WO2002016378A1 - Verfahren zur herstellung von wasserlöslichen saccharidkonjugaten und saccharidmimetika durch diels-alder-reaktion - Google Patents

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WO2002016378A1
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saccharide
diene
diels
reaction
furan
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Inventor
Manfred Wiessler
Hans-Christian Kliem
Bernd Sauerbrei
Birgit Schmauser
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings

Definitions

  • the present invention relates - 'a method for producing substance libraries on the basis of naturally occurring saccharides and saccharide mimetics.
  • the object of the present invention is to provide a method with which complex saccharide compounds or libraries, as mentioned above, can also be built up.
  • the inventors developed a process for the synthesis of saccharide compounds, which comprises the following steps:
  • step (b) Reacting the saccharide-containing diene formed in step (a) or a commercially available saccharide-containing diene with a dienophile by means of the Diels-Alder reaction.
  • the Diels-Alder reaction is a reaction in which a diene reacts with an olefin, passing through a transition state involving 6 ⁇ electrons. This transition state gives the Diels-Alder reactions, in Compared to the usual organic reactions ⁇ - relatively low activation energies, so that these reactions can take place at room temperature or slightly elevated temperatures. Diels-Alder reactions can be accelerated by high pressure.
  • a number of catalysts have become known in recent years which are capable of effectively catalyzing Diels-Alder reactions under mild conditions (K. Pindur et al., Chem Rev. 1993, 93, pp. 741-761; Kente et al., Angew: Chem. 1999, 111, pp.
  • Diels-Alder reactions are fundamentally reversible, this type of reaction is also suitable for dynamic combinatorial chemistry.
  • the formation of exo and endo isomers can be controlled via the temperature and also the catalyst.
  • the Diels-Alder reaction offers great advantages, since it proceeds without further by-products and with an almost quantitative yield.
  • the Diels-Alder reaction is therefore used by the inventors to build complex saccharide compounds and libraries from saccharide-containing compounds or saccharide libraries. With skillful substitution of the two starting compounds (diene and dienophile) with functional groups or residues, molecules are accessible that can contain three or even four different residues.
  • furan, fulvene, furfural, cyclopentadiene, cyclohexadiene, pyrrole, 1,3-ozazole, 1,2-oxazole, pyrazole, thiophene and 1,3-dienes as acyclic compounds are preferably suitable as cyclic diene component in step (a) (eg trans-trans hexadiene-2, 4-1, 6-diol), which can be substituted one or more times with functional groups.
  • the functional groups can be selected from, for example, alkyl chains (C 2 -C 20 , preferably methyl, ethyl, isopropyl, tert-butyl, etc.), OH, SH, halogens, aryl , Carboxyl, carbonyl, nitro, carboxyamido, .. keto, sulfoxide, sulfone, sulfonic acid, phosphoric acid or amino groups, which are bonded directly or via alkyl radicals.
  • the diene component can also carry amino acid, peptide, lipid or oligonucleotide or nucleic acid substituents. All types of active pharmaceutical ingredients, markings, dyes or complexes (for example carborane, ferrocene) can also be coupled to the diene component.
  • Preferred diene components are: Bishydroxyalkylfurans, such as 2,3-bishydroxymethylfuran, 3,4-bishydroxymethylfuran, 2,5-bishydroxymethylfuran, hydroxymethylfurfural, ⁇ -GMF ( ⁇ -glycosylmethyl-furfural; or with, for example, NaBH reduced aldehyde function).
  • Bishydroxyalkylfurans such as 2,3-bishydroxymethylfuran, 3,4-bishydroxymethylfuran, 2,5-bishydroxymethylfuran, hydroxymethylfurfural, ⁇ -GMF ( ⁇ -glycosylmethyl-furfural; or with, for example, NaBH reduced aldehyde function).
  • ⁇ -GMF ⁇ -glycosylmethyl-furfural
  • NaBH reduced aldehyde function NaBH reduced aldehyde function
  • 2,5-disubstituted furans in Diels-Alder reactions have a lower reactivity than 3,4-disubstituted ones.
  • This graded reactivity can be used synthetically. It is advantageous here that the reactivity of hydroxymethyl groups differs in the individual positions of the furan, so that sequential substitution is possible. Different saccharides can thus be introduced very easily into the furan (see FIG. 1).
  • Cyclopentadiene and its substituted S-derivatives are also very suitable as dienes in the Diels-Alder reaction.
  • Aldehyde derivatives of cyclopentadiene have been known for a long time (Chem. Ber. 1964, 97, p. 2066) and can be converted step by step into the hydroxymethyl compounds which are reacted with saccharides according to the Imid.at method and then as Services are available.
  • Carboxylic acid derivatives of cyclopentadiene are also known, such as esters, a ide or nitriles (J. Chem. Soc. 1966, p. 1641).
  • Cyclopentadiene-tetra-carboxylic acid esters can also be prepared from the corresponding cyclopentane precursors by dehydrogenation. These precursors are easily accessible from the Diels-Alder adducts of cyclopentadiene and maleic anhydride. Cyclopentadienes can also be prepared by cyclization reactions of 1,3-diacarbonyl compounds (J. Chem. Soc. 1952, p. 1127). Naturally occurring iridoid glucosides such as Catapol and Aucubin (Liebigs Ann. Chem. 1990, p.
  • glucosides mentioned can also be used as dienophiles in the generation of substance libraries to search for active substances.
  • a saccharide is linked to a diene by reacting the diene with an imidate component which is substituted with a saccharide.
  • the reaction conditions for this reaction have been described, for example, by RR Schmidt, in: Glycosciences, ed. HJ Gabius, S. Gabius, pp. 31-53.
  • the saccharide can also be linked to the diene component by means of other reactions (for example by means of the known Königs-Knorr reaction).
  • saccharide encompasses all types of saccharides, in particular mono-, di-, oligo- or polysaccharides (eg mono-, di-, ultimate, and dendritic saccharides) in all stereoisomeric and enantiomeric forms. These can be pentoses or hexoses, which are in the L or D form. Particularly suitable monosaccharides are glucose, very particularly ⁇ - and ⁇ -D-glucose, fructose, galactose, mannose, arabinose, Xylose, fucose, rhamnose, digitoxose and derivatives thereof are preferred.
  • disaccharides are sucrose, maltose, lactose or gentobiose, either 1,4- or 1,6-linked, and derivatives thereof.
  • Saccharides here also include sugar alcohols, polyols, inositol and derivatives thereof, very particularly cis-inositol, epi-inositol, allo-inositol, myo-inositol, muco-inositol, chiro-inositol, neo-inositol, scyllo-inositol, pinpollitol, Streptamine, quercitol, quinic acid, shikimic acid, conduritol A or B, validatol and quebrachitol, e.g.
  • Saccharides which can be used according to the invention are also glycoconjugates. These can be conjugates of eg saccharides with peptides, lipids, acids (-> esters), alkyl residues (>
  • glycoconjugates is Z1-Z10, a mixture of 10 glycoconjugates.
  • the compounds Z1-Z10 are naturally occurring glycopeptides, glycoproteins and lipopolysaccharides.
  • Derivatives of the saccharides mentioned are, for example, saccharides protected with protective groups (for example benzoyl, silyl, dirnethoxytrityl) and / or with functional groups such as amino, nitro, carboxy, carboxy ido, keto, sulfoxide, sulfone , Sulfonic acid, phosphoric acid, phosphonic acid, mono / di / trilalkylamide groups or halide groups, modified saccharides.
  • protective groups for example benzoyl, silyl, dirnethoxytrityl
  • functional groups such as amino, nitro, carboxy, carboxy ido, keto, sulfoxide, sulfone , Sulfonic acid, phosphoric acid, phosphonic acid, mono
  • the above saccharides can occur naturally or can be made synthetically.
  • the imidate preferably has only one saccharide, but a number of 2, 3, 4, 5 and 6 saccharide components is also conceivable if the imidate is selected accordingly.
  • the saccharides can be the same or different from one another.
  • Preferred saccharide-substituted imidate components are tri-O-benzoyl-fucoseimidate or tetra-O-benzoyl-galactoseimidate.
  • the saccharide-substituted imidate components are, for example, according to H. Paulsen et al., 1992, Liebigs Ann. Chem. 747-750.
  • step (a) In order to obtain a diene completely modified with saccharides in step (a), the above-described reaction of diene with the saccharide-substituted imidate can take place several times in succession (see Example 1) or the imidate is added in excess, after which a reaction occurs - and multiple saccharide-modified diene should be separated from one another in order to arrive at uniform products in the following step (b).
  • the compounds which can be prepared in step (a) from the dienes and saccharide-substituted imidates mentioned above as preferred are, for example, 3,4-bis (fucosyloxymethyl) furan, 3,4-bis (galactosyloxymethyl) furan, 3- fucosyloxymethyl-4-galactosyloxymethylfuran, 2, 5-bis-galactosyloxymethyl-furan, 2,5-bis-fucosyloxymethyl-furan, 2-fucosyloxymethyl-5-galactosyloxymethylfuran and alcohols derived from furan-2, 5-di-ß- propionic acid or - derived from furan-2,5-di-acetic acid.
  • protective groups preferably: benzoyl protective group
  • they can e.g. be split off with sodium methoxide solution according to standard procedures.
  • Suitable dienophiles in step (b) are maleic acid (anhydride) derivatives, fumaric acid (anhydride) derivatives, maleimide derivatives (preferably: N-substituted. Maleimide), acrylic acid derivatives, acetylene derivatives, butynedicarboxylic acid or derivatives thereof or enol ether.
  • j derivatives are those that, after substitution de: Compounds mentioned alkyl chains (C 2 - C 2 o), _-_- OH, SH, halogens, aryl, carboxy, carbonyl, nitro, carboxyamido, keto, sulfoxide, sulfonic, sulfonic, phosphoric acid -, Amino, phosphonic acid or mono / di / trialkyla id groups.
  • the dienophile component can be substituted with saccharides as defined above. However, the dienophile component can also carry amino acid, peptide, lipid or oligonucleotide or nucleic acid substituents.
  • dienophile component All types of active pharmaceutical ingredients, labels, dyes or complexes can also be coupled to the dienophile component.
  • Preferred dienophiles are tris (2-Maleini idoethyDamin (TMEA), • N-phenyl, N-ethyl, Maleini idolysin or Conduritol.
  • the diene component and the dienophile component can individually or both also contain aromatic or heterocyclic radicals. These can be selected from: phenyl, thienyl, thiophenyl, furyl, furanyl, pyrany.l, pyrrolyl, ir ⁇ idazolyl, pyrazolyl, pyridyl, pyrazinyl, pyridinyl, pyrazinyl, pyridazinyl , Thiazolyl, oxazolyl, indolyl, furazannyl, pyrrolinyl, imidazolinyl, pyrazolinyl, thiazolinyl, triazolyl, tetrazolyl group, and the positional isomers of the hetero atom or atoms which these groups can comprise, a radical consisting of carbocyclic fused rings, for example the naphthyl group or the phenanthrenyl group, a radical " consisting of
  • the Diels-Alder reaction is a standard method in organic chemistry and the reaction conditions are well known to a person skilled in the art or can be looked up in relevant textbooks.
  • the Diels-Alder reaction is preferably performed in any solvents between 20 ° C and 100 ° C.
  • Preferred solvents are water or alcohols, such as methanol or ethanol.
  • the formation of exo and endo compounds, as observed in this type of Diels-Alder reaction can be controlled by the experimental conditions and increases the number of compounds to be obtained by a factor of two. This variation in experimental conditions is within the skill of one of ordinary skill in the art.
  • All Diels-Alder reactions are equilibrium reactions in which, depending on the temperature, the components are always present and can therefore react with other partners out of equilibrium.
  • the System_ described above is therefore also suitable for the controlled release of the dienophile component, while at the same time anchoring the diene component to a polymer support or vice versa. If the dienophile carries, for example, a peptide or a therapeutic agent, a system is available that can be used for the controlled and controllable release of drugs from a solid phase.
  • the method according to the invention provides a possibility of linking peptides with saccharides, peptides with nucleic acids, saccharides with nucleic acids and the respective component with itself, provided that one component has a diene and the other one Dienophile would be connected.
  • the resulting Diels-Alder adducts can themselves be modified, for example by ring opening of the anhydride ring or by hydrogenation of the double bond or by addition reactions to this double bond.
  • the oxabicycloheptane ring system can be opened under acidic conditions to form a cyclohexane ring system.
  • a splitting of the Diels-Alder adduct into the components is no longer possible and a new structure type arises, an inositol derivative that certainly has other pharmacological properties, since it no longer has the rigidity of the bicyclus.
  • steps a) and / or b) of the method according to the invention have to be carried out several times in succession.
  • step a) can of course be omitted if a saccharide-substituted diene is already used.
  • the diene 1 (here: furan with the substituents R 1 to R 4 ) is reacted in an aqueous solution directly with the dienophile 2 (here: maleinid with the substituent R 5).
  • the composition of the product mixture can be controlled.
  • R 1 to R 4 and R 5 one or more substituents and in all conceivable combinations can be incorporated.
  • dienes type 1, scheme 1
  • dienophile type 2
  • Diels-Alder reaction some options for the presentation of dienes (type 1, scheme 1) and their saccharide conjugation, then the dienophile (type 2) and finally the Diels-Alder reaction are described.
  • reaction schemes are representative of the easy accessibility of the required furan derivatives and the performance of the synthetic routes.
  • the covalent linkage of the furan derivatives with saccharides is preferably carried out using the imidate method (Scheme 3, see FIG. 6).
  • first step of reaction (A) simple galactosidation is achieved, although one equivalent of furan derivative is reacted with one equivalent of galactose idate.
  • the mono-galactosidated compound is purified by chromatography.
  • second step of the reaction (B) 1 equivalent of a further glycosylimidate is then added.
  • a connection with two galactose units is obtained after the protective groups have been split off.
  • step B You sit down if, on the other hand, the fucose imidate is present in step B, then a mixed glycosidated furan derivative is obtained after the protective groups have been split off.
  • the entire reaction can also be carried out by the Königs-Knorr reaction or other methods known in the literature.
  • the method according to the invention can be used to produce substances / libraries which are suitable for inhibiting the interaction of lectins with proteins.
  • Such Substances can be used in cancer therapy to avoid metastasis or as an anti-inflammatory.
  • spacers which can be inserted both in the diene and in the dienophile, or of rare or with saccharides provided with unusual functional groups, the diversity of the libraries increases.
  • the multiantenarity which can be important for the interaction of saccharides with lectins, can also be produced with the aid of the method according to the invention.
  • Such molecules are easily accessible through the double or triple Diels-Alder reaction with a corresponding dienophile (see FIG. 3).
  • the method according to the invention can also be used to generate compounds / libraries which, in addition to the saccharides, also contain other pharmacophoric groups in order to make new lead structures for therapeutics accessible in general.
  • groups can be heterocycles, aromatics or peptide structures, which are contained either in the diene or dienophile.
  • dienes with dienophiles can also be used to connect proteins with saccharides and saccharides with nucleic acids.
  • dienophiles eg substituted maleimides
  • dienophiles eg substituted maleimides
  • dienes e.g. substituted furans
  • dienophiles e.g. substituted maleinides
  • Both the dienophile and the diene can be immobilized on the surface.
  • An application in chip technology is therefore conceivable.
  • the increase in the loading density on the surface can also be achieved by using structures as in FIG. 2.
  • Fig. 1 Introduction of 2 saccharide residues in a furan system.
  • Fig. 2 Reaction of a doubly substituted furan with an N-substituted maleimide.
  • Fig. 3 Multiple Diels-Alder reaction
  • Fig. 4 Exemplary building blocks for the Diels-Alder reaction
  • the reaction is carried out with sodium methoxide or a mixture of methanol / water / triethylamine.
  • TMEA 2-maleimidoethyl amine 1
  • 190 ⁇ mol bis-galactosylfuran 2 in 1 ml water is stirred for 50 hours at room temperature.
  • the product mixture 3 (combination of endo and exo products) is obtained in approximately 30% yield by means of HPLC.
  • maleimide + spacer + saccharide 5 mmol of suitably derivatized maleimide 1 (maleimide + spacer + saccharide) are dissolved in 4.9 ml of diglycosylated furan 2 in 100 ml of dichloromethane and mixed with 10 drops of triflate at -40DC. It is dormant at ODC. After the reaction is complete, the reaction solution is shaken out with dilute bicarbonate solution and water. The solvent is dried over sodium sulfate and evaporated down i. concentrated. The residue is chromatographed on silica gel using petroleum ether / ethyl acetate (2/1). Yield of product 3: 54%.
  • Example 8 Glycosidation of furan derivatives with hydroxy functions
  • the compounds are reacted in methanolic solution with sodium methoxide.
  • the saponification takes place quantitatively.
  • step A is used for step-by-step glycosidation.
  • method B is used.
  • the combined organic extracts are washed once with sat. Washed NaCl solution.
  • the organic phase is dried with magnesium sulfate and the solvent i. Vak. away.
  • the N-dodecylamine is then purified by chromatography on silica gel (petroleum ether / EtOAc 10: 1) as a colorless solid.
  • the combined organic extracts are washed once with sat. Washed NaCl solution.
  • the organic phase is dried with magnesium sulfate and the solvent i. Vak. away.
  • the N-stearylamine is then purified by chromatography on silica gel (petroleum ether / EtOAc 10: 1) as a colorless solid.
  • the combined organic extracts are washed once with sat. Washed NaCl solution.
  • the organic phase is dried with magnesium sulfate and the solvent i. Vak. away.
  • the desired bis-maleimide is then purified by chromatography on silica gel (petroleum ether / EtOAc 10: 1) and obtained as a colorless solid.
  • Tris- (2-aminoethyl) amine (100 mg, 0.68 mmol) is sat in 5 ml.
  • NaHC03 solution / THF (1: 1) dissolved.
  • N- (methoxycarbonyl) aleinimide (641 mg, 4.13 mmol) is added in portions. After every hour, 20 ml is sat. NaHC03 solution / THF (1: 1) added.
  • Polypropylenimine tetraa in Dendri er (DAB-Am-4, 90 mg, 0.28 mmol) is sat in 5 ml.
  • NaHC03 solution / THF (1: 1) dissolved.
  • N- (methoxycarbonyl) maleimide (356 mg, 2.27 mmol) is added in portions.
  • 20 ml is sat. NaHC03 / THF solution (1: 1) added.
  • the mixture is extracted with ethyl acetate (3 ⁇ 100 ml) and the organic phase is washed with sat. NaCl solution (1 x 100 ml).
  • the organic phase is dried with magnesium sulfate and the solvent is evaporated down i. Vak. away.
  • the desired compound is obtained as a light yellow solid.
  • ⁇ -aminocarboxylic acid 500 mg, 4.84 mmol is sat in 20 ml.
  • NaHC03 solution / THF (1: 1) dissolved.
  • N- (methoxycarbonyl) maleimide 910 mg, 5.81 mmol.
  • the mixture is allowed to warm to room temperature and 20 ml of sat. NaHC03 / THF solution (1: 1) too.
  • the mixture is extracted with ethyl acetate (3 ⁇ 100 ml) and the organic phase is washed with sat. NaCl solution (1 x 100 ml).
  • the organic phase is dried with magnesium sulfate and the solvent is evaporated down i. Vak. away. Chromatography on silica gel (EtOAc) provides the desired compound as a colorless solid.
  • 5-aminofluorescein 500 mg, 1.44 mmol is dissolved in 50 ml acetic acid / chloroform (1: 1) (possibly suspension). At room temperature, maleic anhydride (141 mg, 1.43 mmol) is added and the mixture is stirred overnight. The solvent is then removed i. Vak. And takes up the residue in acetic anhydride (30 ml). Sodium acetate (200 mg) is added and the mixture is heated at 100 ° C. for 4 h. The reaction mixture is poured onto 100 ml of ice water and extracted with ethyl acetate (3 x 100 ml). The organic phase is once with sat. Washed NaCl solution and dried with magnesium sulfate. The solvent is i. Vac .. removed and the residue chromatographed on silica gel (EtOAc / hexane 3: 1).
  • N, N-Bis (2-chloroethyl) -4-nitroaniline (1.8 g, 6.87 mmol) is dissolved in methanol (40 ml) and 10% Pd / C (200 mg) is added.
  • the reaction mixture is stirred under an H2 atmosphere at normal pressure for 4 h at room temperature.
  • the solution is then filtered and the solvent i. Vak. away.
  • the residue is sat in 30 ml.
  • NahC03 / THF solution (1: 1) was added and N-ethoxycarbonyl) -maleinimd (1.61 g, 10.0 mmol) was added in portions at 0 ° C. After 10 min. the ice bath is removed and the mixture is stirred at room temperature for 3 h.
  • 2,3-Diaminopropionic acid monohydochloride (2.0 g, 14.3 mmol) is suspended in dry methanol (80 ml) and cooled to 0 ° C. Dry HCl gas is passed into the solution for 30 min. The mixture is stirred at room temperature for 48 h and then the solvent is removed i. Vak. The desired compound is obtained as a colorless solid and used directly for the next reaction.
  • N, N-Di-tert-butoxycarbonyl-2,3-diaminopropionic acid methyl ester (1.5 g, 4.70 mmol) is dissolved in dry THF (30 ml). At 0 ° C., an excess of lithium aluminum hydride (150 mg) is added in portions and the mixture is stirred at room temperature for 2 h. The reaction mixture is cooled to 0 ° C. and hydrolyzed by adding water. It is extracted with ethyl acetate (3 x 100 ml) and washed with sat. NaCl solution (1 x 100 ml). The organic phase is dried with magnesium sulfate and the residue is chromatographed on silica gel with hexane / EtOAc (1: 1). The alcohol is obtained as a colorless solid.
  • N, N-Di-tert-butoxycarbonyl-2, 3-diaminopropanol 400 mg, 1.38 mmol
  • triphenylphosphine 398 mg, 1.52 mmol
  • maleimide 148 mg, 1.52 mmol
  • DEAD (0.26 ml, 1.67 mmol) is then added dropwise and the mixture is stirred at room temperature for 24 h.
  • the solvent is i. Vak. removed and the residue chromatographed twice on silica gel with hexane / EtOAc 2: 1.
  • the desired compound is obtained as a colorless solid, but not in pure form. A separation by means of HPLC also did not bring the desired success.
  • the furan derivative is dissolved with the corresponding maleimide derivative in water or, if necessary, in a mixture of THF / water (5: 2) and stirred at 50 ° C. for several (2-4) days. Then the solvent i. Vak. removed and the residue on silica gel (CH 2 Cl 2 / MeOH 5: 1) purified. The corresponding Diels-Alder adducts were obtained as mixtures of the exo- / endo- and some of them could be separated. - Synthesized Diels-Alder products with N-ethylmaleinimide as dienophile:
  • Ri / R 2 fucose / fucose, galactose / galactose and fucose / galactose
  • Ri / R 2 H / H; H / galactose; H / fucose; Fucose / fucose, galactose / galactose and fucose / galactose, lactose / lactose
  • Ri / R 2 fucose / fucose, galactose / galactose and fucose / galactose
  • Compounds with biotin-maleimide are particularly suitable for the elucidation of cellular surface structures and therefore for diagnostics and therapy.
  • Ri / R 2 fucose / fucose - Introduction of carborane-derivatized furan and N-ethylmaleinimide

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren mit dem Saccharid-Verbindungen auf sehr einfache Weise hergestellt werden können. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte: (a) Anknüpfung mindestens eines Saccharids an ein cyclisches oder acycliches Dien, (b) Umsetzung des in Schritten (a) entstandenen Saccharid-enthaltenden Diens oder eines käuflich erhältlichen Saccharid-enthaltenden Diens mit einem Dienophil mittels Diels-Alder-Reaktion.

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON WASSERLÖSLICHEN SACCHARIDKONJUGATEN UND SACCHARIDMIMETIKA DURCH DIELS-ALDER-REAKTION
Die vorliegende Erfindung betrifft -' ein Verfahren zur Herstellung von Substanzbibliotheken auf der Grundlage von natürlich vorkommenden Sacchariden und Saccharidmimetika.
Es ist bekannt, daß die Interaktionen zwischen Proteinen und natürlichen oder synthetischen Oligosacchariden hochspezifisch sind. An diesen Interaktionen sind im wesentlichen Wasserstoffbrückenbindungen, wechselseitig vorhandene Donoren und Acceptoren sowie hydrophobe Wechselwirkungen beteiligt. Die dabei erreichten Bindungskonstanten sind allerdings um mehrere Größenordnungen geringer als diejenigen, die bei Antigen-Antikörper Interaktionen gemessen werden. Um auf der Basis von Sacchariden eine Optimierung der genannten Wechselwirkungen durchführen zu können und alle Arten von Wechselwirkungen zuzulassen, müssen eine große Anzahl substituierter Saccharide und Saccharidmimetika ausprobiert werden und synthetisiert werden. Die Grundidee dabei ist die Entwicklung von wirkungsvollen Therapeutika auf Saccharidbasis. Ein großes Problem bei der Synthese von Saccharid(e) -enthaltenden Verbindungen ist allerdings die komplizierte mehrstufige Verfahrensdurchführung, die zusätzlich noch eine ausgeprägte Schutzgruppenchemie verlangt. Dies gilt insbesondere, wenn mehrere Saccharide in bzw. an eine Verbindung synthetisiert werden sollen oder Saccharid-Bibliotheken aufgebaut werden sollen. Es besteht deshalb der dringende Bedarf nach einem Verfahren mit dem auf einfache Weise auch kompliziert aufgebaute Saccharid(e) -enthaltende Verbindungen synthetisiert werden können. Speziell ist daran gedacht mit dem Verfahren Saccharid-Cluster aufbauen zu können, die sich als Therapeutika eignen, weil sie mit Rezeptoren in bzw. auf Zellen oder Organen wechselwirken. Desweiteren sollen damit Saccharid-Bibliotheken und Saccharid-enthaltende Verbindungsbibliotheken aufgebaut werden. Ferner soll sich das Verfahren eignen, um Saccharide mit Peptiden, Nucleinsäuren und/oder Lipiden zu verknüpfen, wobei auch eine Verknüpfung der Polymere untereinander möglich sein soll.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem auch kompliziert aufgebaute Saccharid-Verbindungen oder Bibliotheken, wie vorstehend erwähnt, aufgebaut werden können.
Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.
Von den Erfindern wurde ein Verfahren zur Synthese von Saccharid-Verbindungen entwickelt, das die folgenden Schritte aufweist:
(a) Anknüpfung mindestens eines Saccharids an ein cyclisches oder acylisches Dien,
(b) Umsetzung des in Schritt (a) entstandenen Saccharid-enthaltenden Diens oder eines käuflich erhältlichen saccharidhaltigen Diens mit einem Dienophil mittels Diels-Alder-Reaktion.
Die Diels-Alder-Reaktion ist eine Reaktion, bei der ein Dien mit einem Olefin reagiert, wobei ein Übergangszustand durchlaufen wird, an dem 6π-Elektronen beteiligt sind. Dieser Übergangszustand verleiht den Diels-Alder-Reaktionen, im Vergleich zu den üblichen organischen Reaktionen^- relativ niedrige Aktivierungsenergien, so daß diese Reaktionen bereits bei Raumtemperatur oder leicht erhöhten Temperaturen ablaufen können. Diels-Alder-Reaktionen können durch hohen Druck beschleunigt werden. Gerade in den letzten Jahren sind eine Reihe von Katalysatoren bekannt geworden, die in der Lage sind, unter milden Bedingungen effektiv Diels-Alder Reaktionen zu katalysieren (K. Pindur et al., Chem Rev. 1993, 93, S. 741-761; Kündig et al., Angew: Chem. 1999, 111, S. 1298-1301) . Da Diels-Alder Reaktionen grundsätzlich reversibel sind, eignet sich dieser Reaktionstyp auch für die dynamische kombinatorische Chemie. Die Bildung von exo- und endo-Isomeren kann über die Temperatur und auch den Katalysator gesteuert werden. Hinsichtlich der Ausbeuten bietet die Diels-Alder Reaktion große Vorteile, da sie ohne weitere Nebenprodukte und mit nahezu quantitativer Ausbeute verläuft. Die Diels-Alder Reaktion wird daher von den Erfindern eingesetzt, um kompliziert aufgebaute Saccharid- Verbindungen und Bibliotheken aus Saccharid-enthaltenden Verbindungen bzw. Saccharid-Bibliotheken aufzubauen. Bei geschickter Substitution der beiden AusgangsVerbindungen (Dien und Dienophil) mit funktioneilen Gruppen oder Resten sind damit Moleküle zugänglich, die drei oder sogar vier unterschiedliche Reste enthalten können.
Erfindungsgemäß eignen sich als cyclische Dien-Komponente in Schritt (a) vorzugsweise Furan, Fulven, Furfural, Cyclopentadien, Cyclohexadien, Pyrrol, 1,3-Ozazol, 1,2- Oxazol, Pyrazol, Thiophen und als acyclische Verbindungen 1,3-Diene (z.B. trans-trans Hexadien-2, 4-1, 6-diol) , welche mit funktionellen Gruppen ein- oder mehrfach substituiert sein können. Die funktionellen Gruppen können ausgewählt sein aus beispielsweise Alkylketten (C2 - C20, bevorzugt Methyl, Ethyl, iso-Propyl, Tert.-Butyl usw.), OH, SH, Halogene, Aryl- , Carboxyl-, Carbonyl-, Nitro-, Carboxyamido-,.. Keto-, Sulfoxid-, Sulfon-, Sulfonsäure-, Phosphorsäure- oder A ino- Gruppen, die direkt oder über Alkylreste gebunden sind. Die Dien-Komponente kann aber auch Aminosäure-, Peptid- Substituenten, Lipid-Substituenten oder Oligonukleotid- bzw. Nukleinsäure-Substituenten tragen. An die Dien-Komponente lassen sich auch alle Arten pharmazeutischer Wirkstoffe, Markierungen, Farbstoffe oder Komplexe (z.B. Carboran, Ferrocen) koppeln.
Bevorzugte Dien-Komponenten sind: Bishydroxyalkylfurane, wie 2,3-Bishydroxymethylfuran, 3,4-Bishydroxymethylfuran, 2,5- Bishydroxymethylfuran, Hydroxymethylfurfural, α-GMF (α- Glycosylmethyl-furfural; bzw. mit z.B. NaBH reduzierter Aldehydfunktion) . Ebenso können natürlich auch deren Homologe mit Ethylτ oder Propylgruppe statt Methyl- eingesetzt werden. Die Dien-Komponenten sind käuflich erhältlich z.B. Fa. Aldrich (Furfural = Aldrich #27,886-6; Hydroxymethylfurfural = Aldrich #4,080-7; 3-Hydroxymethyl-furan = Aldrich #19,639- 8) oder Fa. Südzucker AG (α-GMF). Allgemein gilt, daß 2,5- disubstituierte Furane in Diels-Alder-Reaktionen eine geringere Reaktivität besitzen als 3, 4-disubstituierte. Diese abgestufte Reaktivität läßt sich synthetisch nutzen. Dabei ist von Vorteil, daß sich die Reaktivität von Hydroxymet ylgruppen in den einzelnen Positionen des Furans unterscheidet, so daß eine sequentielle Substitution möglich wird. Damit lassen sich sehr einfach verschiedene Saccharide in das Furan einführen (s. Fig. 1) . Cyclopentadien und seine substituierten S-bkömmlinge eignen sich ebenfalls sehr gut als Diene bei der Diels-Alder-Reaktion. Aldehyd-Derivate des Cyclopentadiens sind schon lange bekannt (Chem. Ber. 1964, 97, S. 2066) und können schrittweise in die HydroxymethylVerbindungen überführt werden, die nach der Imid.at-Methode mit Sacchariden umgesetzt werden und dann als Diene verfügbar sind. Carbonsäure-Derivate des Cyclopentadiens sind ebenfalls bekannt, wie Ester, A ide oder Nitrile (J. Chem. Soc. 1966, S. 1641) . Dabei sind Cyclopentadien-tetra-carbonsäureester auch aus den entsprechenden Cyclopentan-Vorstufen durch Dehydrierung darstellbar. Diese Vorstufen wiederum sind leicht aus den Diels-Alder-Addukten aus Cyclopentadien und Maleinsäureanhydrid zugänglich. Auch durch Cyclisierungsreaktionen von 1,3-Diäcarbonyl-Verbindungen können Cyclopentadiene hergestellt werden (J. Chem. Soc. 1952, S. 1127) . In der Natur vorkommende Iridoid-Glucoside wie Catapol und Aucubin (Liebigs Ann. Chem. 1990, S. 715) können als Vorstufen für ssacharid-substituierte Cyclopentadiene betrachtet werden (THL 1997, 38, S. 6433). Daneben können die genannten Glucoside auch als Dienophile bei der Generierung von Substanz-Bibliotheken zur Wirkstoffsuche verwendet werden.
Im Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Saccharid mit einem Dien verknüpft, indem das Dien mit einer Imidat-Komponente umgesetzt wird, die mit einem Saccharid substituiert ist. Die Reaktionsbedingungen für diese Reaktion sind beispielsweise von R.R. Schmidt, in: Glycosciences, ed. H.J. Gabius, S. Gabius, S. 31-53 beschrieben worden. Die Verknüpfung des Saccharids mit der Dien-Komponente kann auch mittels anderer Reaktionen (z.B. mittels der bekannten Königs-Knorr-Reaktion) erfolgen. Der Begriff "Saccharid" umfaßt Saccharide jeglicher Art, insbesondere Mono-, Di-, Oligo- oder Polysaccharide (z.B. mono-, di- tri-, ulti- antennäre sowie dendritische Saccharide) in allen stereoisomeren und enantiomeren Formen. Diese können Pentosen oder Hexosen sein, welche in der L- oder D-Form vorliegen. Als Monosaccharide sind insbesondere Glucose, ganz besonders α- und ß- D-Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Arabinose, Xylose, Fucose, Rhamnose, Digitoxose und Derivate davon bevorzugt. Als Disaccharide eignen sich insbesondere Saccharose, Maltose, Laktose oder Gentobiose, entweder 1,4- oder 1, 6-verknüpft, sowie Derivate davon. Als Saccharide gelten hier auch Zuckeralkohole, Polyole, Inosite und Derivate davon, ganz besonders cis-Inositol, epi-Inositol, allo-Inositol, myo-Inositol, muco-Inositol, chiro-Inositol, neo-Inositol, scyllo-Inositol, Pinpollitol, Streptamin, Quercitol, Chinasäure, Shikimisäure, Conduritol A bzw. B, Validatol und Quebrachitol, z.B. aus Galactinolen, sowohl aus pflanzlichen Quellen, wie Zuckerrüben (daraus erhältlich: Hydroxymethylfurfural; F.W. Lichtenthaler, Mod. Synth. Meth. 1993, 6, S. 273-376), als auch aus Milchprodukten, oder durch enzymatische Enantiomerentrennung gewonnene Verbindungen. Ferner sind erfindungsgemäß einsetzbare Saccharide Glycokonjugate. Diese können Konjugate von z.B. Sacchariden mit Peptiden, Lipiden, Säuren (—> Ester), Alkylresten ( >
Ether) , Heterozyklen oder anderen Kohlenhydraten sein. Ein Beispiel von Glycokonjugaten ist Z1-Z10, ein Gemisch von 10 Glykokonjugaten. Bei den Verbindungen Z1-Z10 handelt es sich um in der Natur vorkommende Glycopeptide, Glycoproteine und Lipopolysaccharide. Derivate der erwähnten Saccharide sind z.B. mit Schutzgruppen (z.B. Benzoyl-, Silyl-, Dirnethoxytrityl-) geschützte Saccharide und/oder mit funktionellen Gruppen, wie Amino-, Nitro-, Carboxy-, Carboxya ido-, Keto-, Sulfoxid-, Sulfon-, Sulfonsäure-, Phosphorsäure-, Phosphonsäure-, Mono/Di/Trilalkylamidgruppen oder Halogenidgruppen, modifizierte Saccharide. Vorstehende Saccharide können natürlich vorkommen oder synthetisch hergestellt sein. Vorzugsweise weist das Imidat nur ein Saccharid auf, aber auch eine Anzahl von 2, 3, 4, 5 und 6 Saccharid-Komponenten ist denkbar, wenn das Imidat entsprechend ausgewählt ist. Die Saccharide können dabei gleich oder verschieden voneinander sein. Bevorzugte Saccharid-substituierte Imidat-Komponenten sind Tri-O-Benzoyl-fucoseimidat oder Tetra-O-Benzoyl- galactoseimidat. Die Saccharid-substituierten Imidat- Komponenten werden beispielsweise gemäß H. Paulsen et al., 1992, Liebigs Ann. Chem. 747-750 hergestellt.
Um in Schritt (a) ein vollständig mit Sacchariden modifiziertes Dien zu erhalten, kann die vorbeschriebene Reaktion des Diens mit dem Saccharid-substituierten Imidat mehrfach hintereinander stattfinden (s. Beispiel 1) oder das Imidat wird im Überschuß zugesetzt, wobei dann nach der Reaktion ein- und mehrfach Saccharid-modifiziertes Dien voneinander getrennt werden sollten, um im nachfolgenden Schritt (b) zu einheitlichen Produkten zu kommen. Die in Schritt (a) aus den vorstehend als bevorzugt genannten Dienen und Saccharid-substituierten Imidaten herstellbaren Verbindungen sind beispielsweise 3, 4-Bis- (fucosyl-oxymethyl)- furan, 3, 4-Bis- (galactosyl-oxymethyl) -furan, 3- Fucosyloxymethyl-4-galactosyloxymethylfuran, 2, 5-Bis- galactosyloxymethyl-furan, 2,5-Bis-fucosyloxymethyl-furan, 2- Fucosyloxymethyl-5-galactosyloxymethylfuran und Alkohole, abgeleitet von Furan-2, 5-di-ß-propionsäure oder- abgeleitet von Furan-2,5-di-essigsäure. Falls die Verbindunger Schutzgruppen enthalten (vorzugsweise: Benzoylschutzgruppe) können diese z.B. mit Natriummethanolatlösung gemäii Standardverfahren abgespalten werden.
In Schritt (b) eignen sich als Dienophil€ Maleinsäure (anhydrid) -Derivate, Fumarsäure (anhydrid) - Derivate, Maleinimid-Derivate (bevorzugt: N-substituierte. Maleinimid) , Acrylsäure-Derivate, Acetylen-Derivate, Butindicarbonsäure bzw. dessen Derivate oder Enolether. Untej Derivaten sind dabei jene, die nach Substitution de: genannten Verbindungen Alkylketten (C2 - C2o) , _-_-OH, SH, Halogenen, Aryl-, Carboxy-, Carbonyl-, Nitro-, Carboxyamido-, Keto-, Sulfoxid-, Sulfon-, Sulfonsäure-, Phosphorsäure-, Amino-, Phosphonsäure- oder Mono/Di/Trialkyla id-Gruppen tragen. Desweiteren kann die Dienophil-Komponente mit Sacchariden gemäß der vorstehenden Definition substituiert sein. Die Dienophil-Komponente kann aber auch Aminosäure-, Peptid-Substituenten, Lipid-Substituenten oder Oligonukleotid- bzw. Nukleinsäure-Substituenten tragen. An die Dienophil-Komponente lassen sich auch alle Arten pharmazeutischer Wirkstoffe, Markierungen, Farbstoffe oder Komplexe koppeln. Bevorzugte Dienophile sind Tris- (2- Maleini idoethyDamin (TMEA), • N-Phenyl, N-Ethyl, Maleini idolysin oder Conduritol.
Die Dien- als auch die Dienophil-Komponente können einzeln oder beide auch aromatische oder heterozyklische Reste enthalten. Diese können ausgewählt sein aus: Phenyl-, Thienyl-, Thiophenyl-, Furyl-, Furanyl-, Pyrany.l-, Pyrrolyl-, Irαidazolyl-, Pyrazolyl-, Pyridyl-, Pyrazinyl-, Pyri idinyl-, Pyrazinyl-, Pyridazinyl-, Thiazolyl-, Oxazolyl-, Indolyl-, Furazannyl-, Pyrrolinyl-, Imidazolinyl-, Pyrazolinyl-, Thiazolinyl-, Triazolyl-, Tetrazolyl-Gruppe, sowie die Positionsisomeren des oder der Heteroatome, die diese Gruppen umfassen können, ein Rest bestehend aus carbocyclischen kondensierten Ringen, beispielsweise die Naphthylgruppe oder die Phenanthrenylgruppe, ein Rest" bestehend aus kondensierten heterocyclischen Ringen, beispielsweise Benzofuranyl, Benzothienyl, Benzimidazolyl, Benzot iazolyl, Naphtho[2,3- b] thienyl, Thianthrenyl, Isobenzofuranyl, Chromenyl, Xanthenyl, Phenoxathionyl, Indolizinyl, Isoindolyl, 3H- Indolyl, Indolyl, Indazolyl, Purinyl, Chinolizinyl, Isochinolyl, Chinolyl, Phthalzinyl, Naphthyridinyl, Chinoxalinyl, Chinazolinyl, Chinolinyl, Pteridinyl, Carbazolyl, ß-Carbolinyl, Cinnolinyl, Acridinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl, Phenoxazinyl, Indolinyl, Isoindolinyl, Imidazopyridyl, Imidazopyridmidinyl oder auch die kondensierten polycyclischen Systeme bestehend aus heterocyclischen Monozyklen, wie beispielsweise vorstehend definiert, wie beispielsweise Thionaphthenyl, Furo[2,3- b.pyrrol oder Thieno[2, 3-b] furan, und insbesondere die Phenyl-, Furylgruppen, wie 2-Furyl, Imidazolyl, wie 2- Imidazolyl, Pyridyl, wie 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, Pyri idinyl, wie Pyridmid-2-yl, Thiazolyl, wie Thiazol-2-yl, Thiazolinyl, wie Thiazolin-2-yl, Triazolyl, wie Triazolyl-2- yl, Tetrazolyl, wie Tetrazol-2-yl, Benzimidazolyl, wie Benzimidazol-2-yl, Benzothiazolyl, Benzothiazol-2-yl, Purinyl, wie Purin-7-yl, oder Chinolyl, wie 4-Chinolyl.
Die Diels-Alder-Reaktion ist ein Standardverfahren der organischen Chemie und die Reaktionsbedingungen sind einem Fachmann wohl bekannt bzw. können in einschlägigen Lehrbüchern nachgeschaut werden. Im Rahmen dejj vorliegenden Erfindung wird die Diels-Alder-Reaktion vorzugsweise in beliebigen Lösungsmitteln zwischen 20°C und 100°C durchgeführt. Bevorzugte Lösungsmittel sind Wasser oder Alkohole, wie Methanol oder Ethanol. Die Bildung von exo- und endo-Verbindungen, wie sie bei diesem Typ von Diels-Alder- Reaktionen beobachtet werden, kann durch die experimentellen Bedingungen gesteuert werden und vergrößert die Zahl der zu erhaltenden Verbindungen um den Faktor zwei. Diese Variation der experimentellen Bedingungen liegt im Können eines Durchschnittsfachmanns .
Alle Diels-Alder-Reaktionen sind Gleichgewichtsreaktionen, bei denen in Abhängigkeit von der Temperatur auch immer auch die Komponenten zugegen sind und somit anderweitig aus dem Gleichgewicht heraus mit anderen Partnern abreagieren können. Damit eignet sich das vorstehend beschriebene System_-auch zur kontrollierten Freisetzung der Dienophil-Komponente, bei gleichzeitiger Verankerung der Dien-Komponente an einem Polymerträger oder umgekehrt. Trägt das Dienophil z.B. ein Peptid oder ein Therapeutikum so steht damit ein System zur Verfügung, das für die kontrollierte und steuerbare Freisetzung von Arzneimitteln von einer Festphase genutzt werden kann. In Erweiterung vorstehend beschriebener Reaktionen steht mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Möglichkeit der Verknüpfung von Peptiden mit Sacchariden, von Peptiden mit Nukleinsäuren, von Sacchariden mit Nukleinsäuren und der jeweiligen Komponente mit sich selbst zur Verfügung, sofern die eine Komponente mit einem Dien und die andere mit einem Dienophil verbunden wäre. Die entstandenen Diels-Alder Addukte können selbst noch abgewandelt werden, z.B. durch Ringöffnung des Anhydridringes oder auch durch Hydrierung der Doppelbindung oder durch Additionsreaktionen an diese Doppelbindung.
Das Oxa-bicycloheptan-Ringsystem kann unter sauren Bedingungen zu einem Cyclohexan-Ringsyste geöffnet werden. Dabei ist eine Spaltung des Diels-Alder Addukts in die Komponenten nicht mehr möglich und es entsteht ein neuer Strukturtyp, ein Inositolderivat, das sicher andere pharmakologische Eigenschaften aufweist, da es nicht mehr die Rigidität des Bicyclus besitzt.
Um größere Cluster oder Bibliotheken aufzubauen, müssen die Schritte a) und/oder b) des erfindungsgemäßen Verfahrens mehrmals hintereinander durchgeführt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann Schritt a) natürlich wegfallen, wenn von einem Saccharid-substituierter Dien bereits ausgegangen wird. Nachfolgend sollen einige wichtige bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung hervorgehoben werden, wobei diese nicht als Beschränkung des breiten Verfahrenskonzepts auszulegen sind.
In der Diels-Alder-Reaktion (Schema 1) wird ein Dien 1 mit einem Dienophil 2 zur Reaktion gebracht.
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Schema 1
Das Dien 1 (hier: Furan mit den Substituenten Ri. bis R4) wird dabei in wässriger Lösung direkt mit dem Dienophil 2 (hier: Maleini id mit dem Substituenten R5) zur Reaktion gebracht. Dabei entsteht ein Produktgemich aus endo- und exo-Diels- Alder-Produkt 3. Die Zusammensetzung des Produktgemisches kann gesteuert werden. Zudem ist es möglich, endo- und exo- Verbindung chromatographisch voneinander zu trennen. (Bedeutung von Ri bis R4 und R5: Es können ein oder mehrere Substituenten und in allen denkbaren Kombinationen eingebaut werden. Zur Definition der Reste: siehe vorstehend)
Im folgenden werden daher zunächst einige Darstellungsmöglichkeiten von Dienen (vom Typ 1, Schema 1) und deren Saccharidkonjugation, dann der Dienophile (vom Typ 2) und schließlich die Diels-Alder Reaktion beschrieben.
Darstellung der Diene (bevorzugt Fürande ivate) Dem erfindungsgemäßen Konzept entsprechend werden saccharidmodifizierte Furanderivate hergestellt. Geeignete Verbindungen sind daher Furanderivate, die eine Hydroxygruppe enthalten (direkt oder durch Spacer vom Ring entfernt) , welche die kovalente, glycosidische Verknüpfung mit einem Saccharidmolekül erlaubt (z.B. Ri = CH2-OH) . Die Synthesemöglichkeiten hierfür sind zahlreich und zumeist literaturbekannt.
Stellvertretend für die leichte Zugänglichkeit der benötigten Furanderivate und die Leistungsfähigkeit der Synthesewege sind die folgenden Reaktionsschemata (Fig. 5(a) - (f) ) angeführt.
Neben den hier vorgestellten Synthesewegen gibt es noch andere, bereits literaturbekannte Varianten. Die hier beschriebenen Diene sind bespielhaft aufgeführt. Daneben gibt es noch eine weitere Zahl von Dienen, die nach Konjugation mit Sacchariden von den Erfindern in Diels-Alder Reaktionen eingesetzt wurden. Diese sind weiter unten tabellarisch dargestellt.
Synthese der saccharidhaltigen Diene
Die kovalente Verknüpfung der Furanderivate mit Sacchariden erfolgt bevorzugt nach der Imidatmethode (Schema 3, s. Fig. 6) . Im ersten Schritt der Reaktion (A) wird die einfache Galactosidierung errreicht, inde jeweils ein Äquivalent Furanderivat mit einem Äquivalent Galactosei idat zur Reaktion gebracht wird. Die Mono-galactosidierte Verbindung wird chromatographisch aufgereinigt. In einem zweiten Schritt der Umsetzung (B) wird dann 1 Äquivalent eines weiteren Glycosylimidates zugesetzt. Bei zweifacher Umsetzung mit Gal- I idat wird so nach Abspaltung der Schutzgruppen eine Verbindung mit zwei Galactoseeinheiten erhalten. Setzt man dagegen in Schritt B das Fucose-imidat ein, so wird.-e.in gemischt glycosidiertes Furanderivat nach Abspaltung der Schutzgruppen erhalten. Die gesamte Reaktion kann aber auch durch Königs-Knorr-Reaktion oder andere in der Literatur bekannte Methoden erfolgen.
Kombinatorik mit Furansaαchariden
Umsetzung von 2, 3,4-Trishydroxyfuran (oder anderen „polyhydroxylierten" Furanderivaten) mit der dreifachen molaren Menge des Mixes an 10 verschiedenen Imidaten in gleichen Verhältnissen. Abspaltung der Schutzgruppen und Diels-Alder Reaktion mit einem markierten Maleinimid im Überschuß. Isolierung der markierten Bibliothek und Test auf fixierte Zellen. Durch Variation der Saccharidimidate, Hinzufügen und Weglassen und ihrer Konzentrationen lassen sich die optimal wirksamen Strukturen ermitteln.
Wird als Dien ein zweifach mit Zuckerresten .substituiertes Furan und als Dienophil ein N-substituiertes Maleinimid eingesetzt, das über einen Spacer beliebiger Länge ein Saccharid trägt, so entstehen bei der Diels-Alder-Reaktion Trisaccharide. Nach diesem Schema läßt sich bei der Verwendung von z.B. zehn unterschiedlichen Saccharidimidaten eine Bibliothek mit fast 1000 verschiedenen Trisacchariden generieren. Da die Schutzgruppen sowohl des Diens als auch des Dienophils vorher abgespalten werden können, kann die Diels-Alder-Reaktion in Wasser durchgeführt werden, was sich günstig auf die Reaktionsgeschwindigkeit und Ausbeute auswirkt (s. Fig. 2) .
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Substanzen/Bibliotheken herstellen, die sich eignen, die Interaktion von Lektinen mit Proteinen zu inhibieren. Solche Substanzen können bei der Krebstherapie zur Vermeidung der Metastatisierung oder als Entzündungshemmer Verwendung finden. Bei Verwendung von Spacern, wobei diese sowohl im Dien als auch im Dienophil eingefügt werden können, oder von seltenen oder mit ungewöhnlichen funktionellen Gruppen versehenen Sacchariden, erhöht sich die Diversität der Bibliotheken. Die Multiantennarität, die für die Interaktion von Sacchariden mit Lektinen von Bedeutung sein kann, läßt sich ebenfalls mit Hilfe des erfindüngsgemäßen Verfahrens herstellen. Durch die zwei- oder dreifache Diels-Alder- Reaktion mit einem entsprechenden Dienophil sind solche Moleküle leicht zugänglich (s. Fig. 3) .
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Verbindungen/Bibliotheken generierbar, die neben den Sacchariden auch andere pharmakophore Gruppen enthalten, um allgemein neue Leitstrukturen für Therapeutika zugänglich zu machen. Solche Gruppen können Heterozyklen, Aromaten oder auch peptidische Strukturen sein, die entweder im Dien oder Dienophil enthalten sind. Durch diese vielfältigen Kombinationsmöglichkeiten erhöht sich die Diversität der Bibliotheken beträchtlich. Günstig kann in diesem Zusammenhang auch die oft geringe konformative Beweglichkeit der entstehenden Diels-Alder-Produkte sein, da sich solche Strukturen besser an Rezeptoren anlagern. Durch das Vorhandensein der Saccharidreste in den Produkten sind diese entsprechend wasserlöslich.
Die Diels-Alder-Reaktion von Dienen mit Dienophilen (z.B. substituierten Maleinimiden) kann auch zur Verbindung von Proteinen mit Sacchariden und von Sacchariden mit Nukleinsäuren eingesetzt werden. Hier ist es zweckmäßig, einen Lysinrest im Protein zu haben, der über die freie Aminogruppe die Anfügung des Maleinimid-Restes gestattet. Es ist aber auch denkbar, daß am a inoterminalen Ende ein Lysin- Rest angefügt wird. Bei diesen so zugänglichen Neo- Glycoproteinen läßt sich der Einfluß von unterschiedlichen
(Oligo) Sacchariden auf die Wirksamkeit der Proteine oder deren Pharmakokinetik untersuchen. Auf dem gleichen Weg ist auch eine Markierung von Sacchariden mit Biotin problemlos durchführbar, was für eine mögliche Diagnostik auf der Basis von Lektin-Saccharid-Wechselwirkungen von Wichtigkeit wäre
(Fig. 2) .
Die Diels-Alder-Reaktion von Dienen (z.B. substituierten Furanen) mit Dienophilen (z.B. substituierten Maleini iden) führt auch zur Dotierung von Oberflächen mit Sacchariden, Lipiden, Peptiden oder (Oligo) nukleotiden. Dabei kann sowohl das Dienophil als auch das Dien auf der Oberfläche immobilisiert sein. Eine Anwendung in der Chip-Technologie ist somit denkbar. Auch die Erhöhung der Beladungsdichte auf der Oberfläche ist durch die Verwendung von Strukturen wie in Fig. 2 machbar.
Da die Diels-Alder-Reaktion mit diesen Komponenten sehr gut in Wasser durchzuführen ist und in der Regel keiner Katalyse bedarf, können alle Komponenten ohne Schutzgruppen miteinander umgesetzt werden. Dadurch entfällt die finale Abspaltung von Schutzgruppen, ein Prozeß der oftmals große Schwierigkeiten bereitet.
Da alle Diels-Alder-Reaktionen reversibel sind und sich die Gleichgewichte schon bei Raumtemperatur einstellen, kann die Umkehrung der Adduktbildung auch für die kontrollierte Freisetzung der Komponenten der Diels-Alder-Reaktion, die dafür mit Wirkstoffen beladen sind, eingesetzt werden. Wie in der Einleitung bereits ausgeführt, sind die natürlichen Bindungskonstanten zwischen Proteinen und (Oligo) sacchariden nicht sehr hoch. Offenbar bestand im Rahmen der Evolution kein Bedarf für eine weitere Optimierung dieser Bindungskonstanten. Aus grundsätzlichen Erwägungen heraus sollte es möglich sein, durch Zulassung aller Arten von Wechselwirkungen einschließlich ionischer Interaktionen, auf der Basis von Sacchariden und Saccharidmimetika wirkungsvolle Agonisten und Antagonisten von Rezeptoren in Analogie zu Peptiden darzustellen. Die Verwendung von substituierten Sacchariden, wobei alle Arten von funktionellen Gruppen eingesetzt werden können, auch solche, die bisher nicht in Sacchariden vorkommen, ist sicher eine Voraussetzung für diese Optimierung.
Mit Hilfe der kombinatorischen Chemie ist es möglich, sehr wirkungsvolle Agonisten und Antagonisten auf der Basis von Peptiden, Lipiden oder Nukleinsäuren zu identifizieren. Um daraus Therapeutika, vor allem für die orale Applikation, zu entwickeln, bedarf es aber Substanzen, die oral verfügbar sind. Eine notwendige Voraussetzung dafür ist die ausreichende Wasserlöslichkeit. Ein möglicher Ansatz zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit und damit der oralen Verfügbarkeit, ist die kovalente Verknüpfung von Wirkstoffen mit Sacchariden unter Bildung von Konjugaten. Mit dem erfindungsgemäßen Ansatz ist es möglich, unter Anwendung eines kombinatorischen Ansatzes von vornherein das Problem einer ausreichenden Wasserlöslichkeit durch die Verwendung geeigneter Bausteine zu berücksichtigen. Dies bietet darüber hinaus noch den Vorteil, daß diese Bausteine auf der Basis von Sacchariden und ihrer Derivate Teil des Wirkstoffs werden und damit zur Stärkung der Bindung des Wirkstoffs an sein Target beitragen können. Von den Erfindern ist auch daran gedacht worden, das Verfahren auf die Festphase zu übertragen, wobei sinnvollerweise die Bindung an die Festphase über den Saccharidteil erfolgt .
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Figuren beschrieben.
Fig. 1 : Einführung von 2 Saccharidresten in ein Furansystem Fig. 2 : Reaktion eines zweifach substituierten Furans mit einem N-substituierten Maleinimid Fig. 3 : Mehrfache Diels-Alder-Reaktion
Fig. 4 : Exemplarische Bausteine für die Diels-Alder Reaktion
Fig. 5 (a) - ( f) : Darstellung von mit Sacchariden konjugierbaren Für ander ivaten Fig. 6 : Glykosidierung von 2, 5-Bis-hydroxymethylfuran
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele verdeutlicht .
Beispiel 1 : Synthese von glycosidierten Hydroxymethyl- furanen
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4 5 20 mmol 3, 4-Bis-Hydroxymethylfuran 1 und 21 mmol Tri-O- Benzoyl-fucose-imidat 2 werden in 300 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird auf -40DC abgekühlt und mit einigen Tropfen Triflat versetzt. Die Reaktionslösung wird dann im Eisbad 1 Stunde gerührt, die organische Phase wird mit verdünnter Bicarbonatlösung und dann mit Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Das Reaktionsprodukt 3 wird nach Säulenchromatographie an Kieselgel mit Petrolether/Essigester (2/1) in einer Ausbeute von ca. 60% erhalten.
6 mmol Mono-fucosyliertes Furan 3 wird mit 6.3 mmol Imidat 4 wie oben beschrieben umgesetzt. Die Reinigung erfolgt säulenchromatographisch an Kieselgel mit Petrolether/Essigester (2/1) . Das Produkt 5 wird in einer Ausbeute von ca. 55% erhalten.
Zur Entschützung (Abspaltung der Benzoylgruppen) wurde das Produkt 5 mit Natriummethanolatlösung umgesetzt. Ausbeuten: ca. 60%.
Um die entspechenden 2,5-Produkte herzustellen, wird im ersten Schritt statt 3, 4-Bis-Hydroxymethylfuran das 2,5-Bis- Hydroxymethylfuran eingesetzt und analog wie vorstehend verfahren.
Beispiel 2: Glycosidierung von Maleinimid bzw. -Derivaten
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5 mmol geeignet derivatisiertes Maleinimid 1 (Maleinimid + Spacer + OH) werden mit 4 .9 mmol Galactosyli idat 2 in 100 ml Dichlormethan gelöst und bei -40DC mit 10 Tropfen Triflat versetzt. Es wird bei ODC geruht." Nach vollständiger Umsetzung wird die Reaktionslösung mit verdünnter Bicarbonatlösung und Wasser ausgeschüttelt. Das Lösungsmittel wird über Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird an Kieselgel mit Petrolether/Essigester (2/1) chromatographiert. Ausbeute an Produkt 3: 54%.
Zur Abspaltung der Benzoylgruppen wird mit Natriummethanolat oder einer Mischung aus Methanol/Wasser/Triethylamin umgesetzt.
Beispiel 3: Diels-Alder Reaktion
a) Biotinylierung
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3
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50umol glycosidiertes Furan 1 (s. Beispiel 1) und 50 μmol Biotinderivat 2 (Fa. Pierce Kat.-No. 2 1900 ZZ) werden in 1 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur gerührt. Der Fortgang der Reaktion wird mittels HPLC kontrolliert. Nach beendeter Umsetzung wird die Reaktionslösung gefriergetrocknet. Das Produkt 3 (endo-/exo-Mischung) wird mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute 50-60%.
Unter den gleichen Bedingungen wurden auch folgende Reaktionen durchgeführt, wobei die Df-en-Komponente jeweils gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde und die Dienophil-Komponente gemäß K. Wakisaka et al., J. Med. Chem. 1997, 40, S. 2643-2652 hergestellt wurde.
Einführung eines Lysinrestes
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c) Umsetzung von 2 , 5 und 3, 4-Glycosyl-hydroxymethylierten Furanen
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Beispiel 4 : Darstellung von Glycoclustern mittels Diels-
Alder Reaktion
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Figure imgf000025_0003
Eine Lösung von 50 μmol Tris (-2-Maleinimidoethyl) amin 1 (TMEA) und 190 μmol Bis-Galactosylfuran 2 in 1 ml Wasser wird 50 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produktgemisch 3 (Kombination aus endo- und exo-Produkten) wird mittels HPLC in ca. 30% Ausbeute erhalten.
Beispiel 5: Gekreuzte Diels-Alder Reaktion
Hierbei handelt es sich um die gleichzeitige Reaktion von
2,5- und 3,4-Furanen mit einem Dienophil (—> Kombinatorik)
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50μmol eines Gemischs der glycosidierten 3,4- und 2,5-Furane 1, 2 (s. Beispiel 1) und 50 μmol N-Ethyl-Maleinimid 3 werden in 1 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur gerührt. Der Fortgang der Reaktion wird mittels HPLC kontrolliert. Nach beendeter Umsetzung wird die Reaktionslösung gefriergetrocknet. Die Produkte 4 und 5 werden mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute 50-60%. Beispiel 6: Diels-Alder Reaktion an der Festphase
Figure imgf000028_0001
1,0 g Tris-(2-aminoethyl)amin-Polymer (Aldrich #47,210-7) werden in 20 ml Wasser für 1 Std. quellen gelassen. Danach wird in 20 ml gesättigter NaHC03 - Lösung aufgeschlämmt und bei ODC mit 1080 mg Methoxycarbonylmaleimid versetzt und dann bei Raumtemperatur 16 Std. gerührt. Man stellt mit H2S04 auf pH 3-4 ein, extrahiert mit Essigester und Dichlormethan. Die wässrige Phase wird getrocknet. Zu 100 mg des Produktes werden 108 mg glykosyliertes Furanderivat (s. Beispiel 1) in 3 ml Wasser gegeben. Es wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 16 Stunden wird das Wasser entfernt und das Produkt mittels HPLC gereinigt.
Beispiel 7 Herstellung von Trisacchariden
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
5 mmol geeignet derivatisiertes Maleinimid 1 (Maleinimid + Spacer + Saccharid) werden mit 4.9 mmol diglycosyliertem Furan 2 in 100 ml Dichlormethan gelöst und bei -40DC mit 10 Tropfen Triflat versetzt. Es wird bei ODC geruht. Nach vollständiger Umsetzung wird die Reaktionslösung mit verdünnter Bicarbonatlösung und Wasser ausgeschüttelt. Das Lösungsmittel wird über Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird an Kieselgel mit Petrolether/Essigester (2/1) chromatographiert. Ausbeute an Produkt 3: 54%. Beispiel 8: Glycosidierung von Furanderivaten mit Hydroxyfunktionen
(a) Verfahren A: Monoglycosidierung:
Figure imgf000030_0001
2, 5-Bishydroxymethylfuran (2 mmol, 265 mg) und 2,3,4-Tri-O- Benzoylfucoseimidat (2 mmol , 1,28g) werden in 50 ml Dichlormethan bei -40°C mit 5 Tropfen Triflat versetzt und anschließend bei 0°C für eine Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wird durch Zugabe von verdünnter wässriger Bicarbonatlösung gestoppt. Die organische Phase wird mit 20 ml Wasser gewaschen und anschließend nach Trocknen über Natriumsulfat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird an Kieselgel (Petrolether/Essigester: 2/1) chromatographiert. Ausbeute: 700mg (60%); ESI-MS: [M+H+] : 58611 Diese Verbindung kann nun in einer zweiten Reaktion nochmals mit einem Äquivalent eines beliebigen Saccharidimidates umgesetzt werden.
(b) Verfahren B: Mehrfachglycosidierung
Figure imgf000030_0002
2, 5-Bishydroxymethylfuran (2 mmol, 265 mg) und 2,3,4, 6-Tetra- O-Benzoylgalctoseimidat (4 mmol, 1,48g) werden in 50 ml Dichlormethan bei -40°C mit 5 Tropfen Triflat versetzt und anschließend bei 0°C für zwei Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wird durch Zugabe von verdünnter wässriger Bicarbonatlösung gestoppt. Die organische Phase wird mit 20 ml Wasser gewaschen und anschließend nach Trocknen über Natriumsulfat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird an Kieselgel (Petrolether/Essigester: 2/1) chromatographiert. Ausbeute: 1,4g (55%); ESI-MS: [M+H+] : 1284,3
Zur Abspaltung der Schutzgruppen werden die Verbindungen in methanolischer Lösung mit Natriummethanolat umgesetzt. Die Verseifung erfolgt quantitativ.
Enthält das Furanderivat mehrere glycosidierbare Hydroxylfunktionen, so wird zur schrittweisen Glycosidierung nach Verfahren A umgesetzt. Soll hingegen nur eine Kohlenhydratspezies an alle zur Verfügung stehenden Hydroxylfunktionen konjugiert werden, wird Verfahren B eingesetzt.
Auf diese Weise wurden folgende Furanderivate hergestellt:
3-Hydroxymethylfuranglycosid
Figure imgf000031_0001
Ri
Glucose 2 , 3-Bishydroxymethylfuranglycoside
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0004
2 , 4-Bishydroxymethylfuranglycoside
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000032_0005
3, 4-Bishydroxymethylfuranglycoside
Figure imgf000032_0003
Figure imgf000032_0006
Figure imgf000033_0003
2, 5-Bishydroxym.ethylfuranglycoside
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0004
2, 3, 4-Trishydroxymethylfuranglycoside
Figure imgf000033_0002
Figure imgf000033_0005
2,3, 5-Trishydroxymethylfuranglycosid
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0003
Andere:
Figure imgf000034_0002
Beispiel 9: Darstellung von Dienophilen
Zahlreiche Dienophile vom Maleinimidtyp sind synthetisiert worden. Daneben sind jedoch auch einige kommerziell erhältich.
Allgemeine Maleinimid-Synthesen:
Synthese des N- ( ethoxycarbonyl) -maleini ids: 0. Keller, J. Rudinger, Hei. Chim. Acta 1975, 58, 531541.
J. T. Elliott, G. D. Prestwich, Bioconjugate Chemistry 2000,
11, 832-841.
S. Kaigutkar, B. C. Crews, L. J. Marnett, J. Med. Chem. 1996,
39, 1692-1703.
M. Dörr, R. Zentel, R. Dietrich, K. Meerholz, C . Bräuchle, J.
Wichern, S . Zippel, P . Boldt, Macromolecules 1998, 31, 1454-
1465. - N-Dodecyl-maleinimid
Figure imgf000035_0001
300 mg (1.62 mmol) Dodecylamin werden in 10 ml CHC13 gelöst und auf 0°C gekühlt. Man versetzt mit N-methoxycarbonyl- maleinimid (NMM, 507 mg, 3.24 mmol) und tetrabutylammonium hydrogensulfat (503 mg, 1.48 mmol). Man versetzt langsam mit Triethylamin (0.3 ml, 2.16 mmol) und läßt noch weitere 10 min bei 0°C rühren. Das Eisbad wird entfernt und man gibt 20 ml gesättigte NaHC03-Lösung zu. Nach 3 h bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung mit Essigsäureethylester extrahiert (3 x 50 ml) . Die vereinigten organischen Extrakte werden einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel i. Vak. entfernt. Das N-dodecylamin wird anschließend durch Chromatographie an Kieselgel aufgereinigt (Petrolether/EtOAc 10:1) als farbloser Feststoff erhalten.
Ausbeute: 365 mg (85 %)
1H NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H) , 1.25 (br. s., 16H), 1.54-1.60 ( , 4 H) , 3.50 (t, J = 7.3 Hz, 2H) , 6.67 (s, 2H) .
- N-Stearyl-malinimid
Figure imgf000035_0002
500 mg (1.85 mmol) Stearylamin werden in 10 ml CHC13 gelöst und auf 0°C gekühlt. Man versetzt mit N-methoxycarbonyl- aleinimid (NMM, 580 mg, 3.71 mmol) und tetrabutylammonium hydrogensulfat (574 mg, 1.69 mmol). Man versetzt langsam mit Triethylamin (0.34 ml, 2.46 mmol) und läßt noch weitere 10 min bei 0°C rühren. Das Eisbad wird entfernt und man gibt 20 ml gesättigte NaHC03-Lösung zu. Nach 3 h bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung mit Essigsäureethylester extrahiert (3 x 50 ml) . Die vereinigten organischen Extrakte werden einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel i. Vak. entfernt. Das N-Stearylamin wird anschließend durch Chromatographie an Kieselgel aufgereinigt (Petrolether/EtOAc 10:1) als farbloser Feststoff erhalten.
Ausbeute: 515 g (80 %)
1H NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H) , 1.25
(br. s., 28H), 1.50-1.60 (m, 4H) , 3.50 (t, J = 7.3 Hz, 2H) ,
6.67 (s, 2H) .
ESI-MS: [M+H+] 350.0
- N-Cholesteryl-maleinimid
Figure imgf000036_0001
Cholesterylamin (1.0 g, 2.58 mmol) wird in CHC13 (50 ml) gelöst und mit Maleinsäureanhydrid (253 mg, 2.58 mmol) versetzt. Man läßt über Nacht rühren und entfernt anschließend das Lösungsmittel i. Vak.. Der Rückstand wird in Essigsäureanhdrid aufgenommen (30 ml) und mit Natriumacetat (300 mg) versetzt. Die Reaktionsmischung wird 4 h bei 100 °C gerührt anschließend auf 100 ml Eiswasser gegossen. Es wird mit Essigsäreethylester extrahiert (3 x 100 ml) und die organische Phase mit ges. NaCl-Lsösung gewaschen (1 x 100 ml) . Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt. Der Rückstand wird durch Chromatographie an Kieselgel (Petrolether/EtOac 7:1) aufgereinigt. Das N-Cholesteryl-maleinimid wird als farbloses Öl erhalten.
ESI-MS: [M+H+] 468.3
Synthese des Cholesterylamins: R. Krieg, R. Wyrwa, U. Möllemann, H. Görls, B. Schönecker, Steroids, 1998, "63, 531- 541; M. Hasan, N. Rashid, K. M. Khan, G. Snatzke, H. Duddeck, W. Voelter, Liebigs Ann. 1995, 889-896.
Bis-maleinimid
Figure imgf000037_0001
300 mg (1.49 mmol) 1,2 Diaminododecan werden in 10 ml CHC13 gelöst und auf 0°C gekühlt. Man versetzt mit N- ethoxycarbonyl-maleinimid (NMM, 702 mg, 4.49 mmol) und tetrabutylammonium hydrogensulfat (508 mg, 1.49 mmol). Man versetzt langsam mit Triethylamin (0.5 ml, 3.97 mmol) und läßt noch weitere 10 min bei 0°C rühren. Das Eisbad wird entfernt und man gibt 20 ml gesättigte NaHC03-Lösung zu. Nach 3 h bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung mit Essigsäureethylester extrahiert (3 x 50 ml) . Die vereinigten organischen Extrakte werden einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel i. Vak. entfernt. Das gewünschte Bis-maleinimd wird anschließend durch Chromatographie an Kieselgel aufgereinigt (Petrolether/EtOAc 10:1) und als farbloser Feststoff erhalten.
Ausbeute: 420 mg (78 %) 1H NMR ( 250 MHz, CDC13 ) : δ = 1 .25 (br . s . , 16H) , 1 . 54-1-59 (m, 4H) , 3 . 50 (t, J = 7 . 3 Hz, 4H) , 6. 68 (s , 2H) .
- Tris-Maleinimid
Figure imgf000038_0001
Tris- (2-aminoethyl) amin (100 mg, 0.68 mmol) wird in 5 ml ges. NaHC03-Lsg/THF (1:1) gelöst. Bei 0°C versetzt man portionsweise mit N- (methoxycarbonyl) aleinimid (641 mg, 4.13 mmol). Nach jeder Stunde wird 20 ml ges. NaHC03-Lsg/THF (1:1) zugegeben. Nach 4 h bei 0°C extahiert man mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) und wäscht die organische Phase mit ges. NaCl-Lösung (1 x 100 ml). Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt. Man erhält die gewünschte Verbindung als hellgelben Feststoff.
Ausbeute: 140 mg
1H NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 2.71 (t, J = 6.6 Hz, 6H) , 3.52 (t, J = 6.6 Hz, 6H) , 6.70 (s, 6H) . ESI-MS: [M+H+] 386.9
Synthese des Tris-maleinimids: J. C. Cheronis, E. T. Whalley, K. T. Nguyen, S. R. Eubanks, L. G. Allen, M. J. Duggan, S. D, Loy, K. A. Bonham, J. K. Blodgett, J. Med. Chem. 1992, 35, 1563-1572.
- Tetra-maleinimid
Figure imgf000039_0001
Polypropylenimin-tetraa in Dendri er (DAB-Am-4, 90 mg, 0.28 mmol) wird in 5 ml ges. NaHC03-Lsg/THF (1:1) gelöst. Bei 0°C versetzt man portionsweise mit N- (methoxycarbonyl)maleinimid (356 mg, 2.27 mmol). Nach jeder Stunde wird 20 ml ges. NaHC03/THF-Lsg (1:1) zugegeben. Nach 4 h bei 0°C extrahiert man mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) und wäscht die organische Phase mit ges. NaCl-Lösung (1 x 100 ml) . Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt. Man erhält die gewünschte Verbindung als hellgelben Feststoff.
Ausbeute: 120 mg
1H NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 1.42-1.43 (m, 4H) , 1.69 (dt, J =
7.2, J = 7.2 Hz, 8H), 2.37-2.40 (m, 4H) , 2.40 (t, J = 7.0 Hz,
8H) , 3.55 (t, J = 7.4 Hz, 8H) , 6.68 (s, 8H) .
13C NMR (63 MHz): δ = 24.76, 26.16, 36.31, 51.24, 53.68,
134.04, 170.76.
ESI-MS: [M+H+] 637.2
- N-Maleinimido-butansäure
Figure imgf000039_0002
δ-Aminocarbonsäure (500 mg, 4.84 mmol) wird in 20 ml ges. NaHC03-Lsg/THF (1:1) gelöst. Bei 0°C versetzt man portionsweise mit N- (methoxycarbonyl) maleinimid (910 mg, 5.81 mmol) . Nach 10 min bei 0 °C läßt man auf Raumtemperatur erwärmen und gibt jede Stunde 20 ml ges. NaHC03/THF-Lsg (1:1) zu. Nach 3 h extrahiert man mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) und wäscht die organische Phase mit ges. NaCl- Lösung (1 x 100 ml) . Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt. Chromatographie an Kieselgel (EtOAc) liefert die gewünschte Verbindung als farblosen Feststoff.
Ausbeute: 798 mg (90 %)
- 5-Maleiιrtido-fluorescein
Figure imgf000040_0001
5-Aminofluorescein (500 mg, 1.44 mmol) wird in 50 ml Essigsäure/Chloroform (1:1) gelöst (evtl. Suspension). Bei Raumtemperatur versetzt man mit Maleinsäureanhydrid (141 mg, 1.43 mmol) und läßt über Nacht rühren. Anschließend entfernt man das Lösungsmittel i. Vak. Und nimmt den Rückstand in Essisäureanhydrid (30 ml) auf. Man gibt Natriu acetat (200 mg) zu und erhitzt 4 h auf 100 °C. Die Reaktionsmischung wird auf 100 ml Eiswasser gegossen und mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) extrahiert. Die organische Phase wird einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird i. Vak.. entfernt und der Rückstand an Kieselgel (EtOAc/Hexan 3:1) chromatographiert.
Ausbeute: 590 mg ESI-MS: [M+H+] 512.0 N,N-Bis (2-chloroethγl) -4-maleinimidoanilin
Figure imgf000041_0001
N,N-Bis (2-chloroethyl) -4-nitroanilin (1.8 g, 6.87 mmol) wird in Methanol (40 ml) gelöst und mit 10 % Pd/C (200 mg) versetzt. Die Reaktionsmischung wird unter H2-Atmosphäre bei Normaldruck für 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Lösung filtriert und das Lösungsmittel i. Vak. entfernt. Der Rückstand wird in 30 ml ges. NahC03/THF-Lösung (1:1) aufgenommen und bei 0 °C portionsweise mit N- ethoxycarbonyl) -maleinimd (1.61 g, 10.0 mmol) versetzt. Nach 10 min. entfernt man das Eisbad und läßt 3 h bei Raumtemperatur rühren. Nach jeder Stunde gibt man 20 ml ges. NaHC03/THF-Lösung (1:1) zu. Die Reaktionsmischung wird mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) extrahiert und die vereinigten organische Phasen mit ges. NaCl-Lösung (1 x 100 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt und der Rückstand an Kieselgel mit Hexan/EtOAc (1:1) chromatographiert. Die gewünschte Verbindung wird als orangefarbenen Feststoff erhalten.
Ausbeute: 600 mg (28 %)
1H NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 3.59-3.77 (m, 8H) , 6.73 (d, J =
9.2 Hz, 2H), 6.80 (s, 2H) , 7.17 (d, J = 9.2 Hz, 2H) .
13C NMR (63 MHz): δ = 40.24, 53.49, 112.22, 120.93, 127.84,
134.09, 145.86, 169.91.
ESI-MS: war nicht möglich Synthese des N,N-Bis (2-chloroethyl) -4-nitroanilins: B. D. Palmer, W. R. Wilson, S. M. Pullen, W. A. Denny, J. Med. Chem. 1990, 33, 112-121.
- Synthese eines cis-Platin Maleinimid-Derivates
2 , 3-Diaminopropionsäuremethγlester Dihydrochlorid
Figure imgf000042_0001
2, 3-Diaminopropionsäure monohydochlorid (2.0 g, 14.3 mmol) wird in trockenem Methanol (80 ml) suspendiert und auf 0 °C gekühlt. Trockenes HCl-Gas wird 30 min in die Lösung eingeleitet. Man läßt 48 h bei Raumtemperatur rühren und entfernt anschließend das Lösungsmittel i. Vak.. Die gewünschte Verbindung wird als farbloser Feststoff erhalten und direkt für die nächste Umsetzung verwendet.
Synthese des 2, 3-Diaminopropionsäuremethylester Dihydrochlorids: P. Jones, G. B. Villeneuve, C. Fei, J. DeMarte, A. J. Haggarty, K. T. Nwe, D. A. Martin, A.-M. Lebuis, J. M. Finkelstein, B. J. Gour-Salin, T. H. Chan, B. R. Leyland-Jones, J. Med. Chem. 1998, 41, 3062-3077.
- N,N-Di-tert-butoxycarbonγl-2,3- diaminopropionsäuremethylester
Figure imgf000042_0002
2, 3-Diaminopropionsäuremethylester Dihydrochlorid (1.2 q, 6.31 mmol) wird in 1, 4-Dixan/Wasser (40 ml, 1:1) gelöst und mit Triethylamin (4.4 ml, 31.61 mmol) versetzt. Anschließend gibt man Di-tert-butyl dicarbonat (3.0 g, 13.78 mmol) zu und läßt über Nacht rühren. Man gibt Essigsäureethylester (100 ml) und 1 N HCl (100 ml) zu der Reaktionsmischung. Die organische Phase wird mit ges. NaCl-Lösung gewaschen (2 x 100) und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Man entfernt das Lösungsmittel und reinigt den Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel (EtOAc/Hexan 1:3). Die gewünschte Verbindung wird als farbloser Feststoff erhalten.
Ausbeute: 1.83 g (91 %)
1H NMR (250 MHz, D6-DMSO) : δ = 1.36 (br. s, 18H, Boc-H) ,
3.20-3.25 (m, 2H) , 3.59 (s, 3H, OCH3) , 4.03 (t, J = 7.0 Hz,
CH), 6.78 (br. t, NH) , 6.98 (d, J = 7.6 Hz, NH) .
13C NMR (63 MHz, D6-DMSO) : δ = 28.10, 40.97, 52.39, 61.24,
77.52, 77,58, 155.15, 155.84.
ESI-MS: [M+Na+] 341.1; [M+H+] 319.1
Methode: E. B. van der Toi, H. J. van Ramesdonk, J. W. Verhoeven, F. J. Steemers, E. G. Kerver, W. Verboom, D. N. Reinhoudt, Chem. Eur. J. 1998, 4, 2315-2323.
- N,N-Di-tert-butoxycarbonyl-2 ,3-diaminopropanol
Figure imgf000043_0001
N,N-Di-tert-butoxycarbonyl-2, 3-diaminopropionsäuremethylester (1.5 g, 4.70 mmol) wird in trockenem THF (30 ml) gelöst. Bei 0 °C gibt man portionsweise einen Überschuß Lithiumaluminiumhydrid (150 mg) zu und läßt 2 h bei Raumtemperatur rühren. Die Reaktionsmischung wird auf 0 °C gekühlt und durch Zugabe von Wasser hydrolisiert. Man extrahiert mit Essigsäureethylester (3 x 100 ml) und wäscht mit ges. NaCl-Lösung (1 x 100 ml). Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und der Rückstand an Kieselgel mit Hexan/EtOAc (1:1) chromatographiert. Der Alkohol wird als farbloser Feststoff erhalten.
Ausbeute: 966 mg (70 %)
1H NMR (250 MHz, D6-DMS0) : δ = 1.37 (br. s, 18H, Boc-H) #
2.94-3.06 ( , 2H) , 3.30 (dd, J = 5.5 Hz, J = 9.5 Hz, 2H) ,
3.40-3.46 (m, 1H, CH) , 4.50 (t, J = 5.6 Hz, 1H, OH), 6.23
(br. d, 1H, NH) , 6.57 (br. t, 1H, NH) .
13C NMR (63 MHz, D6-DMSO) : δ = 28.10, 40.97, 52.39, 61.24,
77.52, 77.58, 155.15, 155.84.
ESI-MS: [M+Na+] 312.9; [M+H+] 290.9
- N,N-Di-tert-butoxycarbonyl-2,3-diaminopropyl-maleinimid
Figure imgf000044_0001
N,N-Di-tert-butoxycarbonyl-2, 3-diaminopropanol (400 mg, 1.38 mmol) wird in trockenem THF gelöst und mit Triphenylphosphin (398 mg, 1.52 mmol) und Maleinimid (148 mg, 1.52 mmol) versetzt. Anschließend gibt man tropfenweise DEAD (0.26 ml, 1.67 mmol) zu und läßt 24 h bei Raumtemperatur rühren. Das Lösungsmittel wird i. Vak. entfernt und der Rückstand zweimal an Kieselgel mit Hexan/EtOAc 2:1 chromatographiert. Die gewünschte Verbindung wird als farbloser Feststoff, jedoch nicht rein erhalten. Auch eine Trennung mittel HPLC brachte nicht den gewünschten Erfolg.
Ausbeute: 50 mg
ESI-MS: [2M+Na+] 761.2; [M+Na+] 392.0; [M+H+] 370.1. IH NMR (250 MHz, CDC13) : δ = 1.39 (br. s, 9H, Boc-H)^.1.44
(br. s, 9H, Boc-H), 3.22 (t, J = 5.9 Hz, 2H) , 3.61 (d, J =
6.6 Hz, 2H) , 3.80-3.88 (m, IH) , 5.00-5.15 (m, 2H, NH) , 6.72 (s, 2H) .
Mitsunobu-Reaktionen mit Maleinimid:
M. A. Walker, Tetrahedron Lett. 1994, 35, 665-668.
M. A. Walker, J. Org. Chem. 1995, 60, 5352-5355.
M. A. Walker, Tetrahedron 1997, 53, 14591-14598.
K. I. Booker-Milburn, C. E. Anson, C. Clissold, N. J. Costin,
R. F. Dainty, M. Murray, D. Patel, A. Sharpe, Eur. J. Org.
Chem. 2001, 1473-1482.
Mitsunobu-Reaktionen mit Scavenger-Reagenzien:
L. D. Arnold, H. I. Assil, J. C. Verderas, J. Am. Chem. Soc.
1989, 111, 3973-3976.
Kommerziell erhältliche Maleimidderivate, die in der Diels- Alder Reaktion erfolgreich eingesetzt wurden:
Figure imgf000046_0001
N-Ethylmaleinimid
Beispiel 10: Diels-Alder-Reaktionen
Alle gezeigten Verbindungen wurden nach der allgemeinen Vorschrift hergestellt und per HPLC gereinigt. Sie wurden mindestens durch ESI-Massenspektren, häufig zusätzlich durch NMR (4.- und 13C) charkterisiert.
Allgemeine Vorschrift:
Das Furan-Derivat wird mit dem entsprechenden Maleinimid- Derivat in Wasser oder wenn nötig in einem Gemisch aus THF/Wasser (5:2) gelöst und mehrere (2-4) Tage bei 50 °C gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel i. Vak. entfernt und der Rückstand an Kieselgel (CH2Cl2/MeOH 5:1) aufgereinigt. Die entsprechenden Diels-Alder Addukte wurden als Gemische der exo-/endo- erhalten und konnten zum Teil aufgetrennt werden. - Synthetisierte Diels-Alderprodukte mit N-Ethylmaleinimid als Dienophil:
Figure imgf000047_0001
Ri / R2 : Fucose/Fucose, Galactose/Galactose und Fucose/Galactose
Figure imgf000047_0002
Ri / R2 : H/H; H/Galactose; H/Fucose; Fucose/Fucose, Galactose/Galactose und Fucose/Galactose, Lactose/Lactose
Figure imgf000047_0003
Ri / R2 : ; Fucose/Fucose, Galactose/Galactose
Figure imgf000047_0004
Ri / R2 : ; Fucose/Fucose, Galactose/Galactose
Figure imgf000048_0001
Ri / R2 / R3 : ; Fucose/Fucose/Fucose
- Synthetisierte Diels-Alderprodukte mit Biotin-Maleinimid als Dienophil :
Figure imgf000048_0002
Ri / R2 : Fucose/Fucose, Galactose/Galactose und Fucose/Galactose
Verbindungen mit Biotin-Maleinimid eignen sich besonders zur Aufklärung von zellulären Oberflächenstrukturen und deshalb für die Diagnostik und Therapie .
- Andere synthetisierte Diels-Alderprodukte :
Acrylamid als Dienophil
Figure imgf000048_0003
Ri / R2 : Fucose/Fucose - Einführung von Carboran-derivatisiertes Furan und N- Ethylmaleinimid
Figure imgf000049_0001
- Diels-Alder Reaktion mit Nukleosiden (Als Beispiel für Diels-Alder-Reaktion an Oligonukleotiden, DNA)
Figure imgf000049_0002
Trimethoxyphenylmaleinimid (potentielle Wirkstoffe, P53)
Figure imgf000050_0001
Bromphenylmaleinimid (potentielle Wirkstoffe, P53)
Gl
Figure imgf000050_0002
Diese Reaktion wurde auch mit zweifach Fucosylierten oder galactosylierten 3,4- und 2, 5-Bishydroxymethylfuranen erfolgreich durchgeführt.
Bei beiden vorstehenden Verbindungen ist ein kombinatorischer Ansatz erfolgt. So lassen sich durch Kombination verschiedenartig glycosylierter Furane mit unterschiedlich subtituierten Maleinimiden kleinere Bibliotheken neuartiger, potentieller Arzneimittel, z.B. als Modulatoren von/für p53 herstellen.
- Diels-Alder-Produkt mit MaleiSäureanhydrid
Figure imgf000051_0001
Rι/R2 : Fucose/Fucose
Und ein Derivat davon :
Figure imgf000051_0002
Bei den folgenden vier Reaktionen wurde als Furanderivat das 2-Glucosylmethyl-5-hydroxymethlfuran eingesetzt .
- mi Cholesterin
Figure imgf000052_0001
Ansatz: 240 mg (0.82 mmol) Furan
530 mg (1.13 mmol) N-Cholesteryl-fαaleinimd Ausbeute: 250 mg (44 %) ESI-MS: [M+C1-] 792.7
- Dodecan (lipophiler Rest)
Figure imgf000052_0002
Ansatz: 200 mg (0.69 mmol) Furan
365 mg (1.38 mmol) N-Dodecyl-maleinimid Ausbeute: 210 mg (55 %) ESI-MS: [M+Na+] 578.0
- Sterylrest (lipophiler Rest)
Figure imgf000052_0003
Ansatz: 200 mg (0.69 mmol) Furan
300 mg (0.86 mmol) N-Stearyl-maleinimid Ausbeute: 230 mg (52 %) ESI-MS: [M+C1-] 674.5 Anilinlost (analog Glu-IPM)
Figure imgf000053_0001
Ansatz: 100 mg (0.34 mmol) Furan
215 mg (0.68 mmol) Anilin-N-Lost 7irιaleinimid Ausbeute: < 50 mg ESI-MS: [M+Na+] 625.0
Beispiel 11: Diels-Alder-Reaktion mit einer Aminosäure (Lysin)
Figure imgf000053_0002
Figure imgf000053_0003
2-tert-Butoxycarbonylamino-6- [3, -dioxo-8, 9-bis- (3,4,5- trihydroxy-6-methyl-tetrahydro-pyran-2-yloxymethyl)-10-oxa-4- aza-tricyclo [5.2.1.02, 6]dec-4-yl]-hexanoic acid (3): Zu einer Lösung von 0,042 g (0,1 mmol) 1 in 3ml Wasser, welches auf pH=6,9 eingestellet ist, werden 0,033 g (0,1 mmol) 2 (nach der Vorschrift [1] hergestellt) hinzugegeben und anschliessend 4 Tage bei 50°C gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Gefriertrocknung entfernt und das weisse Rohprodukt (0,075 g) mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Es werden dabei 12 mg und 16 mg zweier Konformerer erhalten.Gesamtausbeute 40%. ESI-MS: 647,2 [ (MH-Boc)+H]+, 669,1 [ (MH-Boc)+Na]+ , 769,2 [M+Na]+, 1293., 3 [2 (MH-Boc) +H]+, 1315,4 [2 (MH-Boc) +Na]+
HPLC: Abimed. : analytisch: Merck Lichrospher-RPl8 (E) 5μ, (250x4) mm,
Wasser :CH3CN (100:0)% Grad 40 min 100% CH3CN, 1 ml/min Fluss, detektion bei 210 n präparativ: Merck Lichrospher-RPlδ (E) 5μ, (250x25) mm,
Wasser:CH3CN (100:0)% Grad 45 min 25% CH3CN, 10 ml/min Fluss,
Detektion bei 210 nm

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Synthese von Saccharid-Verbindungen, das die folgenden Schritte aufweist:
(a) Anknüpfung mindestens eines Saccharids an ein cyclisches oder acyclisches Dien,
(b) Umsetzung des in Schritten (a) entstandenen Saccharid-enthaltenden Diens oder eines käuflich erhältlichen Saccharid-enthaltenden Diens mit einem Dienophil mittels Diels-Alder-Reaktion.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Dien ein substituiertes Furan, Fulven, Furfural, Pyrrol, Pyrazol, Oxazol, Thiophen, Cyclopentadien, Cyclohexadien oder acyclisches 1,3-Dien ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Dienophil ein Maleinsäure (anhydrid) -Derivat, Fumarsäure (anhydrid) - Derivat, Maleinimid-Derivat, Acrylsäure-Derivat, Acetylen-Derivat oder ein Enolether ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Dien und/oder Dienophil als Substituenten Alkylketten, OH, SH, Halogene, Aryl-, Carboxyl-, Nitro-, Carboxyamido-, Keto-, Sulfoxid-, Sulfon-, Sulfonsäure-, Phosphorsäure-, Amino-Gruppen, Aminosäuren- bzw. Peptid- Substituenten, Oligonukleotid- bzw. Nukleinsäure- Substituenten, Lipid-Substituenten, Saccharide, pharmazeutische Wirkstoffe, Markierungen, Komplexe oder Farbstoffe tragen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei in Schritt (a) das Saccharid mit dem cyclischen Dien verknüpft wird, indem das Dien mit einer.^,. I idat- Komponente umgesetzt wird, die mit einem Saccharid substituiert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Dien eine cyclisches Dien ausgewählt aus 2,3- Bishydroxymethylfuran, 3, 4-Bishydroxymethylfuran, 2,5- Bishydroxymethylfuran oder ein Derivat von α-GMF mit modifizierter Aldehydfunktion ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das mit einem Saccharid modifizierte Imidat Tri-O-Benzoyl- fucoseimidat oder Tetra-O-Benzoyl-galactoseimidat ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das in Schritt a) erhaltene Produkt 3, 4-Bis- (fucosyl- oxymethyl) -furan, 3, 4-Bis- (galactosyl-oxymethyl) -furan, 3-galactosyl-hydroxymethyl-4-fucosyl-hydroxymethylfuran, 3-Fucosyl-4-fucosyl-3, 4-bis-hydroxymethylfuran, 3- Fucosyl-4-galactosyl-3, 4-bis-hydroxymethylfuran, 2- Galactosyl-5-galactosyl-2, 5-bis-hydroxymethylfuran oder 2, 5-Bis- (galactosyl-oxymethyl) -furan ist.
9. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Substituent ein Biotinrest oder ein Lysinrest ist.
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