WO2002034905A1

WO2002034905A1 - Procédé d'amplification de gènes

Info

Publication number: WO2002034905A1
Application number: PCT/JP2001/009490
Authority: WO
Inventors: Kenji Mishima
Original assignee: Supercritical Co., Ltd.
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2001-10-29
Publication date: 2002-05-02
Also published as: AU2002212691A1; US20050118577A1; JP4097523B2; JPWO2002034905A1; EP1329505A1; EP1329505A4

Description

明細書遺伝子の増幅方法技術分野

本発明は、核酸合成酵素を用いた遺伝子の増幅方法に関する。さらに詳しくは、超臨界流体、亜臨界流体、高圧ガス、および液体からなる群から選択される少なくとも一種の高圧流体を反応媒体とする遺伝子増幅方法に関する。背景技術

近年、生物が固有にもつ遺伝子の配列と病気との関連が注目されている。デォキシリポ核酸（D NA) 及ぴリボ核酸（R NA) 等の核酸の配列を解読することは遺伝子研究の分野での根幹を占めている。 D NAぉょぴR NA等の遺伝情報を解読するためには、解析可能濃度まで増幅させる必要がある。 (R. W. Old ana S. B. Primrose, Principle of Gene Manipulation , Black well Scientific Publication ( 1 9 8 9 ) ) 。

この遺伝子増幅の手法としては、適切な耐熱性の酵素を用いて、反応温度を制御しつつ、増幅をおこなう手法が有効な手段となる。特に近年の遺伝子操作技術の発展に伴い、 D NAおよび R NAの増幅に関する多くの方法が報告されている（丹波峰雄、「D NAの化学合成」、廣川書店（1 9 9 2 ) ) 。最も汎用される方法のうち、ゲノム中の短い R NAあるいは D NAの断片を直接増幅させる方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain R eaction： P G R) 法がある。 P C R法による遺伝子の増幅は、ターゲット遺伝子、ターゲット遺伝子に相補的なプライマー（プローブ）、核酸おょぴ耐熱性の核酸合成酵素の存在下、（i)タ ^ゲット遺伝子を解離させ、（ii)プライマー（またはプローブ）をターゲット遺伝子とアニーリング（ハイプリダイゼーシヨン）させ、（iii)鎖延長反応（遺伝子合成反応）を行うというプロセスを 1サイクルとし、これを繰り返して、遺伝子を増幅させる方法である。この遺伝子の解離おょぴ鎖延長反応は、それぞれに適切な温度に制御される。し力し、遺伝子の増幅から検出までに時間がかかり、また特殊な酵素を用いるために、高価であり、ターゲット遺伝子に相補的なプライマーのデザィンによっては増幅効率や特異性が変化するという問題がある。

また、高分子の一本鎖 D N Aは通常、複雑な構造を有していることが知られている。このような複雑な構造を有する高分子の一本鎖 D N Aプローブをターゲット遺伝子にハイブリダィゼーシヨンさせるには、時間がかかる、あるいは、増幅に使用する耐熱酵素の校正活性が弱いため、エラーの頻度が高い等の問題がある。

これらの問題を解決する方法として、互いに相補的な部分が 3力所以上の数から構成される一対のプローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイプリダイゼーシヨンさせることにより、 2本鎖の高分子を形成させる遺伝子増幅法（特開 2 0 0 0— 2 0 1 6 8 7号公報）がある。しかし、この方法でも、従来法に比べると効率よくターゲット遺伝子を増幅し、抗原 ·抗体反応を用いて検出することができるが、実用化するためには速度が遅く、手順が煩雑であるという問題がある。他方、生体関連物質の合成方法では通常用いられない超臨界流体や高圧ガスを反応媒体として利用して、生体関連物質を合成する方法が注目されている。特に、二酸化炭素は、一般に無害で、臨界温度が 3 0 4 . 2 Kと比較的常温に近いこと、圧力操作のみで反応を制御できること、残存溶媒の問題がない等の優れた利点を有している。このような理由から、超臨界二酸化炭素を用いる酵素反応あるいは無触媒反応に関して、多くの研究が行われ、報告がある。

例えば、超臨界二酸ィ匕炭素中でのフルォロアルキル基を有するアクリル酸エステノレのラジカノレ重合反応（DeSimone et al. , Science, 2 6 5 , 3 5 6 ( 1 9 9 4 ) )、無触媒水素化反応 (Jessop et al. , Nature, 3 6 8 , 2 3 1 ( 1 9 9 4 ) ) 、酵素反応（O. Aaltonen and M. Rantakyla, CHEMTECH, 4 , 2 4 0 ( 1 9 9 1 ) ) などの報告がある。既に、本発明者らも、超臨界二酸化炭素を用いて、遺伝子の合成および切断技術の開発を行っている（特開平 1 1 - 2 0 6 3 7 1号公報）。

しかしながら、二酸化炭素等の超臨界流体、高圧ガス等を用い、耐熱性の核酸合成酵素を用いて、温度を制御しながら遺伝子を増幅するという報告は未だなされていない。発明の開示

本発明は上記に鑑み、超臨界流体を用いて遺伝子を増幅し、力つ遺伝子増幅の際のエラーを減らす技術を提供することを目的とするものである。

本発明は、ターゲット遺伝子にプライマーをアニーリングさせ、耐熱性の核酸合成酵素を用レ、て遺伝子を増幅させる遺伝子増幅方法であって、超臨界流体、亜臨界流体、高圧ガス、および液体からなる群から選択される少なくとも一種の高圧流体を反応媒体とする遺伝子増幅方法に関する。

好ましい実施態様においては、前記流体が超臨界流体であり、使用圧力または温度の少なくとも 1つを制御することにより、遺伝子を増幅し、かつ合成された遺伝子のエラーを減少させる。

さらに好ましい実施態様においては、前記流体が、二酸化炭素の超臨界流体である。

さらに好ましくは、前記耐熱性の核酸合成酵素が、界面活性剤あるいは脂質で被覆されており、より好ましくは、前記界面活性剤が、イソォクチルソディゥムサルフアサクシネート、ソルビタンモノステアレートまたはポリオキシエチレンオタチルフェニルエーテルであり、前記脂質がレシチンである。図面の簡単な説明

図 1は、超臨界二酸化炭素を反応媒体として遺伝子増幅を行う装置を示す図である。

図 2は、図 1に示される装置を用いて、 T a qポリメラーゼで増幅した D

NA断片のァガロースゲル電気泳動写真である。比較として、サイズマーカ一 Mと通常の方法で増幅させたものを Pとして示す。

図 3は、（A) KODポリメラーゼ、（B) P f uポリメラーゼを用いて、図 1の装置で増幅した DN A断片のァガロースゲル電気泳動写真である。図 4は、従来の PC R法による増幅物（P) と超臨界二酸化炭素を用いる

PCR増幅物（S) とを比較した電気泳動写真である。発明を実施するための最良の形態

本発明は上記に鑑み、高圧流体を用いて遺伝子を増幅し、かつ遺伝子増幅の際のエラーを減らす技術を提供することを目的とするものである。

本発明における反応媒体は、高圧流体である点に特徴がある。流体とは、流動状態にある液体および気体をいう。高圧とは、大気圧より高い圧力をいレ、、通常、 7. 3MP a以上をいう。温度は、耐熱性の核酸合成酵素が失活しない温度以下であり、一般的には 100°C以下である。ただし、 KODポリメラーゼの場合は、 100°Cを超えても失活しないなど、酵素によって異なる。

流体としては、超臨界流体、亜臨界流体、高圧ガス、および液体が挙げられる。この流体は、単独の気体または液体から構成されてもよく、 2種以上の異なる気体あるいは異なる液体の混合物であってもよく、気体と液体の混合物であってもよい。

本発明に用いられる超臨界流体、亜臨界流体、高圧ガス、および液体としては、特に限定されないが、例えば、二酸化炭素、メタン、ェタン、プロパン、エチレン、アンモニア等の超臨界流体として実用性を有することが知られている化合物（気体）が好ましく用いられる。これらの流体は、反応後の遺伝子を失活させることないという操作上の利点に加えて、回収が容易であることから、環境を汚染しないという利点も有している。

好ましい流体は超臨界流体であり、中でも二酸化炭素の超臨界流体が、臨界温度が 3 0 4 . 2 Kと比較的常温に近いこと、無害であること、圧力操作のみで反応を制御できること、残存溶媒の問題がない等の優れた利点を有していることから、最も好ましく用いられる。

遺伝子増幅反応に際して、流体には、例えば、以下のような有機溶媒を添加してもよい。メタノール、エタノール、 1 -プロパノールなどの脂肪族ァルコール；ァセトン、メチルェチルケトン、シク口へキサノンなどの脂肪族ケトン；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドラフラン、ジメチルフオルムアミドなどの芳香族炭化水素；など。これらは例示であり、本発明の効果を損なわない程度に添加される。

本発明に用いられるターゲット遺伝子は、遺伝子増幅反応の铸型となる遺伝子をいい、 D NAあるいは R NAであればその由来、大きさには、特に制限がないが、約 1 0 k b位まで大きさの D NAが好ましい。

本発明に用いられるプライマー（プローブ）にも特に制限がなく、通常、ターゲット遺伝子（铸型）の 5，末端付近のプライマーと 3，末端付近のプライマーとが一対で用いられる。プライマーはターゲット遺伝子に応じて、合成してもよいし、使用可能であれは、市販のプライマーを用いても良い。例えば、 pBluescriptSK+をターゲット遺伝子とする場合には、 K Sプライマー、 M l 3 ( 1 a c Z ) プライマー、 S Kプライマー、 T 3プライマー、 T 7プライマーなどを拳げることができる。

本発明に使用される耐熱性の核酸合成酵素は特に限定されず、一般に使用されている耐熱性の核酸合成酵素を挙げることができる。例えば、 P f uポリメラーゼ (Pyrococcus furiosus起源) 、 T a qポリメラーセ (Themus aqu aticus起源）、 T t hポリメラーゼ（Themus thermophilius HBB起源）または KODポリメラーゼ（Pyrococcus Kodakaraensis K0D 1起源）を挙げることができるが、これらに限定されない。

これらの耐熱性核酸合成酵素は、そのままでも用いられるが、高圧の超臨界流体中でも活性を維持し、反応を効率的に進行させるために、界面活性剤あるいは脂質で被覆されていることが好ましい。被覆に用いられる界面活性剤としては、イソォクチルソディウムサルフアサクシネート、ソルビタンモノステアレ一ト、ポリオキシエチレンォクチ/レフェニルエーテルなどが挙げられるが、これらに限定されない。被覆に用いられる脂質としては、レシチンが挙げられる。

耐熱性核酸合成酵素の被覆は、例えば、 2 μ g/mlの酵素水溶液と界面活性剤（好ましくはイソォクチルソディウムサルフアサクシネート）を溶解した溶媒（好ましくはイソオクタン）とを、酵素水溶液：界面活性剤：溶媒が重量比で 10 ： 1 ： 25となるように混合し、ホモジナイザーで 10分間混合し、常温にて混合溶液を乾燥することにより、行われる。

遺伝子増幅反応は、反応セル内にターゲット遺伝子と、プライマー（プローブ）と、核酸混合物（dNTP ： dATP、 dCTP、 dTTPおよび d GTPの混合物）と、好ましくは界面活性剤または脂質で被覆された耐熱性核酸合成酵素とを仕込み、例えば、二酸化炭素を導入して、好ましくは超臨界状態にすることにより行われる。反応の制御は、使用圧力または温度の少なくとも 1つを制御することにより行われる。

ターゲット遺伝子の解離おょぴアニーリング反応は、約 90〜98°C、好ましくは 93〜 95°Cとなるように圧力または温度を調整して行われる。増幅反応（鎖伸張反応）は、約 65〜85°C、好ましくは 69〜76°Cとなるように圧力または温度を調整して行われる。

このように各ステップにおける温度を制御することにより、効率的に遺伝子増幅が行われる。また、操作圧力の増加に伴い、増幅エラーは減少する傾向にある。

本発明は、高圧の流体中で反応が行われるため、高圧の反応装置が用いられる。本発明で使用される増幅装置としては、例えば、図 1に示すような超臨界流体を用いた装置を使用することができる。以下、図 1を参照しつつ、増幅装置を説明する。増幅装置は、ボンべ 1力らストップバルブ V 2までの昇圧部、ストツプパルプ V 4力ゝらストツプパルプ V 6までの増幅反応部およびその下流の分析、回収部よりなる。

昇圧部は、超臨界流体等としての二酸化炭素用と溶液用の 2つの昇圧用ポンプ 4A、 4 Bを有する。二酸化炭素ボンべ 1は、液体二酸化炭素を昇圧用ポンプ 4 Aへ送るために、サイフォン式のボンベである。ボンべ 1から送られる液体二酸化炭素中の水分を除去するために、ボンべ 1とポンプ 4 Aの間に乾燥管 2が配置されている。乾燥管 2の仕様は、材質 SUS 316、最高使用圧力 20MP a、内径 35. 5mm、長さ 31 Ommである。また、乾燥剤としては、例えば、 GLサイエンス（株)製のモレキュラーシーブ (1/16 インチ Pellet)が使用される。乾燥管 2により水分を除去された液体二酸化炭素は、冷却ュニット 6 (ャマト科学製 BL- 22) によって約一 5°Cに保たれたエチレングリコールにより冷却され、昇圧用ポンプ 4A (ガス供給ポンプ）に送られる。

昇圧用ポンプ 4 Aは、 GLサイエンス（株）製の高圧用シングルプランジヤーポンプ APS— 5 L (最大圧力 58. 8MP a、常用圧力 49. OMP a、流量 0. 5〜5. 2ml - m i n"¹) が使用される。二酸化炭素送液用のポンプのヘッド部分には、液体二酸化炭素の気化を防ぐために冷却ュニットが装着されている。添加剤、脱保護剤または縮合剤は試料ビン 7に入れられ、試料ビン 7は、昇圧用ポンプ 4 Bの上流に設置される。昇圧用ポンプ 4 Bにより昇圧された溶離液はストップバルブ V 2を通り、ストツプバルブ V 4の前で、昇圧された二酸化炭素と混合され、カラム分離部へ供給される。さらに、溶離液の排出用として、ストップパルプ V 3が設置されている。ストップバルブには、ホワイティー製のボンネットー体型流量調節ストップバルブ SS - 0KS2BKBが用いられる。また、乾燥管 2と冷却ユニット 6の間に、ゴミなどの不純物が混入することを防ぐためにフィルター 3 Aとして、 GL サイエンス（株）製 FT 4- 1 0型が使用される。フィルタの細孔平均径は約 1 0 ja mである。

系内の圧力は、圧力調節弁 V Iにより任意の圧力に設定される。圧力調節弁 V Iとして、 TE S COM製の 2 6— 1 7 2 2— 24が使用される。このバルブは ± 0. IMP aで系内の圧力を制御でき、最大使用圧力は 4 1. 5 MP a (4 1 5 b a r ) である。系内の圧力は、ブルドン式圧力計 5 A (G Lサイエンス（株）製 LCG— 3 50 ；最大使用圧力 34. 3MP a) で測定される。この圧力計には、上限接点出力端子が付いており、指定圧力で昇圧用ポンプ 4 Aの電源を切るように設定されている。また、この圧力計の検定には、司測研（株）製エコノミー圧力計 PE— 3 3— A (歪ゲージ式、精度 ±0. 3%) が使用されている。

昇圧部の圧力を制御するために、昇圧部と抽出部の間にストップバルブ V 4が設置されている。ストップバルブには、 GLサイエンス（株）製の 2

Wa y V a l v e 0 2— 0 1 20 (最大使用圧力 9 8. OMP a) が用いられる。また、昇圧部とカラム分離部の間には、安全性を確保するために、安全弁 8 Aが設置される。安全弁は、ヌプロ製のスプリング式のもので、系内の圧力が 3 4. 3 MP aで作動するように調整 .検定されている。なお、昇圧部のボンべ 1からフィルター 3 Aまでの区間以外の配管には、 1/1 6 インチのステンレス管（材質 SUS 3 1 6、外径 1. 5 8 8 mm, 内径 0. 8111111)カ用いられ、他の部分はすぺて 1/8インチのステンレス管 (材質 SUS 3 16、外径 3. 175讓、内径 2. 17脑）を用いられる。

昇圧部から供給される液体二酸ィ匕炭素と溶離液は、加熱プレート 1 1に設けられている予熱カラム（図示せず）へ送られる。予熱カラムは、溶媒（二酸化炭素等）を平衡温度まで加熱し超臨界流体にするためのものであり、 1 /8インチステンレス管（材質 SUS316、外径 3. 175腿、内径 2. 17讓、長さは約 4m)を直径 55譲、長さ 14 Ommのスパイラル状に変形して、空気恒温槽 14内に設置されている。予熱カラムにより超臨界流体とした二酸化炭素は反応溶液と共に、流体の逆流を防止する逆止弁 10 (ヌプロ製 SS— CH S4- 10:最大使用圧力 41.2MP a) を通過し、反応カラム 13に導入される。なお、反応カラム 13は、六方バルブ 9 Aに設置され、反応カラム 1 3による増幅操作のとき以外には、六方バルブ 9Aを切り替えることによつて配管の洗浄が行えるようにされている。さらに、六方バルブ 9 B (GLサィエンス（株）製レオダイン 7125) にはインジェクタが内蔵されており、このインジェクタより、試料を導入できるようにされている。また、力ラム内の圧力を排出するために、ストップバルブ V5、 V6が設置されている。なお、六方バルブ 9 Aには、 GLサイエンス（株）製の高耐圧切換パルブ HPV— 6 (最大使用圧力 34. 3 MP a) が用いられる。

また、ストップバルブ V 5、 V6としては、ホワイティー製のボンネット —体型流量調節ストップバルブ SS- OKS 2BKBが使用される。カラム通過後の圧力は 5 Bによって測定され、流量調節弁 V 7によって設定圧力に調節される。圧力計はプルドン式のもので、 GLサイエンス（株）製の LCG- 350 (最大使用圧力 34. 3 MP a) が用いられる。圧力計の検定には、司測研 (株）製のエコノミー圧力計 PE— 33— A (歪ゲージ式、精度 ±0. 3% FS、 FS ： k g f · cm一²) が用いられる。また、カラム内の圧力上昇による爆発を防止する目的で、反応カラム 13の上流側に安全弁 8 Bが設置されていする。安全弁 8 Bには、ヌプロ製のスプリング式、 177- R3AKI- G が用いられ、系内の圧力が 34. 3 MP aで作動するように調整、検定する。試料が溶解した超臨界流体（二酸化炭素）は、流量調節弁 V 7を用いて系外へ排出される。

分析回収部として、流量調節弁 V7には、日本分光（株）製のパックプッレツシャーレギユレータ（880— 81型自動圧力調節弁、使用圧力範囲 0 〜49. OMP a、圧力調整精度 ±2%) が用いられる。このバルブにより超臨界流体の流量を調節し、減圧操作が行われる。また、試料の凝縮による管内の閉塞を防止するために、高圧用フィルタ 3 Bが流量調節弁の上流側に設置される。フィルタ 3 Bには、ヌプロ製の 2 TF— 7 (細孔平均径 7 m) が用いられる。また、減圧に伴う試料の凝縮および超臨界流体（二酸化炭素）によるドライアイスの発生を防ぐために、流量調節弁 V7にはヒータが設置される。さらに、管の出口を振動式にすることにより、析出物による管の閉塞を防ぐことができる。流量調節弁 V 7で減圧後、析出した試料はトラップ 16で回収される。また、流量は流量計 17により測定される。流量計としては、品川精器（株）製の積算式湿式ガスメータ W— NK— 0. 5B (測定精度 0. 1m l) が用いられる。また、増幅された化合物は紫外線検出器 15 (日本分光（株）製 UV—970) を用いて確認することもできる。空気恒温槽 14は、反応カラム 13を含む密閉系であり、加熱（昇温）装置して加熱プレート 1 1を、冷却（降温）装置として冷却プレート 12を、それぞれ備えている。空気恒温槽 14には、温度制御機能を有するペルチェ素子、および温度センサが備えられている。空気恒温槽 14の温度は、例えば、チノ一（株）製の温度制御器 D B 1000により、測定温度土 0. 1 K で制御できる。温度測定には、チノ一製の白金抵抗測温体 1TPF483を用いる。冷却装置にはペルチェ素子が用いられる。ペルチェ素子に供給される冷媒は、例えば 4°Cに、常時冷却されて、蓄冷容器中に貯蔵されている。これにより、増幅反応に必要な複数の温度の制御が可能になる。

この装置で、空気恒温槽 14において、反応カラム 13は、アニーリング (ハイブリダィゼーシヨン）は一般的には約 8〜2 OMP a、約 90〜9 8 °Cの条件で行われ、遺伝子の増幅反応は、約 8〜15MP a、約 65〜8 5 °Cの条件で行われる。実施例

以下に本発明の実施例に挙げて更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなレ、。実施例 1

図 1の装置を用いて遺伝子増幅反応を行った。空気恒温槽にある反応カラムのセル内に増幅を目的とする遺伝子 pBluescript SK+ (東洋紡（株）製）を 50 n g、プライマー Forward Ml 3 (lacZ) Primer 5に GCCAGGGTT TTCCCAGTCACGA- 3，（配列番号： 1) および Reverse M 13 (lacZ) Primer 5 ' -GAGCGGATAACAATTTCACAGG- 3，（配列番号： 2 ) をそれぞれ 30 pmol、 d NTP (混合物）を 0. 2mM、および界面活性剤であるイソォクチルソディゥムサルフアサクシネートで被覆した耐熱性の核酸合成酵素 T a qポリメラーゼ（前記条件で作成）を 2.5U、反応セルに仕込んだ。

ストップバルブ V 4を開けてセル内に二酸化炭素を導入し、セル内圧力を 10 MP aとした。このとき、上限圧力は、流量調整弁 V 7で調整した。また、二酸化炭素の温度制御器を 35 °Cに、流量調整弁 V7を 80°Cに温度調整した。ペルチェ素子に供給される冷媒は、 4°Cであった。

アニーリング温度は 94 °C、 0. 5分、鎖伸張反応は 74 °C、 0. 5分行つた。 94 °Cから 74°Cに冷却する際にはヒータをオフにし、冷却プレートで冷却させた。一方、 74°Cから 94°Cに加熱する際にはヒータをオンにして加熱プレートで加熱した。

加熱と冷却のサイクルを 25回以上繰り返した後、流量調整弁 V 7より増幅された遺伝子断片を回収した。回収された遺伝子をァガロースゲル電気泳動にかけた（図 2 ：丄）。電気泳動の結果を図 2に示す。図 2より、 pBlues cript SK+を铸型として常圧下の P CRで増幅させた 271 b pの生成物 (図 2 ： P) と同等のラインにバンドを確認できたことから、超臨界二酸化炭素中で pBluescript SK+の遺伝子断片が増幅されたことが示された。図 2 中、 Mは分子量マーカーである。実施例 2

実施例 1と同様に pBluescript SK+を铸型として、 KOD d a s h ポリメラーゼ、および P f uポリメラーゼを用いる増幅を行った。図 3に (A) KOD d a s h ポリメラーゼ、（B) P f uポリメラーゼで増幅させた電気泳動図（図 3 ： I) を示す。いずれも、 pBluescript SK+の遺伝子断片を増幅できたことが示された。実施例 3

酵素として KOD d a s h ポリメラーゼを用いた実施例 1と同様にして、 pBluescript SK+を鍚型として、遺伝子を増幅させた。比較として、従来の大気圧下における PCR反応を、 KOD d a s h ポリメラーゼを用いて、同じ温度条件、反応時間、行った。結果を図 4に示す。水溶液中での増幅物（図 4 ： P) に比べ、本発明の超臨界二酸ィヒ炭素中での増幅物（図 4 ： S) の方が、分布の狭いパンドを示すことが示された。この結果は、超臨界二酸化炭素中で遺伝子を増幅すると、増幅エラーが抑制され、シャープなバンドとして表れることを示している。産業上の利用可能性

本研究によれば、超臨界流体、亜臨界流体、高圧ガス、および液体からなる群から選択される少なくとも一種の高圧流体を反応媒体として、ウィルス、微生物、動物、植物などのターゲット遺伝子にプライマーをアニーリングさせ、 T a qポリメラーゼまたは P f uポリメラーゼなどの耐熱性の核酸合成酵素を界面活性剤で被覆した界面活性剤被覆酵素を用いて、温度を制御しながら遺伝子を増幅させることができる。また、有機溶媒の削減を行い、かつ、遺伝子増幅を使用圧力、温度を操作することにより制御することができる。本発明の遺伝子増幅法によって、遺伝子が効率良く増幅され、この遺伝子が抗原性である場合には、抗原 ·抗体反応により検出することが可能になるなど、遺伝子関連の製造業、医薬の分野で利用できる。

Claims

請求の範囲

1 . ターゲット遺伝子にプライマーをアニーリングさせ、耐熱性の核酸合成酵素を用いて遺伝子を増幅させる遺伝子増幅方法であって、超臨界流体、亜臨界流体、高圧ガス、および液体からなる群から選択される少なくとも一種の高圧流体を反応媒体とする遺伝子増幅方法。

2 . 前記流体が超臨界流体であり、使用圧力または温度の少なくとも 1つを制御することにより、遺伝子を増幅し、かつ増幅された遺伝子のエラーを減少させる請求項 1に記載の遺伝子増幅方法。

3 . 前記流体が、二酸化炭素の超臨界流体である、請求項 1または 2に記載の方法。

4. 前記耐熱性の核酸合成酵素が、界面活性剤あるいは脂質で被覆されている、請求項 1カゝら 3のいずれかの項に記載の方法。

5 . 前記界面活性剤が、イソォクチルソディウムサルフアサクシネート、ソルビタンモノステアレートまたはポリォキシエチレンオタチルフエニルエーテルであり、前記脂質がレシチンである、請求項 4に記載の方法。

1/1

SEQUENCE LISTING

<110> MISHIMA Kenji

<120> Method for gene amplification

く 130> P2-01M08199

く 160> 2

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gccagggttt tcccagtcac ga 22 <210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gagcggataa caatttcaca gg 22