WO2002040682A1

WO2002040682A1 - Procede servant a preparer un coenzyme q¿10?

Info

Publication number: WO2002040682A1
Application number: PCT/JP2001/010119
Authority: WO
Inventors: Hideyuki Matsuda; Makoto Kawamukai; Kazuyoshi Yajima; Yasuhiro Ikenaka
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2000-11-20
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2002-05-23
Also published as: DE60134567D1; US20040067566A1; EP1336657A4; EP1336657B1; CA2429458A1; US20080064074A1; EP1336657A1; ATE399209T1; JPWO2002040682A1; JP4191482B2

Description

明細書

コェンザィム Q_{1 Q}の製造法

技術分野

本発明は、医薬品等として用いられているコェンザィム。の製造に関する。より詳細には、コェンザィム Q₁₀の生合成に関するキー酵素であるコェンザィム Q 0側鎖合成酵素、すなわちデカプレニル 2燐酸合成酵素をコードする遺伝子を Rh o d o t o r u l a属に属する真菌より単離し、これを宿主微生物に導入することによりコェンザィム Q₁₀を生成させる方法に関する。背景技術

従来のコェンザィム Qェ。の製造法は、タバコなどの植物由来のコェンザィム Qを単離して、その側鎖長を合成法により調整する等によって工業的には生産されている。

また、コェンザィム Qェ。は細菌や酵母などの微生物から高等動植物に至るきわめて幅広い生物により生産されることが知られているが、微生物を培養してその菌体より本物質を抽出する方法が最も有効な一つの製造法であると考えられ、実際の工業的な生産にも用いられている。しかしながら、これらの方法では、生成量が少なかったり操作が煩雑であったりする等、その生産性は良好とは言い難い。

また、コェンザィム。ではないが、鎖長の異なる類縁体. （例えば、コェンザィム Q₈など）においては、その生合成に関わる遺伝子を単離し、遺伝子組換え技術により当該遺伝子を増幅し生産増強に利用する試みもなされている。

生体内において、コェンザィム。は、多くの酵素が関与した多段階の複雑な反応によって生成されている。その生合成経路は、原核生物と真核生物では一部異なっているが、いずれも基本的には大きく 3つのステップ、すなわち、コェンザィム Q₁₀のプレニル側鎖のもとになるデカプレニル 2燐酸を合成するステップ、キノン環のもとになるパラヒドロキシ安息香酸を合成するステップ、そして、これらの 2つの化合物を結合させて置換基を順次変換してコェンザィム 0を完成させるステップよりなっている。これらの反応の中で、生合成反応全体の律速であると言われ、コェンザィム。の側鎖の長さを決定している反応、すなわちデカプレニル 2燐酸合成酵素の反応は最も重要な反応であると考えられる。

従って、コェンザィム。を効率よく生産させる為には、生合成のキー遺伝子であるデカプレニル 2燐酸合成酵素の遺伝子を単離して生産増強に利用することが有効であると考えられ、その遺伝子源としてはコェンザィム。を比較的多量に生産している真菌類が有力な候捕となる。

これまで tこ、 S c h i z o s a c h a r omy c e s p o mb e (特 |8平 9 一 1 / ό 0 7 Ό ) や l u c o n o b a c t e r s u b o x y d a n s (特平 1 0— 5 7 0 7 2) などいくつかの種類の微生物よりデカプレニル 2燐酸合成酵素の遺伝子が分離されているが、本来これらの微生物ではコェンザィム Q_{1 (3} の生産性が十分とはいえず、これらの微生物では効率的な培養や分離精製などは出来ていなかった。そこで、さらにコェンザィム。を高生産する微生物由来の本酵素遺伝子を単離することが望まれていた。

発明の要約

本明は、上記の生産性に関する問題を解決するべく、 R h o d o t o r u l a属に属する真菌由来のコェンザィム Q_{1 ()}の側鎖合成遺伝子を単離してこれを利用することにより、微生物によってコェンザィム Q₁₀を効率よく生産することを目的とする。

上記目的を達成する為に、本発明者らは、コェンザィム。を比較的多量に生産している Rh o d o t o r u 1 a属に属する真菌から、デカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子を単離するための検討を重ね、該遺伝子を単離することに成功した。さらに、該遺伝子の高発現化の検討を重ね、コェンザィム。をより多量に発現する遺伝子に改良することに成功し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、以下の（a ) 、 (b) 又は（c ) の DNA : (a) 塩基配列が配列番号 1に記載のものである DNA：

(b) 配列番号 1に示す塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び Z又は置換された D N A配列を有し、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA：

(c) 配列番号 1に示す塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA。

本発明はまた、原核生物での発現が改良された DNA、即ち、以下の（d) 、 (e) 又は（ f ) の DNAである：

( d ) 塩基配列が配列番号 3に記載のものである D N A：

( e ) 配列番号 3に示す塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び Z又は置換された D N A配列を有し、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA：

( f ) 配列番号 3に示す塩基配列からなる DNAとストリンジントな条件下でハイブリダィズし、かつデカプレニル 2燧酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA。

本発明はまた、原核生物での発現が改良された DNA、即ち、以下の（k) 、 (1) 又は（m) の DNAである：

( k ) 塩基配列が配列番号 5に記載のものである D N A： .

(1) 配列番号 5に示す塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び Z又は置換された D N A配列を有し、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA：

(m) 配列番号 5に示す塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA。

本発明はまた、以下の（g) 又は（h) のタンパク質である：

(g) アミノ酸配列が配列番号 2に記載のものであるタンパク質：

(h) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び/又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質。

本発明はまた、以下の（i) 又は（j ) 'のタンパク質である：

( i ) アミノ酸配列が配列番号 4に記載のものであるタンパク質：

( j ) 配列番号 4に示すァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、追加、挿入及ぴ Z又は置換されたアミノ酸配列からなり、.かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質。

本発明はまた、以下の（n) 又は（o) のタンパク質である：

(n) アミノ酸配列が配列番号 6に記載のものであるタンパク質：

(o) 配列番号 6に示すァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及びノ又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質。

本発明はまた、上記（g) 〜（； i ) のタンパク質をコードする DNAである。本発明はまた、上記 DNAをベクターに組み込んでなる発現ベクターである。本発明はまた、宿主微生物を上記 DNA又は発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体である。

本発明はまた、上記（n) 又は（o) のタンパク質をコードする DNAである。本発明はまた、上記 DNAをベクターに組み込んでなる発現ベクターである。本発明はまた、宿主微生物を上記 D N A又は発現べクタ一にて形質転換してなる形質転換体である。

本発明はさらに、上記形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコェンザィム

Q₁₀を生成蓄積し、これを採取することからなる、コェンザィム。の製造方法でもある。発明の詳細な開示

以下に本発明を具体的に詳述する。

本発明者らは、コェンザィム。を比較的多量に生産している Rh o d o t o r u 1 a属に属する真菌から本酵素遺伝子を分離するための検討を重ねたところ、 P CR法によって該遺伝子の断片を取得することに成功した。

既知のデカプレニル 2燐酸合成酵素、及び本酵素と類縁で鎖長の違うコェンザィム Qの長鎖プレニル鎖合成酵素であるポリプレニル 2燐酸合成酵素の遺伝子の配列を比較し、その相同性の高い領域について PCRプライマーを各種合成した。そしてこれらのプライマーを種々組み合わせ、 PCRの条件をいろいろ検討したところ、プライマー DP S— 1 (5 ' -AAGGATCCTNYTNC AYGA YGAYGT— 3' .) 及び DP S— 1 1 AS (5 ' —ARYTGNADRAA YTCNCC— 3' ) を用い（なお、ここで示した配列中の、 Rは Aまたは G、 Yは Cまたは T、そして Νは G、 A、 Tまたは Cを示す。 ) 、 PCRを 94°C、 3分間の熱処理の後、 94。C、 1分→43°C、 2分→72°C、 2分のサイクルを 40回繰り返すことにより、 Rh o d o t o r u 1 a属に属する真菌、 R h o d o t o r u 1 a m i n u t a I FO 0387の染色体遺伝子から本酵素遺伝子の約 220 b pの断片が増幅してくることを、その遺伝子の塩基配列を解析することにより明らかにした。

次に本酵素遺伝子の全長を取得するために、 Rh o d o t o r ix l a m i n u t a I FO 0387の染色体遺伝子を制限酵素 E c o R Iで切断し、ラムダファージベクターに挿入して組換えファージライブラリ一を作製した。そのプラークをナイロン膜に転写した後、標識した該 PC R断片を用いてプラークハイブリダイゼーシヨンを行うことにより、デカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子全長を持つクローンを取得することができた。

得られたクローンに含まれるデカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子について塩基配列の決定を行つたところ、配列表の配列番号 1に示した配列を持つことが明らかとなり、この配列から予想できるアミノ酸配列（配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列）にはデカプレニル 2燐酸合成酵素の遺伝子として特徴的な配列がみられた。

真核生物では、デカプレニル 2燐酸合成酵素の遺伝子は、ミトコンドリア内で発現し機能しているため、本遺伝子配列のァミノ酸末端側の配列にはミトコンドリアへ局在性を行わせる配列が存在すると考えられる。従って、この遺伝子を原核生物でより有効に機能させるためには、原核生物で必須でない配列を特定し除く必要があると考えた。該遺伝子配列のァミノ酸末端側の配列について検討を重ねた結果、配列番号 3に記載の遺伝子を用いることによりコェンザィム。を著量生産する事が可能になった。配列番号 3に示した D N A配列から予想されるアミノ酸配列は、配列表の配列番号 4に記載した。さらにアミノ酸末端側の配列について検討を重ねた結果、配列番号 5に記載の遺伝子を用いることによりコェンザィム。。を著量生産する事が可能になった。配列番号 5に示した D N A配列から予想されるァミノ酸配列は、配列表の配列番号 6に記載した。

本発明の D N Aは、塩基配列が配列番号 1又は配列番号 3に記載のものである D NAであってもよいし、配列番号 1又は配列番号 3に示す塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、追加、揷入及び/又は置換された塩基配列を有し、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする D N Aであってもよいし、配列番号 1または配列番号 3に示す塩基配列からなる D N Aとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする D N Aであってもよい。なお、多くのアミノ酸は 1種以上のコドンで規定される（遺伝暗号の縮重）ことから、配列番号 2 又は配列番号 4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D N Aとしては、配列番号 1又は配列番号 3で示す塩基配列からなる D N A以外にも多数存在する。従って、本発明の D N Aには、配列番号 2又は配列番号 4で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D NAも含まれる。

本発明の D N Aは、塩基配列が配列番号 5に記載のものである D N Aであつてもよいし、配列番号 5に示す塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び Z又は置換された塩基配列を有し、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする D N Aであってもよいし、配列番号 5 に示す塩基配列からなる D N Aとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする D N Aであってもよい。なお、多くのアミノ酸は 1種以上のコドンで規定される（遺伝暗号の縮重）ことから、配列番号 6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNAとしては、配列番号 5で示す塩基配列からなる 0N A以外にも多数存在する。従って、本発明の DNAには、配列番号 6で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DN Aも含まれる。

ここで、「1若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及ぴ Z又は置換された塩基配列」とは、蛋白核酸酵素増刊遺伝子増幅 PCR法 TAKKAJ 35 (17) , 295 1 -31 78 (1990) 又は H e n r y A. E r 1 i c h 編加藤郁之進鑑訳 PCRテクノロジー（1990) 等に記載の当業者に周知の方法により欠失、追加、挿入及び/又は置換できる程度の数の塩基が欠失、追力挿入及びノ又は置換されてなる塩基配列を意味する。

「配列番号 1 (又は、配列番号 3若しくは配列番号 5) に示す塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズする DNA」とは、配列番号 1 (又は、配列番号 3若しくは配列番号 5) に示す塩基配列からなる DN Aをプローブとして、コロニー .ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーション法、又はサザン ·ハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNAのことをいう。当業者であれば、該ハイブリダィゼーシヨンを M o l e c u l a r C l o n i n g 2 n d E d t . (C o l d S p r i n g Ha r b o r La b o r a t r y P r e s s, 1 989) に記載されている方法に準じて実施して、目的とする DNAを容易に取得できる。

また、「デカブレニル 2燐酸合成璩素活性を有するタンパク質」とは、配列番号 2、配列番号 4、又は配列番号 6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を用いた場合の 10%以上、好ましくは 40%以上、より好ましくは 60%以上、さらに好ましくは 80 %以上の収率でデカプレニル 2燐酸を合成する能力を持つタンパク質のことをいう。このような測定は、 FPP (フアルネシル 2燐酸）と¹ ⁴C- I P P (放射ラベルしたイソペンテュル 2燐酸）を用いて対象酵素と反応させ、生成した¹⁴ C— DP P (デカプレニル 2燐酸）をホスファターゼにより加水分解後、 TLCにて分離して、各鎖長のスポットへの取り込みによって確定する（Ok a d a e t a 1. , Eu r . J. B i o c h em. ， 255, 5 2— 59) 。

本発明のタンパク質は、アミノ酸配列が配列番号 2、配列番号 4、又は配列番号 6に記載のものであるタンパク質であってもよいし、配列番号 2、配列番号 4、又は配列番号 6に示すァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、追加、挿入及び/又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質であってもよい。

「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び/又は置換されたァミノ酸配列」は、部分特異的突然変異誘発法など当業者に周知の方法により、ァミノ酸を欠失、追加、揷入及び Z又は置換することにより取得可能である。具体的には、 Nu c l e i c Ac i d R e s. 10， 6487 (1 982) 、 Me t h o d s i n En z ymo 1 o g y 100， 448 (1 983) 等の文献に記載されている。

デカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子を発現させるためには、適当なプロモータ一の下流に該遺伝子を接続することが必要であるが、例えば遺伝子を含む DN A 断片を制限酵素によって切り出したり、 PCRによって酵素をコードする遺伝子部分のみを増幅させたりした後、プロモーターを持つベクターに揷入することにより発現ベクターとすることができる。

本発明において、デカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコ一'' ドする DNAを組み込む発現用ベクターとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミドに、適当なプロモーターを組み込んだものが挙げられる。大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、 pBR 322、 p BR325、 pUC 1 9、 pUC 11 9等が挙げられ、プロモーターとしては、例えば、 T 7プロモ一ター、 t r pプロモーター、 t a cプロモーター、 l a cプロモーター、 X P Lプロモーター等が挙げられる。また、本発明においては発現用ベクターとして、 p GEX- 2 T_s pGEX— 3T、 p GEX- 3 X (以上、フアルマシア社製) 、 p B l u e s c r i p t l I _N pUC 19、 pUC 18 (東洋紡社製）、 p MA LC 2、 p ET— 3T、 pUCNT (WO 94 / 036 13に記載）等を用いることもできる。このうち、； UCNTが好適に用いられ、具体的な例としては、発現用べクター p U C N Tに配列番号 1に示す塩基配列からなる D N Aを揷入すれば、デカプレュル 2燐酸合成酵素遺伝子の発現べクター pNTRm2を作製することができるし、配列番号 3に示す塩基配列からなる DNAを揷入すれば、発現ベクター _p NT Rm 6を作製することができる。また、配列番号 5に示す塩基配列からなる DNAを発現用ベクター: UC 1 8に揷入すれば、発現ベクター p UCRm 3を作製することができる。

そして、該酵素遺伝子の発現ベクターを適当な微生物に導入することによりコェンザィム。の生産に利用することが可能となる。宿主微生物としては特に限定されず、 E s c h e r i c h i a c o l iが好適に用いられる。 E s c h e r i c h i a c o l iとしては特に限定されず、 XL 1— B l u e、 B L_ 2 1、 J Ml 0 9、 NM5 2 2、 DH 5 a、 HB 1 0 1、 DH 5、 pUC 1 8等が挙げられる。このうち E s c h e r i c h i a c o l i HB 1 0 1及び ρ UC 1 8が好適に用いられ、例えば、デカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター p NTRm2、 p NT Rm 6又は p UCRm 3を大腸菌に導入した場合には、大腸菌が本来は生産しないコェンザィム。を著量生産するように変換できる。 p NTRm2を導入した大腸菌は E. c o l i HB 1 0 1 (p NTR m 2) F ERM B P— 7 3 3 3として、また、： N T Rm 6を導入した大腸菌は E. c o l i HB 1 0 1 (p NTRm6) F ERM B P— 7 3 3 2として、また、 p UCRm 3を導入した大腸菌は E. c o l i DH 5 a (p UCRm 3 ) FERM B P— 7 6 3 8として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) にブタペスト条約に基づき寄託されている。

本遺伝子は単独で用いるほか、他の生合成に関与する遺伝子と同時に微生物に導入して発現させることにより、さらに良い効果が期待できる。

本発明で得られた形質転換体を、常法に従い、培地中で培養し、培養物中からコェンザィム Q₁₀を採取することにより、コェンザィム Q₁₀を製造することができる。宿主微生物が E s c h e r i c h i a c o l iである場合は、培地として、 LB培地や、グルコースやカザミノ酸を含む M9培地を用いることができる。プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピルチオガラクトシドゃィンドリル一 3—ァクリル酸のような薬剤を培地に加えてもよい。培養は例えば、 37°Cで 1 7〜24時間行い、この際必要により通気や攪拌を行ってもよい。本発明において、得られたコェンザィム。は精製を行ってもよく、粗精製物として用いてもよく、用途により適宜選択することができる。得られた培養物からコェンザィム Q₁₀を単離するには公知の分離 ·精製法を適宜組み合わせることができる。公知の分離 '精製法としては、塩析ゃ溶媒沈殿等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、及び、（SDS— ) ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、ァフィ二ティークロマトグラフィ一等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体ク口マトグラフィ一等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。

本発明において得られたコェンザィム Q i 0の用途は特に限定されず、医薬品等に好適に用いることができる。図面の簡単な説明

図 1は、発現ベクター p NT Rm 2の制限酵素地図である。

図 2は、発現べクター p N T R m 6の制限酵素地図である。

図 3は、宿主及び形質転換体生産物の HP L C分析チャートである。

図 4は、発現ベクター pUCRm 3の制限酵素地図である。

図 5は、発現ベクター p UCRm3の宿主及び形質転換体生産物の H P L C分析チヤートである。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

(実施例 1 )

Rh o d o t o r u l a m i nu t a I FO 0387の染色体 DN Aを C. S. Ho f f ma nらの方法（G e n e、 57 (1987) 267— 272 ) で調製した。既知の長鎖プレニル 2燐酸合成酵素の遺伝子との相同性から PC Rに用いるプライマー D P S— 1 (5 ' -AAGGATCCTNYTNCAYG AYGAYGT— 3， ) 及ぴ DPS— I 1 AS (5，一 ARYTGNADRA AYTCNCC- 3' ) を設計した。なお、ここで示した配列中の、 Rは Aまたは G、 Yは Cまたは T、そして Νは G、 A'、 Tまたは Cを示す。これらを用いて。1 を94°〇、 3分間の熱処理の後、 94°C、 1分→43° (、 2分→72°C、 2分のサイクルを 40回操り返すことにより行い（酵素は T a k a r a製 E X T a qを使用）、 1. 2%ァガロースゲル電気泳動により分析した。

そして得られた約 220 b pの断片をゲルより切り出して DN A抽出キット（ S e p h a g l a s (商標） B r a n d P r e p K i t, アマシャムファノレマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、 PCR産物ダイレクトクローニングキット（pT7B l u e T— Ve c t o r K i t, NO V AG EN社製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローユングし、 p T 7— RmDP Sを得た。 D NA塩基配列を DNAシークェンサ一（377型、パーキンエルマ一社製）を用 V\ DNAシークェンスキット（パーキンエルマ一社製、 AB I PR I SM ( 商標） B i g D y e (商標） T e rm i n a t o r Cy c l e S e q u e n c e R e a dy R e a c t i o n K i t Wi t h Am t i T a q (登録商標） DNA p o 1 yme r a s e、 F S) を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定した。その結果、配列表の配列番号 1 の 823から 1029までの塩基配列に示す配列が得られた。この翻訳配列に長鎖プレニル鎖を持つプレニル 2燐酸合成酵素に特徴的な領域の配列「GD F L L ARA」が見出せたことにより、得られた配列はデカプレニル 2燐酸合成酵素の遺伝子の一部であることが想定された。 (実施例 2 )

Rh o d o t o r u l a m i nu t a I F O 0387のデカプレニノレ 2 燐酸合成酵素遺伝子と思われる 220 b pの DNA断片を持つ！） T7— RmDP Sベクター DNA0. 03 /z gを用い、 P CR用のプライマー Rm— 1 S (5⁵ -GCCATGAGGAGAGCACAAGCG- 3 ' の配列を持つ）及ぴ Rm - 2 AS (5 ' — CACGGAGGCTACTAGCTCGAC— 3' の配列を持つ）を用いて PCR (94°C、 3分→ (94°C、 30秒→55°〇、 30秒→7 2°C、 1分) X 25サイクル繰り返し→72°C、 5分→ 4 °C) を行い、 1. 2% ァガロース（宝酒造製）によるゲル電気泳動を行い、約 145 b pの断片をゲルより切り出して DN A抽出キット（S e p h a g l a s (商標） B r a n d P r e p K i t, アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いて精製した。この DNA断片約 10 O n gを用い、 ECLダイレクト核酸ラベリングシステム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いて化学発光標識した。

(実施例 3)

Rh o d o t o r u l m i n u t a I F〇 0387の染色体 DNAを制限酵素 E c o R Iで切断し、 0. 8 %ァガロースゲルを用いた電気泳動を行つた。このゲルをアルカリ（0. 5M NaOH、 1. 5M Na C l ) で変成させ、中和（0. 5M T r i s ■ HC 1 (pH7. 5) 、 1. 5M N a C 1 ) した後、ハイボンド N +フィルター (アマシャム社製) をゲルに重ね、 20 X S SCを用いてー晚、サザントランスファーさせた。そのフィルターを乾燥し、 8 0°Cで 2時間焼付けを行った後、 ECLダイレクト核酸ラベリング■検出システム (アマシャムファルマシアバイォテク社製) でサザンハイブリダイゼーションと検出を行った。すなわち、ゴールドハイプリダイゼーシヨン液（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いて 42°C、 1時間プレハイブリダィズした。化学発光標識したプローブを 95°Cで 5分間加熱後、氷中で急冷し、プレハイブリダイズ処理したフィルターのプレハイブリダイズ液に添加し、 42。Cで 22 時間ハイブリダィズさせた。このフィルターを 6 M尿素、 0. 4%SDSを含む 0. 5 X S S C溶液を用いて 42°Cで 20分 2回洗浄後、 2 XS SC溶液を用い室温で 5分 2回洗浄した。このフィルターをェンハンスドケミルネセンス試薬 ( アマシャムフアルマシアバイオテク社製) に浸した後、 X線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したバンドを検出した。その結果、制限酵素 E c oR Iで切断した約 5. 5 k b の断片に強くハイプリダイズしていた。 (実施例 4)

Rh o d o t o r u l a m i n u t a I FO 0387の染色体 DN Aを制限酵素 E c o R Iで切断し、 0. 8%ァガロースによるゲル電気泳動を行い、約 5. 5 k b p付近の DNA断片をゲルより切り出して精製することにより、クローン化に用いる DNA断片を調製した。この DNA断片を; I一 ZAP I Iファージキット（ストラテジーン社製）を用いてそのファージの E c o R Iサイトに組み込み、インビトロパッケージングキット（アマシャム社製）でパッケージングを行った。そして、大腸菌 XL 1— B 1 u e MR F，に感染させて NZY平板培地（5 gZL N a C l、 2 g/L Mg S0₄ - 7H₂0 5 g/L 酵母エキス、 10 g/L NZァミン、 18 g/L 寒天、 pH7. 5) 上に NZ Y軟寒天培地（NZY平板培地の寒天のみ 8 g/L) とともに重層してプラークとした。これをハイボンド N +フィルタ一 (アマシャム社製) にトランスファーしアルカリ（0. 5M Na OH、 1. 5M N a C 1 ) で変成した後、中和（ 0. 5M T r i s ■ HC 1 (pH7. 5) 、 1. 5M Na C l) 、乾燥し、 80 °Cで 2時間焼付けを行った。

焼き付け後のフィルター 6枚を用い、実施例 3と同様にプレハイブリダィゼーシヨン、化学発光標識したプローブを用いたハイプリダイゼーシヨンを行い、このフィルターを洗浄した。このフィルターを乾燥後、 X線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したスポットに対応するファージのプラークを分離した。この分離したプラークのファージを上記と同様の方法で大腸菌に感染させてブラークとし、フィルターに写して再びハイブリダイゼーションを行い、確認を行ったところ、 7株のファージが選択できた。 '

このファージの懸濁液を L— ZAP I Iファージキット（ストラテジーン社製 ) 中の大腸菌 SOLRにヘルパーファージとともに感染させてィンビトロでファージミドを調製した。上記のファ^"ジミドは、約 5. 5 k b Pの挿入断片を含み、プライマー Rm— 1 S及ぴ Rm— 2 ASを用い P CRを行ったところ、 145 b pの DNA断片が検出できた。内部プライマーである Rm— 1 S及び Rm— 2 A Sを用い、 DNA塩基配列を DNAシークェンサ一（377型、パーキンエルマ一社製）を用い、 DNAシークェンスキット（パーキンエルマ一社製、 AB I PR I SM (商標） B i gDy e (商標） T e rm i n a t o r Cy c l e S e q u e n c e R e a dy R e a c t i o n K i t Wi t h A mp t i T a q (登録商標） DNA p o l yme r a s e、 F S) を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定した。シーケンスすることにより明らかになった配列を元にブラーマ一を作成してその先をシーケンスすることを重ねることにより、 R h o d o t o r u 1 a m i n t a I F〇 0387のデカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子の全配列を明らかにすることができた。約 1. 6 k b pの DNAについてその塩基配列を決定したが、その結果を配列表の配列番号 1に示す。また、この DNA配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号 2に示した。 (実施例 5 )

調製したファージミド DNAよりデカプレニル 2燐酸合成酵素をコードする遺伝子部分のみを切り出す為、合成 DNAプライマー RM— 1 (5' -ATCAT ATGATGCACCGACAAGCT- 3' の配列を持つ）及び Rm— CE 2 3' の配列を持つ）を用いて実施例 2と同様に PC Rを行い、制限酵素 Nd e I 及び E c o R Iで切断した後、発現用ベクター pUCNT (WO 94/0361 3に記載）に挿入してデカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、 pN TRm2を作製した。得られた発現べクタ一、 p NT Rm 2の制限酵素地図を図 1に示す。なお、 DP Sとは、デカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子のコード領域を意味する。

(実施例 6 )

作製したデカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子の発現べクター pNTRm2を大腸菌 HB 101に導入し、 1 OmLの LB培地で 37°C、ー晚振とう培養し、菌を遠心分離（3000回転、 20分間）で集めた。

この菌体を 1 m Lの 3 %硫酸水溶液に懸濁し、 120 ° (：、 30分間熱処理後、 2 m Lの 14 %水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に 120 °C、 1 5分間熱処理した。この処理液に 3mLのへキサン 'イソプロパノール（10 : 2) を添カロして抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層 1. 5mLを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを 200 Lのエタノールに溶解し、その 20 Lを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、 LC一 10A) により分析した。分離には逆相カラム（YMC—； a c k ODS— A、 250 X4. 6mm, S— 5 μ m、 120 A) を用い、ェタノール ·メタノール（2 : 1) を移動相の溶媒として使用して分離させ、 275 nmの波長の吸光度で生成したコェンザィム0₁。を検出した。結果を図 2に示した。図 2に示すように、デカプレニル 2 燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、組換え大腸菌では、大腸菌が本来生産しないコェンザィム。を、生産するようになったことが分かつた。

得られた組換え大腸菌株 E. c o l i HB 101 (pNTRm2) は、ブタペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 1 2年 1 0月 1 9日に寄託した（受託番号 FERM B P— 7333) 。

(実施例 7 )

原核生物で多量に発現させるベく、配列番号 1から真核生物特有のミトコンドリア移行配列を除くため、合成 DNAプライマー Rm— 4 (5，一AT CAT A

AC AG— 3' の配列を持つ）を用いて実施例 2と同様に PC Rを行い 1. 3K b pの断片を増幅させた後、制限酵素 N d e I及ぴ N h e Iで切断して約 600 b pの断片を調製して、： NTR_m2を制限酵素Nd e I及ぴ Nh e Iで消化したフラグメントと組み換えて pNTRmS s pを作製した。また、合成 DNAプライマー RM— 1 (5 ' -AT CATATGATGCACCGAC AAGCT- 3 ' の配列を持つ）及び RM— 6R (5， — ACAATATTGTATTGAG GGCATTCGGGCGACTGC- 3' の配列を持つ）を用いて実施例 2と同様に PC Rを行い、 N部分を欠失させた約 100 b pの断片を増幅させた後、制限酵素 Nd e I及び S s ρ Iで切断した断片を調製して、 pNTRmS s pを制限酵素 Nd e I及び S s p Iで消化したフラグメントと組み換えて； NTRm 6を作製した。 (実施例 8 )

作製したデカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子の発現べクター; pNTRm6を大腸菌 HB 101に導入し、 101111^の：6培地で37°C、一晚振とう培養し、菌を遠心分離（3000回転、 20分間）で集めた。

この菌体を 1 m Lの 3 °/₀硫酸水溶液に懸濁し、 120 °C、 30分間熱処理後、 2 m Lの 14 %水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に 120 °C、 1 5分間熱処理した。この処理液に 3mLのへキサン■イソプロパノール（10 : 2) を添カロして抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層 1. 5mLを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを 200 μ Lのエタノールに溶解し、その²0 Lを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、 LC- 10 Α) により分析した。分離には逆相カラム（YMC_p a c k ODS— A、 250 X4. 6 mm、 S— 5 μ m、 1 20 A) を用い、ェタノール -メタノール（2 : 1) を移動相の溶媒として使用して分離させ、 275 nmの波長の吸光度で生成したコェンザィム<3₁。を検出した。結果を図 3に示した。図 3に示すように、デカプレニル 2 燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、大腸菌が本来生産しないコェンザィム。を、生産するようになり、また、 pNTRm2で形質転換した大腸菌に比べてコェンザィム。を著量生産するように変換できた。

得られた組換え大腸菌株 E. c o l i HB 101 (pNTRm6) は、ブタぺスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 1 2年 10月 19日に寄託した（受託番号 FERM B P- 73 3 2) 。

(実施例 9 )

原核生物で多量に発現させるベく、配列番号 1から真核生物特有のミトコンドリア移行配列を除くため、合成 DNAプライマー RmNE c o (5，一 ACGA ATTCGATGATCTTCGACC CACTCCAACT- 3 ' の配列を持

TGAGCACAG— 3' の配列を持つ）を用いて実施例 2と同様に; N T Rm 2を铸型として PCRを行い 1. 2Kb pの断片を増幅させた後、制限酵素 B a mH I及び E c o R Iで切断し、また pUC 18を制限酵素 B a mH I及び E c o R Iで消化したフラグメントと組み換えて p U C Rm 3を作製した。

(実施例 10)

作製したデカプレニル 2燐酸合成酵素遺伝子の発現べクター pUCRra3を大腸菌 DH 5 αに導入し、 1 OmLの LB培地で 37°C、ー晚振とう培養し、菌を遠心分離（3000回転、 20分間）で集めた。

この菌体を 1 m Lの 3 %硫酸水溶液に懸濁し、 1 20 °C、 30分間熱処理後、 2 m Lの 14 %水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に 120 °C、 1 5分間熱処理した。この処理液に 3mLのへキサン 'イソプロパノール（10 : 2) を添加して抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層 1. 5m'Lを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを 200 Lのエタノールに溶解し、その 20 Lを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、 LC—10A) により分析した。分離には逆相カラム（YMC— p a c k ODS— A、 250 X4. 6mm, S— 5 μ m、 1 20 A) を用い、ェタノール■メタノール（2 : 1) を移動相の溶媒として使用して分離させ、 275 nmの波長の吸光度で生成したコェンザィム Q₁₀を検出した。結果を図 3に示した。図 5に示すように、デカプレニル 2 燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、大腸菌が本来生産しないコェンザィム。を、生産するようになり、また、 p NT Rm 2及び p NT Rm 6で形質転換した大腸菌に比べてコェンザィム Qェ。を著量生産するように変換できた。

得られた組換え大腸菌株 E. c o l i DH 5 a (p UCRm3) は、プタぺスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 1 3年 6月 2 2日に寄託した (受託番号 F ERM B P_ 7 6 3 8) 。産業上の利用の可能性

コェンザィム。の生合成に関するキー酵素、デカプレニル 2燐酸合成酵素をコードする遺伝子を R h o d o t o r u 1 a属の真菌より単離し、配列決定を行った。また、これを大腸菌に導入して発現させることに成功した。さらに遺伝子配列を改良することによりコェンザィム。の著量生産に成功した。本発明の方法を用いることにより医薬品等として用いられているコェンザィム Q _{1 0}を効率的に製造することができる。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（a) 、 (b) 又は（c) の DNA :

(a) 塩基配列が配列番号 1に記載のものである DNA：

(b) 配列番号 1に示す塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、追加、揷入及ぴ Z又は置換された D N A配列を有し、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA：

( c ) 配列番号 1に示す塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA。

2. 以下の（d) 、 ( e ) 又は（ί) の DNA：

( d ) 塩基配列が配列番号 3に記载のものである DNA :

(e) 配列番号 3に示す塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び Z又は置換された DNA配列を有し、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA：

( f ) 配列番号 3に示す塩基配列からなる DNAとストリンジユントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA。

3. 以下の（g) 又は（h) のタンパク質：

( h ) 配列番号 2に示すァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、追加、揷入及び Z又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質。

4. 以下の（ i ) 又は（j ) のタンパク質：

( i ) ァミノ酸配列が配列番号 4に記載のものであるタンパク質： ( j ) 配列番号 4に示すァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、追加、揷入及び/又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質。

5. 請求の範囲第 3項記載のタンパク質をコードする DNA。

6. 請求の範囲第 4項記載のタンパク質をコードする DNA。

7. 発現用ベクターに請求の範囲第 1、 2、 5又は 6項記載の DN Aを組み込んでなる発現ベクター。

8. 発現用ベクターは、 pUCNTである請求の範囲第 7項記載の発現べクタ

9. 発現ベクターは、 p NT Rm 2である請求の範囲第 8項記載の発現べクタ

10. 発現ベクターは、 p NT Rm 6である請求の範囲第 8項記載の発現べクター。

1 1. 宿主微生物を請求の範囲第 1、 2、 5又は 6項記載の DN Aにて形質転換してなる形質転換体。

1 2. 宿主微生物を請求の範囲第 7、 8、 9又は 10項記載の発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体。

1 3. 宿主微生物は、 E s c h e r i c h i a c o 1 iである請求の範囲第 1 1又は 1 2項記載の形質転換体。

14. E s c h e r i c h i a c o l iは、 E s c h e r i c h i a c o 1 i HB 101である請求の範囲第 1 3項記載の形質転換体。

1 5. 形質転換体は、 E. c o l i HB 101 (p NTRm2) (FERM B P- 7 333) である請求の範囲第 14項記載の形質転換体。

16. 形質転換体は、 E. c o l i HB 101 (p NTRm6) (FERM B P- 7 3 32) である請求の範囲第 14項記載の形質転換体。

17. 請求の範囲第 1 1、 12、 13、 14、 1 5又は 16項記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコェンザィム。を生成蓄積し、これを採取することを特徴とするコェンザィム。の製造方法。

1 8. 以下の（k) 、（1) 又は（m) の DNA：

(k) 塩基配列が配列番号 5に記載のものである DNA：

( 1 ) 配列番号 5に示す塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、追加、揷入及び Z又は置換された D N A配列を有し、かつデカプレュル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA ：

(m) 配列番号 5に示す塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつデカプレニル 2燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA。

1 9. 以下の（n) 又は（o) のタンパク質：

( o ) 配列番号 6に示すァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、追加、揷入及び/又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル 2憐酸合成酵素活性を有するタンパク質。

2 0. 請求の範囲第 1 9項記載のタンパク質をコードする DNA。

2 1. 発現用ベクターに請求の範囲第 1 8又は 2 0項記載の DN Aを組み込んでなる発現ベクター。

2 2. 発現用ベクターは、 p UC 1 8である請求の範囲第 2 1項記載の発現べクタ一。

2 3. 発現ベクターは、 p UCRm 3である請求の範囲第 2 2項記載の発現べクタ一。

24 · 宿主^ [生物を請求の範囲第 1 8又は 2 0項記載の D N Aにて形質転換してなる形質転換体。

2 5. 宿主微生物を請求の範囲第 2 1、 2 2又は 2 3項記載の発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体。

2 6. 宿主微生物は、 E s c h e r i c h i a c o l iである請求の範囲第 2 4又は 2 5項記載の形質転換体。

2 f . E s c h e r i c n i a c o l lは、 Ji s c h e r i c h i a c o 1 i DH 5 αである請求の範囲第 2 6項記載の形質転換体。 2 8. 形質転換体は、 E. c o l i DH 5 a (p UCRm 3) (F ERM B P— 7 6 3 8) である請求の範囲第 2 7項記載の形質転換体。

2 9. 請求の範囲第 24、 2 5、 2 6、 2 7又は 2 8項記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコェンザィム。を生成蓄積し、これを採取する. とを特徴とするコェンザィム Q₁₀の製造方法。