküle Rhamnose und/oder Glucu- ronsäure sind
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Glukosemoleküle substituiert sind.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Glu- kosemoleküle mit Glycerat' oder Acetat substituiert sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydratsequenz Seitenketten aufweist.
6. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenketten aus Kohlenhydraten bestehen.
7. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenketten einmolekulare Seitenketten sind.
8. Verfahren nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenketten L-Rhamnose-Moleküle und/oder L-Mannose- Moleküle sind
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydratsequenz Gellan oder Wellan ist.
10. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß das Gellan einen unterschiedlichen vorbestimmten Acetylierungsgrad aufweist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Komponente einer 0,75 %igen Lösung des
Matrixmaterials zugegeben wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung aus biologisch aktiver Komponente und Lösung des Matrixmaterials in die das Matrixmaterial kom- plexierende Substanz eingetropft oder eingesprüht wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Komplexbildner eine Lösung von Kationen verwendet wird.
14. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch da- durch gekennzeichnet, daß als das das Matrixmaterial komplexierender Komplexbildner Lösungen ein- oder mehrwertiger Kationen verwendet werden
15. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Ko - plexbildner Lösungen von Na+, Ca2+ und/oder Ba2+ verwendet werden.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel für den Komplexbildner PBS oder Tris-Puffer verwendet wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Komponente einer 0,1 bis 10 %igen Lösung des Matrixmaterials zugegeben wird.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktiven Komponente und die Lösung des Matrixmaterials über eine Düse miteinander vermischt werden.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktiven Komponente und die Lösung des Matrix a- terials beim Vermischen mit einem Fluid beaufschlagt werden.
20. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluid in gleiche Richtung wie die Mischung aus biologisch aktiver
Komponente und Lösung des Matrixmaterials strömt.
21. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluidstro die Mischung aus biologisch aktiver
Komponente und Lösung des Matrixmaterials konzentrisch umgibt.
22. Biologische aktive Partikel mit einer Matrix enthaltend komplexierte Ketten aus einer sich wiederholenden Kohlenhydratsequenz, wobei die Kohlenhydratsequenz aus zwei Glukosemolekülen und zwei weiteren Nichtglukose- Kohlenhydratmolekülen besteht, sowie in die Matrix eingelagerte biologisch ak- tive Moleküle.
23. Partikel nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Nichtgluko- se-Kohlenhydratmoleküle Rhamnose und/oder Glucu- ronsäure sind.
24. Partikel nach einem der beiden vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Glukosemoleküle substituiert sind.
25. Partikel nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Glukosemoleküle mit Glycerat oder Acetat substituiert sind.
26. Partikel nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydratsequenz Seitenketten aufweist.
27. Partikel nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenketten aus Kohlenhydraten bestehen.
28. Partikel nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenketten einmolekulare Seitenketten sind.
29. Partikel nach einem der drei vorhergehenden An- Sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenketten L-Rhamnose-Moleküle und/oder L-Mannose- Moleküle sind
30. Partikel nach einem der Ansprüche 22 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydratsequenz Gellan oder Wellan ist.
31. Partikel nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Gellan einen unterschiedlichen vorbestimmten Acetylierungsgrad aufweist.
32. Partikel nach einem der Ansprüche 22 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Komponente tierische, pflanzliche und/oder chimöre Zellen, Enzyme oder andere biologisch aktive Substanzen aufweist.
33. Partikel nach einem der Ansprüche 22 bis 32, ge- kennzeichnet durch einen Durchmesser zwischen
0, 1 und 10 mm.
34. Partikel nach dems vorhergehenden Anspruch, gekennzeichnet durch einen Durchmesser zwischen
0, 5 und 5 m .
35. Verwendung von Partikeln nach einem der Ansprüche 22 bis 34 zur Herstellung von nativen und/oder rekombinanten Proteinen, wie Antikörpern, Enzyme, Hormone oder Cytokine in vitro oder in vivo in biologischem Gewebe, wie Gewebe tierischer oder menschlicher Herkunft, als ex- trakorporales Ersatzgewebe, zur späteren Transplantation oder Implantation als intrakorporales Ersatzgewebe oder zur intrakorporalen Erzeugung und/oder Freisetzung von Stoffen, beispielsweise pharmazeutisch wirksamen Stoffen an Lebewesen wie Tier oder Mensch, und/oder für Cytotoxizi- tätsmessungen .
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